instituto agronÔmico curso de pÓs-graduaÇÃo em … · tabela 7 efeito da aplicação do indutor...

i

INSTITUTO AGRONÔMICO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E

SUBTROPICAL

EFEITO DO INDUTOR DE RESISTÊNCIA ACIBENZOLAR-S-METÍLICO

SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE BACTÉRIA ‘Candidatus Liberibacter

asiaticus’ EM PLANTAS CITRÍCAS.

DHIEGO LEANDRO DUVARESCH

Orientador: Fernando A. de Azevedo

Co-orientador: Nelson A. Wulff

Dissertação submetida como requisito

paraobtenção do grau de Mestre em

Agricultura Tropical e Subtropical, Área de

Concentração em Fitossanidade

Campinas, SP

Abril 2016

ii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... iv

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... vi

RESUMO ....................................................................................................................... vii

ABSTRACT .................................................................................................................. viii

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 3

2.1 Huanglongbing ........................................................................................................... 3

2.1.1 Etiologia do HLB .................................................................................................... 4

2.1.2 Danos do HLB sobre plantas cítricas ...................................................................... 6

2.1.3 Transmissão do agente associado ao HLB .............................................................. 7

2.1.4 Manejo do HLB ....................................................................................................... 8

2.2 Indução de resistência ................................................................................................. 9

2.3 Indutores de resistência ............................................................................................ 10

2.3.1 Acibenzolar-S-metílico (ASM) ............................................................................. 10

3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 12

3.1 Condições experimentais .......................................................................................... 12

3.2 Infecção artificial via enxertia .................................................................................. 13

3.3 Infecção via inoculação de psilídeos adultos infectivos ........................................... 14

3.4 Tratamentos Indutores .............................................................................................. 15

3.5 Avaliações ................................................................................................................ 17

3.6 Análise qualitativa através de qPCR ........................................................................ 18

3.6.1 Extração de DNA das folhas ................................................................................. 18

3.6.2 Extração de DNA de Diaphorina citri .................................................................. 19

3.6.3 Detecção de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ através de qPCR ................................... 19

3.7 Análises estatísticas .................................................................................................. 20

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 20

4.1 Experimento 1 – Infecção via enxertia ..................................................................... 20

4.1.1 Desenvolvimento de plantas .................................................................................. 20

4.1.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ ........................................................... 23

4.1.3 Evolução de sintomas associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’........ 28

4.2 Experimento II – Inoculação via psilídeos infectivos .............................................. 33

4.2.1 Desenvolvimento de plantas .................................................................................. 33

4.2.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ ........................................................... 34

4.2.3 Evolução de sintomas de HLB associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L.

asiaticus’ ......................................................................................................................... 39

4.3 Comparação entre os métodos de infecção............................................................... 42

4.4 Considerações ........................................................................................................... 43

iii

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 45

6 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 46

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Descrição dos tratamentos, doses e intervalos de aplicação do indutor de

resistência para os experimentos I e II............................................................................ 16

Tabela 2 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o diâmetro do

caule de plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores

representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. ............................... 21

Tabela 3 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de

plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores representam

a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. ................................................... 23

Tabela 4 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a da presença de

‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens infectadas através de enxertia. Total de plantas

positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e 500 dias

após o início das aplicações do indutor. Holambra, SP. ................................................. 25

Tabela 5 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento

de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’

através de enxertia. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e total),

manganês, zinco+manganês e magnésio por tratamento aos 270 dias após o início das

aplicações. Holambra, SP. .............................................................................................. 31


de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’

através de enxertia. Total de plantas com mosqueado, nevuras amareladas e super

desenvolvidas, queda significativa de folhas e sem sintomas por tratamento aos 270 dias

após o início das aplicações. Holambra, SP. .................................................................. 32


caule de plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos.

Valores representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. .................. 33

Tabela 8 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de

plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Valores

representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. ............................... 34

Tabela 9 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a presença de

‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens inoculadas através de psilídeos infectivos. Total de

plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e

440 dias após o início das aplicações. Holambra, SP. .................................................... 35

Tabela 10 Porcentagem de mortalidade de psilídeos adultos e resultado em qPCR

para ‘Ca. L. asiaticus’ (amostragem de insetos provinientes de duas repetições por

tratamento) após o período de inoculação em campo, aos 5, 60, 120, 180 e 240 dias após

início das aplicações. Holambra, SP. .............................................................................. 36

Tabela 11 Dados de temperatura (°C) para os meses de inoculação de psilídeos:

valores médios mensais, obtidos através do banco de dados do local do experimento.

Holambra, SP. ................................................................................................................. 38


de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’

através de psilídeos infectivos. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e

total), manganês, zinco+manganês e magnésio por tratamento aos 270 dias após o início

das aplicações. Holambra, SP. ........................................................................................ 40

v


de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’

através de psilídeos infectivos. Total de plantas com mosqueado, nervuras amareladas e

super desenvolvidas, queda significativa de folhas e sem sintomas por tratamento aos

270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP. .................................................... 41

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Corte longitudinal ilustrando sintoma do HLB em fruto: filetes alaranjados

na columela, partindo da região de inserção com o pedúnculo. ....................................... 7

Figura 2 Ovos (A), ninfas (B) e adultos (C) de Diaphorina citri (Fonte: USDA). .......... 8

Figura 3 Área experimental, Holambra-SP. ................................................................... 13

Figura 4 Descrição de estádios fenológicos de vegetação em citros (Fonte:

Stoller®).... ..................................................................................................................... 15

Figura 5 Sintomas associados ao HLB observados durante a condução dos

experimentos. (A) mosqueado, (B) nervura amarelada e espessa, (C) deficiência de

zinco leve, (D) deficiência de zinco média, (E) deficiência de zinco severa, (F)

deficiência de manganês, (G) deficiência de magnésio e (H) sem sintomas. ................. 18

Figura 6 Estrutura química do BTH (A) e ASM (B) (Fonte: Sigma Aldrich® e

Syngenta®). .................................................................................................................... 27

Figura 7 Evolução de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’. Número de

plantas Las+ acumuladas na população do experimento com infecção via enxertia e via

psilídeos aos 60, 120, 180, 270, 360 e 440/500 dias após início das aplicações

(Holambra, SP). .............................................................................................................. 42


plantas Las+ acumuladas nas testemunhas (Las- e Las+) do experimento com infecção

via enxertia e via psilídeos ao longo do tempo, onde (NS) representa diferença não

significativa e (*) significativa. Holambra, SP. .............................................................. 43

vii

Efeito do indutor de resistência acibenzolar-S-metílico sobre o desenvolvimento de

bactéria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas.

RESUMO

O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de suco de laranja. No entanto, o

aumento de pragas e doenças tem colocado em risco sua hegemonia. O huanglongbing

(HLB), causado predominantemente pela bactéria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ -

Las, é a doença mais destrutiva no Brasil. O manejo do HLB é realizado através do plantio

de mudas sadias, controle do inseto vetor, o psilídeo Diaphorina citri e da erradicação de

plantas sintomáticas. Entretanto, essas ações não estão impedindo o avanço da doença.

Novos métodos de controle são demandados. Um trabalho realizado recentemente,

evidenciou que o indutor de resistência acibenzolar-S-metílico (ASM) diminuiu o número

de plantas infectadas por ‘Ca. L. asiaticu’s em condições experimentais controladas.

Portanto, o presente estudo teve como objetivo quantificar o efeito de aplicações foliares

sequenciais de ASM na presença de ‘Ca. L. asiaticus’ através da PCR em tempo real

(qPCR) em plantas de um ano de idade recém enxertadas com borbulhas contendo ‘Ca.

L. asiaticus’ e em plantas inoculadas com psilídeos infectivos, mantidos em condições de

campo. No experimento via enxertia, aos 270 dias após o início dos tratamentos houve

diferença significativa para os tratamentos com 50 mg i.a. planta-1 (intervalo de 30 dias)

e 100 mg i.a. planta-1 (intervalo de 45 dias), atingindo 79 e 60 % de eficiência em

manifestação da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ por qPCR, respectivamente, quando

comparados à testemunha positiva. A transmissão de Las via psilídeos apresentou baixa

eficiência, não permitindo discorrer sobre o efeito de ASM na população do patógeno

quando transmitido pelo vetor. Os resultados trazem nova confirmação do efeito do ASM

em plantas cítricas jovens infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia,

adicionando informações para plantas mantidas em condições em campo. Considerando-

se o avanço da doença no cenário atual da citricultura brasileira e a importância sócio-

econômica da cultura, é evidente a importância e a necessidade do aprofundamento do

tema indução de resistência, bem como de outras tecnologias que possam agregar ao

manejo do HLB em citros.

Palavras-chave: indução de resistência, Bion, huanglongbing, Diaphorina citri.

viii

Effect of the resistance inducer acibenzolar-S-methyl on the development of

‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus.

ABSTRACT

Brazil is the major producer and exporter of orange juice in the world. However, the

increase of pests and diseases have been threatening its hegemony. Huanglongbing (HLB)

in citrus, mainly associated to the bacteria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ - Las, is

the most destructive disease in Brazil. Its management is based on use of healthy

seedlings, vector control (psyllid Diaphorina citri) and erradication of symptomatic

plants. These actions are not enough to stop the HLB spread, demanding new alternatives

of control. It was observed that the resistance inducer acibenzolar-S-methyl (ASM)

reduced the number of infected plants by ‘Ca. L. asiaticus’ in controlled experimental

conditions (AGNELLI, 2011). The present study had the objective to quantify the effect

of foliar applications of ASM against ‘Ca. L. asiaticus’ through real time PCR (qPCR) in

young citrus plants, grafted with tissue contaminated with ‘Ca. L. asiaticus’ or inoculated

with psyllid carrying ‘Ca. L. asiaticus’. The grafting trial showed a significant difference

at 270 days after beginning of applications in the treatments 50 mg a.i. plant-1 (30 days

interval) and 100 mg a.i. plant-1 (45 days interval), reaching 79 e 60 % of effiency over

the manifestation of presence of ‘Ca. L. asiaticus’ respectively, when compared to the

infected untreated check. The efficiency in transmission through psyllids was very low,

not allowing to conclude about the ASM effects on Las by using this methodologyof

transmission. The grafting results bring confirmation of the effect of ASM in young citrus

plants, adding information to field conditions. Considering the development of HLB in

the current Brazilian scenario and the social-economic relevance of citrus business,

becomes evident the need of more studies to better understand the resistance induction

against HLB in order to validate its use by growers, as well for other technologies that

could contribute to the disease complex management.

Key-words: resistance inducer, Bion, huanglongbing, Diaphorina citri.

1

1 INTRODUÇÃO

O setor agroindustrial citrícola brasileiro apresenta números que impressionam.

Em nenhum outro produto de exportação do agronegócio o país tem expressividade

semelhante. De cada cinco copos de suco de laranja consumidos no mundo, três são

produzidos nas fábricas brasileiras. O país detém atualmente mais da metade da produção

mundial de suco de laranja, sendo 98% destinados à exportação. Os Estados da Flórida

(EUA) e São Paulo (Brasil) detêm mais de 80% da produção mundial de suco (NEVES

et al., 2010).

A área de pomares de citros no principal cinturão citrícola brasileiro totaliza

482.591 hectares e está distribuída em municípios no estado de São Paulo, Triângulo

Mineiro e Sudoeste de Minas Gerais. Em 2015, foram quase 175 milhões de árvores

produzindo na região, e na Flórida, seu principal concorrente, em torno de 53 milhões

(FUNDECITRUS, 2015a; USDA, 2015).

O aumento de pragas e doenças tem colocado em risco a hegemonia do Brasil

nos últimos anos. Dentre os principais entraves fitossanitários, o huanglongbing (HLB) é

a mais destrutiva doença da citricultura devido à severidade dos sintomas, rapidez com

que se dissemina entre plantas cítricas e entre pomares, e também pela falta de resistência

genética no gênero Citrus.

O HLB não provoca a morte biológica das plantas, mas, com o passar dos anos,

elas se tornam debilitadas e improdutivas. Pomares adultos podem ficar inviáveis

economicamente dentro de sete a dez anos após o aparecimento da primeira planta

sintomática se medidas de controle não forem adotadas (GOTTWALD et al., 2007). A

partir do ramo infectado, a bactéria coloniza a planta afetando o fluxo e a distribuição de

fotossintatos no floema. Plantas jovens infectadas não produzem de forma viável

(FUNDECITRUS, 2008).

Plantas afetadas exibem folhas mosqueadas (clorose assimétrica) e folhas com

sintomas similares aos provocados por deficiências minerais, particularmente de zinco,

manganês e ferro. Ocorre também a deformação dos frutos, abortamento de sementes,

queda de folhas e frutos e morte de brotações (GRAÇA, 1991). No Brasil, o HLB está

associado a duas espécies de bactérias bastonete Gram negativas denominadas

‘Candidatus (Ca) Liberibacter (L.) asiaticus’ e ‘Ca. L. americanus’ e a um fitoplasma do

grupo IX (Teixeira et al., 2009). Ambas as liberibactérias são transmitidas por enxertia

de ramos infectados (Lin, 1963; LOPES & FRARE, 2008) e pelo vetor Diaphorina citri

(Hemiptera: Psyllidae) (CAPOOR et al., 1967; GASPAROTO et al., 2010).

2

Não há métodos de controle curativo para o HLB que possam ser usados nos

pomares, de modo que prevenir a infecção das plantas é fundamental no controle da

doença. Para o manejo é preconizada a utilização de mudas sadias, inspeção de pomares

acompanhada de erradicação das plantas infectadas, eliminação de hospedeiros e controle

rigoroso do vetor através do monitoramento e aplicação de inseticidas (BOVÉ, 2006).

