estudo comparativo entre gerações de soja transgênica e...

Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP

Instituto de Química

BRUNA KAUELY DE CAMPOS

Estudo comparativo entre gerações de soja

transgênica e não-transgênica utilizando uma

abordagem proteômica e metabolômica

Campinas

2017

BRUNA KAUELY DE CAMPOS

Estudo comparativo entre gerações de soja

transgênica e não-transgênica utilizando uma

abordagem proteômica e metabolômica

Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção

do Título de Doutora em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA BRUNA KAUELY DE CAMPOS E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCO AURÉLIO ZEZZI ARRUDA

Campinas

2017

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2013/17514-7; FAPESP,

02015/24668-6

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Química

Camila Barleta Fullin - CRB 8462

Campos, Bruna Kauely de, 1989-

C157e Estudo comparativo entre gerações de soja transgênica e não-transgênica

utilizando uma abordagem proteômica e metabolômica / Bruna Kauely de

Campos. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.

Orientador: Marco Aurélio Zezzi Arruda.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Química.

1. Transgênico. 2. Proteômica. 3. Metabolômica. 4. Soja. I. Arruda, Marco

Aurélio Zezzi, 1965-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de

Química. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Comparative study between generations of transgenic and non-

transgenic soybeans seeds using a proteomic and metabolomic approach

Palavras-chave em inglês:

Transgenic

Proteomics

Metabolomics

Soybean

Área de concentração: Química Analítica

Titulação: Doutora em Ciências

Banca examinadora:

Marco Aurélio Zezzi Arruda [Orientador]

Ana Rita de Araújo Nogueira

Aline Klassen

Anne Hélène Fostier

Alessandra Sussulini

Data de defesa: 23-11-2017

Programa de Pós-Graduação: Química

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda (Orientador)

Profa. Dra. Ana Rita de Araújo Nogueira (EMBRAPA/São Carlos-SP)

Profa. Dra. Aline Klassen (UNIFESP-Diadema)

Profa. Dra. Alessandra Sussulini (IQ- UNICAMP)

Profa. Dra. Anne Hélène Fostier (IQ- UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Tese de

Doutorado defendida pela aluna BRUNA KAUELY DE

CAMPOS, aprovada pela Comissão Julgadora em 23 de

novembro de 2017.

Dedico essa tese a minha mãe Elke Patricia,

a ela o meu amor e gratidão por nunca

medir esforços para garantir minha formação

e me apoiar em minhas escolhas.

“Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu

É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu”

Ana Vilela

Agradecimentos

Agradeço a Deus por toda sua bondade em me fazer chegar até aqui.

À minha mãe, Elke Patricia, pelo apoio incondicional, por ela ser minha

inspiração diária para querer sempre mais, pelo seu exemplo de coragem e

perseverança, a ela todo o meu amor e gratidão.

À minha avó Mirna que na hora do choro estava sempre presente segurando

minha mão, fazendo minhas comidas congeladas, a esse amor dedicado, a

minha gratidão.

Ao Osmar, meu papito, que cuida da minha mãe, do meu irmão Daniel e da

minha doce irmã Maria Eduarda, obrigada.

À toda família Campos, que muitas e inúmeras vezes fizeram a vez do meu pai,

que torcem por mim e se sentem orgulhosos da minha caminhada. A mãe de

todos, nosso exemplo Vó Maria, obrigada por sempre ter um café e um chimarrão

quentinho para me receber, esse amor transborda e nos faz seguir mais forte!

Tio Everaldo obrigada por ser o mais lindo da família, tia Lô obrigada por ser o

meu pai quando eu não o tive, tia Quel sua pedagogia me inspira, obrigada! Tio

Chico, sua Pitty agradece! Tio Juca, você foi na minha formatura do colegial,

obrigada! Tio Laurici, que eu leve a vida com a sua sabedoria. Tio Leo, tenho

certeza que suas orações me ajudaram muito, obrigada! Meu pai Neoraldo,

sempre há tempo para mudar, obrigada por tentar! Aos meus primos amados

companheiros de infância e aqueles que já são da nova geração, obrigada!

Ao grupinho da moda, Dra. Barbara, quase Dra. Daniele, Dr. João Benhur, Dr.

Silvano, vocês que eu conheci na faculdade, até aqui são 10 anos juntos, na

alegria e na tristeza, na saúde e na doença, obrigada! Agradeço em especial

meu amoy João, nosso Skype, nossa cumplicidade, nossa parceria, não há nada

igual, você me ajudou com os resultados desse trabalho, com interpretações e

ensinamentos, que sua vida seja longa para que eu possa desfrutar ao seu lado

tudo que há de melhor. Obrigada!

Ao GEPAM – agradeço cada sotaque, cada cultura, cada pessoa que por lá

passou. Vocês me fizeram crescer como profissional e ser humano. Aos amigos

queridos e especiais Ciço (Cícero), Rodrigo, Hemissone (Jemmyson), Gustavo,

Katika (Ketherine), Sra. Josi (Josiane), Alejandra, Lara (Larissa), vocês são

demais, espero revê-los um dia. Meu amigo Alisson, que alegria ter conhecido

um ser humano tão incrível como você, quebrando barreiras de preconceito você

“mata a cobra e mostra o pau”, obrigada por tudo!! Ivanilce (nesse momento ela

estava achando que eu não iria falar dela), você tem um lugar especial nesse

agradecimento, minha amiga que chorou junto comigo, que dividiu angustias,

que sempre me recebia com um “bom dia pra quem?”, à você o meu

agradecimento por tudo. Ao Prof. Dr. Zezzi, que me recebeu como uma estranha,

acreditou e apoiou os meus desejos e sonhos, obrigada. Certamente lembrarei

desse grupo com muito carinho.

Ao Artur Zardin Graeff, meu gruds, parceiro e amigo, que bom ter você com a

calmaria que eu precisava, que bom que você me fez sorrir e mudou a minha

vida, que bom fazer planos com você, obrigada!

Ao laboratório ThoMSon da UNICAMP e ao Dr. Tiago Santana Balbuena e Msc.

Bruna Santos da UNESP-Jaboticabal pela ajuda com os experimentos de

espectrometria de massas.

À Hexis Cientifica (Danaher Corporation), em especial a Patricia Rodrigues, pela

confiança em mim depositada para assumir o cargo de especialista de produtos

e assim poder repassar os conhecimentos acadêmicos a uma empresa e vice-

versa.

À fundação de amparo a pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio

financeiro concedido nos processos - regular 2013/17514-7 e BEPE 2015/24668-

6.

Por fim, agradeço a Bel da CPG que me socorreu inúmeras vezes, a todos os

mestres que até aqui me guiaram e a UNICAMP pela infraestrutura.

RESUMO

Este trabalho baseou-se no estudo comparativo entre sementes de soja

transgênica (T) e não-transgênica (NT) no que diz respeito a suas proteínas e

metabólitos em diferentes gerações da planta, pois acredita-se que o gene

inserido possa alterar seu perfil em nível molecular, uma vez que seu genoma

foi alterado. Para tal avaliação, foi necessário o plantio das sementes de soja em

casa de vegetação sob as mesmas condições até a obtenção da terceira

geração. Além disso, foram realizadas diversas extrações das proteínas das

sementes de soja para posterior separação por eletroforese em gel. Os géis de

eletroforese obtidos mostram um perfil bastante semelhante, mostrando que a

separação foi adequada, e que existem proteínas diferentes e também

diferenciais entre as mesmas. A quantificação relativa das proteínas foi realizada

por meio da técnica de 2-D DIGE, revelando um total de 89 proteínas diferenciais

com critério de seleção que partiu de p<0,1 e fator de regulação maior que 2,0

entre os grupos estudados. Um menor número de proteínas diferenciais foi

observado nos grupos de sementes T. Após identificação por espectrometria de

massas, 29,2% das proteínas corresponderam a classe de armazenamento.

Com relação aos metabólitos, os resultados indicaram que o solvente composto

por metanol/água (70/30% v/v) foi considerado o mais adequado para a extração

dos mesmos. Com isso, as duas gerações de sementes tiveram sua análise

realizada por LC-MS com analisador QTOF. Os dados obtidos foram avaliados

por uma análise estatística para melhor compreensão dos resultados. Os

resultados mostraram uma diferença estatística significativa entre os perfis T e

NT e também entre suas gerações. Esses resultados indicam, que as sementes

de soja T e NT estão sofrendo uma alteração em seu proteoma e metaboloma.

A soja T se mostrou mais robusta, mas não é possível afirmar se é devido a

transgenia. O fato das menores diferenças terem sido observadas entre os

grupos transgênicos, com um menor número de proteínas diferenciais e menores

variações estatísticas com relação aos metabólitos, nos levam a concluir que a

soja transgênica se adapta melhor as mudanças que estão ocorrendo em seu

metabolismo, sejam elas causadas por fatores biológicos, químicos ou físicos.

ABSTRACT

This work was based on the comparative study between transgenic (T) and non-

transgenic (NT) soybean seeds with respect to their proteins and metabolites in

different generations of the plant, since it is believed that the inserted gene can

change its profile at the molecular level, once their genome was altered. For this

evaluation, it was necessary to plant the soybean seeds in a greenhouse under

the same conditions until obtaining the third generation. In addition, several

extractions of the proteins of the soybean seeds were carried out for subsequent

separation by electrophoresis. The obtained electrophoresis gels show a very

similar profile, showing that the separation was adequate, and that there are

different proteins and also differentials between them. The relative quantification

of the proteins was performed using the 2-D DIGE technique, revealing a total of

89 differential proteins with a selection criterion starting from p<0.1 and a

regulation factor greater than 2.0 between the groups studied. A lower number of

differential proteins was observed in the T seed groups. After identification by

mass spectrometry, 29.2% of the proteins corresponded to the storage class.

Regarding the metabolites, the results indicated that the solvent composed of

methanol/water (30/70% v/v) was considered the most adequate. Thus, the two

seed generations were analyzed by LC-MS with QTOF analyser. The obtained

data were evaluated by a statistical analysis to better understand the results. The

results showed a difference between the T and NT profiles and also between their

generations. These results indicate that soybean seeds T and NT are undergoing

a change in their proteome and metabolome. The T soybean was more robust,

but it is not possible to say if it is due to transgenic. The fact that the smaller

differences were observed between the transgenic groups, with a lower number

of differential proteins and lower statistical variations with respect to the

metabolites, lead us to conclude that transgenic soya is better adapted to the

changes that are occurring in its metabolism, whether they are caused by

biological, chemical or physical factors.

Lista de abreviação

USDA United States Department of Agriculture

2-D DIGE Two-Dimensional Differential Gel Electrophoreisis

2-D PAGE Two-Dimensional Poliacrylamide Gel Electrophoresis

AmBic Ammonium Bicarbonate

CIBio Comissão Interna de Biosegurança

CTNBio Comissão Nacional de Biosegurança

Da Daltons

DIA Differential in-gel analysis

ESI Electrospray Ionization

GMO Genetically Modified Organism

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

iCAP Isotope Coded Affinity Tags

ICR Ion Ciclotron Ressonance

IEF Isoeletric Focusing

IPG Immobilized pH Gradient

iTRAQ Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification

LC-SRM Liquid Chromatography Selected Reaction Monitoring

m/z Massa/Carga

MALDI Matrix Assisted Laser Dessorption/Ionization

MS Mass Spectrometry

MS-Imaging Mass Spectrometry imaging

NT Não-Transgênica

PFF Peptide Fragmentation Fingerprint

PHG Programa Genoma Humano

pI Ponto Isoelétrico

PMF Peptide Mass Fingerprint

PSMs Peptide Spectrum Match

SILAC Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture

T Transgênica

TOF Time of Flight

Sumário

INTRODUÇÃO GERAL 14

Capítulo 1-

Análise proteômica de duas gerações de soja transgênica e não-

transgênica

17

1.1 INTRODUÇÃO 18

1.2 OBJETIVOS 23

1.3 MATERIAIS E MÉTODOS 24

1.3.1 Reagentes e equipamentos 24

1.3.2 Cultivo das sementes de soja 25

1.3.2.1 Aspectos Éticos 26

1.3.3 Extração e separação das proteínas de Soja 26

1.3.4 Quantificação relativa das proteínas de soja por 2D-DIGE 27

1.3.5 Digestão com tripsina in gel das proteínas 29

1.3.6 Identificação das proteínas 30

1.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 31

1.4.1 Plantio e Cultivo da soja 31

1.4.2 Separação das proteínas 34

1.4.3 Quantificação relativa das proteínas diferenciais por 2-D

DIGE

37

1.4.4 Identificação das proteínas diferenciais por espectrometria

de massas

40

1.4.5 Conclusão Parcial 54

Capítulo 2-

Análise metabolômica de duas gerações de soja transgênica e

não-transgênica

56

2.1 INTRODUÇÃO 57

2.2 OBJETIVOS 61

2.3 MATERIAIS E MÉTODOS 61

2.3.1 Reagentes e equipamentos 61

2.3.2 Extração e análise de metabólitos 61

2.3.3 Pré-processamento de dados e análise multivariada 62

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 63

2.4.1 Plantio e cultivo da soja 63

2.4.2 Análise de metabólitos 63

2.4.3 Conclusão Parcial 79

3. CONCLUSÃO FINAL 81

4. REFERÊNCIAS 82

ANEXO 88

14

INTRODUÇÃO GERAL

A soja é uma semente que pertence à família das leguminosas

(Fabaceae), sendo considerada uma importante fonte de proteínas, pois, em

suas sementes, aproximadamente 40 % de sua massa seca corresponde a

proteínas e 20 % a óleo, o que torna a soja um produto aplicado nos mais

diversos setores industriais como alimentos para humanos e animais, e ainda,

como fonte alternativa de combustível (Arruda et al., 2015; Embrapa, 2014; Kim

et al., 2009; Komatsu e Ahsan, 2009; Sussulini et al., 2007). Nos últimos anos, o

cultivo de soja cresceu significativamente em muitos países. O departamento de

agricultura dos Estados Unidos da América (USDA, do inglês – United States

Department of Agriculture) divulgou a estimativa de produção esperada para a

safra de 2017/2018 em 351 milhões de toneladas. O Brasil contribuiu com uma

produção de 113 milhões na safra de 2016/2017 e se destaca por ser o segundo

maior produtor mundial de soja (CONAB, 2017), no entanto, é líder mundial em

exportação desse grão, sendo cerca de 43% de sua produção.

