instituto federal catarinense pró reitora de pesquisa, pós
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INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE
Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação
Mestrado Profissional em Produção e Sanidade Animal
Dissertação
Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp. para caracterização das cepas em cães
naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina
Marinara Macelai Leite
Concórdia, 2020
Marinara Macelai Leite
Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp. para caracterização das cepas em cães
naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina
Dissertação apresentada ao Mestrado Profissional
em Produção e Sanidade Animal do Instituto
Federal Catarinense, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências (área de
concentração: Produção e Sanidade Animal).
Orientador: Profª Drª Soraya Regina Sacco Surian
Concórdia, 2020
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática do ICMC/USP, cedido ao IFC e
adaptado pela CTI - Araquari e pelas bibliotecas do Campus de Araquari e Concórdia.
L141Leite, Marinara Macelai Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp.para caracterização das cepas em cães naturalmenteinfectados nas regiões Oeste e Litoral de SantaCatarina / Marinara Macelai Leite; orientador SorayaRegina Sacco Surian. -- Concórdia, 2020. 45 p.
Dissertação (mestrado) - Instituto FederalCatarinense, campus Araquari, Mestrado Profissionalem Produção e Sanidade Animal, Concórdia, 2020.
Inclui referências.
1. Erliquiose. 2. RIFI. 3. TRP19. 4. TRP36. 5.Hemoparasitose. I. Surian, Soraya Regina Sacco. II.Instituto Federal Catarinense. Mestrado Profissionalem Produção e Sanidade Animal. III. Título.
Marinara Macelai Leite
Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp. para caracterização das cepas em cães
naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina
Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências, Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa,
Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense.
Data da Defesa: 10/07/2020
Banca examinadora:
Profª. Drª. Soraya Regina Sacco Surian (Orientador)
Doutora em Clínica Veterinária pela Universidade Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de
Botucatu-SP
Prof. MSc. Hugo Leonardo Riani Costa
Mestre em Clínica Veterinária pela Universidade Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de
Botucatu-SP
Profª. Drª. Maria Francisca Neves
Doutorado em Patologia Veterinária pela Universidade Estadual Paulista (UNESP),
Câmpus de Jaboticabal e pós-doutorado em Parasitologia Humana na Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP).
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃOINSTITUTO FEDERAL CATARINENSESISTEMA INTEGRADO DE PATRIMÔNIO, ADMINISTRAÇÃO ECONTRATOS
FOLHA DE ASSINATURAS
Emitido em 10/07/2020
DOCUMENTOS COMPROBATÓRIOS - CAMPUS ARAQUARI Nº 4/2020 - PGPSA/ARAQ (11.01.02.22) (Nº do Documento: 12)
NÃO PROTOCOLADO)(Nº do Protocolo:
(Assinado digitalmente em 29/04/2021 19:41 )SORAYA REGINA SACCO
PROFESSOR ENS BASICO TECN TECNOLOGICOLABPAR/CON (11.01.04.01.03.02.12.05)
Matrícula: 2408296
Para verificar a autenticidade deste documento entre em informando seu número: https://sig.ifc.edu.br/documentos/, ano: , tipo: , data de emissão: 12 2020 DOCUMENTOS COMPROBATÓRIOS - CAMPUS ARAQUARI
e o código de verificação: 29/04/2021 7177a6f52d
Dedico este trabalho à toda equipe,
Que fez dele possível.
Agradecimentos
A presente dissertação de mestrado não poderia ao fim sem o valioso apoio de várias
pessoas.
Em primeiro lugar, não poderia deixar de agradecer à minha orientadora, Professora
Doutora Soraya Regina Sacco Surian, pela paciência, empenho e carinho. Muito obrigada
por nunca me desmotivar.
Desejo igualmente agradecer a todos os colegas da equipe Professora Doutora
Vanessa Peripolli, Professor Doutor Daniel Moura de Aguiar, Bruna Vianini, Tainá Luana
Vieira Lopes Zuchi e Joice Lara Maia Faria. Sem vocês esse trabalho não seria possível.
Agradeço à Professora Doutora e amiga Elizabeth Schwegler que não mediu esforços
pra me motivar nessa etapa de muitos acontecimentos na minha vida. Obrigada pela
amizade, conselhos e broncas.
Por último agradeço à minha família, meu esposo Bruno Leite dos Anjos que apostou
nos nossos sonhos e não me permitiu desistir, e a minha filha Beatriz que virá ao mundo em
breve, um grande presente de Deus que sela todas as vitórias e escolhas realizadas no
último ano.
“Eu sou parte de uma equipe.
Então, quando venço, não sou eu apenas quem vence.
De certa forma, termino o trabalho de um grupo de pessoas”.