Entretanto, o conjunto de ferramentas disponível para o manejo do HLB não

impediu o avanço da doença nos últimos anos. No Estado de São Paulo, o HLB foi

responsável pela eliminação de 42,6 milhões de plantas entre 2007 e 2015 de acordo com

a Coordenadoria de Defesa Agropecuária. Entre 2005 e 2012, houve um replantio de 1,2

milhão de plantas cítricas (FUNDECITRUS, 2013). Em seu levantamento mais recente,

o Fundecitrus aponta que 17,89% das laranjeiras do parque citrícola de São Paulo e das

regiões do Triângulo e Sudoeste de Minas Gerais apresentam sintomas de HLB. O

número corresponde a 35 milhões de plantas doentes no campo. Destas, 44% apresentam

sintomas severos, com perdas de produção ao redor de 50%. Em algumas regiões do

Estado de São Paulo, a incidência de plantas sintomáticas é mais expressiva, chegando a

42,5% (FUNDECITRUS, 2015b).

Frente aos danos potenciais dessa doença e dificuldade de controle, o setor

citrícola busca novos métodos de controle que sejam eficazes e menos agressivos ao meio

ambiente e à saúde humana. A indução de resistência na planta é um método de controle

não convencional, mas que apresenta potencial para o controle do HLB como uma

ferramenta adicional ao manejo integrado de medidas de controle.

A indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes

existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos

(CAVALCANTI et al., 2005). Os agentes indutores capazes de ativar ou induzir respostas

de resistência nas plantas são chamados de eliciadores ou indutores, podendo apresentar

natureza química variada (SMITH, 1996).

Estudos recentes (AGNELLI, 2011), sob condições controladas e utilizando-se

inoculação por meio de enxertia de borbulhas provenientes de ramos sintomáticos de

plantas afetadas pelo HLB, indicaram que o indutor de resistência acibenzolar-S-metílico

(ASM), comercializado como Bion®, retardou o aparecimento de plantas cítricas

infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’.

A eficácia do agente indutor está relacionada com os metabólitos de defesa

produzidos pela planta, como proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-RP) – dos

tipos quitinases e glucanases (BONALDO et al., 2015) e que, por sua vez, estão

associados com a quantidade do composto indutor fornecido à planta. Nesse sentido,

3

estudos sobre doses e intervalos entre aplicações são fundamentais para que sejam obtidos

resultados adequados com o indutor de resistência.

Os resultados de AGNELLI (2011) indicam que o uso do ASM pode ser

promissor na indução de resistência contra infecção por ‘Ca. L. asiaticus’. Acredita-se

que a indução de resistência com o uso do ASM possa ser uma opção para o controle

preventivo do HLB em condições de infecção natural, através do seu vetor Diaphorina

citri, uma vez que esse, possivelmente, contem uma menor quantidade de bactéria em

comparação a borbulhas infectadas provenientes de ramos assintomáticos. Abaixo de uma

determinada concentração da bactéria é possível que as plantas resistam e que seus

mecanismos de defesa possam conferir proteção contra as infecções (PELZ-STELINSK

et al., 2010).

No presente contexto, as seguintes hipóteses foram consideradas: (i) aplicações

foliares sequenciais com o indutor de resistência ASM inibem ou retardam o

desenvolvimento de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas e (ii) o efeito de ASM

sobre a desenvolvimento de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas depende da

combinação entre dose e intervalo utilizados.

Dessa forma, objetivou-se com o presente trabalho, quantificar o efeito de

aplicações foliares sequenciais de ASM, em diferentes doses e intervalos, sobre os

sintomas e o desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens infectadas através

de enxertia de borbulhas infectadas e psilídeos infectivos, em condições de campo.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Huanglongbing

O HLB é uma doença que afeta severamente a cultura dos citros, ameaçando sua

viabilidade econômica. É conhecido na China há mais de cem anos, tendo sido relatado

pela primeira vez em 1919 com esse nome (huanglongbing), que significa “doença do

ramo amarelo” (REINKING, 1919; LIN, 1956). No continente africano, uma doença com

sintomas similares foi descrita em 1937, com o nome de greening (VAN DE MERWE &

ANDERSON, 1937). Nos diversos países asiáticos onde ocorre, o HLB está associado à

presença da bactéria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, enquanto que, no continente

africano, à presença de Ca. L. africanus. Nas Ilhas Reunião e Maurício foram detectadas

as duas espécies de liberibacter (GARNIER & BOVÉ, 1996).

4

No Brasil, o HLB foi relatado em 2004, estando inicialmente restrito a 35

municípios na região central do Estado de São Paulo. A maior parte das amostras

sintomáticas analisadas em 2004 estava infectada por Ca. L. americanus, uma nova

espécie de liberibacter identificada e caracterizada no final daquele ano (COLETTA-

FILHO et al., 2004; TEIXEIRA et al., 2005a; TEIXEIRA et al., 2005b; TEIXEIRA et al.,

2005c).

A proporção entre as espécies de liberibacters associadas ao HLB inverteu-se a

partir de meados de 2006: em 2009 cerca de 96% das 11.000 amostras analisadas pelo

Fundecitrus para a ocorrência de HLB estavam associadas à presença de ‘Ca. L.

asiaticus’, mostrando a melhor adaptação desta espécie às nossas condições (TEIXEIRA

et. al., 2010).

Hoje o HLB está disseminado em todas as regiões citrícolas do Estado de São

Paulo, e também está presente nos Estados de Minas Gerais e Paraná. Em São Paulo, a

porcentagem de blocos ou talhões afetados e de incidência de plantas aumentou de 18,6%

e 0,6% em 2008 para 53,3% e 3,8% em 2011, e para 64,1% e 6,9% em 2012,

respectivamente (LOPES et al., 2013). Em seu levantamento mais recente, o Fundecitrus

aponta que 17,89% das laranjeiras do parque citrícola de São Paulo e das regiões do

Triângulo e Sudoeste de Minas Gerais têm HLB, sendo que em algumas regiões do Estado

de São Paulo, a incidência de plantas sintomáticas é mais expressiva, chegando a 42,5%

(FUNDECITRUS, 2015b).

2.1.1 Etiologia do HLB

Antes da adoção do termo chinês huanglongbing (doença do ramo amarelo)

como nome oficial da doença, a mesma recebeu diversas denominações de acordo com o

local de ocorrência dos sintomas como greening (inversão de cores na fase de

amadurecimento dos frutos) na África do Sul, dieback (seca de ponteiros) na Índia,

phloem degeneration (necrose do floema ou degeneração do floema) na Indonésia, likubin

(declínio) em Taiwan e leaf mottling (folha mosqueada) nas Filipinas (BOVÉ, 2006).

Em 1956, Lin Kung Hsiang, professor da Universidade de Guangzhou na China,

obteve sucesso na transmissão da doença por enxertia, provando ser a mesma de origem

biótica ou infecciosa (LIN, 1956). Até o final dos anos 60, o agente do HLB era

considerado ser de origem viral. Entretanto, em 1970, LAFLECHE & BOVÉ, através de

microscopia eletrônica, relataram a presença de um procarioto nos vasos do floema de

plantas de laranja doce que apresentavam sintomas de HLB (TEIXEIRA et al., 2010). Em

5

1984, por meio de estudos de microscopia eletrônica, identificou-se a membrana celular

interna e externa nestes procariotos, o que possibilitou a caracterização definitiva como

bactérias Gram-negativas (GARNIER et al., 1984).

Caracterizações adicionais vieram com o sequenciamento de regiões gênicas do

cluster rplKAJL-rpoBC (operon ribosomal β), que mostrou que as bactérias do HLB

possuíam a mesma estrutura gênica para este locus presente em Eubactérias

(VILLECHANOUX et al., 1993). A caracterização detalhada foi estabelecida com a

obtenção do gene ribosomal 16S (16SrDNA) do isolado asiático de Poona (Índia) e

africano de Nelspruit (África), o que colocou as liberibacters em um grupo distinto dentro

do grupo das alfa-proteobactérias, dentro da ordem das rizobactérias (Rhizobium spp.,

Agrobacterium spp., Bortadella spp. e outras) (JAGOUEIX et al., 1994; JAGOUEIX et

al., 1996; JAGOUEIX et al., 1997).

Com a caracterização molecular e ferramentas apropriadas de detecção (sondas

para hibridação e primers para PCR), a identificação de plantas com liberibacter deixou

de ser efetuada somente pela microscopia eletrônica de transmissão e um número maior

de amostras pôde ser avaliado. Desta maneira, as liberibacters foram extensivamente

associadas a plantas apresentando sintomas de HLB, sendo assim consideradas a causa

primária da doença, mesmo que para a confirmação da etiologia do HLB seja necessário

o isolamento, cultivo da bactéria e a reprodução dos sintomas (SECHLER et al., 2009),

para a conclusão dos postulados de Koch.

Três espécies de Ca. Liberibacter estão associadas ao HLB dos citros, ‘Ca.

Liberibacter africanus’, ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ e ‘Ca. Liberibacter americanus’,

sendo que as duas últimas ocorrem no Brasil (COLETTA-FILHO et al., 2004; TEIXEIRA

et al., 2005a; TEIXEIRA et al., 2005b; TEIXEIRA et al., 2009).

Além das liberibacters, dois casos envolvendo a associação de sintomas do HLB

com fitoplasmas foram confirmados nos últimos anos. Em ambos os casos, o vetor desses

fitoplasmas não é conhecido. No Brasil, no final de 2007, foi confirmada a associação de

um fitoplasma do grupo 16SrDNA-IX com plantas de citros exibindo sintomas típicos de

HLB. Com base na caracterização de genes verificou-se que este fitoplasma exibe 99%

de identidade com o representante do grupo Pigeon Pea Phytoplasma (TEIXEIRA et al.,

2008c). Este grupo de fitoplasmas possui representantes de ocorrência na América, porém

são pouco estudados quanto a características genéticas, vetores e gama de hospedeiros.

Em 2009, um fitoplasma similar ao ‘Candidatus Phytoplasma asteris’,

pertencente ao grupo 16SrDNA-I, foi associado aos sintomas do HLB na China, sendo

6

encontrado isoladamente ou associado a ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas cítricas (CHEN et

al., 2009).

As informações acumuladas ao longo dos anos sugerem a existência de uma

associação causal entre liberibactérias e HLB, apesar de outros organismos, como é o

caso dos fitoplasmas, também estarem associados a sintomas idênticos aos do HLB em

plantas cítricas (TEIXEIRA et al., 2010).

2.1.2 Danos do HLB sobre plantas cítricas

O início do aparecimento de sintomas em plantas com HLB é caracterizado pela

presença de um ou poucos ramos com folhas amareladas, geralmente em poucas plantas

no pomar. As folhas contidas nesses ramos perdem parte da coloração verde,

apresentando-se amarelas e verdes, sem uma delimitação clara entre essas duas cores.

Esse tipo de sintoma é chamado de “mosqueado” ou blotchy mottle. Esse é o sintoma

mais característico de plantas com HLB, tendo sido observado em todos os locais nos

quais a doença foi descrita até hoje, independentemente do agente causal, do hospedeiro

e da condição ambiental. Há assimetria entre essas regiões de coloração diferente

assemelhando-se aos lados opostos do limbo foliar, definidos pela nervura central

(BOVÉ, 2006).

Frutos também podem apresentar assimetria, tamanho reduzido e ficam

incompletamente maduros. Cortando-o no sentido longitudinal, é possível verificar

internamente filetes alaranjados na columela, que partem da região de inserção com o

pedúnculo (Figura 1). O albedo, em alguns casos, apresenta uma espessura maior do que

a de um fruto sadio. Também ocorre queda intensa e precoce dos frutos. As sementes

geralmente abortam, ficam pequenas, mal formadas e de coloração escura. Com o

progresso dos sintomas, aumenta a proporção de frutos sintomáticos e caídos. A redução

na produção de frutos pode ser de até 100%, dependendo da proporção da copa afetada e

da idade da planta (BASSANEZI et al., 2006).

7

Figura 1 Corte longitudinal ilustrando sintoma do HLB em fruto: filetes alaranjados

na columela, partindo da região de inserção com o pedúnculo.

Além da queda precoce, frutos sintomáticos são menores e apresentam-se mais

ácidos e com menor teor de sólidos solúveis, porcentagem e qualidade de suco

(BASSANEZI et al., 2006). Os sintomas podem ser vistos durante o ano todo, mas

aparecem com mais frequência nas estações de outono e inverno.

2.1.3 Transmissão do agente associado ao HLB

As três espécies de Ca. Liberibacter que ocorrem nos citros podem ser

transmitidas através de material vegetal infectado via enxertia (BOVÉ, 2006). A

transmissão via enxertia de tecidos infectados apresenta resultados variáveis dependendo

da espécie de Liberibacter. Nesse caso, ‘Ca. L. asiaticus’ é mais facilmente transmitida

para plantas cítricas do que Ca. L. americanus (LOPES et al., 2009a).

Naturalmente, a disseminação ocorre planta a planta nos pomares através de

psilídeos. O inseto adquire a bactéria quando se alimenta em plantas doentes e, uma vez

infectado, permanece assim toda sua existência. Duas são as espécies de psilídeos

associadas à transmissão de ‘Ca. Liberibacter spp.’: Diaphorina citri, de ocorrência na

Ásia e Américas, e Trioza erytreae, presente na ÁfriCa. A D. citri transmite as espécies

asiática e americana de liberibacter (CAPOOR et al., 1967; YAMAMOTO et al., 2006),

8

enquanto T. erytreae transmite a espécie africana (MCCLEAN & OBERHOLZER,

1965).

D. citri é um inseto de coloração cinza, com manchas escuras nas asas que mede

de 2 a 3 mm de comprimento (Figura 2) e que pode na sua fase adulta viver de 3 a 4

meses. O inseto se aloja em todas as variedades cítricas e na murta (Murraya paniculata).

Na fase adulta, é encontrado nas folhas e ramos com uma inclinação de 45º, o que ajuda

no seu reconhecimento. Há ocorrência do inseto durante o ano inteiro, mas a sua

população é maior durante o período de brotações da planta cítrica (FUNDECITRUS,

2009).

