instituto nacional de pesquisas da amazônia – inpa...
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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e
Biologia Evolutiva
Análise citogenética e genotóxica de Caiman crocodilus (Linnaeus, 1758) provenientes de ambiente natural e antropizado dos arredores de Manaus
Vanessa Cristina Sales Oliveira
MANAUS, AMAZONAS ABRIL, 2015
ii
Vanessa Cristina Sales Oliveira
Análise citogenética e genotóxica de Caiman crocodilus (Linnaeus, 1758) provenientes de ambiente natural e antropizado dos arredores de Manaus
Orientador: Carlos Henrique Schneider, Dr.
Coorientadora: Eliana Feldberg, Dra.
Coorientador: Ronis Da Silveira, Dr.
Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
MANAUS, AMAZONAS ABRIL, 2015
iii
FICHA CATALOGRÁFICA O48a Oliveira, Vanessa Cristina Sales. Análise citogenética e genotóxica de Caiman crocodilus
(Linnaeus, 1758) provenientes de ambiente natural e antropizado dos arredores de Manaus / Vanessa Cristina Sales Oliveira. --- Manaus: [s.n.], 2015.
xiii, 64 f. : il. Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2015. Orientador : Carlos Henrique Schneider. Coorientador : Eliana Feldberg, Ronis Da Silveira. Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva.
1. Genotoxicidade. 2. Jacaretinga. 3. Caiman Crocodilus. 4. Elementos Retrotransponíveis.
I. Título. CDD 597.98
Sinopse: Caiman crocodilus, jacaré amazônico, foi estudado por meio de análises
genotóxicas e de citogenética clássica e molecular. Os resultados
evidenciaram que a poluição ambiental causa danos ao genoma e uma
diversificação na macroestrutura cariotípica dos representantes desta
espécie.
Palavras-chave: Caiman crocodilus, genotoxicidade, REX, FISH.
iv
Dedico esta dissertação a todos os que me apoiaram e
contribuíram direta ou indiretamente com a mesma.
v
Agradeço
À minha família que mesmo longe sempre me deram todo o apoio para a
conquista desse sonho e de tantos outros.
Ao meu orientador Dr. Carlos Henrique Schneider, por embarcar nessa
empreitada, dar-me todo o apoio científico, acadêmico, dedicação e
principalmente paciência, preocupando-se comigo não só como aluna, mas como
pessoa, afinal de contas não sou uma pessoa muito fácil de lidar!
À Dra. Maria Claudia Gross, pelos ensinamentos, correções e carinho ao
me acolher no seu laboratório e na grande família LACA.
À minha coorientadora, Dra. Eliana Feldberg, que se preocupa com todos
os alunos como sem fossem filhos e que desde o momento em que cheguei em
Manaus sempre procurou saber como eu estava e se “as coisas” estavam
caminhando.
Ao meu coorientador, Dr. Ronis Da Silveira, que apesar de ser um pouco
não convencional, sempre me ajudou nas coletas dentro da zona urbana de
Manaus, principalmente na pior de todas, no Igarapé do Mindu, contribuindo
bastante com a ampliação do meu conhecimento sobre jacarés e me dando todo
o suporte logístico.
Aos colegas do Laboratório de Citogenômica Animal da UFAM que me
ajudaram na bancada, sempre dispostos a me ensinar. Em especial Natália, Thais
e Erika.
Ao pessoal do Laboratório de Genética Animal do INPA por me acolherem
sempre que precisei de algum reagente ou mesmo pra jogar conversa fora.
Principalmente Patrik que me acompanhou nas coletas, bancada, disciplinas,
organização de Workshop, recepção dos novos alunos e etc.
À Diego, por juntamente com Patrik ter me ajudado em algumas coletas e
assim como ele ser um grande conhecedor da fauna amazônica.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), ao programa de
pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEv).
À Universidade Federal do Amazonas (UFAM) e ao Laboratório de
Citogenômica Animal (LACA), onde realizei todas as metodologias e análises de
resultados.
vi
Aos financiamentos concedidos pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Superior (CNPq) e pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado.
Aos colegas da turma de mestrado, especialmente Mayara, Erika e Patrik.
À Lara que me deu abrigo e motivos para boas risadas nesse último mês,
firmando ainda mais nossa amizade de dez anos.
Ao Júlio César que foi o único que me apoiou incondicionalmente, desde o
momento em que decidi fazer a inscrição do mestrado, pelas conversas diárias,
conselhos, por ouvir meus lamentos, pelo amor dispensado e por tentar se fazer
presente mesmo distante.
Muito Obrigada!
vii
“A ciência nunca resolve um problema
Sem criar pelo menos outros dez."
George Bernard Shaw
viii
Resumo
Os crocodilianos são predadores de topo de cadeia e possuem um importante
papel nos ecossistemas em que estão inseridos. Das espécies que ocorrem no
Brasil, a mais abundante é o jacaretinga (Caiman crocodilus). Os jacarés da
região amazônica são os menos estudados em relação às outras espécies de
crocodilianos, onde os poucos estudos realizados estão circunscritos a áreas
protegidas, excluindo as populações de C. crocodilus ocorrentes no perímetro
urbano, que estão continuamente expostas a ambientes antropizados. Em termos
citogenéticos foi descrito o número diploide da espécie, porém uma abordagem
mais específica sobre bandeamentos cromossômicos diferenciais, hibridização
fluorescente in situ (FISH), teste de micronúcleo e ensaio do cometa se fazem
necessários para um melhor entendimento do efeito da poluição no genoma
desses animais. Exemplares oriundos de ambiente natural e antropizado de
Manaus, AM foram estudados para avaliar o potencial genotóxico dos poluentes
domésticos no genoma de C. crocodilus. Para as análises cromossômicas foram
utilizados 12 exemplares de C. crocodilus (6 ♂, 6 ♀), do Lago Catalão – Manaus,
Igarapé do Mindu e Igarapé da Assua, Estado do Amazonas. A espécie
apresentou número diploide de 42 cromossomos (24t+18m/sm e NF=60) com
pouca complexidade e heteromorfismo. O padrão de distribuição da
heterocromatina mostrou-se conservado, nas regiões centroméricas dos
cromossomos, porém mais acentuado no par 21. A região organizadora de
nucléolo (Ag-RON) é simples, cuja localização no par 13 coincidiu com a região
heterocromática centromérica, e com a localização de sítios de hibridação
duplicados com sonda de DNAr 18S no par 13 de C. crocodilus. Estes resultados
sugeriram a possibilidade de variação para a espécie, entre os exemplares da
América do Sul em relação aos da América do Norte, diferenciada através de
fissões cromossômicas, rearranjo comum a outras espécies do gênero. A análise
genotóxica, por Ensaio do Cometa, de 8 exemplares de C. crocodilus (4 ♀, 4 ♂),
do Lago Catalão e 7 (2 ♀, 1 ♂ e 4 indeterminados) dos igarapés urbanos de
Manaus – AM. Foi realizado por meio do teste U de Mann-Whitney. Observaram-
se que, o valor de “p” foi significativo para os níveis 3 (p = 0,007) e 5 (p = 0,010),
ao comparar os diferentes ambientes, onde o nível 3 é considerado um dano
moderado e o nível 5 que a célula se encontra em apoptose. Já para o teste do
ix
Micronúcleo, entre os 15 exemplares de C. crocodilus (7 ♀, 8 ♂), Lago Catalão e
15 (8 ♀, 9 ♂) do igarapé do Mindu. Nota-se que ao comparar a quantidade de
eritrócitos micronucleados encontrados com o ambiente, o valor de p = 0,04 se
mostrou significativo. O impacto da poluição no ambiente aquático pode ser
significativo a longo prazo para o surgimento de mutações e diferenciação no
cariótipo das espécies que ocorrem na região amazônica. Nossos resultados
podem contribuir significativamente com estratégias de conservação dos
crocodilianos no perímetro urbano da cidade de Manaus.
x
Abstract
Crocodilians are chain top predators and play an important role in the ecosystems
in which they live. Species that occur in Brazil, the most abundant is the
spectacled Caiman (Caiman crocodilus), which is found in many different
environments. Alligators in the Amazon region are the least studied in relation to
other species, occurring in other parts of the world where the few studies are
confined to protected areas, excluding the populations of C. crocodilus occurring
within the city limits, which are continuously exposed the anthropogenic
environments, generating an incipient knowledge about them. Although there is
description for the diploid number of the species, a more specific approach as
banding chromosome techniques, fluorescent in situ hybridization (FISH),
micronucleus test and comet assay are necessary for a better understanding of
pollution effect in the genome of these animals. Thus, we collected specimens in
non anthropic environment and anthropic for domestic effluents to assess the
genotoxic potential of these pollutants in the genome of alligators. For
chromosomal analyzes were used 12 Caiman crocodilus (6 ♂, ♀ 6), caughts in
Lake Catalão, in the Mindu stream and the Assua stream in the Amazon state.
Where, from the conventional staining subspecies showed diploid number of 42
chromosomes (24t+18m/sm and NF=60) with little complexity and
heteromorphisms. The pattern observed in C. crocodilus in relation to the
distribution of heterochromatin is shown maintained, presenting in the centromeric
regions of chromosomes, but more so in pair 21. The nucleolus organizer region
(Ag-RON) is simple, where your location the pair 13 coincides with the
heterochromatic centromeric region, and with the location of hybridization sites
with 18S rDNA probe. These hybridization sites showed a doubling in one of the
pair of chromosomes 13 in C. crocodilus. Cytogenetic characteristics suggested
the possibility of variation for the species in relation to North America,
differentiated by chromosomal fissions, common rearrangement to other species
of the genus. For genotoxic analysis of Comet Assay were captured 8 C.
crocodilus (4 ♀, 4 ♂) Lake Catalan and 7 (2 ♀, 1 ♂ and 4 indeterminate) of urban
streams of Manaus - AM. Using the Mann-Whitney U test, it was observed that the
p value was significant for levels 3 (p=0.007) and 5 (p=0.010) when comparing the
different environments, where the level 3 is considered damage moderate, and
xi
level 5 that the cell is undergoing apoptosis. As for the micronucleus test, 15 C.
crocodilus were captured (7 ♀, 8 ♂) on Lake Catalão and 15 (8 ♀, 9 ♂) of Mindu
stream - AM. Note that when comparing the amount of micronuclei with the size of
the animals, the value of p=0.04 was significant. Our study demonstrates that the
impact of pollution on the aquatic environment can be significant in the long term
for the emergence of mutations and differentiation in the karyotype of the species
occurring in the Amazon. Our results can significantly contribute to the crocodilian
conservation strategies within the city limits of the city of Manaus.
xii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................XIII 1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 1
1.1 CROCODYLIA............................................................................................................ 1
1.1.1 Aspectos Gerais.........................................................................................................1
1.1.2 Aspectos Taxonômicos..............................................................................................1
1.1.3 Espécie-alvo...............................................................................................................2
1.2 CITOGENÉTICA DE CROCODILIANOS.................................................................................4
1.3 POLUIÇÃO NA BACIA AMAZÔNICA.................................................................................. 10
1.4 TESTE DE MICRONÚCLEO (MN) E ENSAIO DO COMETA................................................... 12
1.5 OBJETIVOS................................................................................................. 16
1.5.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................................... 16
1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................................ 16
2. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................17
2.1 CAPTURA DOS EXEMPLARES.......................................................................................... 17
2.2 TESTE DO MICRONÚCLEO.............................................................................................. 21
2.3 ENSAIO DO COMETA...................................................................................................... 21
2.4 ANÁLISES CITOGENÉTICAS CLÁSSICAS........................................................................... 23
2.5 CITOGENÉTICA MOLECULAR.......................................................................................... 24
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................... 28
3.1 CAPÍTULO 1................................................................................................................... 29
4. CONCLUSÃO GERAL..................................................................................... 48 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 50
xiii
Lista de Figuras Figura 1 – Distribuição Geográfica de Caiman crocodilus ....................................... 3
Figura 2 - Origem do micronúcleo durante a divisão celular ................................. 10
Figura 3 – Mapa Indicando os pontos de coleta no Igarapé do Mindu .................. 16
Figura 4 – Mapa Indicando os pontos de coleta na Universidade Federal do
Amazonas. ............................................................................................................. 16
Figura 5 - Mapa Indicando os pontos de coleta no Lago Ouro Verde ................... 17
Figura 6 - Mapa Indicando os pontos de coleta no Lago Catalão ......................... 18
Figura 7 – Classificação de Cometas de acordo com o tamanho da cauda
segundo Ribeiro et al. (2004). ............................................................................... 21!