(Ayrton Senna)
Resumo
LEITE, Marinara Macelai. Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp. para caracterização das cepas em cães naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina. 2020. 44p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Concórdia, 2020. A erliquiose é uma doença de distribuição mundial, causada pelas rickettsias Ehrlichia spp. É considerada endêmica em cães de várias regiões do Brasil, porém no Estado de Santa Catarina (SC) quase não são relatados casos clínicos da doença, devido à escassez de seu hospedeiro intermediário, Rhipicephalus sanguineus, e quando há suspeita de hemoparasitoses, muitas vezes outros parasitas podem ser confundidos, por provocar quadros clínicos semelhantes. Com o intuito de detectar a presença do parasita e caracterizar sorologicamente sua cepa, foram coletadas amostras de sangue de uma população de 70 cães com suspeita de hemoparasitose na região Oeste e no Litoral do estado de Santa Catarina. O gene dsb5 foi utilizado como alvo da PCR para fins diagnósticos, sendo também realizada a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp., assim como ELISA específico para os peptídios TRP19, TRP36 e TRP32 para avaliar a diversidade sorológica. A prevalência da doença foi de 14,29%, com limite de confiança variando entre 7,07% a 24,71%. Dos animais avaliados 3/70 (4,3%) foram positivos para a PCR, todos na região Oeste de SC, e 7/70 (10%) sorologicamente positivos na RIFI, sendo dois de Concórdia e cinco de Joinville. Não houve concordância entre os testes, indicando que a PCR detectou os casos agudos de erliquiose e a RIFI, provavelmente, os casos crônicos da enfermidade, ou ainda animais que entraram em contato com o agente, com títulos de anticorpos variando entre 1:40 a 1:10.240. Ainda em relação à sorologia, o ELISA para TRP19, que detecta anticorpos específicos para E. canis, detectou três animais positivos (4,3%), dois no Oeste e um no Litoral, o ELISA para o peptídeo TRP36 genogrupo US foi positivo também para três cães (4,3%), todos de Joinville e o ELISA para o TRP36 genogrupo Brasileiro foi positivo em dois cães do Litoral (2,8%), sugerindo a existência de pelo menos dois genogrupos de E. canis no Litoral do Estado (US e Brasileiro). Em Concórdia os animais positivos para E. canis não reagiram para nenhum dos genogrupos, indicando a presença de outra cepa na região. Nenhum cão foi sororeagente ao ELISA para o peptídeo TRP32, demonstrando não haver anticorpos anti-E. chaffeensis. Todos os testes de ELISA realizados foram bastante específicos, porém pouco sensíveis, justamente por selecionar e indicar a cepa e não somente a positividade. Para melhor a sensibilidade dos testes diagnósticos, indica-se que sejam realizados PCR e RIFI da mesma amostra, pois a razão de chance do mesmo ser positivo para Ehrlichia spp é quatro vezes maior do que utilizando-se somente a PCR (P<0.05). Conclui-se que mesmo com uma menor incidência do que a relatada nos demais estados do Brasil, o conhecimento sorológico das cepas circulantes pode auxiliar em dados sobre a gravidade da doença, possibilidades de tratamento e até mesmo sobre desenvolvimento de vacinas. Palavras-chave: Erliquiose; RIFI; TRP19; TRP36; Hemoparasitose.
Abstract
LEITE, Marinara Macelai. Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp. para caracterização das cepas em cães naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina. 2020. 44p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Concórdia, 2020.
Ehrlichiosis is a worldwide disease, caused by rickettsiae Ehrlichia spp. It is considered endemic in dogs from several regions of Brazil, but in the State of Santa Catarina (SC), almost no clinical cases of the disease are reported, due to the scarcity of its intermediate host, Rhipicephalus sanguineus, and when there is suspicion of hemoparasitosis, often others parasites can be confused by causing similar clinical conditions. In order to detect the presence of the parasite and characterize its strain serologically, blood samples were collected from a population of 70 dogs suspected of having hemoparasitosis in the West and Coast of the state of Santa Catarina. The dsb5 gene was used as a target for PCR for diagnostic purposes, and an Indirect Immunofluorescence Reaction (RIFI) for Ehrlichia spp. Was also performed, as well as a specific ELISA for TRP19, TRP36 and TRP32 peptides to assess serological diversity. The prevalence of the disease was 14.29%, with a confidence limit ranging from 7.07% to 24.71%. Of the animals evaluated 3/70 (4.3%) were positive for CRP, all in the western region of SC, and 7/70 (10%) serologically positive in RIFI, two from Concórdia and five from Joinville. There was no agreement between the tests, indicating that CRP detected acute cases of ehrlichiosis and IFAT, probably chronic cases of the disease, or animals that came into contact with the agent, with antibody titers ranging from 1:40 to 1: 10,240. Still in relation to serology, the ELISA for TRP19, which detects specific antibodies to E. canis, detected three positive animals (4.3%), two in the West and one in the Coast, the ELISA for the TRP36 peptide genogroup US was also positive for three dogs (4.3%), all from Joinville and the ELISA for the TRP36 Brazilian genogroup was positive in two dogs from the Litoral (2.8%), suggesting the existence of at least two E. canis genogroups in the Litoral do State (US and Brazilian). In Concórdia, positive animals for E. canis did not react to any of the genogroups, indicating the presence of another strain in the region. No dog was seraeagent to the ELISA for the TRP32 peptide, demonstrating that there are no anti-E antibodies chaffeensis. All ELISA tests performed were very specific, but not very sensitive, precisely because they select and indicate the strain and not just the positivity. In order to improve the sensitivity of diagnostic tests, it is indicated that PCR and RIFI of the same sample are performed, since the odds ratio of being positive for Ehrlichia spp is four times greater than using only PCR (P <0.05) . It is concluded that even with a lower incidence than that reported in the other states of Brazil, the serological knowledge of the circulating strains can help in data on the severity of the disease, possibilities of treatment and even on vaccine development. Keywords: Ehrlichiosis; RIFI; TRP19; TRP36; Hemoparasitosis.
Lista de Tabelas
Tabela 1 Resultados positivos em pelos menos um dos testes sorológicos (ELISA e/ou
RIFI) e moleculares (PCR) no Oeste e no Litoral Catarinense. 29
Tabela 2 Comparação da acurácia, sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo
(VPN) e valor preditivo positivo (VPP) dos testes sorológicos utilizados no
estudo utilizando a RIFI como padrão ouro.
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SUMÁRIO
1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE ................................. 14
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 19
2.1 Geral .................................................................................................................. 19
2.2 Específicos .................................................................................................... 19
3 ARTIGO ............................................................................................................ 20
1 Introdução ............................................................................................................ 21
2 Material e Métodos ............................................................................................. 24
3 Resultados e discussão ........................................................................................ 27
Referências .............................................................................................................. 32
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................... 40
5 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 41
14
1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE
A erliquiose é uma doença causada por uma rickettsia pertencente a Ordem
Rickettsiales, Família Anaplasmataceae e Gênero Ehrlichia spp. (Dumler et al., 2001;
Labruna & Pereira, 2001). Diversas espécies são apontadas como causadoras da doença,
como a Ehrlichia canis, responsável pela Erliquiose Monocítica Canina (EMC); E. chaffeensis,
agente etiológico da Erliquiose Monocítica Humana (EMH); E. ewingii, agente da Erliquiose
Granulocítica Canina (EGC) e Humana (EGH) (Little, 2010) e E. ruminantium (antiga Cowdria
ruminantium), agente de uma erliquiose de ruminantes africanos e caribenhos conhecida
por hidropericardite bovina (Peter et al., 2002), compreendendo espécies
filogeneticamente relacionadas, porém genética e antigenicamente diferentes (Yu et al.,
2007). Uma sexta espécie identificada no Japão por Shibata (2000), isolada de carrapatos
Ixodes ovatus, foi designida como Ehrlichia OIE.