Figura 2 Ovos (A), ninfas (B) e adultos (C) de Diaphorina citri (Fonte: USDA).

No Brasil, ‘Ca. L. asiaticus’ é a espécie que prevalece em associação com o

HLB. No Estado de São Paulo, a doença se espalhou mais lentamente em regiões com

verão de temperaturas relativamente mais elevadas, como as regiões norte e nordeste do

Estado de São Paulo, provavelmente em função da influência do clima sobre a

multiplicação da bactéria na planta e na aquisição do agente causal pelo psilídeo. Em

condições controladas, LOPES et al. (2013) constataram que a multiplicação de ‘Ca. L.

asiaticus’ e aquisição do patógeno por D. citri foi inferior em plantas mantidas sob regime

de temperaturas mais elevadas (24 a 38 °C) do que em plantas mantidas sob regime de

temperaturas mais baixas.

2.1.4 Manejo do HLB

9

Não existem métodos curativos para o HLB e o controle preconizado baseia-se

na exclusão das fontes de inóculo através do plantio de mudas sadias, da eliminação de

plantas sintomáticas e do controle do inseto vetor. Adicionalmente, recomenda-se a

eliminação de hospedeiros alternativos, como as murtas (Murraya paniculata)

(BELASQUE JUNIOR et al., 2009).

O controle químico do vetor é a medida de controle mais facilmente adotada pelo

citricultor. É um método que requer uso intensivo e constantes aplicações de inseticidas,

que impactam no custo de produção. No entanto, questiona-se se apenas a adoção de

controle químico seria capaz de controlar doenças com vetores, pois embora o uso de

inseticidas seja uma ferramenta eficaz no controle do inseto vetor, somente a redução da

população de D. citri no campo não tem contribuído para a diminuição da disseminação

do HLB.

De acordo com FUNDECITRUS (2015b), em comparação com o levantamento

até a safra de 2012, a incidência de plantas com HLB aumentou em 159%. A evolução

indica que o citricultor deve ser rigoroso na adoção das medidas de manejo da doença no

seu pomar e em áreas vizinhas, com controle sistemático do inseto transmissor e

eliminação de plantas doentes.

Os danos potenciais dessa doença e dificuldade de controle trazem a necessidade

de busca por novos métodos de controle que, além de eficazes, sejam menos agressivos

ao meio ambiente e à saúde humana.

2.2 Indução de resistência

A resistência induzida consiste no aumento da expressão da resistência por meio

da utilização de agentes externos (indutores), sem qualquer alteração do genoma da

planta, ocorrendo de maneira não específica, através da ativação de genes que codificam

diversas respostas de defesa, como proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-RP),

por exemplo, quitanases e glucanases; enzimas envolvidas na rota de síntese de

fitoalexinas, como a fenilalanina amônia-liase; acúmulo de lignina em tecidos

circunvizinhos ao local de penetração de microrganismo, entre outras (CAVALCANTI

et al., 2005).

Em função da rota de sinalização que leva a expressão das defesas, a indução de

resistência pode ser dividida em resistência induzida que contém o ácido salicílico (AS)

como principal sinalizador, sendo denominada de resistência sistêmica adquirida ou SAR

(do inglês – systemic acquired resistance) (MAUCH-MANI; MÉTRAUX, 1998), e como

10

resistência sistêmica induzida ou ISR, quando os sinalizadores principais independem do

AS (BOSTOCK, 2005). Porém, para se evitar confusões, muitos autores preferem usar o

termo geral indução de resistência (IR) (KUHN et al., 2006).

A IR apresenta como vantagens a efetividade contra vírus, bactérias, fungos e

nematóides; estabilidade devido à ação de diferentes mecanismos de resistência; caráter

sistêmico, persistente e natural quanto à proteção; economia de energia metabólica e

utilização do potencial energético para resistência em todas as plantas susceptíveis

(PASCHOLATI, 2002). Como desvantagens, é uma resistência parcial e que pode

requerer reativações temporárias. Por outro lado, por ser parcial e inespecífica, a

resistência induzida não impõe pressão de seleção sobre o patógeno, dificultando, assim,

a quebra de resistência (SILVA & RESENDE, 2001).

2.3 Indutores de resistência

A busca por sistemas de produção que possam conciliar alta produtividade com

a redução de impactos negativos sobre o meio ambiente é essencial para o alcance da

sustentabilidade da citricultura. Neste contexto, a ativação dos mecanismos de resistência

das plantas deixando que ela própria se proteja contra patógenos é uma estratégia

desejável para o futuro.

Entende-se como agente indutor de resistência qualquer composto ou fator capaz

de ativar mecanismos de defesa na planta. São considerados eliciadores ou elicitores

moléculas que estimulam qualquer resposta de defesa nas plantas podendo ser

classificados, quanto à origem, em bióticos e abióticos (CAVALCANTI et al., 2005).

Indutores bióticos são organismos vivos ou partes destes capazes de ativar

respostas de defesa localizadas ou de maneira sistêmica em plantas. Bactérias, fungos,

vírus, nematoides e insetos são alguns exemplos (DUKE et al., 1987). Indutores abióticos

podem ser classificados em indutores físicos, como temperatura e radiações ultravioletas,

e em indutores químicos como o ácido salicílico (AS), acibenzolar-S-metílico (ASM),

ácido jasmônico, entre outros (CAVALCANTI et al., 2005).

2.3.1 Acibenzolar-S-metílico (ASM)

Avanços nas pesquisas envolvendo a indução de resistência em plantas vêm

sendo acompanhados pelo surgimento de produtos comerciais, como o Bion, Messenger,

Elexa, Orizamate e Oxycom.

11

O acibenzolar-S-metílico (ASM) é o composto mais estudado e mais eficiente

como ativador de genes que codificam a resistência de plantas (MORAES, 2006). Esse

composto tem se mostrado mais eficiente na indução de resistência quando comparado

ao AS e ao ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA), além de apresentar baixa fitotoxidez

(GORLACH et al., 1996; KUNZ et al., 1997).

A duração da resistência induzida desencadeada por ASM afeta o progresso da

doença em função da produção de compostos associados à defesa na planta. O ASM,

derivado benzotiadiazólico, é um composto sintético análogo funcional do ácido

salicílico. Da mesma forma que o ácido salicílico (AS), o ASM atua como ativador

químico de resistência, fornecendo proteção contra o mesmo espectro de patógenos e

ativando a expressão dos mesmos genes que atuam principalmente na produção de

proteínas-RP (CAVALCANTI et al., 2005).

PARKINSON et al. (2015), estudando a eficiência de ASM sobre o

desenvolvimento de Passionfruit woodiness virus (PWV) e sobre a atividade de proteínas

relacionadas a patogênese em maracujazeiro, demonstrou o aumento da atividade de

quitinase e β-1,3-glucanase em folhas tratadas com ASM e subsequente inoculação.

Entende-se que há necessidade de harmonização entre doses e intervalos entre

aplicações de um indutor de resistência para que se obtenha uma adequada indução na

planta. A importância desta harmozinação foi demonstrada por HUANG et al. (2012) em

estudo sobre o controle de Xanthomonas spp em tomateiro através do indutor de

resistência ASM. PARKINSON et al. (2015), comparando concentrações de 0,10 e 0,05

g do ingrediente ativo ASM por litro, verificaram maior atividade dessas proteínas em

folhas tratadas com a menor concentração de ASM. Esses trabalhos mostram que nem

sempre se obtém um incremento na indução de resistência através do aumento de doses,

e que há necessidade de estudos de doses e intervalos entre aplicações para a validação

do uso de indutores de resistência no manejo de doenças em cada cultura.

As interações Tobbaco mosaic virus, Cercospora nicotianae, Phytophthora

parasitica, Erwinia carotovora e Pseudomonas syringae pv. tabaci em fumo; Erysiphe

graminis em trigo; infecções bacterianas em pimentão; e Xanthomonas vesicatoria em

tomate são alguns exemplos de sucesso do uso do ASM como indutor de resistência no

controle de doenças (KUHN et al., 2006).

No Brasil, o ASM foi registrado junto ao Ministério da Agricultura e

Abastecimento, sob o nome comercial Bion pela Syngenta Proteção de Cultivos LTDA,

para proteção contra doenças em algodoeiro, batata, cacaueiro, citros, melão, tomateiro e

feijoeiro (AGROFIT, 2015).

12

Em citros é indicado no controle da bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da

clorose variegada dos citros (CVC) (AGROFIT, 2015). A indução de resistência pelo

ASM contra o cancro cítrico (Xanthomonas citri) também é comprovada (GRAHAM &

MEYERS, 2011 e 2013; MILLER et al., 2011).

Para o HLB, ainda não há comprovação de que o ASM pode ser utilizado dentro

do manejo da doença. Todavia, AGNELLI (2011) demonstrou que o ASM retardou o

aparecimento de plantas cítricas com ‘Ca. L. asiaticus’ em condições controladas, quando

aplicado em plantas inoculadas artificialmente por meio de enxertia de borbulhas

provenientes de ramos sintomáticos de plantas afetadas pelo HLB. Acredita-se que a

indução de resistência através do ASM possa ser eficaz como controle preventivo do HLB

em condições de infecção natural, através do seu vetor, uma vez que esse, possivelmente,

contém uma menor quantidade de bactéria em comparação a borbulhas infectivas

provenientes de ramos assintomáticos.

Abaixo de um determinado título da bactéria é possível que as plantas resistam

e que seus mecanismos de defesa possam conferir proteção contra as infecções (PELZ-

STELINSK et al., 2010). Destaca-se a necessidade de estudos que avaliem a capacidade

do ASM em induzir a resistência em plantas cítricas contra o desenvolvimento ‘Ca. L.

asiaticus’ em condições de infecção mais próximas da forma natural da disseminação da

doença nos pomares.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Condições experimentais

Dois experimentos foram implementados: (i) realizado por infecção artificial via

enxertia de borbulhas provenientes de ramos de plantas ‘Candidatus Liberibacter

asiaticus’ positivas (Las+) e (II) por infecção via inoculação de psilídeos infectivos (Las+)

em ramos em desenvolvimento (brotações).

Ambos os experimentos foram conduzidos no município de Holambra-SP

(22º38’55”S 47º04’49”O), utilizando-se a variedade de copa laranjeira Pêra [Citrus

sinensis (L.) Osbeck] enxertadas sobre limoeiro cravo (C. limonia Osbeck). As plantas

foram transplantadas com espaçamento de 7m entre linhas e 2m entre plantas. O pomar

foi conduzido com sistema de irrigação por gotejo, em solo de textura média (Figura 3).

As mudas para os ensaios foram adquiridas de um viveiro comercial certificado

para produção de mudas cítricas segundo as normas da CDA (COORDENADORIA DE

13

DEFESA AGROPECUÁRIA DO ESTADO DE SÃO PAULO, 2006). Com o objetivo

de certificar que as mesmas eram sadias quanto a HLB, algumas plantas foram amostradas

e suas folhas submetidas para análise de qPCR antes de se iniciar o experimento.

Amostras resultaram em ausência de Las. Em função do uso de psilídeos no experimento

II, algumas mudas foram previamente expostas à alimentação de insetos não infectivos

para checar o efeito de resíduos de inseticidas nas mudas. A não ocorrência de

mortalidade indicaram ausência de residual significativo de inseticidas. Em ambos os

experimentos foram adquiridas mudas com três pernadas para facilitar a inoculação de

psilídeos em voal.

Figura 3 Área experimental, Holambra-SP.

3.2 Infecção artificial via enxertia

O início do experimento deu-se pela inoculação através do método da enxertia,

descrito por LOPES & FRARE (2008). Foi realizado um corte longitudinal de

aproximadamente quatro centímetros em lados opostos do caule a ser inoculado, mais ou

menos cinco centímetros acima da linha de junção do porta-enxerto com a copa. Em

seguida, um segmento de quatro centímetros de comprimento (borbulhão), com diâmetro

equivalente a 2/3 do caule da planta a ser inoculada, foi removido de ramo infectado

(Las+) e após corte longitudinal foi afixado na região do corte. Cada planta recebeu dois

borbulhões, de aproximadamente 5 mm de diâmetro e 15 mm de comprimento,

enxertados em lados opostos no caule.

14

A fixação do borbulhão foi feita por meio de fitas de plástico transparente de

dois centímetros de largura (fitilho), comumente empregadas na formação de mudas em

viveiros. O fitilho foi removido do caule 20 dias após a enxertia (após o pegamento do

enxerto), quando as mudas foram transplantadas em campo. Antes da remoção do fitilho,

as mudas foram mantidas em casa de vegetação (temperatura entre 20,4 e 26,5 °C,

umidade relativa do ar entre 70 a 75% e irrigações duas vezes ao dia) para evitar

movimentação entre o caule e a borbulha, o que poderia comprometer o pegamento da

enxertia. O controle negativo foi constituído de plantas enxertadas com borbulhões

provenientes de mudas sadias (testemunha Las-), como descrito anteriormente.

Os ramos infectados com HLB foram fornecidos pelo Centro APTA Citros

Sylvio Moreira/IAC, previamente confirmados em qPCR, infectados apenas com a

espécie ‘Ca. L. asiaticus’.

3.3 Infecção via inoculação de psilídeos adultos infectivos

Para obtenção dos psilídeos infectivos foi utilizada uma população de psilídeos

conhecida, isenta de Las, que foi confinada em plantas fontes de HLB, diagnosticadas

com ‘Ca. L. asiaticus’ através de PCR. Inicialmente, optou-se por utilizar adultos

oriundos da primeira geração da população não infectiva, criada nas plantas fontes (Las+).

Porém, foi uma metodologia que trouxe desafios significativos de implementação,

tornando-se inviável, em função do elevado número de insetos e plantas fontes demandas

frente ao número de tratamentos e repetições do experimento. Dessa forma, ao invés de

criá-los em planta fonte para as demais inoculações, optou-se em utilizar insetos adultos

expostos às plantas fontes pelo período de 20 dias. Adotou-se o período de 20 dias em

função de testes preliminares de qPCR que asseguraram ser um período suficiente para a

aquisição da bactéria pelos adultos.