Devido à reconhecida importância da soja, muitos institutos de pesquisas

e empresas buscam aperfeiçoar a qualidade nutricional da planta e, ainda,

aumentar o controle contra pragas de uma maneira eficiente e barata. Nesse

sentido, na década de 80, foram realizados estudos iniciais baseados em

modificação genética nas sementes de soja pela empresa americana

Monsanto®, a qual patenteou esta tecnologia ao desenvolver a soja transgênica.

Denominada Roundup Ready® (RR) por ser resistente ao herbicida Roundup®

- um dos herbicidas mais empregados em todo o mundo (Barbosa, 2011;

Monsanto, 2013).

A soja sofreu uma modificação genética, e por isso é chamada de

transgênica, a qual foi realizada por meio da inserção do gene cp4EPSPS

proveniente da bactéria Agrobacterium do tipo cp4. Esta modificação confere a

esta variedade resistência ao herbicida que tem glifosato como princípio ativo

(Funke et al., 2006). O glifosato inibe os processos bioquímicos (formação de

compostos aromáticos) da planta nas quais a enzima EPSPS, que é produzida

pelas plantas de soja não-transgênicas, participa. O gene cp4EPSPS inserido na

soja é funcionalmente similar a enzima EPSPS, presente na soja não-

15

transgênica, no entanto, possui uma baixa afinidade pelo glifosato. Esse

processo está resumido na Figura 1 (Barbosa, 2011; Kim et al., Funke et al.,

2006).

Figura 1. (A) Síntese de compostos aromáticos na soja na presença da enzima

endógena da planta EPSPS (B) na presença da enzima exógena da planta cp4EPSPS.

Entretanto, o plantio e o consumo de alimentos geneticamente

modificados enfrentam numerosas críticas de consumidores e organizações

ecológicas que lideram alguns países e regulam sua produção, comércio e o

crescimento de GMO (do inglês - genetically modified organism) (Léon et al.,

2009). No Brasil, o plantio da soja RR foi aprovado pela comissão técnica

nacional de biossegurança (CTNBio) em 1998, após protestos e críticas com

relação a este organismo geneticamente modificado. Isso devido às inúmeras

controvérsias em relação aos riscos e benefícios que a soja transgênica poderia

causar na alimentação humana e animal (Kléba, 1998).

COO-

OH

-2O3PO OH

+-2O3PO COO-

Enzima Epsps

COO-

OH

-2O3PO O COO-

+ Pi

Inibição

HN PO3

2--OOC

glifosfato

shikimato-3-fosfato fosfoenolpiruvato 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato

X

COO-

OH

-2O3PO OH

+-2O3PO COO-

Enzima Epsps

COO-

OH

-2O3PO O COO-

+ Pi

Inibição

HN PO3

2--OOC

glifosfato

shikimato-3-fosfato fosfoenolpiruvato 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato

cp4EPSPS

X

(A)

(B)

16

Nos dias atuais, tal controvérsia ainda não foi esclarecida pela ciência,

contudo, alguns estudos estimam que a composição química de produtos

transgênicos mostrou modificações inesperadas neste tipo de organismo (Léon,

et al., 2009). Dessa forma, acredita-se que essa modificação genética sofrida

pela soja possa contribuir para mudanças nas características químicas e

biológicas da soja denominada transgênica (Arruda et al., 2015; Barbosa, 2011).

Isso corrobora com a necessidade de desenvolvimentos analíticos mais

poderosos, capazes de enfrentar a complexidade deste problema.

Sendo assim, a temática desta tese foi a de avaliar, de forma comparativa

e em nível molecular, se existem diferenças entre a soja transgênica e não-

transgênica cultivadas por duas gerações. No capítulo 1, uma abordagem

proteômica foi utilizada por meio das técnicas de eletroforese em gel de

poliacrilamida para separação das proteínas e espectrometria de massas para a

identificação das mesmas. Os resultados do estudo levaram a uma avaliação

metabolômica, que foi realizada por meio das técnicas de cromatografia líquida

de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas, a qual é apresentada

no capítulo 2.

17

Capítulo 1-

Análise proteômica de duas gerações

de soja transgênica e não-transgênica

18

1.1 INTRODUÇÃO

O sequenciamento dos genes humanos, por meio de um grande estudo

realizado por inúmeros pesquisadores oriundos de diferentes países, ficou

conhecido como Projeto Genoma Humano (PGH). Tais estudos tiveram início na

década de 90 e tinham como objetivo elucidar questões que envolviam o

diagnóstico e a cura para inúmeras doenças. No ano de 2001, o artigo intitulado

The Sequence of the Human Genome foi publicado por Venter et al. (2001),

mostrando os resultados obtidos e, ainda, que cerca de 90% do genoma humano

já havia sido sequenciado com 99% de precisão. A partir de então, uma

revolução nas áreas biológicas aconteceu, a chamada “era pós-genômica”.

Contudo, para entender a função de todos os genes em um organismo,

se faz necessário conhecer não só quais genes são expressos, mas também

quais são os produtos dessa expressão e como são sintetizados. Assim, iniciou-

se o desenvolvimento dos estudos “ômicos”, como a transcriptômica,

proteômica, metabolômica, metalômica, dentre outras, com o objetivo de uma

maior e melhor compreensão de todo o RNA, proteínas, metabólitos e íons

metálicos, respectivamente, presentes em determinado organismo (Gomez-

Cabrero et al., 2014; Lay Jr. et al., 2006).

O termo proteoma foi proposto por Wilkins e Willians em 1994 (Wilkins e

Willians, 1994) como sendo todo o conteúdo de proteínas expressas por um

genoma, tecido, célula ou organismo. A comunidade científica percebeu que

após a euforia provocada pelo sequenciamento do genoma humano e outros

organismos, eram necessários outros estudos, pois enquanto o genoma de um

organismo permanece estável, o proteoma por exemplo, é extremamente

variável. Sendo assim, a área cientifica de estudo do proteoma de um organismo

ficou conhecida como proteômica.

A proteômica é uma área em crescente desenvolvimento que examina

todas as proteínas envolvidas em uma célula ou tecido e fornece informações

importantes para complementar os estudos de transcriptômica e metabolômica

(Patel, 2012). A avaliação de proteínas é essencial para compreender os

processos biológicos que ocorrem em organismos sadios, doentes, e/ou

geneticamente modificados. A análise de um proteoma, ou seja, do conjunto de

proteínas que pode ser encontrada em uma célula ou organismo, vem sendo

19

realizada em diferentes áreas do conhecimento e em diferentes matrizes

biológicas. Nas áreas médicas, por exemplo, os pesquisadores buscam

respostas para diferentes doenças e terapias, que vão desde a neurologia

(depressão, esquizofrenia, Alzheimer) até doenças como o câncer (Sussulini,

2011; Zhang et al., 2014). Já a biologia, química, ciências agronômicas, entre

outras, estudam multidisciplinarmente desde o proteoma humano até o animal e

vegetal (Navarrete-Perea et al., 2014).

Dependendo do objetivo geral, a análise proteômica pode ser dividida em

três diferentes áreas:

Proteômica qualitativa - que tem como objetivo caracterizar e

identificar um conjunto de proteínas presentes em uma

determinada amostra. As abordagens mais comuns são peptide

mass fingerprint (PMF) e peptide fragmentation fingerprint (PFF),

ambas as abordagens necessitam de uma digestão enzimática das

proteínas em peptídeos.

Proteômica quantitativa – que tem como objetivo quantificar as

proteínas entre diferentes amostras e/ou tratamentos da amostra

de forma relativa. Isso pode ser feito baseado em gel, marcação

das proteínas e também livre de marcação (label-free). A

proteômica quantitativa é o foco deste trabalho e será discutida

com maiores detalhes na sequência desse capítulo.

Proteômica funcional – que estuda a interação proteína-proteína ou

entre proteínas e outras moléculas de uma determinada amostra.

A tecnologia de MS-imaging (do inglês – Mass Spectrometry imaging) vem

sendo uma ferramenta importante para esse tipo de estudo, pois permite a

observação da localização de proteínas até de suas isoformas (Ortea, et al.,

2006). Entretanto, mesmo nos dias atuais, a análise proteômica é considerada

um desafio analítico, uma vez que são necessárias basicamente etapas de

extração, separação e identificação das proteínas.

O processo de extração das proteínas é crucial para um bom resultado,

uma vez que quanto maior o número de proteínas puder ser extraído, com

reprodutibilidade adequada e confiança, maiores são as chances de avaliar o

proteoma total do organismo em estudo. Devido à complexidade de amostras

vegetais, como a soja, protocolos de extração já estão muito bem definidos e

20

consistem basicamente em ruptura celular por meio de maceração, ultrassom,

radiação micro-onda, ou ainda, procedimentos que aumentem a solubilidade das

proteínas com uso de detergentes. As próximas etapas contemplam a

preservação das proteínas com consequente depleção de interferentes para

isso, meios caotrópicos como uréia e tiouréia são utilizados, os quais

proporcionam a ruptura das ligações proteicas e aumentam a interação com o

meio extrator. A adição de inibidores de protease (fluoreto de fenilmetilsulfonila

(PMSF) e o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) é necessária ao protocolo

de extração, pois minimiza a degradação das proteínas extraídas no decorrer

das etapas do preparo de amostra. Essa etapa de preservação é essencial, pois

tecidos vegetais apresentam elevado conteúdo de protease (Rabilloud & Lelong,

2011).

Como mencionado, a proteômica quantitativa foi foco deste trabalho e

várias abordagens analíticas para tal podem ser utilizadas, dentre elas, as

técnicas mais empregadas são baseadas na separação por eletroforese em gel

(utilizada neste trabalho) (Barbosa et al., 2012; Clement et al., 2013; Collier et

al., 2012; Valdez et al., 2013), eletroforese capilar (Simó et al., 2010) e

cromatografia (Mataveli et al., 2012) e a identificação por espectrometria de

massas (utilizada neste trabalho) (Clement et al., 2013; Collier et al., 2012;

Déglon et al., 2012). A proteômica tem ido além da identificação de proteínas e

leva em conta a precisão e a confiabilidade em quantificar as diferenças na

abundância de proteínas em um organismo. Para isso muitos métodos de análise

vêm sendo utilizados a partir de diferentes técnicas.

Dentre as técnicas de separação, a eletroforese é uma das mais

empregadas para a separação de proteínas (Arruda et al., 2013; Rodrigues et

al., 2012; Xu et al., 2008). A eletroforese 2 D em gel de poliacrilamida (2-D PAGE

- do inglês two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis) foi desenvolvida

em 1975 por O’Farrel (O’Farrel, 1975). A separação é realizada em duas etapas,

as quais se baseiam em propriedades distintas das proteínas. Na primeira etapa,

a focalização isoelétrica (IEF, do inglês - isoelectric focusing) é empregada para

separar as proteínas de acordo seu ponto isoelétrico (pI), sendo este o pH no

qual a molécula apresenta carga líquida igual a zero. A separação de acordo

com o pI pode ser feita em fita pré-fabricada denominada IPG (immobilized pH

21

gradient). Na segunda etapa, a fita de IEF é inserida no topo do gel de SDS-

PAGE, havendo a separação por massa molecular.

Outro meio de separação, juntamente com a quantificação relativa de

proteínas, é obtido por meio da técnica de 2-D DIGE (do inglês, two-dimensional

difference gel electrophoresis), a qual foi desenvolvida por Unlu et al. (1997).

Nesta técnica, misturas complexas de proteínas provenientes de amostras

distintas são marcadas com corantes fluorescentes, por meio da ligação

covalente entre o corante e as proteínas. Com isso, a técnica de 2-D DIGE

apresenta algumas vantagens em relação à técnica de 2-D PAGE, como, por

exemplo uma maior sensibilidade, que permite a detecção de proteínas pouco

abundantes, a diminuição dos problemas de reprodutibilidade, e ainda, a

redução do número de géis necessários para uma análise, uma vez que duas

amostras distintas são analisadas em um único gel (Arruda et al., 2011).

Em estudos proteômicos, a identificação dessas proteínas previamente

separadas e/ou quantificadas por 2-D DIGE é realizada por espectrometria de

massas (MS – do inglês, mass spectrometry). Na prática, após efetuar a

separação e quantificação relativa dos spots proteicos, realiza-se,

primeiramente, a digestão das proteínas com tripsina, afim de que estas

apresentem massas moleculares dentro da faixa de relação m/z (massa/carga)

detectável pelo espectrômetro de massas. O tratamento dos dados gerados é

realizado por meio de uma busca em banco de dados utilizando algoritmos

específicos para a identificação das proteínas.

O sucesso da MS no campo de proteômica se deve, em grande parte, aos

avanços na tecnologia de fontes de ionização e dos analisadores de massas. A

MS é uma técnica analítica que permite discriminar íons de acordo com a relação

m/z de cada espécie analisada. É importante ressaltar, que o que é avaliado em

espectrometria de massas é a relação m/z e não a massa de um íon em Da

(Daltons). Apenas para íons monocarregados a relação m/z reflete a massa do

íon. Além de discriminar íons, a MS é capaz de contar a quantidade de íons

numa determinada razão m/z. Para usar a MS como ferramenta em proteômica

é necessário gerar os íons por meio de uma fonte de ionização, como eletrospray

(ESI - do inglês, electrospray ionization) ou MALDI (do inglês, Matrix Assisted

Laser Dessorption/Ionization), por exemplo, e ainda, discriminá-los por meio de

analisadores de massas, que dentre os mais utilizados pode-se citar os de alta

22

resolução como o TOF (do inglês, Time of Flight), o ICR (do inglês, Ion Ciclotron

Ressonance) e o mais recente desenvolvido por armadilha de íons - Orbitrap.

Quando se trata de quantificação de proteínas por espectrometria de

massas, muitos modos são encontrados na literatura, que incluem as técnicas

hifenadas de LC-MS/MS e LC-SRM (do inglês, Liquid chromatography –

Selected reaction monitoring) que é um método de quantificação que tem como

alvo proteínas específicas, ou seja, deve-se conhecer de antemão as proteínas

que se deseja quantificar. Esses modos podem ser combinados com diferentes

métodos para a quantificação, que podem incluir a marcação de peptídeos

isobáricos e isotópicos (iTRAP, do inglês - isobaric tags for relative and absolute

quantification ou iCAP, do inglês – isotope-coded affinity tags) ou metabólica

(SILAC, do inglês - stable isotope labeling by amino acids in cell culture).