Figura 1 - Cariótipo de Caiman crocodilus em coloração convencional com
Giemsa (a); Distribuição de heterocromatina constitutiva (b); Localização da
região organizadora de nucléolo. .......................................................................... 35
Figura 2 - Cariótipo de Caiman crocodilus com hibridização de sonda telomérica
em vermelho; localização do DNAr 18S. Os cromossomos foram contra corados
com DAPI (azul). .................................................................................................... 37
Figura 3 - Cariótipos de Caiman crocodilus com hibridização do retroelemento
Rex1 (vermelho) de ambiente não antropizado em fêmeas (a) e machos. ........... 38
Figura 4 - Cariótipos de Caiman crocodilus com hibridização do retroelemento
Rex1 (vermelho) de ambiente antropizado em fêmeas (a) e machos (b).. ........... 39
Figura 5 – Células submetidas ao ensaio do cometa impregnadas com nitrato de
prata: núcleos sem danos (0), caudas de cometas indicando os danos
progressivos ao DNA (1 a 4) e apoptose (5) em indivíduos de ambiente não
antropizado (a) e antropizado (b). ....................... Error! Bookmark not defined.41
Figura 6 – Micronúcleo em Caiman crocodilus em coloração convencional com Giemsa (seta). Barra: 10µm................................................................................. Error! Bookmark not defined.42
1
1. Introdução
1.1. Crocodylia 1.1.1. Aspectos gerais
Os crocodilianos atuais apresentam uma história evolutiva de
aproximadamente 60 milhões de anos, estando associados a diversos habitats
aquáticos como rios, lagos, córregos e pântanos (Ross 1989).
Os indivíduos adultos apresentam uma dieta mais variada do que a dieta
dos juvenis (Webb et al. 1982). Durante o primeiro ano de vida a dieta é composta
principalmente por invertebrados, desde insetos (principalmente Odonata,
Hemiptera e Coleóptera), aranhas, crustáceos (principalmente caranguejos),
moluscos (principalmente Pomacea e Bivalvia) e pequenos peixes, enquanto que
os adultos incrementam a dieta com o acréscimo de peixes grandes, aves, outros
répteis e mamíferos de pequeno e médio porte (Magnusson et al. 1987;
Thorbjarnarson 1993; Da Silveira e Magnusson, 1999; Rueda-Almonacid et al.
2007; Coutinho e Campos 2007; Marioni et al. 2008).
1.1.2 Aspectos taxonômicos Os componentes da ordem Crocodylia são divididos em três famílias:
Crocodylidae, Gavialidae e Alligatoridae. Esta divisão se deve principalmente às
variações observadas no que diz respeito à morfologia da cabeça, estas
variações se devem basicamente às estratégias e preferências alimentares. Os
Alligatoridae apresentam o rostro mais largo, enquanto os representantes da
família Crocodylidae possuem uma variedade de larguras dos rostros, e os
representantes da família Gavialidae possuem um rostro bem estreito (Grigg e
Gans 1993).
O número de espécies atualmente aceito varia entre 23 (Brochu 2003), 24
(Martin 2008; Hekkala et al. 2011) e 25 (elevando uma subespécie ao nível de
espécie) (McAliley et al. 2006). Estas espécies estão distribuídas em nove
gêneros, que estão agrupados nas famílias: Alligatoridae (Caiman, Melanosuchus,
Paleosuchus, Alligator), Crocodylidae (Crocodylus, Osteolaemus, Tomistoma e
Mecistops) e Gavialidae (Gavialis) (McAliley et al. 2006), sendo que o maior nível
de diversidade de espécies é observado em Crocodylus, que reúne 13 espécies
(Martin 2008).
2
No Brasil ocorrem cinco espécies, pertencentes apenas à família
Alligatoridae: Caiman crocodilus (Linnaeus, 1758), conhecido como jacaretinga;
Paleosuchus trigonatus (Schneider, 1801), conhecido como jacaré-coroa; Caiman
latirostris (Daudin, 1802), conhecido como jacaré-de-papo-amarelo; Paleosuchus
palpebrosus (Cuvier, 1807), conhecido como jacaré-paguá e Melanosuchus niger
(Spix, 1825), conhecido como jacaré-açu. Na Amazônia ocorrem quatro espécies
que são popularmente chamadas de jacarés: i) o jacaré-açu é um dos maiores
predadores das Américas, podendo atingir mais de cinco metros de comprimento
total (CT), onde o CT compreende a medida completa do animal, desde a
extremidade do rostro até a extremidade da cauda; ii) o jacaré-coroa que pode
atingir 1,7 m de CT, ocorrendo basicamente nos riachos de terra firme; iii) o
jacaré-paguá atinge pouco mais de 1,5 m de CT, sendo um dos menores
crocodilianos viventes; iv) o jacaré-tinga (Caiman crocodilus) é um dos
crocodilianos mais abundantes na Amazônia, chegando a atingir 2,5 m de CT
(Steel 1989; Rueda-Almonacid et al. 2007).
1.1.3 Espécie-alvo O Caiman crocodilus é um táxon amplamente distribuído no continente
americano, sendo a espécie com maior distribuição entre os jacarés, habitando
desde o sul do México até o norte da Bolívia (King e Burke 1989; Ross 1998;
Rodriguez 2000; Oliveira 2010) e foi introduzido nos EUA, em Cuba e Porto Rico
(Figura 1) (Da Silveira e Marioni 2010).
3
No que diz respeito à conservação, segundo a União Internacional para
Conservação da Natureza (IUCN), C. crocodilus está listado como “Pouco
Preocupante” (CSG 1996 apud IUCN 2013).
Caiman crocodilus pode suportar maior pressão de exploração pela
facilidade no recrutamento de indivíduos para a população reprodutiva (Rebêlo e
Magnusson 1983). Isto se deve ao fato de que esta espécie atinge o comprimento
reprodutivo com aproximadamente 60 cm para as fêmeas e 75 cm para os
machos, em um intervalo de tempo mais curto, entre 4 e 6 anos de idade,
diferentemente das outras espécies de crocodilianos, que alcançam a maturidade
sexual entre 10-20 anos, com comprimento variando de 130 cm para as fêmeas e
140 cm para os machos (Da Silveira 2001; Rueda-Almonacid et al. 2007).
Possuem comportamento territorialista na estação reprodutiva, exibindo
comportamento de corte (Rueda-Almonacid et al. 2007).
Figura 1 – Distribuição Geográfica de Caiman crocodilus (Fonte: IUCN Crocodile Specialist Group)
4
Os jacarés amazônicos figuram entre os crocodilianos menos estudados no
mundo. Padrões de distribuição, abundância, estrutura de tamanho e razão
sexual destas espécies ainda são pouco conhecidos, limitando-se a poucos
estudos realizados em áreas protegidas e em áreas de savana, sendo raramente
estudados em áreas florestais e urbanas (Ouboter e Nanhoe 1984; Da Silveira et
al. 1997).
Até o momento foram desenvolvidas várias pesquisas de cunho ecológico
(Da Silveira et al. 1997; Da Silveira e Magnusson 1999; Da Silveira e
Thorbjarnarson 1999; Da Silveira et al. 2010; 2013; Marioni et al. 2008; 2013), de
diversidade genética (Farias et al. 2004; Vasconcelos et al. 2006; 2008) e de
paternidade múltipla (Oliveira et al. 2010), entretanto, trabalhos que abordem a
estrutura cariotípica e a organização genômica destas espécies são escassos.
1.2 Citogenética de Crocodilianos
O cariótipo das espécies tende a diferir quanto à forma, tamanho e número
de cromossomos (Guerra 1988; Nicholas 1999). Assim, as análises dos
cromossomos de vertebrados e de outros organismos têm finalidades diversas,
como contribuir para o conhecimento da estrutura, da organização molecular e do
comportamento cromossômico, o que pode auxiliar na elucidação de espécies
crípticas, de complexo de espécies, além de revelar mecanismos de rearranjos e
identificar marcadores para híbridos interespecíficos (Kasahara 2009).
Dados citogenéticos disponíveis para as espécies de crocodilianos (Tabela
1) revelaram que o número diploide (2n) varia entre 30 (Crocodylus siamensis e
Crocodylus rhombifer) a 42 (Caiman latirostris, C. yacare, C. crocodilus,
Melanosuchus niger, Paleosuchus trigonatus e P. palpebrosus) e o número
fundamental (NF) varia entre 56 e 62 (King et al. 1986; Amavet et al. 2003;
Kawagoshi et al. 2008; Olmo e Signorino 2014), apresentando ausência de
microcromossomos, possivelmente pela ocorrência de uma série de fusões entre
eles, após a divergência ocorrida entre as linhagens de crocodilianos e aves há
220–250 m.a.a. (Kawagoshi et al. 2008). Das 23 espécies estudadas
citogeneticamente, nenhuma apresentou cromossomos sexuais diferenciados, o
que é facilmente compreendido devido à dependência da temperatura para
determinação do sexo (Amavet et al. 2003; Valenzuela e Lance 2004; Kawai et al.
2007).
