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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SOLANGE REGINA SENA DE SOUZA

INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE DA RAIZ DE EUTERPE OLERACEA

MART. (AÇAÍ)

BELÉM-PA

2009

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INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA RAIZ DE

Euterpe oleracea Mart. (Açaí)

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

da Universidade Federal do Pará, como

requisito para obtenção do título de Mestre

em Ciências Farmacêuticas.

Orientador:

Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos

Co-Orientador:

Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa

BELÉM-PA

2009


INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA RAIZ DE

Euterpe oleracea Mart. (Açaí)

Banca Examinadora:

________________________________________________

Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos

ORIENTADOR

________________________________________________

Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa

CO-ORIENTADOR

_______________________

1º EXAMINADOR

Prof. Dra. Marciene Ataíde de Andrade

_________________________________________________

2º EXAMINADOR

Prof. Dr. Adolfo Henrique Müller

Aprovada pela Comissão Avaliadora no dia 20 de março de 2009.

NOTA BIOGRÁFICA

A autora nascida em 05 de dezembro de 1979, natural de Santarém-PA,

iniciou sua vida acadêmica aos 19 anos quando foi aprovada no vestibular da Universidade

Federal do Pará, campus de Santarém-PA em 1999 no curso de Licenciatura em Ciências

Biológicas do qual cursou apenas dois anos, alterando assim sua trajetória para o curso de

Bacharelado em Farmácia no campus da UFPA de Belém-Pa através do processo seletivo de

mobilidade acadêmica conhecido popularmente como vestibulinho. Aprovada iniciou o curso

em fevereiro de 2001 e finalizou em agosto de 2004, seguida da habilitação em bioquímica

que foi concluída no final de 2005. Neste mesmo ano ocorreu seu casamento com Marlisson

seu então noivo que na época era estudante de engenharia mecânica também da UFPA. Em

seguida iniciou a preparação para a prova de mestrado que foi no início do ano seguinte em

2006. Foi aprovada e iniciou as disciplinas curriculares em agosto de 2006 e no ano seguinte

iniciou os experimentos na linha de pesquisa para a qual foi direcionada e apresentou maior

afinidade e experiência. Ao longo de sua jornada ocorreram alguns imprevistos e um deles foi

uma gravidez da qual não houve nenhum arrependimento e que veio somente a atrasar um

pouco o desenvolvimento e conclusão do seu trabalho, mas que não lhe impediu de perseverar

nos objetivos do trabalho proposto. Em maio de 2008 por motivos familiares foi morar na

cidade do Rio de Janeiro-RJ e então com a ajuda de seu co-orientador o professor Wagner

Barbosa da UFPA, que lhe indicou para a professora de farmacognosia da UFRJ Suzana

Leitão para trabalhar e concluir os experimentos do trabalho em seu laboratório, conseguiu

dar prosseguimento em suas atividades. A professora não só a aceitou como também lhe

ajudou bastante nos procedimentos experimentais que faltavam ser realizados fornecendo

algumas orientações necessárias. Graças a Deus e com a ajuda dessas e outras pessoas

conseguiu concluir e apresentar o seu trabalho de mestrado sobre a espécie Euterpe oleracea

Mart.(Açaí) em março de 2009 com grande êxito.

A meus pais Benedito Gomes e Sandra Regina;

Ao meu esposo Marlisson e minha filha Sofia;

E aos meus irmãos Sidney e Simone.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela vida e por todas as oportunidades que tem me concedido.

A Universidade Federal do Pará (UFPA).

A Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

Ao orientador, Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos e Co-orientador Prof. Dr. Wagner Luiz

Ramos Barbosa pela orientação, ajuda e paciência a mim demonstrada em vários momentos

ao longo do curso e durante esta caminhada.

Ao Prof. Dr. José Maria Vieira Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas pela ajuda em vários momentos ao longo deste trabalho.

À professora do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFRJ Suzana

Guimarães Leitão pela cooperação neste trabalho, cedendo a mim um espaço físico, estrutura,

apoio e orientação nas etapas crucias em meu trabalho experimental.

À professora do Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais-NPPN da UFRJ Gilda Guimarães

Leitão pela ajuda e apoio que me concedeu sempre que solicitei.

À minha mais nova e querida amiga Érica, estudante de mestrado da faculdade de farmácia da

UFRJ, a quem devo muitos e muitos favores pois me ajudou bastante na realização dos

ensaios químicos.

Aos professores da Faculdade de Farmácia do PPGCF da UFPA pelo apoio e suas

contribuições neste trabalho.

Aos meus pais, Benedito Gomes de Souza e Sandra Regina Dourada Sena e meus irmãos,

cujo apoio, amor e incentivo ajudaram na realização deste trabalho.

Ao meu esposo Marlisson Sousa de Azevedo, por me incentivar e me ajudar bastante em

várias atividades e compartilhar comigo todos os momentos da minha vida e principalmente

deste trabalho com dedicação, amor e paciência às vezes.

Ao senhor Claudio, proprietário da fábrica de açaí que permitiu que eu fizesse a coleta do

material vegetal em sua propriedade.

Aos amigos do mestrado e a todos aqueles que de alguma forma participaram do processo

desenvolvimento deste trabalho.

“Tudo o que um sonho precisa para ser realizado é de

alguém que acredite que ele possa ser realizado.”

Autor desconhecido

RESUMO

Euterpe oleracea Mart. (Açaí) é uma Arecaceae de grande distribuição na região Norte do Brasil, sendo nativa dos estados do Pará, Amapá, Maranhão, Tocantins e Mato Grosso. Apresenta grande importância na alimentação e saúde da população dessas regiões e possui uma larga utilização na medicina popular local. Seus frutos são tradicionalmente utilizados como fonte de alimento por serem ricos em nutrientes e muito saborosos. Diversos estudos já foram realizados com esta espécie utilizando os frutos como material vegetal analisado. Este trabalho foi o primeiro a realizar um estudo fitoquímico e determinar a presença de compostos químicos e a capacidade antioxidante das raízes desta espécie, parte vegetal também utilizada na medicina popular para tratamento de várias enfermidades. Para obtenção de dados com relação à droga vegetal foi realizado a granulometria do pó para caracterização da droga, a qual veio mostrar que esta se enquadra na classificação de pó grosso, de acordo com a Farmacopéia Brasileira 4a edição. Foi realizada a abordagem fitoquímica do extratos etanólico bruto a qual detectou a presença de flavonóides, catequinas, açúcares redutores, taninos catequinicos, esteróides e triterpenóides, já no extrato hidroacetônico foi detectada a presença de flavonóides, taninos catequinicos, catequinas e açúcares redutores. A capacidade antioxidante foi testada in vitro pelo ensaio do DPPH para o extrato hidroacetônico e suas frações acetato de etila e aquosa, para o extrato etanólico bruto e suas frações. Quase todas as amostras apresentaram no geral percentual de atividade antioxidante relativamente maior que o padrão utilizado, pois os valores obtidos da CE50 foram menores. O teor de fenóis totais foi determinado com auxílio do método de Folin-Ciocalteau e os resultados para o extrato hidroacetônico e fração aquosa mostraram valores de 55 e 77 mg de EAG/g de amostra, respectivamente. Os espectros de RMN de 1H das frações 6 e 14 mostraram a presença de esteróides e derivados de ácidos graxos em mistura, e através das análises realizadas por CG-EM dessas frações foi possível identificar os esteróides: estigmasterol, sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona e estigmastano-3,6-diona. Foram identificados os seguintes ácidos graxos e derivados: o ácido dodecanóico (ácido láurico), ácido tetradecanóico (ácido mirístico), ácido pentadecanóico, ácido hexadecanóico (ácido palmítico), ácido octadecanóico (ácido esteárico), ácido decanóico (ácido cáprico), o aldeído n-nonanal e o n-hexadecanoato de metila (éster metílico do ácido palmítico). Palavra-chave: Euterpe oleracea Mart., capacidade antioxidante, DPPH, esteróides, estigmasterol, sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona, estigmastano-3,6-diona, ácidos graxos e derivados.

ABSTRACT

Euterpe oleracea Mart. (Açai) is an Arecaceae of large distribution in Northern Brazil native from states of Pará, Amapá, Maranhão, Mato Grosso and Tocantins. It has great importance in the diet and health of the population of these regions and has a wide use in taditionally local medicine. Its fruits are used as food because they are rich in nutrients and very tasty. Several studies have been conducted with this species using the fruit as the plant material analyzed. This work was first to make a phytochemical study and determine the presence of chemical compounds and antioxidant capacity of the roots of this species, part of the plant also used in popular medicine for treatment of various diseases. For more details regarding the drug plant was the size of the powder for characterization of the drug, which has shown that this falls in the classification of bulk powder, according to which the Brazilian Pharmacopeia 4th edition. Was performed the phytochemical approach of the crude ethanolic extract, which detected the presence of flavonoids, catechins, reducing sugars, catechinic tannins, steroids and triterpenoids and in the acetone/water extract was detected the presence of flavonoids, catechinic tannins, catechins and reducing sugars. The antioxidant capacity was tested in vitro by the DPPH test with the extract and the fractions aqueous and ethyl acetate, the crude ethanolic extract and its fractions obtained by partition. Almost all samples showed the general percentage of relatively higher antioxidant activity than the standard used, because the EC50 values were lower. The content of total phenols was determined using the Folin-Ciocalteau method and the results for the acetone/water extract and aqueous fraction showed values of 55 and 77 mg of EAG/g of sample respectively. The 1H NMR spectra of the fractions 6 and 14 showed the presence of steroids and fatty acid derivatives in mixture, and the through the analysis for GC-MS of those fractions was possible to identify the steroids stigmasterol, sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona and stigmastan-3, 6-dione. Fatty acids and derivatives have been identified to dodecanoic acid (lauric acid), tetradecanoic acid (myristic acid), pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid), octadecanoic acid (stearic acid), decanoic acid (capric acid), the aldehyde n-nonanal, and n-hexadecanoate of methyl (methyl ester of palmitic acid).