Também pode ser realizada a quantificação de proteínas sem marcação

(label-free), na qual não é necessária a modificação dos peptídeos ou proteínas

com padrões isotópicos, exigindo, portanto, um preparo de amostra menos

trabalhoso. Assim, as proteínas podem ser quantificadas por meio da correlação

com as áreas dos picos obtidos por cromatografia ou por contagem no número

de espectros dos peptídeos sequenciados por espectrometria de massas. O

sinal analítico obtido é comparado com a abundância relativa das mesmas.

Embora a contagem espectral seja simples, um pequeno número de contagens

para proteínas presentes em baixa abundância fornece medições quantitativas

menos robustas, devido às limitações estatísticas e de outros fatores, tais como

a necessidade de limitar a taxa de falsa descoberta de modo a não "contar"

espectros de baixa qualidade. Na quantificação label-free, qualquer variação no

preparo de amostras, na reprodutibilidade, na eficiência de ionização e outras

variáveis do instrumento pode conduzir a erros na análise (Xie et al., 2011).

Contudo, esse método de quantificação pode ser considerado preciso e menos

trabalhoso, já que dispensa o uso de géis ou de reagentes com elevado custo

como isótopos, porém necessita de software específico e um cuidadoso trabalho

por parte do analista.

Com relação à proteômica da soja, é possível encontrar vários estudos na

literatura, no entanto, estudos comparativos entre soja T e NT ainda são

escassos (Arruda et al., 2015; Barbosa et al., 2012; Mataveli et al., 2012;

Natarajan et al., 2007). Neste sentido, Barbosa et al., (2012), estudaram, por

23

meio de comparação proteômica, as sementes de soja transgênica e não-

transgênica. Os resultados deste trabalho evidenciaram quatro spots proteicos

com abundância diferentes, indicando que tais proteínas apresentaram

abundâncias diferentes entre as amostras, provavelmente devido a modificação

genética realizada na soja transgênica. Tal fato, foi confirmado pela identificação

da proteína cp4EPSPS nas sementes de soja transgênica, característica da

modificação genética, e ainda, foi possível identificar um total de 192 proteínas

nessas sementes de soja, por meio da separação por 2-D PAGE e identificação

por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF.

Com relação à segurança alimentar, ainda não há relatos científicos sobre

os efeitos que a alimentação a base de organismos transgênicos pode causar.

Todavia, Krzyzowska et al. (2010) relataram possíveis efeitos do triticale

transgênico, investigando cinco gerações consecutivas de ratos. O triticale é um

cereal resultante da hibridação do trigo e do centeio. Os resultados indicam que

a utilização de triticale transgênico na alimentação dos roedores aumentou a

concentração de glóbulos brancos no sangue e, ainda, a expansão de células B

nos órgãos linfóides secundários.

Da mesma maneira, estudos sobre os efeitos que a transgenia pode

provocar em plantas de soja cultivadas com sementes provenientes de uma

mesma família, ou seja, em futuras gerações, ainda são escassos ou

inexistentes, bem como nas sementes por essas plantas fornecidas. Assim o

presente estudo é importante do ponto de vista de segurança alimentar, uma vez

que os produtores de soja costumam guardar sementes obtidas de uma safra

para plantar na safra seguinte.

1.2 OBJETIVOS

O objetivo principal desse capítulo foi o de investigar, de forma

comparativa, os efeitos que o cultivo consecutivo pode causar em nível

proteômico entre as sojas T e NT. Como objetivos específicos têm-se:

i. Plantar e cultivar as sementes de soja T e NT, em condições

idênticas, até sua terceira geração;

ii. Realizar a extração, separação e quantificação relativa das

proteínas de soja T e NT através da eletroforese bidimensional em gel de

24

poliacrilamida e eletroforese diferencial em gel de poliacrilamida (2-D PAGE e 2-

D DIGE);

iii. Identificar e caracterizar as proteínas diferenciais por

espectrometria de massas (nLC-MS);

iv. Avaliar se houve alguma alteração diferencial e ao longo das

gerações de sementes;

v. Investigar quais as funções das proteínas identificadas no

metabolismo das sementes.

1.3 MATERIAIS E MÉTODOS

1.3.1 Reagentes e equipamentos

Todas as soluções foram preparadas com água deionizada de alta pureza

(resistividade 18,2 MΩ cm) obtida a partir de um sistema deionizador de água

Milli-Q, modelo DirectQ 5 (Millipore). Na secagem das amostras de semente de

soja T e NT, usou-se uma estufa de secagem à 37 °C (Quimis).

Para o preparo da solução nutritiva utilizada no cultivo da soja, os sais

utilizados foram: KH2PO4 (J. T. Baker), Ca(NO3)2.4H2O (Ecibra), KNO3 (Nuclear)

e MgSO4.7H2O (Carlo Erba).

Na extração das proteínas das sementes de soja os reagentes utilizados

foram: Tris-HCl (GE Healthcare), KCl (Mallinckrodt), DTT (Ditiotreitol) (GE

Healthcare), PMSF (Sigma Aldrich), SDS (GE Healthcare) e éter de petróleo

(Mallinckrodt). Para a precipitação das mesmas, acetato de amônio

(Mallinckrodt), metanol (J. T. Baker) e acetona (Merck) foram usados.

No preparo dos géis foram utilizados acrilamida, bis-acrilamida, SDS

(dodecil-sulfato de sódio), tris-HCl, agarose, persulfato de amônio e TEMED (GE

Healthcare). Para os demais procedimentos de análise foram utilizados os

seguintes reagentes: Uréia, tiouréia, CHAPS e anfólitos pH 4-7 (GE Healthcare),

kit de quantificação de proteínas 2-D Quant (GE Healthcare), óleo mineral (GE

Healthcare), Comassie Blue (J. T. Baker), etanol (Synth), ácido acético (Synth),

iodoacetamida – IAA, bicarbonato de amônio - AmBic (GE Healthcare) e

acetonitrila (Sigma-Aldrich).

25

A separação das proteínas foi realizada em sistema de eletroforese

modelo EttanTM Dalt six (GE Healthcare, Suécia) e posterior tratamento das

imagens em Scanner, modelo Image Scanner (Amershan, Bioscience). As

análises de identificação das proteínas foram realizadas em um espectrômetro

de massas do tipo LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific), equipado com fonte de

nanoESI (Thermo Scientific). Entre outros equipamentos e materiais

volumétricos utilizados, destacam-se balança analítica AX 200 7 (Shimadzu),

ultrasonicador (modelo Qsonica Q700, potência 700 W) e micropipetas de 20 –

200 μL; 100 – 1000 μL e 1000 – 5000 μL (Eppendorf).

1.3.2 Cultivo das sementes de soja

As sementes de soja transgênica (T - variedade M7211 RR) e não-

transgênica (NT - variedade MSOY 8200) foram gentilmente cedidas pela

empresa Monsanto do Brasil.

O primeiro cultivo (sementes precursoras) para obtenção da segunda

geração de sementes foi realizado entre os meses de janeiro a maio de 2014.

Foram preparados 19 vasos para cultivar 3 sementes de soja T e 3 NT (por vaso),

denominadas ST2 e SNT2 (segunda geração), respectivamente, em casa de

vegetação pertencente ao Instituto de Biologia (IB) da Unicamp e em solo

apropriado, que consistiu de uma mistura 1:1 de substrato (BasaplantTM) e

vermiculita (AgroTM). As plantas foram irrigadas com água deionizada todos os

dias e com solução nutritiva [consistindo de uma solução composta por KH2PO4

(0,136 g L-1), Ca(NO3)2.4H2O (11,8 g L-1), KNO3 (5,05 g L-1) e MgSO4.7H2O (4,92

g L-1)] a cada 3 dias após os cotilédones dessas plantas apresentarem cor

amarelada (aproximadamente após 18 dias de cultivo). Após o décimo quinto dia

de cultivo, foi realizado o desbaste, que consistiu em retirar as duas plantas

menos desenvolvidas do meio, para que apenas uma crescesse e se

desenvolvesse. Esse procedimento foi necessário, para que não ocorresse

competição entre as sementes com relação aos nutrientes necessários para o

seu crescimento, e assim minimizasse o estresse da mesma. Depois de

aproximadamente 150 dias as sementes foram coletadas. Devido à alta umidade

apresentada naquele período foi necessário realizar um controle químico com

26

um fungicida sistêmico (SCORE® 250 EC, 200 μl L-1), com objetivo de prevenir

o aparecimento de fungos nas plantas.

O segundo cultivo para obtenção da terceira geração de sementes foi

realizado entre os meses de janeiro a maio de 2015 em condições idênticas ao

primeiro, com as sementes coletadas provenientes da segunda geração e que

foram denominadas ST3 e SNT3 (terceira geração). Novamente, após

aproximadamente 150 dias de cultivo as sementes foram coletadas.

1.3.2.1 Aspectos Éticos

Como nesse trabalho foram empregadas sementes de soja

geneticamente modificada, é informado o número do registro do Certificado de

Qualidade em Biossegurança: 240/2007, publicado em 24/07/2007, bem como

todos os experimentos foram conduzidos em laboratório apropriado para

manipulação de organismos transgênicos (classe I), que está certificado pela

CIBio do IQ-UNICAMP.

1.3.3 Extração e separação das proteínas de Soja

O procedimento de extração foi realizado de acordo com Barbosa (2012),

com algumas modificações. As sementes das três gerações de soja foram

congeladas em nitrogênio líquido e, então, maceradas com o auxílio de pistilo e

almofariz. Para cada 600 mg de soja moída, adicionaram-se 6 mL de éter de

petróleo, e então, o solvente foi deixado em contato com a amostra, sob

agitação, durante 10 minutos. O solvente foi removido e a amostra foi novamente

macerada (este procedimento foi realizado 3 vezes). As proteínas foram

extraídas pela maceração da amostra em banho de gelo com 6 mL de solução

extratora (Tris-HCl 50 mmol L-1 (pH 8,8), KCl 1,5 mmol L-1, DTT 10 mmol L-1,

PMSF 1,0 mmol L-1 e SDS 0,1% (m∕v)).

O extrato proteico foi centrifugado durante 5 minutos à 4°C e 5000 g, para

a remoção dos materiais insolúveis. O sobrenadante contendo as proteínas foi

armazenado em microtubos a -20ºC. A precipitação das proteínas foi realizada

com acetato de amônio 0,1 mol L-1 em metanol, a fim de remover possíveis

interferentes durante 12h a -20ºC. O precipitado proteico foi coletado por

27

centrifugação durante 10 min à 4°C e 5000 g, e, em seguida, lavado com solução

de acetona 80% (2 vezes) e etanol 70% (2 vezes), ambos gelados. Para a

obtenção dos géis de eletroforese, o precipitado proteico foi ressolubilizado em

tampão de hidratação [uréia 7 mol L-1, tiouréia 2 mol L-1, CHAPS 2% (m/v) e

anfólitos 0,5% (m/v)] em pH de 4-7, para a obtenção da quantidade de proteínas

totais extraídas, que foi obtida por meio do kit 2D-Quant, de acordo com as

instruções do fabricante.

Para a primeira dimensão da eletroforese utilizou-se uma fita de 13 cm

com pH de 4-7, aplicando-se sobre a mesma, 250 µL de amostra que continha

500 µg de proteínas ressolubilizadas. Esta fita foi hidratada por 12h em

temperatura ambiente com óleo mineral para, então, ser levada ao sistema

focalizador, o qual foi programado da seguinte maneira: (1) 500 V até 500 Vh,

(2) 1000 V até 800 Vh, (3)10000 V até 11300 Vh e (4) 10000 V até 2000 Vh.

Após a focalização, a fita foi equilibrada em duas etapas de 15 min cada,

sendo a redução e alquilação das proteínas, com DTT e iodoacetamida,

respectivamente. Após essa etapa a fita foi, então, fixada sobre um gel de

poliacrilamida 12 % para a obtenção da segunda dimensão. A corrida da

segunda dimensão foi realizada em duas etapas. Na primeira foi aplicado 90 V,

25 mA gel-1 e 100 W durante 30 min e na segunda 250 V, 25 mA gel-1 e 100 W

por aproximadamente 6 h. Por fim, as proteínas fixadas no gel foram fixadas com

solução contendo 40 % (v∕v) de etanol e 10 % (v∕v) de ácido acético por 1h e, em

seguida, reveladas empregando o corante Comassie Blue concentrado por 45

min. A remoção do corante foi realizada a partir de lavagens sucessivas com

água deionizada por aproximadamente 3 dias.

O gel obtido foi escaneado e sua imagem analisada pelo programa de

imagens ImageMaster 2D Platinum versão 6.0, que permite obter uma estimativa

do número de spots obtidos no gel de eletroforese.

1.3.4 Quantificação relativa das proteínas de soja por 2-D DIGE

A extração das proteínas das sementes de soja provenientes das

diferentes gerações para a quantificação relativa por 2 D-DIGE foram realizadas

da mesma maneira descrita no item 1.3.3.; no entanto, a partir da primeira etapa

28

de separação a massa utilizada e marcada com os corantes CyDyeTM DIGE

Fluors foi de 50 µg de proteínas para cada amostra e 50 µg de padrão interno

(que consiste em 25 µg de cada amostra do grupo). Os corantes Cy2, Cy3 e Cy5

foram misturados com as proteínas de cada amostra, de forma que cada amostra

fosse marcada com 400 pmol do corante selecionado. A reação foi feita à 4°C

durante 30 min e foi cessada com 1 µL de lisina 10 mmol L-1 durante 10 min (no

escuro). As amostras (padrão interno marcado com Cy2 e duas amostras

marcadas com Cy3 e Cy5) foram misturadas, e em seguida, levadas a um

volume de 250 µL com tampão de hidratação (descrito anteriormente, item 5.3.)

juntamente com 0,002% (m/v) de azul de bromocressol. A separação

eletroforética ocorreu da mesma maneira descrita no item 5.3. As imagens dos

géis foram obtidas por um scanner especifico para detectar a fluorescência dos

corantes utilizados na marcação das amostras e a análise das imagens realizada

com o programa DeCyderTM 2D-Differential Analysis Softwere v7.0 (GE

Healthcare), empregando o programa DIA (do inglês, differential in-gel analysis),

que permite avaliar os spots diferenciais, em termos de abundância, entre as

amostras marcadas com os corantes Cy3 e Cy5, sendo seus sinais normalizados

pelo corante Cy2 (utilizado como padrão interno). Um fator de variação de 2,0

(100% de variação) foi empregado para determinar as proteínas diferenciais. A

Figura 2 resume esse procedimento. Cada grupo de amostra foi avaliado em

duplicata de acordo com a Tabela 1.