5
Família
Espécie N
úmero
Diploide
Núm
ero Fundam
ental B
anda C
RO
N*
FISH**
Referência
Alligatoridae
A
lligator mississippiensis
2n=32 N
F=60
Cohen e G
ans 1970
A
lligator sinensis 2n=32
NF=60
Zeng et al. 2011
C
aiman crocodilus
2n=42 N
F=62 intersticial, constrição
secundária (par 16)
C
ohen e Gans 1970
King et al. 1986
Am
avet et al. 2000
Caim
an latirostris 2n=42
NF=60
centrômero, intersticial
(par indefinido) intersticial (par
indefinido)
Cohen e G
ans 1970, A
mavet et al. 2000,
2003
Caim
an yacare 2n=42
NF=60
centrômero
intersticial (par indefinido)
A
mavet et al. 2003
M
elanosuchus niger 2n=42
NF=60
C
ohen e Gans 1970
P
aleosuchus palpebrosus 2n=42
NF=58
C
ohen e Gans 1970
P
aleosuchus trigonatus 2n=42
NF=58
C
ohen e Gans 1970
Crocodylidae
Crocodylus cataphractus
2n=30 N
F=58
Cohen e G
ans 1970
C
rocodylus palustris 2n=30
NF=58
C
ohen e Gans 1970
C
rocodylus rhombifer
2n=30 N
F=58
Cohen e G
ans 1970 C
havananikul et al. 1994
Tabela 1 – Dados citogenéticos para a O
rdem C
rocodylia. *RO
N (R
egião Organizadora de N
ucléolo). **FISH (Fluorescence in situ hybridization)
6
C
rocodylus siamensis
2n=30 N
F=58 centrôm
ero e constrição
secundária (par 15)
18S/28S
(intersticial, par 15)
Chavananikul et al. 1994 K
awagoshi et al. 2008
C
rocodylus acutus 2n=32
NF=58
C
ohen e Gans 1970
C
rocodylus intermedius
2n=32 N
F=58
Cohen e G
ans 1970
C
rocodylus johnstoni 2n=32
NF=58
intersticial , crom
ossomo
heterocromático (par
15) e constrição secundária (par 10)
Cohen e G
ans 1970 K
ing et al. 1986
C
rocodylus moreletii
2n=32 N
F=56
Cohen e G
ans 1970
C
rocodylus niloticus 2n=32
NF=58
C
ohen e Gans 1970
Chavananikul et al. 1994
C
rocodylus novaeguineae
2n=32 N
F=58
Cohen e G
ans 1970 C
havananikul et al. 1994
C
rocodylus porosus 2n=34
NF=58
centrômero, braço
curto (14), braço curto e longo (par 15), crom
ossomo
heterocromático (par
16)
constrição secundária (10)
18S/26S (intersticial, ITS e telôm
ero) braço curto (1) e braço
longo (2, 3, 6 e 10)
Cohen e G
ans 1970 K
ing et al. 1986 C
havananikul et al. 1994 D
alzell et al. 2010
Gavialidae
G
avialis gangeticus 2n=32
NF=60
C
ohen e Gans 1970
Tom
istoma schlegelii
2n=32 N
F=58
Cohen e G
ans 1970
Tabela 1 – Dados citogenéticos para a O
rdem C
rocodylia (cont.)
7
Estudos evidenciam que o cariótipo ancestral de Crocodylia possuía 42
cromossomos telocêntricos, assim como as espécies de Paleosuchus.
Modificações estruturais como fusão, inversão pericêntrica e translocação
recíproca deram surgimento às fórmulas cariotípicas atuais, como as encontradas
nos gêneros Alligator, Crocodylus, Osteolaemus, Tomistoma e Gavialis (Cohen e
Gans 1970; King 1986; Amavet et al. 2003). Na maioria das espécies de
Crocodylidae observa-se a constrição secundária no par 10, ainda que em C.
crocodilus ela se apresente no par 16 (King et al. 1986).
Para C. crocodilus, assim como para a maioria dos crocodilianos, apenas o
número diploide foi descrito (King et al. 1986; Lui et al. 1994). Entretanto,
bandeamentos cromossômicos diferenciais, tais como detecção da região
organizadora de nucléolo, da heterocromatina e mapeamentos físicos de regiões
específicas são de fundamental importância quando se quer entender o efeito de
poluição ambiental, seja industrial ou doméstica, sobre o genoma das espécies
expostas a estas interferências, tornando-se necessário observar se esta está
causando alterações estruturais e/ou funcionais como mutações, rearranjos,
perda de regiões de interesse e modificações na expressão gênica.
1.3 Poluição na Bacia Amazônica
O crescimento urbano e populacional desordenado tem impactado de maneira
drástica os ecossistemas aquáticos e terrestres (Branco 1983; Payne 1986;
Tundisi e Barbosa 1995; Silva et al. 1998), causando uma redução na
biodiversidade (Tundisi et al. 1995; Silva et al. 1998).
A bacia amazônica possui o mais extenso e mais volumoso sistema fluvial do
mundo, formado pelo complexo Solimões/Amazonas e um incontável número de
pequenos igarapés (Santos e Ferreira 1999; Figueiredo et al. 2009; Mora et al.
2010), abrangendo aproximadamente sete milhões de km2 de área, onde 58%
desse total localiza-se no território brasileiro (Sioli 1985; Hoorn e Wesselingh
2010; Wanderley-Filho et al. 2010).
Nos últimos anos, os ecossistemas aquáticos da Amazônia Central vêm
sofrendo com efeitos da antropização, onde muitos deles tiveram um aumento na
quantidade de material particulado em 300 vezes comparados aos trechos
naturais (Cleto Filho e Walker 2001; Melo et al 2005; Pinto 2009). O despejo de
8
esgotos em corpos d’água pode criar um aumento na quantidade de nutrientes e
íons dissolvidos na água (eutrofização), ocasionando a proliferação de
organismos que em condições normais não existiriam, criando um desequilíbrio
ambiental e disputas por recursos como oxigênio e alimentos (Esteves 1988).
Entre os principais poluentes destacam-se os metais pesados (Hg, Au, Co,
Cu, Fe, Cr, Ni, Mn, Pb e Zn), que contaminam o meio ambiente devido o descarte
incorreto de pilhas, baterias e eletroeletrônicos. Ao entrarem no ecossistema
aquático se distribuem em diversos níveis como solo, sedimento, plantas e
animais, chegando a ser tóxicos dependendo do nível de bioacumulação
(Förstner 1987; Filgueiras et al. 2004; Santana e Barroncas 2007).
Substâncias como metal, plástico e matéria orgânica contribuem para a
produção de um chorume rico em metais pesados e, consequentemente,
aumentam o valor do pH da água. Esse aumento acaba por reduzir a quantidade
de oxigênio dissolvido disponível - OD (Oygard et al. 2004), o que facilita a
mobilidade dos metais pesados presentes no meio (Sletten et al. 1995; Manahan
1999; Bartolomeo et al. 2004; Silva et al. 2004). A antropização causa um
distúrbio que altera, além da mobilidade, a interação dos metais carreados com o
OD (Filgueiras et al. 2004), facilitando reações que alteram sua estrutura química,
resultando num aumento da potencial toxicidade dos metais pesados (Lacerda e
Fitzgerald 2001; Oliveira et al. 2007).
A cidade de Manaus, uma das maiores capitais da Região Norte, é um
exemplo de zona urbana localizada no meio da floresta (Nogueira et al. 2007). A
capital que em 1940 possuía aproximadamente 67 mil habitantes passou a 635
mil habitantes em 1980, com um crescimento demográfico de 405% (Santana e
Barroncas 2007), chegando em 2013 à 1.982.177 habitantes, sendo o sétimo
município mais populoso do Brasil (IBGE 2013). A cidade é recortada por uma
densa malha de igarapés e devido a essa intensa explosão demográfica houve
um aumento considerável de lixo, o que resulta em um armazenamento em locais
não apropriados, sendo despejados em locais a céu aberto, ou diretamente nos
corpos d’água sem nenhum tratamento (Silva 1996; Elias e Silva 2001; Cleto Filho
e Walker 2001; Melo et al. 2005). Isto vem alterando drasticamente as
características físico-químicas dos corpos d’água, tais como: a) aumento da
temperatura; b) aumento no pH; c) elevação no teor de cálcio e magnésio; d)
diminuição da condutividade elétrica; e) diminuição do oxigênio dissolvido na água
9
(Silva 1996; Melo et al. 2005). Estudos já mostram que há contaminação por
metais pesados em diversas bacias dos igarapés urbanos de Manaus (Silva 1996;
Sampaio 2000; Santana e Barroncas 2007).
A área urbana de Manaus possui três bacias hidrográficas (Bacia do
Puraquequara, Bacia do Tarumã-Açu e Bacia do Rio Negro), onde as duas
primeiras bacias se encontram parcialmente inseridas na malha urbana e a última
se encontra integralmente dentro da cidade (Santana e Barroncas 2007). A bacia
do Rio Negro tem como tributários urbanos as microbacias do São Raimundo e
Educandos, que possuem como principais tributários os igarapés do Mindu e do
Quarenta, respectivamente que drenam áreas densamente povoadas (Pinto et al.
2009).
Interferências humanas sobre a paisagem influenciam a riqueza e a
composição da fauna nestes ambientes. A fauna aquática, de modo geral é
sensível a mudanças no ambiente, principalmente quando se refere à qualidade
da água e o nível de OD (Cleto Filho e Walker 2001). Percebe-se então que
corpos hídricos amazônicos podem ser aceptores de poluentes liberados no
ambiente, seja de fontes naturais por lavagem e lixiviação do solo, seja por
atividades humanas que lançam diretamente os despejos industriais e urbanos,
servindo como um sistema de estoque de poluentes (Förstner e Wittmann 1983;
Al-Sabti e Metcalfe 1995; Filgueiras et al. 2004).
A contaminação química dos corpos hídricos pode motivar uma redução no
tamanho da população natural, por mutações deletérias em células somáticas
e/ou células germinativas ou ainda por perda da diversidade genética de aves e
peixes (Bickham et al. 2000). Entretanto, algumas espécies suportam viver
nestes ambientes poluídos e entre elas destacam-se os jacarés por serem
espécies-chave no ecossistema que ocupam. A presença deste grupo nos
igarapés urbanos se dá pelo fato destes serem predadores de topo de cadeia,
cuja dieta é generalista e oportunista que varia de acordo com a idade, tamanho
do indivíduo, sazonalidade, disponibilidade de presas, estação e o nicho que
ocupam (Webb et al.1982; Magnusson et al. 1987; Thorbjarnarson 1993).
Para medir esses danos, faz-se necessário uma melhor compreensão a
respeito do efeito da poluição no genoma dos organismos aquáticos, visto que
muito deles possuem ciclo de vida parcial ou completamente aquático.
10
1.4 Teste de Micronúcleo (MN) e Ensaio do Cometa Paralelamente às análises citogenéticas, o teste de micronúcleo é utilizado
para determinar componentes clastogênicos e aneugênicos a partir da contagem
de micronúcleos (MN) em linfócitos do sangue periférico, células epiteliais,
eritrócitos e fibroblastos (Fenech et al. 1999). O micronúcleo se origina a partir de
quebras de cromossomos ou da perda de cromossomos que não estão presentes
no núcleo da célula-filha durante a divisão celular (Figura 2) ou ainda, por
hipometilação de regiões centroméricas e intersticiais, sendo assim considerado
um bom marcador para fatores genotóxicos (Fenech et al. 1999; 2011; Singh et al.
2013).
A análise de MN foi desenvolvida primeiramente em camundongos (Schmid
1976; Pantaleão et al. 2006) e tem sido utilizada em estudos com outros animais,
considerados bioindicadores como peixes (Al-Sabit 2000; Bucker et al. 2006; Nan
et al. 2013), pequenos mamíferos (Benincá 2006; Arias et al. 2007; Ramsdorf
2007; Takeiri et al. 2013; Zhou et al. 2013), humanos (Tomanin et al. 1991; Anwar
et al. 1994; Severin 1995; Chang et al. 1996; Tates et al. 1996; Dertinger et al.
2003), plantas (Fernandes et al. 2002; Yi et al. 2007) e em crocodilos (Poletta et
al. 2009), para avaliar possíveis danos genotóxicos ocasionados por exposições a
poluentes ambientais como agrotóxicos, sendo considerado um bom bioindicador
de genotoxicidade (Al-Sabti e Metcalfe 1995; Al-Sabti 2000).
Figura 2 - Origem do micronúcleo durante a divisão celular (Fonte: Fenech et al. 1999)
Atualmente, vários estudos utilizam micronúcleo para medir lesões e
genotoxicidade no DNA, ocasionadas pela maioria dos compostos químicos e
radioativos (Lau et al. 2009; Watters et al. 2009; Cveticanin et al. 2010; Lal e
11
Ames 2011). Watters et al. (2009) observaram que a frequência de micronúcleos
mostra-se relacionada com quebras na dupla fita e em eventos de recombinação
do DNA. A formação dessas quebras na dupla fita é geralmente produto do reparo
por excisão de danos e de bases incorporadas erroneamente (Dianov et al. 1991).
