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Juliana Tavares Pinheiro
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, estado
do Rio de Janeiro e Mossoró, estado do Rio Grande do Norte
Rio de Janeiro
2017
Juliana Tavares Pinheiro
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, Estado
do Rio de Janeiro e Mossoró, Estado do Rio Grande do Norte
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Saúde Pública, da Escola
Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, na
Fundação Oswaldo Cruz, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Saúde Pública. Área de concentração:
Abordegem Ecológica de Doenças
Transmissíveis.
Orientador: Prof. Dr. Fabiano Borges
Figueiredo.
Coorientador: Prof. Dr. Marcos Barbosa de
Souza.
Rio de Janeiro
2017
Catalogação na fonte
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica
Biblioteca de Saúde Pública
P654i Tavares-Pinheiro, Juliana.
Investigação de populações do complexo Lutzomyia
longipalpis em Mangaratiba, Estado do Rio de Janeiro e
Mossoró, Estado do Rio Grande do Norte / Juliana Tavares
Pinheiro. -- 2017.
66 f. : il. color. ; mapas
Orientador: Fabiano Borges Figueiredo.
Coorientador: Marcos Barbosa de Souza.
Dissertação (mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Escola
Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, Rio de Janeiro, 2017.
1. Psychodidae. 2. Leishmaniose. 3. Fenótipo.
4. Leishmaniose Visceral. 5. Lutzomyia longipalpis. I. Título.
CDD – 22.ed. – 616.9364
Juliana Tavares Pinheiro
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, estado
do Rio de Janeiro e Mossoró, estado do Rio Grande do Norte
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Saúde Pública, da Escola
Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, na
Fundação Oswaldo Cruz, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Saúde Pública. Área de concentração:
Abordegem Ecológica de Doenças
Transmissíveis.
Aprovada em: 16 de março de 2017.
Banca Examinadora
Prof.a Dra. Marina Carvalho Furtado
Fundação Oswaldo Cruz – Campus FIOCRUZ Mata Atlântica
Prof. Dr.Antonio Nascimento Duarte
Fundação Oswaldo Cruz – Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca
Prof. Dr. Fabiano Borges Figueiredo (Orientador)
Fundação Oswaldo Cruz – Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
Rio de Janeiro
2017
Dedico, aos meus miríficos pais (in memoriam).
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço ao meu pai Thelmo Azevedo Pinheiro (in memoriam) e a minha mãe
Jamil Ribeiro Tavares (in memoriam) por tudo amor, carinho e dedicação. Por terem sempre
zelado pela minha educação, como semear com a expectativa da colheita. Vocês vivem em
mim agora, “pois o que a memória ama fica eterno” Rubem Alves. Fazem parte do que sou
hoje e dessa conquista tão almejada. Certamente estão olhando por mim nesse momento.
Obrigada por tudo, amo muito vocês!!!
Ao meu orientador Dr. Fabiano Borges Figueiredo pela orientação segura, pelo exemplo
profissional e humano, sempre disposto a ajudar. Você foi fundamental na minha formação.
Muito obrigada!!!
Ao meu querido coorientador Dr. Marcos Barbosa de Souza (in memoriam) por ter aberto as
portas para mim e ter compartilhado com generosidade conhecimentos sobre flebotomíneos,
como especialista que era no assunto.
Aos meus companheiros de coleta, Adilson Benedito, Arthur Velho, Renato Orsini, Larissa
Clara, Cézar do Santo Ponte, Ciro Vilanova e Antônio Meira. A parceria de vocês foi
fundamental. Muito obrigada!!!
Aos professores da disciplina de seminários, Dra. Joseli Nogueira, Dra. Sheila Ferraz, Dr.
Francisco Paumgartten e Dra. Cecilia Paumgartten pelas valiosas contribuições nesse
processo.
À Thaís Leal, pela contribuição no trabalho, com importantes sugestões e sempre solícita.
À Thaís Kazimoto, por ter cedido gentilmente os espécimes de L. longipalpis provenientes do
estado do Rio Grande do Norte.
Aos técnicos em Saúde Pública do Instituto Nacional de Endemias Rurais- INERU,
especialmente Sidney da Silva Alves, Cesinha do Santo Ponte, Walace Guimarães e Flávio
Alcelino por todo o suporte que deram na identificação de flebotomíneos. Sempre muito
gentis e antenciosos, se tornaram bons amigos. Muito obrigada a todos!!!
A Dra. Suzana Côrte-Real Faria, a técnica Sandra Maria e aos estudantes Gabriel Henriques e
Stella da Silva Oliveira do laboratório de Biologia Estrutural; à Luisa Miranda e ao Dr.
Rodrigo Menezes do laboratório de dermatozoonoses por terem gentilmente ajudado a tirar as
fotos dos flebotomíneos L. longipalpis.
À toda equipe do laboratório de Dermatozoonoses.
Aos funcionários da secretaria do Departamento de Ciências Biológicas da ENSP, Maria
Isabel Pereira Soares, Rogéria Leite Peregrino Pinho, Rosa Maria Rodrigues Lopes e Fabiano
Esteves Silva, foram sempre muito amáveis e atenciosos.
Aos amigos brasileiros, colombianos, paquistaneses, moçambicanos, angolanos e cabo-
verdianos que conviveram comigo durante o mestrado no Alojamento do Centro de
Referência Professor Hélio Fraga. Obrigada pela experiência intercultural!!!
Dentre os amigos agradeço especialmente ao Ramon Feliphe Souza por ter me ajudado
cedendo seu tempo, sempre me incentivando e me lembrando que ostra feliz não faz pérolas.
Mergulhou tão intensamente no trabalho que agora é um historiador que sabe reconhecer as
manchas nos tergitos dos machos de L. longipalpis.
À amiga Quezia Dias, por ter me apresentado ao meu Coorientador, pelo incentivo e pelas
horas de estudos juntas desde a graduação ao processo seletivo do mestrado. Muito
obrigada!!!
Aos moradores das áreas de estudo por terem permitido as instalações das armadilhas no
peridomicílio de suas residencias.
À Marinha do Brasil, por ter concedido a realização do trabalho de campo na Restinga da
Marambaia.
Ao CNPQ pelo apoio financeiro.
E a todos aqueles que de alguma forma contribuiram para essa realização.
Seguir para a vida.
Ser barco, navegar.
Começar com uma gota,
de repente mar...
Ramon Feliphe Souza, amigo do Mestrado.
RESUMO
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) é considerado o principal vetor de Leishmania chagasi,
agente etiológico causador da leishmaniose visceral nas Américas. Durante estudos pioneiros no
nordeste Brasil, Mangabeira (1969) observou variações fenotípicas entre machos de L.
longipalpis que coexistiam em simpatria em Sobral no Ceará, e sugeriu que poderiam se tratar
de espécies distintas. Desde então a maioria dos estudos destinados a esclarecer o verdadeiro
status taxonômico de L. longipalpis, apontam para a existência de um complexo de espécies
incipiente, embora o número de integrantes e suas áreas de distribuição ainda não estejam
totamente resolvidos. Recentemente, estudos tem correlacionado variabilidade genética a
padrões fenotípicos distintos. Essas diferenças são de grande importância para a saúde pública,
não somente pela possibilidade de influenciarem na capacidade vetorial desses flebotomíneos,
mas também de sua antropofilia. O presente estudo teve como objetivo analisar as
características fenotípicas das populações de machos de L. longipalpis provenientes da Restinga
da Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo
Antônio, localizado no município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, região semi-
árida do nordeste brasileiro. As capturas foram realizadas durante o período de 12 meses.
Armadilhas do tipo HP foram empregadas, iniciadas às 18 horas e encerradas às 7 horas do dia
seguinte, totalizando 13 horas/coleta. Os flebotomíneos machos capturados foram identificados
a nível de espécie de acordo com a nomenclatura proposta por Galati (2003) e, em seguida, os
machos de L. longipalpis obtidos submetidos à caracterização fenotípica. Todos os machos de
L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia apresentaram o padrão morfológico de
uma mancha clara no 4º tergito abdominal, morfotipo predominante também em outras áreas do
Rio de Janeiro. No bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, identificamos significativa
diversidade fenotípica, composta por machos que apresentaram o padrão morfológico de uma
mancha clara no 4º tergito abdominal, enquanto outros apresentaram o padrão morfológico de 2
manchas claras no 3º e no 4º tergito, além do encontro de um fenótipo intermediário
representado por machos com uma mancha clara no 4º tergito e 3/4 do 3º tergito preenchido
pela mancha clara. Na última região, variedades morfológicas parecem apresentar importância
vetorial com fortes consequências epidemiológicas, tendo em vista a maior incidência da
leishmaniose visceral na região nordeste do Brasil, sobretudo no Estado do Rio Grande do
Norte.
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis lato sensu. Complex Lutzomyia longipalpis.
Caracterização fenotípica.
ABSTRACT
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) is considered the main vector of Leishmania chagasi,
an etiological agent that causes visceral leishmaniasis in the Americas. During pioneering
studies in northeast Brazil, Mangabeira (1969) observed phenotypic variations among males
of L. longipalpis that coexisted in sympatry in Sobral, Ceará, and suggested that they could
be different species. Since then, most of the studies aimed at clarifying the true taxonomic
status of L. longipalpis point to the existence of an incipient species complex, although the
number of members and their areas of distribution are still not fully resolved. Recently,
studies have correlated genetic variability to distinct phenotypic patterns. These differences
are of great importance for public health, not only for the possibility of influencing the
vectorial capacity of these sandflies, but also for their anthropophilia. The present study had
the objective of analyzing the phenotypic characteristics of the L. longipalpis males
populations from Restinga da Marambaia, Mangaratiba municipality, state of Rio de Janeiro
and Santo Antônio neighborhood, located in the municipality of Mossoró, state of Rio
Grande do Norte, semi-arid region of Northeast Brazil. Catches were taken during the 12-
month period. HP- type traps were employed, starting at 6 pm and ending at 7 pm the
following day, totaling 13 hours / collection. The captured male sandflies were identified at
species level according to the nomenclature proposed by Galati (2003) and then the males
of L. longipalpis obtained submitted to the phenotypic characterization. All males of L.
longipalpis from the Restinga da Marambaia presented the morphological pattern of a pale
spot in the 4th abdominal tergite, a predominant morphotype in other areas of Rio de
Janeiro. In the Santo Antônio neighborhood, Mossoró municipality, we identified a
significant phenotypic diversity composed by males that presented the morphological
pattern of a pale spot in the 4th abdominal tergite, while others presented the morphological
pattern of 2 pale spots completely filled in the 3rd and 4th tergite, In addition to the finding
of an intermediate phenotype represented by males with a single solid spot in the 4th tergite
and 3/4 of the 3rd tergite filled by the light spot. In the latter region, morphological varieties
seem to present vectorial importance with strong epidemiological consequences, due to the
higher incidence of visceral leishmaniasis in northeastern Brazil, especially in the State of Rio
Grande do Norte.