Keywords: Euterpe oleracea Mart., antioxidant capacity, DPPH, steroids, stigmasterol, sitosterol, β-saccharostenone, campesterol, stigmastenone, stigmastan-3, 6-dione and fatty acids and derivatives.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19

2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................... 20

2.1 ASPECTOS GERAIS ....................................................................................................... 20

2.1.1 Família Arecaceae ......................................................................................................... 20

2.1.2 Gênero Euterpe .............................................................................................................. 21

2.1.3 Euterpe oleracea Mart. .................................................................................................. 26

2.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE ...................................................................... 30

2.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA ESPÉCIE ............................................................. 31

2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE ................................................................. 31

2.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ..................................................................................... 32

2.5.1 Processos oxidativo ....................................................................................................... 32

2.5.2 Processo de oxidação lipídica ........................................................................................ 33

2.5.3 Ensaios com DPPH ........................................................................................................ 35

2.5.4 Substâncias antioxidantes .............................................................................................. 36

2.6 COMPOSTOS FENÓLICOS ........................................................................................... 37

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 38

3.1 GERAL ............................................................................................................................ 38

3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 39

4.1 PRODUTOS QUÍMICOS ................................................................................................ 39

4.1.1 Solventes, Reagentes e Soluções ................................................................................... 39

4.1.2 Reveladores ................................................................................................................... 40

4.2 EQUIPAMENTOS ........................................................................................................... 40

4.2.1 Para análise granulométrica ........................................................................................... 40

4.2.2 Para análise cromatográfica e espectroscópica .............................................................. 41

4.2.3 Para análise da capacidade antioxidante e teor de fenóis totais .................................... 41

4.3 MATERIAL VEGETAL .................................................................................................. 42

4.4 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA................................................................................... 43

4.5 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS ................................................................................. 43

4.5.1 Obtenção do Extrato etanólico bruto (EEB) .................................................................. 43

4.5.2 Obtenção das frações por partição sólido-líquido do extrato etanólico bruto. .............. 44

4.5.3 Obtenção do Extrato Hidroacetônico (EHA) ................................................................ 44

4.5.4 Partição liquído-líquido do extrato hidroacetônico com Acetato de etila e Água ......... 44

4.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS ...................................................... 45

4.7 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS .............................................................................. 45

4.7.1 Monitoração dos extratos e frações por CCD ................................................................ 45

4.7.2 Determinação da presença de catequina por CLAE analítica da fração acetato de etila

(FAEH) obtida do EHA. ..................................................................................... 46

4.7.3 Cromatografia em coluna (CC) da fração clorofórmio (FCE) obtida do EEB .............. 46

4.7.4 Cromatografia de Contra Corrente da FAEH obtida do EHA ....................................... 47

4.7.5 Cromatografia gasosa (CG) ........................................................................................... 47

4.7.6 Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (CG-EM) .......................... 48

4.8 ENSAIOS ANTIOXIDANTE IN VITRO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES ................... 48

4.9 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENÓIS TOTAIS (FT) NOS EXTRATOS E

FRAÇÕES .......................................................................................................... 49

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 52

5.1 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO PÓ ...................................................................... 52

5.2 EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO ............................................................................. 54

5.3 ABORDAGEM FITOQUÍMICA ..................................................................................... 55

5.4 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA POR CLAE DA FAEH ............................................ 56

5.5 TEOR DE FENÓIS TOTAIS ........................................................................................... 57

5.6 ESPECTRO DE RMN 1H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 6. ................................. 58

5.7 ESPECTRO DE RMN 1H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 14. ............................... 63

5.8 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................................. 71

6 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 76

7 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 78

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Foto de Euterpe oleracea Mart.(Açaí). .................................................................. 27

Figura 2 - Foto do cacho de frutos de Euterpe oleracea Mart. .............................................. 27

Figura 3 - Raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí). ............................................................. 42

Figura 4 - Esquema das etapas da preparação das soluções para a análise do teor de fenóis

totais. ................................................................................................................... 51

Figura 5 - Curva de distribuição granulométrica da droga vegetal. ....................................... 53

Figura 6 - Curvas cumulativas de resíduo e passagem da droga vegetal após tamisação. ..... 53

Figura 7 - Cromatografia em camada delgada das frações 1 a 18 obtidas por CC. ................ 54

Figura 8 – Presença de catequina na fração acetato de etila (FAEH) por CLAE ................... 56

Figura 9 - Curva padrão e equação da reta obtidas após os ensaios com ácido gálico nas

concentrações de 2,5; 5,0 ; 7,5; 10,0 e 12,5 µg/mL. ........................................... 57

Figura 10 - Espectro de RMN 1H da fração 6 (300 MHz; CDCl3; relativo para TMS). ........ 58

Figura 11 - Ampliação da área que corresponde aos sinais de hidrogênios de 4,00 ppm a 5,50

ppm da fração 6. ................................................................................................. 59

Figura 12 - Cromatograma da fração 6 por CG-EM (TIC). ................................................... 60

Figura 13 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro do pico

12 eluído em 17,2 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido

hexadecanóico (ácido palmítico). ....................................................................... 61

Figura 14 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de

massas do pico 38 eluído em 31,9 min (B) obtido por CG-EM proposto para o

estigmasterol. ...................................................................................................... 62



sitosterol (α-dihidrofucosterol). .......................................................................... 62


massas do pico 44 eluído em 35,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para a

substância estigmasta-3,5-dien-7-ona (β-sacharostenona). ................................ 63

Figura 17 - Espectro de RMN 1H da fração 14 e ampliação da área com sinais de hidrogênios

de 0 a 2,50ppm (300 MHz; CDCl3; relativo para TMS)..................................... 64

Figura 18 - Cromatograma da fração 14 obtido da análise por CG-EM (TIC). ..................... 65



ácido dodecanóico (ácido láurico). ..................................................................... 66


massas do pico 7 eluído em 14,9 min (B) obtido por GC-MS proposto para a

substância ácido tetradecanóico ou ácido mirístico. ........................................... 67



ácido pentadecanóico (pentadecílico). ................................................................ 67



ácido hexadecanóico (ácido palmítico). ............................................................. 68



ácido octadecanóico (ácido esteárico). ............................................................... 68

Figura 24 - Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante apresentada pelas

amostras EHA, FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5, 10

e 25 µg/mL frente ao radical DPPH 0,1 mM e com seus respectivos erros

padrões. ............................................................................................................... 72

Figura 25 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EHA,

FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5; 10 e 25 µg/mL

frente ao radical DPPH 0,3 mM com seus respectivos erros padrões. ............... 73

Figura 26 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EEBA,

FHA, FCA, FAEA, FMA e do padrão EGb (761) nas concentrações de 5; 10 e 25

µg/mL frente a radical DPPH 0,3mM com seus respectivos erros padrões. ...... 75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura . ...... 22

Quadro 2 – Formas de uso dos componentes da espécie Euterpe oleracea Mart. (Açaí) ...... 29

Quadro 3 - Etapas da reação não enzimática mediada por radicais livres (ANTOLOVICH et

al, 2002) .............................................................................................................. 34

Quadro 4 - Resultados da Abordagem fitoquímica do extrato etanólico e hidroacetônico das

raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) ............................................................. 55

Quadro 5 – Estruturas dos compostos majoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e

14. ....................................................................................................................... 69

Quadro 6 – Estruturas dos compostos minoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e

14. ....................................................................................................................... 70

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Análise granulométrica por tamisação do pó das raízes de Euterpe oleracea Mart.

(Açaí). ................................................................................................................. 52

Tabela 2 - Dados de RMN 1H da fração 6 (300 MHz; CDCl3;relativo para TMS). ............... 59

Tabela 3 - Dados de RMN 1H da fração 14 (300 MHz; CDCl3; relativo para TMS). ............ 63

Tabela 4 - Atividade antioxidante (%) e CE50 do EHA, FAEH e FAH e do padrão EGb (761)

frente ao radical DPPH 0,1mM. ......................................................................... 71


frente ao radical DPPH 0,3mM. ......................................................................... 73

Tabela 6 - Atividade antioxidante (%) e CE50 do EEB, FH, FC, FAE e FM e do padrão EGb

(761) frente ao radical DPPH 0,1mM. ................................................................ 74

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AA% .................................... Percentual de Atividade Antioxidante

ABS ...................................... Absorbância

AcOEt .................................. Acetato de Etila

CC ........................................ Cromatografia em Coluna

CCD ..................................... Cromatografia em Camada Delgada

CCDP ................................... Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CCC ..................................... Cromatografia de Contra Corrente

CE50 ...................................... Concentração Eficiente 50%

CG ....................................... Cromatografia Gasosa

CG-EM ................................ Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massa

CLAE ................................... Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

d ............................................ Dubleto

dd .......................................... Duplo dubleto

DPPH. .................................. 2,2-difenil-1-picril-hidrazila radical

EAG ..................................... Equivalente de Ácido Gálico

EEB ...................................... Extrato Etanólico Bruto

EGb ...................................... Extrato de Ginkgo biloba

EHA ..................................... Extrato Hidroacetônico

FAEE ................................... Fração Acetato de Etila obtida do EEB

FAH ...................................... Fração Aquosa obtida do EHA

FAEH ................................... Fração Acetato de Etila obtida o EHA

FCE ...................................... Fração Clorofórmio obtida do EEB

FHE ...................................... Fração Hexano obtida do EEB

FME ..................................... Fração Metanólica obtida do EEB

Hoe 140 ................................ Antagonista do receptor de Bradicinina

Hz ......................................... Hertz

iNOS ..................................... Inibidor de Óxido Nítrico Sintetase

J ............................................ Constante de Acoplamento

K+2 ........................................ Íon Potássio

KCl ....................................... Cloreto de Potássio

MeOH .................................. Metanol

mg ......................................... Miligrama

min ....................................... Minuto

mL ........................................ Mililitro

mm ....................................... milímetro

mM ....................................... Milimolar

m/v ........................................ Massa/volume

m/z ........................................ Massa/carga

NE ......................................... Norepinefrina

NO ........................................ Óxido Nítrico

nm ......................................... Nanômetro

NPPEG ................................. Difenilborato de aminoetanol e polietilenoglicol

ppm ...................................... Partes por milhão

PT ......................................... Polifenóis totais

RMN 1H ............................... Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1

RMN 13C .............................. Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

sl ........................................... Singleto Largo

t ............................................. Tripleto

UV ........................................ Ultravioleta

µL ......................................... Microlitro

19

1 INTRODUÇÃO

O uso terapêutico de plantas medicinais parece ser tão antigo quanto a

espécie humana, o conhecimento químico e as propriedades antioxidantes destes são

relativamente recentes, especialmente nas duas últimas décadas onde observou-se um enorme

crescimento da investigação científica, envolvendo extratos brutos, frações ou componentes

isolados e/ou modificados (YUNES, 2001).

Euterpe oleracea Mart. (Açaí) é uma Arecaceae amplamente distribuída no

norte da América do Sul, de ocorrência frequente nas planícies inundadas da Amazônia

brasileira em especial no Estado do Pará. É popularmente conhecida no Brasil como

açaizeiro, onde apresenta elevado valor comercial e é considerado um importante alimento na

dieta da população amazônica (CPATU-EMBRAPA, 2007).

Diante das inúmeras citações sobre o uso popular dos frutos, raízes e

sementes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) para tratamento de diversos problemas de saúde e

sendo muito utilizada como alimento, verificou-se a importância de uma investigação

fitoquímica mais aprofundada sobre as raízes da espécie. Estas apresentam, segundo várias

citações, uso na medicina popular para o tratamento de verminoses (JARDIM et al., 2006),

diarréia, anemia (PLANTAMED, 2007), entre outras indicações.

A grande utilização e importância econômica e social desta espécie reforça

ainda mais a questão da pesquisa e o desenvolvimento de estudos complementares, não

apenas para confirmações dos dados de estudos anteriores, como também para obtenção de

novas informações acerca de tão importante espécie vegetal. É então muito importante buscar

conhecer a sua composição e avaliar suas atividades químicas e biológicas utilizando-se

métodologias padronizadas.

20

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 ASPECTOS GERAIS

2.1.1 Família Arecaceae

A família Palmae também denominada Arecaceae descrita por Antoine

Laurent de Jussieu, apresenta 203 gêneros nos quais estão distribuídas aproximadamente

2650 espécies tropicais que incluem árvores ou arbustos e raras trepadeiras (DI STASI et al.,

2002).

Apresentam caule do tipo estipe, não ramificados, com folhas terminais e

ocorrem também acaules com folhas que nascem rentes ao chão. Os principais gêneros

encontrados no Brasil são representados por espécies de grande valor econômico, usados

tanto na indústria de alimentos como para ornamentos. Destaca-se o gênero Euterpe, que

inclui o palmiteiro encontrado na mata atlântica e o açaízeiro na região amazônica (DI

STASI et al., 2002).