O MN possui sequências teloméricas que podem ser reconhecidas por sondas
específicas (Boukamp et al. 2005), o teste de MN se torna um método importante
para observar a ação de agentes genotóxicos em diferentes organismos.
A formação de MN parece ser regulada por mecanismos epigenéticos
como: 1) metilação do DNA, 2) modificações nas histonas, 3) remodelação da
cromatina e 4) expressão de RNA não-codificante (Gibney e Nolan 2009; Bonasio
et al. 2010). Aypar et al. (2011) demonstraram que a exposição à radiação induziu
a formação de MN acompanhada de alteração na metilação do DNA e na
expressão do miRNA. Apesar do importante papel desempenhado pelas
mudanças epigenéticas no comportamento do centrômero, ainda não são bem
conhecidas quais delas estão associadas com a formação do micronúcleo
(Luzhna et al. 2013).
Complementarmente, o ensaio do cometa é um teste utilizado para
comparar danos ao DNA ocorridos durante a apoptose e que não são observados
por outros métodos (Huang et al. 2005). O ensaio consiste em uma técnica de
eletroforese em gel para analisar danos no DNA de cada célula, individualmente,
induzidos por agentes alquilantes, intercalantes e oxidantes (Singh et al. 1988;
Tice et al. 2000). As células são então incorporadas em géis de agarose e
submetidas a um campo elétrico, o que gera um padrão de distribuição que, após
a coloração com fluorocromo se assemelha a um cometa e a extensão da cauda
está diretamente relacionada com a gravidade dos danos no DNA (Ostling e
Johanson 1984).
O ensaio do cometa é amplamente utilizado na biomonitoração e na
detecção de agentes mutagênicos e genotóxicos em diferentes animais (Piperakis
et al. 2009; Poletta et al. 2009; Capriglione et al. 2011; Nan et al. 2013) por
apresentar: 1) grande sensibilidade na detecção de pequenos danos no DNA, 2)
simplicidade, 3) pelo baixo custo e 4) por produzir resultados rápidos nos estudos
de genotoxicidade. Assim, pode ser utilizado em qualquer organismo eucarioto,
independentemente se estão em estado proliferativo ou não e apresenta bons
12
resultados, mesmo com uma pequena quantidade de células (Singh et al. 1988;
Tice et al. 2000).
Sabe-se que os crocodilianos são muito sensíveis a pesticidas, pois estas
substâncias imitam a ação de esteroides sexuais, como o estrógeno, alterando a
síntese de hormônios e o metabolismo dos embriões, aumentando assim a
proporção de machos no ninho (Rueda-Almonacid et al. 2007).
Deste modo, a técnica do MN e o ensaio do cometa apresentam-se como
ferramentas robustas para testar possíveis alterações provocadas por substâncias
provenientes dos efluentes despejados no ecossistema aquático, que agem como
um provável agente genotóxico/citotóxico, devido a diferentes vantagens como
fácil detecção, rápida formação (Luzhna et al. 2013) e sensibilidade a pequenos
danos ao DNA (Tice et al. 2000).
Sabe-se que os organismos aquáticos respondem diretamente às
alterações físico-químicas do meio então, faz-se necessário verificar se estas
alterações se estendem a nível cromossômico e molecular e se pode estar
relacionado a estratégias adaptativas dos crocodilianos nestes ambientes, visto
sua maior plasticidade à matriz urbana, por ser generalista.
13
1.5 OBJETIVOS
1.5.1 Objetivo Geral
Avaliar o impacto da poluição doméstica sobre o genoma de jacaretinga
(Caiman crocodilus) e determinar a composição cromossômica de indivíduos da
espécie, que ocorrem em corpos hídricos antropizados e não antropizados,
utilizando marcadores cromossômicos clássicos e moleculares.
!
1.5.2 Objetivos Específicos
– Inferir o potencial genotóxico dos corpos hídricos impactados da cidade de
Manaus em Caiman crocodilus.
– Comparar o potencial genotóxico dos esgotamentos sanitários e de
ambientes não impactados em Caiman crocodilus.
– Comparar o cariótipo de indivíduos silvestres e urbanos, observando se
existem modificações referentes à poluição.
– Determinar a macroestrutura cariotípica de indivíduos da espécie C.
crocodilus que ocorrem na Amazônia.
– Estabelecer padrões cromossômicos estruturais para a espécie C.
crocodilus, pelo uso de bandamentos cromossômicos como identificação
da heterocromatina constitutiva e de regiões organizadoras de nucléolo.
– Mapear as sequências do gene ribossomal 18S, sequências teloméricas e
do retroelemento Rex1 nos espécimes coletados por meio de hibridação
fluorescente in situ (FISH).
14
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Captura dos Exemplares
Foram coletados 30 animais adultos, de ambos os sexos, em idade
reprodutiva, sendo: 15 de ambientes que recebem efluentes domésticos, zona
urbana de Manaus – AM (Tabela 1; Figura 3, 4, 5 e 6) e 15 espécimes de
ambiente não antropizado, Lago Catalão – AM (Tabela 2; Figura 7) com
autorização do ICMBio/SISBIO (Instituto Chico Mendes de
Biodiversidade/Sistema de Autorização e Informação de Biodioversidade: 5532-1).
Tabela 1 – Pontos de coletas de espécimes de Caiman crocodilus da zona urbana de Manaus.
Coordenadas geográficas N° de Espécimes
Sexo
3°07’22.5’’S/60°01’53.1’’W 1 ♂
3°07’23.5’’S/60°01’48.4’’W 3 ♀
3°07’23.0’’S/60°01’48.2’’W 1 ♀
3°06’52.0’’S/60°01’58.0’’W 2 ♂
3°07’20.9’’S/60°01’53.8’’W 1 ♂
3°07’25.3’’S/60°01’50.6’’W 2 ♀
3°06’02.0”S/59°58’54.7”W 1 ♂
3°04’53.8”S/59°57’38.5”W
2 ♂
3°05’50.8”S/59°59’03.3”W
1
♀
3°05’50.8”S/59°59’03.3”W
1
♂
15
Tabela 2 – Pontos de coletas de espécimes de C. crocodilus do Lago Catalão, Manaus.
Coordenadas geográficas N° de
Espécimes
Sexo
03°10.428’S/059°54.411’W 3 ♂
03°09.730’S/059°55.406’W 2 ♂
03°09.941’S/059°55.406’W 3 ♀
03°09.673’S/059°55.213’W 3 ♀
03°10.197’S/059°54.217’W 3 ♂
03°10.213’S/059°54.936’W 1 ♀ ! ! !
Figura 3 - Mapa dos pontos de coletas de C. crocodilus na cidade de Manaus:
Mindu (1); UFAM (2); Acariquara (3); Catalão (4) (Fonte: Google Earth, com modificações)
16
Figura 4 – Mapa dos pontos de coletas de C. crocodilus no Igarapé do Mindu
(Fonte: Google Maps)
Figura 5 – Mapa dos pontos de coletas de C. crocodilus no campus da
Universidade Federal do Amazonas (Fonte: Google Maps).
17
Figura 6 - Mapa dos pontos de coletas no Lago Ouro Verde, Manaus (Fonte: Google Maps).
18
Figura 7 - Mapa dos pontos de coletas no Lago Catalão (Fonte: Google Maps).
Indivíduos de C. crocodilus foram capturados em levantamentos noturnos,
nos períodos de cheia do rio utilizando uma canoa de alumínio, equipada com
motor de popa, movendo-se ao longo das margens dos corpos hídricos.
A captura dos espécimes foi manual, com auxílio de pegador-de-pinça
(Reptile Snare), cambão (Ketch-All Animal Restraining Pole) e/ou laço especial de
cabo de aço (Locking Cable Snares) (Da Silveira et al. 1997), imobilizado-os com
cordas e fita gomada. Estes foram acondicionados em saco de pano umedecido e
transportados à base de apoio onde foram marcados com Markal Paintstik “3”
Orange (Figura 8).
Amostras de sangue obtidas dos indivíduos foram obtidas segundo Tourn
et al. (1993), transferidas para Vacutainers e mantidas em refrigerador a 10° C,
visando a realização do Teste de Micronúcleo, Ensaio do Cometa e obtenção de
preparações cromossômicas.
19
!Figura 8 - Marcação provisória com cera. (Fonte: Instituto Mamirauá)
2.2 Teste do Micronúcleo
No Teste de Micronúcleo (MN), 10 µl do sangue total foram obtidos de cada
indivíduo para ser utilizado até 24 horas a partir da perfuração do bulbo arterioso.
Uma gota foi colocada sobre uma lâmina limpa e espalhada por meio do método
de distendido sanguíneo. Os distendidos sanguíneos foram corados com solução
de Giemsa e tampão fosfato pH 6,8. A análise microscópica das lâminas foi feita
sob aumento de 100x. Três lâminas de cada indivíduo foram identificadas por
códigos e analisadas de forma cega, sem identificação, por um único observador.
A determinação da frequência de micronúcleos (MN) foi realizada a partir da
observação de 2000 eritrócitos periféricos por animal e definidos de acordo com
Heddle (1973), Schmid (1975) e Fenech (2000). Imagens dos micronúcleos foram
capturadas, utilizando objetiva de imersão em microscópio Zeiss Axio CAM ERC
5S e câmera digital Canon Power Shot A650 IS.
2.3 Ensaio do Cometa
O ensaio do cometa foi utilizada a técnica alcalina descrita por Singh et al.
(1988) com modificações (Hartmann et al. 1995; Nadin et al. 2001; Fukumasu et
al. 2006; Brianezi et al. 2009) onde: lâminas histológicas foram mergulhadas em
gel de agarose (1,5%), mantido em banho-maria a 85 °C. Após a remoção do
excesso com papel absorvente, as lâminas foram secas em temperatura
ambiente. O sangue coletado (10 µl) foi previamente misturado com heparina e
diluído em 600 µl de meio de cultura RPMI 1640 (composto de sais inorgânicos,
20
aminoácidos, vitaminas, glicose, glutatione e vermelho de fenol). Posteriormente,
10 µl do sangue diluído foi misturado com 95 µl de agarose 1,5% low melting, e
esta solução aplicada por toda a lâmina previamente revestida com o gel de
agarose, coberta com lamínula até sua solidificação. Após a solidificação e
adesão das células à agarose, a lamínula foi então removida e as lâminas
dispostas em cubeta vertical com solução de lise gelada e protegida da luz por 24
horas. Posteriormente, elas foram incubadas por 20 minutos em solução de EDTA
(1mM) e NaOH (300 mM) com pH >13 na cuba de eletroforese de um lado a outro
e submetidas à uma corrente de 25 V e 300 mA por 20 minutos. As lâminas foram
então retiradas do tampão de eletroforese, colocadas em uma solução tampão
neutralizadora de Tris (Invitrogen), por 5 minutos e logo em seguida, as lâminas
foram lavadas com água destilada duas vezes. Após a lavagem, as lâminas foram
secas em temperatura ambiente e imersas em uma cubeta com solução fixadora
por 10 minutos; em seguida foram novamente lavadas com água destilada por
três vezes, secas em temperatura ambiente e hidratadas por 5 minutos com água
destilada. A coloração foi realizada com prata pelo método descrito por Nadin et
al. (2001) e Fukumasu et al. (2006). Para isto, foram misturadas em uma cubeta
32 mL de solução A (50 g Na2CO3 [q.s.p.] 1000 mL de água bidestilada) e 68 mL
de solução B (0,2 g de NH2NO3, 0,2 g de AgNO3, 1 g de ácido silicotungstênico,
500 µl de formaldeído, q.s.p. 1000 mL de água bidestilada) por um minuto. Em
seguida, as lâminas foram lavadas por 5 minutos em solução de parada (1mL de
ácido acético q.s.p. 1000 mL de água bidestilada) e depois em água bidestilada
por um minuto, secas e observadas ao microscópio óptico. Como recomendado
na literatura, foram analisados 50 cometas (Wiklund et al. 2003; Ribeiro et al.