Dumler et al. (2001) reclassificaram a família Anaplasmataceae, sendo que algumas
espécies foram transferidas para o gênero Anaplasma: Anaplasma platys (antiga E. platys),
A. phagocytophilum (antigas E. equi e E. phagocytophila), A. bovis (antiga E. bovis); e outras
para o gênero Neorickettsia: Neorickettsia risticii (antiga E. risticii) e N. sennetsu (antiga E.
sennetsu).
As Ehrlichia spp. são parasitos intracelulares obrigatórios gram-negativos, que se
situam em vacúolos citoplasmáticos de células hematopoiéticas maduras ou imaturas e
células endoteliais nos hospedeiros vertebrados ou no intestino e glândula salivar dos
hospedeiros artrópodes (Unver et al., 2001). A E. canis é a principal espécie circulante no
Brasil, tendo o carrapato Rhipicephalus sanguineus envolvido na transmissão do agente em
cães (Labruna & Pereira, 2001).
A E. canis é o agente primário da erliquiose monocítica canina (EMC), sendo
importante patógeno, responsável por provocar doença grave em cães. Sua prevalência
está largamente associada à distribuição do vetor, R. sanguineus, encontrado
principalmente em regiões tropicais e subtropicais (Rodriguez-Vivas et al., 2005).
O carrapato transmissor Rhipicephalus sanguineus é conhecido como carrapato
marrom, pode invadir tanto canis, quanto ambientes domésticos. Está distribuído por toda
a América do Norte, e podem sobreviver como adultos sem se alimentar de 155 a 568 dias,
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podendo transmitir a infecção por até 155 dias após se tornarem infectados (Dagnone,
2001).
O ciclo da E. canis se inicia com a inoculação do agente no cão pelo carrapato R.
sanguineus, no momento do repasto sanguíneo. A erliquia infecta preferencialmente os
leucócitos. Ela penetra na parede celular por fagocitose e uma vez dentro da célula
hospedeira, inibe a formação do fagolisossoma. O organismo cresce dentro do fagossoma
e é liberado pela lise da célula. O corpo de inclusão contendo o organismo é chamado
mórula (Popov et al., 1998; Santarém, 2003).
A Ehrlichia spp é encontrada mundialmente, de forma comum, em áreas temperada
quentes e tropicais (Dunn, 2001). Segundo Moraes-Filho (2013) estudos filogenéticos
demonstraram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados
como R. sanguineus, aqueles carrapatos da chamada América Latina temperada (Chile,
Argentina, Uruguai e estado brasileiro do Rio Grande do Sul), que formam um grupo
monofilético, claramente distinto de um segundo grupo formado por R. sanguineus da
denominada América Latina tropical (desde México ao estado brasileiro de Santa Catarina).
Ainda segundo o autor, os estudos sobre erliquiose canina indicam que a E. canis é mais
prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina
temperada, e isso ocorre, provavelmente, devido à baixa competência vetorial dos
carrapatos presentes nessa região.
No Brasil, o primeiro relato da doença ocorreu em Belo Horizonte, Minas Gerais,
com a observação de inclusão da Rickettsia em linfócito (Costa et al., 1973). Birchard &
Sherding (2008) observaram que, devido à natureza crônica e insidiosa da doença, a
erliquiose canina é prevalente o ano inteiro.
Morais et al. (2002) estimaram a prevalência da doença ao redor de 20% nos estados
do Paraná, Bahia, Rio de Janeiro, Santa Catarina, São Paulo, Rio Grande do Sul, Minas Gerais,
Ceará, Alagoas, Pernambuco, Mato Grosso do Sul e Distrito Federal. Desde então, a doença
tem sido relatada em vários estados, acometendo aproximadamente 20 a 30% dos cães
atendidos em hospitais e clínicas veterinárias (Bulla et al., 2004; Dagnone et al., 2003;
Labarthe et al., 2003; Trapp et al., 2002).
A erliquiose pode se manifestar de três fases: fase aguda, fase subclínica e fase
crônica, e os sinais clínicos variam nas diferentes fases da doença. Na fase aguda os sinais
clínicos comuns são linfoadenopatia generalizada, esplenomegalia, hepatomegalia,
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dispneia ou intolerância a exercícios devido à pneumonite, sinais neurológicos, causados
por meningoencefalite, uveíte anterior e coriorretinite, petéquias e equimoses devidas à
trombocitopenia. Durante essa fase os títulos de anticorpos podem ficar negativos, pois se
leva até três semanas para se desenvolver um título significativo (Birchard & Sherding,
2008).
Na fase subclínica os pacientes permanecem assintomáticos. Podem-se identificar
alterações hematológicas e bioquímicas leves. Essa fase pode durar semanas a meses e se
caracteriza por uma persistência do organismo após uma recuperação aparente da fase
aguda. Durante essa fase os cães podem eliminar o organismo ou a infecção pode progredir
para a fase crônica (Birchard & Sherding, 2008).
Os cães com resposta imunológica insuficiente entrarão na fase crônica (Dagnone,
2001). Devido à imunossupressão, infecções secundárias podem ser comprovadas. Os sinais
clínicos associados com esta fase da doença são discretos e ausentes em alguns cães, e
graves em outros e desenvolvem-se uma a quatro meses após a inoculação do organismo
(Ettinger & Feldman, 2004).