Segundo JOLY, (1998) a família Palmae ou Arecaceae é a única família

representante da ordem Principes, compreendendo um dos maiores grupos de plantas

pertencentes à classe das monocotiledôneas.

Dentre as classes de metabólitos secundários detectados nas espécies desta

família destacam-se os alcalóides, proantocianidinas, flavonóides, saponinas e sapogeninas

(SANTOS, 2001).

21

2.1.2 Gênero Euterpe

O gênero Euterpe é um dos mais de 200 gêneros pertencentes à família

Palmae (JOLY, 1998; SANTOS, 2001)

Congrega cerca de 28 espécies, ocorre nas Américas Central e do Sul e está

distribuído por toda bacia Amazônica. As três espécies que ocorrem com maior freqüência

são E. oleraceae, E. edulis e E. precatoria (GALOTTA & BOAVENTURA, 2005 ).

Dentro do gênero Euterpe, que compreende espécies muito semelhantes, E.

oleracea (Mart.) não é a única espécie conhecida como açaí, E. edulis (Mart.), E. badiocarpa

(Barbosa Rodrigues) e E. precatoria (Mart.) são também denominadas “açaí” enquanto E.

catinga (Wallace), E. controversa (Barb. Rodr.) e E. longibracteata (Barb. Rodr.) são

conhecidas como “açaí-chumbinho”, “açaí-chumbo” e “açaí-da-mata” respectivamente

(HENDERSON & SCARIOT, 1993).

Estudos fitoquímicos e farmacológicos são bastante limitados neste gênero,

sendo que dos frutos de E. oleraceae e E. edulis já foram isolados ácidos graxos, esteróides e

antocianinas (GALOTTA & BOAVENTURA, 2005).

Algumas das substâncias que já foram detectadas, isoladas e identificadas

em duas espécies do gênero Euterpe são apresentadas no Quadro 1 com seus respectivos

nomes, estruturas químicas, referências bibliográficas e parte utilizada no estudo.

22

Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura.

Espécie Substância (exemplos) Estrutura Parte

Euterpe oleracea

Mart.

- Cianidina-3-sambubiosideo, - R1=Sambubiose e R2=OH;

- Cianidina-3-glucosideo ; R1=glucose e R2=OH;

- Cianidina-3-rutinosideo; - R1=rutinose e R2=OH;

- Peonidina-3-glucosideo, - R1=glucose e R2=Ome;

- Peonidina-3-rutinosideo, - R1=rutinose e R2=Ome.

(SCHAUSS et al, 2006b; LICHTENTHÄLER et al.,

2005)

Frutos

- Homoorientina;

- Orientina;

(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et al., 2006b)

Frutos

-Isovitexina;

(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et al., 2006b)

Frutos

23



Euterpe oleracea Mart.

- Taxifolina desoxihexose;

(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et

al., 2006a)

Frutos

- Cianidina-3-O-Glicosídeo;

- Cianidina-3-O-rutinosídeo;

(GALLORI et al, 2004;

LICHTENTHÄLER et al., 2005)

Frutos

Euterpe precatoria Mart.

- Ácido p-hidroxibenzóico.

(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005)

Raízes

24



Euterpe precatoria Mart.

- R1=CH3;R2=H; α – amirina;

- R1=H; R2=CH3; β – amirina.

(GALOTTA & BOAVENTURA , 2005.)

Raízes

- Estigmast-4-n-6β-ol-3-ona.

(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005.)

Raízes e talos das

folhas

- R1=H; R2=OH; α-D-glicose;

- R2=OH; R2=H; β-D-glicose.


Raízes

25



Euterpe precatória

Mart.

- Lupeol.


Raízes

- R= H; friedelan-3-ona;

- R= OH;28-hidroxi-friedelan-3-ona;


Talos das

folhas

- R= H, β= OH, sitosterol;

-R=H, β= OH, ∆22 estigmasterol;

-R=H, β-D-glicose, 3-β-D-glicopiranosídeo de β-

sitosterila;

-R= H, β-CH3(CH2)14COO-, palmitato de β-

sitosterila.


Raízes e talos das

folhas

26

2.1.3 Euterpe oleracea Mart.

É uma palmeira encontrada nas regiões de clima tropical e uma das

espécies mais abundantes nas várzeas da região amazônica. Sua distribuição se limita ao

norte da américa do sul (LICHTENTHÄLER et al, 2005). A espécie se desenvolve bem em

vários tipos de clima e solos, mas prefere regiões tropicais com temperatura média de 26ºC,

índice pluviométrico superior a 2.300mm e períodos de estiagem bem definidos (SANTOS,

2001).

Pertencente ao reino Plantae, divisão Magnoliophyta, classe Liliopsida,

ordem Arecales, família Arecaceae e gênero Euterpe. É uma palmeira multicaule (figura 1),

com até 25 estipes por touceira, estes nos indivíduos adultos, apresentam altura e diâmetro

variando de 3m a 20m e de 7cm a 18cm, respectivamente. Cada estipe sustenta, em sua

porção terminal, um conjunto de 8 a 14 folhas compostas, pinadas e de arranjo espiralado,

com 40 a 80 pares de folíolos, opostos ou subopostos. A inflorescência do açaizeiro é

infrafoliar e disposta quase horizontalmente. Nos dois primeiros terços de cada ráquila, as

flores estão dispostas em tríades, com cada flor feminina ladeada por duas flores masculinas.

No terço terminal das ráquilas encontra-se, normalmente, somente flores masculinas. As

inflorescências apresentam em média 80,5% de flores masculinas e 19,5% de flores

femininas. O fruto (figura 2) é uma drupa globosa, contendo resíduos florais, com diâmetro

variando entre 1cm e 2cm e peso médio de 1,5g. O epicarpo, nos frutos maduros, apresenta

coloração arroxeada quase preta ou verde, dependendo do tipo. O mesocarpo é polposo e

delgado, com espessura quase sempre igual ou inferior a 1mm e envolve o volumoso e duro

endocarpo o qual contém em seu interior uma semente, com embrião diminuto e abundante

endosperma ruminado (CPATU-EMBRAPA, 2007).

27

Figura 1 - Foto de Euterpe oleracea Mart.(Açaí).

Os frutos de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) possuem uma única semente,

que ocupa a maior parte de seu volume. Esta é revestida por fibras filamentosas que são

recobertas por uma fina camada comestível (mesocarpo e epicarpo), onde se inclui a polpa e

também a casca (DEL-POZO INSFRAN et al., 2004; LICHTENTHÄLER et al, 2005).

Os frutos devem ser colhidos na estação seca do ano, de agosto a dezembro

para se obter maior produção e melhor característica organoléptica (ROGEZ, 2000).

Figura 2 - Foto do cacho de frutos de Euterpe oleracea Mart.(Açaí)

Disponível em: www.cpatu.embrapa.br/...2008

28

Os açaizeiros passam por um estágio monocaule durante um a três anos.

Segundo OLDEMAN (1969), um regalo de raízes aéreas se forma na base da palmeira e

nesse regalo, no nível das cicatrizes foliares basais, se esboçam eixos laterais que são

verdadeiros ramos e não rebentos. O açaizeiro cresce formando touceiras agrupando os

rebentos sucessivos (ramificação na base) a partir de uma unidade de dispersão, onde se

apresenta sob a forma de uma palmeira cespitosa o que significa dizer que ela apresenta

novos estipes na sua base a cada ano (de 1 a 10) e que sua regeneração é teoricamente infinita

(ROGEZ, 2000).

No Estado do Pará, o açaizeiro predomina no estuário do rio Amazonas,

principalmente em pólos de várzea, mas também de terra firme e de igapó. O biótipo do

açaizeiro não é definido por um clima preciso. Um estudo realizado no Museu Paraense

Emílio Goeldi demonstrou que os açaizeiros crescem em terrenos pobres em fósforo,

nitrogênio, cálcio e magnésio (JARDIM & ROMBOLD, 1994). Os açaizeiros são de fato

adaptados a este tipo de solo por meio de dois mecanismos: a presença de bactérias que

fixam o nitrogênio na superfície aérea das raízes e a imponente massa de raízes capazes de

absorver os minerais necessários a seu crescimento em um importante volume de terra

(ROGEZ, 2000).

As palmeiras não tem pêlos absorventes, entretanto possuem micorrizos

simbióticos na superfície. O raizame do açaizeiro é muito largo (6 m ou mais) e superficial

(80% do volume são encontrados nos primeiros 30 cm do solo). É constituído de dois tipos

de raízes. As horizontais que formam na parte inferior do estipe um regalo vermelho,

cravam-se no solo (geotropismo positivo) e evoluem de forma horizontal à pequena

profundidade abaixo do humus. As partes expostas ao ar livre são cobertas de pneumatorizes,

orgãos cônicos brancos e de aspecto granuloso especializados na função respiratória. As

pneumatofores são oriundas das raízes horizontais e apresentam geotropismo negativo. Sua

29

parte aérea é marrom e lisa, coberta de pneumatorizes e um ápice marrom. Sua parte terrestre

é amarelada, lisa e abundantemente ramificada e desempenham a absorção (ROGEZ, 2000).

Estudo realizado na ilha do Combú sobre a composição florística e uso

popular de plantas medicinais oleaginosas, verificou que a raiz de Euterpe oleracea Mart.

(açaí), é empregada pela população local no tratamento de verminoses (JARDIM &

MEDEIROS, 2006) e das diarréias intestinais provocadas por amebas (COSTA, 1992).

Todos os componentes da espécie em estudo são utilizados, daí sua grande

importância econômica, social, cultural e medicinal para a população principalmente do norte

da América do Sul. Estas informações podem ser observadas com mais detalhes no quadro 2

a seguir.

Quadro 2 – Formas de uso dos componentes da espécie Euterpe oleracea Mart. (Açaí).

Componentes Formas de uso

Frutos Suco, creme, sorvete, licor, geléia, mingau, curtimento de couro, adubo orgânico, produção de álcool, carburante e antidiarréico.

Palmito Picles, salada, recheio, creme e ração animal.

Folhas

Cobertura de casa, parede, cesto, tapete, chapéu, esteira, adorno caseiro, celulose, ração animal, adubo orgânico, cobertura morta,

sombreamento de sementeiras e plantas.

Estipe (caule) Construção de casa, ponte, cerca, curral, lenha, celulose e isolamento

elétrico, Cacho Vassoura e adubo orgânico.

Raízes Vermífugo.

Fonte: Destaque Amazônia, Órgão de divulgação do Museu Emílio Goeldi, 1985.

30

2.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE

Compostos polifenólicos como os flavonóides homoorientina, orientina,

isovitexina, taxifolina desoxi-hexose e as antocianinas cianidina-3-glicosídeo, cianidina-3-

rutinosídeo e derivados de cianidina e peonidina já foram identificadas através de métodos

cromatográficos e espectroscópicos em estudos realizados com a polpa dos frutos

(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et al, 2006b).

Dentre os principais componentes químicos presentes na espécie

destacamos: antocianinas, proantocianidinas e outros flavonóides, como a ciandina- 3-

glucosídeo e vílio-3-rutinosideo detectados como compostos predominantes (SCHAUSS et

al, 2006b).