2004) com rastreamento contínuo de toda a lâmina. Estes foram classificados
conforme o tamanho da cauda em seis classes: 0, 1, 2, 3, 4 e 5 correspondentes
à gravidade dos danos ao DNA (Ribeiro et al. 2004) (Figura 7).
21
Figura 9 – Classificação de Cometas de acordo com o tamanho da cauda segundo Ribeiro et al. (2004).
2.4 Análises Citogenéticas Clássicas
Na obtenção das preparações cromossômicas mitóticas foi utilizada a
técnica de cultura de linfócitos descrita por Moorhead et al. (1960) com algumas
modificações, que consistiram em coletar 4 mL de sangue via punção do bulbo
arterioso com seringas descartáveis heparinizadas. Em seguida a amostra, até 1
mL, foi transferida para o meio de cultura completo para cariótipo e levada para
estufa a 29 ºC por 96 horas. Uma hora antes do término deste período
acrescentou-se 0,1 mL de colchicina a 0,025% ao meio de cultura. Após este
tempo, a cultura foi transferida para um tubo de centrífuga e centrifugada por 10
minutos, a 800 rpm. O sobrenadante foi então desprezado e acrescentou-se 8 mL
de solução hipotônica de cloreto de potássio (KCl 0,075M) previamente aquecida
a 37 ºC, o material foi homogeneizado com uma pipeta Pasteur e colocado em
estufa a 37 ºC por 1 hora.
Transcorrido o tempo total de hipotonização, o processo foi interrompido
acrescentando-se 0,3 mL de fixador Carnoy I (Metanol 3:1 Ácido Acético), recém-
22
preparado. O material foi centrifugado por 10 minutos a 800 rpm. O sobrenadante
foi descartado e acrescentou-se 10mL de fixador Carnoy I. Novamente o material
foi ressuspendido com o auxílio de uma pipeta Pasteur, 10 mL de fixador Carnoy I
foram adicionados e a suspensão foi novamente centrifugada durante 10 minutos
a 800 rpm, sendo desprezado o sobrenadante. Este procedimento foi repetido por
mais uma vez. Após esta fase, adicionou-se 1,5 mL de fixador seguido de
ressuspensão cuidadosa do material. Essa suspensão celular foi então estocada
em tubo “eppendorf” e mantida em freezer (-4° C).
Na caracterização da heterocromatina constitutiva utilizou-se a técnica de
banda C descrita por Sumner (1972), com modificações. As lâminas contendo as
preparações cromossômicas foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2 N a
42 ºC, lavadas em água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Em
seguida foram incubadas a 45 ºC, em solução de hidróxido de bário a 5%, filtrada
e recém-preparada, por 32 segundos. A ação do hidróxido de bário foi
interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (37 ºC),
sendo posteriormente lavada em água destilada. Após secas, as lâminas foram
incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3 M e citrato trisódico 0,03 M,
pH 6,8), em banho-maria a 60 ºC, por um período de 15 minutos, sendo
posteriormente secas ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e
pH 6,8 por 10 minutos, lavadas em água de torneira e secas novamente ao ar.
Após secagem, foi possível visualizar com microscópio óptico a heterocromatina
constitutiva dos cromossomos.
Para a caracterização das regiões organizadoras de nucléolos (RON) foi
utilizada a técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações.
As lâminas contendo as preparações cromossômicas são tratadas com HCl
0,2N a 37° C por 10 minutos, lavadas com água destilada à temperatura ambiente
e secas ao ar. Em seguida colocou-se 2 gotas de uma solução coloidal preparada
com gelatina e sobre cada gota de gelatina, 2 gotas de solução aquosa de AgNO3
(nitrato de prata) a 50%, agitando levemente para que ocorra a homogeneização.
Cobre-se então com lamínula, a lâmina é incubada em câmara úmida a 60° C, por
um período de 4 minutos, após a lâmina atingir coloração marrom dourada, a
mesma é lavada com água destilada, permitindo a remoção da lamínula e seca ao
ar para posterior análise.
23
2.5 Citogenética Molecular
A extração de DNA foi realizada a partir de tecido muscular, utilizando o
protocolo básico de Sambrook e Russel (2001) com algumas modificações.
Foram macerados aproximadamente 20 mg de tecido muscular e transferidos
para um tubo de volume de 1,5 mL. Adicionou-se 500 µL de tampão de lise (Tris-
HCl 10 mM em pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS 1%) de Estoup
et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente acrescentou-se: 15 µL de
proteinase K (10 mg/mL) e 6 µL de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram
incubadas a 60 ºC por aproximadamente 2 horas para que o tecido estivesse
totalmente digerido. Adicionou-se 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume
(600 µL) de fenol-clorofórmio (1:1) e agitou-se por inversão, por alguns minutos.
Centrifugou-se por 30 minutos a 14.000 rpm em temperatura ambiente. A fase
superior foi transferida para um novo tubo, adicionando-se 600 µL de clorofórmio
e misturando, gentilmente, por alguns minutos, por inversão. Em seguida, a
mistura foi centrifugada por 20 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante transferido
para um novo tubo e acrescentou-se 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume
(600 µL) de isopropanol gelado e misturado gentilmente por inversão. Deixou-se
precipitar a -20 °C por cerca de 14 horas ou a -80 °C por 1 hora. O material foi
retirado do freezer e centrifugado por 30 minutos a 14.000 rpm, descartando o
sobrenadante. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol 70% e centrifugado por 20
minutos a 14.000 rpm. Novamente, o sobrenadante foi descartado, e o pellet seco
em estufa a 55 °C, ressuspendido em 100 µL de TE 0,2X ou água milli-Q e
deixou-se eluir por 14 horas. Para possibilitar a análise da quantidade e
integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com
marcador de concentração conhecida, em eletroforese padrão (com tampão Tris-
Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e
corado com GelRed (Biotium). A visualização e análise do DNA no gel foram
feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado
um transluminador de luz ultravioleta (260 nm).
As sondas de sequências repetitivas foram obtidas por amplificação por
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - Saiki et al. 1988), utilizando o DNA
genômico extraído do tecido muscular e o primer: - DNAr 18S (IpF
5’CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e IpR 5’CCGAGGACCTCACTAAACCA) (Gross
24
et al. 2010), Rex1 (RTX1-F1 5’TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC e RTX1-R3
5’TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CTC) (Volff et al. 1999; 2000; 2001a).
Nas sequências teloméricas as amplificações foram feitas sem DNA com
os seguintes primers: (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1992). Os ciclos de
amplificação seguiram as seguintes etapas:
a) DNAr 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação inicial); 35 ciclos de 1 minuto a 95
ºC (desnaturação), 1 minuto a 55 ºC (ligação dos primers), 1 minuto e 40
segundos a 72 ºC (extensão); 7 minutos a 72 ºC (extensão final).
b) Rex1: 5 minutos a 95 °C (desnaturação inicial); 35 ciclos de 1 minuto a 95 °C
(desnaturação), 40 segundos a 55 °C (ligação dos primers), 2 minutos a 72 °C
(extensão); 5 minutos a 72 °C (extensão final).
c) Telomérica: a primeira parte da amplificação foi feita em baixa extringência: 4
minutos a 94 °C (desnaturação inicial), 12 ciclos de 1 min a 94 °C (desnaturação),
45 segundos a 52 °C (ligação dos primers) e 1 minuto e 30 segundos a 72 °C
(extensão); seguida por 35 ciclos de alta extringência: 1 minuto a 94 °C
(desnaturação), 1 minuto e 30 segundos a 60 °C (ligação dos primers) e 1 minuto
e 30 segundos a 72 °C(extensão); 7 minutos a 72 ºC (extensão final).
As reações de PCR foram feitas em um termociclador BioRad, para volume
final de 15 µL (1 µL de DNA genômico (100 ng); 1,5 µL de Tampão 10X com
cloreto de magnésio (1,5 mM); 0,15 µL de Taq DNA polimerase (5U/µL); 3,0 µL de
dNTP (1 mM); 0,6 µL de cada primer (5 mM); água milli-Q para completar o
volume. Os produtos de PCR foram utilizados como sondas que são marcadas
pelo método de nick translation, utilizando biotina 14-dATP (Bionick labeling
system-Invitrogen) e/ou digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix Roche).
Para tanto, em um tubo eppendorf de 1,5 mL, foi preparada uma solução
contendo 1 µL de Mix dNTP 10x; 1 µL do produto do PCR (200 ng/ µL); 1 µL de
Mix de enzima 10x; 6 µL de água milli-Q, totalizando 9 µL para cada lâmina
hibridizada. Esta solução foi homogeneizada, centrifugada brevemente e
incubada a 16 ºC por 90 minutos no termociclador. Em seguida, para interromper
a reação adicionou-se 1 µL de stop buffer, contendo 1 µL de acetato de sódio 3M
e, posteriormente, foi mantida em freezer para posterior utilização.
25
Utilizou-se a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) descrita por
Pinkel et al. (1986) com algumas modificações no produto da PCR, sendo estes
então utilizados como sondas.
As lâminas, contendo preparações cromossômicas ou esfregaços
sanguíneos, foram lavadas em tampão PBS 1x por 5 minutos em temperatura
ambiente. As lâminas foram desidratadas em uma série alcoólica gelada (70%,
85% e 100%) durante 5 minutos cada. Em seguida foram tratadas com 90 µL de
RNase 10 µg/mL por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. As lâminas foram lavadas
três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada. Após isso, as lâminas foram
lavadas em PBS 1x durante 5 minutos.
As lâminas frescas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X durante 10
minutos à temperatura ambiente. Posteriormente lavadas em PBS 1x por 5
minutos. Após, as lâminas foram desidratadas em uma série alcoólica gelada
(70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada.
As lâminas foram desnaturadas em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5
minutos e novamente desidratadas em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5
minutos cada.
Em um tubo eppendorf foram adicionados 4 µL de sonda 1, 4 µL de sonda 2,
20 µL de formamida, 8 µL de sulfato de dextrano 50% e 4 µL de 20xSSC. A sonda
foi desnaturada a 99 °C por 10 minutos e transferida imediatamente ao gelo.
Colocou-se 40 µL de solução de hibridização sobre uma lamínula e a lâmina
foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material voltado
para baixo em câmara úmida a 37 °C por cerca de 14 horas.
As lamínulas foram removidas das lâminas. Em seguida as lâminas foram
lavadas duas vezes em formamida 15% a 42°C durante 10 minutos cada. Em
seguida, foram lavadas novamente em solução Tween 0,5% durante 5 minutos à
temperatura ambiente.
As lâminas foram incubadas em tampão NFDM (Non Fat Dry Milk) por 15
minutos. Em seguida lavadas duas vezes com solução Tween 5% por 5 minutos à
temperatura ambiente. Então, foram colocadas sobre cada lâmina 20 µL de anti
digoxigenina-rodamina e 100 µL de solução contendo tampão NFDM e
estreptavidina/Alexa Fluor 488. Em seguida foram cobertas com lamínula e
deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Posteriormente,
as lamínulas foram removidas e as lâminas foram lavadas três vezes em solução
26
Tween 5% por 2 minutos a temperatura ambiente cada. As lâminas foram
desidratadas em uma série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada. Deixou-
se secar, foi adicionado a cada lâmina solução de DAPI diluído em antifade
VectaShield Vector (20 µL de antifade e 1 µL de DAPI).