Nos cães com erliquiose crônica, os sinais clínicos, os achados físicos e as
anormalidades laboratoriais podem lembrar um mieloma múltiplo ou uma leucemia
linfocitária crônica, além de apresentarem perda de peso, pirexia, sangramento
espontâneo, palidez devido à anemia, linfoadenopatia generalizada,
hepatoesplenomegalia, uveíte anterior e posterior, sinais neurológicos causados por
meningoencefalomielite, poliartrite e edema de membro intermitente (Birchard &
Sherding, 2008).
O diagnóstico da erliquiose canina tem como base o histórico clínico, exames
laboratoriais (hemograma completo, bioquímica sérica, eletroforese de proteínas);
sorológicos pelas técnicas de reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e ensaio
imunoenzimático (ELISA); molecular através da técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR) e exame direto, pela técnica de citologia aspirativa de baço, linfonodos e pulmão,
esfregaço sanguíneo e cultura (Andereg & Passos, 1999).
O esfregaço sanguíneo raramente é eficaz para detectar o microorganismo (5% de
positividade), utiliza-se sangue total coletado, sem anticoagulante, de preferência na borda
da orelha, em seguida deve ser fixado em álcool metílico e depois corado. O achado de
mórulas nas células confirma um diagnóstico de infecção por Ehrlichia, mas é raro, exceto
17
no caso de infecção com uma cepa granulocítica (Andereg & Passos, 1999; Ettinger &
Feldman, 2004).
A trombocitopenia é uma importante desordem na hematologia veterinária.
Quando um contador eletrônico registra baixas quantidades de plaquetas, é importante
que esse achado seja confirmado pela avaliação do esfregaço sanguíneo. As plaquetas são
pequenas células granulares e discoides, que embora anucleadas, possuem um
citoesqueleto que contém actina e miosina. Em seguida a uma lesão endotelial elas
bloqueiam o sangramento, através da aderência ao colágeno subendotelial. Quando as
plaquetas estão suficientemente reduzidas numericamente, ou estão funcionalmente
prejudicadas, os eritrócitos extravasam pelas paredes capilares (Thomson, 1990).
Além de trombocitopenia a erliquiose apresenta também nos achados
hematológicos, anemia, leucocitose ou leucopenia e linfopenia. Os achados bioquímicos
são hiperproteinemia, bem como o aumento de fosfatase alcalina. Esses achados
dependem da fase em que a doença se encontra (Cabral et al., 2006).
Os testes sorológicos são métodos úteis e confiáveis para o diagnóstico de erliquiose
(Tilley & Smith, 2003). De acordo com Nelson & Couto (2015) anticorpos anti-E. canis podem
ser detectados por imunofluorescência indireta (RIFI) ou “Dot-ELISA”, que permitem o
diagnóstico preciso da doença (Tilley & Smith, 2003). Porém, Morais et al. (2004) também
adverte que os testes que detectam anticorpos não fazem distinção entre a enfermidade e
a exposição prévia ao organismo ou infecção latente. Além disso, normalmente a titulação
não aparece na fase aguda (Harrus et al., 1997) e Massard & Fonseca (2004) citam que a
sorologia também pode ser negativa na fase crônica, se houver baixo nível de anticorpos.
Nos testes de RIFI, a soropositividade inicia entre sete a 21 dias após a infecção,
chegando a índices máximos 80 dias após e persistindo, a menos que se efetue o
tratamento. Porém, pode acontecer dos títulos aumentarem com o início do tratamento e
declinarem três a seis meses após. A persistência do título após este período assinala a
presença de E. canis em fase subclínica, ou reinfecção (Almosny & Massard, 2002). Segundo
Morais et al. (2004) o teste sorológico deve ser repetido após 14 a 21 dias para confirmar
ou descartar a doença.
Nelson & Couto (2015) afirmam que pode haver algum grau de reação cruzada da E.
canis com outros microrganismos como A. phagocytophilum, N. risticii e N. sennetsu. Lau &
Hay (1996) relatam também, que há discreta ou nenhuma reatividade com A. platys.
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A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) permite um diagnóstico rápido
e com alta sensibilidade (Dagnone et al., 2003; Bulla et al., 2004; Macieira et al., 2005),
porém possui custo elevado (Tillley & Smith, 2003). Portanto, na rotina clínica em animais
de companhia, o diagnóstico ainda é firmado com base na associação entre os sinais clínicos
e os resultados de exames hematológicos.
Após a caracterização molecular do gênero Ehrlichia novos genes têm sido
identificados como alvos para ensaios moleculares. O gene Thio-dissulfóxido-oxiredutase
foi caracterizado em várias bactérias, sendo identificada por McBride et al. (2002). Este
gene codifica proteínas responsáveis pelas ligações dissulfídicas (disulfide bond – dsb) das
bactérias, sendo muito divergente entre os microrganismos e útil para ensaior moleculares
de alta especificidade. A reação em cadeia da polimerase do gene dsb de Ehrlichia é
bastante específica, pois é altamente divergente dos outros gêneros de bactérias, mesmo
daquelas filogeneticamente mais próximas (Kuyler-Doyle et al., 2005).
Na biologia da Ehrlichia, as glicoproteínas TRP36 e TRP19 são específicas da espécie,
sendo proteínas reativas imunológicas, importantes para a resposta imune do hospedeiro,
possuindo apego à célula do hospedeiro e outros papéis potencialmente significativos
(Ferreira et al., 2014). Os genes que codificam a proteína TRP36 (~ 840 bp) e proteína TRP19
(414 pb) têm sido frequentemente estudados e foram utilizados para identificar diferentes
variações dentro do Espécies de E. canis (Cardénas et al., 2007). O gene TRP19 é altamente
conservado e, portanto, possui grande potencial de desenvolvimento vacinas e testes
sorológicos sensíveis, quando correlacionados com essa proteína (Doyle et al., 2006). A
proteína TRP19 está correlacionada à resposta imune aguda (ou precoce) em cães (McBride
et al., 2003) e apresenta reatividade também demonstrado no GP200, outra proteína
imunorreativa presente em E. canis (Cardénas et al., 2007).
