UNESP –

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

CURSO DE MEDICINA

Disciplina de Microbiologia

AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA

2017

ÍNDICE

LEMBRETES IMPORTANTES ..................................................................................................................... 1

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS ......................................................................................................... 1

MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA .............................................................. 3

MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO ................................. 6

CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS ................................................................................... 8

CONJUGAÇÃO BACTERIANA ................................................................................................................. 11

DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS ................................................ 13

STAPHYLOCOCCUS .................................................................................................................................. 14

STREPTOCOCCUS ..................................................................................................................................... 17

PSEUDOMONAS .......................................................................................................................................... 20

ENTEROBACTÉRIAS ................................................................................................................................. 22

1

LEMBRETES IMPORTANTES

1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o

uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em

uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do

ambiente fora do laboratório.

2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são

realizados.

3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente

(derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de

qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.).

4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.

5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.

6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que

deixe os pés expostos.

7. Não serão permitidas fotografias no interior do laboratório, salvo em caso

de autorização do docente responsável pela aula.

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório

individual da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso

da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente

deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo

menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em

seu relatório, mesmo que o entregue.

Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de

forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos

experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais

que duas folhas.

2

Docentes do Ciclo de Bacteriologia

Prof. Dr. Augusto Cezar Montelli

Prof. Dr. Josias Rodrigues

Prof. Dr. Rodrigo Tavanelli Hernandes

Profa. Vera Lúcia Mores Rall

Técnicos responsáveis pelas aulas práticas

Ivana Giovannetti Castilho

Larissa Ragozzo Cardoso de Oliveira

Luiz Henrique Alquati

3

MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA

Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das

lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram

coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas

pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração

(como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco

ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a

observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando

bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e

corada pelo método de Ziehl-Neelsen.

Coloração de Bactérias pelo Método de Gram

Material:

- Lâminas contendo o esfregaço de bactérias

- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool 95%, fucsina.

Procedimento:

a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto.

b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1

minuto.

c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool

cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os

esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o

corante dos mesmos.

d) Lavar a lâmina em água corrente.

e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1

minuto.

f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro.

g) Observar ao microscópio e desenhar na folha seguinte.

4

Desenhos:

Lâmina B (Staphylococcus aureus)

Forma:________________

Arranjo: ________________

Gram: ________________

Lâmina A (Escherichia coli)

Forma:________________

Arranjo: ________________

Gram:_________________

Lâmina C (Streptococcus agalactiae)

Forma:________________

Arranjo: ________________

Gram: ________________

5

Lâmina E (Neisseria sp)

Forma:________________

Arranjo: ________________

Gram:_________________

Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR)

(Mycobacterium tuberculosis) Lâmina contendo um esfregaço de escarro de um paciente com tuberculose, corada pelo método de Ziehl-Neelsen e apresentando BAAR

Lâmina D (Bacillus cereus)

Forma:________________

Arranjo: ________________

Gram: ________________

6

MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO

A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias

Material:

- Cultura A (Escherichia coli)

- Cultura B (Staphylococcus aureus)

- Cultura C (Streptococcus agalactiae)

- Caldo sintético

- Caldo comum

- Caldo glicosado (caldo comum acrescido de 1% de glicose)

- Alça de níquel cromo

Procedimento:

1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.

2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.

3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).

4. Anotar os resultados.

Cultura Crescimento em

Caldo sintético Caldo comum Caldo glicosado

A

B

C

B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano

Material:

- Meio de Tiogel

- Caldo simples

- Cultura A (Escherichia coli)

- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)

- Cultura F (Clostridium sp)

- Agulha de níquel cromo

7

Procedimento:

Com a agulha de níquel cromo, semear as culturas A e D em tubos de tiogel e

incubar em estufa a 37 °C. No dia seguinte, observar o crescimento das culturas

A e D juntamente com a cultura F que foi previamente semeada quando do

preparo da aula prática. Classificar cada cultura quando à dependência de

oxigênio em aeróbia, anaeróbia ou facultativa, conforme o local de seu

crescimento no tubo de tiogel (em cima, no fundo ou em toda a extensão do tubo)

Cultura Local do crescimento no tubo

Classificação Superfície Toda extensão Base do Meio

A

D

F

8

CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS

A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias

Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada

ou não.