As metáfases completas e mais nítidas obtidas foram fotografadas e os
cromossomos foram classificados morfologicamente de acordo com Levan et al.
(1964) em metacêntricos (M), submetacêntricos (SM) e telocêntricos (T), o
número fundamental (NF) foi determinado de acordo com a contagem dos braços
de cada cromossomo, onde os cromossomos metacêntricos e submetacêntricos
foram considerados como portadores de dois braços e os telocêntricos foram
considerados como tendo um braço cromossômico.
Para análise das amostras independentes, de sangue em cada ambiente,
foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney (U), implementado no
programa Statistica (Statsoft), utilizando o valor de significância p=0,05.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
CAPÍTULO 1
27
Oliveira, V. C. S.; Viana, P. F.; Gross, M. C.; Feldberg, E.; Da Silveira, R.; Schneider, C. H. 2015. Análise genotóxica comparativa associada com sequências repetitivas em Caiman crocodilus (LINNAEUS, 1758) dos arredores de Manaus. Manuscrito em preparação
__________________________________________________________________________
28
Análise genotóxica comparativa associada com sequências repetitivas em
Caiman crocodilus (LINNAEUS, 1758) dos arredores de Manaus.
Vanessa Cristina Sales Oliveiraa*, Patrik Ferreira Vianab, Maria Claudia Grossa,
Eliana Feldbergb, Ronis Da Silveirac, Carlos Henrique Schneidera
Laboratório de Citogenômica Animal, Departamento de Genética, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazila
Laboratório de Genética Animal, Coordenação de Biodiversidade, Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia, Manaus, Amazonas, Brazilb
Laboratório de Zoologia Aplicada à Conservação, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazilc
RESUMO
Os ecossistemas aquáticos amazônicos vêm sofrendo com efeitos do
aumento populacional desordenado, que tem alterado os corpos hídricos e
prejudicado a biota aquática. Caiman crocodilus é um táxon complexo que possui
ampla distribuição e uma ótima adaptabilidade a diversos ambientes, mesmo os
impactados. O presente estudo objetivou caracterizar citogeneticamente a
espécie C. crocodilus oriunda de igarapés urbanos de Manaus, Amazonas e
demonstrar os efeitos da poluição ambiental no genoma destes animais,
utilizando técnicas de citogenética clássica e molecular, Teste do Micronúcleo e o
Ensaio do Cometa. Foi utilizado um total de 30 indivíduos adultos, 15 de ambiente
antropizado e 15 de ambiente não antropizado. Nas análises cromossômicas por
coloração convencional C. crocodilus apresentou 42 cromossomos (24t+18m/sm;
NF=60). As regiões ricas em heterocromatina foram evidenciadas nas regiões
centroméricas, porém mais acentuada no par 21. A região organizadora de
nucléolo (Ag-RON) foi coincidente com a região heterocromática do par 13, e com
a localização de sítios de DNAr 18S. Estes sítios de hibridação evidenciaram uma
duplicação em um dos homólogos do par 13 em C. crocodilus. Já, a análise
genotóxica comparativa dos dois ambientes demonstraram um valor de p= 0,007
e p=0,010, para os níveis 3 e 5, respectivamente, no Ensaio do Cometa, enquanto
para o Teste do Micronúcleo o valor de p= 0,04, independente do ambiente. Os
resultados aqui encontrados descrevem um novo citótipo, divergente do padrão
29
cariotípico da população de Nova Iorque e Flórida (2n= 42; 22t+20m/sm; NF= 62),
descrito anteriormente. Esta condição sugere uma variação, diferenciada através
de fissões cromossômicas, rearranjo comum a outras espécies do gênero ou um
caso a ser esclarecido de nova subespécie. Os dados obtidos para os dois
biomarcadores evidenciam a necessidade de tomar medidas de preservação mais
eficazes.
*Correspondência para: Vanessa Cristina Sales Oliveira, Laboratório de Citogenômica Animal, Departamento
de Genética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Av. Gen. Rodrigo Otávio
3000, CEP 69077000, Manaus, Amazonas, Brazil
Email: [email protected]
INTRODUÇÃO
Caiman crocodilus é amplamente distribuída no continente americano,
sendo a espécie com maior distribuição entre os jacarés, habitando do sul do
México ao norte da Argentina (King e Burke 1989; Ross 1998; Rodriguez 2000;
Oliveira 2010) e foi introduzido nos Estados Unidos em Cuba e Porto Rico (Farias
et al. 2013).
Caiman crocodilus é um táxon complexo, que atualmente inclui cinco
subespécies morfológicas. Dentre as quais, no Brasil ocorre apenas a subespécie
C. crocodilus (Rueda-Almonacid et al. 2007; Oliveira 2010; Farias et al. 2013) que
está listada como “Pouco Preocupante” na União Internacional para a
Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (International Union for
Conservation of Nature – IUCN), possivelmente pela quantidade de espécimes
existentes, pela ampla distribuição (CSG 1996 apud IUCN 2013) e pela
adaptabilidade a diversos ambientes, como lagos, córregos, pântanos, rios e
zonas estuárias (Steel 1989).
Nos últimos anos, os ecossistemas aquáticos da Amazônia Central vêm
sofrendo com efeitos da antropização, onde muitos deles tiveram um aumento na
quantidade de material particulado em 300 vezes, quando comparado aos trechos
naturais (Cleto Filho e Walker 2001). Esta contaminação deve-se principalmente
ao fato destes corpos hídricos tornarem-se o destino final de vários tipos de
efluentes industriais e domésticos (Förstner e Wittmann 1983; Al-Sabti e Metcalfe
1995). Em Manaus, uma das maiores capitais do norte do Brasil, o aumento
30
populacional e a implementação do Complexo Industrial têm contribuído para a
antropização dos ambientes aquáticos urbanos e prejudicando a biota (Fonseca
et al. 1982; Silva 1995; Cleto Filho 1998; Nava 1999).
A contaminação química dos corpos hídricos pode motivar uma redução no
tamanho da população natural, por mutações deletérias em células somáticas
e/ou células germinativas ou ainda por perda da diversidade genética (Bickham et
al. 2000). Entretanto, algumas espécies suportam viver nestes ambientes
poluídos e entre elas destacam-se os jacarés. Neste caso, a avaliação de danos
genotóxicos ocasionados por exposições a poluentes ambientais são
interessantes para verificar a integridade do material genético dos indivíduos que
habitam este meio, seja pela realização do teste de micronúcleo (MN), pelo
ensaio cometa ou até mesmo pela organização cromossômica diferencial do
genoma.
Dados citogenéticos disponíveis para crocodilianos demonstram um
número diploide (2n) que variando entre 30 e 42 cromossomos e número
fundamental (NF) entre 56 e 62 (King et al. 1986; Amavet et al. 2003; Kawagoshi
et al. 2008; Olmo e Signorino 2014), apresentando ausência de
microcromossomos (Kawagoshi et al. 2008). Das 23 espécies estudadas
citogeneticamente, nenhuma apresenta cromossomos sexuais diferenciados, o
que é justificado pela dependência da temperatura para determinação do sexo
(Amavet et al. 2003; Valenzuela e Lance 2004; Kawai et al. 2007). Entretanto,
dados de mapeamento físico cromossômico são incipientes para crocodilianos, e
a integração de mapeamento com ensaios genotóxicos realizada neste trabalho
evidenciou o efeito da poluição sobre o genoma de animais provenientes de
ambientes aquáticos antropizados.
Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar o impacto da poluição
doméstica sobre o genoma de Caiman crocodilus e determinar a composição
cromossômica de indivíduos da espécie, que ocorrem em ambientes impactados
e não impactados.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisados 30 animais adultos, de ambos os sexos, de Caiman
crocodilus, sendo 15 (7 fêmeas e 8 machos) da zona urbana de Manaus – AM,
31
ambientes que recebem efluentes domésticos (Cleto Filho e Walker 2001; Melo et
al 2005; Pinto 2009) (Tabela 3) e 15 espécimes (8 fêmeas e 7 machos) do Lago
Catalão – AM, ambiente não antropizado (Brito et al 2014) (Tabela 4). As coletas
foram realizadas de Maio a Agosto de 2014, com autorização do ICMBio/SISBIO
(Instituto Chico Mendes de Biodiversidade/Sistema de Autorização e Informação
de Biodiversidade: 5532-1) e do Comitê de Ética de Utilização Animal (CEUA) do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).
Após a caracterização morfológica do animal (Comprimento total, peso total
e sexo) e coleta do sangue, todos os indivíduos foram soltos no ponto exato de
captura.
Tabela 3 – Espécimes de Caiman crocodilus capturados na zona urbana de Manaus, Amazonas.
Ponto de Coleta N° de Espécimes
Sexo
3°07’22.5’’S/60°01’53.1’’W 1 ♂
3°07’23.5’’S/60°01’48.4’’W 3 ♀
3°07’23.0’’S/60°01’48.2’’W 1 ♀
3°06’52.0’’S/60°01’58.0’’W 2 ♂
3°07’20.9’’S/60°01’53.8’’W 1 ♂
3°07’25.3’’S/60°01’50.6’’W 2 ♀
3°06’02.0”S/59°58’54.7”W 1 ♂
3°04’53.8”S/59°57’38.5”W
2 ♂
3°05’50.8”S/59°59’03.3”W
1
♀
3°05’50.8”S/59°59’03.3”W
1
♂
Tabela 4 - Espécimes de C. crocodilus capturados no Lago Catalão, Manaus.
Ponto de Coleta N° de Espécimes Sexo
03°10.428’S/059°54.411’W 3 ♂
32
03°09.730’S/059°55.406’W 2 ♂
03°09.941’S/059°55.406’W 3 ♀
03°09.673’S/059°55.213’W 3 ♀
03°10.197’S/059°54.217’W 3 ♂
03°10.213’S/059°54.936’W 1 ♀
Análise do Potencial Genotóxico
As amostras de sangue foram obtidas por punção do bulbo arterioso,
seguindo o método de Tourn et al. (1993) e mantidas sobe refrigeração em
temperatura baixa (10° C).
Para o Teste de Micronúcleo (MN) foram obtidas lâminas em triplicata para
cada indivíduo e cada lâmina de distendido sanguíneo foi preparada segundo
Ribeiro et al. (2004). As lâminas foram coradas com Giemsa e sua frequência
determinada de acordo com Heddle (1973), Schmid (1975) e Fenech (2000) após
contabilizar 2000 células por indivíduo. Foram analisadas 30 amostras,
totalizando 90 lâminas.
No ensaio do cometa, a técnica utilizada foi a alcalina, descrita por Singh et
al. (1988) com modificações e as lâminas foram obtidas em duplicatas (Hartmann
et al. 1995; Nadin et al. 2001; Fukumasu et al. 2006; Brianezi et al. 2009). As
lâminas foram coradas com prata pelo método descrito por Nadin et al. (2001) e
Fukumasu et al. (2006). Foram analisadas 50 células por indivíduo, que foram
classificadas conforme o tamanho da cauda em seis classes: 0, 1, 2, 3, 4 e 5
correspondentes à gravidade dos danos ao DNA (Ribeiro et al. 2004) a partir de
15 amostras, sendo 8 (4 fêmeas e 4 machos) de ambiente limpo e 7 (2 fêmeas, 1
macho e 4 indeterminados) de ambiente poluído.