Soma-se a cianidina-3-arabinosídeo e cianidina -3-arabinosil-arabinosídeo

que também foram identificadas segundo BOBBIO e colaboradores (2000).

Resveratrol e ácidos graxos foram encontrados em baixas concentrações,

19 aminoácidos, esteróis, sais minerais e outros nutrientes também foram identificados e

quantificados (SCHAUSS et al, 2006b). Soma-se o sitoesterol, β-esteróis totais e os esteróis

campesterol e estigmasterol também identificados na espécie (SCHAUSS et al, 2006b).

Estudos realizados por SILVA, (2007) foram detectados os seguintes

ácidos fenólicos: ácidos gálico, protocatecuico, p-OH-benzóico, vanílico, siríngico, verático,

ferúlico, p-cumárico, 3-(4-OH)-fenil-2(Z)-propenóico e 3-(3-metoxi-4-OH)-fenil-2(Z)-

propenóico dentre outros compostos.

31

2.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA ESPÉCIE

Euterpe oleracea Mart. (Açaí) é uma espécie rica em compostos

polifenólicos e antocianinas, cuja presença contribuiu para estudos e avaliações da

capacidade antioxidante da espécie (DEL POZO et al, 2004).

A capacidade antioxidante da polpa do fruto de Euterpe oleracea Mart.

(Açaí) foi avaliada, apresentando excelente atividade contra radicais peróxido, boa atividade

contra peroxinitrito e pouca atividade contra radicais hidroxila, comparado com frutos

europeus comuns. Esta atividade antioxidante foi também demonstrada nas sementes dos

frutos, para as quais também foram relatadas o uso popular na medicina local (RODRIGUES

et al, 2006).

O fruto de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) exibiu significante atividade

antioxidante em testes in vitro. A capacidade antioxidante da polpa congelada e seca e do pó

da casca do fruto foi avaliada através das diferenças químicas apresentadas frente às várias

fontes de radicais livres e apresentaram excepcional atividade contra o radical superóxido, o

maior efeito reportado atualmente contra o radical peroxil, medido pela capacidade de

absorvância do radical oxigênio e fraca atividade contra ambos radicais peroxinitrito e

hidroxil (SCHAUSS et al, 2006a).

2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE

Estudo realizado com o extrato hidroalcoólico obtido da semente do açaí

induziu um efeito vasodilatador nos vasos mesentéricos de ratos que foram pré-contraídos

com norepinefrina (NE). O extrato induziu uma prolongada vasodilatação endotélio

dependente que foi significantemente reduzida por NG-nitro-L-arginina. Nos vasos pré-

32

contraídos com NE e KCl ou tratados com K+2 bloqueador do canal Ca (Cálcio), o efeito do

extrato da semente do açaí foi significativamente reduzido, mas este efeito não foi afetado

pela indometacina, glibenclamida e 4-aminopiridina. Atropina, pirilamina, ioimbina e Hoe

140 reduziram significativamente o efeito vasodilatador de acetilcolina, histamina, clonidina

e bradicinina, mas não mudou o efeito vasodilatador do extrato dos caroços do açaí (ROCHA

et al, 2007).

Em estudo com as flores, frações de frutos de Euterpe oleracea Mart.

(Açaí), os resultados mostraram que as frações obtidas dos frutos foram as mais potentes em

inibir a produção de NO, seguido pelos extratos das flores. Somente em altas doses, algumas

frações reduziram a viabilidade celular. A redução na produção de NO não foi devida à

atividade eliminadora de NO, mas sim pela inibição da expressão de iNOS. O efeito mais

pronunciado foi observado nas frações que apresentaram concentração elevada de cianidina-

3-O-glicosídeo e cianidina-3-O-raminosídeo. Os resultados indicaram que as frações de

Euterpe oleracea Mart. (Açaí) inibem a produção de NO pela redução na expressão dos

níveis de iNOS (MATHEUS et al, 2006).

2.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

2.5.1 Processos oxidativo

A oxidação é uma transferência de elétrons de um átomo a outro e

representa uma parte essencial do nosso metabolismo, sendo que o oxigênio é o último

receptor no sistema de fluxo de elétrons que produz energia na forma de ATP (DAVIES,

1995). O metabolismo oxidativo é essencial para a sobrevivência das células, entretanto leva

a produção de radicais livres e outras espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e cloro, que

levam a modificações oxidativas no organismo (ANTOLOVICH et al., 2002).

33

Um radical livre é capaz de existir independentemente. Apresentam, em

geral, elevada instabilidade, meia vida curta e reagem rapidamente com diversos compostos e

podem atacar alvos celulares. Os radicais livres podem formar complexos com proteínas,

glicoproteínas, purinas e pirimidinas, formação de produtos de oxidação de tióis, peróxidos

lipídicos, polímeros, epóxidos, endoperóxidos e produtos de cissão, como alquenais e

hidroalquenais, que são citotóxicos.

A oxidação de tióis, a ligação covalente de alquenais com proteínas e a

modificação das glicoproteínas podem afetar a atividade de divisão de enzimas. Os processos

de transcrição e de tradução podem ser impedidos ou modificados, em função de lesões no

DNA, induzidas pelos radicais livres. O termo espécies reativas de oxigênio é um coletivo

que inclui não somente radicais de oxigênio como o radical superóxido (O2•) ou hidroxila

(OH•), mas, também, alguns derivados não radicalares, como o peróxido de hidrogênio

(H2O2) e o ácido hipocloroso (HClO) (JORDÃO et al, 1998)

2.5.2 Processo de oxidação lipídica

A oxidação lipídica tem papel importante na deterioração de alimentos e

nas modificações oxidativas nas lipoproteínas de baixa densidade LDL (ANTOLOCICH et

al, 2002).

O processo de peroxidação lipídica pode ocorrer por meio de três rotas

diferentes:

a) Reação não enzimática mediada por radicais livres;

b) Foto oxidação não enzimática e não radicalar;

c) Reação enzimática (ANTOLOCICH et al, 2002).

34

A rota 1 é a via clássica de radicais livres, que leva à iniciação e rápida

propagação das cadeias de reações destrutivas, esta rota conta com as etapas de iniciação,

propagação, ramificação e término (ANTOLOCICH et al, 2002).

Quadro 3 - Etapas da reação não enzimática mediada por radicais livres (ANTOLOVICH et

al, 2002)

Iniciação

LH + R• → L• + RH

LH representa o substrato, por exemplo um lipídeo, sendo R. o radical livre iniciador. A

oxidação do lipídeo gera um radical alil altamente reativo (L· ), que rapidamente reage com o

oxigênio, formando o radical peroxil (LOO· ).

Propagação

Os radicais peroxil são os carreadores da cadeia de reações, que podem oxidar o lipídeo

produzindo hidroperóxidos lipídicos (LOOH), os quais podem se transformar em uma série de

substâncias como álcoois, aldeídos, cetonas, hidrocarbonetos e radicais alcoxil (LO·). Ramificação

A quebra de hidroperóxidos lipídicos frequentemente envolvem catálises de íons de metais de

transição, em reações análogas àquelas com peróxidos de hidrogênio, resultando em radicais

lipídicos alcoxil e peroxil.

Término

Combinação de radicais para formar produtos não radicalares.

L• + O2 → LOO•

LOO• + LH → L• + LOOH

LOOH → LO• + HO•

2LOOH → LOO• + LO• + H2O

LOOH + Mn+ + H+ → L• + M(n+1)+ + H2O

LOOH + M(n+1)+ + OH - → LOO• + Mn+ + H2O

LO• + LO•

LOO• + LOO• → Produtos não radicalares

LOO• + LO•

35

2.5.3 Ensaios com DPPH

Vários métodos são utilizados para determinar a atividade antioxidante em

extratos e substâncias isoladas. Um dos mais usados consiste em avaliar a atividade

seqüestrante do radical livre 2,2- difenil-1-picril-hidrazila-DPPH (SOUSA et al., 2007).

A avaliação da atividade sequestradora do radical livre DPPH se apresenta

como um teste de predição de uma potencial atividade antioxidante e pode ser empregado

para triagem de compostos químicos sintéticos e produtos naturais (MIRANDA & FRAGA,

2006).

O ensaio fundamenta-se na propriedade do DPPH apresentar uma forte

absorção no espectro visível, em 517 nm, de coloração violácea intensa, devido à presença de

elétrons livres. Quando o DPPH é colocado em presença de substâncias capazes de sequestrar

radicais livres, a absorção é inibida, resultando em uma descoloração estequiométrica em

relação ao número de életrons retirados e independente de qualquer atividade enzimática. O

grau de descoloração indica a capacidade sequestradora de radical livre (MATHIESEN et al,

1997).

Pela ação de um composto antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar

(R•), o DPPH• é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com

consequente desaparecimento da absorção que pode ser monitorada pelo decréscimo da

absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade

antioxidante ou seqüestrante de radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH• remanescente

no meio reacional. A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à

quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante

necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada

concentração eficiente (CE50) ou concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de

36

DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA

et al., 2007).

2.5.4 Substâncias antioxidantes

Denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em

concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou

inibem a oxidação do substrato. Os radicais formados a partir dos antioxidantes não são

reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados por reação com outro radical,

formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante (SOUSA et al.,

2007).

Substâncias antioxidantes desempenham papel importante na saúde através

de seus efeitos na modulação dos processos oxidativos que ocorrem no organismo. A

formação das espécies reativas de oxigênio e subsequente oxidação das moléculas biológicas

constitui um mecanismo de dano tecidual presente em vários processos patológicos como

inflamação, derrame, infarto do miocárdio, ateroesclerose, doença de Alzheimer e Parkinson

e em alguns tipos de câncer (OZBEN, 1998).

Atualmente os antioxidantes foram divididos em duas classes:

antioxidantes primários ou interruptores de cadeia e antioxidantes secundários ou

preventivos. Antioxidantes secundários são substâncias que retardam a velocidade de

oxidação, através da remoção do substrato ou quelação do oxigênio singleto. Já os

antioxidantes primários, podem inibir ou retardar a etapa de iniciação da cadeia, reagindo

com o radical lipídico, ou ainda inibir a etapa de propagação da cadeia, reagindo com os

radicais peroxila ou alcoxila (ANTOLOVICH et al, 2002).

37

2.6 COMPOSTOS FENÓLICOS

Os compostos polifenólicos pertencem a uma classe de metabólitos que

inclui uma diversidade de estruturas, das mais simples como os chiquimídeos a muito

complexas como os taninos e os glicosídeos. Possuem, pelo menos um anel aromático no

qual um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila (SIMÕES et al., 2001). As

substâncias fenólicas tendem a ser hidrossolúveis, pois ocorrem frequentemente combinadas

com açúcares como glicosídeos e se localizam geralmente no vacúolo das células

(HARBONE, 1989).

A atividade antioxidante dos compostos fenólicos deve-se principalmente à

sua propriedade redutora oriunda da estrutura química. Esta característica desempenha papel

importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição,

agindo tanto na etapa de inibição como na propagação do processo oxidativo. Os

intermediários formados pela ação dos antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis,

devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias (SOUSA et

al, 2007).

Os flavonóides protegem os constituintes orgânicos contra o dano

oxidativo, podendo também contribuir para a prevenção de importantes doenças, como as

cardiovasculares, o envelhecimento e os cânceres (HANASAKI et al, 1994).