Material

- Suspensão da cultura A (Escherichia coli, bactéria não esporulada) em solução

salina

- Suspensão da cultura E (Bacillus cereus, bactéria esporulada) em solução salina

- Placas de Petri contendo ágar nutriente e divididas em quadrantes, identificados

pelo tempo de cultivo bacteriano em minutos (0’, 5’, 10’ e 15’).

- Banho-Maria a 60º C

- Alça de Níquel cromo

Procedimento

1. Inocule (com a alça de níquel cromo) amostras das suspensões bacterianas A

e E nas respectivas placas, no quadrante correspondente ao tempo 0’.

2. Coloque, em banho-maria a 60º C, os tubos com a suspensões e, aos 5', 10' e

15', inocule novamente amostras das suspensões para os quadrantes

correspondentes nas placas.

3. Deixe as placa na estufa a 37ºC até o dia seguinte.

4. Observe a variação quantitativa de crescimento bacteriano nos quadrantes

em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a

++++, conforme a intensidade de crescimento).

Cultura Tempo de aquecimento

0’ 5’ 10’ 15’

A

E

B) Efeito de agentes químicos (antisséptico para enxague bucal)

Material:

- 3 suabes estéreis

- Antisséptico bucal de uso comercial

9

- 1 placa de ágar-nutriente, dividida em três partes (identificadas por A, B e C)

Procedimento:

1. Friccionar um suabe estéril na mucosa da bochecha e espalhar (“em

ziguezague”) seu conteúdo no quadrante A da placa de ágar nutriente.

2. Bochechar, por 1 minuto, com parte do o antisséptico bucal fornecido.

3. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material, com outro

suabe, espalhando seu conteúdo no quadrante B.

4. Bochechar novamente com o antisséptico bucal por 1 minuto.

5. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta com um novo suabe estéril espalhando

seu conteúdo no quadrante C.

6. Deixe a placa na estufa a 37°C até o dia seguinte.

7. Fazer a leitura das placas, anotando com cruzes (de + a ++++), na tabela

abaixo, a intensidade do crescimento microbiano, conforme o tempo de

exposição ao antisséptico bucal.

Tempo de exposição* A B C

Crescimento Microbiano

*Tempo de exposição ao antisséptico = A (antes do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo tratamento).

C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias (álcool iodado a 0,1%)

Material:

- 1 tubo contendo aproximadamente 1 mL de álcool iodado a 0,1%

- 1 placa de ágar-nutriente dividida em duas partes iguais, identificadas como

“antes” e “depois”

- 3 suabes estéreis

Procedimento

1. Umedeça um suabe em salina, contida em um tubo de ensaio. Após retirar o

excesso de salina, pressionando a suabe contra a parede do tubo, esfregue-a

vigorosamente no dorso de uma das mãos;

2. Passe o suabe em uma das partes da placa com ágar nutriente (“antes”);

10

3. Umedeça um segundo suabe em álcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da

outra mão;

4. Aguarde 2 minutos para que o antisséptico aja sobre a microbiota da pele;

5. Passe então, nessa área, um terceiro suabe umedecido em salina, tomando

cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Passe o suabe na superfície

da outra metade da placa com ágar nutriente (“depois”)

6. Incube a placa na estufa a 37°C, durante uma noite.

7. Observe as placas e anote a intensidade do crescimento microbiano com sinal

+ (de + a++++) na tabela abaixo

Sem álcool-iodado 0,1% Com álcool-iodado 0,1%

11

CONJUGAÇÃO BACTERIANA

Material:

- 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal), dividida em duas

partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas.

- 1 placa de ágar MacConkey contendo cloranfenicol (Clo), dividida em duas

partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas.

- 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico e cloranfenicol (Nal + Clo)

dividida em três partes, identificadas com as culturas a serem semeadas.

- Escherichia coli C600, não fermentadora de lactose (lac-) (cultura A) em meio

líquido.

- Escherichia coli J53 fermentadora de lactose (lac+) (cultura B) em meio líquido

- mistura das culturas A e B (cultura M) em meio líquido.

- alça de níquel cromo.

Procedimento:

1. Semear as culturas A e B nas partes correspondentes da placa de ágar

MacConkey contendo Nal. Fazer o mesmo na placa contendo Clo.

2. Semear as culturas A, B e M nas partes correspondentes da placa de ágar

MacConkey contendo Nal+Clo

3. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte.