As imagens dos micronúcleos e dos cometas foram capturadas, utilizando
objetiva de imersão em microscópio Zeiss Axio CAM ERC 5S e câmera digital
Canon Power Shot A650 IS.
Na análise das amostras independentes foi utilizado o teste não-
paramétrico de Mann-Whitney (U), implementado no programa Statistica
33
(Statsoft), com o valor de significância p=0,05 para comparar as variáveis:
ambiente não antropizado frente ambiente antropizado e verificar se havia
influência entre os sexo dos indivíduos.
Obtenção de Cromossomos Mitóticos
Os cromossômicos mitóticos foram obtidos pela técnica de cultura de linfócitos
descrita por Moorhead et al. (1960) com algumas modificações.
As suspensões celulares foram submetidas à coloração convencional com
Giemsa para determinação do número diploide e fundamental. A heterocromatina
constitutiva foi determinada, utilizando a técnica de banda C descrita por Sumner
(1972) e as regiões organizadoras de nucléolos (RON) pela impregnação por
nitrato de prata (Howell e Black 1980). Sequências teloméricas (Ijdo et al. 1991),
Rex1 (Volff et al. 1999; 2000; 2001a) e DNA ribossomal 18S (Gross et al. 2010)
foram amplificadas por PCR (Saiki et al. 1988) e utilizadas como sondas no
mapeamento físico cromossômico, por hibridização fluorescente in situ (FISH)
descrita por Pinkel et al. (1986).
As metáfases completas e mais nítidas obtidas foram fotografadas e os
cromossomos foram classificados morfologicamente de acordo com Levan et al.
(1964) em metacêntricos (M), submetacêntricos (SM) e telocêntricos (T), o
número fundamental (NF) foi determinado de acordo com a contagem dos braços
de cada cromossomo, onde os cromossomos metacêntricos e submetacêntricos
foram considerados como portadores de dois braços e os telocêntricos foram
considerados como tendo um braço cromossômico.
RESULTADOS
Citogenética Clássica
A análise cariotípica de Caiman crocodilus revelou um número diploide
igual a 42 cromossomos (24t+18m/sm e NF=60) com ausência de
microcromossomos, polimorfismo intraespecífico, cromossomos sexuais
diferenciados e supranumerários (Figura 1a). A heterocromatina constitutiva foi
34
observada no centrômero de todos os cromossomos em blocos conspícuos,
englobando praticamente todo o cromossomo no caso do par 21 (Figura 1b). A
Região Organizadora Nucleolar apresentou marcação na região centromérica de
apenas um par cromossômico (par 13), coincidindo com a região heterocromática
nesse mesmo par (Figura 1c).
Figura 1 - Cariótipo de Caiman crocodilus em coloração convencional com Giemsa (a); Distribuição de heterocromatina constitutiva (b); Localização da região organizadora de nucléolo (c).
35
Citogenética Molecular
Os resultados das hibridizações fluorescentes in situ (FISH) utilizando a
sonda de DNAr 18S foram coincidentes com as regiões organizadoras de
nucléolo (RON) detectadas pela prata, entretanto em um dos homólogos ocorreu
uma duplicação deste sitio (Figura 2b).
A sonda telomérica detectou sítios nas regiões terminais de todos os
cromossomos do complemento. Adicionalmente, nos pares 14, 15 e 16 foram
verificados sítios teloméricos intersticiais (ITS) em todas as metáfases analisadas.
(Figura 2b).
O retroelemento Rex1 foi detectado de forma dispersa ao longo de todos
os cromossomos em indivíduos de ambientes antropizados e não antropizados,
em ambos os sexos. Ainda, é possível visualizar uma compartimentalização
desse retroelemento em alguns pares de cromossomos. Em fêmeas de ambiente
não antropizado, os sinais foram detectados nas regiões teloméricas dos pares
cromossômicos 7, 12, 13, 15 e 17 (Figura 3a). Em machos, detectou-se
marcações nas regiões teloméricas dos pares 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 17
e 19 (Figura 3b).
Nos espécimes de ambiente antropizado além dos sinais dispersos, foram
detectados elementos compartimentalizados em ambos os sexos. Nas fêmeas
uma maior quantidade de pares cromossômicos apresentou marcações
conspícuas, tais como na região terminal dos pares 1, 3, 4, 5, 6, 11, 13, 15 e
sinais intersticiais no par cromossômico 14 (Figura 4a). Entretanto, nos machos a
localização do retroelemento Rex1 apresentou-se distribuída de forma
compartimentalizada em um menor número de pares cromossômicos, quando
comparados aos do ambiente não antropizado, como mostram as regiões
terminais dos pares 1, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 18 (Figura 4b).
36
Figura 2 - Cariótipo de Caiman crocodilus com hibridização de sonda telomérica em vermelho (a); localização do DNAr 18S (b). Os cromossomos foram contra corados com DAPI (azul).
37
Figura 3 - Cariótipos de Caiman crocodilus com hibridização do retroelemento Rex1 (vermelho) de ambiente não antropizado em fêmeas (a) e machos (b).
38
Figura 4 - Cariótipos de Caiman crocodilus com hibridização do retroelemento Rex1 (vermelho) de ambiente antropizado em fêmeas (a) e machos (b).
39
Ensaio do Cometa
Para indivíduos do ambiente não poluído, das 400 células analisadas,
69,5% apresentaram danos, sendo 14,75% em nível 1; 11,5% em nível 2; 10,75%
em nível 3; 21,75% em nível 4 e 10,75% em nível 5 (apoptose) (Figura 5a). Já,
para indivíduos do ambiente antropizado das 350 células analisadas, 86,57%
apresentaram danos sendo 9,71% em nível 1; 14% em nível 2; 26,6% em nível 3;
34,28% em nível 4 e 1,98% em apoptose (Figura 5b). Não observamos diferenças
na quantidade de células em cada nível em razão do sexo dos espécimes.
Diferenças significativas foram observadas entre o ambiente antropizado e não
antropizado para o nível 3 (p =0,007) e nível 5 (p =0,010).
40
Figura 5 – Células submetidas ao ensaio do cometa impregnadas com nitrato de prata: núcleos sem danos (0), caudas de cometas indicando os danos progressivos ao DNA (1 a 4) e apoptose (5) em indivíduos de ambiente não antropizado (a) e antropizado (b).
41
Teste do Micronúcleo (MN)
Um total de 59.071 eritrócitos foi analisado e destes, 401 apresentaram
micronúcleo (Figura 6). Em média foram encontrados 159 (~5,26%) micronúcleos
em ambiente não antropizado e 242 micronúcleos (~8,38%) em ambiente
antropizado. Ainda, a quantidade de micronúcleos diferiu significativamente entre
os ambientes analisados, p=0,046.
Figura 6 – Micronúcleo em Caiman crocodilus em coloração convencional com Giemsa (seta). Barra: 10µm.
DISCUSSÃO
A macroestrutura cromossômica da Ordem Crocodylia
A ordem Crocodylia apresenta uma macroestrutura cariotípica variável,
onde Crocodylus cataphractus, C. palustris, C. siamensis e C. rhombifer possuem
o menor número diploide com 30 cromossomos e Caiman latirostris, C. yacare, C.
crocodilus, M. niger, P. trigonatus e P. palpebrosus possuem o maior número
diploide com 42 cromossomos dos tipos telocêntrico, meta e submetacêntricos e o
número fundamental (NF) variando entre 56 e 62 (King et al. 1986; Amavet et al.
2003; Kawagoshi et al. 2008; Olmo e Signorino 2014), acreditam-se que o
cariótipo basal para a ordem é semelhante ao descrito para o gênero
42
Paleosuchus, onde os cariótipos atuais derivaram do cariótipo ancestral, a partir
de inversões pericêntricas e rearranjos robertsonianos do tipo fusão.
Para o gênero Caiman, o cariótipo de C. latirostris é análogo ao que teria
dado origem ao cariótipo de C. crocodilus e C. yacare por meio de duas inversões
(Cohen e Gans 1970).
Amavet et al. (2003) ao compararem os cariótipos de C. latirostris e C.
yacare, espécies que ocorrem na Argentina, por meio de marcações
convencionais (Giemsa, Banda C e RON) notaram que os cariótipos de ambas as
espécies são similares, ou seja, o mesmo número diploide (2n=42), mesma
fórmula cariotípica (24t+14m/sm+4mi) e número fundamental (NF=58). Marcações
teloméricas observadas aqui se mostraram bastante conservadas, com
marcações terminais em todos os cromossomos, mas marcações intersticiais
(ITS) foram evidentes nos pares metacêntricos 14, 15 e 16, sugeridas como
resultados de fusões ou inversões da sequência (TTAGG)n (Meyne et al 1990;
Wiley et al 1992), corroborando em parte a teoria de Cohen em Gans (1970),
entretanto os nossos resultados sugerem que teriam ocorrido três inversões e não
duas como previsto pelos autores.
No presente trabalho, o número diploide se mantém (2n=42), mas a
fórmula cariotípica (24t+18m/sm e NF=60) difere da descrita por Cohen e Gans
(1970) (22t+20m/sm e NF=62) e por King et al. (1986) (24t+18m e NF=60). Ainda,
segundo King et al. (1986) o padrão da heterocromatina constitutiva revela uma
marcação predominantemente centromérica e pericentromérica com marcação
heteromórfica coincidente à constrição secundária no par 16. Nesta pesquisa,
detectamos heterocromatina apenas em regiões centroméricas e presença de
blocos heterocromáticos na região centromérica e pericentromérica do par 21.
Das 23 espécies de crocodilianos analisadas citogeneticamente
previamente, nenhuma demonstrou possuir cromossomos sexuais
heteromórficos, ratificando a possibilidade de que a determinação do sexo se dá
pela temperatura de incubação dos ovos (Cohen e Gans 1970; Ferguson e
Joanen 1982; Head et al. 1987; Menzies e Kushlan 1991; Lang e Andrews 1994;
Sarre, Georges, Quinn 2004; Valenzuela e Lance 2004).
Corroborando estes dados, no presente trabalho não observamos
diferenças na distribuição da heterocromatina constitutiva entre os ambientes
analisados e entre machos e fêmeas, rejeitando assim a possibilidade da
43
presença de cromossomos sexuais como já observado em estudos prévios. O
padrão encontrado foi exclusivamente centromérico, evidenciando um
conservadorismo cromossômico, assim como descrito para Crocodylus johnstoni,
embora seja distinto do encontrado por King et al. (1986) para C. crocodilus, onde
eles observaram uma distribuição dos blocos heterocromáticos no centrômero dos
pares 6, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 e 21. Em nossos dados, nos demais pares
cromossômicos observaram -se uma ausência de marcação.
A região organizadora de nucléolo (RON) ativa foi localizada no décimo
terceiro par, na região centromérica, ao contrário do descrito por King et al.
(1986), onde esta foi detectada no par 16. Esta variação pode ser devido à
qualidade do material analisado e ao padrão de compactação dos cromossomos
observado por King et al. (1986). A ocorrência de apenas um sitio de DNAr
também foi corroborada pela hibridização fluorescente in situ (FISH) da sonda de
DNAr 18S. Ainda, é possível notar a presença de um bloco duplicado em um dos
cromossomos homólogos do par. A presença de duplicações de sítios de DNAr
correspondendo a uma região C-positiva é comum para o gênero Caiman como
descrito anteriormente (Lui 1994; Amavet et al. 2003). Este fato é devido a
processo de crossing-over desigual comum entre sequencias repetitivas como os
sítios de DNAr.