Existem vários relatos de que os flavonóides exibem uma grande variedade

de efeitos biológicos como a ação antibacteriana, antiviral, antiinflamatória e antialérgica

(HANASAKI et al, 1994), a ação vasodilatadora (DUARTE et al, 1993), além de inibirem in

vitro a peroxidação lipídica (SUGIHARA et al, 1999).

38

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

a) Investigação fitoquímica e determinação da capacidade antioxidante e

teor de compostos fenólicos nos extratos e frações das raízes de Euterpe

oleracea Mart (Açaí).

3.2 ESPECÍFICOS

a) Determinar o perfil fitoquímico dos extratos etanólico e hidroacetônico

obtidos a partir das raízes por meio de metodologias de fitoquímica

clássica;

b) Fazer a análise granulométrica do pó para caracterização da droga

vegetal;

c) Determinar o teor de fenóis totais na espécie;

d) Caracterizar a presença de compostos fenólicos, esteróides e

triterpenóides nos extratos e frações;

e) Determinar por meio de ensaios in vitro a capacidade antioxidante

apresentada pelos extratos e frações.

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no período de agosto 2006 a novembro

de 2009 nos Laboratórios de Análise Fitoquímica e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Pará-UFPA e no Laboratório de

Farmacognosia e de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio

de Janeiro-UFRJ.

O período para desenvolvimento dos experimentos e análises dos dados

incluindo a pesquisa bibliográfica e o desenvolvimento do trabalho como um todo foi de

agosto de 2006 a fevereiro de 2009.

4.1 PRODUTOS QUÍMICOS

4.1.1 Solventes, Reagentes e Soluções

a) Solventes de grau analítico (MTedia): acetato de etila, acetona, ácido

acético glacial, ácido fórmico, ácido sulfúrico conc., água destilada e

ultra pura (Mili-Q), clorofórmio, diclorometano, n-butanol, etanol,

hexano, metanol, éter etílico, éter de petróleo, anidrido acético.

b) Solução etanólica de cloreto férrico a 1% e 5%, lugol, ninhidrina a 1%,

ácido clorídrico conc., magnésio, hidróxido de amônio 6N e a 10%, ácido

clorídrico 6N, peróxido de hidrogênio 30 vol., nitroprussiato de sódio a

5%, hidróxido de sódio 1N e 2N, vanilina a 1%, carbonato de sódio a

25%, sulfato de sódio anidro, formaldeído a 4%, o-dinitrobenzeno a 5%,

cloridrato de hidroxilamina a 10%, solução metanólica de hidróxido de

potássio a 10%, p-dimetilaminobenzaldeído, tricloreto de antimônio,

40

reativo de Keede, Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Pascová e Fehling A

e B, NPPEG.

c) Radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) obtido da Sigma-Aldrich.

d) Padrão extrato de Ginkgo biloba (EGb 761) Tebonin® (40mg/mL)

produto comercial obtido do laboratório Altana-Pharma Ltda.

e) Reagente Folin-Ciocalteau 2N e o Padrão Ácido Gálico obtidos da

Sigma-Aldrich.

4.1.2 Reveladores

Os reveladores utilizados foram:

a) Reveladores físicos como luz ultra-violeta a 254 e 365 nm;

b) Reveladores químicos como Cloreto férrico, Folin-Ciocalteau diluído,

H2SO4 a 20% e NPPEG.

4.2 EQUIPAMENTOS

4.2.1 Para análise granulométrica

a) Agitador de peneiras para análises granulométricas eletromagnético-

Bertel do Laboratório de Farmacotécnica da Faculdade de Farmácia da

UFPA;

b) Balança analítica-Gehaka BK 500 do Laboratório de Farmacotécnica da

Faculdade de Farmácia da UFPA;

c) Balança analítica-Bioprecisa FA2104N do Laboratório de Fitoquímica

da UFPA;

41

4.2.2 Para análise cromatográfica e espectroscópica

a) Sistema para Cromatografia Gasosa (CG): Cromatógrafo GC-2010

Shimadzu do Núcleo de pesquisa em Produtos Naturais (NPPN) da

UFRJ.

b) Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa: Cromatógrafo

modelo Shimadzu GC-MS-QP5000 do Nucleo de Pesquisa em Produtos

Naturais (NPPN) da UFRJ.

c) Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN

1H) da marca Bruker operando a 400MHz da UFRJ.

d) Sistema para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência La Chrom 7000

Merck Hitachi do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de

Farmácia da UFRJ;

4.2.3 Para análise da capacidade antioxidante e teor de fenóis totais

a) Balança analítica Sartorius BP-2215 do Laboratório de Farmacognosia

da UFRJ;

b) Espectrofotômetro Shimadzu UV-mini 1240, do Departamento de

Produtos Naturais e Alimentos da UFRJ;

c) Pipetas analíticas Gilson de 5000µL, 1000µL, 200µL, 50 µL, 20µL e

ponteiras Zap com filtros.

42

4.3 MATERIAL VEGETAL

Um exemplar da exsicata da espécie Euterpe oleracea Mart. (Açaí)

identificada por Nascimento, M.P. do e onde o material coletado por Xavier-Junior, S.R. e

Lisboa, O.S.B., foi depositada no Herbário IAN da EMBRAPA com registro (nº.180979).

O material vegetal (figura 3) foi adquirido numa Fábrica de cultivo e

extração do Açaí, a qual trabalha com a exportação da polpa do fruto e que fica localizada na

ilha do Combú, próximo a cidade de Belém-PA, foi coletado no período da manhã, no mês

de abril de 2007, priorizando-se a coleta de raízes adultas. Obteve-se um total de 3 kg do

material vegetal que foi seco em estufa até estabilização do peso, triturado em moinho de

facas e pesado obtendo-se aproximadamente 1 kg de droga vegetal.

Figura 3 - Raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí).

43

4.4 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA

A determinação da granulometria do pó das raízes foi realizada com base

na Farmacopéia Brasileira 4aEdição (1988), empregando-se a técnica da granulometria por

tamisação de 10g de droga vegetal em tamises com aberturas nominais de malha de 2,00mm;

1,40mm; 710µm; 355µm; 250µm; 180µm, 125µm e um coletor, os quais foram tarados

individualmente. A droga vegetal foi submetida a vibrações de intensidade 7 por um período

de 30 minutos de acordo com o equipamento. Após a tamisação realizou-se a pesagem e

determinou-se a quantidade de pó da droga vegetal retida e a quantidade que passou por cada

tamis. A partir dos dados obtidos foi construída a tabela 1 e os gráficos (figuras 5 e 6)

representativos desta análise.

4.5 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS

4.5.1 Obtenção do Extrato etanólico bruto (EEB)

Inicialmente 150g da droga vegetal foram deixados em maceração estática

por uma semana (7 dias) em etanol até saturação, sendo então filtrado à baixa pressão. A

solução obtida foi concentrada sob baixa pressão em evaporador rotativo a uma temperatura

média de 40ºC, armazenado para secagem em estufa, obtendo-se assim 5g do extrato

etanólico bruto seco.

O rendimento total obtido para este tipo de material vegetal foi de

aproximadamente 3,3%. A amostra foi conservada em geladeira para a realização dos testes

fitoquímicos, análises cromatogáficas e testes da atividade antioxidante. Outras partidas de

extrato etanólico das raízes foram preparadas posteriormente de acordo com as necessidades

e com a mesma técnica aqui descrita.

44

4.5.2 Obtenção das frações por partição sólido-líquido do extrato etanólico bruto.

Foram utilizados 5g do extrato etanólico bruto, o qual foi colocado em um

becker de 250 mL, em seguida adicionaram-se os solventes em ordem crescente de

polaridade diretamente sobre a amostra e suspendendo-a várias vezes com cada solvente até

esgotamento total da droga. Os solventes utilizados foram: hexano, clorofórmio, acetato de

etila e metanol. Foram obtidos 455mg da FHE, 400mg da FCE, 830mg da FAEE, e 790mg

da FME que foram monitoradas por CCD para avaliação da composição e posterior

refracionamento por CC da fração FCE.

4.5.3 Obtenção do Extrato Hidroacetônico (EHA)

Cerca de 100g das raízes secas e trituradas foram submetidas a maceração

sob agitação em agitador elétrico (mixer) utilizando os solventes acetona/água (70:30) como

líquido extrator, na proporção de 10% de droga (m/v) ou seja 100g do material vegetal para

1000mL dos solventes, em seguida a solução foi filtrada e concentrada a baixa pressão. Para

eliminação da água residual utilizou-se n-butanol e o extrato obtido foi seco em estufa

obtendo-se 2,68g com um rendimento final de 2,7% (RESENDE, 2007). Este procedimento

foi realizado várias vezes até esgotamento total da droga e obtenção de uma quantidade

razoável de extrato adequado para as análises posteriores.

4.5.4 Partição liquído-líquido do extrato hidroacetônico com Acetato de etila e Água

Uma amostra do extrato, aproximadamente 3,6g foi solubilizada em 500

mL de água destilada e submetida a filtração simples. O filtrado foi transferido para um funil

de separação de 2L e em seguida foram adicionados 200 mL de acetato de etila. O funil foi

45

agitado cuidadosamente por cerca de 5 minutos e deixado em repouso para decantar e separar

as fases. Este procedimento foi realizado por três vezes até esgotamento. As frações aquosa

(FAH) e acetato de etila (FAEH) foram armazenadas para posterior liofilização e concetração

sob baixa pressão respectivamente. Antes de ser concentrada, a FAEH foi tratada com sulfato

de sódio anidro para retirar a água residual, armazenada em frasco apropriado, seco em estufa

e finalmente pesada obtendo-se assim aproximadamente 1g com rendimento de 28% e a

massa da FAH liofilizada foi de 800mg com rendimento de 22%.

4.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS

A determinação das classes de metabólitos secundários foi realizada com

base no Manual de Análise Fitoquímica e Cromatográfica de Extratos Vegetais do

Laboratório de Fitoquímica (BARBOSA, 2004).

Foram realizados testes para as classes dos metabólitos secundários:

açúcares redutores, alcalóides, antraquinonas, azulenos, catequinas, carotenóides, derivados

da cumarina, depsídeos e depsidonas, derivados de benzoquinonas, esteróides e

triterpenóides, fenóis e taninos, flavonóides, glicosídeos cardíacos, polissacarídeos, proteínas

e aminoácidos, purinas, saponinas e sesquiterpenolactonas. Foram analisados os extratos

etanólico bruto e o hidroacetônico.

4.7 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

4.7.1 Monitoração dos extratos e frações por CCD

A Cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em

cromatoplacas padronizadas de alumínio com gel de sílica Alugram Sil G/UV254 Macherey-

Nagel® de 0,20 mm de espessura. Para monitoração dos extratos e frações obtidas o sistema

46

de solventes utilizado foi hexano/acetato de etila em diferentes proporções (1:1, 8:2 e 7:3) e

os cromatogramas observados sob luz UV de 254nm e 365nm e revelados com H2SO4 a 20%

seguido de aquecimento, com NP/PEG e solução de Folin.

4.7.2 Determinação da presença de catequina por CLAE analítica da fração acetato de

etila (FAEH) obtida do EHA.

Foi utilizado o sistema de cromatografia líquida de alta eficiência(CLAE)

La Chrom Merck Hitachi 7000 e eluido com uma coluna Resechrom (Regis) RP 18, L-7351

25cm/4,6mm I.D, interface D-7000. Detecção: DAD detector Lachron Merck L-7450A,

Bomba L-7100, integração do sinal em 240-260 nm e fluxo de 1mL/min.