4. Verificar a ocorrência de crescimento (+ ou -) e o fenótipo de fermentação de

lactose (+ ou -) das culturas que cresceram e anote os resultados na tabela

abaixo.

Cultura

Crescimento em ágar MacConkey contendo: Fermentação

da lactose Nal Clo Nal + Clo

A

B

M

12

Responda as seguintes questões:

- Quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido?

- Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos

moleculares?

Análise Molecular do Experimento de Conjugação:

Eletroforese em gel de agarose do DNA plasmidial das culturas (1 a 3), juntamente com padrão de peso molecular (1ª. amostra à esquerda).

Com base na análise da figura acima e nas informações sobre as culturas em

ágar MacConkey, identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras

empregadas nessa aula prática.

Perfil Plasmidial Cultura

1

2

3

13

DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS

Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby

Material:

- Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos

contendo antibióticos distintos, em concentrações definidas

- Régua

- Tabela de referência

Procedimento:

1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.

2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no

quadro abaixo.

Droga Concentração

(g/ml)

Diâmetro do halo de inibição do crescimento

Interpretação*

1

2

3

4

5

* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário.

14

STAPHYLOCOCCUS

1) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever

as características das colônias (cor, brilho, opacidade, tamanho, etc.) e

classificar as culturas quanto ao tipo de hemólise ( ou ).

Cultura Características das Colônias Hemólise

A

B

2) Observar lâmina com esfregaço da cultura A corada pelo método de Gram.

Desenhar. 3) Prova da Catalase

Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle (Streptococcus)

algumas gotas de água oxigenada. Observar se há formação de bolhas e

anotar abaixo o resultado (positivo ou negativo).

Cultura Catalase

A

B

Streptococcus

Cultura A

15

4) Prova da Coagulase

Princípio: A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma

sanguíneo, produzindo coágulo.

Procedimento: Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de

sangue de coelho a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 3-4 horas. Fazer o

mesmo com a cultura B e anotar os resultados, como positivo ou negativo,

segundo houver ou não a formação de coágulo.

Cultura Prova da Coagulase

A

B

5) Compilação dos resultados e identificação das culturas

Cultura Hemólise Catalase coagulase Identificação

A

B

16

Cocos Gram +

isolados ou

agrupados

Catalase

Negativa

Streptococcus

Positiva

Metabolismo

Oxidativo e Fermentativo (OF)

Staphylococcus

Coagulase

Positiva

Staphylococcus aureus

Negativa

Staphylococcus epidermidis e outros

Oxidativo (O)

Micrococcus

ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS

Staphylococcus, Streptococcus e Micrococcus

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STREPTOCOCCUS

EXERCÍCIOS

A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E.

Verificar o tipo de hemólise.

Cultura Hemólise

C

D

E

B) Observar lâminas das culturas C e E coradas pelo método de Gram.

C) Prova da catalase.

Colocar sobre a cultura C (em caldo) e sobre uma cultura controle positivo

algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e anotar o resultado

(Positivo = formação de bolhas).

Cultura Catalase

C

Staphylococcus aureus (controle +)

Cultura C Cultura E

18

D) Prova de sensibilidade à bacitracina

Princípio: Baseia-se na inibição de crescimento do Streptococcus pyogenes

(-hemolítico, grupo A) frente a uma pequena quantidade de bacitracina. A

inibição do crescimento se manifesta através de um halo ao redor do disco de

papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura a ser testada,

que é previamente espalhada sobre a superfície do ágar sangue.

Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento.

resistente: ausência de zona de inibição de crescimento.

E) Prova de sensibilidade à optoquina.

Baseada no mesmo princípio da prova anterior. Coloca-se um disco contendo

optoquina sobre uma cultura semeada em ágar sangue e incuba-se por uma

noite. No dia seguinte, verifica-se a ocorrência de um halo de inibição de

crescimento bacteriano em torno do disco contendo a droga.

F) CAMP teste

Princípio: A atividade da hemolisina do Staphylococcus aureus é aumentada

pela atividade hemolítica do Streptococcus agalactiae (-hemolítico do grupo

B). As bactérias são semeadas perpendicularmente no ágar e incubadas por

uma noite a 37ºC. Com o crescimento bacteriano, as hemolisinas de ambas as

bactérias difundem-se no ágar, de modo que no ponto onde se misturam

forma-se uma zona de hemólise mais clara e que tem o formato de uma ponta

de flecha.