Keywords: Lutzomyia longipalpis lato sensu. Lutzomyia longipalpis complex. Phenotypic
characterization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo Biológico dos protozoários do gênero Leishmania........................... 21
Figura 2 - Espermateca feminina de L. longipalpis...................................................... 23
Figura 3 - Terminália genital masculina de L. longipalpis............................................ 23
Figura 4 - Resumo das informações disponíveis sobre diferentes sons de cópula e
principais tipos de feromônios produzidos por 14 populações de L.
longipalpis do Brasil..................................................................................... 25
Figura 5 - Área de estudo: Ilha da Marambaia............................................................. 28
Figura 6 - Área de estudo: Mossoró………………………………………………….. 29
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1M Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com uma mancha clara no quarto tergito
abdominal
2M Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com duas manchas claras uma no terceiro e outra
no quarto tergito abdominal
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animal
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DPP Teste imunocromatográfico rápido em dupla plataforma
ENSP Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca
ELISA Ensaio Imunoenzimático
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
INI Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
INERU Instituto Nacional de Endemias Rurais
IOC Instituto Oswaldo Cruz
KDNA DNA do cinetoplasto ou DNA mitocondrial
LGP Molécula lipofosfoglicana
l.s. lato sensu
LT Leishmaniose Tegumentar
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana
LV Leishmaniose Visceral
LVA Leishmaniose Visceral Americana
MLEE Eletroforese Multilocus de Isoenzimas
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
Pb Pares de bases
Per Gene period
WHO/OMS Organização Mundial da Saúde
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 12
2 PRESSUPOSTO TEÓRICO....................................................................... 14
2.1 LEISHMANIOSES........................................................................................ 14
2.2 AGENTE ETIOLÓGICO.............................................................................. 15
2.3 CICLO BIOLÓGICO..................................................................................... 19
2.4 FLEBOTOMÍNEOS VETORES................................................................... 22
2.5 COMPLEXO L. longipalpis........................................................................... 23
3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA......................................................... 26
4 OBJETIVO................................................................................................... 27
4.1 OBJETIVO GERAL...................................................................................... 27
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 27
5 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................ 28
5.1 TRABALHO DE CAMPO............................................................................. 28
5.1.1 Área de estudo: Ilha da Marambaia........................................................... 28
5.1.2 Área de estudo: Mossoró.............................................................................. 29
5.2 CAPTURA DE FLEBOTOMÍNEOS, SELEÇÃO DE AMOSTRAS E
IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA............................................................ 30
5.2.1 Caracterização fenotípica............................................................................ 30
6 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................... 31
7 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................. 31
8 RESULTADOS............................................................................................. 31
8.1 ARTIGO......................................................................................................... 32
9 CONCLUSÃO.............................................................................................. 53
REFERÊNCIAS........................................................................................... 54
GLOSSÁRIO................................................................................................ 65
12
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são consideradas doenças cosmopolitas de grande preocupação para
a saúde pública. São doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania,
transmitidos por vetores, os flebotomíneos. Nas Américas, essas enfermidades apresentam
uma variedade de sinais clínicos agrupados basicamente sob duas formas - Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA) e Leishmaniose Visceral Americana (LVA) (GONTIJO;
CARVALHO, 2003).
A ampla distribuição geográfica das leishmanioses está estreitamente condicionada ao
desenvolvimento bem sucedido dos flebotomíneos, espécies vetoras pertencentes ao gênero
Phlebotomus no Velho Mundo e ao gênero Lutzomyia no Novo Mundo (RANGEL;
LAINSON, 2003).
Lutzomyia longipalpis lato sensu, considerado o principal vetor da LVA no Brasil,
possui extensa distribuição geográfica, entretanto, em áreas focalizadas e de forma
descontinua (YOUNG; DURAN, 1994). Esse cenário muito se deve a existência de barreiras
geográficas, climáticas e ao curto raio de vôo do vetor (ALEXANDER et al., 1998), sendo o
isolamento por distância condição reconhecida por reduzir o fluxo gênico entre as populações,
atuando em processos de especiação (BAUZER et al., 2007). Nessa perspectiva, a
variabilidade genética observada entre populações de L. longipalpis pode estar relacionada
aos processos de deriva gênica e seleção natural, eventos graduais na escala espaço-temporal
que possivelmente exercem influências sob a capacidade vetorial desses flebotomíneos, tendo
fortes consequências na epidemiologia da LVA (LANZARO et al., 1993).
Durante estudos pioneiros no Nordeste do Brasil, Mangabeira (1969) observou
variações morfológicas entre machos de populações simpátricas de L. longipalpis em Sobral,
no Ceará, em comparação com as populações alopátricas do Pará. Foi identificada a existência
de dois fenótipos distintos, compostos por machos com uma mancha clara no IV seguimento
abdominal (1M), enquanto outros apresentavam manchas claras no III e IV segmentos
abdominais (2M). O mesmo também observou que essas populações estavam dispostas em
ambientes com condições ecológicas distintas. Com base nesses indícios, sugeriu que
poderiam se tratar de espécies distintas (MANGABEIRA, 1969).
Tais achados impulsionaram o desenvolvimento de novas pesquisas, no sentido de
solucionar a questão enigmática posta em debate, que ainda hoje pretende responder se as
populações de L. longipalpis, de diferentes regiões geográficas do Brasil, correspondem a
uma única espécie ou a um complexo de espécies a ser investigado. Estudos comparativos a
13
nível inter-populacional utilizaram diferentes metodologias no intuito de esclarecer o
verdadeiro status taxonômico de L. longipalpis, principalmente a partir das populações
encontradas na América do Sul e Central. A maioria deles fornecem fortes evidências para a
existência do complexo L. longipalpis (URIBE, 1999; SOARES; TURCO, 2003; BAUZER et
al., 2007), embora ainda não haja consenso quanto ao número de espécies integrantes e as
suas áreas de distribuição (ARRIVILLAGA et al., 2003; BAUZER et al., 2007).
Por conseguinte, a epidemiologia complexa da LVA e sua distribuição heterogênea,
com manifestações de amplo espectro clínico produzidas por L. chagasi, podem ser
explicadas pelo envolvimento de diversas espécies crípticas dentro do complexo L.
longipalpis. Deste modo, a importância dos processos de especiação para a saúde pública é de
tal ordem que torna-se necessário o conhecimento do vetor em cada foco de transmissão
(ARRIVILLAGA et al., 2003).
É nesse contexto que foi realizado o primeiro estudo com o objetivo de analisar as
características fenotípicas das populações de L. longipalpis provenientes da Restinga da
Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo
Antônio, município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, área de transmissão
silenciosa e intensa dessa protozoose, respectivamente.
14
2 PRESSUPOSTO TEÓRICO
2.1 LEISHMANIOSES
As leishmanioses, na sua forma tegumentar (LT) e visceral (LV), constituem um
grupo de protozooses infecto-parasitárias de grande importância em saúde pública no mundo
(GRIMALDI; TESH, 1993). São endêmicas em 88 países, infectando cerca de 12 milhões de
pessoas em todo mundo. Cerca de 350 milhões estão sob risco de adquirir a doença, com
incidência anual de 1 a 1,5 milhões de novos casos de leishmaniose cutânea e 500.000 novos
casos da forma visceral. Nas Américas, o Brasil é o país com mais registros de casos, tanto da
forma tegumentar quanto visceral (WHO, 2010).
As leishmanioses são zoonoses importantes, que acometem o ser humano e outras
espécies de mamíferos silvestres e domésticos, sob a forma de doenças infecciosas crônicas
com diversas manifestações clínicas (GRIMALDI; TESH, 1993). São causadas por
protozoários do gênero Leishmania e a sua principal forma de transmissão ocorre através da
picada de insetos vetores da subfamília Phlebotominae. São relacionadas entre as seis
principais endemias do mundo (MARZOCHI; MARZOCHI, 1994; WHO, 2010).
No Brasil, a LV é um problema de saúde pública cada vez mais importante devido à
frequência com que ocorre e a habilidade de se espalhar rapidamente (BRASIL, 2006). É
causada por L. infantum, comumente transmitida pelo flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. A
densidade populacional desses insetos no peridomicílio pode alcançar níveis muito altos
(WARD et al., 1985).
O ciclo para manutenção da L. infantum envolve populações de raposas no ambiente
silvestre (DEANE; DEANE, 1962; LAINSON; SHAW, 1969) e cães domésticos que habitam
no peridomicílio e servem como reservatórios dos parasitas. Embora gambás possam ser
naturalmente infectados (SHERLOCK et al., 1984; CORREDOR et al., 1989), seu papel
epidemiológico como reservatório permanece desconhecido.
Os cães domésticos são altamente susceptíveis para a infecção por L. infantum e a
principal fonte de infecção para o vetor, devido ao intenso parasitismo na pele, independente
da apresentação clínica (MOLINA et al., 1994; MICHALSKY et al., 2007; GIUNCHETTI et
al., 2006). Tem sido identificado como o principal reservatório de L. infantum, além do que a
doença no cão ter se tornando uma doença emergente e reemergente, dependendo da área de
ocorrência, como indicado pelo número de cães soropositivos para LV e a expansão
geográfica da doença (COURA-VITAL et al., 2014).
Medidas de controle usadas para LV no Brasil são focadas na busca ativa de pacientes
15
humanos e tratamento, eutanásia dos cães soropositivos e controle do vetor por meio de
dedetização dos domicílios e canis (LACERDA, 1994).
Alguns autores sugerem que o controle efetivo requer uma elevada proporção de cães
infectados removidos imediatamente após detecção para alcançar uma redução na transmissão
da doença (QUINNELL et al., 1997; COURTENAY et al., 2002). O estudo de Costa e
colaboradores (2013) demonstra que os métodos citados, dependendo da intensidade da
transmissão canina, se aplicados de forma contínua, com remoção dos cães infectados em até
quatro meses após coletados, podem reduzir significativamente a prevalência da LVC ao
longo do tempo (COSTA et al., 2013).
Desde 2011, após um estudo realizado pelo Ministério da Saúde, o teste
imunocromatotográfico rápido em dupla plataforma (DPP®) tem sido utilizado como exame
de referência na triagem da LVC, em substituição ao ensaio imunoenzimático (ELISA)
anteriormente utilizado. Contudo, resultados positivos no DPP® devem ser confirmados por
ELISA (NOTA TÉCNICA N° 01/2011) para posterior eutanásia dos cães positivos para LV.
Com o propósito de melhorar o diagnóstico para a retirada do animal e consequentemente
melhor controle da doença.
As técnicas de biologia molecular baseadas na detecção de ácidos nucléicos como a
reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem demonstrado ser uma importante ferramenta
para o diagnóstico de diferentes doenças infecciosas, dentre elas as leishmanioses (HARRIS
et al., 1998).
Na detecção do DNA de Leishmania, a PCR apresenta a vantagem de utilização de
uma extensa variedade de amostras clínicas como, por exemplo, aspirados de linfonodos
(REALE et al., 1999; MANNA et al., 2004), sangue (REITHINGER et al., 2000; MANNA et
al., 2004), medula óssea (REITHINGER et al., 2000), pele (ROURA et al., 1999), “swab” oral
e conjuntival (LOMBARDO et al., 2012), e pelos (BELINCHON-LORENZO et al., 2013).
2.2 AGENTE ETIOLÓGICO
No mundo, a leishmaniose visceral tem como agentes etiológicos os protozoários da
ordem Kinetoplastida, da família dos tripanossomatídeos, pertencentes ao subgênero
Leishmania, do gênero Leishmania. Esses parasitos integram o complexo donovani, o qual é
constituído por três espécies: Leishmania donovani incriminada pelo calazar Indiano, L. (L.)
infantum responsável pela enfermidade no continente Europeu, Africano e Asiático e L. (L.)
chagasi de ocorrência nas Américas (LAINSON et al., 1987), apesar dessa classificação
16
taxonômica ainda hoje ser questionada (DANTAS-TORRES, 2006a; DANTAS-TORRES,
2006b; SHAW, 2006).
Em 1937, L. chagasi (CUNHA; CHAGAS, 1937) foi descrita como uma nova espécie
do gênero Leishmania responsável por causar a LVA, após ter sido demostrada a
incapacidade do protozoário parasita de produzir experimentalmente infecções viscerotrópicas
em seu principal reservatório, o cão doméstico, o que a distinguiu de L. infantum, o primeiro
agente causal descrito por Nicole (1908), outrora incriminado pelo calazar Europeu na região
Mediterrânea (NICOLLE, 1908).
Entretanto no ano seguinte, Cunha (1938) reconheceu que L. chagasi, a espécie recém
descrita, e L. infantum eram morfologicamente indistinguíveis (CUNHA, 1938). Tal
declaração inevitavelmente, representou o estopim para a realização de novos estudos, no
sentido de prestar maiores esclarecimentos sobre a verdadeira etiologia e taxonomia do
parasita visceral de ocorrência nas Américas (DANTAS-TORRES, 2006a). Os resultados dos
estudos produzidos desde então fundamentam posicionamentos taxonômicos divergentes. Por
convenção, mesmo à parte da discussão sobre o staus taxonômico dos agentes causais da
leishmaniose visceral no Novo e Velho Mundo, respeitamos no presente estudo o
posicionamento taxonômico defendido por cada autor citado para fazer referência a ambos os
parasitos, de acordo com as denominações deliberadas em suas obras.
De acordo com Shaw (2006), sempre houve uma forte tendência de considerar a
origem geográfica do parasito viscerotrópico no momento de decidir sobre o seu status
taxonômico, prática que possivelmente motivou a denominação L. chagasi para incriminar o
agente causal da LVA. Para ele é possível que existam diferentes linhagens de leishmanias
viscerotrópicas nas Américas, sejam elas nativas e ou introduzidas (SHAW, 2006).