Solução de 5mg/mL da FAEH foi preparada para a análise cromatográfica

por CLAE e utilizou-se o método I segundo o artigo de Moreira et al. (2005), com o

gradiente de Ácido acético em água 2,5% como solvente A e acetonitrila 100% como

solvente B, utilizando-se de 0-3 min 3% de B de forma isocrática; de 3-13 min 9% de B de

forma linear; de 13-18 min 11% de B de forma linear; de 18-25 min 18% de B de forma

linear; de 25-30 min 18% de B de forma isocrática; de 30-40 min 30% de B de forma linear

seguida pela lavagem da coluna por 10 min com acetonitrila.

4.7.3 Cromatografia em coluna (CC) da fração clorofórmio (FCE) obtida do EEB

Cerca de 1g da fração clorofórmio (FCE) foi fracionada por cromatografia

em coluna, empregando-se uma coluna de vidro de 56cm de comprimento por 2,4cm de

diâmetro. Como fase estacionária utilizou-se gel de sílica de fase normal e como eluentes:

hexano 100%, hexano/acetato de etila (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70,

20:80, 10:90), acetato de etila 100%, acetato de etila/metanol (90:10, 80:20, 70:30, 60:40,

47

50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90) e metanol 100%. Foram obtidas 160 frações,que foram

monitoradas por CCD com o eluente hexano/ acetato de etila (7:3) e a seguir (1:1). As

frações foram reunidas de acordo com o perfil apresentado nos cromatogramas, obtendo-se

assim 40 frações monitoradas por CCD, visualizadas no UV a 254nm e 365 nm e reveladas

com H2SO4 a 20%. As frações 6, 7, 9, 12, 13 e 14 apresentaram-se mais interessantes de

acordo com o desenvolvimento das cromatoplacas após revelação e foram analisados por

RMN 1H. As frações 6 e 14 foram analisadas por CG-EM posteriormente.

4.7.4 Cromatografia de Contra Corrente da FAEH obtida do EHA

Foram utilizados 50 mg da amostra, que foi solubilizada em 1mL da

mistura dos solventes utilizados, sendo 0,5mL da fase superior e 0,5mL da fase inferior. Os

solventes utilizados foram hexano/acetato de etila/metanol/água na proporção

(0,6:0,8:0,6:0,8). A fase superior foi considerada a fase móvel e a fase inferior a fase

estacionária. Foi utilizada uma coluna de 26mL, com fluxo de 1mL/min e a retenção da

coluna foi de 13mL (50%) da fase estacionária. Foram utilizados 80 tubos de ensaio para

coletar as frações e no tubo 53 foi desligada a rotação, pois já havia sido coletado duas vezes

o volume da coluna utilizada.

4.7.5 Cromatografia gasosa (CG)

A análise cromatográfica preliminar das frações 6 e 14 obtidas da da fração

clorofórmio (FCE) por CC, foi realizada nas seguintes condições: coluna utilizada DB-1MS,

solvente clorofórmio para solubilizar as amostras, gás de arraste Hélio, temperatura do injetor

60ºC – 290ºC a 10ºC/min permanente a 290ºC/15min (isotérmico).

48

4.7.6 Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (CG-EM)

Na análise por CG-EM das frações 6 e 14 obtidas da fração clorofórmio

(FCE) da CC, foi utilizada uma coluna ZB-5MS, solvente clorofórmio para solubilizar as

amostras, gás de arraste utilizado Hélio com fluxo de 1mL/min, temperatura do injetor de

270ºC e a variação foi de 10ºC/min. As análises foram realizadas em espectrômetro

por impacto de elétrons a 70eV e os resultados expressos em relação massa/carga

(m/z).

4.8 ENSAIOS ANTIOXIDANTE IN VITRO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES

Foi realizada a análise quantitativa da capacidade antioxidante para o EHA

e suas frações FAEH e FAH e para o EEB e suas frações FHE, FCE, FAEE e FME

comparando-as com o padrão EGb 761 . Foram construídas as tabelas com os dados da AA%

e CE50 e os gráficos comparativos das análises das amostras e do padrão EGb (761). Os

ensaios foram realizados de acordo com a metodologia dos trabalhos descritos por Mensor et

al.(2001).

Foram pesados 20 mg de cada amostra e solubilizado em 20 mL do

solvente adequado no caso do extrato hidroacetônico em água e suas frações em metanol, ou

seja o mesmo solvente utilizado na preparação da solução de DPPH. A solução do padrão

utilizado EGb (761) foi preparado em metanol a 1,0 mg/mL para as posteriores diluições.

As amostras foram diluídas a concentrações finais de 250; 125; 50; 25;

10;7,5; 5, 2,5, 1,0 e 0,5 µg/mL em metanol, partindo-se da solução estoque de 1,0 mg/mL.

Foram utilizadas duas séries de testes com DPPH (0,1 mM e 0,3mM) de cada uma destas

soluções adicionou-se 1mL a 2,5 mL da solução de cada amostra (A). A mistura de 1mL de

49

Metanol e 2,5mL da solução-amostra foram usados como branco (B). A solução de DPPH

(1,0 mL; 0,1 mM ou 0,3mM) e 2,5mL de metanol foram usados como controle (C). As

reações transcorreram à temperatura ambiente e no escuro por 60 minutos. A seguir foram

realizadas as leituras das absorbâncias, a 517 nm. Os valores de absorbância foram

convertidos em atividade antioxidante percentual (AA%) usando a seguinte fórmula:

AA% = 100 – { [ (ABSA – ABSB) X 100 ] / ABSC}

Onde:

AA% - Atividade Antioxidante percentual;

ABSA - Absorbância de A (amostra);

ABSB - Absorbância de B (branco);

ABSC - Absorbância de C (controle).

Como padrão de atividade antioxidante foi usado extrato padronizado de

Ginkgo biloba (EGb 761), utilizando os mesmos procedimentos de diluições seriadas

executados com as amostras provenientes dos extratos. Todas as análises foram realizadas

em triplicata (MENSOR et al.,2001).

Após os cálculos dos percentuais de atividade antioxidante foram

calculados os valores da CE50 do extrato, frações e do padrão para posteriomente serem

construídos os gráficos comparativos e representativos das análises (MENSOR et al., 2001).

CE50 = Quantidade de antioxidante necessário para diminuir a concentração inicial de DPPH em 50%.

4.9 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENÓIS TOTAIS (FT) NOS EXTRATOS E

FRAÇÕES

Os extratos e frações foram analisados pelo método colorimétrico

utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau (ANDRADE et al., 2007) com algumas

50

modificações, para determinação do teor de fenóis totais. O ácido gálico foi usado para

elaboração da curva de concentração padrão. O teor de fenóis totais foi determinado por

interpolação dos dados das amostras na curva de calibração construída com o ácido gálico e

expressos como equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/g de amostra).

A solução estoque de ácido gálico também foi preparada em água destilada

a 1,0 mg/mL e foram realizadas diluições obtendo-se concentrações finais de 12,5; 10,0; 7,5;

5,0 e 2,5 µg/mL (ANDRADE et al, 2007).

Foi preparada uma solução estoque para as amostras EHA e FAH em água

destilada a 1,0 mg/mL para posteriores diluições. As amostras foram diluídas a

concentrações finais de 400, 200, 100, 50 e 25 µg/mL em água destilada, partindo-se da

solução estoque (1,0 mg/mL). A 0,5 mL da amostra foi adicionado 0,5 mL do reagente de

Folin-Ciocalteau 2N e 1,0 mL de água destilada. Após um período de 5 minutos foi

acrescentado aos tubos 0,5 mL de carbonato de sódio (Na2CO3) a 10%, sob agitação. Após 1

hora de incubação à temperatura ambiente, as absorbâncias foram medidas em

espectrofotômetro a 760 nm, usando água destilada como branco (Figura 4). Todas as leituras

foram realizadas em triplicata (ANDRADE et al, 2007).

Todas as etapas destes experimentos para determinação do teor de fenóis

totais no padrão e nas amostras encontram-se detalhadas na figura 4, onde são mostrados os

procedimentos, etapas e informações necessárias para realização do ensaio.

51

Figura 4 - Esquema das etapas da preparação das soluções para a análise do teor de fenóis

totais.

52

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados da atividade antioxidante e teor de fenóis totais obtidos com

as amostras testadas foram expressos neste trabalho como a média de três repetições (n=3) ±

desvio padrão da média e foram analisados utilizando análise de variancia unilateral

ANOVA. A análise estatística foi realizada utilizando o programa BioEstat 4.0 (AYRES et

al., 2005).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO PÓ

Os resultados obtidos na análise granulométrica do pó das raízes do

açaizeiro estão apresentados na tabela 1. Os valores obtidos de fração retida, residual e

passagem percentual estão representados nos gráficos (figuras 5 e 6).

Tabela 1 - Análise granulométrica por tamisação do pó das raízes de Euterpe oleracea Mart.

(Açaí).

Abertura

de malha

(mm)

Peso dos

tamises (g)

Peso dos

tamises após

vibração (g)

Fração retida

percentual

(%)

Fração residuo

percentual (%)

Fração

passagem

percentual (%)

2,000 107,18 107,18 0 0 100

1,400 110,88 110,97 0,9 0,9 99,1

0,710 103,04 105,93 28,9 29,8 70,2

0,355 99,45 103,22 37,4 67,2 32,8

0,250 99,13 99,45 3,2 70,4 29,6

0,180 97,15 98,00 8,5 78,9 21,1

0,125 95,74 96,38 6,4 85,3 14,7

Coletor 0,86 1,38 5,2 90,5 9,5

53

A distribuição granulométrica é um fator importante na obtenção de um

extrato, pois um maior ou menor rendimento de extração está relacionado com a área de

superfície e dimensões das partículas em contato com o líquido extrator (CARDOSO, 2002).

A figura 5, que representa a curva de distribuição granulométrica da droga

triturada mostrou que a maior porcentagem de partículas ou seja mais de 65% encontram-se

na faixa granulométrica que varia de 0,355 a 0,710 mm.

Figura 5 - Curva de distribuição granulométrica da droga vegetal.

A figura 6 representa as curvas características de retenção e passagem da

droga triturada através da análise granulométrica por tamisação, empregando-se os dados

fornecidos pela tabela 1. O pó é considerado grosso de acordo com o que preconiza a

Farmacopéia Brasileira 4a edição, pois as partículas passam em quase 100 % pelo tamis de

abertura nominal de malha de 1,400mm e 32,8 % pelo tamis de abertura nominal de malha de

0,355mm. O diâmetro médio, calculado a partir do ponto de intersecção das retas foi de

aproximadamente 0,533mm.

Figura 6 - Curvas cumulativas de resíduo e passagem da droga vegetal após tamisação.

54

5.2 EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO

A fração clorofórmio (FCE) obtida do extrato etanólico bruto foi tratada em

coluna cromatográfica de gel de sílica de fase normal, conforme descrito no item 4.7.3. A

partir de 1g da amostra FCE foram obtidas 40 frações, as quais foram monitoradas por CCD

com o sistema de solvente hexano/acetato de etila (1:1) e posteriormente analisadas por

RMN 1H. Destas frações, as 18 primeiras encontram-se ilustradas na cromatoplaca das figura

9 após revelação e o espectro de RMN 1H obtido da fração 6 é mostrado na figura 10 e uma

ampliação na figura 11, ilustrando a estrutura de uma das substâncias detectadas.