O antígeno TRP36 é uma glicoproteína de fase aguda que é exposto na superfície
bacteriana e é secretado no hospedeiro citoplasma (McBride et al., 2003). Foram relatadas
diferenças no gene TRP36, assim indicando algum grau de diversidade de E. canis na
natureza e estudos sugeriram que TRP36 é útil para a genotipagem das cepas de E. canis.
19
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Detectar a presença dos agentes etiológicos causadores da erliquiose canina, pela
pesquisa de anticorpos e DNA de Ehrlichia spp., a fim de conhecer o perfil epidemiológico
da doença na população canina em um município da região Litoral, e em outro da região
Oeste do Estado de Santa Catarina e comparar os testes diagnósticos utilizados.
2.2 Específicos
Investigar a ocorrência dos agentes Ehrlichia canis, seus genogrupos US e Brasileiro
e E. chaffensis em caninos nos municípios de Joinville, Litoral catarinense e em
Concórdia, cidade localizada no Oeste do Estado de Santa Catarina;
Comparar a sensibilidade e especificidade dos métodos sorológicos ELISA e RIFI para
diagnóstico de Ehrlichia spp. em cães naturalmente infectados;
Calcular a razão de chances dos testes molecular e sorológico no diagnóstico da
erliquiose em cães.
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3 ARTIGO
Detecção sorológica e molecular de Ehrlichia spp. para caracterização das cepas em cães
naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina1
Manuscrito a ser submetido à Ciência Rural
(http://coral.ufsm.br/ccrrevista/normas.htm)
____________________________________________________________________
Autores:
Marinara Macelai Leite2; Bruna de Fátima Vianini3; Tainá Luana Vieira Lopes Zuchi3;
Joice Lara Maia Faria3; Vanessa Peripolli4; Daniel Moura de Aguiar5, Soraya Regina Sacco
Surian3*
1Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. 2Mestrado Profissional em Produção e Sanidade Animal. Instituto Federal Catarinense (IFC). 3IFC. Rodovia SC-283, km 17. Fragosos. CEP: 89.703-720 – Concórdia, Santa Catarina – Brasil. 4IFC. Rodovia BR-280, km 27. CEP: 89.245-000 – Araquari, Santa Catarina – Brasil. 5UFMT. Av. Fernando Corrêa da Costa, 2367 - Vila do Ipase. CEP: 78.060-900 – Cuiabá, Mato Grosso – Brasil. *Autor para correspondência: [email protected]
21
1 Introdução
A erliquiose é uma doença causada por uma rickettsia pertencente a Ordem
Rickettsiales, Família Anaplasmataceae e Gênero Ehrlichia spp. (DUMLER et al., 2001;
LABRUNA; PEREIRA, 2001). Diversas espécies são apontadas como causadoras da doença,
como a Ehrlichia canis, responsável pela Erliquiose Monocítica Canina (EMC); E.
chaffeensis, agente etiológico da Erliquiose Monocítica Humana (EMH); E. ewingii, agente
da Erliquiose Granulocítica Canina (EGC) e Humana (EGH) (LITTLE, 2010) e E.
ruminantium (antiga Cowdria ruminantium), agente de uma erliquiose de ruminantes
africanos e caribenhos conhecida por hidropericardite bovina (PETER et al., 2002),
compreendendo espécies filogeneticamente relacionadas, porém genética e antigenicamente
diferentes (YU et al., 2007). Uma sexta espécie identificada no Japão por Shibata (2000),
isolada de carrapatos Ixodes ovatus, foi designida como Ehrlichia OIE.
Dumler et al. (2001) reclassificaram a família Anaplasmataceae, sendo que algumas
espécies foram transferidas para o gênero Anaplasma: Anaplasma platys (antiga E. platys),
A. phagocytophilum (antigas E. equi e E. phagocytophila), A. bovis (antiga E. bovis); e outras
para o gênero Neorickettsia: Neorickettsia risticii (antiga E. risticii) e N. sennetsu (antiga E.
sennetsu).
As Ehrlichia spp. são parasitos intracelulares obrigatórios gram-negativos, que se
situam em vacúolos citoplasmáticos de células hematopoiéticas maduras ou imaturas e
células endoteliais nos hospedeiros vertebrados ou no intestino e glândula salivar dos
hospedeiros artrópodes (UNVER et al., 2001). A E. canis é a principal espécie circulante no
Brasil, tendo o carrapato Rhipicephalus sanguineus envolvido na transmissão do agente em
cães (LABRUNA; PEREIRA, 2001).
22
A E. canis é o agente primário da erliquiose monocítica canina (EMC), sendo
importante patógeno, responsável por provocar doença grave em cães. Sua prevalência está
largamente associada à distribuição do vetor, R. sanguineus, encontrado principalmente em
regiões tropicais e subtropicais (RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2005).
O diagnóstico da erliquiose canina tem como base o histórico clínico, exames
laboratoriais (hemograma completo, bioquímica sérica, eletroforese de proteínas);
sorológicos pelas técnicas de reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e ensaio
imunoenzimático (ELISA); molecular através da técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR) e exame direto, pela técnica de citologia aspirativa de baço, linfonodos e pulmão,
esfregaço sanguíneo e cultura (ANDEREG; PASSOS, 1999).
Os testes sorológicos são métodos úteis e confiáveis para o diagnóstico de erliquiose,
os anticorpos anti-E. canis podem ser detectados por imunofluorescência indireta (RIFI) ou
“Dot-ELISA”, que permitem o diagnóstico preciso da doença (TILLEY; SMITH, 2003).
Porém, Morais et al. (2004) também adverte que os testes que detectam anticorpos não fazem
distinção entre a enfermidade e a exposição prévia ao organismo ou infecção latente. Além
disso, normalmente a titulação não aparece na fase aguda (HARRUS et al., 1997) e Massard
& Fonseca (2004) citam que a sorologia também pode ser negativa na fase crônica, se houver
baixo nível de anticorpos.
Nos testes de RIFI, a soropositividade inicia entre sete a 21 dias após a infecção,
chegando a índices máximos 80 dias após e persistindo, a menos que se efetue o tratamento.