Outros pesquisadores (KILLICK-KENDRICK, 1984; RIOUX et al., 1990) sustentam
a hipótese de que L. infantum fora introduzida nas Américas por cães infectados trazidos
durante o período da colonização portuguesa e espanhola, sendo o complexo donovani
constituído por apenas duas espécies: L. donovani e L. infantum. Logo L. chagasi é
desconsiderada como espécie. Porém, o encontro de altas taxas de infecção benigna e
assintomática em reservatório silvestre (Cerdocyon thous), no Parque Ambiental do Utinga-
Amazônia brasileira, área sem relatos de casos humanos e caninos, sugere a existência de
ciclos enzoóticos fechados antigos, possivelmente decorrente de milhares de anos de interação
adaptativa entre a ação patogênica do parasito a resposta imune do hospedeiro (LAINSON E
SHAW, 2005; SILVEIRA; CORBETT, 2010). Além disso L. (L.) infantum adaptada ao
flebotomíneo vetor Phlebotomus dubosqi nos países europeus, teria que se adaptar num curto
17
período de tempo a L. longipalpis, espécie de febotomíneo autóctone do continete americano,
o qual vive sob condições climáticas e ecológicas muito distintas às encontradas no continente
Europeu (SILVEIRA; CORBETT, 2010).
Por outro lado, no final da década de 90, Mauricio e colaboradores (1999) avaliaram
relações genotípicas dentro do complexo donovani, por métodos moleculares de ligação da
sonda Lmet9 específica para L. chagasi e Leishmania spp do Velho Mundo, sequenciamento
parcial do gene MSPC, além da utilização da técnica de amplificação aleatória de DNA
polimórfico a partir de diferentes isolados de leishmanias viscerotrópicas provenientes do
Novo e Velho Mundo. Ao comparar os perfis genéticos traçados, verificou-se que L. chagasi
e L. infantum eram geneticamente indistinguíveis. Frente a esses achados, eles consideraram
que L. chagasi e L. infantum são sinonímias e, por conseguinte, concluíram que L. chagasi
não deveria ser considerada como espécie. Adiciona-se a isso, o fato dos padrões
filogeográficos obtidos nesse estudo indicarem a origem monofilética de ambos os parasitos
dentro do complexo donovani, o que sugere a introdução de L. infantum no Novo Mundo
(MAURICIO et al., 1999a).
Em contraposição, Lainson e Shaw (2005) publicaram uma vasta revisão do gênero
Leishmania e, amparados por evidências consistentes, tais como: aspectos
ecoepidemiológicos da LVA na América Latina, interação do parasito com o seu principal
vetor L. longipalpis e reservatório silvestre, sugeriram o status taxonômico para ambos os
parasitos a nível subespecífico, com a denomição L (L.) infantum chagasi para o agente
etiológico da LV de origem americana e L. (L.) infantum infantum para o agente causal da
enfermidade natural do Velho Mundo (LAINSON; SHAW, 2005).
Posteriormente, análises multilocus de microssatélites, marcadores moleculares
altamente polimórficos (KUHLS et al., 2011) e, comparações de perfis isoenzimáticos por
eletroforese multilocus de isoenzimas – MLEE, identificaram que a baixa variabilidade
genética encontrada entre os parasitos em questão não foi significativa a ponto de separá-los a
nível específico ou subespecífico (RIOUX et al., 1990), sendo a última técnica considerada
“padrão ouro” para a classificação taxonômica do gênero Leishmania (WHO, 1990).
Entretanto, uma nova abordagem combinada de ensaios fluorogênicos identificou
heterogeneidade genética significativa entre parasitas viscerais provenientes do Velho Mundo,
com o encontro de cinco grupos distintos dentro do complexo donovani, cujos membros
foram tipados por zimodemas (QUISPE-TINTAYA et al., 2005), o que indica a existência de
mais de uma linhagem com a mesma origem geográfica (SHAW, 2006). O alto poder
discriminatório da técnica empregada foi compatível com a percepção de evolução do gênero
18
e revelou discrepância na atual taxonomia baseada em MLEE (QUISPE-TINTAYA et al.,
2005).
As demais análises comparadas de perfis genéticos traçados a partir de fragmentos de
DNA do cinetoplasto ou mitocondrial (KDNA) obtidos por digestão enzimática de restrição
(JACKSON; WOHLHIETER; HOCKMEYER, 1982; JACKSON et al., 1984), o uso de
impressão digital de DNA (ELLIS; CRAMPTON, 1991), a identificação de Leishmania spp
por radiorrespirometria (DECKER- JACKSON et al., 1980), e ainda o não reconhecimento
das proteínas de superfície de formas promastigotas de L. chagasi a anticorpos monoclonais
glicoconjugados (SANTORO et al., 1984) forneceram evidências consistentes de diferenças
significativas entre as duas linhagens dentro do complexo donovani. Achados esses,
interpretados por Maurício e colaboradores (2000), como “menores diferenças” genotípicas e
fenotípicas utilizadas como critérios para justificar a separação em duas espécies ou
subespécies (MAURICIO; STOTHARD; MILES, 2000; DANTAS-TORRES, 2006a). Em
contraposição, Rangel (2006) ressalta as análises de sorodemas e zimodemas como adventos
promissores da biologia molecular capazes de aumentar a consciência sob “menores
diferenças” entre isolados parasitários de leishmanias viscerais, os quais futuramente podem
ser considerados como subespécies, denominação essa, indicativa da estreita relação entre L.
(L.) infantum chagasi e L. (L.) infantum infantum, o que reforça a existência de processos de
especiação recentes na produção de “menores diferenças”, como se referem os autores
supracitados (DANTAS-TORRES, 2006b).
Na opinião de Shaw (2006) estamos testemunhando um processo de especiação
atribuído a seleção natural espécie-específica de parasitas viscerais no vetor (SHAW, 2006).
Existem diferenças nas galectinas intestinais secretadas por flebotomíneos, responsáveis por
intermediar a adesão específica do parasito à parede intestinal do vetor, atuando por
consequência no sucesso da transmissão (KAMHAWI et al., 2004; SHAW, 2006). Assim a
adaptação a novos vetores irá depender da compatibilidade entre os glicolipídeos de superfície
do protozoário parasito às galectinas secretadas no tubo digestivo do flebotomíneo vetor
durante a digestão do alimento sanguíneo (SHAW, 2006).
De fato, ainda hoje a questão é polêmica e, por não haver consenso sobre o real status
taxonômico do agente causal da LV nas Américas, várias denominações são utilizadas para
fazer referência ao mesmo parasito, o que é inaceitável do ponto de vista científico
(DANTAS-TORRES, 2006b). Frente a esses entraves taxonômicos, muitos pesquisadores
(MOMEN; GRIMALDI; DEANE, 1986; RIOUX et al., 1990; MAURICIO et al., 1999b;
MAURICIO; STOTHARD; MILES, 2000; DANTAS-TORRES, 2006a; DANTAS-TORRES,
19
2006b; LUKES et al., 2007; KUHLS et al., 2011) sugerem a reclassificação do agente causal
da LVA dentro do complexo donovani.
Sobre esse aparente dilema taxonômico, Shaw (2006) argumenta com propriedade que
justamente por ainda existirem muitas questões a serem respondidas sobre a etiologia,
identidade e epidemiologia do parasito americano, sinonimizar o nome chagasi com infantum,
significaria excluir linhagens passíveis de investigação antes mesmo de ser cogitada a sua
existência (SHAW, 2006). Além disso, desqualificar L. (L.) chagasi com base apenas em sua
similaridade genética com L. (L.) infantum representaria desconsirar cinquenta anos de
conhecimento acumulado sobre o agente etiológico responsável pela LVA (SILVEIRA;
CORBETT, 2010).
Mesmo para os evolucionistas os processos de especiação representam um grande
desafio para a identificação de agentes infecciosos. Na maioria dos casos é possível atribuir
uma denominação a nível específico a agentes patogênicos de impotância médica, sendo
fundamental para os tomadores de decisão, mas tal deliberação requer uma abordagem
integrada na qual devem ser considerados aspectos biológicos, filogenéticos, fenéticos e
fenotípicos. Logo, a combinação desses princípios aliados ao advento das tecnologias
moleculares modernas podem contribuir para a manipulação desses conceitos (TIBAYRENC,
2006).
2.3 CICLO BIOLÓGICO
A cadeia de transmissão dos protozoários do gênero Leishmania envolve interações
complexas entre parasitas, vetores e hospedeiros susceptíveis em ambientes com
características ecológicas distintas (DANTAS-TORRES et al., 2012).
Nas Américas, L. (L.) chagasi é o único agente etiológico causador da leishmaniose
visceral, comumente transmitido pela fêmea do flebotomíneo L. longipalpis. Dentro da fauna
flebotomínica apenas as fêmeas são hematófagas, desenvolveram o hábito de alimentar-se do
sangue de animais vertebrados, nutrição necessária para o amadurecimento do folículo
ovariano e a produção de ovos, o que as deixou susceptíveis a invasão de microorgamismos
como os protozoários do gênero Leishmania (RANGEL; LAINSON, 2003).
L. (L.) chagasi, pode apresentar-se na natureza sob duas principais formas necessárias
para completar seu ciclo evolutivo digenético: promastigotas, formas extracelulares presentes
no tubo digestivo de fêmeas infectadas e as amastigotas, formas intracelulares obrigatórias
que parasitam o sistema fagocítico mononuclear de hospedeiros vertebrados (PETERS;
20
KILLICK-KENDRICK, 1987; RANGEL; LAINSON, 2003). As amastigotas são imóveis,
apresentam morfologia ovoide, contendo um flagelo internalizado próximo ao cinetoplasto
situado abaixo do núcleo. Já as promastigotas são formas móveis, com flagelo livre e
aparente, possuem corpo alongado, com cinetoplasto na parte anterior ao núcleo centralizado
(MOLYNEUX; KILLICK-KENDRICK; PETERS, 1987).
Durante o repasto sanguíneo num vertebrado infectado, a fêmea flebotomínea causa
um pequeno hematoma no ponto da picada, de onde ingere macrófagos parasitados com
formas amastigotas de L. chagasi (COURA, 2008). Na luz do trato digestivo da fêmea vetora,
as formas amastigotas diferenciam-se em poucos dias de formas intermediárias a
promastigotas (RANGEL; LAINSON, 2003). Esse processo é intertermediado pela matriz
peritrófica, uma membrana amorfa semipermeável, a qual atua como barreira física com a
função de evitar danos ao epitélio intestinal do vetor e confere proteção contra o ataque de
microorganismos patogênicos ingeridos no momento da hematofagia (PIMENTA et al.,
1997). No entanto, a formação da matriz peritrófica pode minimizar a ação de enzimas
digestivas sob verdadeiros ninhos de leishmanias concentrados do meio do bolo alimentar. O
escape da matriz peritrófica permite a adesão do parasito ao epitélio intestinal do vetor e
impede que as formas promastigotas sejam excretadas junto com o alimento não digerido
(PIMENTA et al., 1997; RANGEL; LAINSON, 2003). Em seguida, inicia-se o processo de
metaciclogenese e a emergência de promastigotas metacíclicas, altamente infectantes, que
logo migram para a porção anterior do trato digestivo em direção a probóscide. O aglomerado
de metacíclicas causam a desfunção da válvula cárdea ou estomodeal, a qual em seu estado
normal funciona como um esfíncter que impede o refluxo do alimento sanguíneo ingerido
(SCHLEIN; JACOBSON; MESSER, 1992).
Ao realizar um novo repasto sanguíneo a fêmea infectada regurgita o conteúdo
intestinal com formas promastigotas metacíclicas de L. chagasi, as quais possuem tropismo
pelas vísceras, interiorizadas principalmente por macrófagos do fígado, baço e da medula
óssea do hospedeiro vertebrado (COURA, 2008). Posteriormente as promastigotas
metacíclicas são encerradas por vacúolos parasitófaros, os fagolisossomas. As leishmanias são
capazes de resistir a atividade leishmanicida dentro dos fagolisossomas, devido a expressão da
molécula lipofosfoglicana (LGP) de superfície, existente apenas nas formas promastigotas
metacíclicas que inibe a exposão oxidativa decorrente da atividade respiratória dos
macrófagos, o que confere proteção contra a lise (SCHLEIN; SCHNUR; JACOBSON, 1990;
RANGEL; LAINSON, 2003). Ainda no interior dos fagolisossomas as formas promastigotas
metacíclicas diferenciam-se em formas amastigotas, essas multiplicam-se ativamente por
21
bivisão binária e abarrotam aqueles macrófagos causando a sua ruptura e o estrapolamento
para o meio extracelular, aptas a infectar novas células do sistema fagotícico mononuclear
(COURA, 2008), como pode ser observado abaixo (figura 1):
Ciclo Biológico
Figura 1. Esquema do ciclo biológico das leishmanioses (adaptado traduzido para o português).