Sítios teloméricos intersticiais (ITS) foram detectados em alguns
cromossomos, onde a presença destes ITS é alusiva a rearranjos cromossômicos
do tipo fusão, possivelmente por eventos de fusões, após a divergência ocorrida
entre as linhagens de crocodilos e aves há 220–250 M.a. (Kawagoshi et al. 2008).
Portanto, corrobora a teoria de Cohen em Gans (1970) que sugere que o cariótipo
basal para a ordem Crocodylia deriva do cariótipo do gênero Paleosuchus. Ao
comparar o cariótipo considerado basal com o descrito no presente trabalho,
observa-se uma notável diferença em sua fórmula cariotípica, onde Paleosuchus
(26t+16m/sm e NF=58) (Cohen e Gans 1970) e Caiman crocodilus (24t+18m/sm e
NF=60).
Sequências repetitivas de DNA podem estar envolvidas na evolução do
genoma por controle gênico e principalmente por intermédio de rearranjos
cromossômicos (Valente et al. 2011). As sequências repetitivas mapeadas
cromossomicamente neste trabalho provavelmente estão envolvidas na evolução
e adaptação do genoma da espécie ao seu habitat. É possível sugerir isso devido
44
à maior quantidade de cópias dos elementos transponíveis no genoma dos
animais de ambiente contaminado, considerando que os animais de ambiente
natural possuem menos cópias.
Semelhante aos resultados encontrados nesse trabalho, os retroelementos
Rex são encontrados dispersos ao longo dos cromossomos ou
compartimentalizados em diferentes grupos de peixes (Mazzuchelli e Martins,
2009; Gross et al. 2009; Teixeira et al. 2009; Valente et al. 2011; Schneider et al.
2013), incluindo regiões eucromáticas (Gross et al. 2009; Teixeira et al. 2009;
Terencio et al. 2012, Schneider et al. 2013), demonstrando que estes elementos
possuem uma função estrutural ou regulatória (Schneider 2013b). Para Caiman
crocodilus o retroelemento Rex1 foi encontrado na mesma região das sequências
teloméricas dos cromossomos mitóticos, porém não foram evidenciados em
regiões teloméricas intersticiais. Estas marcações coincidentes com regiões
terminais podem estar relacionadas à perda ou inativação de sequências
teloméricas, tornando essas regiões propícias a eventos de recombinação
(Slijepcevic 1998; Cherry e Blackburn 1985; Wyman e Blackburn 1991; Ashley e
Ward 1993; Nergadze et al. 2007) o que propiciaria eventos de evolução
cromossômica para o grupo, visto que acredita-se que os cariótipos derivados se
originam por fusões e consequentemente redução no número diplóide (Cohen e
Gans 1970; King et al. 1986).
Ainda, o aumento na quantidade do Rex1 nos cromossomos das fêmeas
do ambiente limpo em relação ao ambiente poluído pode estar associado à
influência hormonal somada a fatores ambientais, os quais representam uma
condição ideal para a transcrição dos retrotransposons (Barbosa et al. 2014).
Além disso, em alguns organismos aquáticos foi observado que fatores
ambientais como hipóxia, pH, temperatura, doenças e poluentes influenciam na
mobilização destes elementos (Arnault e Dufournel 1994; Grandbastien 1998;
Capy et al. 2000; Edwards e Myers 2007; de La Vega et al. 2007) como
observado em plantas (Grandbastien 1998; Pourteau et al. 2004), camarão (de La
Vega et al. 2007), ratos (Lu e Ramos 1998; El-Sawy et al. 2005) e peixes (Roling,
Bain e Baldwin 2004; Barbosa et al. 2014). Assim estes fatores podem estar
influenciando na quantidade destes retroelementos nos indivíduos de ambiente
poluído por representarem condições de estresse, como observado nos
45
resultados aqui descritos e corroborados pelos resultados demonstrados pelo
Teste do MN e CA.
Aspectos genotóxicos de Caiman crocodilus
A bacia amazônica possui a maior e mais volumosa rede hidrográfica do
mundo, com inúmeros “igarapés” (Santos e Ferreira 1999; Figueiredo et al. 2009;
Mora et al. 2010). Estes igarapés são a principal porta de entrada de efluentes
domésticos e industriais nos ecossistemas aquáticos, pois fazem parte da malha
urbana de cidades da Amazônia Central, como Manaus (Cleto Filho e Walker
2001). Estes contaminantes ao entrarem nos corpos hídricos se distribuem em
graus distintos desde o solo até animais, chegando a ser letais (Förstner 1987;
Filgueiras et al. 2004; Santana e Barroncas 2007).
A fauna aquática, de modo geral é sensível a mudanças no ambiente,
principalmente quando se refere à qualidade da água e ao nível de oxigênio
dissolvido (Cleto Filho e Walker 2001). A presença dos crocodilianos nos igarapés
urbanos se dá pelo fato destes serem predadores de topo de cadeia, cuja dieta é
generalista e oportunista que varia de acordo com a idade, tamanho do indivíduo,
sazonalidade, disponibilidade de presas, estação e o nicho que ocupam (Webb et
al.1982; Magnusson et al. 1987; Thorbjarnarson 1993). Sabe-se ainda que os
crocodilianos são muito sensíveis a pesticidas, pois estas substâncias imitam a
ação de esteroides sexuais, como o estrógeno, alterando a síntese de hormônios
dos mesmos (Rueda-Almonacid et al. 2007).
Em indivíduos de C. crocodilus analisados nesse trabalho, o Ensaio do
Cometa (CA) evidenciou uma alta frequência de cometas no nível 3 para o
ambiente antropizado e nível 5 para o ambiente não antropizado.
Esses resultados demonstram que houve um aumento de danos no DNA e
uma possível inibição da apoptose nos organismos residentes em ambiente
poluído, visto que determinados compostos presentes na carga orgânica do
esgotamento doméstico, como ferro, manganês, zinco, cobre, cálcio, magnésio,
sódio, potássio, nitrato, alteração no pH da água (Melo et al. 2005) e
concentração de mercúrio no solo (Medeiros et al. 2014), induzem efeitos
genotóxicos/citotóxicos, interferindo na ação das caspases, chegando a agir como
um anti-apóptotico em concentrações elevadas (Kirkland e Müller 2000). No
46
ambiente não antropizado provavelmente está ocorrendo indução de apoptose
pelas características da água, que se mostram pouco oxigenadas, com pH ácido
e altos valores de nitrato e amônia (Brito et al. 2014), estes fatores podem causar
privações de nutrientes (Evan e Littlewood 1998), estresse oxidativo (Dypbukt et
al. 1994) e danos no DNA que não podem ser corrigidos pelo sistema de reparo
(Junqueira e Carneiro 2005).
O ensaio do cometa é um teste utilizado para comparar danos ao DNA
ocorridos durante o ciclo celular e que não são observados por outros métodos
(Huang et al. 2005). É amplamente utilizado na biomonitoração e na detecção de
agentes mutagênicos e genotóxicos em jacarés, lagartos, sapos e tartarugas
(Cotelle e Férard 1999; Poletta et al. 2009; Ruiz de Arcaute et al. 2014;
Schaumburg et al. 2014; Caliani et al. 2014). Contudo, observa-se que as
imagens das células de jacarés do ambiente limpo não são tão nítidas quanto as
de ambiente poluído devido ao fato das primeiras preparações terem sido feitas
em laboratório de campo, sem ambiente laboratorial climatizado, com temperatura
e umidade ambiental não controlada, ao contrário das preparações referentes a
indivíduos de ambientes antropizados. Portanto, este teste não parece ser o mais
indicado para ser realizado em campo, quando não se pode controlar o ambiente
laboratorial. Neste caso, a análise de micronúcleos se torna muito mais robusta
por não sofrer estes efeitos.
Para Caiman crocodilus o teste do Micronúcleo (MN) revelou diferenças
significativas na ocorrência de danos entre ambiente antropizado e não
antropizado, sendo mais frequente no primeiro. Possivelmente isso ocorre porque
os crocodilianos possuem um alto nível de magnificação no ecossistema aquático,
determinado por apresentar um ciclo de vida longo, consumidor primário de
presas aquáticas e por possuir metabolismo lento, o que dificulta a detoxificação
dos contaminantes (Novillo et al. 2005). Em estudos anteriores realizados em
outros crocodilianos do gênero Crocodylus (Crocodylus acutus e Crocodylus
moreletii) o teste do MN foi utilizado apenas para análise da quantidade de MN
formados espontaneamente, onde observa-se que a frequência observada é bem
reduzida, sem valores significativos, onde a média obtida de MN/1000 eritrócitos
foi de 0,12 e 0,30 respectivamente (Zúñiga-González et al. 2000) enquanto que
nossos resultados demonstram uma média de 0,18 micronúcleos a cada 1000
47
eritrócitos (MN/1000) em ambiente não antropizado e de 0,11 MN/1000 em
ambiente antropizado.
Além disso, a análise de MN já havia sido previamente utilizada em Caiman
latirostris, que ocorrem na Argentina, visando avaliar a ação de agrotóxicos e
pesticidas no genoma dos espécimes, porém não foi observada diferença
significativa em nenhum dos tratamentos adotados, mesmo com doses elevadas
(Poletta et al. 2007; Poletta et al. 2011; López González et al. 2013). Estes
valores encontrados que tendem ao zero, demonstram que o sistema
reticuloendotelial dos crocodilianos é eficiente, evitando o aumento e acumulação
de MN nestes organismos.
Em análise genotóxica comparativa entre ambientes não antropizados e
antropizados da Amazônia central usando MN como biomarcador em espécies de
peixes como Prochilodus nigricans, Mylossoma duriventris e Hoplias malabaricus,
detectou-se uma diferença significativa na frequência dos MN em indivíduos de
ambiente poluído (Porto et al. 2005). Entretanto em Hoplosternum littorale, não foi
observada diferença significativa na quantidade de micronúcleos entre os dois
ambientes, porém uma organização cromossômica diferencial de elementos
repetitivos de DNA foi evidente, tais como retroelementos da família Rex (Da Silva
et al. 2015).
Portanto, os dados demonstrados nesse trabalho apesar de serem novos,
reforçam a ideia de que é necessário tomar medidas cabíveis em relação à ação
antrópica e como ela pode estar afetando a dinâmica das espécies que vivem nos
ecossistemas aquáticos. Deste modo mais estudos se fazem necessários para
ampliar o conhecimento sobre as características genéticas destes animais.
4 CONCLUSÃO
– As análises de citogenética clássica para fórmula cariotípica e rearranjos
cromossômicos foram diferentes dos dados encontrados em estudos
anteriores, apesar de no presente estudo não haver diferenças entre os
ambientes analisados.
– O mapeamento do retroelemento Rex1 no genoma de Caiman crocodilus
sugere que estes estão sob forças evolutivas que tendem a acumula-los
48
em regiões cromossômicas especificas, principalmente em regiões
terminais.
– As análises genotóxicas utilizadas demonstraram que os ambientes afetam
o genoma dos animais, principalmente os ambientes contaminados com
efluentes. Isso se deve ao fato de que os indivíduos tendem a passar o
início do seu desenvolvimento no mesmo local.
– O ambiente interfere no DNA dos espécimes expostos à poluição. Como as
análises de MN que demonstraram diferença entre as frequências destes e
o ambiente em que o animal habita, assim como as análises de cometa
demonstram que a fragmentação do DNA é bem intensa em ambientes
antropizados.
– Caiman crocodilus demonstrou ser um bom indicador de genotoxicidade,
evidenciando resultados mesmo com sutis diferenças.
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