As plantas fonte (Las+) foram fornecidas pelo Fundo de Defesa da Citricultura

(Fundecitrus), previamente confirmadas em qPCR e correspondentes apenas à espécie

‘Ca. L. asiaticus’. O confinamento nas plantas fontes, mantidas em casa de vegetação

(temperatura entre 23,5 e 27,5 °C, umidade relativa do ar entre 70 a 75% e irrigações duas

vezes ao dia), foi realizado em brotações de aproximadamente metade do seu

comprimento final e folhas tenras com 6 a 7 cm de comprimento (estádio V3-V5, de

acordo com a chave descritiva de estádios fenológicos de vegetação em citros da

STOLLER® - Figura 4).

15

Figura 4 Descrição de estádios fenológicos de vegetação em citros (Fonte:

Stoller®).

Durante todo o experimento, foram realizadas cinco inoculações em cada planta,

sendo o intervalo entre as mesmas de 60 dias. A primeira inoculação foi realizada aos

cinco dias após o início dos tratamentos. Foram confinados 20 psilídeos infectivos em

cada planta, permanecendo na mesma pelo período de 15 dias. Após retirados, foi

avaliada a porcentagem de mortalidade dos insetos e os mesmos foram encaminhados

para análise de qPCR para confirmação da presença de ‘Ca. L. asiaticus’. O confinamento

em campo foi realizado em ramos com folhas entre o estádio V3-V5, em algumas plantas

V7 em função da dificuldade de padronização de brotações em condições de campo. O

controle negativo constituiu-se de plantas confinadas com psilídeos não infectivos

(testemunha Las-), como descrito anteriormente.

3.4 Tratamentos Indutores

16

Os tratamentos foram aplicados via foliar (pulverizador propelido a gás

carbônico) utilizando-se um volume de 50 mL de água por planta. Foram trabalhados

quatro intervalos de aplicação: 15, 30, 45 e 60 dias. Ambos os experimentos (I e II) foram

submetidos aos mesmos tratamentos de dose e intervalo de aplicação, diferindo apenas

quanto à metodologia de inoculação de ‘Ca. L. asiaticus’. A descrição dos tratamentos

segue na Tabela 1. As testemunhas (Las- e Las+) não receberam nenhum tratamento.

Em ambos os experimentos seguiu-se um cenário preventivo para o uso do

indutor de resistência. No experimento I, a primeira aplicação foi efetuada logo após a

enxertia. Assumiu-se que: (i) há um tempo mínimo para que a união dos tecidos da planta

e da borbulha ocorra; (ii) a transmissão da bactéria da borbulha para a planta requer a

união desses tecidos; e (iii) que esse tempo de união dos tecidos é suficiente para que o

tratamento, e seu efeito indutor, anteceda a chegada da bactéria na planta. No experimento

II, o confinamento dos psilídeos foi realizado aos cinco dias após a primeira aplicação.

Foram utilizadas 14 repetições por tratamento, sendo que cada planta representou uma

parcela. O delineamento experimental foi blocos ao acaso.

Tabela 1 Descrição dos tratamentos, doses e intervalos de aplicação do indutor de

resistência para os experimentos I e II.

Tratamento Dose

(mg i.a2/planta)

Dose

(mg p.c3/planta)

Intervalo entre

aplicação (dias)

1. Testemunha Las- - - -

2. Testemunha Las+ - - -

3. ASM 500 WG¹ 25 50 15

4. ASM 500 WG 50 100 15

5. ASM 500 WG 25 50 30

6. ASM 500 WG 50 100 30

7. ASM 500 WG 100 200 30

8. ASM 500 WG 50 100 45

9. ASM 500 WG 100 200 45

10. ASM 500 WG 200 400 45

11. ASM 500 WG 50 100 60

12. ASM 500 WG 100 200 60

13. ASM 500 WG 200 400 60

¹Aplicações realizadas pelo período de 12 meses. ASM = acibenzolar-S-metílico,

ingrediente ativo do produto comercial Bion 500 WG; 2ingrediente ativo; 3produto

comercial.

17

3.5 Avaliações

Aos 60, 120, 180, 270, 360 (ambos experimentos), 440 (experimento via

psilídeos) e 500 (experimento enxertia) dias após o início dos tratamentos, a presença de

Las foi avaliada pelo método de PCR (polymerase chain reaction) em tempo real (qPCR),

identificando as plantas ‘Ca. L. asiaticus’ positivas coletando-se seis folhas por planta

(duas folhas em cada pernada). As mesmas foram encaminhadas para o laboratório do

Fundecitrus, no município de Araraquara-SP, para análise de qPCR.

Aos 440 dias foi realizada poda drástica no experimento I (via enxertia). Para

última coleta deste experimento, aguardou-se a rebrota das plantas, de modo que a coleta

de amostras ocorreu apenas aos 500 dias após o início dos tratamentos. A operação de

poda drástica foi um artifício utilizado para estimular a brotação e a multiplicação da

bactéria nos vasos do floema dos novos brotos (AGNELLI, 2011).

Durante a coleta das folhas, as plantas dos experimentos foram observadas

quanto a incidência dos seguintes sintomas: mosqueado assimétrico, nervura amarelada e

espessa, deficiência de zinco (cloroses internervais contrastantes às nervuras central e

laterais verde-escuras das folhas) leve (até 10% de cloroses no limbo foliar), média (10 a

50% de cloroses no limbo foliar) e severa (acima de 50% de cloroses no limbo foliar),

deficiência de manganês (clorose internerval - folhas jovens) e deficiência de magnésio

(clorose em forme de V – folhas velhas), por serem estes os sintomas mais comuns

associados ao desenvolvimento do HLB e que se evidenciaram durante a condução dos

experimentos. Plantas saudáveis foram classificadas como sem sintomas (Figura 5). Ao

final das avaliações notou-se significativa queda de folhas em diversas plantas, de forma

que esses dados também foram avaliados para ambos os experimentos.

18

Figura 5 Sintomas associados ao HLB observados durante a condução dos

experimentos. (A) mosqueado, (B) nervura amarelada e espessa, (C) deficiência de zinco

leve, (D) deficiência de zinco média, (E) deficiência de zinco severa, (F) deficiência de

manganês, (G) deficiência de magnésio e (H) sem sintomas.

Avaliações de diâmetro de caule (com auxílio de um paquímetro digital, 5 cm

acima da região da enxertia) e altura de plantas (régua) foram realizadas aos 0 (prévia),

180 e 360 dias após o início dos tratamentos com o objetivo de identificar e quantificar o

efeito das aplicações sobre o desenvolvimento das plantas.

3.6 Análise qualitativa através de qPCR

3.6.1 Extração de DNA das folhas

A extração de DNA das amostras foi conduzida utilizando o método do CTAB

(MURRAY & THOMPSON, 1980). Foram pesados 0,5 g de material vegetal (pecíolo e

nervura central), picado com lâmina sobre papel toalha, colocado em sacola plástica e o

macerado em homogeneizador Homex.

Após a maceração, o tampão foi transferido com pipeta Pasteur para um

microtubo de 2 mL e incubadas em banho-maria a 65 °C por um período de 30 minutos.

Após a incubação, as amostras foram centrifugadas por cinco minutos a 18.000

g e 900 μL do sobrenadante foram recuperados para outro tubo de 2 mL, onde se

adicionou o mesmo volume de clorofórmio:álcool isoamil (24:1). Após a

homogeneização, os tubos foram centrifugados a 18.000 g por mais cinco minutos.

Recuperou-se 800 μL do sobrenadante, transferindo-o a outro tubo de 1,5 mL,

sendo adicionado 480 μL de isopropanol. Após o processo, as amostras foram incubadas

19

por 30 minutos a -4 ºC para a precipitação do DNA. Após esse período, as amostras foram

centrifugadas por 20 minutos a 18.000 g, o sobrenadante descartado e o pellet

(precipitado) lavado com 900 μL de etanol 70 %, centrifugado por dez minutos a 18.000

g. Esse processo foi repetido mais um vez para obtenção de um DNA limpo de sais.

Em seguida, os tubos contendo DNA foram secos em “speed vacum” por seis

minutos e o DNA ressuspenso em 50 μL de água ultrapura e armazenado a 4 ºC.

3.6.2 Extração de DNA de Diaphorina citri

A extração do DNA das amostras foi conduzida utilizando-se o método do

CTAB (MURRAY & THOMPSON, 1980). As amostras de insetos foram maceradas,

com auxílio de um pistilo, em tubos de 1,5 mL contendo 400 μL de tampão e, em seguida,

incubadas a 65 °C por um período de 30 minutos. Após incubação, as amostras foram

centrifugadas por 5 minutos a 960 g. Foram recuperados 350 μL do sobrenadante e

adicionados a 350 μL da solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Após

homogeneização, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 15.300 g.

Posteriormente, 300 μL do sobrenadante foi transferido para novos tubos e em cada

amostra acrescentou-se 180 μL de isopropanol para precipitação do DNA através de

incubação a -20 °C por 30 minutos. Após esse período, as amostras foram centrifugadas

a 15.300 g por 20 minutos, o sobrenadante descartado e o pellet lavado duas vezes com

700 μL de etanol 70%. Esse processo foi repetido mais um vez para obtenção de um DNA

limpo de sais.

Em seguida, os tubos contendo DNA foram secos em “speed vacum” por dez

minutos e o DNA ressuspenso em 30 μL de água ultrapura.

3.6.3 Detecção de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ através de qPCR

As amostras do processo anterior foram analisadas para a detecção de presença

de ‘Ca. L. asiaticus’ através do método PCR em tempo real (qPCR), considerado mais

sensível do que o PCR convencional para a detecção de ‘Ca. L. asiaticus’ (LI et al, 2006;

TEIXEIRA et al., 2005b). Para a detecção de de ‘Ca. L. asiaticus’ foram utilizados os

oligonucleotídeos e sonda descritos por LI et al. (2006).

Para cada reação, usou-se 1 μL de DNA, Master Mix [1x], 0,5 μM dos primers

HLBas e HLBr e 0,2 μM da sonda HLBp, em um volume final de reação igual a 12 μL.

A reação de polimerase em cadeia (PCR) consistiu de desnaturação inicial por dois

20

minutos a 50 ºC, 95 ºC durante dez minutos, seguido de 45 ciclos de 15 segundos a 95 ºC

e 45 segundos a 59 ºC de anelamento e extensão. Os controles utilizados foram: sadio

(sem a presença de ‘Ca. Liberibacter spp.’), positivo (DNA com a presença de ‘Ca.

Liberibacter asiaticus’) e negativo (água – ausência de DNA).

As leituras da fluorescência foram realizadas no equipamento StepOnePlus™

Real-Time PCR System (Applied Biosystems) a cada ciclo de amplificação e,

posteriormente, analisados com o StepOne™ Software v2.3. As amostras que obtiveram

um Ct (número de ciclos de PCR necessários para que a fluorescencia ultrapasse o limiar

de detecção) abaixo de 35 foram consideradas positivas para ‘‘Ca. L. asiaticus’’.

3.7 Análises estatísticas

Para verificar a possível ocorrência de diferenças significativas entre os

tratamentos, as médias dos parâmetros quantitativos (diâmetro do caule e altura de

planta), foram submetidas a análise de variância e posteriormente, comparadas pelo teste

de Scott-Knott (5%), utilizando o software SISVAR. Para os dados qualitativos não

paramétricos (resultados qualitativos de qPCR), foi utilizado o teste do qui-quadrado de

Pearson em pares, comparando-se os tratamentos que receberam ASM com a testemunha

positiva e negativa, considerando-se o valor de P < 0,05, através do software SAS

INSTITUTE INC. (2013).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Experimento 1 – Infecção via enxertia

4.1.1 Desenvolvimento de plantas

Analisando-se os resultados de desenvolvimento de plantas pelos parâmetros

diâmetro do caule e altura de plantas, não detectou-se diferenças significativas entre os

tratamentos (Tabelas 2 e 3).

21


caule de plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores

representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.

Tratamento Dose² Intervalo³ Diâmetro do caule (mm)

4

0DAIA5

180DAIA 360DAIA %Incremento6

1. Testemunha Las- - - 9,8 11,4 19,4 98

2. Testemunha Las+ - - 9,7 11,7 18,5 91

3. ASM 500 WG¹ 25 15 9,8 11,9 18,7 91

4. ASM 500 WG 50 15 9,3 11,6 18,3 97

5. ASM 500 WG 25 30 9,6 11,7 18,5 93

6. ASM 500 WG 50 30 9,3 11,5 18,4 98

7. ASM 500 WG 100 30 9,7 12,0 18,9 95

8. ASM 500 WG 50 45 9,5 12,0 20,4 115

9. ASM 500 WG 100 45 9,5 11,7 16,9 78

10. ASM 500 WG 200 45 9,2 11,3 18,8 104

11. ASM 500 WG 50 60 8,9 11,3 19,3 117

12. ASM 500 WG 100 60 9,3 11,6 20,1 116

13. ASM 500 WG 200 60 10,3 11,7 19,9 93

Scott-Knott 5% - CV (%) 9,71 NS7

9,88 NS 17,33 NS 21,07 NS

¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4medição: 5

cm acima da enxertia; 5dias após início das aplicações; 6em relação ao tempo zero

(0DAIA); 7não significativo.

O desenvolvimento de plantas é um importante parâmetro que sempre deve ser

acompanhado em estudos com indutores de resistência. O custo fisiológico da indução de

resistência foi um tema bastante discutido em trabalhos anteriores no que diz respeito a

uma troca ou compensação entre controle da doença e reduções em produtividade

(VALLAD & GOODMAN, 2004; WALTERS et al., 2005). Resultados indicam que essa

compensação varia de acordo com espécie e condições ambientais (WALTERS et al.,

2005).