Fonte: www.cdc.gov/dpdx/leishmaniasis/index.html
Recentemente, Warburg e colaboradores (1994) observaram que em países da
América do Sul, como Colômbia e Brasil, L. chagasi transmitido pela fêmea do flebotomíneo
L. longipalpis, geralmente causa a leishmaniose visceral, enquanto que na América Central,
mais especificamente em Costa Rica, L. chagasi produz leishmaniose cutânea atípica. Eles
evidenciaram que a variabilidade no curso da infecção pode ser atribuída a diferenças na
composição da substância salivar indutora de eritema (maxidilan), secretada no momento da
hematofagia por flebotomíneos L. longipalpis da América do Sul e Central. O peptídeo
maxidilan de populações de L. longipalpis encontradas no Brasil e Colômbia é mais potente e
está em maior quantidade exacerbando a infecção cutânea menor, causando a leishmaniose
visceral. Já nas populações de L. longipalpis da Costa Rica, o maxidilan apresenta pouca
quantidade e baixa atividade vasodilatadora, portanto, o parasito não visceraliza
permanecendo na pele. Frente a esses achados foi sugerido que L. longipalpis representa um
complexo de espécies cuja a capacidade vetorial de seus integrantes diferem, com efeito de
modular a patologia da enfermidade que transmitem (WARBURG et al., 1994).
22
2.4 FLEBOTOMÍNEOS VETORES
No Brasil, segundo atualizações do Ministério da Saúde (2010), as espécies com
maiores competências vetoriais de LTA são: Lutzomyia flaviscutellata, Lutzomyia whitmani,
Lutzomyia umbratilis, Lutzomyia intermedia e Lutzomyia migonei. Outras espécies como
Lutzomyia neivai e Lutzomyia fisheri são frequentemente encontradas em áreas endêmicas,
porém ainda não são incriminadas na transmissão do parasito (BRASIL, 2010). Até o
momento, as espécies de flebotomíneos L. longipalpis e L. cruzi estão relacionadas com a
transmissão de LV, sendo essa última recentemente incriminada no estado do Mato Grosso do
Sul (MISSAWA et al., 2011). Rangel e Lainson (2003) afirmam que, no Brasil, 19 espécies
são suspeitas ou incriminadas de transmitir Leishmania spp. e capazes de infectar humanos.
L. longipalpis, apresenta ampla distribuição geográfica, abrangendo as Américas
Central e do Sul (FORATTINI, 1973; LAINSON; RANGEL, 2005). No Brasil, este
flebotomíneo apresenta ampla distribuição geográfica, sendo registrado em todas as regiões
político-administrativas, incluindo 21 estados (BRASIL, 2003).
Este vetor apresenta atividade, tanto intradomiciliar como extradomiciliar, ressaltando
sua capacidade de adaptação aos ambientes antrópicos (DEANE; DEANE, 1957; DE SOUZA
et al., 1981; RESENDE et al., 2006; DIAS et al., 2007). Esta adaptação é fruto de sua
habilidade de se alimentar tanto de animais domésticos como de animais sinantrópicos
(DEANE; DEANE, 1957; FORATTINI, 1973; RANGEL; LAINSON, 2003; BARATA et al.,
2005) e, juntamente de sua antropofilia, favorece a manutenção e transmissão da doença em
ambientes modificados (CONCEIÇÃO-SILVA; ALVES, 2014). É evidente a importância de
tais fatores para a saúde pública, somado aos impactos gerados pelas alterações ambientais,
determinadas principalmente pelas ações humanas, uma vez que podem influenciar no padrão
epidemiológico da LVA (DESJEUX, 2004; NUNES et al., 2008; MARZOCHI et al., 2009).
Segundo Barata e colaboradores (2005), L. longipalpis é uma espécie oportunista, pois
realiza o repasto sanguíneo em diversas espécies de vertebrados. Vale ressaltar tais aspectos,
uma vez que a LVA já é abordada como uma doença com forte tendência a urbanização
(DESJEUX, 2004; COSTA, 2008; FRANCA-SILVA et al., 2005, MARZOCHI et al., 2009),
por conta dos achados em áreas urbanas (DE OLIVEIRA; FALCAO; BRAZIL, 2000;
FRANCA-SILVA et al., 2005; RANGEL; VILELA, 2008; SANTOS; FERREIRA; BISETTO
JUNIOR, 2012).
Os indivíduos adultos são de porte médio em relação a outras espécies de
flebotomíneos e de tonalidade castanho amarronzada. A espermateca das fêmeas possui corpo
23
anelado, embora não tão evidente, no qual podem ser contados aproximadamente 10 anéis e
seus dutos são longos e estreitos (Figura 2). Já os machos possuem espinhos geniculados bem
característicos da espécie, além de um tufo basal de 4 cerdas longas e delgadas no basistilo,
enquanto que o dististilo é dotado de 4 espinhos desenvolvidos e anexados em posições
diferentes; o parâmero apresenta parte distal triangular com várias cerdas, com pequenas
cerdas enfileiradas na parte inferior do parâmero; o lobo lateral é simples e mais longo que o
basistilo; a bomba ejaculadora apresenta extremidades simples e afiladas e três vezes mais
longas que as mesmas (FORATTINI, 1973; YOUNG; DURAN, 1994), (Figura 3).
Fonte: http://www.scielo.br/pdf/paz/v51n27/01.pdf .(SHIMABUKURO et al., 2011)
Os machos de L. longipalpis podem apresentar dois fenótipos distintos de acordo com
manchas nos tergitos abdominais, um deles com presença de um par de manchas claras no 4º
tergito e o outro com um par adicional de manchas claras no 3º tergito. O primeiro registro
dessa característica foi descrito por Mangabeira (1969) no Nordeste do Brasil.
As duas formas apresentam distribuição variada, sendo a forma 1M com distribuição
mais ampla, do sul do México ao norte da Argentina (LANZARO et al., 1993; YOUNG e
DUNCAN, 1994), enquanto que a forma 2M apresenta uma distribuição mais restrita, sendo
encontrada apenas na Bolívia, Paraguai e algumas localidades do Brasil (WARD et al., 1983;
DUJARDIN et al., 1997; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; ARAKI et al., 2009;
ARAKI et al., 2013).
2.5 COMPLEXO L. longipalpis
A evidência da formação de híbridos ou acasalamentos não aleatórios, consequência
do processo de diferenciação genética (MAINGON et al., 2008), parece existir com
populações de L. longipalpis. Costa Rica, Colômbia e Brasil produzem machos híbridos
(LANZARO et al., 1993). A seleção sexual também já é registrada entre populações que
vivem em simpatria, como as de Sobral (CE), nas quais fêmeas reconhecem feromônios e
Figura 2. Espermateca
feminina de L. longipalpis.
Figura 3. Terminália genital
masculiana de L. longipalpis.
24
sons de corte, produzidos especificamente pelo sexo oposto, dados esses concordantes com o
padrão de manchas nos tergitos dos machos (WARD et al., 1988; HAMILTON; DAWSON;
PICKETT, 1996; SOUZA et al., 2004; HAMILTON et al., 2005). A participação dos
feromônios e sons de corte é forte no processo de seleção sexual, agindo como barreira
reprodutiva (BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; BOTTECCHIA et al., 2004;
WATTS et al., 2005; MAINGON et al., 2008), na escolha dos parceiros no momento do
acasalamento (JONES; HAMILTON, 1998). Apesar dos fortes indícios de fluxo gênico e
introgressão em populações simpátricas, como é o caso de populações de Sobral (CE)
(ARAKI et al., 2013), há evidências de que o isolamento reprodutivo entre tais populações é
mais forte do que entre irmãs alopátricas do complexo L. longipalpis (WARD et al., 1983;
SOUZA et al., 2008).
Considerando somente os dados de manchas – 1M para machos com uma mancha
clara no 4º tergito e 2M para machos com duas manchas claras (3º e 4º tergito) – Ward e
colaboradores (1983) induziram o cruzamento entre os esses dois grupos, de populações
alopátricas (Morada Nova, Lapinha e Marajó) e simpátricas (Sobral - CE) do Brasil, nos quais
a inseminação falhou para praticamente todos eles. Observou-se também esse insucesso em
machos alopátricos com padrão igual de manchas, indicando o isolamento reprodutivo e
consequentemente a existência do complexo (WARD et al., 1983). Ainda é clara a falta de
consenso a respeito da existência ou não do complexo. Alguns autores apontam tal fato como
fruto da recente ou incompleta separação dessas populações, permanecendo ainda
características genéticas do ancestral comum (WARD et al., 1983; BAUZER et al., 2002a;
ARAKI et al., 2009). Além disso, a introgressão genética também é apontada, tanto em L.
longipalpis, como em outros flebotomíneos (BAUZER et al., 2002b; MAZZONI et al., 2008;
ARAKI et al., 2009; ARAKI et al., 2013), levando ao atual mosaico genético encontrado na
literatura científica.Os estudos apontam para a existência de dois grupos principais dentro das
populações brasileiras de L. longipalpis. De acordo com características moleculares e
químicas, o primeiro grupo é constituído de um complexo morfologicamente semelhante, mas
vivem em alopatria (LANZARO et al., 1993; MUTEBI et al., 1998; BAUZER et al., 2002a).
Este forma um grupo mais homogênico que apresenta som de corte (“love song”) do tipo
explosão (“brust-type) e produção de um mesmo feromônio, C20. Já o segundo grupo é mais
heterogêneo e interessantemente, ocorre em simpatria. Tal grupo apresenta padrões de sons de
corte variáveis, em pulso (“Pulse-type”), além de apresentarem composição de diferentes
feromônios C16 ( Figura 4 ), (SOUZA et al., 2004; ARAKI et al., 2009).
25
Figura 4 - Resumo das informações disponíveis sobre diferentes sons de corte e principais tipos de feromônios
produzidos por 14 populações de L. longipalpis do Brasil (ARAKI et al., 2009).
No Brasil, apesar das diferenças apresentadas entre os marcadores genéticos (URIBE,
1999; SOARES; TURCO, 2003; BAUZER et al., 2007; ARAKI et al., 2013), alguns estudos
apontam, de acordo com análises mais amplas através de características fenotípicas,
comportamentais e genéticas, que existem espécies crípticas, simpátricas ou alopátricas, em
diferentes processos de diferenciação (WARD et al., 1983; LANZARO et al., 1993;
BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; MAINGON et al., 2003; ARAKI et al., 2009;
LINS et al., 2012; ARAKI et al., 2013).
Marcadores moleculares estudados em L. longipalpis voltam-se principalmente para a
questão do complexo de espécies. Incluem estudos que vão desde bandeamento
cromossômico (YIN et al., 1999), polimorfismo em gens de especiação (MAZZONI et al.,
2002; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; ARAKI et al., 2009; ARAKI et al.,
2013) e expressão gênica (MCCARTHY et al., 2013).
Dentre vários marcadores, os apontados como mais confiáveis para o estudo de
populações de L. longipalpis são, segundo Araki e colaboradores (2013), per, para, up e
sec22. Um bom marcador molecular precisa ser capaz de diferenciar duas espécies
simpátricas (Ex: Sobral 1M vs Sobral 2M) e não necessariamente um que é capaz de
distinguir duas espécies alopátricas (Ex: Lapinha 1M vs Pancas1M), (ARAKI et al., 2013).
26
3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
Este foi o primeiro estudo destinado a analisar variações fenotípicas a partir de
populações de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município de
Mangaratiba, Rio de Janeiro, e do bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, estado do
Rio Grande do Norte, sendo de grande contribuição para a maior compreensão da
epidemiologia da leishmaniose visceral em área de transmissão silenciosa e intensa dessa
protozoose, respesctivamente. Além disso, fornecerá subsídios essenciais para análises
comparadas a outras populações de L. longipalpis dentro de um complexo de espécies
crípticas do Brasil, ainda desconhecidas.