29

Figura 2. Procedimento experimental para a separação e quantificação relativa das

proteínas por 2-D DIGE. Adaptado de Galazzi, 2017.

Tabela 1. Marcação das amostras de soja e seu respectivo corante

Géis Grupo Cy2 Cy3 Cy5

1-2 T1G x NT1G T1G/NT1G T1G NT1G



7-8 T1G x T2G T1G/T2G T1G T2G



13-14 NT1G x NT2G NT1G/NT2G NT1G NT2G



Onde: T = transgênica; NT = não transgênica; 1, 2 e 3G = primeira, segunda e terceira geração,

respectivamente.

1.3.5 Digestão com tripsina in gel das proteínas

Cada spot considerado diferencial em termos de abundância foi recortado

do gel de poliacrilamida com o auxílio de uma ponteira de polietileno e colocado

30

em uma placa de ELISA. O processo de lavagem consistiu em agitação

constante durante 1h com 100 μL de solução de lavagem [100% ACN:100 m mol

L-1 AmBic (1:1)] por três vezes. Os pedaços de géis foram desidratados com 100

μL de acetonitrila (ACN) e reidratados com solução redutora (10 mmol L-1 de DTT

em 100 mmol L-1 de AmBic) por 30 min à 56 °C. Após essa etapa, novamente,

os pedaços de géis foram desidratados com 100 μL de ACN e reidratados com

solução de alquilação (50 mmol L-1 de IAA em 100 mmol L-1 de AmBic) por 30

min na ausência de luz e em temperatura ambiente. Após essa etapa, foi

realizada a desitradatação com ACN e, em seguida, realizou-se a etapa de

digestão com solução de tripsina overnight à 37 °C. Após esse período, foram

adicionados 200 μL de solução de extração [5% ácido fórmico:100% ACN (1:2)]

e foi deixado sob agitação por 30 min (2x). O líquido sobrenadante foi coletado

em microtubos. Os peptídeos extraídos foram secos em SpeedVac e

armazedados em -80 °C até sua ressuspensão em 0,1% (v/v) de ácido fórmico

para posterior análise por espectrometria de massas.

1.3.6 Identificação das proteínas

As análises das proteínas digeridas em peptídeos foram realizadas em

um HPLC (do inglês – High Pressure Liquid Chromatography) de nano fluxo

(Easy nLC, Thermo Fisher Scientific) acoplado on-line a um espectrômetro de

massas do tipo QExactive [Orbitrap (Thermo Scientific)] com fonte de ionização

nanoeletrospray (Proxeon). Os peptídeos foram carregados em uma coluna de

fase reversa do tipo C18 (10 cm de comprimento e 75 μm de diâmetro interno) e

separados através de um gradiente linear de 5-95% da solução B (0,1 % de ácido

fórmico em ACN) com vazão de 20 μL min-1 controlado por IntelliFlow durante

120 min configurado para operar em modo de aquisição dependente de dados

(DDA), contendo uma função de MS fullscan (m/z 200 a 2000). Os peptídeos

foram ionizados em modo positivo com 2.1 kV em 250 °C. O espectrômetro de

massas foi controlado pelo software XCalibur 2.0 (Thermo Scientific) e os dados

foram processados no Proteome Discovery 2.0.

31

1.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

1.4.1 Plantio e Cultivo da soja

As variedades de sementes de soja MSOY 7211RR (T) e MSOY 8200

(NT) para obtenção da segunda geração de sementes foram plantadas no

período de janeiro até maio do ano de 2014. A Figura 3 apresenta algumas

imagens exibindo o desenvolvimento morfológico das plantas em seus diferentes

estágios.

32

Figura 3. Desenvolvimento morfológico da soja: (A) germinação, (B) crescimento vegetativo, (C) florescimento, (D) desenvolvimento da vagem,

(E) crescimento das sementes dentro da vagem e (F) maturidade completa.

33

Por meio da Figura 3, nota-se que o plantio se mostrou adequado para o

desenvolvimento das plantas e obtenção das sementes. Neste momento, é

importante ressaltar que a solução nutritiva foi adicionada depois de

aproximadamente 15 dias da emergência das plantas, pois as reservas nutritivas

armazenadas nos cotilédones suprem as necessidades da planta jovem depois

do estágio de emergência, ou até próximo estágio onde aparece o primeiro nó,

com o objetivo de melhorar a nutrição da planta (IPNI, 2015). O controle químico

aplicado foi eficiente para combater alguns fungos que foram observados com

aproximadamente 40 dias de cultivo nas plantas, e, assim, a planta se

desenvolveu normalmente.

Na Figura 4 é observado o estágio de florescência e a formação da vagem

das plantas de soja T e NT. O cultivar MSOY 7211RR apresenta uma flor roxa,

enquanto o cultivar MSOY 8200 a cor da flor é branca. Esta é a descrição

morfológica mais segura para a diferenciação dos cultivares T e NT dessas

variedades.

Figura 4. Plantas de soja no estágio de florescência (A) transgênica e (B) não-

transgênica.

Foi possível observar que as plantas T apresentaram uma maior

produtividade, ou seja, maior quantidade de sementes por planta, além da

maturidade completa da planta se dar em aproximadamente 20 dias antes das

plantas NT.

(A) (B)

34

Quanto ao segundo plantio, que iniciou em janeiro de 2015, para obtenção

das sementes de terceira geração, a colheita foi realizada em maio de 2015 e os

estágios pelos quais as plantas passaram foram semelhantes aos observados

na Figura 2.

1.4.2 Separação das proteínas

A separação das proteínas extraídas das sementes de soja T e NT foi

realizada de acordo aos procedimentos descritos por Barbosa (2011) e Sussulini

(2007). A separação ocorreu por meio da técnica de eletroforese em gel de

poliacrilamida (2-D PAGE), pois esta permite separar as proteínas de acordo

com seu ponto isoelétrico em fita pré-fabricada em pH 4-7 e massa molecular,

gerando assim, um perfil de proteínas representado por spots como representa

a Figura 5. A primeira dimensão foi realizada em pH 4-7, pois em trabalhos

anteriores foi observado um maior número de proteínas nessa faixa para

sementes de soja (Barbosa, 2011 e Brandão et al., 2010).

35

Figura 5. Mapa proteico obtido por meio da técnica de separação de proteínas 2-D PAGE das sementes de soja (A) T e (B) NT de primeira

geração. MM significa a massa molecular e pH variando de 4-7.

(A) (B)

pH pH 4 7 4 7

200

116

97

66

45

31

21

14

6

MM

36

O perfil proteômico obtido para as três gerações e variedades de

sementes é semelhante aos observados na Figura 5, e também, aos

apresentados por Barbosa (2011) em seu trabalho de Tese, sendo que a

separação foi considerada adequada para as análises por 2-D DIGE. Apesar do

perfil muito semelhante entre as gerações e variedades de soja estudadas, um

indicativo de que existem proteínas diferenciais entre as mesmas pode ser

observado na Figura 6, onde o spot é mais intenso na amostra não-transgênica

do que na transgênica, mostrando, assim, uma diferença no perfil químico das

sementes.

Figura 6. Região ampliada do mapa proteico das sementes de soja segunda geração

para (A) e (C) não transgênica e (B) e (D) transgênica. (C) e (D) são imagens obtidas

no programa em 3 dimensões.

37

1.4.3 Quantificação relativa das proteínas diferenciais por 2-D DIGE A técnica de 2D-DIGE foi utilizada para a quantificação relativa das

proteínas entre as sementes de soja T e NT e entre as gerações. O fator de

diferenciação foi considerado como sendo ≥ 2,0, ou seja, 100% de variação,

conforme determinado pelo programa de análise das imagens (software Decyder

2D). Na análise estatística, foi considerado um valor de p ≤ 0,1 de acordo com

teste t de Student. A Figura 7 foi obtida no programa de tratamento das imagens

e representa o gel obtido por 2-D DIGE para proteínas das sementes de soja de

primeira geração. Os corantes fluorescentes quais realizaram a marcação das

amostras como mencionado no item 1.3.5 dessa Tese, sofrem uma reação de

substituição nucleofilica com o grupo Ɛ-amido dos resíduos de lisina para formar

uma amida. Os corantes são positivamente carregados para compensar a carga

da lisina que é perdida na reação de marcação. Aproximadamente 1-3% da

concentração de cada proteína são marcadas por esta técnica, cada uma com

uma única molécula do corante. Isso faz com que esta técnica seja

extremamente dinâmica permitindo que todas as proteínas visualizadas sejam

quantificadas (Barbosa, 2011).

38

Figura 7. Análise por 2-D DIGE (pH 4-7) para sementes de soja T e NT de primeira

geração. Spots marcados em azul representam maior abundância na amostra

transgênica e spots marcados em vermelho representam maior abundância na amostra

não transgênica.

Na Figura 7, observam-se spots marcados em azul. Esses representam

proteínas menos abundantes marcadas com CY5, ou seja, na amostra NT1G

(Tabela 1) e somam 9 nesta análise. Em vermelho, são proteínas mais

39

abundantes, também em CY5 e somam 14, num total de 25 proteínas

diferenciais para esse grupo. O contrário é verdadeiro para o CY3, ou seja, para

a amostra T1G. O spot marcado em amarelo mostra a abundância relativa entre

a mesma proteína em diferentes amostras, ou seja, entre T e NT, por exemplo.

Os outros 8 grupos estudados, como mencionado na Tabela 1, foram analisados

da mesma maneira, e foi observado um total de 91 proteínas diferenciais ao todo.

As Figuras encontram-se no anexo I. A Tabela 2 mostra esses resultados, sendo

a quantidade total de proteínas diferenciais foram maior que 91, pois muitas das

proteínas se repetem entre os grupos.

Tabela 2. Quantidade de proteínas diferenciais por grupo estudado

Grupo Número de proteínas diferenciais

T1G x NT1G 24

T2G x NT2G 19

T3G x NT3G 36

T1G x T2G 16

T1G x T3G 17

T2G x T3G 4

NT1G x NT2G 21

NT1G x NT3G 43

NT2G x NT3G 23

Por meio da Tabela 2, é possível observar que as diferenças proteicas

entre as gerações de soja T foram menores do que entre a NT. Isso pode ser

justificado devido ao fato da soja T poder ser considerada mais robusta, e, sendo

assim, se adaptou melhor às pequenas variações climáticas ou de cultivo. As

diferenças observadas entre T x NT das diferentes gerações não apresentam

uma tendência em relação ao aumento da variação ou não. No entanto,

considerando que a primeira geração, ou seja, a semente precursora, é

proveniente de cultivo realizado em campo, e as demais de cultivo realizado em

casa de vegetação, as variações observadas podem ser consideradas

proveniente da mudança de solo, temperatura e umidade, por exemplo.

Entretanto, se considerarmos somente a segunda e terceira geração (que foram

40

obtidas em condições idênticas de cultivo), pode-se estimar um aumento de

proteínas diferenciais entre as sementes T e NT. Todas as proteínas diferenciais

encontradas no grupo T são mais abundantes na 3G em relação a 2G, enquanto

no grupo NT apenas 5, em um total de 23, são mais abundantes.

Em comparação ao trabalho desenvolvido por Barbosa (2011), que

realizou o estudo comparativo entre sementes de soja T e NT por 2D-DIGE, o

mesmo encontrou apenas 4 proteínas diferenciais; no entanto, as variedades

das sementes não são as mesmas das utilizadas nesse trabalho, o que justifica

o fato do número de proteínas diferenciais ser maior nesse estudo.

Com esses resultados, não é possível afirmar que tais mudanças sejam

causadas inerentemente pela inserção do gene da transgenia na planta, mas

pode-se estimar que a planta transgênica é mais resistente às variações

ambientais naturais de cultivo que as plantas não-transgênicas.

1.4.4 Identificação das proteínas diferenciais por

espectrometria de massas

Das 91 proteínas diferenciais observadas de acordo com o item 1.4.3, 72

puderam ter a análise realizada (devido à resolução do gel obtido) por um

espectrômetro de massas do tipo LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific) em parceria

com o Dr. Tiago S. Balbuena da UNESP de Jaboticabal-SP. A Tabela 3

apresenta os resultados obtidos. A Figura 8 apresenta os spots marcados para

a identificação e a região dos mesmos. A Tabela 3 e Figura 8 são

complementares para o entendimento dos dados.

41

Figura 8. Gel 2-D marcado com cada spot considerado diferencial (fator de diferenciação > 2,0 e p-value > 0,01) entre os grupos de sementes de soja

estudados por 2-D DIGE, num total de 91.

42

Tabela 3. Identificação dos spots diferenciais (vide Figura 8) das sementes de soja T e NT de diferentes gerações por espectrometria de massas

do tipo LTQ-Orbitrap. Acesso = código da proteína; PSM = peptide spectrum match (número de espectro MS2 adquiridos para cada proteína); Variação =

diferença entre a abundância dos spots no gel experimental.