LI et al. (2016), em experimentos com diversos indutores de resistência em

condições de campo para o controle de HLB em citros, constataram efeito positivo sobre

produtividade e qualidade de frutos. Possivelmente, o resultado observado seja reflexo do

efeito positivo dos indutores, permitindo as plantas agirem suprimindo o

desenvolvimento do HLB ao longo do tempo. Os autores não observaram efeitos

22

negativos relacionados a um possível custo fisiológico da indução de resistência, fato que

infere sobre a viabilidade do uso de indutores em nível comercial, portanto sem impacto

negativo sobre a produtividade.

No presente estudo, trabalhou-se com plantas jovens por um curto período de

tempo, apenas um ano, não sendo possível a realização de avaliação de produtividade. No

Brasil, ainda faltam informações para um melhor entendimento do efeito de compensação

do ASM e outros indutores de resistência sobre produtividade de plantas cítricas ao longo

de safras.

23

Tabela 3 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de plantas

jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores representam a média

de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.

Tratamento Dose² Intervalo³ Altura de plantas (cm)

0DAIA4


1. Testemunha Las- - - 73 78 108 48

2. Testemunha Las+ - - 74 83 100 35

3. ASM 500 WG¹ 25 15 77 83 105 36

4. ASM 500 WG 50 15 76 83 98 29

5. ASM 500 WG 25 30 73 82 99 36

6. ASM 500 WG 50 30 74 81 98 32

7. ASM 500 WG 100 30 76 84 96 26

8. ASM 500 WG 50 45 79 83 115 46

9. ASM 500 WG 100 45 78 85 94 21

10. ASM 500 WG 200 45 75 82 102 36

11. ASM 500 WG 50 60 72 80 107 49

12. ASM 500 WG 100 60 74 80 104 41

13. ASM 500 WG 200 60 71 82 109 54

Scott-Knott 5% - CV (%) 9,89 NS6 9,36 NS 15,41 NS 30,19 NS

¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4dias após

início das aplicações; 5em relação ao tempo zero (0DAIA); 6não significativo.

4.1.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’

A evolução do número de plantas Las+, no ensaio I (enxertia) ocorreu de forma

pouco significativa até os 180 dias após o início das aplicações (DAIA) – dados não

mostrados. Até aquele momento, apenas uma planta Las+, dentre as 14 repetições, foi

identificada na testemunha Las+ (Tabela 4). A maioria dos tratamentos com ASM

começou a mostrar alguma manifestação de ‘Ca. L. asiaticus’, porem não houve

diferenças significativas quando comparados à testemunha Las+.

Aos 270 DAIA, a testemunha Las+ apresentou cinco plantas positivas (36 %)

para ‘Ca. L. asiaticus’. Como esperado, nenhuma planta positiva para ‘Ca. L. asiaticus’

foi identificada na testemunha Las- até aquele momento. Os únicos tratamentos que foram

significativamente iguais à testemunha Las- e distintos da testemunha Las+ foram os

tratamentos 6 e 9: 50 mg i.a. planta-1 (com intervalos de 30 dias entre as aplicações) e 100

mg i.a. planta-1 (com intervalos de 45 dias entre as aplicações), os quais apresentaram

24

apenas uma e duas plantas Las+, atingindo 79 e 60 % de eficiência em controle (fórmula

de Abbott), respectivamente, quando comparados à testemunha Las+ (Tabela 4).

Embora esses mesmos tratamentos com ASM não tenham se diferenciado

significativamente da testemunha Las+ aos 360 DAIA (Tabela 4), foram os únicos

tratamentos que se mantiveram semelhantes à testemunha Las-, mantendo uma eficiência

em controle em torno de 50% quando comparados à testemunha Las+.

Após 360 DAIA, as aplicações com ASM foram encerradas para todos os

tratamentos. Aos 440 DAIA, realizou-se poda drástica em todas as plantas com a

finalidade de estimular a brotação e a atividade da bactéria nos vasos do floema antes de

se realizar a última coleta de folhas para análise em qPCR, de acordo com AGNELLI

(2011).

Embora a testemunha Las+ tenha atingido elevada incidência (64%) de plantas

positivas para ‘Ca. L. asiaticus’ durante o experimento (Tabela 4), notou-se que não

houve efeito significativo de Las sobre o diâmetro de caule e altura de plantas (Tabelas 2

e 3), dentro do período observado.

25

Tabela 4 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens infectadas através de

enxertia. Total de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e 500 dias após o início das aplicações do indutor.

Holambra, SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

180 DAIA4 270 DAIA 360 DAIA 500 DAIA

Total5 %6 Vs7

Las-

Vs

Las+ %E8 Total % Vs Las-

Vs

Las+ %E Total %

Vs

Las-

Vs

Las+ %E Total %

Vs

Las-

Vs

Las+ %E

1. Test. Las- - - 0 - NS9 NS - 0 - NS * - 1 7 NS * - 2 14 NS * -

2. Test. Las+ - - 1 7 NS NS - 5 36 * NS - 9 64 * NS - 10 71 * NS -

3. ASM 500 WG¹ 25 15 2 14 NS NS - 8 57 * NS 0 9 64 * NS 0 10 71 * NS 0

4. ASM 500 WG 50 15 2 14 NS NS - 7 50 * NS 0 8 57 * NS 11 9 64 * NS 9


6. ASM 500 WG 50 30 1 8 NS NS - 1 8 NS * 79 4 31 NS NS 52 9 69 * NS 2



9. ASM 500 WG 100 45 1 7 NS NS - 2 14 NS * 60 4 33 NS NS 48 7 58 * NS 18

10. ASM 500 WG 200 45 0 - NS NS - 6 43 * NS 0 8 57 * NS 11 9 64 * NS 9


12. ASM 500 WG 100 60 4 29 * NS - 6 43 * NS 0 7 50 * NS 22 11 79 * NS 0


¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 dias após início das aplicações; 5total de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’

por tratamento; 6porcentagem de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento; 7análise estatística versus testemunha Las- ou Las+; 8porcentagem

de eficiência de controle (fórmula de Abbott) em relação a testemunha Las+; 9NS: não significativo e * significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).

26

Aos 500 DAIA, todos os tratamentos com ASM foram semelhantes à testemunha

Las+ e distintos da testemunha Las- para o teste do qui-quadrado de Pearson (Tabela 4).

Esses resultados descartam falhas de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através de enxertia

que poderiam justificar a menor percentagem de plantas Las+ nos tratamentos que se

destacaram neste estudo.

Em metodologia de infecção similar ao experimento I, porém trabalhando-se

com a dose de 0,8 g.L-1 (20 mg i.a.L-1) em aplicações foliares com intervalo de 20 dias, e

em casa de vegetação, AGNELLI (2011) constatou superioridade significativa entre ASM

e testemunha Las+ apenas aos 180 DAIA, atigindo o máximo de 50% de eficiência em

controle durante todo o seu experimento. A partir dos 270 DAIA, ASM se assemelhou

novamente à testemunha Las+, e ambos os tratamentos atingiram mais de 90% de plantas

Las+ ao final das avaliações (após poda drástica), da mesma forma como realizado neste

trabalho.

Sabe-se que a indução confere uma resistência parcial e que pode requerer

reativações temporárias (SILVA & RESENDE, 2001), pois a duração da resistência

induzida desencadeada por ASM afeta o progresso da doença em função da manutenção

da produção de compostos associados à defesa na planta. Os resultados obtidos aos 500

DAIA sugerem que a continuidade das aplicações com ASM, em intervalos de 30 e 45

dias nas doses de 50 e 100 mg i.a. planta-1, respectivamente, é necessária para a

manutenção da indução de resistência em plantas cítricas.

Preservando-se as devidas diferenças entre o experimento I e o trabalho

conduzido por AGNELLI (2011), nota-se que, com o passar do tempo, o número de

plantas infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’ nos tratamentos com ASM aumenta, atingindo

níveis similares à testemunha Las+. Este comportamento mostra que, sob as condições

testadas, a resposta da planta, frente a ativação por ASM, retardou a detecção da bactéria,

porém não foi capaz de eliminar ou inibir completamente a presença de Las.

Todavia, ambos os trabalhos mostram que, mesmo em condições mais agressivas

que a forma de transmissão do HLB em condições de campo, existem de fato propriedades

que dificultam a manifestação de ‘Ca. L. asiaticus’, o que evidencia o potencial de uso

do ASM como mais uma alternativa para o manejo de HLB em citros.

LI et al. (2016), em condições de campo, testando diversos indutores de

resistência para o controle de HLB em citros, constatou diminuição significativa do

crescimento da população de ‘Ca. L. asiaticus’ e redução na severidade da doença entre

15 a 30%, quando comparado a testemunha. O ácido β-aminobutírico (BABA) e 2,1,3-

benzothiadiazole (BTH) foram os tratamentos que mostraram maior estabilidade de

27

desempenho. Os resultados foram obtidos em pomares de 4 a 10 anos de idade, em plantas

sintomáticas, previamente confirmadas quanto a presença de ‘Ca. L. asiaticus’ através de

qPCR.

Embora BHT e ASM diferenciem-se em nível de estrutura química (Figura 6),

pertencem ao mesmo grupo químico (benzotiadiazol) e possuem modo de ação similar,

sugerindo que os resultados de BHT sejam mais um indicativo do potencial de ASM. As

descorbertas de LI et al. (2016) validam o potencial de uso de indutores de resistência na

estratégia de manejo do HLB e adicionam informações para um cenário curativo de

aplicação.

Figura 6 Estrutura química do BTH (A) e ASM (B) (Fonte: Sigma Aldrich® e

Syngenta®).

Durante todo o experimento não foi observado incremento em controle de ‘Ca.

L. asiaticus’ através do aumento de doses do indutor ASM. Dentre todas as combinações

testadas, apenas duas apresentaram desempenho satisfatório: 50 mg i.a. planta-1 (com

intervalos de 30 dias entre as aplicações) e 100 mg i.a. planta-1 (com intervalos de 45 dias

entre as aplicações).

O entendimento dos dados obtidos está ligado, possivelmente, aos mecanismos

envolvidos no processo de indução de resistência. O ASM atua como ativador químico

de resistência, fornecendo proteção contra patógenos através da ativação da expressão

dos genes que atuam, principalmente, na produção de proteínas-RP (CAVALCANTI et

al., 2005).

GORLACH et al. (1996), estudando o efeito de indutores de resistência sobre o

desenvolvimento de Erysiphe graminis f sp tritici em trigo, encontrou correlação positiva

entre ativação de genes (wheat chemically induced genes - WCI) e controle do patógeno

em plantas induzidas e, posteriormente, inoculadas, bem como a existência de um limiar

de ativação, ou seja, de uma dose mínima do indutor para que expressão gênica,

resistência e níveis de controle do patógeno observados fossem significativos.

28

PARKINSON et al. (2015), estudando a eficiência de ASM sobre o

desenvolvimento de Passionfruit woodiness virus (PWV) em maracujazeiro, comparou

concentrações de 0,10 e 0,05g do ingrediente ativo ASM por litro, verificando maior

atividade de proteínas-RP (quitinase e β-1,3-glucanase) em folhas tratadas com a menor

concentração de ASM, demonstrando que nem sempre se obtém um incremento na

indução de resistência através do aumento de doses, e que a intensidade de ativação de

genes ligados à resistência necessita de quantidades específicas de indutores.

A respeito de intervalos entre aplicações, os melhores resultados foram

encontrados para os intervalos de 30 e 45 dias. Para estudos de indução de resistência, a

harmonização utilizada entre dose e intervalo entre aplicações mostra-se mais relevante

do que o entendimento do efeito de doses e intervalos isoladamente. A importância desta

harmonização foi demonstrada por HUANG et al. (2012) onde, em estudo sobre o

controle de Xanthomonas spp em tomateiro através do indutor de resistência ASM, a

eficiência de ASM em campo também esteve associada à frequência e dose aplicada, não

havendo um incremento na indução de resistência através do aumento de doses.

4.1.3 Evolução de sintomas associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’

Trabalhando com HLB em plantas cítricas inoculadas através do método da

enxertia, LOPES et al. (2009a) e AGNELLI (2011), observaram os primeiros sintomas

associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’ aos 120 dias após inoculação, porém

ocorrendo de forma pouco significativa e aleatória entre os tratamentos. No experimento

I, houve maior incidência a partir dos 270 DAIA. A avaliação de 270 DAIA foi refeita

aos 360 DAIA, porém como não houve mudanças significativas de uma época para outra,

neste trabalho optou-se por registrar apenas os resultados aos 270 DAIA.

O sintoma que mais se observou no experimento foi de deficiência de zinco, o

qual foi segmentado em leve, médio e severo. No entando, em função da baixa e aleatória

incidência os dados de deficiência de zinco leve e médio não são mostrados.

Com relação ao desenvolvimento de sintomas de deficiência nutricional, apenas

para zinco intenso foram observadas diferenças significativas. Na comparação em pares

com a testemunha Las+, nenhum dos tratamentos, com exceção da testemunha Las-, se

diferenciou significativamente. Os tratamentos que se destacaram na indução de

resistência para ‘Ca. L. asiaticus’ (6 e 9) apresentaram valores mais baixos de incidência

de zinco severo, porém apenas o tratamento 6 (50mg i.a.planta-1 em intervalos de 30 dias)

foi semelhante à testemunha Las- (Tabela 5).

29

Segundo ALVARENGA (2013), essas desordens nutricionais são decorrentes de

prejuízos que a doença causa ao transporte de fotoassimilados na planta afetada pelo HLB

e consequentemente de elementos minerais das raízes para as folhas, como o

aparecimento de clorose no limbo foliar (Zn e Mn).

De acordo com VAHLING et al. (2011), o estudo do genoma da bactéria ‘Ca. L.

asiaticus’ tem revelado a presença de operons para a absorção de zinco e outros minerais,

indicando que esse pode ser um dos mecanismos de virulência ou associados aos sintomas

observados em plantas infectadas.