G) Identificação das culturas

Cultura Identificação

C

D

E

19

19

Catalase negativos

Tipo de hemólise

Gama Beta

Bacitracina

Resistente

Streptococcus não do grupo A

Sensível

Streptococcus pyogenes (gr. A)

Alfa

Letalidade em camundongos

Negativa

Streptococcus -hemolítico

Positiva

Streptococcus pneumoniae

Bile-solubilidade

Negativa

Streptococcus -hemolítico

Positiva

Streptococcus pneumoniae

Optoquina

Resistente

Streptococcus -hemolítico

Sensível

Streptococcus pneumoniae

ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO Família: Streptococcaceae

Gênero: Streptococcus (Cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia)

20

PSEUDOMONAS

1) Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.

Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar,

também, a pigmentação verde do crescimento em ágar simples – uma

característica peculiar da espécie.

Cultura Característica das colônias

P. aeruginosa

2) Observar lâmina com esfregaço da cultura de Pseudomonas aeruginosa

corada pelo método de Gram. Observar ao microscópio e desenhar.

3) Teste de fermentação da glicose

Observar uma cultura de Pseudomonas e uma de Escherichia coli em caldo

glicosado, contendo vermelho fenol ou indicador de Andrade. Interpretar a

diferença de cor das culturas e anotar os resultados na tabela abaixo.

Cultura Cor do meio Fermentação da glicose

P. aeruginosa

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

21

4) Prova da Citocromo C-oxidase

Fazer prova da citocromo C-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com uma

cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado (positivo

ou negativo).

Cultura Prova de citocromo C-oxidase

P. aeruginosa

Escherichia coli

22

ENTEROBACTÉRIAS

1) Observar a coloração das colônias das bactérias A, B, C e D cultivadas em

placas de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de

fermentação de lactose e de produção de H2S.

Cultura Coloração da colônia em

Lactose H2S MacConkey SS

A

B

C

D

2) Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e

citrato de Simmons (conforme orientação nas páginas 24 e 25) Anotar abaixo

os resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.

Prova Cultura

A B C D

Citrato

Glicose

Gás

Urease

H2S

LTD*

Motilidade

Lisina

Indol

Lactose**

*LTD = L-triptofano desaminase ** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)

Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 26, identificar

cada uma das culturas.

Culturas: A________________________

B________________________ C________________________ D________________________

23

3) Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação

bioquímica.

Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os

soros anti - S. flexneri e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou

negativo).

Soro Cultura

B C

Anti - Shigella flexneri

Anti – Salmonella

Leitura das provas bioquímicas nos meios de EPM, MILi e Citrato de Simmons

Meio de cultura1 Cor/Aspecto Resultado Positivo para:

EPM

Amarelo na base Fermentação de Glicose

Verde na superfície 2 Desaminação de triptofano (LTD)

Preto na base H2S

Bolhas de ar Produção de gás de ferm. da glicose

Azul na base Urease

MILi

Roxo Descarboxilação da lisina (LDC)

Tubo completamente turvo

Movimento

Vermelho3 Produção de indol

Citrato de Simmons

Azul Aproveitamento de Carbono do citrato de sódio

Obs: 1Cor original dos meios: EPM e Citrato de Simmons = verde; MILi = roxo 2Resultado positivo difícil de ser identificado; as culturas da aula prática dão

resultado negativo nesta prova 3A prova de indol é feita com a adição do reativo de Kovacs

24

25

26

Perfil bioquímico e motilidade de algumas Enterobactérias

*LTD = L-triptofano desaminase

Espécie/Gênero Prova Bioquímica

Citrato Glicose Gás Urease H2S LTD* Movimento Lisina Indol Lactose

Escherichia coli - + + ou - - - - + ou - + ou - + +

Shigella flexneri - + - - - - - - + ou - -

Edwardsiella tarda - + + - + - + + + -

Salmonella sp + ou - + + - + - + + - -

Citrobacter rodentium + + + + ou - + - + - - + ou -

Klebsiella pneumoniae + + + + - - - + - +

Enterobacter + + + + ou - - - + - - + ou -

Serratia marcescens + + + ou - + ou - - - + + - -

Proteus mirabilis + ou - + + + ou - + + + - - -

Proteus vulgaris + ou - + + ou - + + + + - + -

Morganella morganii - + + ou - + - + + ou - - + -

Providencia rettigeri + + + ou - + - + + - + -