T1G x NT1G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM [kDa]

pI Variação

1 NR

2 NR

3 Glyma.12G213600.1.p Protease inhibitor/seed storage/LTP family (Tryp_alpha_amyl)

40,43 15,48 13 17,8 6,38 -5,13

4 Glyma.11G117300.1.p RNA recognition motif. (a.k.a. RRM, RBD, or RNP domain) (RRM_1)

21,54 21,05 7 16,6 5,63 -3,08

5 NR

6 Glyma.01G095000.1.p KUNITZ FAMILY TRYPSIN AND PROTEASE INHIBITOR PROTEIN-RELATED

28,07 13,30 10 22,4 5,01 3,69

7 NI


78,72 17,24 25 22,6 7,24 -4,21


12,10 8,76 4 24,1 5,11 2,06

10 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 76,66 15,76 23 43,4 5,22 -2,69

11 NR

12 Glyma.03G163500.4.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 54,92 9,02 18 54,6 5,38 2,30

13 Glyma.20G164700.1.p Chitinase / Poly-beta-glucosaminidase 22,1 10,21 8 37 5,08 -5,72

14 Glyma.13G223700.2.p Protein of unknown function (DUF1264) (DUF1264) 34,24 41,74 12 27,3 6,10 2,08

15 Glyma.02G012600.1.p Legume lectin domain (Lectin_legB) 37,92 17,19 12 30,9 6,05 2,18

16 Glyma.02G012600.1.p Legume lectin domain (Lectin_legB) 7,52 12,28 3 30,9 6,05 -2,23





43

21 Glyma.10G155300.1.p GLUCOSE AND RIBITOL DEHYDROGENASE HOMOLOG 1-RELATED

45,64 24,57 13 31,8 7,36 2,11

22 Glyma.20G148400.2.p Cupin (Cupin_1) 14,93 11,25 4 63,2 5,05 -2,93

23 NI

24 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 12,14 6,69 3 67,9 6,58 3,32


pI Variação


28,07 13,30 10 22,4 5,01 -3,90

7 NI

11 NR



45,64 24,57 13 31,8 7,36 -2,42


25 NR

26 NR

27 Glyma.01G177000.1.p CUPIN FAMILY PROTEIN 11,32 5,70 3 71,7 5,49 2,20

28 Glyma.09G185500.1.p Dehydrin (Dehydrin) 14,05 28,85 5 26,6 6,8 13,96

29 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 124,97 28,93 37 50,4 6,24 3,36

30 Glyma.12G159300.1.p Malate dehydrogenase / Malic dehydrogenase 9,32 7,54 3 36,1 8,12 -2,55





35 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 498 46,92 148 50,4 6,24 2,12

36 Glyma.13G149000.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN (ATECP63)-RELATED

46,88 22,68 13 50,6 6,67 2,17


44


pI Variação


78,72 17,24 25 22,6 7,24 -3,45









23 NI


26 NR

27 Glyma.01G177000.1.p CUPIN FAMILY PROTEIN 11,32 5,70 3 71,7 5,49 -3,16






35 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 498 46,92 148 50,4 6,24 -5,33


38 NR


21,54 21,05 7 16,6 5,63 -2,30

40 NR


42 NR

45


44 Glyma.06G170900.2.p ELONGATION FACTOR 1-BETA 5,31 9,42 2 20,7 4,6 8,31




48 NI


50 NI

51 Glyma.10G064400.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN (ATECP63)-RELATEDLinksB Pm

87,5 35,63 27 48,8 6,42 2,76

52 NI

53 Glyma.10G246300.1.p Cupin 77,49 21,1 22 72,2 5,71 6,37

T1G x T2G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM [kDa]

pI Variação


21,54 21,05 7 16,6 5,63 -2,30

16 Glyma.02G012600.1.p Legume lectin domain (Lectin_legB) 7,52 12,28 3 30,9 6,05 -2,78




38 NR


21,54 21,05 7 16,6 5,63 -2,83


50 NI



56 NR

57 NR

46

58 Glyma.20G148400.1.p Cupin 97,11 10,58 24 70,3 5,17 -2,33

59 NI


96,85 34,99 29 50,6 6,67 2,31


pI Variação


21,54 21,05 7 16,6 5,63 -5,03





38 NR

50 NI


87,5 35,63 27 48,8 6,42 3,35


59 NI

61 Glyma.09G185500.1.p Dehydrin (Dehydrin) 22,88 28,06 7 26,6 6,8 -3,35




65 Glyma.20G146200.1.p Cupin 161,08 45,33 44 50,4 6,24 -5,04




pI Variação



47

52 NI

68 NI

NT1G x NT2G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM [kDa]

pI Variação


78,72 17,24 25 22,6 7,24 2,34




45,64 24,57 13 31,8 7,36 -2,15


38 NR

57 NR


65 Glyma.20G146200.1.p Cupin 161,08 45,33 44 50,4 6,24 -4,32


69 NR

70 NR


5,44 13,92 2 18,4 5,34 3,48

72 NI


9,04 15,82 3 18,4 5,34 3,08

74 NI


31,52 13,92 11 18,4 5,34 2,06

76 NR

77 NR

78 NR


66,12 35,64 18 50,6 6,67 2,28

48


pI Variação



25 NR

26 NR

27 Glyma.01G177000.1.p CUPIN FAMILY PROTEIN 11,32 5,70 3 71,7 5,49 -3,64





40 NR


44 Glyma.06G170900.2.p ELONGATION FACTOR 1-BETA 5,31 9,42 2 20,7 4,6 3,51




48 NI



87,5 35,63 27 48,8 6,42 3,95


59 NI


65 Glyma.20G146200.1.p Cupin 161,08 45,33 44 50,4 6,24 -6,97



70 NR

49


5,44 13,92 2 18,4 5,34 5,78

72 NI


9,04 15,82 3 18,4 5,34 3,27

74 NI

77 NR

78 NR


66,12 35,64 18 50,6 6,67 2,62


87,9 27,1 27 17,8 6,38 2,97

81 NI

82 NR

83 NR


85 NI

86 NR



20,84 14,63 7 31,6 6,84 -5,09

89 Glyma.03G189200.2.p Late embryogenesis abundant protein (LEA_4) 23,42 25,24 9 34,5 6,19 -2,72

90 Glyma.10G028300.1.p Cupin 49,51 21,83 14 58 6,49 -2,12


pI Variação

7 NI


78,72 17,24 25 22,6 7,24 -2,23




50

25 NR

28 Glyma.09G185500.1.p Dehydrin (Dehydrin) 14,05 28,85 5 26,6 6,8 -7,06






40 NR







87,5 35,63 27 48,8 6,42 2,92


85 NI


91 Glyma.15G050200.1.p ACTIN 92,96 34,75 31 41,6 5,49 -2,50

NR = não recortado do gel/não levado a identificação. NI = não identificado por MS.

51

Das 72 proteínas levadas para a identificação, 61 tiveram sua identidade

conhecida de acordo com a Tabela 3. Um ponto importante a ser considerado

no processo de identificação foi sua eficácia de 84%, Barbosa (2011) identificou

apenas 49% por metodologia semelhante. O aumento do número de spots

identificados pode estar relacionado com o analisador de massas utilizado nesse

trabalho (Orbitrap), o qual é considerado de alta resolução, melhorando os

resultados nas análises proteômicas. Relacionado ao processo de identificação,

alguns spots apresentaram mais de uma identidade, o critério de seleção foi de

acordo com o score e PSMs apresentado por cada proteína, uma vez que cada

spot pode apresentar mais de uma possível proteína durante a identificação.

Utilizando o banco de dados de soja (Glycine max. Wm82.a2.v1) e Arabidopsis

thaliana, no site Phytozome (versão 12.1) as proteínas identificadas puderam ser

classificadas de acordo com atividade biológica em categorias. A Figura 9

representa as principais classes observadas.

Figura 9. Distribuição funcional das proteínas diferenciais identificadas entre os grupos

de soja transgênica e não-transgênica estudados por 2-D DIGE.

No geral, observa-se na Figura 9, que a maioria das proteínas diferenciais

identificadas corresponde aos processos de armazenamento e defesa da planta.

Esse resultado já era esperado visto que as proteínas de armazenamento

correspondem a 70-80% das proteínas totais da soja (Sebastiani, et. al., 1990).

59%

10%

2%

25%

2% 2%

Armazenamento Metabolismo Transporte

Defesa Divisão Celular Não identificada

52

O maior número de proteínas de armazenamento foi encontrado para a

superfamília Cupin. São conhecidas cerca de 18 classes funcionais diferentes

para essa superfamília, que variam de enzimas bacterianas de domínio único,

como isomerases e epimerases envolvidas na modificação de carboidratos da

parede celular, através de bicupins de dois domínios, tais como globulinas de

armazenamento de sementes tolerantes à dessecação e fatores de transcrição

de vários domínios, incluindo um ligado à resposta de nodulação em

leguminosas (Dunwell, et. al. 2004).

À tal família, pertencem as proteínas de armazenamento com diferentes

isoformas, tais como, beta-conglinina ’, e β, glicinina e suas subunidades (G1-

G5) entre outras. Durante o enchimento das sementes, essas proteínas são

reguladas por uma ampla rede fisiológica e genética da soja (Schmidt et al.,

2011) e é conhecido que as proteínas de armazenamento de sementes estão

envolvidas na síntese de amino ácidos e transporte de nitrogênio da planta (Cao

et al., 2016).

Até o momento, não foi reportado na literatura nenhuma relação das

proteínas diferenciais encontradas neste trabalho com os processos de

modificação genética. No entanto, três das quatro proteínas diferenciais

reportadas por Barbosa (2011) foram encontradas nesse trabalho, sendo elas:

Actin – que é considerada uma proteína de armazenamento e encontrada em

todas as células eucariotas, podendo se ligar a ATP e outras proteínas; RNA

recognition motif. – que é uma proteína que se liga ao DNA e RNA em plantas,

e está envolvida na resposta celular ao ambiente e condições de

desenvolvimento; superfamília Cupin – que é considerada a principal proteína de

armazenamento nas sementes de soja, e é responsável pelas propriedades

nutricionais da planta. Porém, vale ressaltar que as sementes estudadas por

Barbosa não são da mesma variedade das empregadas nesse trabalho.

Schmidt et. al. (2011), utilizaram soja transgênica para verificar a resposta

em silenciar proteínas de armazenamento das sementes, como beta-conglicina.

Essas proteínas são as mais abundantes nas sementes de soja como

mencionado anteriormente. Depois de análises proteômicas e metabolômicas

nas sementes, foi observado que a soja busca um reequilíbrio proteico,

mantendo sua concentração de proteínas a mesma, metabolizando o que lhe foi

silenciado em outras classes de proteínas, ou seja, alterando sua composição

53

proteica. Esse reequilíbrio é devido a pequenas alterações no transcriptoma e

metaboloma das sementes.

Pode-se estimar que a soja transgênica esteja buscando esse reequilíbrio

citado por Schmidt et. al. (2011) depois de sofrer a modificação genética, uma

vez que, de acordo com a Tabela 4, quando comparados os grupos de soja T x

NT, as proteínas que sofreram maior alteração em seu conteúdo foram proteínas

classificadas como de armazenamento.

Um fato curioso é que a enzima Malate dehydrogenase foi encontrada

como diferencial apenas no grupo T2G x NT2G. Essa é uma enzima que catalisa

reversivelmente a oxidação do malato em oxaloacetato usando a redução de

NAD+ para NADH. Esta reação é parte de muitas vias metabólicas, incluindo o

ciclo do ácido cítrico. Esta enzima está menos abundante na variedade NT, o

que pode explicar a alta produtividade das sementes transgênicas. Também a

proteína Late embryogenesis abundant (LEA), pertencente à classe de

crescimento e divisão celular, foi observada apenas no grupo T2G x NT2G, onde

encontra-se mais abundante na variedade NT. As proteínas LEA protegem as

membranas mitocondriais contra a desidratação e são bastante acumuladas nos

últimos estágios da embriogenese, ou seja, as sementes NT precisaram

desenvolver mais LEA proteínas para o seu desenvolvimento do que as

sementes T. Outra proteína pertencente ao grupo LEA é a Dehydrin, também foi

observada diferencial e esta envolvida em processos de desitatração e stress à

baixas temperaturas.

A proteína Kunitz pertence à classe dos inibidores de proteases e

apresenta massa molecular próxima de 22 kDa atuando como inibidor da

atividade da enzima tripsina. Essa proteína foi observada como diferencial em

todos os grupos T x NT, sendo nos grupos dois e três menos abundante na

variedade não transgênica. Chitinase foi observada como diferencial em todos

os grupos T x NT e mostrou-se em menor abundância nas variedades NT. Esta

proteína é especificamente expressa nos estágios de desenvolvimento da

planta. Como as plantas transgênicas historicamente apresentam um melhor

desenvolvimento e produtividade se comparadas à variedade NT, esse resultado

está de acordo com o esperado.

Não se pode afirmar que as proteínas diferenciais são relativas ao gene

da transgenia, mas podem ser atribuídas às pequenas variações ambientais. A

54

soja T se mostrou mais resistente em relação a essas variações, bem como em

trabalho recente desenvolvido por Wang et. al. (2012). A análise proteômica

comparativa entre sementes de arroz T e NT, mostrou que 21 proteínas são

mais, ou menos, abundantes devido às condições ambientais e de crescimento,

e não somente devido a inserção de um gene na planta. Isto ocorre porque uma

planta transgênica pode estar em diferentes condições ambientais e de

crescimento ser mais resistente com relação ao seu homólogo não transgênico.

De maneira semelhante, Agapito-Tenfen et. al. (2013) avaliaram as diferenças

entre milho T e NT, e os resultados mostraram que o meio ambiente foi a principal

fonte de influência sobre a expressão das proteínas do milho geneticamente

modificado. Essa observação indica que as mudanças no genoma do milho

podem ter efeito não somente sobre a expressão do gene, mas, também possuir

uma influência ambiental significativa. Tais mudanças não resolvem as questões

de segurança alimentar e mais estudos são necessários.

Com relação à segurança alimentar ao consumo de alimentos

transgênicos, Zhou et. al. (2012) avaliaram três gerações de ratos que foram

alimentados com arroz transgênico. A dieta dos ratos foi elaborada de modo que

um grupo fosse alimentado à base de arroz transgênico, outro grupo arroz

convencional, e, ainda, outro grupo controle. Análises hematológicas foram

realizadas a fim de avaliar o teor de células brancas, vermelhas, hemoglobina,

contagens de plaquetas, entre outras, no organismo dos roedores. Os resultados

após a dieta aplicada as três gerações de ratos mostraram que não houve

diferença significativa entre o consumo do arroz transgênico ou convencional.

Dessa forma, concluíram que não há problema em ministrar arroz transgênico à

dieta de ratos. Conclusões a respeito do consumo de transgênicos em seres

humanos ainda não são encontradas na literatura.