27
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a ocorrência de populações do complexo Lutzomyia longipalpis na Restinga
da Marambaia, Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e no bairro de Santo Antônio,
Município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Identificar populações do complexo Lutzomyia longipalpis provenientes da Restinga
da Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro, através das
características fenotípicas utilizando o padrão morfológico de 1 mancha (1M) e 2
manchas (2M) dos tergitos abdominais dos machos;
II. Identificar populações do complexo Lutzomyia longipalpis provenientes do bairro de
Santo Antônio, município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, através das
características fenotípicas utilizando o padrão morfológico de 1 mancha (1M) e 2
manchas (2M) dos tergitos abdominais dos machos;
III. Comparar os padrões fenotípicos encontrados nas duas áreas de estudo com os
achados descritos na literatura.
28
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 TRABALHO DE CAMPO
5.1.1 Área de estudo: Restinga da Marambaia
A Restinga de Marambaia faz parte da Baía de Sepetiba, localizada no município de
Mangaratiba (entre 23°04’S e 43°53’ W), ao litoral sul do estado do Rio de Janeiro (Figura 5).
Corresponde a uma Área de Proteção Ambiental (BRASIL, 2014), com clima tropical úmido
e ecossistemas diversificados contíguos ao bioma Mata Atlântica, tais como: pântanos,
restingas, dunas, praias e mangues. O pico da Marambaia é considerado o ponto culminante,
atinge cerca de 647 metros de altura. O território possui 79 km² e uma estreita faixa de areia
com 40 km de extensão o conecta ao continente. Embora a Restinga da Marambaia não seja
cercada de água por todos os lados, recebe também a denominação de Ilha da Marambaia, por
seu relevo e topografia característicos (CONDE et al., 2005; MATTOS, 2005; CARMO et al.,
2013), por exemplo, durante a maré alta a extensa faixa de restinga torna-se inundada.
A região é administrada pelas Forças Armadas do Brasil e recebe militares de origem
nacional e internacional para treinamentos, além de visitantes brasileiros de regiões
endêmicas de leishmaniose. A Restinga da Marambaia ainda é habitada por remanescentes
quilombolas. Alonso e colaboradores (2014) relataram a existência de 100 residências na
região, distribuídas por oito praias, algumas junto à costa e outras próximas da mata. Há
coleta de lixo, mas as condições sanitárias ainda não correspondem as ideais. No
peridomicílio a maioria dos moradores locais possuem criações de animais para consumo. Os
cães de estimação geralmente são deixados soltos e retornam as residências ao anoitecer,
período de maior atividade dos flebotomíneos. Ademais, casos de leishmaniose visceral
canina foram identificados em inqueritos sorológicos realizados na região (ALONSO et al.,
2014; CARMO et al., 2013).
Figura 5 - Mapa da Costa Verde, litoral sul do estado do Rio de Janeiro, em destaque a Restinga da Marambaia,
localizada no município de Mangaratiba.
29
5.1.2 Área de estudo: Mossoró
O município de Mossoró, está situado no estado do Rio Grande do Norte, mesorregião
do Oeste Potiguar, sobre as seguintes coordenadas geográficas: Latitude 5º 11’ 15” Sul, e
longitude: 37º 20’ 39” Oeste. Possui área de aproximadamente 2.110,21 km² e com altitude
em relação a sede do município de 16 metros. Natal, a capital do estado, está distante cerca de
285 km do município de Mossoró. O tipo de clima é muito quente e semi-árido, com baixa
precipitação pluviométrica, de aproximadamente 703.7mm/ano. Apresenta duas estações bem
marcadas, cujo o período chuvoso ocorre de fevereiro a abril, seguido da estação seca, com
Umidade Relativa Média Anual em torno de 70% (IDEMA, 2008).
Para a realização do estudo foi selecionada uma área com transmissão intensa para
LVA, no município de Mossoró, seja ela: o bairro de Santo Antônio (Figura 2). Cabe
ressaltar, que na localidade há soroprevalência de leishmaniose visceral canina (KAZIMOTO
et al 2016).
Figura 6 - Mapa do município de Mossoró, em destaque o bairro de Santo Antônio.
30
5.2 CAPTURA DE FLEBOTOMÍNEOS, SELEÇÃO DE AMOSTRAS E IDENTIFICAÇÃO
TAXONÔMICA
As capturas foram realizadas entre o período de agosto de 2015 a agosto de 2016,
totalizando 12 meses de captura em cada área de estudo. Para isso, armadilhas luminosas do
tipo HP foram empregadas, iniciadas às 18 horas e encerradas às 7 horas do dia seguinte,
totalizando 13 horas/coleta.
As armadilhas foram instaladas em pontos onde levantamentos entomológicos
anteriores evidenciaram a presença de L. longipalpis e no peridomicílio das residências as
quais inquéritos sorológicos caninos relataram a ocorrência de casos de leishmaniose visceral
canina. No peridomicílio foram selecionados os locais mais propícios à proliferação dos
flebotomíneos, como os abrigos de animais, principalmente galinheiros e canis.
Os insetos capturados foram entorpecidos com éter e em seguida foi realizada uma
triagem para separar flebotomíneos de não flebotomíneos. Todos os flebotomíneos obtidos na
triagem foram alocados em tubos plásticos contendo álcool a 70%, devidamente rotulados de
acordo com o local de captura e enviados para o laboratório de entomologia do Instituto
Nacional de Endemias Rurais (INERU/FIOCRUZ).
No laboratório, com o auxílio de uma lupa estereoscópica os flebotomíneos foram
submetidos a uma segunda triagem para a separação de machos e fêmeas. Os machos obtidos
foram montados em lâminas para a visualização dos caracteres morfológicos em microscópio
óptico, e então identificados a nível de espécie de acordo com a nomenclatura proposta por
Galati, 2003. Após a identificação taxonômica os espécimes machos de L. longipalpis foram
separados para posterior caracterização fenotípica.
5.2.1 Caracterização fenotípica
A caracterização fenotípica dos machos de L. longipalpis provenientes das duas áreas
de estudo, consistiu em identificar por meio de visualização em lupa estereoscópica o padrão
morfológico de 1 mancha (1M) e ou de 2 manchas (2M) nos segmentos abdominais dos
machos, de acordo com a metodologia proposta por Mangabeira (1969), incluindo os
fenótipos intermediários descritos em estudo prévios (WARD et al., 1983; WARD et al.,
1988; MUKHOPADHYAY et al., 1998; SOUZA et al., 2008).
31
6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada de forma descritiva.
7 ASPECTOS ÉTICOS
O presente estudo não necessita de aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA) por se tratar de um estudo desenvolvido com insetos.
8 RESULTADOS
Os resultados e discussão dessa dissertação serão apresentados em formato de artigo
científico submetido para publicação na Revista Acta Amazônica.
32
8.1 ARTIGO
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, estado
do Rio de Janeiro e Mossoró, estado do Rio Grande do Norte.
Autores: Tavares-Pinheiro, J. ¹*; De Souza, M. B.²; Amora, S. S. A.³; Kazimoto, T. A.³;
Figueiredo, F. B 4.
¹Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública- ENSP/ Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil;
²Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca- ENSP/ Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil;
³Programa de Pós-Graduação em Ambiente, Tecnologia e Sociedade – Universidade Federal Rural do Semi-
Árido, Mossoró, RN, Brazil;
4 Laboratório de Biologia Celular, Instituto Carlos Chagas/Fiocruz, Curitiba, PR, Brazil.
*Corresponding author: Tel.:(+5521) 3865-9536
E-mail address: [email protected] (Tavares-Pinheiro, J).
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Resumo
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) é considerado o principal vetor de Leishmania
chagasi, agente etiológico causador da leishmaniose visceral nas Américas. Durante estudos
pioneiros no nordeste Brasil, Mangabeira (1969) observou variações fenotípicas entre
machos de L. longipalpis que coexistiam em simpatria em Sobral no Ceará, e sugeriu que
poderiam se tratar de espécies distintas. Desde então a maioria dos estudos destinados a
esclarecer o verdadeiro status taxonômico de L. longipalpis, apontam para a existência de
um complexo de espécies incipiente, embora o número de integrantes e suas áreas de
distribuição ainda não estejam totalmente resolvidos. Recentemente, estudos tem
correlacionado variabilidade genética a padrões fenotípicos distintos. Essas diferenças são
de grande importância para a saúde pública, não somente pela possibilidade de
influenciarem na capacidade vetorial desses flebotomíneos, mas também de sua
antropofilia. O presente estudo teve como objetivo analisar as características fenotípicas das
populações de machos de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município
de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo Antônio, localizado no
município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, região semi-árida do nordeste
brasileiro. As capturas foram realizadas durante o período de 12 meses. Armadilhas do tipo
HP foram empregadas, iniciadas às 18 horas e encerradas às 7 horas do dia seguinte,
totalizando 13 horas/coleta. Os flebotomíneos machos capturados foram identificados a
nível de espécie de acordo com a nomenclatura proposta por Galati (2003) e, em seguida, os
machos de L. longipalpis obtidos submetidos à caracterização fenotípica. Todos os machos
de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia apresentaram o padrão
morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, morfotipo predominante
também em outras áreas do Rio de Janeiro. No bairro de Santo Antônio, município de
Mossoró, identificamos significativa diversidade fenotípica, composta por machos que
apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, enquanto
outros apresentaram o padrão morfológico de 2 manchas claras no 3º e no 4º tergito, além
do encontro de um fenótipo intermediário representado por machos com uma mancha clara
no 4º tergito e 3/4 do 3º tergito preenchido pela mancha clara. Na última região variedades
morfológicas parecem apresentar importância vetorial com fortes consequências
epidemiológicas, tendo em vista a maior incidência da leishmaniose visceral na região
nordeste do Brasil, sobretudo no Estado do Rio Grande do Norte.
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis lato sensu, complexo Lutzomyia longipalpis,
caracterização fenotípica.
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Abstract
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) is considered the main vector of Leishmania chagasi,
an etiological agent that causes visceral leishmaniasis in the Americas. During pioneering
studies in northeast Brazil, Mangabeira (1969) observed phenotypic variations among males
of L. longipalpis that coexisted in sympatry in Sobral, Ceará, and suggested that they could
be different species. Since then, most of the studies aimed at clarifying the true taxonomic
status of L. longipalpis point to the existence of an incipient species complex, although the
number of members and their areas of distribution are still not fully resolved. Recently,
studies have correlated genetic variability to distinct phenotypic patterns. These differences
are of great importance for public health, not only for the possibility of influencing the
vectorial capacity of these sandflies, but also for their anthropophilia. The present study had
the objective of analyzing the phenotypic characteristics of the L. longipalpis males
populations from Restinga da Marambaia, Mangaratiba municipality, Rio de Janeiro State
and Santo Antônio neighborhood, located in the municipality of Mossoró, state of Rio
Grande do Norte, semi-arid region of Northeast Brazil. Catches were taken during the 12-
month period. HP- type traps were employed, starting at 6 pm and ending at 7 pm the
following day, totaling 13 hours / collection. The captured male sandflies were identified at
species level according to the nomenclature proposed by Galati (2003) and then the males
of L. longipalpis obtained submitted to the phenotypic characterization. All males of L.
longipalpis from the Restinga da Marambaia presented the morphological pattern of a pale
spot in the 4th abdominal tergite, a predominant morphotype in other areas of Rio de
Janeiro. In the Santo Antônio neighborhood, Mossoró municipality, we identified a
significant phenotypic diversity composed by males that presented the morphological
pattern of a pale spot in the 4th abdominal tergite, while others presented the morphological
pattern of 2 pale spots completely filled in the 3rd and 4th tergite, In addition to the finding
of an intermediate phenotype represented by males with a single solid spot in the 4th tergite
and 3/4 of the 3rd tergite filled by the light spot. In the latter region, morphological varieties
seem to present vectorial importance with strong epidemiological consequences, due to the
higher incidence of visceral leishmaniasis in northeastern Brazil, especially in the State of Rio
Grande do Norte.
Key words: Lutzomyia longipalpis lato sensu, Lutzomyia longipalpis complex, phenotypic
characterization.
INTRODUÇÃO
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) é considerado o principal vetor envolvido no
ciclo de transmissão de L. chagasi, agente etiológico causador da LVA. Durante estudos
pioneiros no Nordeste do Brasil, Mangabeira (1969) observou variações fenotípicas entre
machos de populações simpátricas de L. longipalpis em Sobral, no estado do Ceará e
alopátricas no estado do Pará. Foi identificada a existência de dois fenótipos distintos,
compostos por machos com uma mancha clara no IV segmento abdominal (1M), enquanto
outros apresentavam duas manchas claras, uma no III e outra no IV segmento abdominal
(2M). O mesmo também observou que em Sobral, apesar de coexistirem em simpatria,
essas populações estavam dispostas em ambientes com características ecológicas distintas.