As 18 primeiras frações obtidas da partição em clorofórmio por

fracionamento em CC que foram monitoradas por CCD estão apresentadas na figura 7 a

seguir.

Figura 7 - Cromatografia em camada delgada das frações 1 a 18 obtidas por CC.

Do fracionamento por CCC da fração acetato de etila (FAEH) foram

obtidas 4 frações, as quais foram monitoradas por CCD com o sistema de solvente

hexano/acetato de etila (1:1). O resultado não foi conclusivo, pois seriam necessários outros

fracionamentos, haja vista que não pôde ser realizado o isolamento de nenhuma substância

55

devido à pequena quantidade de material obtido, não sendo possível assim realizar outras

análises.

5.3 ABORDAGEM FITOQUÍMICA

O resultado da abordagem fitoquímica encontra-se representado no quadro

4, onde o extrato etanólico bruto (EEB) apresentou resultados positivos para as seguintes

classes de metabólitos secundários: açúcares redutores, catequinas, depsídeos e depsidona,

esteróides e triterpenóides, taninos catequinicos, flavonóides, glicosídeos cardíacos e

sesquiterpenolactonas. Enquanto o extrato hidroacetônico (EHA) apresentou resultados

positivos para os açúcares redutores, catequinas, taninos catequinicos, flavonóides e nos

testes específicos, obteve-se resultado positivo para catequinas e flavanonas. Os resultados

obtidos para estas classes de substâncias químicas estão de acordo com o que já se tem

detectado, identificado e isolado nesta espécie em estudos já realizados com os frutos

(SILVA, 2007).

Quadro 4 - Resultados da Abordagem fitoquímica do extrato etanólico e hidroacetônico das

raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí)

Testes fitoquímicos Extrato Etanólico Bruto EEB

Extrato Hidroacetônico EHA

Açúcares Redutores + +

Catequinas + +

Depsídeos e Depsidonas + -

Esteróides e Triterpenóides + -

Fenóis e Taninos + p/ taninos Catequinicos +p/ taninos catequinicos

Flavonóides + +

Glicosídeos Cardíacos + -

56

5.4 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA POR CLAE DA FAEH

A análise cromatográfica por CLAE da FAEH obtida do EHA, mostrou

através do cromatograma obtido a possível presença da substância catequina, caracterizada

pelo pico em 6,91min, que quando comparado com os dados apresentados na literatura

(MOREIRA, 2005) onde é mostrado pico com tempo de retenção em 6,8min o qual pode ser

considerado semelhante ao obtido na análise pois foram detectados utilizando o mesmo

método e nas mesmas condições. A seguir a estrutura da catequina e o cromatograma obtido

na análise (figura 8).

1,07

2,69

3,25 4,80

6,91

7,76

8,43

9,01

9,65

10,11

11,39

12,13

13,04

13,55

13,97

14,48

15,71

15,97

16,43

17,47

20,80

21,28

23,57

24,40

25,55

26,75

27,44

28,67

29,52

29,81

30,19

30,72

31,09

32,69

33,04

33,55

33,87 34,77

35,04

35,65

36,21

36,37

36,96

37,41

37,76

38,29

38,72

39,23

40,43

42,45

42,85

43,25

43,95

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Retention Time (min)

-0,10

0,00

0,10

0,20

0,30

Absorbance (AU)

Figura 8 – Presença de catequina na fração acetato de etila (FAEH) por CLAE.

57

5.5 TEOR DE FENÓIS TOTAIS

O ensaio para determinação dos teores de fenóis totais que está descrito no

item 4.9 teve o auxílio de uma curva padrão do ácido gálico (R2=0,993) representada na

figura 9, para expressar o teor de fenóis totais no extrato hidroacetônico (EHA) e sua fração

aquosa (FAH) em equivalente de ácido gálico por unidade de massa. O teor de fenóis totais

(mg de ácido gálico/g de amostra) para as amostras EHA e FAH foram de aproximadamente

55 e 77 respectivamente, as quais foram analisadas nas concentrações de 25, 50, 100, 200 e

400µg/mL. Os valores obtidos correspondem a média das três determinações para cada

concentração. Estes resultados mostram que o teor de fenóis totais presentes nas amostras

foram significativos, o que pode ser consequência da composição química das amostras,

caracterizadas pela predominância de compostos de alta polaridade e podem estar

relacionados com os elevados valores de atividade antioxidante (%) apresentada pelas

mesmas.

Figura 9 - Curva padrão e equação da reta obtidas após os ensaios com ácido gálico nas

concentrações de 2,5; 5,0 ; 7,5; 10,0 e 12,5 µg/mL.

58

5.6 ESPECTRO DE RMN 1H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 6.

O espectro de RMN 1H (figura 10) da fração 6 mostra sinais característicos

dos esteróides sitosterol e estigmasterol nas formas livre. O espectro apresentou um conjunto

de sinais em 0,65ppm a 2,40 ppm característicos de esqueleto esteroidal. O multipleto em

3,52 ppm é característico do hidrogênio oximetínico H-3 do sitosterol e do estigmasterol. O

singleto largo (sl) em 5,36 ppm é devido ao hidrogênio olefínico H-6 tanto para o sitosterol

como para o estigmasterol. A expansão do espectro de RMN 1H (figura 11) da fração 6 exibe

ainda dois duplos dubletos (dd) em 5,04 ppm (J=7,0 Hz e J=15 Hz) e 5,17 ppm (J=7,0 Hz e

J=15 Hz), referentes, respectivamente, aos hidrogênios H-22 e H-23 da cadeia lateral do

essstigmasterol. Esses sinais estão de acordo com os dados da literatura para estas

substâncias (KUO & LI, 1997).

ppm (t1)0.05.010.0

0

50

100

150

200

250

7.264

5.3585.3455.1855.1685.1645.1535.1475.126

5.0485.0335.0275.0104.9893.488

1.254

1.0100.8460.8280.8240.806

0.6810.000

Figura 10 - Espectro de RMN 1H da fração 6 (300 MHz; CDCl3; relativo para TMS).

59

Figura 11 - Ampliação da área que corresponde aos sinais de hidrogênios de 4,00 ppm a 5,50

ppm da fração 6.

Tabela 2 - Dados de RMN 1H da fração 6 (300 MHz; CDCl3;relativo para TMS).

Hidrogênio δ (ppm) Multiplicidade J (Hz)

H6 5,36 sl -

H22 5,17 dd 15 e 7,0

H23 5,04 dd 15 e 7,0

A ampliação do espectro de RMN 1H (figura 11) da fração 6 mostra sinais

na faixa de 4,00 a 4,40 ppm referentes a unidade de açúcar. Com apenas o espectro de RMN

1H não foi possível identificar com segurança qual(ais) substância(s) glicosilada(s) está(ao)

presente(s) nessa fração. O espectro de RMN 13C seria muito útil para essa análise, porém

não foi obtido. Pode-se especular a presença dos esteróides glicosilados estigmasterol e

sitosterol e/ou ainda a glicose livre. A análise por CG-EM da fração 6 não detectou essas

60

substâncias, o que pode estar associado à solubilização da amostra para injeção no

cromatógrafo.

A fração 6 foi submetida à análise por CG-EM nas condições

cromatográficas descritas no item 4.7.6. A figura 12 mostra o cromatograma desta fração,

onde os principais sinais estão indicados com seus respectivos valores de tempo de retenção.

Figura 12 - Cromatograma da fração 6 por CG-EM (TIC).

Os espectros de massas gerados a partir dos picos detectados na fração 6

analisada por CG-EM (figuras 13 a 16) foram correspondentes aos derivados de ácidos

graxos e esteróides e a comparação com espectros da biblioteca do aparelho levou a sugerir a

presença do ácido hexadecanóico (ácido palmítico) (pico 12, figura 13), estigmasterol (pico

38, figura 14), sitosterol (α-dihidrofucosterol) (pico 39, figura 15), estigmasta-3,5-dien-7-one

(β-sacharostenona) (pico 44, figura 16) que correspondem aos compostos majoritários, ou

seja que apresentaram percentuais de área dos picos acima de 4%. O sitosterol e o

61

estigmasterol estão presentes na fração 6, respectivamente, em 25,08% e 8,24%, portanto,

são os majoritários, o que está de acordo com a intensidade dos sinais observada no espectro

de RMN 1H para essas substâncias. Além dessas, foram identificadas, também, as

substâncias minoritárias campesterol (5-ergostenol) (pico 37, figura 12), estigmastenona

(pico 45, figura 12), estigmastano-3,6-diona (pico 48, figura 12). Essas substâncias

minoritárias estão de acordo com os tipos de estruturas (esteróides) indicadas pela análise do

espectro de RMN 1H da fração 6.

A identificação das substâncias foi feita através da biblioteca digital de

espectros do software do próprio aparelho e todas as estruturas propostas tiveram um alto

índice de similaridade. As estruturas das substâncias encontram-se ilustradas no quadro 5 e 6,

na página 69 e 70.

Figura 13 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro do pico

12 eluído em 17,2 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido hexadecanóico (ácido

palmítico).

62


massas do pico 38 eluído em 31,9 min (B) obtido por CG-EM proposto para o estigmasterol.


massas do pico 39 eluído em 33,5 min (B) obtido por CG-EM proposto para o sitosterol (α-

dihidrofucosterol).

63


massas do pico 44 eluído em 35,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para a substância

estigmasta-3,5-dien-7-ona (β-sacharostenona).

5.7 ESPECTRO DE RMN 1H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 14.

O espectro de RMN 1H (figura 17) da fração 14 apresentou sinais

característicos de ácidos graxos e derivados (KNOTHE, 2005). Dentre outros, o espectro

exibe o tripleto em 2,34 ppm e o multipleto em 1,61ppm atribuídos aos hidrogênios

metilênicos (CH2) α e β à carbonila, respectivamente. O sinal intenso em 1,27 ppm é devido

aos demais hidrogênios metilênicos da cadeia longa dos ácidos graxos. O conjunto de sinais

entre 0,90 e 0,60 ppm são relacionados aos grupos metílicos (CH3) terminais da mistura de

ácidos graxos.

Tabela 3 - Dados de RMN 1H da fração 14 (300 MHz; CDCl3; relativo para TMS).

Hidrogênios δ(ppm)

CH2α carbonila 2,36 a 2,02

CH2 β carbonila 1,65 a 1,59

CH2 cadeia longa 1,27

CH3 terminal 0,90 a 0,60

64

ppm (t1)0.05.010.0

0

500

1000

1500

7.262

3.491

2.3632.3442.3251.6491.6321.6131.5941.3021.255

0.8970.8800.8700.8630.8530.8460.8270.000

ppm (t1)0.000.501.001.502.00

0

500

1000

1500

2.363

2.344

2.325

1.649

1.632

1.613

1.594

1.3021.255

0.897

0.8800.8700.8630.8530.846

0.827

0.000

Figura 17 - Espectro de RMN 1H da fração 14 e ampliação da área com sinais de hidrogênios de 0 a 2,50ppm (300 MHz; CDCl3; relativo para TMS).

65

A figura 18 mostra o cromatograma da fração 14 obtido com as condições

cromatográficas e espectroscópicas descritas no item 4.7.6. Os principais sinais estão

indicados com seus respectivos valores de tempo de retenção.

