Alberto Chebabo

Chefe do Serviço de Doenças Infecciosas e Parasitárias - HUCFF/UFRJ

Diagnósticos da América/DASA - RJ

Coleta

Recebimento do material

Semeadura

Leitura

Reisolamento (se necessário)

Identificação e TSA

Liberação do laudo

Observar: ◦ Esterilidade/integridade da amostra ◦ Identificação ◦ Hora da coleta

Registrar no sistema do Laboratório Hemoculturas ◦ Bactec ou BacT/Alert

Outros materiais: ◦ Semeadura

Lençol

Esgotamento

Spot

Rolamento

Sistema Bactec 9240

◦ Utiliza fluorescência para detecção de CO2

◦ Realiza leitura a cada 10 minutos

◦ Avisa caso haja aumento de concentração de CO2 no frasco

Sistema BacT/Alert

◦ Utiliza método colorimétrico para detecção de crescimento bacteriano

◦ Caso haja crescimento bacteriano, há mudança na coloração do fundo de frasco

Amostras devem ser colocadas no aparelho

idealmente até 2 horas após a coleta

Manter no aparelho por até 5 dias

Quando o aparelho detecta crescimento,

realizar Gram

Semear amostra em Agar Cled, Agar sangue

e Agar chocolate

Leitura da placa após 12, 24 e 48 h

Volume ideal: 10 ml

Semear até 2 h após a coleta.

Pode ser conservada entre 2 a 8º C por até 24

h

Semeadura em lençol com alça calibrada de

1L 1 colônia=1000 UFC/ml

Meio Agar Cled

Leitura após 24 e 48 h

Cultura simples

◦ Técnica de esgotamento

Cultura quantitativa

◦ Realizar diluições

◦ Semeadura em esgotamento e spot

Cateter

◦ Técnica de rolamento (semiquantitativa)

Revisão crítica do laudo do aparelho

Confirmar presença de ESBL, KPC, etc

Comparar TSA de Kirby-Bauer com do

aparelho quando for realizado

Cultura mista

Disco fora do padrão

Erro de leitura

Erro de interpretação

Erro de transcrição

Principal queixa em Microbiologia ◦ Demora na liberação da identificação e TSA

No sistema atual, como acelerar os resultados? ◦ Utilização de meios cromogênicos para acelerar a

identificação, principalmente para vigilância de MDR

◦ Realizar 2 leituras diárias da placa

Antecipar o preparo da cepa para identificação automatizada

Maior carga de trabalho e custo

Novos equipamentos para a microbiologia ◦ Incubadores de hemoculturas inteligentes

◦ Esteiras interligando toda a linha

◦ Inoculação e semeadura automáticos

◦ Incubação e leitura de placas

Reduz a necessidade de mão de obra especializada

Incubadora automática ◦ Leitura das placas customizadas

◦ Manuseio das placas com escolha à distância da colônia a ser trabalhada

Matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight (MALDI-TOF)

Aplicação em áreas da ciência desde final dos anos 80

Desenvolvimento do WC- MS (whole cell mass spectometry) com aplicação em microbiologia

O princípio MS consiste em ionizar compostos químicos para gerar moléculas carregadas e medir sua relação massa-carga.

A partir da ionização das proteínas do ribossomo, os íons são

acelerados por campo elétrico

Tempo da viagem até o detector é medido

A velocidade do íon depende da relação massa-carga

Íons de baixo peso viajam mais rápido do que íons mais

pesados

A detecção dos íons gera um espectro através de

espectometria de massa, que é comparado com um banco de

dados, levando à identificação bacteriana

Welker M, Moore ERB. Syst Applied Microbiol. 2011;34:2-11

desorption

ionization

acceleration

separation

detection ion detector

+

+ +

+

+ +

target

matrix/analyte crystals

acceleration zone

field-free drift range

ring electrode

• Matrix • Assisted • Laser • Desorption/ • Ionisation

• Time- • Of- • Flight

• Mass • Spectrometry

MALDI-TOF

4000 m/z 8000

4000 m/z 8000

Burkholderia cepacia

Raoultella ornithinolytica

Staphylococcus aureus

Pantoea agglomerans

Acinetobacter lwoffi

Escherichia coli

*Full Width of a peak at Half of its Maximum height = m Resolution r = m/ m

Microflex AXIMA Assurance

Flight Tube 1,05m 1,20m Resolution 3500 (FWHM*) 5000 Mass range: 1-300k Da 1-500k Da Accuracy 75 ppm (intrnl std) 30 ppm (intrnl std)

Bruker Shimadzu/BioMérieux

Sept 2010 1021 clinical isolates

tested 98% correct ID’s

Jan 2011 1019 clinical isolates

tested 98% correct ID’s

Apr 2010 680 clinical isolates

tested 99% correct ID’s

Identificação Convencional

MALDI-TOF

Cherkaoui A et al. J Clin Microbiol.2010;48(4):1169-75

Rapidez na identificação ◦ Redução de 24 – 48 h na liberação da identificação

em culturas

Baixo custo de insumos ◦ Utiliza slide com 96 alvos + Matriz

◦ Avaliar custo do equipamento

¼ do custo em relação aos métodos automatizados

Acurácia na identificação de bactérias ◦ 98 – 99% de correlação com métodos padrão

Proporciona melhor escolha e/ou descalonamento precoce do esquema antibiótico

Identificação rápida, mas TSA com tempo convencional ◦ Sem informação rápida de resistência