35
Com base nesses indícios, sugeriu que poderiam se tratar de espécies distintas
(MANGABEIRA, 1969). Tais achados impulsionaram o desenvolvimento de novas
pesquisas, no sentido de solucionar a questão enigmática posta em debate, que ainda hoje
pretende responder se as populações de L. longipalpis, de diferentes regiões geográficas do
Brasil, correspondem a uma única espécie ou a um complexo de espécies a ser investigado
(BAUZER et al., 2007).
A evidência da formação de híbridos ou acasalamentos não aleatórios, consequência
do processo de diferenciação genética (MAINGON et al., 2008), parece existir com
populações de L. longipalpis. Costa Rica, Colômbia e Brasil produzem machos híbridos
(LANZARO et al., 1993). A seleção sexual também já é registrada entre populações que
vivem em simpatria, como as de Sobral (CE), nas quais fêmeas reconhecem feromônios e
sons de corte, produzidos especificamente pelo sexo oposto, dados esses concordantes com
o padrão de manchas nos tergitos dos machos (WARD et al., 1988; HAMILTON;
DAWSON; PICKETT, 1996; SOUZA et al., 2004; HAMILTON et al., 2005). A
participação dos feromônios e sons de corte é forte no processo de seleção sexual, agindo
como barreira reprodutiva (BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; BOTTECCHIA
et al., 2004; WATTS et al., 2005; MAINGON et al., 2008), na escolha dos parceiros no
momento do acasalamento (JONES; HAMILTON, 1998).
No Brasil, apesar das diferenças apresentadas entre os marcadores genéticos
(URIBE, 1999; SOARES; TURCO, 2003; BAUZER et al., 2007; ARAKI et al., 2013),
alguns estudos apontam, de acordo com análises mais amplas através de características
fenotípicas, comportamentais e genéticas, que existem espécies crípticas, simpátricas ou
alopátricas, em diferentes processos de diferenciação (WARD et al., 1983; LANZARO et
al., 1993; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; MAINGON et al., 2003; ARAKI
et al., 2009; LINS et al., 2012; ARAKI et al., 2013).
Lutzomyia longipalpis (l.s), possui extensa distribuição geográfica no Brasil,
entretanto, em áreas focalizadas e de forma descontinua (YOUNG; DURAN, 1994). Esse
cenário muito se deve a existência de barreiras geográficas, climáticas e ao curto raio de
vôo do vetor (ALEXANDER et al., 1998), sendo o isolamento por distância condição
reconhecida por reduzir o fluxo gênico entre as populações, atuando em processos de
especiação (BAUZER et al., 2007). Nessa perspectiva, a variabilidade genética observada
entre populações de L. longipalpis pode estar relacionada aos processos de deriva gênica e
seleção natural, eventos graduais na escala espaço-temporal que possivelmente exercem
influências sob a capacidade vetorial desses flebotomíneos, tendo fortes consequências na
36
epidemiologia da LVA (LANZARO et al., 1993).
A epidemiologia complexa da LVA e distribuição heterogênea, com manifestações
de amplo espectro clínico produzidas por L. chagasi, podem ser explicadas pelo
envolvimento de diversas espécies crípticas dentro do complexo L. longipalpis. Deste
modo, a importância dos processos de especiação para a saúde pública é de tal ordem que
torna-se necessário o conhecimento do vetor em cada foco de transmissão
(ARRIVILLAGA et al., 2003) de modo a contribuir para o seu controle.
É nesse contexto que foi realizado o primeiro estudo com o objetivo de analisar as
características fenotípicas das populações de L. longipalpis provenientes da Restinga da
Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo
Antônio, município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, área de transmissão
silenciosa e intensa dessa protozoose, respectivamente.
MATERIAIS E MÉTODOS
Área de estudo: Restinga da Marambaia, município de Mangaratiba (RJ).
A Restinga de Marambaia faz parte da Baía de Sepetiba, localizada no município de
Mangaratiba (entre 23°04’S e 43°53’ W), ao litoral sul do estado do Rio de Janeiro
(Figura1). Corresponde a uma Área de Proteção Ambiental (BRASIL, 2014), com clima
tropical úmido e ecossistemas diversificados contíguos ao bioma Mata Atlântica, tais como:
pântanos, restingas, dunas, praias e mangues. O território possui 79 km² e uma estreita faixa
de areia com 40 km de extensão o conecta ao continente. Embora a Restinga da Marambaia
não seja cercada de água por todos os lados, recebe também a denominação de Ilha da
Marambaia, por seu relevo e topografia característicos (CONDE et al., 2005; MATTOS,
2005; CARMO et al., 2013), por exemplo, durante a maré alta a extensa faixa de restinga
torna-se inundada.
A região é administrada pelas Forças Armadas do Brasil e recebe militares de origem
nacional e internacional para treinamentos, além de visitantes brasileiros de regiões
endêmicas de leishmaniose. A Restinga da Marambaia ainda é habitada por remanescentes
quilombolas. No peridomicílio a maioria dos moradores locais possuem criações de animais
para consumo. Os cães de estimação geralmente são deixados soltos e retornam as
residências ao anoitecer, período de maior atividade dos flebotomíneos. Ademais, casos de
leishmaniose visceral canina foram identificados em inqueritos sorológicos realizados na
37
região (ALONSO et al., 2014; CARMO et al., 2013).
Área de estudo: Bairro de Santo Antônio, município de Mossoró (RN)
O município de Mossoró, está situado no estado do Rio Grande do Norte,
mesorregião do Oeste Potiguar, sobre as seguintes coordenadas geográficas: Latitude 5º 11’
15” Sul, e longitude: 37º 20’ 39” Oeste. Possui área de aproximadamente 2.110,21 km² e
com altitude em relação a sede do município de 16 metros. Natal, a capital do estado, está
distante cerca de 285 km do município de Mossoró. O tipo de clima é muito quente e semi-
árido, com baixa Precipitação Pluviométrica, de aproximadamente 703.7mm/ano. Apresenta
duas estações bem marcadas, cujo período chuvoso ocorre de fevereiro a abril, seguido da
estação seca, com Umidade Relativa Média Anual em torno de 70% (IDEMA, 2008).
Para a realização do estudo foi selecionada uma área com transmissão intensa para
LVA, no município de Mossoró, seja ela: o bairro de Santo Antônio (Figura 2). Cabe
ressaltar, que na localidade há soroprevalência de leishmaniose visceral canina
(KAZIMOTO et al 2016).
Captura de flebotomíneos, seleção das amostras e identificação taxonômica
As capturas foram realizadas nas duas regiões geográficas descritas anteriormente,
entre o período de agosto de 2015 a agosto de 2016, totalizando 12 meses de captura em cada
área de estudo. Para isso, armadilhas luminosas do tipo HP foram empregadas, iniciadas às 18
horas e encerradas às 7 horas do dia seguinte, totalizando 13 horas/coleta.
As armadilhas foram instaladas em pontos onde levantamentos entomológicos
Figura 1. Mapa da Costa Verde, litoral sul do estado do
Rio de Janeiro, em destaque a Restinga da Marambaia,
localizada no município de Mangaratiba.
Figura 2. Mapa do município de
Mossoró, em destaque o bairro de
Santo Antônio.
38
anteriores evidenciaram a presença de L. longipalpis e no peridomicílio das residências as
quais inquéritos sorológicos caninos relataram a ocorrência de casos de leishmaniose visceral
canina. No peridomicílio foram selecionados os locais mais propícios à proliferação dos
flebotomíneos, como os abrigos de animais, principalmente galinheiros e canis.
Os insetos capturados foram entorpecidos com éter e em seguida foi realizada uma
triagem para separar flebotomíneos de não flebotomíneos. Com o auxílio de uma lupa
estereoscópica os flebotomíneos foram submetidos a uma segunda triagem para a separação
de machos e fêmeas. Os machos obtidos foram montados em lâminas para a visualização dos
caracteres morfológicos em microscópio óptico, e então identificados a nível de espécie de
acordo com a nomenclatura proposta por Galati, (2003).
Caracterização fenotípica
Após a identificação taxonômica os espécimes machos de L. longipalpis de cada uma
das regiões de captura foram submetidos à caracterização fenotípica, que consistiu em
identificar por meio de visualização em lupa estereoscópica o padrão morfológico de 1
mancha (1M) e ou de 2 manchas (2M) nos segmentos abdominais dos machos, de acordo com
a metodologia proposta por Mangabeira (1969), incluindo os fenótipos intermediários
descritos em estudo prévios.
Figura 3. Esquema ilustrativo de fenótipos descritos na literatura. A) Fenótipo 1M - 4º tergito preenchido pela
mancha clara; B) Fenótipo 2M- 3º e 4º tergitos preenchidos pela mancha clara; C) Fenótipo intermediário de 1
ponto (1P) - Uma mancha clara no 4º tergito abdominal e um ponto claro no 3º tergito em adicional; D) Fenótipo
intermediário de ¼ - 4º tergito preenchido pela mancha clara e 1/4 do 3º tergito em adicional preenchido pela
mancha clara; E) Fenótipo intermediário de ½ - 4º tergito preenchido pela mancha clara e 1/2 do 3º tergito
preenchido pela mancha clara; F) Fenótipo intermediário de ¾ - 4º tergito preenchido pela mancha clara e ¾ do
3º tergito em adicional preenchido pela mancha clara (MANGABEIRA, 1969 – A e B; WARD et al., 1985– A,
B;WARD et al., 1988 – A, B, C, D, E e F; DE SOUZA et al., 2008. – A, B e E; MUKHOPADHYAY et al.,
1998– A, B e F).
39
RESULTADOS
Durante os 12 meses de captura na Restinga da Marambaia foram coletados um total
24 (1,0%) espécimes machos de L. longipalpis. Todos os machos de L. longipalpis
capturados e submetidos à caracterização fenotípica apresentaram o padrão morfológico de
uma mancha clara no quarto tergito abdominal (Figura 3).
No município de Mossoró, especificamente no bairro de Santo Antônio, foram
coletados um total de 337 espécimes machos de L. longipalpis durante os 12 meses de
captura. Após a caracterização fenotípica, observou-se 131 (38,9%) machos que
apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4° tergito abdominal, 139
(41,2%) apresentaram o padrão morfológico de 2 manchas claras no 3º e 4º tergito, além do
encontro de um fenótipo intermediário composto por 67 (19,9%) machos com uma mancha
clara no 4º tergito e ¾ do 3º tergito em adicional preenchido pela mancha clara (Figura 4),
(Tabela 1).
Figura 3. Fenótipo de uma mancha clara no 4º
tergito obtido na Restinga da Marambaia
(Aumento de 25 X).
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Figura 4. Fenótipos obtidos na área de estudo de Mossoró: A- Fenótipo de uma mancha clara no 4º tergito
abdominal; B- Fenótipo de uma mancha clara no 4ª e 3º tergito abdominal e C- Fenótipo intermediário da uma
mancha clara no 4º tergito e ¾ do 3º tergito em adicional preenchido pela mancha clara (Aumento de 25 X).
Tabela 1. Número de fenótipos e as respectivas frequências obtidas nas áreas de estudo.
Durante a caracterização fenotípica observou-se que o padrão morfológico de 1M,
nem sempre apresenta o 4º tergito totalmente prenchido pela mancha clara, enquanto todos
padrões morfológicos de 2M apresentaram o 3º e o 4º tergito abdominal totalmente
preenchidos pela mancha clara.
Quanto ao fenótipo intermediário obtido, observamos que o 4º tergito nem sempre está
totamente preenchido pela mancha clara e o 3º tergito em adicional apresenta ¾ de
preenchimento pela mancha clara.
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DISCUSSÃO
Ao longo de doze meses de capturas na Restinga da Marambaia, foram obtidos um
total de 15.032 flebotomíneos, entre os quais, apenas 24 espécimes machos de L. longipalpis
foram capturados. A baixa densidade vetorial de L. longipalpis já havia sido observada desde
o primeiro levantamento entomológico realizado na região no ano de 2009, o qual revelou a
existência de uma composição faunística diversificada com a captura de um total de 32.006
flebotomíneos, distribuídos entre 13 espécies distintas, sendo quatro delas de importância
epidemiológica no Brasil (Migoneimyia migonei, Nyssomyia intermedia e Pintomyia fischeri),
espécies vetoras da LTA, incluindo entre machos e fêmeas um total 108 espécimes de
Lutzomyia longipalpis, espécie vetora da LVA (NOVO et al., 2013).