Figura 18 - Cromatograma da fração 14 obtido da análise por CG-EM (TIC).

A análise por CG-EM da fração 14 mostrou após comparação dos dados

obtidos com os da literatura através das semelhanças apresentadas pelos espectros, a presença

dos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: ácido dodecanóico (ácido láurico) (pico 6,

figura 19), ácido tetradecanóico (ácido mirístico) (pico 7, figura 20), ácido pentadecanóico

(ácido pentadecílico) (pico 8, figura 21), ácido hexadecanóico (ácido palmítico) (pico 10,

figura 22) e ácido octadecanóico (ácido esteárico) (pico 13, figura 23) que correspondem aos

compostos majoritários, ou seja que apresentaram percentuais de área dos picos acima de

5%. Foram identificados, ainda, como componentes minoritários o aldeído n-nonanal (pico 1,

figura 18), o ácido decanóico (ácido cáprico) (pico 4, figura 18) e o n-hexadecanoato de

66

metila (éster metílico do ácido palmítico) (pico 9, figura 18) onde são mostrados no quadro 6

da página 70. As substâncias identificadas por CG-EM estão de acordo com o previsto pela

análise de RMN 1H da fração 14. Nesse espectro não é possível detectar o sinal do

hidrogênio do grupo aldeído, mas isso pode ser explicado pela baixa concentração do n-

nonanal nessa fração.

A identificação das substâncias foi feita através da biblioteca digital de

espectros do software do próprio aparelho e todas as estruturas propostas tiveram um alto

índice de similaridade.


massas do pico 6 eluído em 12,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido

dodecanóico (ácido láurico).

67


massas do pico 7 eluído em 14,9 min (B) obtido por GC-MS proposto para a substância ácido

tetradecanóico ou ácido mirístico.



pentadecanóico (pentadecílico).

68



hexadecanóico (ácido palmítico).



octadecanóico (ácido esteárico).

69

Quadro 5 – Estruturas dos compostos majoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e

14.

FRAÇÃO 6 FRAÇÃO 14

Ácido Hexadecanóico

Ácido Dodecanóico

Estigmasterol

Ácido Tetradecanóico

Sitosterol

Ácido Pentadecanóico

Sacharostenona

Ácido Hexadecanóico

Ácido Octadecanóico(ácido esteárico)

70

Quadro 6 – Estruturas dos compostos minoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e

14.

FRAÇÃO 6 FRAÇÃO 14

Campesterol

O

n-Nonanal

Estigmastenona

O

Ácido n-Decanóico

Estigmastano-3,6-dione

Hexadecanoato de metila

71

5.8 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE

A avaliação da atividade antioxidante das amostras analisadas mostrou que

os extratos e frações de Euterpe oleracea Mart.(Açaí) são bem mais ativos em relação ao

padrão EGB (761) que foi utilizado e confirmam assim a forte atividade antioxidante que

esta espécie apresenta e que já foi demonstrada nos frutos.

Os resultados obtidos na avaliação da atividade antioxidante (AA%) frente

ao radical DPPH 0,1mM e as CE50 das amostras EHA, FAEH, FAH e padrão EGb (761) nas

concentrações de 2,5; 5; 7,5; 10 e 25 µg/mL são mostradas na tabela 4. Um gráfico em barras

(figura 24) mostrou uma comparação entre as quatro amostras analisadas. As frações FAH e

FAEH apresentaram maior atividade antioxidante frente ao radical DPPH 0,1mM, pois foram

as que obtiveram os menores valores de CE50 de 2,073 e 2,277 respectivamente, ou seja

diminuíram a concentração do DPPH em 50% com as menores concentrações, seguidas pelo

padrão EGb que apresentou CE50 de 5,093.


frente ao radical DPPH 0,1mM.

Concentração

(µg/mL)

AA (%)

EHA

(AA%)

FAEH

(AA%)

FAH

AA (%)

PADRÃO

2,5 10,835 58,082 29,130 12,789

5,0 25,933 83,837 53,641 48,668

7,5 43,694 84,014 81,350 54,174

10 60,036 83,304 84,725 83,304

25 77,975 86,146 80,639 89,876

CE50±DP 8,465±0,100 2,073±0,329 2,277±0,299 5,093±0,166

72

Figura 24 - Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante apresentada pelas

amostras EHA, FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5, 10 e 25 µg/mL

frente ao radical DPPH 0,1 mM e com seus respectivos erros padrões.


ao radical DPPH 0,3mM e as CE50 das amostras EHA, FAEH, FAH e o padrão EGb (761)

nas concentrações de 2,5; 5; 7,5; 10 e 25 µ/mL são apresentadas na tabela 5 e um gráfico em

barras (figura 25) mostra uma comparação entre as quatro amostras analisadas evidenciando

as diferenças obtidas nas diversas concentrações. As amostras FAEH e FAH foram as mais

potentes das quatro frente ao radical DPPH 0,3mM. Aprsentaram AA% relativamente alto

pois os valores de CE50 obtidos foram de 7,55 e 9,363 respectivamente enquanto o padrão

21,16. A amostra EHA não atingiu a CE50 com a maior concentração testada de 25µg/mL e

teve que ser calculada com o auxílio da equação da reta.

73


frente ao radical DPPH 0,3mM.

Concentração

(µg/mL)

(AA%)

EHA

(AA%)

FAEA

(AA%)

FAA

(AA%)

PADRÃO

2,5 14,000 25,525 22,102 13,932

5,0 17,898 38,000 31,017 26,881

7,5 22,678 49,763 44,847 30,441

10 32,746 60,000 51,763 35,119

25 44,237 95,186 94,780 55,119

CE50±DP 27,906±0,369 7,550±0,385 9,363±1,092 21,161±1,309

Figura 25 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EHA,

FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5; 10 e 25 µg/mL frente ao

radical DPPH 0,3 mM com seus respectivos erros padrões.

74


ao radical DPPH 0,3mM e as CE50 das amostras EEB, FHE, FCA, FAEA, FMA e padrão

EGb (761) nas concentrações de 5; 10; 25, 50 e 100 µg/mL são mostradas na tabela 6 e um

gráfico em barras (figura 26) mostra uma comparação das seis amostras analisadas

evidenciando as diferenças obtidas nas diversas concentrações. A amostra EEB foi a mais

potente das seis amostras apresentando uma atividade antioxidante (AA%) frente ao radical

DPPH 0,3mM bastante sigificativa pois a CE50 de 5,46 bem menor que o do padrão utilizado

e das outras amostras analisadas. A amostra FHA não atingiu a CE50 nem com a maior

concentração testada de 100µg/mL e teve que ser calculada com o auxílio da equação da reta,

isto mostra que quanto menos polar a amostra analisada menor é a AA% apresentada.

Tabela 6 - Atividade antioxidante (%) e CE50 do EEB, FH, FC, FAE e FM e do padrão EGb

(761) frente ao radical DPPH 0,1mM.

Concentração (µg/mL)

AA (%)

EEBA

(AA%)

FHA

(AA%)

FCA

AA (%)

FAEA

AA(%)

FMA

AA(%)

PADRÃO

5 46,523 10,547 12,803 16,484 14,922 17,930

10 83,789 11,328 14,961 24,492 23,984 22,070

25 92,031 12,148 24,844 43,906 47,539 63,164

50 93,711 18,438 52,344 74,688 73,008 86,953

100 87,031 23,906 74,492 88,867 87,617 90,859

CE50

±DP 5,46

±0,11 275,85* 47,86 ±1,43

29,95 ±1,29

27,42 ±4,25

20,20 ±1,46

*A amostra FHA não chegou a alcançar a CE50 nas concentrções testadas, então esta foi calculada com auxílio

da equação da reta obtida do gráfico, não sendo possível calcular o desvio padrão.

75

Figura 26 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EEBA,

FHA, FCA, FAEA, FMA e do padrão EGb (761) nas concentrações de 5; 10 e 25 µg/mL

frente a radical DPPH 0,3mM com seus respectivos erros padrões.

76

6 CONCLUSÃO

Pelos resultados obtidos com a investigação fitoquímica dos extratos

etanólico (EEB) e hidroacetônico (EHA), a análise cromatográfica e espectroscópica das suas

respectivas frações, observa-se a presença, nas amostras, de compostos de alta polaridade

indicados nos ensaios de teor de fenóis totais e compostos de baixa polaridade como

derivados de ácidos graxos e esteróides, determinados por análises de RMN 1H.

As análises por CG-EM das frações 6 e 14 levaram à obtenção de uma série

de espectros, os quais foram comparados com os espectros existentes na biblioteca do

aparelho, levando à identificação de substâncias das classes dos esteróides, de ácidos graxos

e derivados. As substâncias identificadas estão de acordo com o perfil fitoquímico indicado

nos resultados e na literatura para a espécie Euterpe oleracea Mart (Açaí).

Os esteróides caracterizados nas frações 6 e 14 foram o estigmasterol,

sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona e estigmastano-3,6-diona. Os

ácidos graxos e derivados identificados foram o ácido dodecanóico (ácido láurico), ácido

tetradecanóico (ácido mirístico), ácido pentadecanóico, ácido hexadecanóico (ácido

palmítico), ácido octadecanóico (ácido esteárico), ácido decanóico (ácido cáprico), o aldeído

n-nonanal e o n-hexadecanoato de metila (éster metílico do ácido palmítico).

O resultado obtido na análise cromatográfica por CLAE da FAEH mostrou

a possível presença de catequina na amostra, o que é evidenciado pelo valor do tempo de

retenção apresentado pelo sinal, que pode ser considerado semelhante ao citado no artigo

usado com referência nesta análise.

No geral as amostras testadas apresentaram um percentual de atividade

antioxidante (AA%) bastante significativo em relação ao padrão EGb (761), com destaque

especial para as amostras FAH e FAEH testadas frente ao radical DPPH nas concentrações

77

de 0,1 e 0,3 mM, apresentando uma CE50 de 2,073; 2,277 e de 7,55; 9,363 para as respectivas

amostras e nas respectivas concentrações de DPPH, estes bem menores que o do padrão

utilizado, ou seja o consumo de DPPH foi maior, e consequentemente as atividades

antioxidantes das amostras também foram maiores nas mesmas concentrações testadas com o

padrão EGb (761). A amostra EEB testada frente ao radical DPPH 0,3mM também

apresentou uma CE50 de 5,46 valor bem significativo em relação ao CE50 apresentado pelo

padrão EGb (761) que foi de 20,2 e de suas frações.

O teor de fenós totais encontrado para as duas amostras testadas EHA e

FAH foi de aproximadamente 55 e 77 (mg de ácido gálico/g de amostra), respectivamente, e

pode ser considerado relativamente alto quando comparado com outros valores encontrado

em estudos realizados com a espécie, já descritos na literatura.

A evidência de uma atividade antioxidante elevada nos extratos e frações

analisadas de Euterpe oleracea Mart. encorajam estudos com as substâncias e suas frações

obtendo um maior grau de pureza das amostras, a fim de se determinar e isolar os compostos

fenólicos presentes que de alguma forma estão relacionados com a atividade antioxidante

apresentada pelas amostras testadas. Vale ressaltar que este é o primeiro estudo químico e

fitoquímico realizado com as raízes de Euterpe oleracea Mart. até o momento.

78

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