TIAN et al. (2014), utilizando imagem micro-XRF, observou que zinco esteve

preferencialmente localizado em tecidos do floema de folhas e caules sadios, porém

ausente em tecidos infectados, encontrando concentrações de zinco até 10 vezes maiores

em tecidos sadios. ZHANG et al. (2016) levantaram a hipótese de que sintomas

caracterizados como deficiência de zinco comumente presentes em plantas Las+ podem

resultar da absorção, pela bactéria, do nutriente do hospedeiro. Os autores, testando

diferentes doses de zinco, concluiram que embora plantas Las+ demonstrassem

deficiência de zinco, o fornecimento do nutriente aumentou os níveis no patógeno.

Possivelmente, o sequestro de zinco pelo metabolismo bacteriano seja uma explicação

para a pronunciada manifestação das deficiências severa de zinco, acompanhado à

evolução de plantas Las+ no experimento I.

O desenvolvimento do sintoma de mosqueado nas folhas, considerado como

sintoma típico e diagnóstico para a identificação da doença no campo, foi observado com

baixa freqüência e de forma não significativa, sendo esse resultado semelhante ao de

LOPES et al. (2009a) e AGNELLI (2011). O espessamento da nervura das folhas também

foi insignificante (Tabela 6).

Com a evolução dos sintomas de deficiência nutricional, em especial para o

zinco severo, ao final do experimento observou-se queda acentuada de folhas, realizando-

se também esta avaliação para todos os tratamentos. Para queda de folhas, os resultados

obtidos foram semelhantes à deficiência de zinco severa (Tabela 6).

Excluindo-se sintomas de deficiências leves (zinco, manganês e magnésio),

classificou-se cada planta em sintomática e assintomática – sem sintomas (Tabela 6).

Todos os tratamentos se diferenciaram significativamente da testemunha Las-, sendo que

a mesma apresentou 100% de suas plantas sem sintomas.

De modo geral, todos os tratamentos que receberam enxertia de borbulhas

infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’, incluindo aqueles que mais interferiram na taxa de

infecção da bactéria, exibiram os sintomas avaliados, em especial para a deficiência

30

severa de zinco. Neste sentido, houve semelhança com os resultados obtidos por

AGNELLI (2011), onde mesmo no tratamento com ASM, que foi capaz de retardar a

detecção de ‘Ca. L. asiaticus’, os sintomas avaliados apareceram. A semelhança entre

esses trabalhos sugere que os sintomas observados são em grande parte em função da

agressividade do método de inoculação adotado.

COLETTA-FILHO et al. (2009) observaram uma relação direta entre a

concentração do patógeno e a expressão de sintomas. No entanto, no presente trabalho,

avaliando-se o desenvolvimento da doença através de respostas qualitativas em qPCR,

considera-se que não foi possível estabelecer uma boa conexão entre o desenvolvimento

da doença e o desenvolvimento de sintomas, visto que muitas vezes plantas identificadas

como Las+ através qPCR não apresentavam sintomas visuais em campo, ocorrendo com

frequência o contrário. A partir desta análise, sugere-se que, sempre que possível, a

diagnose em campo seja confirmada através de análise molecular.

31

Tabela 5 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas

por ‘Ca. L. asiaticus’ através de enxertia. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e total), manganês, zinco+manganês e magnésio por

tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

Zinco (Severa) Zinco (Total) Manganês Zinco+Manganês Magnésio

Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+

1. Test. Las- - - 0 NS6 * 6 NS NS 10 NS NS 10 NS NS 1 NS NS

2. Test. Las+ - - 6 * NS 7 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 0 NS NS

3. ASM 500 WG¹ 25 15 10 * NS 12 NS NS 13 NS NS 13 NS NS 0 NS NS

4. ASM 500 WG 50 15 8 * NS 10 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 0 NS NS


6. ASM 500 WG 50 30 2 NS NS 9 NS NS 12 NS NS 12 NS NS 1 NS NS








¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las- ou

Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).

32

Tabela 6 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas

por ‘Ca. L. asiaticus’ através de enxertia. Total de plantas com mosqueado, nevuras amareladas e super desenvolvidas, queda significativa de folhas e

sem sintomas por tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

Mosqueado Nervuras Queda de folhas Sem sintomas

Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total4 Vs Las- Vs Las+ Total4 Vs Las- Vs Las+ Total4 Vs Las- Vs Las+

1. Test. Las- - - 0 NS6 NS 0 NS NS 0 NS * 14 NS *

2. Test. Las+ - - 0 NS NS 3 NS NS 6 * NS 6 * NS

3. ASM 500 WG¹ 25 15 3 NS NS 3 NS NS 9 * NS 4 * NS

4. ASM 500 WG 50 15 2 NS NS 2 NS NS 7 * NS 6 * NS


6. ASM 500 WG 50 30 0 NS NS 1 NS NS 2 NS NS 10 * NS








¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las- ou

Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).

33

4.2 Experimento II – Inoculação via psilídeos infectivos

4.2.1 Desenvolvimento de plantas

Analisando-se os resultados de desenvolvimento de plantas pelos parâmetros

diâmetro de caule e altura de plantas, não foram detectadas diferenças significativas entre

os tratamentos (Tabela 7 e 8). Todavia, assim como no Experimento I, as mesmas

considerações sobre o efeito de compensação se aplicam ao Experimento II.


caule de plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos.

Valores representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.

Tratamento Dose² Intervalo³ Diâmetro do caule (mm)

4

0DAIA5


1. Testemunha Las- - - 9,1 11,5 19,9 119

2. Testemunha Las+ - - 9,6 12,1 21,6 125

3. ASM 500 WG¹ 25 15 9,5 12,1 20,7 118

4. ASM 500 WG 50 15 9,4 12,0 20,3 116

5. ASM 500 WG 25 30 9,4 11,7 21,2 126

6. ASM 500 WG 50 30 9,5 12,5 23,1 143

7. ASM 500 WG 100 30 9,1 12,3 23,0 153

8. ASM 500 WG 50 45 9,4 11,9 21,1 124

9. ASM 500 WG 100 45 9,6 12,2 22,3 132

10. ASM 500 WG 200 45 9,0 12,3 23,2 158

11. ASM 500 WG 50 60 9,2 11,9 22,7 147

12. ASM 500 WG 100 60 9,5 12,7 22,9 141

13. ASM 500 WG 200 60 9,5 12,1 21,3 124


¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4medição: 5

cm acima da enxertia; 5dias após início das aplicações; 6em relação ao tempo zero

(0DAIA); 7Não significativo.

34

Tabela 8 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de plantas

jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Valores

representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.

Tratamento Dose² Intervalo³ Altura de plantas (cm)

0DAIA4


1. Testemunha Las- - - 75 79 109 45

2. Testemunha Las+ - - 75 81 115 53

3. ASM 500 WG¹ 25 15 77 81 107 39

4. ASM 500 WG 50 15 77 81 110 43

5. ASM 500 WG 25 30 77 82 124 61

6. ASM 500 WG 50 30 80 85 115 44

7. ASM 500 WG 100 30 79 85 126 59

8. ASM 500 WG 50 45 81 87 114 41

9. ASM 500 WG 100 45 81 84 127 57

10. ASM 500 WG 200 45 78 83 118 51

11. ASM 500 WG 50 60 79 85 123 56

12. ASM 500 WG 100 60 79 85 118 49

13. ASM 500 WG 200 60 79 84 115 46


¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4dias após

início das aplicações; 5em relação ao tempo zero (0DAIA); 6Não significativo.

4.2.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’

A eficiência de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos

foi baixa neste experimento (Tabela 9). Mesmo aos 440 DAIA, momento em que se

contabilizava 80 dias desde a última aplicação, apenas duas plantas na testemunha Las+

foi identificada como Las+. Desse modo, não foi possível discorrer sobre o efeito do

indutor de resistência ASM sobre o desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’, usando-se essa

metodologia de inoculação.

35

Tabela 9 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a presença de ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens inoculadas através de psilídeos

infectivos. Total de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e 440 dias após o início das aplicações. Holambra,

SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

180 DAIA4 270 DAIA 360 DAIA 440 DAIA

Total5 %6 Vs7 Las- Vs Las+ %E8 Total % Vs Las- Vs Las+ %E Total % Vs Las- Vs Las+ %E Total % Vs Las- Vs Las+ %E

1. Test. Las- - - 0 - NS9 NS - 0 - NS NS - 0 - NS NS - 1 8 NS NS -

2. Test. Las+ - - 0 - NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS - 2 14 NS NS -

3. ASM 500 WG¹ 25 15 0 - NS NS - 2 15 NS NS - 3 23 NS NS - 3 23 NS NS -

4. ASM 500 WG 50 15 0 - NS NS - 0 - NS NS - 0 - NS NS - 0 - NS NS -

5. ASM 500 WG 25 30 0 - NS NS - 0 - NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS -

6. ASM 500 WG 50 30 1 7 NS NS - 2 14 NS NS - 2 14 NS NS - 3 21 NS NS -








¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 dias após início das aplicações; 5total de plantas positivas em qPCR para

‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento; 6porcentagem de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento; 7análise estatística versus testemunha

Las- ou Las+; 8 porcentagem de eficiência de controle (fórmula de Abbott) em relação a tesmunha Las+; 9NS: não significativo e * é significativo para o

teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).

36

Aos 15 dias após cada inoculação, realizou-se uma avaliação de mortalidade dos

psilídeos, amostrando-se duas repetições por tratamento. Os insetos foram encaminhados

para confirmação de aquisição através da análise de qPCR. Exceto pela primeira

inoculação, não houve diferenças significativas entre os tratamentos quanto à mortalidade

de insetos (Tabela 10), o que nos permite descartar este parâmetro como um significativo

fator de variação. Embora a amostragem de insetos tenha confirmado a aquisição de ‘Ca.

L. asiaticus’, os resultados de transmissão mostraram baixa eficiência, mesmo na

testemunha Las+ (Tabela 9).

Tabela 10 Porcentagem de mortalidade de psilídeos adultos e resultado em qPCR

para ‘Ca. L. asiaticus’ (amostragem de insetos provinientes de duas repetições por

tratamento) após o período de inoculação em campo, aos 5, 60, 120, 180 e 240 dias após

início das aplicações. Holambra, SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

Confinamento

5DAIA4

Confinamento

60DAIA

Confinamento

120DAIA

Confinamento

180DAIA

Confinamento

240DAIA

M5 Las+6 M Las+ M Las+ M Las+ M Las+

1. Test. Las- - - 18 A -/- 21 -/- 21 -/- 21 -/- 18 -/-

2. Test. Las+ - - 9 A +/+ 26 -/- 38 +/+ 27 +/+ 25 +/+

3. ASM 500 WG¹ 25 15 14 A +/+ 32 -/- 45 +/+ 28 +/+ 21 +/+

4. ASM 500 WG 50 15 18 A +/+ 31 +/- 35 +/+ 20 +/+ 25 +/+

5. ASM 500 WG 25 30 32 B +/+ 23 -/- 43 +/+ 16 +/+ 23 +/+

6. ASM 500 WG 50 30 17 A +/+ 26 -/- 38 +/+ 21 +/+ 16 +/+

7. ASM 500 WG 100 30 25 A +/- 22 -/- 41 +/+ 19 +/+ 19 +/+

8. ASM 500 WG 50 45 23 A +/+ 25 -/- 37 +/+ 17 +/- 26 +/+

9. ASM 500 WG 100 45 42 B +/+ 32 +/- 43 +/+ 31 +/+ 34 +/+

10. ASM 500 WG 200 45 24 A +/+ 24 -/- 35 +/+ 18 +/+ 22 +/+

11. ASM 500 WG 50 60 30 B +/+ 28 -/- 40 +/+ 20 +/+ 29 +/+

12. ASM 500 WG 100 60 34 B +/+ 20 -/- 36 +/+ 25 +/+ 14 +/+

13. ASM 500 WG 200 60 40 B +/+ 29 -/- 39 +/+ 24 +/+ 22 +/+

Scott-Knott (5%) - CV (%) 19,09 23,20 NS7 33,83 NS 25,76 NS 26,72 NS

¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 dias após

início das aplicações; 5mortalidade (%) de insetos após o período de 15 dias de

inoculação; 6resultado em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’: resultado da primeira/segunda

repetição amostrada; 7não significativo.

Considerando-se os estudos que abordam o comportamento alimentar do

psilídeo, aquisição e proliferação de ‘Ca. L. asiaticus’, entende-se que dentre os principais

37

fatores que influenciariam sobre a eficiência de transmissão da bactéria pelo inseto vetor

neste experimento, estariam: (i) processo de aquisição da bactéria pelo inseto, (ii)

concentração da bactéria no psilídeo e (ii) comportamento alimentar do inseto.

INOUE et al. (2009), em estudo sobre a eficiência de transmissão de ‘Ca. L.

asiaticus’ por psilídeos, constatou que quando insetos adultos se alimentaram em plantas

infectadas, a concentração da bactéria não aumentou significativamente nesses insetos e

que a eficiência de transmissão através destes para plantas sadias foi baixa. Em

contrapartida, quando psilídeos se alimentaram em plantas fontes no estágio de ninfas, a

concentração da bactéria aumentou significativamente entre dez e 20 dias após o

confinamento desses insetos, resultando em taxas de transmissão para plantas sadias

próximas a 70% através de adultos recém-emergidos.

Os resultados de INOUE et al. (2009), bem como de outros autores (PELZ-

STELINSK et al., 2010; COLETTA-FILHO et al., 2014), sugerem que a multiplicação

da bactéria nos psilídeos é essencial para uma transmissão eficiente e mostram que é

difícil a transmissão através de insetos adultos, quando estes adquirem a bactéria na fase

adulta.