1.4.5 Conclusão Parcial

Pode-se concluir que o cultivo das sementes de soja T e NT em casa de

vegetação foi eficiente, pois conseguiu-se atingir o estágio de obtenção de

sementes. A extração e separação das proteínas presentes nas sementes de

soja também se mostraram adequadas. Com o perfil proteômico obtido, foi

possível realizar o estudo por 2-D DIGE, que permitiu a visualização dos spots

55

diferenciais, em termos de abundância, entre as gerações das sementes de soja

T e NT. O número de identificação atribuído aos spots foi considerado satisfatório

com 84%. Nesse sentido, a soja transgênica pode ser considerada mais robusta

em comparação com a não-transgênica, pois, um menor número de spots

diferenciais foi observado entre as sementes T de diferentes gerações.

56

Capítulo 2-

Análise metabolômica de duas

gerações de soja transgênica e não-

transgênica

57

2.1 INTRODUÇÃO Os metabólitos são moléculas pequenas (até 1000 Da) que são

quimicamente transformadas durante o metabolismo de um organismo,

proporcionando uma leitura funcional do estado celular. Ao contrário dos genes,

RNA e proteínas, que estão sujeitos a regulação epigenética e modificações pós-

traducionais, os metabólitos não são codificados diretamente no genoma, mas

eles servem como uma assinatura direta de uma atividade bioquímica. Por esta

razão, os metabólitos são diretamente correlacionados com o fenótipo, sendo

uma ferramenta útil para a caracterização de amostras biológicas e relacionando

a atividade molecular celular com o fenótipo da planta (Baker, 2011; Patti, 2011).

Geralmente, a classe dos metabólitos inclui espécies orgânicas, tais como

aminoácidos, ácidos graxos, carboidratos, lipídeos e vitaminas, bem como

espécies inorgânicas e elementares.

Determinar a composição química de um organismo é uma tarefa

desafiadora devido à alta, rica e complexa diversidade química em um extrato

bruto. Estima-se que o reino vegetal apresente mais de 200.000 metabólitos, no

entanto, apenas um quarto deles tiveram sua composição conhecida (Oksman-

Caldentey et al., 2004). O desenvolvimento da metabolômica fornece a

informação necessária sobre os níveis de metabólitos que permitem a avaliação

de mudanças para respostas a diferentes perturbações do organismo. Esta

perturbação pode ser devido a, por exemplo, produtos farmacêuticos, estresse

ambiental, mudanças relacionadas à dieta, modificações genéticas ou

contaminantes dos alimentos.

Assim como em proteômica, para determinar a composição total de

metabólitos em um organismo são necessárias técnicas de alta precisão e

sensibilidade. Avanços em tecnologias no campo da metabolômica com técnicas

hifenadas de separação e identificação e alta resolução de espectros de massa

tem contribuído para a elucidação desses desafios. As técnicas de separação

como eletroforese capilar (CE, do inglês - Capillary electrophoresis),

cromatografia líquida (LC, do inglês - liquid chromatography) e cromatografia

gasosa (GC, do inglês – gas chromatography) acoplada à espectrometria de

massa (MS) foram recentemente comparada para determinar qual a técnica mais

apropriada para a quantificação de metabólitos. Com base na cobertura,

58

sensibilidade, facilidade de uso, robustez à matriz e na operação de rotina, a

técnica de LC foi identificada como a plataforma ideal para separações dos

metabólitos (Buscher et al., 2009). A maior vantagem de utilizar LC é que é

compatível com os solventes geralmente utilizados para extração das amostras

como metanol e água, compostos polares de alta massa molecular podem ser

analisados sem reações de derivatização e LC-MS/MS também possibilita obter

a informação estrutural dos compostos (de Voz, et al., 2006).

Grande parte do sucesso da LC é baseado no método de eluição por fase

reversa que apresenta algumas vantagens em comparação com a fase normal,

entre elas pode-se citar o uso de uma fase móvel menos tóxica, fases

estacionárias estáveis, rápido equilíbrio de coluna depois de mudar a fase móvel

e, ainda, o fácil uso de eluição por gradiente com boa reprodutibilidade nos

tempos de retenção (Osiso, et al., 2008).

As técnicas analíticas para identificação dos metabólitos mais utilizadas

são: ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massas (MS, do

inglês - mass spectrometry). Devido a limitações de sensibilidade em

RMN, a aplicação da MS neste campo está crescendo cada vez mais. Como

escrito no capitulo 1, a MS é uma técnica analítica que permite discriminar íons

de acordo com a relação massa/carga (m/z) de cada espécie analisada. Para

isso uma fonte de ionização é necessária, um analisador de massas e um

detector. Novamente analisadores de alta resolução como TOF e armadilha de

íons (Orbitrap), são os mais utilizados em estudos metabolômicos.

A ionização por eletrospray (ESI, do inglês – electrospray ionization) é

comumente empregada por ser considerada suave e pode ionizar desde grandes

moléculas como as proteínas até pequenas moléculas como os metabólitos. O

processo de ionização ocorre devido a uma alta tensão na fonte que está em

contato com a solução contendo os analitos. Nesta solução é aplicado um

potencial positivo ou negativo o qual gera os íons por redução ou oxidação. A

evaporação do solvente ocorre por meio de um fluxo de gás aquecido

(nitrogênio) permitindo que apenas íons isentos de solvente sejam

encaminhados ao analisador.

O analisador de massas do tipo TOF baseia-se na teoria de que a massa

de um íon está relacionada a velocidade do seu vôo ao longo do tubo e, portanto,

o tempo de chegada no detector é proporcional a sua massa. Já os analisadores

59

baseados em armadilhas de íons são ligeiramente diferentes. O objetivo é isolar

íons de baixa abundância enquanto estão presos, construindo uma população

de íons específicos para as análises posteriores (Mokochinski, 2017).

Os métodos de análise de um metaboloma continuam em

desenvolvimento, mas basicamente, podem ser resumidos em três formas. Uma

delas é a análise de metabólitos alvo, onde um pequeno conjunto ou classe

especifica de moléculas são pré-selecionadas e a análise é focada nesse grupo.

Para isso curvas de calibração e padrões de comparação são necessários e as

respostas são obtidas em concentração (targeted metabolomics). Outro método

é a análise de um perfil metabólico, neste, é realizado a identificação e a

quantificação relativa do número máximo de metabólitos (targeted

metabolomics). Para isso, os espectros de massa são processados e

convertidos em ID’s usando um software adequado e a comparação entre as

áreas dos picos é realizada. Por fim, um fingerprint metabólico também pode ser

adquirido (untargeted metabolomics). Esta é uma análise rápida de classificação

da amostra contendo metabólitos sem a realização de identificação dos

compostos. As amostras geralmente são injetadas no espectrômetro de massas

com separação prévia em cromatografia líquida ou gasosa e os dados podem

indicar diferenças entre as amostras em questão se utilizado um programa de

analise multivariada adequado (Vilas-Bôas e Gombert, 2006).

Os estudos em metabolômica seguem algumas etapas básicas, iniciando

com o objeto de estudo, que pode ser a comparação de diferentes tratamentos

aplicados em uma amostra por exemplo, seguindo por um fluxo de trabalho, que

é a parte mais importante da metodologia. O fluxo geralmente envolve o preparo

da amostra com posterior aquisição de dados, seguido do processamento de

dados e análise estatística, por fim, a identificação dos metabólitos. A última

etapa realizada é a interpretação biológica com base nos metabólitos

identificados.

Normalmente, os dados multidimensionais são convertidos em gráficos

2D ou 3D, permitindo uma interpretação visual mais significativa. Uma análise

muito comum é a PCA (do inglês, Principal Component Analysis), que é uma

análise exploratória e é baseada na redução dos dados, onde informações

desnecessárias como ruído e resíduos dão descartados.

60

Outro método exploratório destinado a encontrar similaridade entre as

amostras é o HCA (do inglês, Hierarchical Cluster Analysis) que usa informações

para combinar um cluster (aglomerado), medindo diferenças em conjuntos de

observações. Por outro lado, se o objetivo da análise de dados for a classificação

ou regressão dos dados, modelos preditivos como PLS (do inglês, Partial Least

Squares) podem ser utilizados.

Neste sentido, um estudo mostrou a importância da luz para o crescimento

e enchimento das sementes de soja por meio dos metabólitos, uma vez que a

luz induz a geração de ATP (Allen, 2009). Outro estudo mostrou que a

germinação das sementes foi regulada pela produção de etileno e espécies

reativas de oxigênio (ROS) (Ishibashi, 2013). Um estudo comparativo realizado

na Espanha entre os metabólitos da soja T e NT foi obtido por meio da

eletroforese capilar acoplada a um espectrômetro de massas (TOF). Os autores

indicam que muitos dos metabólitos encontrados não são alterados entre as

variedades T e NT. No entanto, alguns deles apresentam diferenças

significativas, como prolina, histidina, aspargina e ácido glucônico, que estão

mais abundantes na soja convencional do que na transgênica (Garcia-Villalba et

al., 2008).

A utilização de analisadores de relação m/z de alta resolução como FT-

ICR para a análise metabolômica vem sendo pouco relatada devido ao alto custo

do equipamento e a quantidade de dados gerados. No entanto, este pode

fornecer análises precisas e exatas permitindo obter uma correspondência entre

massas exatas para composições elementares a possíveis metabólitos, dando

como resultado, por exemplo, a geração de mapas metabólicos específicos para

cada organismo. León et al. (2009), mostraram o potencial desta técnica na

análise e identificação de metabólitos em amostras de milho geneticamente

modificado, com posterior avaliação estatística, para sugerir íons que

diferenciam as variedades T e NT.

Baseado nisto, foi realizada uma análise untargeted do metaboloma nas

diferentes gerações de sementes de soja transgênica e não-transgênica

estudadas no capitulo 1, a fim de conhecer se existem diferenças em nível

molecular entre as mesmas.

61

2.2 OBJETIVOS O objetivo principal desse Capítulo (como no anterior) foi o de investigar

de forma comparativa os efeitos que o cultivo consecutivo pode causar em nível

molecular entre as sementes de soja T e NT empregando análise metabolômica

comparativa. Como objetivos específicos têm-se:

i. Plantar e cultivar as sementes de soja T e NT, em condições

idênticas, até sua terceira geração;

ii. Avaliar uma solução extratora adequada para a extração dos

metabólitos das sementes de soja;

iii. Avaliar o perfil metabolômico por meio de espectrometria de

massas (acoplada ou não a cromatografia líquida);

iv. Identificar e caracterizar o maior número de compostos;

v. Avaliar se houve alguma alteração diferencial e ao longo das

gerações de sementes;

2.3 MATERIAIS E MÉTODOS

2.3.1 Reagentes e equipamentos Os reagentes utilizados para a extração dos metabólitos foram todos de

grau HPLC como: metanol, acetonitrila, CCl4 (Sigma Aldrich). Um espectrômetro

de massas do tipo ICR (Thermo Scientific) foi utilizado para a análise de

metabólitos baseada em fingerprint e para um perfil metabólico foi utilizado um

cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado a um QTOF (LC-MS). Os demais

materiais foram descritos no item 1.3.1 deste trabalho.

2.3.2 Extração e análise de metabólitos

Os metabólitos das sementes de soja T e NT da segunda e da terceira

geração foram extraídos de acordo com metodologia proposta por de Vos et al.

(2007) com algumas modificações. As sementes foram maceradas em nitrogênio

líquido, em seguida, pesou-se uma massa de 100,0 mg e a extração foi realizada

com 1 mL de solução de metanol/água (70:30 v/v) em ultrasonicador durante 30

62

s com condições de tratamento em modo de pulso 10 s on-off em 3 ciclos e 50%

de amplitude. Depois disso as amostras foram centrifugadas durante 5 min a

13000 g, sendo recolhido o sobrenadante das extrações, diluído e diretamente

analisado por espectrometria de massas. Os fingerprints foram adquiridos em

um espectrômetro de massas de alta resolução do tipo ICR com modo de injeção

direta controlado pelo software Xcalibur 2.0 (Thermo Scientific). As análises

foram conduzidas em modo positivo e negativo e os dados espectrais obtidos na

faixa de m/z 50 – 1000 com 100.000 de resolução na m/z 400.

Foram testados 3 protocolos de extração diferentes utilizando um pool de

50 mg das sementes já maceradas em N2 (l). O primeiro protocolo utilizou 800

μL MeOH + 200 μL H2O, o segundo utilizou 150 μL H2O + 190 μL CCl4 + 375 μL

MeOH e por fim, o terceiro protocolo utilizou 200 μL MeOH + 540 μL MTBE.

Todos os protocolos foram testados em triplicata e as amostras agitadas em

vórtex por 30 min bem como em ultrasonicador (do tipo cup-horn) empregando

uma amplitude de 50% durante 1 min (10 s on-off) separadamente, a fim de

comparação. Após essa etapa, todas as soluções foram centrifugadas e o

sobrenadante foi analisado diretamente após diluição por LC-MS do tipo QTOF

(Agilent Technologies) equipado com fonte ESI. Os dados espectrais foram

obtidos na faixa de m/z 100 – 1500 utilizando 3 μL de amostra por injeção durante

uma corrida cromatográfica de 25 min com um gradiente linear de 5-95% da

solução B (0,1 % de ácido fórmico em ACN) com vazão de 400 μL min-1.

2.3.3 Pré-processamento de dados e análise multivariada

Os cromatogramas foram pré-processados utilizando a ferramenta online

XCMS. Inicialmente os cromatogramas foram tratados para eliminação de ruído

e correção da linha de base. Em seguida, foram alinhados para corrigir possíveis

desvios do tempo de retenção. Os dados foram exportados para uma tabela e

posteriormente submetidos a análise multivariada por meio da ferramenta online

MetaboAnalyst (Xia, Sinelnikov, Han, & Wishart, 2015). Os valores da tabela,

contendo as intensidades dos íons, foram normalizados pela média e

transformação logarítmica (10log). O resultado foi posteriormente escalonado

pelo método de Pareto (centrado na média e dividido pela raiz quadrada do

desvio padrão de cada variável). As diferenças significativas entre os grupos de

63

amostras foram avaliadas a partir de Análise de Variância (ANOVA, p < 0,05). A

análise dos componentes principais – PCA (do inglês – principal component

analysis) e análise hierárquica de clusters HCA (do inglês – hierarchical cluster

analysis) foram utilizadas como uma abordagem não supervisionada, fazendo

uma revisão simplificada das amostras e variáveis, indicando possíveis outliers.