Porém, pode acontecer dos títulos aumentarem com o início do tratamento e declinarem três
a seis meses após. A persistência do título após este período assinala a presença de E. canis
em fase subclínica, ou reinfecação (ALMOSNY; MASSARD, 2002). Segundo Morais et al.
(2004) o teste sorológico deve ser repetido após 14 a 21 dias para confirmar ou descartar a
doença.
23
Nelson & Couto (2015) afirmam que pode haver algum grau de reação cruzada da E.
canis com outros microorganismos como A. phagocytophilum, N. risticii e N. sennetsu. Lau
& Hay (1996) relatam também, que há discreta ou nenhuma reatividade com A. platys.
A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) permite um diagnóstico rápido e
com alta sensibilidade (DAGNONE et al., 2003; BULLA et al., 2004; MACIEIRA et al.,
2005), porém possui custo elevado (TILLLEY; SMITH, 2003). Portanto, na rotina clínica
em animais de companhia, o diagnóstico ainda é firmado com base na associação entre os
sinais clínicos e os resultados de exames hematológicos.
Na biologia da Ehrlichia, as glicoproteínas TRP36 e TRP19 são específicas da espécie,
sendo proteínas reativas imunológicas, importantes para a resposta imune do hospedeiro,
possuindo apego à célula do hospedeiro e outros papéis potencialmente significativos
(FERREIRA et al., 2014). Os genes que codificam a proteína TRP36 (~ 840 bp) e proteína
TRP19 (414 pb) têm sido frequentemente estudados e foram utilizados para identificar
diferentes variações dentro do Espécies de E. canis (CARDÉNAS et al., 2007).
O antígeno TRP36 é uma glicoproteína de fase aguda que é exposto na superfície
bacteriana e é secretado no hospedeiro citoplasma (MCBRIDE et al., 2003). Foram relatadas
diferenças no gene TRP36, assim indicando algum grau de diversidade de E. canis na
natureza e estudos sugeriram que TRP36 é útil para a genotipagem das cepas de E. canis.
Desta maneira, o objetivo do trabalho foi detectar por exames molecular e sorológico
bastante específicos a Ehrlichia spp. caracterizando sorologicamente as cepas presentes em
cães naturalmente infectados nas regiões Oeste e Litoral de Santa Catarina, Brasil, que se
localiza bem na área de transição entre a América Latina temperada e tropical.
24
2 Material e Métodos
A metodologia adotada foi aprovada pelo Comitê de Ética em Uso Animal (CEUA) do
Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, Estado de Santa Catarina, Brasil
(Protocolo nº 07/2020).
2.1 Critério de seleção e obtenção das amostras
Foram utilizados amostras de sangue total e soro de 70 cães, de ambos os sexos, de
diferentes raças, sendo 40 oriundas da cidade de Concórdia-SC, representando o Oeste do
Estado e 30 de Joinville-SC sendo representativas do Litoral do estado de Santa Catarina.
As amostras foram colhidas no Centro de Práticas Clínicas e Cirúrgicas do IFC,
campus Concórdia e em Clínicas Veterinárias de ambas as regiões, parceiras do projeto.
Todos os cães apresentavam pelo menos algum sinal ou sintoma clínico compatíveis com
hemoparasitoses como: hipertermia, linfoadenopatias, sangramentos, anemia,
trombocitopenias, ou histórico recente de presença de carrapatos, ou ainda sorologia anterior
positiva no teste comercial ELISA Imunoteste Ehrlichia (Immunodot Diagnostics, Brazil).
De cada animal foram colhidos aproximadamente 5 mL de sangue total, da veia
jugular ou cefálica, sendo utilizados tubos comerciais com anticoagulante (EDTA a 10%) e
tubos comerciais com gel acelerador do coágulo, para separação do soro. Alíquotas de soro
e sangue total foram armazenadas à -20 ºC, sendo encaminhadas ao Laboratório de Virologia
e Rickettsioses do Hospital Veterinário da UFMT, onde permaneceram congeladas até o
momento da realização das técnicas.
2.3 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)
25
A RIFI foi realizada a partir de células DH82 infectadas com o isolado Jaboticabal de
E. canis, fixado em lâminas de imunofluorescência, como descrito por Ristic et al. (1972). O
ponto de corte adotado foi de 40, mesma metodologia preconizada por McBride et al. (2001),
sendo, portanto, os soros diluídos em PBS pH 7,2 e aplicados às lâminas com antígeno fixado,
sendo incubados por 30 minutos a 37ºC em câmara úmida. Após, foi realizada lavagem de
10 minutos com PBS 7,2, secagem em temperatura ambiente, e adição do conjugado de
coelho anti-IgG de cão (Sigma Diagnostics) na diluição de 1:1000. As lâminas foram
novamente incubadas a 37ºC por 30 minutos e lavadas conforme descrição supracitada. Após
a secagem, aplicou-se glicerina pH8,5 em cada lâmina e estas foram examinadas em
microscópio de imunofluorescência Olimpus®. Àquelas consideradas positivas, foram
sucessivamente diluídas na razão dois, para obtenção do título final. O soro controle positivo
foi proveniente de estudo anterior também realizado com a cepa Jaboticabal (HASEGAWA,
2005).
2.4 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Foram sintetizados peptídeos correspondentes às regiões de repetição do TRP36 da
cepa US de E. canis (18-mer, TEDSVSAPATEDSVSAPA) (DOYLE et al., 2006), do TRP36
da cepa Brasileira de E. canis (24-mer, ASVVPEAEASVVPEAEASVVPEAE) (AGUIAR
et al., 2013) e da região contendo o epítopo TRP19 de E. canis (24-mer, HFTGPTF-
SEVNLSEEEKMELQEVS) (Bio-Synthesis Inc., Lewisville, TX) (MCBRIDE et al., 2007),
assim como um peptídeo sintético específico para E. chaffeensis (TRP32) (30 –mer,
SDLHGSFSVELFDPFKEAVQLGNDLQQSSD) (LUO et al., 2008). Um peptídeo
correspondente à região C-terminal TRP36 da cepa israelense de E. canis (IS36-C-V, 15-
26
mer, NPTGLKFLDLYTQLTL) (ZHANG et al., 2008) foi utilizado como controle negativo
de peptídeos. Todos os peptídeos (liofilizados) foram suspensos em água de grau molecular
a 1 mg/mL. As placas ELISA (MaxiSorp; Nunc, Roskilde, Denamark) foram revestidas (1,0
g/poço) com os respectivos peptídeos sintéticos suspensos em solução salina tamponada com
fosfato (pH 7,4) e o ensaio foi realizado conforme descrito anteriormente (LUO et al., 2010).