As bactérias associadas ao HLB são capazes de habitar o interior dos vasos de

floema. Pouco se conhece sobre sua biologia, uma vez que seu cultivo in vitro ainda não

é feito de modo rotineiro e sistemático. De modo geral, estas bactérias apresentam-se

distribuídas de modo errático e em baixas concentrações dentro dos vasos do floema

(MACHADO et al., 2010) de modo que, supostamente, o processo de aquisição,

inoculação e transmissão de ‘Ca. Liberibacter spp’ ocorre nos vasos floemáticos.

Em estudo sobre o comportamento alimentar de D. citri, BONANI (2009) sugere

que o mesmo é influenciado pela idade das folhas das plantas, visto que em folhas novas

o período de permanência e alimentação floemática é maior, o que traria implicações

sobre a eficiência de aquisição da bactéria.

No experimento II, o período de remoção dos insetos entre plantas fontes e

campo foi o menor possível justamente para minimizar possíveis efeitos negativos do

jejum dos insetos sobre a transmissão da doença. No cenário de aquisição, as plantas

fontes foram previamente preparadas através de podas, irrigação e adubação com

nitrogênio, com o objetivo de garantir o máximo de fluxo de brotações e folhas em estádio

V3. No campo, apesar de não se ter um bom controle sobre o fluxo de novas brotações,

as folhas dos ramos em que os insetos infectivos foram inoculados estavam entre V3-V5,

sendo algumas vezes inevitável a utilização de ramos com folhas em V7.

38

Motivado por entender o menor avanço do HLB em regiões de temperaturas

médias mais elevadas no Estado de São Paulo, LOPES et al. (2013) estudaram o efeito de

diferentes regimes de temperatura sobre o título de ‘Ca. L. asiaticus’ e sobre a aquisição

da bactéria por psilídeos, e constataram menor título (concentração da bactéria) nos

tecidos das folhas e menor eficiência de aquisição da bactéria por insetos em regimes de

temperaturas mais elevadas (24 a 38 ºC) quando comparado a regimes de temperaturas

menores (14 a 28 ºC).

As inoculações no experimento II ocorreram nos meses de Maio (2014), Julho

(2014), Setembro (2014), Novembro (2014) e Janeiro (2015). As temperaturas médias

mensais para cada mês em que ocorreu a inoculação, bem como a média dos últimos anos

para os mesmos meses, constam na Tabela 11. As temperaturas mínimas e máximas

mantiveram-se, praticamente, dentro dos intervalos mais amenos estudados por LOPES

et al. (2013), indicando que, provavelmente, não houve condições limitantes à

proliferação de ‘Ca. L. asiaticus’.

Tabela 11 Dados de temperatura (°C) para os meses de inoculação de psilídeos:

valores médios mensais, obtidos através do banco de dados do local do experimento.

Holambra, SP.

Momento da Inoculação Temperatura Mínima Temperatura Máxima

Maio 2014 14,8 26,5

Média 2004-2013 14,0 26,3

Julho 2014 12,7 25,1

Média 2004-2013 12,1 25,8

Setembro 2014 18,4 29,7

Média 2004-2013 15,0 28,8

Novembro 2014 22,1 29,7

Média 2004-2013 18,1 30,1

Janeiro 2015 23,9 33,1

Média 2004-2013 19,5 30,1

Possivelmente, o insucesso na transmissão da bactéria através de psilídeos não

esteja ligado à baixa taxa de aquisição pelos vetores e condições vegetativas das plantas

e ambientais em campo, mas, sim, à baixa concentração e proliferação de ‘Ca. L.

asiaticus’ nos insetos em função da forma em que o processo de aquisição foi conduzido

(aquisição na fase adulta), resultando em níveis insuficientes da bactéria no inseto para

que a transmissão para a planta se afetuasse de maneira significativa.

39

4.2.3 Evolução de sintomas de HLB associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L.

asiaticus’

Embora o teste do qui-quadrado tenha capturado diferenças significativas para

algumas comparações entre os tratamentos e testemunha Las-, no contexto pode-se

considerá-las não representativas em função da baixa eficiência de transmissão via

psilídeos, uma vez que não houve diferença significativa entre as testemunhas Las- e Las+

para nenhum dos parâmetros avaliados (Tabelas 12 e 13).

Como ambos os experimentos (I e II) foram instalados no mesmo local e época,

considera-se que a baixa eficiência de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através de

psilídeos infectivos tenha como consequência uma menor frequência de sintomas, visto

que no experimento I (via enxertia) foram claramente maiores.

A menor eficiência de transmissão da bactéria no experimento II, nos permite

excluir o efeito de ‘Ca. L. asiaticus’ sobre a manifestação dos sintomas e melhor analisar

o efeito das aplicações sequênciais de ASM sobre diâmetro e altura de plantas.

Comparando-se todos os tratamentos que receberam ASM com as testemunhas Las+ e

Las-, pode-se afirmar que, no período avaliado, não houve efeito negativo ou fitotóxico

de ASM sobre diâmetro e altura de plantas.

40

Tabela 12 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas

com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e total), manganês, zinco+manganês e magnésio

por tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

Zinco (Intenso) Zinco (Total) Manganês Zinco+Manganês Magnésio

Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+

1. Test. Las- - - 0 NS6 NS 4 NS NS 4 NS NS 7 NS NS 1 NS NS

2. Test. Las+ - - 1 NS NS 8 NS NS 7 NS NS 11 NS NS 2 NS NS

3. ASM 500 WG¹ 25 15 3 NS NS 8 NS NS 5 NS NS 11 NS NS 0 NS NS

4. ASM 500 WG 50 15 1 NS NS 7 NS NS 7 NS NS 14 * NS 1 NS NS




8. ASM 500 WG 50 45 1 NS NS 7 NS NS 10 * NS 11 NS NS 2 NS NS


10. ASM 500 WG 200 45 0 NS NS 10 * NS 5 NS NS 12 NS NS 1 NS NS




¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las-

ou Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).

41

Tabela 13 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas

com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Total de plantas com mosqueado, nervuras amareladas e super desenvolvidas, queda significativa

de folhas e sem sintomas por tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.

Tratamento

Do

se²

Inte

rv.³

Mosqueado Nervuras Queda de folhas Sem sintomas

Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+

1. Test. Las- - - 1 NS6 NS 1 NS NS 13 NS NS 0 NS NS

2. Test. Las+ - - 3 NS NS 3 NS NS 10 NS NS 1 NS NS

3. ASM 500 WG¹ 25 15 3 NS NS 4 NS NS 8 NS NS 3 NS NS

4. ASM 500 WG 50 15 0 NS NS 0 NS NS 10 NS NS 1 NS NS










¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las-

ou Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).

42

4.3 Comparação entre os métodos de infecção

Comparando-se a evolução de plantas Las+ ao longo do tempo entre a população

(todos os tratamentos juntos) de plantas no experimento I e II notamos uma superioridade

do método de enxertia a partir dos 180 DAIA, que após um ano atingiu 44% de plantas

Las+, em contraste aos 10% para o método via psilídeos (Figura 7).

Figura 7 Evolução de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’. Número

de plantas Las+ acumuladas na população do experimento com infecção via enxertia e

via psilídeos aos 60, 120, 180, 270, 360 e 440/500 dias após início das aplicações

(Holambra, SP).

Para a comparação entre as medotologias de infecção (enxertia vs psilídeo),

realizou-se o teste do qui-quadrado entre as testemunhas Las+ dos dois experimentos. A

partir dos 270 DAIA encontrou-se uma diferença significativa entre as metodologias, com

superioridade em eficiência de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através da metodologia

de enxertia de borbulhas. Aos 360 DAIA e 500 DAIA, a testemunha Las+ via enxertia

atingiu os valores de 65 e 71% de plantas positivas, em contraste aos 7 e 14% da metologia

via psilídeos (Figura 8).

43


plantas Las+ acumuladas nas testemunhas (Las- e Las+) do experimento com infecção

via enxertia e via psilídeos ao longo do tempo, onde (NS) representa diferença não

significativa e (*) significativa. Holambra, SP.

4.4 Considerações

O presente estudo adicionou informações para condições de campo e trouxe mais

uma confirmação da indução efetiva de ASM sobre plantas jovens de citros infectadas

com ‘Ca. L. asiaticus’, desencadeando um efeito, supostamente, capaz de retardar a

multiplicação da bactéria. No entanto, para validação do uso de ASM no manejo do HLB,

é fundamental que se desenvolvam trabalhos com transmissão via psilídeos,

considerando-se plantas jovens e adultas (em produção). Para estes trabalhos, recomenda-

se a utilização de adultos infectados na fase de ninfas, visto que estudos têm demonstrado

que a transmissão de Las é mais eficiente para esses psilídeos (COLETTA-FILHO et al.,

2009; INOUE et al., 2009; PELZ-STELINSK et al., 2010; COLETTA-FILHO et al.,

2014).

Mesmo em condições agressivas de infecção, como a enxertia, o indutor de

resistência apresenta potencial de uso como alternativa adicional ao manejo do HLB em

citros. Houve contribuição sobre o entendimento de combinações de doses e intervalos

entre aplicações, que poderá direcionar estudos futuros, os quais são necessários para

confirmação da performance do indutor de resistência, bem como validação do uso de

doses e intervalos.

44

Frente a complexidade da interação entre doses e intervalos na indução de

resistência, aconselha-se a complementação com estudos que quantifiquem a ativação de

mecanismos de defesa da planta para o direcionamento de combinações ótimas, que

induzam resistência efetiva ao HLB e suportem a recomendação de intervalos entre

aplicações, baseando-se no tempo de duração da ativação após o uso do indutor de

resistência.

É fundamental que os resultados apresentem reprodutividade, através de um

número mínimo apropriado de experimentos com dose e intervalos. Em um patossistema

como o HLB, onde levam-se meses para que os sintomas da doença apareçam e para

detecção via qPCR do patógeno, e anos para se avaliar o efeito e a viabilidade do

tratamento, estudos da indução das vias de defesa podem ser utilizados para monitorar o

período de indução, o nível de resposta e inferir sobre a efetividade do indutor.

Possivelmente, a concentração de ‘Ca. L. asiaticus’ nos tecidos de plantas recém

infectadas através do vetor Diaphoria citri em condições naturais seja inferior à

concentração em plantas infectadas através de enxertia em condições experimentais

(AGNELLI, 2011). Isto sugere que o desempenho do indutor de resistência ASM possa

ser superior ao obtido neste trabalho. Suposição que ainda demanda comprovação

científica. De fato, ainda não existem informações que descartem o uso da indução de

resistência através do ASM como controle preventivo do HLB em condições de infecção

natural.

Existem ainda relatos de diversos autores (FORD et al., 2010; SUR & STORK,

2003; FRANCIS et al., 2009; GRAHAM et al., 2011; MILLER et al., 2011, GRAHAM

& MEYERS, 2013) sobre a capacidade de indução de resistência de outros ingredientes

ativos amplamente utilizados em citros para o controle de insetos, como thiametoxam e

imidacloprid. Assim são necessários trabalhos visando o entendimento do papel desses

defensivos, isoladamente ou combinados com ASM, as respostas de resistência das

plantas ao desenvolvimento das bactérias associadas ao HLB.

Informações de literatura sobre a eficiência de transmissão de Las por adultos de

D. citri, que adquirem a bactéria durante o estágio de ninfas, sugerem que este seja o

ponto chave do sucesso da disseminação do HLB em pomares, e inferem sobre a

importância da erradicação de plantas infectadas (fontes de inóculo) e do controle

eficiente de adultos, antes que deem início a novas gerações (presença de ninfas nas

brotações).

É essencial que nenhuma ferramenta disponível aos citricultores seja utilizada

de maneira isolada, pois o sucesso do manejo do HLB está associado à integração de

45

métodos como escolha da área para implementação do pomar, o uso de mudas sadias e

certificadas, nutrição equilibrada de acordo com as recomendações do Boletim 100 IAC,

inspeções frequentes visando a identificação de plantas sintomáticas, eliminação de

plantas infectadas, monitoramento da presença do psilídeo, controle sistemático do vetor,

maior frequência de pulverizações de inseticidas nas bordas dos talhões e manejo regional

do psilídeo (FUNDECITRUS, 2015c).

Considerando-se o avanço da doença no cenário atual da citricultura brasileira e

a importância sócio-econômica da cultura, é evidente a importância e a necessidade do

aprofundamento do tema indução de resistência, bem como outras tecnologias que sejam

agregadas ao manejo do HLB em citros.

5 CONCLUSÃO

Aplicações foliares sequenciais com o indutor de resistência acibenzolar-S-

metílico (ASM) retardaram a detecção de ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ em plantas

cítricas.

O efeito do indutor de resistência ASM sobre a detecção de ‘Ca. Liberibacter

asiaticus’ em plantas cítricas dependeu da combinação entre dose e intervalo utilizados,

sendo que as melhores respostas foram obtidas nas concentrações de 50 mg i.a. planta-1

com intervalo de 30 dias e 100 mg i.a. planta-1 com intervalo de 45 dias, as quais

apresentaram controle significativo de 79 e 60%, respectivamente, aos 270 dias após

início das aplicações.

46

6 REFERÊNCIAS

AGNELLI, A.R. Potencial de agentes indutores de resistência para o controle da bactéria

‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas. Dissertação de mestrado –

FUNDECITRUS, 2011. 44f. Araraquara, SP.

AGROFIT. Sistema de Agrotóxicos Fitossanitário, 2009. Disponível em:

<http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>. Acesso em 01 de

dezembro de 2014.

ALVARENGA, F.V. Cobre, manganês e zinco afetam estado nutricional, tolerância e

resistência de plantas com HLB? Dissertação de mestrado – IAC, 2011. Campinas, SP.

BASSANEZI, R.B.; MONTESINO, L.H.; BUSATO, L.A.; STUCHI, E.S. Damages

caused by huanglongbing on sweet orange yield and quality in São Paulo. Proceedings

of the Huanglongbing-Greening International Workshop. Ribeirão Preto, SP. p. 39,

2006.