A análise discriminante para projeção de estrutura latente (PLS-DA, do inglês -

Projection to Latent Structure Discriminant Analysis) foi empregada para

encontrar metabólitos significativos, usando um modelo discriminante construído

por variáveis latentes. Heatmaps foram utilizados para encontrar padrões entre

replicatas e tratamentos.

A identificação dos metabólitos foi realizada seguindo as regras descritas

por Sumner et al. (2007), sendo classificados em quatro níveis: metabólitos

identificados por comparação com padrões (nível 1), compostos supostamente

identificados (nível 2), classes de compostos identificados (nível 3) e compostos

desconhecidos (nível 4). Os metabólitos selecionados foram verificados

manualmente utilizando um banco de dados interno baseado em comparações

de tempo de retenção, massa exata, composição isotópica e informação MS/MS.

Foram também utilizadas bases de dados de metabólitos disponíveis online, tais

como KNApSAcK, Kegg e MassBank.

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.4.1 Plantio e cultivo da soja

Resultado discutido no item 1.4.1 deste trabalho, pois foi usado o mesmo

cultivo de sementes.

2.4.2 Análise de metabólitos

A análise dos metabólitos das sementes de soja T e NT das três gerações

foi realizada com o intuito de se obter, primeiramente, um perfil químico entre as

variedades estudadas para explorar se existem ou não diferenças entre as

64

mesmas. O método de obtenção da composição química (fingerprint) das

amostras foi adquirido em modo negativo e positivo de ionização, no entanto, os

resultados em modo positivo não se mostraram adequados para descrever as

amostras uma vez que durante o tratamento de dados (discutido a seguir) não

foi observado separação entre os grupos e estes não serão apresentados. As

Figuras 10 e 11 representam os dados obtidos.

Figura 10. Fingerprint das amostras de sementes de soja T 1, 2 e 3G na m/z 100 à 1000

por ESI (-) FT-ICR MS.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

0

20

40

60

80

100711.22

665.22191.02

387.11341.11

533.14637.14325.18 729.23258.99 833.52 921.49 987.52401.13 503.16

129.02

711.22

665.22191.02

387.12341.11 533.14729.23

601.11475.13 763.19325.18 833.52 921.49239.08133.01 987.52

651.23

665.22

711.22

191.02

341.11387.12

533.14637.14 763.19475.13 833.52 921.49325.18239.08133.01 987.52

717.16

NL: 1.05E5

1T1G_neg_ok#239-250 RT: 0.66-0.86 AV: 12 T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1000.00]

NL: 7.23E4

1t2g_neg_ok#232-243 RT: 0.66-0.86 AV: 12 T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1000.00]

NL: 7.51E4

1t3g_neg_ok#234-244 RT: 0.66-0.85 AV: 11 T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1000.00]

65

Figura 11. Fingerprint das amostras de sementes de soja NT 1, 2 e 3G na m/z 100 à

1000 por ESI (-) FT-ICR MS.

De modo geral, observa-se nas Figuras 10 e 11 que, independente da

geração analisada, o perfil químico é bastante similar de acordo com os

espectros de massas, e não foi possível avaliar qualquer relação entre os

metabólitos das sementes de soja. Pode-se estimar uma mudança entre os perfis

T e NT em relação a intensidade de alguns íons. Para melhorar a compreensão

dos resultados, foi realizado uma análise dos componentes principais (PCA) -

uma ferramenta estatística que permite que a dimensionalidade dos dados

originais seja reduzida por meio do cálculo desses componentes principais, a fim

de obter uma visão geral da variação, de modo que grupos e tendências possam

ser identificados entre as amostras. A razão pela qual tal redução é possível se

refere as variáveis que são correlacionadas uma com a outra.

A Figura 12 apresenta os resultados obtidos em 3 fatores, onde é possível

observar uma nítida separação entre dois grandes grupos das amostras T e NT,

e também entre as gerações 1, 2 e 3, confirmando o fato de que, em nível

molecular, as sementes de soja T são diferentes das sementes de soja NT.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

0

20

40

60

80

100191.02

683.23

711.22665.22

387.11341.11533.14

729.23601.11475.13239.08 325.18

859.22445.12133.01 911.51763.20 987.52

683.23

191.02665.22 711.22

341.11387.12 533.14

729.23555.11 834.56133.01 239.08

325.18

637.14

911.51763.19401.13 957.51

683.23

711.22665.22

191.02475.13341.11 387.12

729.24533.14239.08 601.11133.01 911.51

325.18763.19 833.52439.08 957.51

NL: 6.54E4

1NT1G_neg_ok#234-245 RT: 0.64-0.85 AV: 12 T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1000.00]

NL: 6.42E4

1nt2g_neg_ok#229-240 RT: 0.65-0.85 AV: 12 T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1000.00]

NL: 6.16E4

1nt3g_neg_ok#255-266 RT: 0.64-0.85 AV: 12 T: FTMS - p ESI Full ms [100.00-1000.00]

66

Figura 12. PCA das sementes de soja analisadas que representam a análise de

metabólitos entre as mesmas.

Ao considerar todos os dados de massa obtidos pelo FT-ICR-MS sem

qualquer filtro por software, um número muito maior de sinais poderia ser

encontrado, mas sem qualquer informação estrutural, somente sua composição

elementar. Desse modo, baseado na alta resolução (100.000) do analisador de

m/z, conseguiu-se resolver alguns dos íons presentes nos espectros, bem como

a fórmula molecular mínima, por meio da exatidão de massa, apresentado na

67

Tabela 4, para as sementes T e NT de segunda e terceira geração, pois estas

foram cultivadas sob as mesmas condições.

Tabela 4. Identificação putativa de metabólitos presentes nas sementes de soja das

diferentes gerações obtidos por massa exata em analisador de massas ICR.

Possível composto* Massa

Molecular

(ICR)

Fórmula

Molecular

Erro

(ppm)

T2G NT2G T3G NT3G

Unknow 443.19255 C21H31O10 3.106 sim sim sim sim

Daidzein 7-O-malonyl glucoside

(daidzin)

501.10410 C24H21O12 2.689 sim sim sim sim

6-Methoxytaxifolin 333.05920 C16H13O8 -3.885 sim sim sim sim

Genistein 269.04535 C15H9O5 3.346 sim sim sim sim

Ɣ-L-Glutamyl-l-tyrosine 309.10912 C14H17O6N2 3.359 sim sim sim sim

Ɣ -l-Glutamyl-l-phenylalanine 293.11416 C14H17O5N2 3.282 sim sim sim sim

Gluconic acid (l-gluconate) 195.05076 C6H11O7 4.260 sim sim sim sim

Tetrahydroxypentanoic acid (l-xylonate) 165.04020 C5H9O6 5.063 sim sim sim sim

Glutamic acid 146.04564 C5H8O4N 5.860 sim sim sim sim

Taxifolin 3-rhamnoside 449.10994 C21H21O11 4.681 não não sim não

Kushenol B 505.24807 não não sim não

N-acetyl-l-glutamate 5-semialdehyde 172.06120 C7H10ON4 4.450 não não sim não

Trihydroxypentanoic acid 149.04530 C5H9O5 5.704 não não sim não

4-Hydroxy-4-methyl glutamate 176.05615 C6H10ON5 4.550 não não não sim

Medicarpin 3-O-glucoside 431.14095 C22H23O9 16.912 não não não sim

Trihydroxybutanoate (threonate) 135.02960 C4H7O5 5.926 sim não não não

Aspartic acid 132.02998 C4H6O4N 6.406 não sim não não

Daidzein 7-O-glucoside (daidzin) 415.10387 C21H19O9 3.6 não sim não não

Fuconate 179.05586 C6H11O6 4.722 sim sim sim não

* Compostos encontrados de acordo com a tabela de Garcia-Villalba (2008).

A Tabela 4 mostra que, por meio da busca no site ChemSpiderSearch and

share chemistry, foi possível encontrar 19 metabólitos que estão presentes (ou

não) nas gerações das sementes de soja T e NT segundo estudo realizado por

Garcia-Villalba (2008). Esses metabólitos pertencem a diversas classes, tais

como isoflavonas, aminoácidos, ácidos carboxílicos, peptídeos, entre outras. Os

primeiros nove metabólitos apresentados na Tabela 4 foram observados em

todas as gerações de sementes T e NT e, sendo assim, não são relevantes para

descreverem as amostras. Se forem comparadas as sementes T, observa-se

que quatro metabólitos estão presentes apenas na 3G, sendo eles, taxifolin 3-

rhamnoside, kushenol B, N-acetyl-l-glutamate 5-semialdehyde e

trihydroxypentanoic acid. Desses, os três primeiros citados, estão envolvidos em

68

rotas de biossíntese de flavonas e amino grupos (Garcia-Villalba, 2008).

Considerando que a EPSPS é a enzima chave da rota de biossíntese da

shikimato (precursor na formação de amino ácidos aromáticos) é plausível que

a síntese desses compostos esteja alterada nas gerações das sementes

transgênicas. Entre as gerações de sementes NT, a molécula 4-hydroxi-4-methyl

glutamate e Medicarpin 3-O-glucoside foram também encontradas apenas na

3G. Esses dados podem indicar que as sementes estão sofrendo alterações em

nível molecular quando cultivadas em gerações consecutivas. García-Villalba et

al. (2008), realizaram um estudo comparativo entre sementes de soja T e NT

com relação a seus metabólitos empregando as técnicas de eletroforese capilar

e espectrometria de massas, identificando 45 compostos. Os autores concluíram

que as sementes não apresentam mudanças relevantes, apesar do metabólito

4-hidroxy-L-threonine não ter sido observado na semente transgênica.

A soja tem sido considerada abundante no conteúdo de flavonoides e de

isoflavonas, que são predominantes em suas sementes (Miernyk e Johnston,

2013). Alguns flavonoides identificados nesse estudo foram: 6-Methoxytaxifolin,

Daidzin, Genistin, entre outros. Um estudo realizado por Leon et al. (2009),

avaliou três diferentes variedades de milho transgênico e sua respectiva linha

exógena de milho convencional, cultivados da mesma maneira, por meio da

técnica de FT-ICR MS. De acordo com os resultados, foi possível observar um

maior número de compostos no milho transgênico e que, ainda, algumas vias

metabólicas foram alteradas na variedade transgênica se comparada a

convencional do milho.

Após avaliar esses resultados e sabendo que infusão direta por FT-ICR

MS não pode diferenciar compostos isômeros e também devido a possível

acrescentar supressão iônica, uma dimensão analítica adicional foi necessária

para determinar/confirmar a identidade dos íons observados e possivelmente

outros. Abordagens utilizando LC-MS tem sido utilizada pois podem separar e

detectar melhor os metabólitos presentes na amostra como muitos compostos

semi-polares, de metabolismo primário e secundário. Sendo assim, um

experimento com um pool de sementes foi realizado por um LC-MS (Agilent

Technologies) em modo positivo e negativo de ionização, e a partir de diferentes

protocolos de extração, com o intuído de se obter uma condição de análise

adequada para que um maior número de íons pudesse ser observado. No

69

entanto, novamente o modo positivo não foi eficiente para descrever as amostras

e somente o modo negativo será apresentado na Figura 13.

Figura 13. Análise por LC-MS de um pool de sementes de soja (A) protocolo 1 utilizando

Vórtex (vermelho) e ultrasonicador (preto) como sistema de extração; (B) Protocolo 1

(preto), 2 (vermelho) e 3 (verde) utilizando ultrasonicador como sistema de extração.

Por meio da Figura 13 (A) pode-se observar que não houve diferenças no

perfil cromatográfico entre os sistemas de extração utilizados no preparo da

amostra. Como o ultrasonicador depende de um menor tempo com eficiência

semelhante ao vórtex, este foi escolhido como ideal para seguir com as análises

dos diferentes protocolos como descrito no item 4.7. deste trabalho. Observa-se

que o protocolo 1, o qual apresenta característica polar, foi o qual mostrou um

maior número de picos no cromatograma e assim uma melhor extração de

acordo com a Figura 13 (B), abrangendo compostos polares e semi-polares. Um

pico de alta intensidade no tempo de retenção aproximado de 16 min foi

observado no protocolo 2, que apresenta característica mais apolar se

comparada aos outros protocolos. No entanto, apesar da baixa intensidade, esse

mesmo pico também foi observado nos outros protocolos. Como a análise visa

70

obter diferenciação entre as amostras, neste momento, o maior número de íons

pode trazer um maior número de informações.

Portanto o protocolo 1, que utilizou o ultrasonicador como sistema de

extração foi escolhido para as posteriores análises dos metabólitos das

sementes de soja em suas gerações. Acredita-se que nesse protocolo, um maior

número de compostos semi-polares pode ser observado, devido a polaridade do

solvente utilizado, no entanto, metabólitos primários – que são mais polares -

como ácidos orgânicos, amino ácidos, açúcares, entre outros, podem co-eluir

com outros compostos resultando na supressão dos íons.

Após obter os dados, as diferenças significativas entre os grupos de

amostras (genotípicas e geracionais) foram observadas (p < 0,05) por meio da

análise cromatográfica por UHPLC-HRMS. Para melhor visualizar a variabilidade

dos resultados, os dados multidimensionais foram convertidos em

representações bidimensionais (PCA – 2D), permitindo uma interpretação visual

das variações mais significativas do conjunto de dados. O resultado dessa

análise exploratória permitiu identificar quatro grupos distintos. A componente

principal 1 (PC1) descreveu 44,4% da variância dos dados, enquanto na

componente 2 (PC2) foi observado 15,8%, totalizando 60,2% da variância em

apenas dois componentes. A Figura 14 representa os resultados obtidos.

71

Figura 14. Scores plot 2D de PCA dos grupos de soja transgênica (T) e não transgênica

(NT) de segunda (2nd) e terceira (3rd) geração. Elipses representam intervalo de

confiança de 95% entre os grupos.

Os quatro grupos foram separados por diferentes cores e as elipses

representam intervalo de confiança de 95% entre os grupos. Observa-se que na

PC1 é possível discriminar o efeito genotípico (T e NT), indicando que a maior

variabilidade dos dados está relacionada à transgenia. No que diz respeito ao

efeito geracional, também são observados diferenças entre os grupos de

amostras. A maior variabilidade está relacionada ao grupo de não-transgênicos

(NT). A partir da análise do perfil metabólico das amostras de transgênicos da

segunda e terceira geração, foi observada menor variabilidade (e maior

similaridade), característica evidenciada pela sobreposição elíptica. Outro

72

método de análise exploratória utilizado para identificar tendências e

similaridades entre as amostras é o HCA, o qual é representado pela Figura 15.