No presente estudo os machos de L. longipalpis coletados na Restinga da Marambaia
mostraram o padrão fenotípico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, morfotipo
predominante também em outras áreas do Rio de Janeiro, como no município de Campo
Grande (WARD et al., 1985) Mesquita e Garatiba - Barra de Guaratiba (ARAKI et al., 2009),
região sudeste do Brasil.
Durante o mesmo período foram capturados no bairro de Santo Antônio, município de
Mossoró (RN), um total de 1.002 flebotomíneos, dentre eles foram identificados 337 machos
de L. longipalpis. Através da caracterização morfológica, foi possível observar significativa
diversidade fenotípica, composta por machos que apresentaram o padrão morfológico de uma
mancha clara no quarto segmento abdominal, outros machos mostraram o padrão morfológico
de duas manchas claras no 3º e 4º tergito abdominal e ainda verificou-se a existência de um
fenótipo intermediário composto por machos com uma mancha clara no 4º segmento
abdominal e ¾ do 3º tergito em adicional preenchido pela mancha clara.
Se compararmos o total de flebotomíneos capturados nas duas áreas de estudo, é
notável o número bem superior de espécimes coletados na Restinga da Marambaia, devido a
sua maior extensão territorial e ecoepidemiologia condicionada a um mosaico de ecossistemas
associados, em relação ao bairro de Santo Antônio, área antrópica intensamente urbanizada.
Por outro lado, embora na Restinga da Marambaia o total de flebotomíneos tenha sido alto,
poucos espécimes de L. longipalpis foram capturados, ao passo que no município de Mossoró
– apesar do total menos expressivo, a quantidade de machos capturados foi mais elevada em
comparação com a primeira região. Isso reflete a densidade significativa do vetor na última
área de estudo, como sendo de alta endemicidade. Inquéritos entomológicos realizados na
mesma área apontam L. longipalpis como o flebotomíneo mais frequente e predominante, em
42
relação a outras espécies (KAZIMOTO et al 2016; AMORIM et al 2015).
Os machos de L. longipalpis provenientes do Estado do Rio Grande do Norte,
especialmente aqueles encontrados em Natal são altamente polimórficos para o fenótipo de
manchas nos tergais dos machos, uma vez que foram observados além dos padrões
morfológicos 1M e 2M, os fenótipos intermediários de ½, ¼ e ¾ do 3º tergito em adicional
preenchido pela mancha clara (WARD et al., 1983; WARD et al., 1988; MUKHOPADHYAY
et al., 1998; SOUZA et al., 2008).
Os morfotipos obtidos em Mossoró no presente estudo (1M, 2M e ¾) foram também
evidenciados por Mukhopadhyay e colaboradores (1998) em área endêmica próxima a cidade
de Natal, mas quando frequências isoenzimáticas foram comparadas, as 3 formas se
mostraram genotipicamente monomórficas, em conformidade com as expectativas de Hardy-
Heinberg. Diante desses achados eles consideram que em Natal, as variedades morfológicas
de L. longipalpis, correspondem na realidade a membros de uma população panmítica
(MUKHOPADHYAY et al., 1998).
No entanto estudos que analisaram isoenzimas (Mukhopadhyay et al., 1998; Mutebi et
al 1999; Azevedo et al., 1999), não encontraram heterogeneidade genética significativa a
ponto de considerar a existência de um complexo de espécies no Brasil.
Nessa perspectiva, Bauzer e colaboradores (2002a e b) ressaltam que populações de L.
longipalpis em diferentes regiões geográficas do Brasil, alopátricas ou simpátricas,
representam um complexo de espécies incipiente e distâncias genéticas a nível
interpopulacional não são facilmente detectáves por marcadores isoenzimáticos, pois estes
parecem não evoluir rápido o suficiente; seja por mudanças silenciosas ou pela persistência de
frequências alélicas semelhantes, quando se tratam de populações numerosas. Mas
particularmente em Natal, as variedades morfológicas de L. longipalpis parecem ser
monomórficas tanto para isoenzimas quando para marcadores nucleares de especiação, tais
como o gene per (BAUZER et al., 2002 a e b), cacofonia( BOTTECHIA et al., 2004),
microssatélites (WATTS et al., 2005), além de apresentarem filogenia monofilética
(BAUZER et al., 2002b).
Mangabeira (1969) foi o primeiro taxonomista a observar variações morfológicas entre
machos de L. longipalpis encontrados no Norte e Nordeste do Brasil. Ele identificou que no
estado do Pará os machos apresentavam apenas uma mancha clara no 4º tergito abdominal,
enquanto que no estado do Ceará, na localidade de Sobral, esse morfotipo coexistia em
simpatria com outro de uma mancha clara em adicional no 3º tergito abdominal. Ambos
habitavam nichos com características ecológicas contrastantes e, com base nesses indícios
43
sugeriu que poderiam se tratar de espécies distintas (MANGABEIRA, 1969).
Amparados pela definição de espécie biológica Ward e colaboradores (1983), testaram
a hipótese com cruzamentos experimentais realizados a nível interpopulacional, a partir de
colônias estabelecidas de L. longipalpis coletados em diferentes regiões geográficas do Brasil.
Quase todos os machos falharam em inseminar fêmeas heterólogas para os padrões
morfológicos de manchas. Em menores taxas, falhas na inseminação de fêmeas concordantes
com machos de uma mancha clara no 4º tergito também ocorreram. O forte isolamento
reprodutivo encontrado entre os morfotipos de populações simpátricas (1M X 2M), e entre
populações alopátricas com mesmo padrão de mancha (1M X 1M), indicou a existência de
pelo menos duas formas distintas pertencentes ao complexo L. longipalpis (WARD et al.,
1983).
Ainda assim, quando cópulas ocorreram entre populações alopátricas com fenótipos
distintos, observou-se a emergência de proles intermediárias, recuperadas por
retrocuzamentos após algumas gerações (WARD et al., 1983). Condição similar foi observada
durante cruzamentos experimentais realizados posteriormente e, fenótipos intermediários
foram descartados para não gerarem resultados ambíguos (WARD et al., 1988; SOUZA et al.,
2008). Com base nesses indícios, os padrões morfológicos de manchas nos tergitos
abdominais dos machos (1M e 2M) não foram considerados confiáveis para diferenciação a
nível específico, pois esses não se conservam por isolamento reprodutivo (WARD et al.,
1983; WARD et al., 1988; MUTEBI et al., 1999). Exceto para os pares morfológicos da
localidade de Sobral, os quais indicaram isolamento reprodutivo mais forte no pré –
acasalamento, a medida que não foram observadas cópulas durante tentativas de cruzamentos
heteroespecíficos, o que sugere um reforço no papel da especiação dentro do complexo L.
longipalpis, por se tratarem de populações simpátricas (SOUZA et al., 2008). Nesse caso,
diferenças morfológicas são úteis para separar espécie. (WARD et al., 1983; WARD et al.,
1988; SOUZA et al., 2008; ARAKI et al., 2009).
Na maioria das áreas onde os dois morfotipos se sobrepõem (1M e 2M), formas
intermediárias também são relatadas (BOTTECHIA et al., 2004; WARD et al., 1988).
Possivelmente, em condições naturais fenótipos intermediários são a manifestação visual de
polimorfismos intraespecíficos, originados a partir de cruzamentos entre padrões fenotípicos
distintos (WARD et al., 1988). No entanto, especialmente na localidade de Sobral (CE), onde
fenótipos intermediários são raros ou inexistentes (MUTEBI et al., 1999; BAUZER et al.,
2002b), os pares morfológicos (1M e 2M) em simpatria parecem representar espécies distintas
(WARD et al., 1983; WARD et al., 1988; SOUZA et al., 2008). Supostamente, a ausência de
44
fenótipos intermediários na localidade possa ser explicada por uma alteração de
semidominância para dominância de base genética, responsável pela expressão do fenótipo de
manchas, possivelmente pelo envolvimento de algum fator ambiental (MUTEBI et al., 1999;
BAUZER et al., 2002b).
Diante do exposto, tudo indica que assim como em Natal, o fenótipo intermediário de
¾ obtido na área estudo de Mossoró, corresponde a um híbrido, resultante do intercuzamento
entre os fenótipos 1M e 2M, morfotipos encontrados também na mesma área de captura.
Nesse contexto, o alto polimorfismo morfológico observado entre os machos de Natal
(MUKHOPADHYAY et al., 1998; WARD et al., 1988) sugere a existência de acasalamentos
aleatórios com fêmeas discordantes. Portanto o isolamento reprodutivo incompleto observado,
indica que nessas duas localidades os padrões morfológicos de manchas nos tergais dos
machos não devem ser utilizados para separar espécie (WARD et al., 1988; SOUZA et al.,
2008; BAUZER et al., 2007; ARAKI et al., 2009).
No Brasil as populações de L. longipalpis foram separadas em dois principais grupos,
de acordo com aspectos moleculares e comportamentais. O primeiro grupo possivelmente
corresponde a membros da mesma espécie, com ampla distribuição geográfica e genótipos
mais homogêneos, cujos machos emitem o som de corte do tipo estouro (brust- type) e
produzem o feromônio cembrene-1. Já o segundo grupo parece ser composto por membros
em diferentes processos de especiação incipiente, com distribuição restrita e genotipicamente
mais heterogêneo. Os machos pertencentes a esse grupo podem emitir subtipos de sons de
corte do tipo pulso (P1, P2, P3, P4, P5 e Mix) e secretar feromônios distintos com as seguintes
composições químicas: Germacrene, Himachalene, Cembrene-1 e Cembrene-2 (ARAKI et al.,
2009).
Esses sinais químicos e sonoros são fortes no processo de especiação a medida que
atuam como barreiras reprodutivas pré-zigóticas, acarretando na seleção sexual e isolamento
reprodutivo (SOUZA et al., 2008; BAUZER et al., 2007). Além das populações simpátricas
de Sobral, os pares morfológicos provenientes de Estrela de Alagoas e de Jaiba foram
recentemente indicados como novas espécies putativas do complexo L. longipalpis, os quais
diferem em aspectos genéticos e comportamentais na produção de feromônios e sons de corte
discordantes em relação aos fenótipos de manchas. Jaíba 1M produz o feromônio cembrene-2
e som do tipo pulso (P4), enquanto Jaíba 2M produz o feromônio cembrene-1 e som do tipo
estouro (HAMILTON et al., 2004; SOUZA et al., 2002b; ARAKI et al., 2009). Já os machos
de Estrela de Alagoas 1M e 2M apesar de produzirem o mesmo quimiotipo de feromônio
(cembrene-1), emitem sons de corte distintos, sendo o primeiro morfotipo do pulso (P5) e o
45
segundo do tipo estouro (ARAKI et al., 2009).
Tomamos aqui as populações de Natal como referência, pela proximidade com o
município de Mossoró - área do presente estudo - e pela similaridade dos morfotipos
encontrados nas duas áreas. Porém, não está claro na literatura o tipo de feromônio e som de
corte produzido por cada uma das três formas (1M, 2M e 3/4) encontradas em Natal. Portanto
presume-se que esses morfotipos produzem o mesmo tipo de feromônio (cembrene-1) e som
do tipo estouro, embora apresentem padrões morfológicos distintos (SOUZA et al., 2004;
ARAKI et al., 2009).
Recentemente foi identificado um novo padrão sonoro chamado de mix, produzido por
machos provenientes de município de Mesquita, estado do Rio de Janeiro. O som foi
caracterizado por uma mistura do tipo pulso e do tipo estouro, o qual inicia no primeiro terço
com trens de pulsos policíclicos seguido de rajadas do tipo estouro, altamente policíclicas até
o seu término. Tais achados revelam mudanças envolvidas com aspectos comportamentais e
fornecem indícios interessantes sobre a evolução de sons de corte, a medida que esses machos
além de vibrar as asas, mexem de forma continua seus corpos de um lado para outro num
ângulo de aproximadamente 30 graus durante o ritual de acasalamento, comportamento não
observado para as populações de tipo pulso (ARAKI et al., 2009). Vale ressaltar que os
machos de Barra de Guaratiba (RJ), apresentaram produção de dois tipos de feromônios,
sendo 9-metilgermacrene o principal composto encontrado, feito por um terpeno com 16
carbonos e o segundo composto constituído por dispertenos variados (ARAKI et al., 2009).
Futuramente será interessante conhecer o som de corte e o tipo de feromônio
produzidos pelos machos da Restinga da Marambaia, área de nosso estudo localizada no
mesmo estado.