O desenvolvimento da cor foi determinado em um leitor de microplacas (VersaMax;
Molecular Devices, Sunnyvale, CA), e os dados foram analisados usando o SoftMax Pro v4.0
(Molecular Devices). As leituras de densidade óptica (DO; A650) representam a média para
três poços (± desvios padrão) após subtrair o valor de DO do peptídeo de controle não reativo
(IS36-C-V). O Allsera IFA negativo para E. canis e o cão infectado com E. chaffeensis teve
leituras médias de OD de <0,020 e <0,100, respectivamente; portanto, um limiar de amostra
positivo foi definido em> 0,300 unidades de OD acima da absorvância de controle negativo.
O valor de especificidade para o ELISA foi calculado de acordo com Thrusfield (2007) e o
intervalo de confiança de 95% foi calculado para os resultados de amostras de soro de cães
naturalmente infectados pelo software EpiInfo 7.0 para Windows.
2.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a técnica, a amostra de sangue foi submetida à extração de DNA usando o kit
Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) de acordo com as instruções do
fabricante. Foi utilizada para a amplificação do DNA de Ehrlichia canis uma solução de 22,5
µL, contendo 8 µL água ultrapura; 12,5 µL GoTaq® Green Master Mix (Promega); 1 µL de
primer e 4 µL de amostra. Para realizar a PCR foi utilizado os primers dsb5 330 (5’-GAT
GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3’), seguindo a técnica de Kuyler-Doyle et al.
(2005). As fitas de DNA foram amplificadas usando um protocolo de termociclagem de 95ºC
27
por 30 seg., 45º C por 30 seg. e 72ºC por 1 min por 30 ciclos. Os produtos da PCR foram
visualizados por agarose electroforese em gel (1,2% FlashGel).
2.5 Análises estatísticas
Os dados foram analisados usando o programa SAS (Analysis System Institute, Cary,
NC, USA, versão 9,4). Para avaliar as associações entre diferentes variáveis, utilizou-se o
Teste do Qui quadrado (χ2). Considerou-se o valor de p ≤ 0,05 estatisticamente significativo.
A prevalência, acurácia, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP)
e valor preditivo negativo (VPN) para os testes sorológicos foram determinados usando a
RIFI como padrão ouro. A análise de regressão logística e o cálculo do odds ratio foram
realizados para identificar qual teste diagnóstico ou associação de testes foi o melhor na
detecção de positivos.
3 Resultados e discussão
A prevalência da doença foi de 14.29%, com limite de confiança variando entre
7.07% a 24.71%. Dos animais avaliados 3/70 (4,3%) foram positivos para a PCR, todos na
região Oeste de SC, e 7/70 (10%) sorologicamente positivos na RIFI, sendo dois de
Concórdia e cinco de Joinville. Não houve concordância entre os testes, indicando que a PCR
detectou os casos agudos de erliquiose e a RIFI, provavelmente, os casos crônicos ou pré-
exposição prévia ao agente, com títulos de anticorpos variando entre 1:40 a 1:10.240 (Tabela
1).
Morais et al. (2002) estimaram a prevalência da doença ao redor de 20% nos estados
do Paraná, Bahia, Rio de Janeiro, Santa Catarina, São Paulo, Rio Grande do Sul, Minas
28
Gerais, Ceará, Alagoas, Pernambuco, Mato Grosso do Sul e Distrito Federal. Desde então, a
doença tem sido relatada em vários estados, acometendo aproximadamente 20 a 30% dos
cães atendidos em hospitais e clínicas veterinárias (BULLA et al., 2004; DAGNONE et al.,
2003; TRAPP et al., 2006). Labarthe et al. (2003) indicou uma prevalência menor, variando
entre 0,7 a 4,7% em três estados da região Sul do Brasil.
A Ehrlichia spp é encontrada mundialmente, de forma comum, em áreas temperada
quentes e tropicais (DUNN, 2001). Segundo Moraes-Filho (2013) estudos filogenéticos
demonstraram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados
como R. sanguineus, aqueles carrapatos da chamada América Latina temperada (Chile,
Argentina, Uruguai e estado brasileiro do Rio Grande do Sul), que formam um grupo
monofilético, claramente distinto de um segundo grupo formado por R. sanguineus da
denominada América Latina tropical (desde México ao estado brasileiro de Santa Catarina).
Ainda segundo o autor, os estudos sobre erliquiose canina indicam que a E. canis é mais
prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina
temperada, e isso ocorre, provavelmente, devido à baixa competência vetorial dos carrapatos
presentes nessa região.
Ainda em relação à sorologia, o ELISA para TRP19, que detecta anticorpos
específicos para E. canis, detectou três animais positivos (4,3%), dois no Oeste e um no
Litoral, o ELISA para TRP36 genogrupo US foi positivo também para três cães (4,3%), todos
de Joinville e o ELISA para TRP36 genogrupo Brasileiro foi positivo em dois cães do Litoral
(2,8%), sugerindo a existência de pelo menos dois genogrupos de E. canis no Estado (US e
Brasileiro). Nenhum cão foi sororeagente ao ELISA TRP32, indicando não haver anticorpos
anti-E. chaffeensis (Tabela 1).
29
Tabela 1. Resultados positivos em pelos menos um dos testes sorológicos (ELISA e/ou RIFI)
e moleculares (PCR) no Oeste e no Litoral Catarinense.