◦ Descalonamento apenas para espécie (ie, ATB para CGP)

◦ Aguardar tempo convencional para resistência para modificação do esquema ATB

Limitações na identificação de fungos e micobactérias ◦ Dificuldades com fungos filamentosos

Espectro de proteínas diferente para cada condição de crescimento, poucas informações nos bancos de dados

Produção de enzimas

◦ Betalactamases

Impermeabilidade da parede celular

◦ Alteração de porinas

Alteração do sítio de ação do ATB

◦ Alteração de PBP

Bomba de efluxo

Caminhos metabólicos alternativos

Adaptado de Peleg AY, Hooper DC. NEJM.2010;362:1804-13

Aumento dos relatos de resistência

bacteriana no mundo

Novos (????) mecanismos surgiram

Transferência de mecanismos de resistência

entre bactérias

Facilidade na disseminação local e global de

mecanismos de resistência

Mutação em qualquer gen ocorre em 1 celula/107

Mutação que codifica resistência é selecionada

Da noite para o dia uma célula se multiplica para 109 células

Seleção na terapia pode levar à falha no tratamento

Mutante surge

Células sensíveis mortas pelo antibiótico

Clone mutante sobrevive

Plasmídeos transferem genes de resistência entre as células

Transposons transferem genes entre plasmídeos

Integrons inserem genes adquiridos

+

+

E. coli (rod prokaryote) strains undergoing conjugation. One strain has fimbriae

Ceftriaxone,

Ceftazidime

•P. aeruginosa resistente à Amicacina

Imipenem,

Meropenem

•ESBL

•Acinetobacter sp. resistente às cefalosporinas 3ª geração

Polimixina

•P. aeruginosa e Acinetobacter sp.resistentes aos

carbapenêmicos

Polimixina + Meropenem

•?????????????????? KPC resistente a todos ATBs

Classe A ◦ Cromossômica

K. oxytoca

Proteus vulgaris Citrobacter diversus

◦ Plasmidiais TEM, SHV

CTX-M

KPC, GES, IMI

Classe B ◦ Cromossômica

S. maltophilia

◦ Plasmidiais IMP, VIM, SPC, GIM

Classe C ◦ Cromossômica

Enterobacter Amp C

Citrobacter freundii Amp C

Serratia Amp C

Morganella Morganii Amp C

P. aeruginosa Amp C.

Providencia Amp C.

◦ Plamidiais CMY-2

Classe D ◦ Plasmidiais

Família OXA (principalmente Acinetobacter spp.)

Betalactamases TEM e SHV: ◦ Derivadas de TEM-1 (Temoniera - Grécia)

descrita na década de 60 em E. coli

◦ SHV-1 (Variável sulfidril)

◦ Hidrolisa a Ampicilina

ESBL (Betalactamase de Amplo Espectro) ◦ SHV-2 descrita na Alemanha em 1983 e TEM-3

em 1989

◦ CTX-M descrita na Alemanha em 1990

◦ Disseminação mundial, sendo a principal ESBL no Brasil e no mundo

Naseer U, Sundsfjord A. Microb Resist Drug.2011;17(1):83-97 Rossi F. CID. 2011;52(9):1138-43

Spain (11)

Italy (4)

Korea (1)

Philippines (2)

Switzerland (1)

Germany (5)

Taiwan (7)

China (6)

USA (23) Turkey (3)

Guatemala (1)

Argentina (3)

Brazil (5)

Peru (2) Venezuela (3)

Mexico (4)

Puerto Rico (2)

Portugal (3)

New Zealand (3)

Greece (2)

Israel (2) Colombia (4)

Lithuania (1)

Estonia (1)

South Africa (3)

France (4)

Chile (2)

Panama (1)

United Kingdom (3) Latvia (1)

Thailand (2)

Vietnam (2)

Malaysia (2)

Singapore (2)

India (9)

Hong Kong (2)

Indonesia (2)

Dom. Rep. (1)

Canada (9)

Jordan (2)

Australia (3)

Ecuador (2)

Romania (2)

aThe total number of study sites and centers participating in SMART is for 2009 only.

Number of study sites is subject to change.

aIn 2009, both intraabdominal infection (IAI) and urinary tract infection (UTI) isolates were collected.

aIn 2009, both intraabdominal infection (IAI) and urinary tract infection (UTI) isolates were collected.

Betalactamase Classe A

Enzimas KPC, SME, GES, NMC e IMI

Transmissão plasmidial

KPC:

◦ KPC-1: Descrita em K. pneumoniae na Carolina do Norte

(USA) em 1996

◦ 1º surto descrito em New York em 2000-01, por KPC-3

◦ KPC-2: Grande surto em New York em 2003 e 2004

◦ Hidrolisam Imipenem, reduzindo sensibilidade. Necessário

redução da permeabilidade de membrana para resistência

Bradford, P et al. CID. 2004;39:55-60 Bratu S et al. Arch Intern Med. 2005;165:1430-35 Nordmann P et al. Lancet Infect Dis.2009;9:228-36

Walsh T. Int J Antimicrobial Agents.2010;36(S3):S8-S14

Utilizar metodologia NNISS Realizar vigilância pós alta por até 2 meses ◦ Acompanhamento dos pacientes internados

(médicos da CCIH e enfermeira) ◦ Revisão de prontuário pós-alta (realizado pela

enfermeira responsável

Notificar apenas as infecções do sítio cirúrgico

Feedback para os Cirurgiões Relatório anual à Direção

achebabo@gmail.com