Dentre os marcadores moleculares mais utilizados, o gene per destaca-se por controlar
ritmos biológicos e circadianos, associados a locomoção (KONOPKA; BENZER, 1971) e a
regulação de sons de corte, determinados pelo bater de asas dos machos durante o ritual de
acasalamento (KYRIACOU; HALL, 1980). Inicialmente estudado para o inseto modelo
Drosophila melanogaster (PEIXOTO et al., 1992; SAWYER et al., 2006), o gene per tem
sido útil para análise de diversidade genética entre membros do complexo L. longipalpis,
contanto que foi reconhecido por Coyne (1992) como “gene de especiação” (COYNE, 1992).
Um fragmento de 266 pares de bases (pb) do gene per, foi analisado a partir de
populações brasileiras isoladas por distância (Lapinha - MG, Jacobina - BA e Natal -RN). Os
resultados obtidos indicaram a existência de pelo menos três populações alopátricas altamente
diferenciadas para o gene per, com um nível muito baixo de fluxo gênico entre elas.
46
Entretanto, nenhuma mudança de aminoácidos foi observada neste fragmento (BAUZER et
al., 2002a).
Em seguida o mesmo fragmento de 266 pb do gene per foi analisado, desta vez a partir
de populações que coexistiam na região geográfica de Sobral (1M e 2M). Eles foram os
primeiros a apresentarem fortes evidências de que esses morfotipos poderiam representar duas
espécies simpátricas, sendo os membros do grupo 1M mais polimórficos do que o grupo 2M.
Entretanto, apesar da alta diversidade genética observada, não foram encontrados
polimorfismos fixos entre as duas formas (BAUZER et al., 2002b).
Essas inconsistências foram atribuídas a introgressão genética, ou seja, a possibilidade
de populações praticamente isoladas voltarem a se cruzar, resultando na manutenção de
polimorfismos ancestrais. Evidenciou-se ainda que Natal e Sobral 2M pertencem ao mesmo
pool genético e os índices de fixação em pares (FST) não foram significativos, embora as
duas localidades estejam a mais de 600 km de distância (BAUZER et al., 2002a; BAUZER et
al., 2002b). Nesse contexto cabe ressaltar que o município de Mossoró, onde foi realizado o
presente estudo está distante apenas 285 km quilômetros de Natal, a capital.
Após analisar um fragmento maior de 525 pb, Costa e colaboradores (2015)
identificaram novos polimorfismos fixos do gene per entre os pares morfológicos 1M e 2M de
duas localidades do Estado do Ceará (Sobral e Caririaçu) e uma do Estado de Pernambuco
(Bodocó), o que sugere relação direta entre variações fenotípicas e genotípicas. A utilidade
desse marcador molecular para análise de diversidade genética foi de tal ordem que o mesmo
foi indicado como um verdadeiro código de barras para identificação taxonômica de
populações simpátricas do complexo L. longipalpis no nordeste do Brasil. Além disso, os
perfis filogeográficos obtidos aqui, revelaram a origem ancestral do morfotipo 1M sob o 2M,
sendo de grande contribuição para entendimento da história natural e biogeografia desses
flebotomíneos (LIMA COSTA et al., 2015).
De acordo com aspectos biogeográficos, L. longipalpis pode ter habitado uma
extensão geográfica muito maior do que a atual, mas devido a alterações climáticas, sua
distribuição se tornou gradativamente focal e descontínua (WARD et al., 1985). Nessa
perspectiva a teoria dos refúgios parte do pressuposto que durante períodos extremamente
secos do pleistoceno e pós-pleistoceno, vastas áreas de floresta da América do Sul teriam
escasseado, restando apenas fragmentos de floresta úmida, os quais atuaram como “ilhas de
refúgios” (HAFFER, 1969), onde processos de especiação se intensificaram tal como uma
verdadeira “bomba de espécies” (HAFFER, 1992). Durante o quaternário, flutuações
climático-vegetacionais teriam provocado a retração e re-associação das áreas florestadas,
47
condição determinante para a diversificação da fauna e flora mais rápida nos trópicos
(HAFFER, 1969).
Atualmente, a alta diversidade genética observada entre as populações brasileiras de L.
longipalpis é comparada ao nível de complexidade evidenciado para o complexo Anopheles
gamblia reconhecido na África (BAUZER et al., 2007), cujos membros podem diferir quanto
a capacidade vetorial, em sua preferência hospedeira (AYALA; COLUZZI, 2005), assim
como na resistência a inseticidas, o que dificulta o controle de protozooses por eles
transmitidas, tendo graves implicações epidemiológicas (MARCONDES et al., 1997).
Nesse contexto, as duas áreas onde o presente estudo foi realizado apresentam
características epidemiológicas próprias e contrastantes. Apesar da Restinga da Marambaia
não ser considerada endêmica para leishmaniose visceral, um inquérito sorológico canino
realizado por Carmo e colaboradores (2014), confirmou a soropositividade da doença em 17
cães entre os 116 testados, equivalente a soroprevalência de 14,6% cães infectados, além do
encontro de L. infantum isolada em culturas positivas (CARMO et al., 2014).
Ainda não há relatos de casos humanos de leishmaniose visceral na Restinga da
Marambaia, porém as condições são favoráveis para a emergência da enfermidade, já que está
comprovada a circulação do parasito, vetor e de reservatórios amplificadores na região, elos
cruciais para que o ciclo de transmissão dessa protozoose ocorra e se estabeleça.
Por outro lado, cerca de 90 % dos casos de LVA relatados na América Latina ocorrem
no Brasil, principalmente na região nordeste (BRASIL, 2010). O Estado do Rio Grande do
Norte destaca-se pela alta endemicidade dessa protozoose, além de apresentar o coeficiente de
incidência anual mais elevado da média nacional (BARBOSA, 2013). Especialmente no
município de Mossoró, ocorre a maior incidência de casos do Estado (BARBOSA, 2013), e
vem apresentando nos últimos anos crescente taxa de letalidade, a cima da média para o país
(LEITE; ARAÚJO, 2013).
Considerando a distribuição das duas formas (1M e 2M) no Brasil, Ward e
colaboradores (1983) sugeriram que o padrão morfológico de 2M pode ter maior importância
vetorial na transmissão de L. chagasi, a medida que a sua distribuição desigual e restrita
coincide com a ocorrência focalizada de casos humanos de LVA na região nordeste do Brasil.
Nada obstante, mesmo apresentado perfis genéticos monomórficos
(MUKHOPADHYAY et al., 1998; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b;
BOTTECHIA et al., 2004; WATTS et al., 2005), não há como negligenciar a importância
vetorial das variedades morfológicas de L. longipalpis encontradas no Rio Grande do Norte,
haja vista que no estado são relatados os maiores índices de LVA do Brasil.
48
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53
9 CONCLUSÃO
• Todos os machos de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia (RJ)
apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal,
assim como em outras áreas do Rio de Janeiro.
• No bairro de Santo Antônio (RN), foi encontrada significativa diversidade fenotípica
composta por machos com o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito,
enquanto outros apresentaram uma mancha clara no 4º e 3º tergito abdominal, além do
encontro de um fenótipo intermadiário com 3/4 do 3º tergito em adicional preenchido
pela mancha clara.
• Na última região variedades morfológicas parecem apresentar importância vetorial
com fortes consequências epidemiológicas, tendo em vista a maior incidência da
leishmaniose visceral na região nordeste do Brasil, sobretudo no Estado do Rio
Grande do Norte.
54
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GLOSSÁRIO
Complexo de espécies crípticas: Formado por duas ou mais espécies morfologicamente
indistinguíveis, as quais são classificadas como uma única espécie, passíveis de
discrimimação por diferenças comportamentais e genéticas (BICKFORD et al., 2007).
Deriva gênica: Mudanças ao acaso na freqüência de alelos de uma população. Ocorre com a
diminuição do número de invíduos uma população, por conseguite, menos gametas formarão
a constituição genética das gerações futuras. Portanto, há redução da variabilidade genética,
com alelos sub-representados ou ausentes, considerando a composição genética da
população original. A longo prazo, tanto alelos deletérios podem ser fixados na população
quanto alelos de importância do ponto de vista evolutivo podem ser pedidos (KLUG et al.,
2009).
Especiação: Desdobramento de uma espécie em duas ou mais espécies filhas. Diz respeito
ao processo gradativo de formação de novas espécies a partir de um ancestral comum por
incompatibilidade reprodutiva intra- específica (ODUM; BARRETT, 2011). Os processos de
especiação podem ocorrer em condições simpátricas, parapátricas ou alopátricas.
Fenótipo: Expressão de uma característica que pode ser determinada por interações entre o
genótipo e fatores ambientais (LIMA-E-SILVA et al., 2002).
Fluxo gênico: Troca de atributos genéticos de uma população para outra, determinada pela
movimentação de indivíduos (LIMA-E-SILVA et al., 2002). A existência de fluxo gênico
entre populações é considerada fonte efetiva de variabilidade genética, enquanto a redução
gradual de fluxo gênico pode separá-las a nível de espécie (KLUG et al., 2009).
Genótipo: Corresponde a todas as informações genéticas presentes no genoma de um
organismo, as quais determinam sua fisiologia e estrutura (LIMA-E-SILVA et al., 2002).
Híbrido: Indivíduo resultante do cruzamento entre genitores com linhagens genéticas
distintas (KLUG et al., 2009).
Isolamento reprodutivo: Impedimento total ou parcial de intercruzamento efetivo entre
organismos integrantes de duas ou mais populações, inviabilizando o intercâmbio de fluxo
gênico, devido tanto a mecanismos pré-zigóticos quanto a mecanismos pós-zigóticos, os
quais podem ser determinados por diferenças morfológicas, genéticas, fisiológicas,
comportamentais e ecológicas (LIMA-E-SILVA et al., 2002). Fatores esses reconhecidos por
atuar em processos de especiação.
Introgressão genética: Quando populações em processo de especiação recente voltam a se
cruzar, devido ao tempo insuficiente para separá-las a nível de espécie por conta do
isolamento reprodutivo incompleto, o que dificulta a detecção de diferentes graus de
polimorfismos genético, por conseqüência da reintrodução de atributos genéticos e
conservação de polimorfismos ancestrais existentes entre os organismos envolvidos, como
ocorre com as populações simpátricas de flebotomíneos L. longipalpis encontradas no
nordeste do Brasil (BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; MAZZONI et al., 2008;
ARAKI et al., 2009; DE SOUZA FREITAS; DE QUEIROZ BALBINO, 2010; ARAKI et
al., 2013).
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Populações alopátricas: Conjunto de organismos pertencentes a mesma espécie separados
geograficamente, com baixo ou nenhum fluxo gênico entre eles (LIMA-E-SILVA et al.,
2002). Condição associada a processos de especiação alopátrica.
Populações simpáticas: Grupos de organismos pertencentes a mesma espécie que coexistem
na mesma região geográfica, mas por barreiras reprodutivas há impedimento parcial ou total
de intercruzamento entre eles (LIMA-E-SILVA et al., 2002). Condição associada a
processos de especiação simpátrica.
Ritmos circadianos: Termo proveniente do latim circa= “cerca” + dies= “dia”, o qual
designa a capacidade de um organismo programar seu ciclo de vida, realizar atividades, as
marcando e as repetindo durante intervalos de tempo de cerca de 24 horas (ODUM;
ORTEGA, 2006).
Seleção natural: Termo proposto por Charles Darwin (DARWIN, 1859) em sua obra
“Origem das Espécies”, o qual parte do princípio que seres pertencentes a mesma espécie
apresentam ligeiras variações na forma e fisiologia. Na luta pela sobrevivência as
características vantajosas são selecionadas pelo ambiente, logo os indivíduos mais adaptados
sobrevivem, se reproduzem e por conseguinte transmitem suas características genéticas ás
gerações futuras, garantindo assim a continuidade da espécie.
Sons de corte: Sons emitidos por machos no ritual de acasalamento para a atração das
fêmeas. No que diz respeito a fauna flebotomínica, machos de L. longipalpis pertencentes a
populações alopátricas e simpátricas podem emitir sinais sonoros com variações de
amplitude e frequência (SOUZA et al., 2004; BAUZER et al., 2007). Em evolução, esses
mecanismos pré-zigoticos são precurssores dos processos de especiação, a medida que atuam
na seleção sexual, resultando no isolamento reprodutivo (KLUG et al., 2009).