Figura 15. Gráfico de HCA dos grupos de soja transgênica (T) e não transgênica (NT)

de segunda (2nd) e terceira (3rd) geração.

Na Figura 15 é possível observar que as amostras foram agrupadas

corretamente e todas pertencem as suas respectivas classes.

Para construção do modelo de regressão multivariada, utilizou-se PLS-

DA, que consiste em um método matemático para combinação linear das

variáveis e construção de modelos de classificação e predição. Após

classificação, o modelo avalia a significância das variáveis através de

permutação para classificar as amostras. A Figura 16 representa os resultados

obtidos.

73

Figura 16. Scores plot 2D de PLS-DA dos grupos de soja transgênica (T) e não

transgênica (NT) de segunda (2nd) e terceira (3rd) geração.

A Figura 16 mostra o gráfico da análise discriminante, com a componente

1 descrevendo 35,7% da variância e a componente 2, 23,2%. Observa-se que o

resultado obtido através de PLS-DA é comparável com PCA. Em ambas as

análises (Figuras 14 e 16), pode-se observar que houve uma separação entre

os grupos T e NT na componente 1. Na PLS-DA fica evidente a distinção

geracional (segunda e terceira geração) na componente 2.

Por meio das Figuras 14, 15 e 16, pode-se observar que houve uma boa

separação entre os grupos T e NT e também com relação as suas gerações,

resultando em exatamente quatro pequenos grupos. Os dados sugerem que as

amostras transgênicas apresentaram uma menor variação no nível de

74

metabólitos, pois estes estão sobrepostos na Figura 16. Estes dados corroboram

com os dados obtidos para a análise proteômica, os quais apresentaram um

menor número de proteínas diferenciais entre os grupos de soja transgênica, de

acordo com a Tabela 3, se comparado com os grupos não-transgênicos.

As variáveis utilizadas no modelo foram organizadas de acordo com sua

importância na projeção (VIP, do inglês - Variable Importance in Projection) e as

25 mais discriminatórias são exibidas na Figura 17. Esses 25 íons também são

exibidos em um gráfico de heatmap (Figura 18) e alguns deles estão listados na

Tabela 5 de identificação.

Figura 17. Ranking das variáveis utilizadas pelo modelo de PLS-DA para classificação

das amostras. As caixas coloridas à direita indicam as intensidades relativas de cada

íon-ID.

75

Figura 18. Heatmap com os 25 metabólitos superiores classificados pela PLS-DA. Os

números apresentados no lado direito da figura são referentes a classificação do

processamento de dados. Variedades da soja e gerações (T2G, T3G, NT2G e NT3G)

são identificadas por cores acima do mapa.

Por meio da Figura 18, dois blocos principais de metabólitos foram

claramente identificados no gráfico de heatmap. O primeiro bloco (as primeiras

7 fileiras do topo) mostra um grupo de metabólitos que têm uma abundância

relativamente alta em plantas transgênicas, cuja abundância diminui em plantas

não-transgênicas. Os metabólitos do segundo bloco (demais fileiras), mostram

um efeito oposto, independente das gerações.

Se avaliarmos, no segundo bloco de metabólitos, a relação entre T2G e

NT2G, e também T3G e NT3G, observa-se uma tendência de os metabólitos

76

serem menos abundantes nas amostras transgênicas. Isso mostra, que as

gerações podem também influenciar no metabolismo da planta. A Tabela 5

mostra a identificação de alguns dos íons da Figura 18 e ainda, os demais que

puderam ser identificados nesse estudo.

77

Tabela 5. Lista de compostos identificados nas análises por LC-MS dos grupos de soja.

ID Tempo de

retenção

(min)

Massa

Experimental

KEGG_ID Nome do metabólito Formula

Molecular

Massa Teórica Desvio de

Massa

Nível Classe/Função

119 14,14 340,1282 C15509 Glyceocarpin C20H20O5 340,1311 -0,0029 2 Flavonoide

1424 13,02 210,1268 C08491 (-)-Jasmonic acid C12H18O3 210,1256 0,0012 2 Biosint. De metab.

Secundário 1575 11,77 336,0968 C10529 Sojagol C20H16O5 336,0998 -0,003 2 Flavoinode

1348 11,05 364,1478 C03579 Gibberellin A8 C19H24O7 364,1522 -0,0044 2 Lipídio

118 10,39 332,1616 C02035 Gibberellin A20 C19H24O5 332,1624 -0,0008 2 Lipídio

1146 9,45 942,5186 C08983 Soyasaponin I C48H78O18 942,5188 -0,0002 2 Terpenoide

1418 8,73 958,5178 C15428 Asiaticoside C48H78O19 958,5137 0,0041 2

524 6,6 284,0951 C07576 Psilocybin C12H17N2O4P 284,0926 0,0025 2 Alcalóide

616 6,35 254,0821 C05945 L-Arginine phosphate C6H15N4O5P 254,078 0,0041 2 Metabolismo secundário

563 0,99 429,1910 C20167 7-Benzylidenenaltrexone C27H27NO4 429,194 -0,003 2 Receptor de peptídeo

565 0,97 261,1471 C07790 Phenindamine C19H19N 261,1518 -0,0047 2 Sistema respiratório

114 4,78 518,1556 C12116 Esmeraldic acid C30H22N4O5 518,159 -0,0034 2

17 11,48 506,2124 C01593 Limonoate C26H34O10 506,2152 -0,0028 2

304 1,01 445,1862 C07862 Tridihexethyl iodide C21H36NO. I 445,1842 0,002 2

1278 10,38 180,0438 C01179 Aminoácido C9H8O4 180,0423 0,0015 3 Aminoácido

214 9,34 224,1412 C01760 Lipídeo C13H20O3 224,1412 0 3 Lipídeo

296 4,92 432,1457 C14942 Flavonoide C22H24O9 432,142 0,0037 3 Flavonoide

78

Todos os compostos identificados neste estudo por UHPLC-HRMS estão

listados na Tabela 5. É importante destacar o baixo desvio de massa obtido para

as identificações, o que mostra um resultado confiável. Dos 25 compostos que

foram mais discriminatórios das amostras de acordo com o PLS-DA, 9 deles

puderam ser identificados e estão apresentados na Tabela 5, são eles: ID 524,

616, 563, 565, 114, 17, 304, 214 e 296. O ID 214 foi um dos mais discriminantes

entre e representa o íon de massa 224,1412 g mol-1. Esse íon apresentou mais

de um possível composto e, portanto, foi classificado como nível 3, de acordo

com a sua classe funcional, lipídeo. Assim também o ID 296, que representa a

massa 432,1457 g mol-1, foi classificado em nível 3 e é um flavonoide. Os demais

ID’s do PLS-DA que tiveram sua identidade conhecida, foram classificados como

nível 2, são eles: Psilocybin, L-Arginine phosphate, 7-Benzylidenenaltrexone,

Phenindamine, Esmeraldic acid, Limonoate, Tridihexethyl iodide.

Desses compostos, o Psilocybin chama atenção por ser derivado de um

alcaloide o qual participa da biossíntese do Shikimato, que é a enzima

responsável pela formação dos compostos aromáticos e é inibida pelo glifosato,

nas plantas de soja não-transgênicas, como representado pela Figura 1 dessa

tese. Por meio do Heatmap (Figura 18), observa-se que esse metabólito está

mais abundante nas plantas NT do que nas T, e que na segunda geração

apresenta elevada abundância.

Observa-se uma tendência por meio da Figura 18, onde os íons que foram

discriminatórios, apresentam-se mais abundantes na variedade não transgênica

e também na segunda geração da planta. Provavelmente as plantas NT

precisam produzir um maior conteúdo desses metabólitos. Isso mostra que as

plantas T tem uma vantagem em relação as plantas NT.

Outros 8 compostos tiveram sua identidade conhecida e 7 deles foram

classificados em nível 2, são eles: Glyceocarpin, (-)-Jasmonic acid, Sojagol,

Gibberellin A8, Gibberellin A20, Soyasaponin I, Asiaticoside, apenas 1 foi

classificado como nível 3, um aminoácido.

O metabólito Soyasaponin I, pertence a classe das soya saponins e nos

últimos anos vem sendo alvo de estudos contra células cancerígenas. Embora

estudos recentes tenham demonstrado um efeito direto das saponinas de soja

em células cancerosas, também são discutidos mecanismos alternativos de

prevenção do câncer por esses agentes (Kervin, 2004). Esse metabólito foi

79

identificado porém como não foi discriminate nas análises estatisticas, não é

possivel afirmar sua abundância nas diferentes variedades estudadas.

O conteúdo de lipídeo se mostrou diferencial entre os metabólitos

identificados, principalmente entre as variedades T e NT. Os lipídeos são

acumulados nas plantas com o objetivo de nutrir o embrião da semente. A soja

é uma semente muito rica no conteúdo de óleo, que são formados a partir de

transformações bioquímicas dos açúcares que se originaram da glicose,

resultante da fotossíntese. Porém quando muito jovem, a soja ainda não faz

fotossíntese e utiliza os lipídeos como fornecedor de energia para o

desenvolvimento da planta. Mais uma vez a planta NT precisou desenvolver um

maior conteúdo de lipídeos em relação a T.

Além disso, as propriedades antioxidantes de produtos naturais e vegetais

como a soja, são muito explorados na literatura e mostram excelentes resultados

contra radicais livres, principalmente devido a alta concentração de compostos

fenólicos e flavonoides. Quimicamente, os compostos fenólicos pertencem a

uma classe de compostos que inclui uma grande diversidade de estruturas

simples e complexas. Caracterizam-se por apresentar em sua estrutura pelo

menos um núcleo aromático contendo substituintes hidroxilados e seus

derivados funcionais (Simões et al., 2004). Nesse estudo, foram identificados 2

metabólitos pertencentes a essa classe, sendo eles: Glyceocarpin e Sojagol.

Novamente esses metabólitos não foram discriminates nas análises estatisticas

e não é possivel afirmar sua abundância nas diferentes variedades de soja

estudadas.

Apesar do pequeno número de trabalhos destinados à elucidação de

metabólitos na soja, 14 compostos identificados pelo nosso estudo também

foram reportados em outros trabalhos da literatura obtendo classificação nível 2.

Nenhum composto pode ser identificado e classificado em nível 1, uma vez que

para isso, seria necessário a análise de um padrão, a qual não foi realizada

devido ao alto custo do mesmo e ainda, devido a intenção desta parte do trabalho

ser exploratória. A identificação desses íons foi realizada de acordo com a

ferramenta online KNApSAcK nos bancos de dados da Glycine max.

Poucos trabalhos na literatura utilizaram até o momento ferramentas

similares as utilizadas nesse trabalho no que diz respeito as análises

metabolômicas comparativa, principalmente se considerarmos a soja como

80

objeto de estudo. No entanto, há trabalhos que discutem a respeito de

organismos transgênicos. Chang et. al. (2014), buscou através da análise de

metabólitos e lipídeos, entender o mecanismo de ação do tratamento com

inseticidas em arroz transgênico (genes cry1Ac e sck) e seu tipo selvagem ou

natural. O método de análise foi validado em um LC-MS de geometria Q-TOF e

como resposta a 24h de tratamento, foi observado que antioxidantes, incluindo

ácido felúrico e sinápico, foram menos abundantes na variedade transgênica.

Um número significativo de flavonoides também foi alterado na variedade

transgênica. Os autores concluíram que a modificação genética afetou o

metabolismo de resposta do arroz quando exposto a um stress provocado pelo

inseticida.

Dessa maneira, as variações observadas no que diz respeito as análises

metabolômicas, leva a estimar que a soja transgênica está buscando um

reequilíbrio nutricional (proteínas e metabólitos) de forma mais efetiva do que a

soja não transgênica. Esse resultado pode ajudar a minimizar alguns mitos com

relação a organismos transgênicos, pois apesar das variações observadas,

nenhuma delas provoca como resposta algo ofensivo para a planta.

2.4.3 Conclusão Parcial

As técnicas analíticas utilizadas nesse Capítulo permitiram a avaliação em

nível molecular das sementes de soja em estudo. Os resultados indicam que

existe uma clara diferença entre as sementes transgênicas e não-transgênicas

no que diz respeito ao conteúdo de metabólitos. Também as gerações de

sementes estudadas indicam que pode haver uma diferença entre os níveis de

metabólitos de uma mesma variedade porem cultivadas em épocas diferentes.

Esses resultados corroboram aos obtidos no Capítulo 1 desta tese.

81

3. CONCLUSÃO FINAL

Dê acordo com o relatado, pode-se concluir que o cultivo das sementes

de soja T e NT em casa de vegetação foi eficiente, pois se conseguiu chegar ao

estágio de obtenção de sementes. A extração e separação das proteínas

também se mostraram adequada visto que com perfil proteômico obtido foi

possível realizar a quantificação relativa das mesmas por meio da técnica 2D-

DIGE. Assim, 89 proteínas se mostraram diferenciais entre os 9 grupos

estudados, no entanto, 79 foram levadas a identificação sendo 67 identificadas

com sucesso. Conclui-se também, que a soja transgênica pode ser considerada

mais robusta com relação a não-transgênica, pois foi observado um número

menor de proteínas diferenciais entre as sementes T de diferentes gerações.

Com relação aos seus metabólitos, fica claro que existe diferença entre

variedades e gerações de soja, corroborando com os dados proteômicos. Sendo

assim, é possível conclui que, de modo geral e em nível molecular, as variedades

de soja transgênica e não-transgênica não apresentam o mesmo metabolismo,

resultando em diferenças no que diz respeito à produção de suas proteínas e

metabólitos. Esse fato não gera até o momento, respostas em relação ao seu

consumo sendo benéfico ou maléfico, uma vez que não foram realizados testes

em seres humanos, mas gera uma proposta de investigação mais profunda para

futuras pesquisas relacionadas a esse tema.

82

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88

ANEXO

T1G x NT1G

T2G x NT2G

89

T3G x NT3G

T1G x T2G

90

T1G x T3G

T2G x T3G

91

NT1G x NT2G

NT1G x NT3G

92

NT2G x NT3G

estudo comparativo entre gerações de soja transgênica e...

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