Cidade Sexo PCR ELISA
RIFI Título TRP19 TRP36US TRP36Br TRP32
Concórdia
(n=40)
F + - - - - - NR
F + - - - - - NR
F + - - - - - NR
F - + - - - - NR
F - - - - - + 1:40
F - + - - - + 1:640
Joinville
(n=30)
M - - - - - + 1:160
F - - + - - + 1:640
M - + - - - + 1:2.560
M - - - + - + 1:10.240
M - - - + - + 1:10.240
F - - + - - - NR
F - - + - - - NR
P - 0.12 0.73 0.04 0.09 - 0.10 0.27
Legenda: M: macho; F: fêmea; +: positivo; -: negativo; NR: não reagente. Valores de p em
negrito são estatisticamente significativos (P<0.05), demonstrando diferença entre as
cidades.
30
A diversidade de E. canis foi investigada usando abordagens genéticas e sorológicas
baseadas em sequências distintas de proteína de repetição em tandem de 36 kDa (TRP36),
sendo relatados quatro genótipos de E. canis, havendo três destas cepas identificadas na
América do Norte ou do Sul (ARROYAVE et al., 2019).
ELISA usando peptídeos sintéticos para distinguir sorologicamente infecções por E.
canis e E. chaffeensis já haviam sido relatadas anteriormente por Doyle et al. (2006),
McBride et al. (2007) e Luo et al. (2008).
Aguiar et al. (2013) relataram a existência de genomas de E. canis em circulação no
Brasil que podem ser distinguidos molecularmente pelo TRP36, destacando que os ensaios
sorológicos para entender as infecções por E. canis por cada genótipo seriam úteis para o
diagnóstico, a compreensão de declarações clínicas representadas por cada cepa e a
epidemiologia da erliquiose canina no país.
Em Concórdia, os animais positivos para E. canis no ELISA TRP19, não reagiram
para nenhum dos genogrupos, indicando a presença de outra cepa na região. Um resultado
semelhante foi citado por Aguiar et al. (2016), no qual um cão que tinha anticorpos contra o
peptídeo TRP19 não reagiu com o peptídeo TRP36, sugerindo que esse cão pode ter sido
exposto a um novo genótipo de E. canis TRP36 que circula no Brasil. Além disso, os autores
indicam que a ocorrência de anticorpos específicos contra ambos os genótipos no mesmo
animal implica que os cães podem estar co-infectados ou ainda de serem infectados em
momentos diferentes por diferentes genótipos. Esse resultado apoia a possibilidade de
ocorrência de recombinação genética entre os genótipos US e Brasileiro TRP36, que pode
ter ocorrido em um estudo anterior de Aguiar et al. (2013).
Utilizando-se a RIFI como padrão ouro para a sorologia dos animais, os demais testes
apresentaram-se muito específicos, variando de 96,67 até 100%, com acurácia acima de 84%,
e com valor preditivo negativo (VPN) bastante altos, indicando que os testes ELISA são
31
ótimos em negativar as amostras analisadas (Tabela 2), porém quando verificamos a
sensibilidade esta é baixa, variando entre 10 a 20% (Tabela 2), indicando que estes testes não
são necessariamente testes de triagem, devendo ser utilizados somente quando o objetivo é
caracterizar as cepas.
Tabela 2. Comparação da acurácia, sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo
(VPN) e valor preditivo positivo (VPP) dos testes sorológicos utilizados no estudo utilizando
a RIFI como padrão ouro.
Teste diagnóstico
Acurácia % (limites de confiança)
Sensibilidade %
(limites de confiança)
Especificidade %
(limites de confiança)
VPP % (limites de confiança)
VPN% (limites de confiança)
ELISA TRP19
87.1 (76.9 a 93.9)
20.0 (2.5 a 55.6)
98.3 (91.0 a 99.9)
66.6 (16.6 a 95.2)
88.0 (84.3 a 90.9)
ELISA TRP36US
84.2 (73.6 a 91.8)
10.0 (0.25 a 404.5)
96.67 (88.4 a 99.5)
33.3 (4.75 a 83.3)
85.5 (83.9 a 88.8)
ELISA TRP36Br
88.5 (78.7 a 94.9)
20.0 (2.5 a 55.6)
100 (94 a 100)
100 88.2 (84.6 a 91.0)
Com o intuito de correlacionar os testes, e indicar qual seria o melhor no diagnóstico
da enfermidade foi realizado o cálculo de regressão logística odds ratio. Encontrou-se que
quando se associa os testes PCR e RIFI da mesma amostra, a razão de chance de encontrar
um animal positivo para Ehrlichia spp. são quatro (1/0,269) vezes maiores do que o teste de
PCR isolado (P<0.05). Para a RIFI não houve diferença, pois, o intervalo de confiança (0,229
a 1,848) inclui o valor de “1”, e isto significa que a associação não é estatisticamente
significativa, e que os resultados podem dever-se à casualidade (Figura 1).
Avaliando-se os achados do trabalho, pode-se concluir que há a existência de pelo
menos dois genogrupos de E. canis no Litoral de Santa Catarina (US e Brasileiro) e que há
outra cepa circulante no Oeste do estado. Estes resultados poderão ser úteis para mais
trabalhos na área de genotipagem e possíveis associações das cepas com a gravidade da
32
doença. Além disto, a compreensão da variabilidade antigênica de E. canis é importante para
o desenvolvimento de vacinas e/ou tratamentos mais específicos.
Figura 1. Odds ratio e intervalo de confiança da associação de testes PCR e RIFI (ouro) com
os testes diagnósticos PCR e RIFI isolados.
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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Conclui-se que sugerindo a existência de pelo menos dois genogrupos de E. canis no
Litoral de Santa Catarina (US e Brasileiro) e de outra cepa circulante no Oeste do estado.
Estes achados poderão ser úteis para mais trabalhos na área de genotipagem e possíveis
associações das cepas com a gravidade da doença. Além disto, a compreensão da
variabilidade antigênica de E. canis é importante para o desenvolvimento de vacinas e/ou
tratamentos mais específicos.
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