BELASQUE JUNIOR, J.; BERGAMIN FILHO, A.; BASSANEZI, R.B.; BARBOSA,

J.C.; FERNANDES, N.G.; YAMAMOTO, P.T.; LOPES, S.A.; MACHADO; M.A.;

LEITE JUNIOR, R.P.; AYRES, A.J.; MASSARI, C.A. Base científica para a erradicação

de plantas sintomáticas e assintomáticas de Huanglongbing (HLB, Greening) visando o

controle efetivo da doença. Tropical Plant Pathology, v. 34, 3, p. 137-145, 2009.

BONALDO, S.M.; PASCHOLATI, S.F.; ROMEIRO, R.S. Indução de resistência: noções

básicas e perspectivas. In: Indução de resistência em plantas a patógenos e insetos.

Piracicaba: FEALQ, v. 13, p. 11-28, 2015.

BOSTOCK, R.M. Signal crosstalk and induced resistance: straddling the line between

cost and benefit. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 42, p. 545-580, 2005.

BOVÉ, J.M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of

citrus. Journal of Plant Pathology, v. 88, p. 7-37, 2006.

47

CAPOOR, S.P.; RAO, D.G.; VISWANATH, S.M. Diaphorina citri Kuwayama., a vector

of Greening disease of citrus in India. Indian Journal of Agriculture. v.37, p. 572-576,

1967.

CAVALCANTI, L.S.; BRUNELLI, K.R.; STARGARLIN, J.R. Aspectos bioquímicos e

moleculares da resistência induzida. In: CAVALCANTI, L.S.; DI PIERO, R.M.; CIA, P.;

PASCHOLATI, S.F.; RESENDE, M.L.V.; ROMEIRO, R.S. In: Indução de resistência

em plantas a patógenos e insetos. Piracicaba: FEALQ, v. 13, p. 81-124, 2005.

CHEN J.; PU X.; DENG X.; LIU S.; LI H.; CIVEROLO E. A phytoplasma rRelated to

“Candidatus Phytoplasma asteri” detected in citrus showing Huanglongbing (Yellow

Shoot Disease) symptoms in Guangdong, P. R. China. Phytopathology, v. 99 (3), p. 236-

242, 2009.

COLETTA-FILHO H.D.; TARGON M.L.P.N.; TAKITA M.A.; DE NEGRI J.D.;

POMPEU JR. J.; MACHADO M.A. First report of the causal agent of Huanglongbing

(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) in Brazil. Plant Disease, v. 88, 1382, 2004.

COLETTA-FILHO, H.D.; CARLOS, E.F.; ALVES, K.C.S.; PEREIRA, M.A.R.;

BOSCARIOL-CAMARGO, R.L.; DE SOUZA, A.A.; MACHADO, M.A. In: Plant

multiplication and graft transmission of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ revealed by

Real-Time PCR. European Journal Plant Pathology. v. 126, p. 53-60, 2009.

COLETTA-FILHO, H.D.; DAUGHERTY, M.P.; FERREIRA, C.; LOPES, J.R.S.

Temporal Progression of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ Infection in citrus and

acquisition efficiency by Diaphorina citri. Phytopathology, v. 104, 4, p. 416-421, 2014.

COORDENADORIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA DO ESTADO DE SÃO

PAULO. Estabelece normas de medidas de defesa sanitário vegetal e certificação de

conformidade fitossanitária de mudas cítricas no Estado de São Paulo. Ratificada pela

resolução SAA - 10 DE 29.03.2006. Disponível em: <

http://www.defesa.agricultura.sp.gov.br/www/legislacoes/popup.php?action=view&idle

g=642>. Acesso em 02/04/2016.

48

DA GRAÇA, J.V. Citrus Greening disease. Annual Review Phytopathology. v. 29, p.

109-136, 1991.

DUKE, N.; RAMIREZ, A.V.; TOMIYAMA, K. Systemic induction of resistance in

potato plants against Phytophthota infestans by local treatment with hyphal wall

components of the fungus. Journal of Phytopathology, v.119, p. 232-239, 1987.

FORD, K.A.; CASIDA, J.E.; CHANDRAN, D.; GULEVICHA, A.G.; OKRENT, R.A.;

DURKINC, K.A.; SARPONG, R.; BUNNELLEC, E.M.; WILDERMUTH, M.C.

Neonicotinoid insecticides induce salicylate associated plant defense responses. Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A., v. 107, p. 17527-17532, 2010.

FRANCIS, M.I.; REDONDO, A.; BURNS, J.K.; GRAHAM, J.H. Soil application of

imidacloprid and related SAR inducing compounds produces effective and persistent

control of citrus canker. European Journal Plant Pathology. v. 124, p. 283-292, 2009.

FUNDECITRUS – Fundo de Defesa da Citricultura. Manual Técnico de Greening, 2008.

FUNDECITRUS – Fundo de Defesa da Citricultura. Manual Técnico de Greening, 2009.

FUNDECITRUS – Fundo de Defesa da Citricultura. Relatório Coordenadoria de Defesa

Agropecuária, 2013. Disponível em:

<http://www.fundecitrus.com.br/comunicacao/relatorios>. Acesso em 01/06/2014.

FUNDECITRUS – Fundo de defesa da Citricultura. Inventário de árvores e estimativa de

safra de laranja 2015/16 do cinturão citrícola de São Paulo e Triângulo/Sudoeste Mineiro,

2015a. Disponível em: <

http://www.fundecitrus.com.br/pdf/pes_relatorios/Inventario%20e%20Estimativa%20d

o%20Cinturao%20Citricola_Versao%20Ampliada_01_Julho.pdf>. Acesso em

14/02/2015.

FUNDECITRUS. Fundo de defesa da Citricultura. Comunicação: Greening atinge 18%

dos pés de laranja, 2015b. Disponível em

<http://www.fundecitrus.com.br/comunicacao/noticias/integra/greening-atinge-18-dos-

pes-de-laranja/327>. Acesso em 01/12/2015b.

49

FUNDECITRUS – Fundo de defesa da Citricultura. Os dez mandamentos do HLB.

Citricultor, v. 28, p. 13-14, 2015c.

GARNIER M. & BOVÉ J.M. Transmission of organism associated with citrus Greening

disease from sweet orange to periwinkle by dodder. Phytopathology, v. 73(10), p. 1358-

1363, 1983.

GARNIER M.; DANEL N.; BOVÉ J.M. The Greening organism is a gram negative

bacterium. In: Conference of the International Organization of Citrus Virologists.

Proceedings of 9th Conference IOCV, Riverside, University of California, p.115-124,

1984.

GARNIER M. & BOVÉ J.M. Distribution of the Huanglongbing (Greening) Liberibacter

species in fifteen African and Asian countries. In: Conference of the International

Organization of Citrus Virologists. Proceedings of 13th Conference IOCV, Riverside,

University of California, p.388-391, 1996.

GASPAROTO, M.C.G.; BASSANEZZI, R.B.; AMORIN, L.; MONTESINO, L.H.;

LOURENCO, S.A.; WULFF, N.A.; TEIXEIRA, D.C.; MARIANO, A.G.; MARTINS,

E.C.; LEITE, A.P.R.; BERGAMIM, A. First report of ‘Candidatus Liberibacter

americanus’ transmission from Murraya paniculata to sweet orange by Diaphorina citri.

Journal of Plant Pathology. v. 92, p. 546-546, 2010.

GORLACH, J.; VORATH, S.; KNAUF-BEITER, G.; HENRY, G.; BECKHOVE, V.;

KOGEL, K.H.; OOSTENDORP, M.; STAUB, T.; WARD, E.; DESSMAN, H.; RYALS,

J. Benzothiadiazole, a novel class of inducers of systemic acquired resistance, activates

gene expression and disease resistance in wheat. The Plant Cell. v. 8, p. 629-643, 1996.

GOTTWALD, T.R.; DA GRAÇA, J.V.; BASSANEZI, R.B. Citrus huanglongbing: the

pathogen and its impact. Online. Plant Health Progress, 2007.

GRAHAM, J.H. & MYERS, M.E. Soil application of SAR inducers Imidacloprid,

Thiametoxam and acibenzolar-S-methyl for citrus canker in young grapefruit trees. Plant

Disease, v. 95, 6, p. 725- 2011.

50

GRAHAM, J.H. & MYERS, M.E. Integration of soil applied neonicotinoid insecticides

and acibenzolar-S-methyl for systemic acquired resistance (SAR) control of citrus canker

on young citrus trees. Crop Protection, v. 54, p. 239-243, 2013.

HUANG C.H.; VALLAD G.E.; ZHANG S.; BALOGH B.; FIGUEIREDO J.F.L.;

BEHLAU F.; JONES J.B.; MOMOL M.T.; OLSON M.S. Effect of application frequency

and reduced rates of acibenzolar-S-methyl on the field efficacy of induced resistance

against bacterial spot on tomato. Plant Disease, v. 96, 2, p. 221-227, 2012.

INOUE, H.; OHNISHI, J.; ITO T.; TOMIMURA, K.; MIYATA, S.; IWANAMI, T.;

ASHIHARA. Enhanced proliferation and efficient transmission of ‘Candidatus

Liberibacter asiaticus’ by adult Diaphorina citri after acquisition feeding in the nymphal

stage. Annals of Applied Biology. v. 155, p. 29-36, 2009.

JAGOUEIX S.; BOVÉ J.M.; GARNIER M. The phloem-limited bacterium of Greening

disease of citrus is a member of the α subdivision of the proteobacteria. International

Journal of Systematic Bacteriology. v. 44 (3), p. 379-386, 1994.

JAGOUEIX S.; BOVÉ J.M.; GARNIER M. PCR detection of the two ‘Candidatus’

Liberibacter species associated with Greening disease of citrus. Molecular and Cellular

Probes. v. 10, p. 43-50, 1996.

JAGOUEIX S.; BOVÉ J.M.; GARNIER M. Comparison of the 16S/23S ribosomal

intergenic regions of ‘Candidatus Liberibacter asiaticum’ and ‘Candidatus Liberibacter

africanum’, the two species associated with citrus Huanglongbing (Greening) disease.

International Journal of Systematic Bacteriology. v. 47, p. 224-227, 1997

KE C.; KE S.; WU R.J.; YANG H.; HSU P.T. Purification and serology of the organism

associated with citrus Huanglongbing. In: Conference of the International

Organization of Citrus Virologists. Proceedings of 12th Conference IOCV, Riverside,

University of California, p.220-223, 1993.

KUHN, O.J.; PASCHOLATI, S.F.; CARDOSO FILHO, J.A.; PORTZ, R.L.; OSWALD,

W. Indução de resistência sistêmica em plantas: aspectos gerais, efeitos na produção e

51

sobre microrganismos não-alvo. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo,

v.14, p. 249-300, 2006.

KUNZ, W.; SCHURTER, R.; MAETZKE, T. The chemistry of benzothiadiazole plant

activators. Pesticide Science, New York, v. 50, n. 4, p. 275-282, 1997.

LI, J.; TRIVEDI, P.; WANG, N. Field evaluation of plant defense inducers for the control

of citrus Huanglongbing. Phytopathology. v. 106, p. 37-46, 2016.

LI, W.; HARTUNG, J.S.; LEVY, L. Quantitative real-time PCR for detection and

identification of ‘Candidatus’ Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.

Journal of Microbiological Methods. v. 66, p. 104-115, 2006.

LIN, K.H. Observation on yellow shoot of citrus. Etiological study of yellow shoot of

citrus. Acta Phytopathologica SiniCa. v. 2, p. 1-42, 1956.

LIN, C.K. Notes on citrus yellow shoot diseases. Acta Phytophylact. SiniCa. v. 2, p.

243-251, 1963.

LIN, H.; CHEN, C.; DODDAPANENI, H.; DUAN, Y.; CIVEROLO, E.L.; BAI, X.;

ZHAO, X. A new diagnostic system for ultra-sensitive and specific detection and

quantification of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, the bacterium associated with citrus

huanglongbing. Journal of Microbiological Methods. v. 81, p. 17-25, 2010.

LOPES, S.A.; FRARE, G.F. Graft transmission and cultivar reaction of citrus to

‘Candidatus Liberibacter americanus’. Plant Disease, v. 92, p. 21-24, 2008.

LOPES S.A.; BERTOLINI E.; FRARE G.F.; MARTINS E.C.; WULFF N.A.;

TEIXEIRA D.C.; FERNANDES N.G.; CAMBRA M. Graft transmission efficiencies and

multiplication of ‘Candidatus Liberibacter americanus’ and ‘Ca. Liberibacter asiaticus’

in citrus plants. Phytopathology. v. 99, p. 301-306, 2009a.

LOPES S.A.; FRARE G.F.; BERTOLINI E.; CAMBRA M.; FERNANDES N.G.;

MARIN D.R.; BOVÉ J.M. Liberibacters associated with citrus huanglongbing in Brazil:

52

‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ is heat tolerant, ‘Ca. L. americanus’ is heat sensitive.

Plant Disease. v. 93, p. 257-262, 2009b.

LOPES, S.A.; LUIZ, F.Q.B.F.; MARTINS, E.C.; FASSINI, C.G.; SOUSA, M.C.;

BARBOSA, J.C.; BEATTIE, G.A.C. ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ titers in citrus

and acquisition rates by Diaphorina citri are decreased by higher temperature, Plant

Disease. v. 97, p. 1563-1570, 2013.

MACHADO, M.A.; LOCALI-FABRIS, E.C.; COLETTA-FILHO, H.D. Resumo:

‘Candidatus Liberibacter spp.’, agentes do huanglongbing dos citros. Citrus Research

& Technology, Cordeirópolis, v.31, n.1, p.25-35, 2010.

MAUCH-MANI, B.; MÉTRAUX, J.P. Salicylic acid and systemic acquired resistance to

pathogen attack. Annals of Botany, London, v.82, p.535-540, 1998.

MCCLEAN, A.P.D.; OBERHOLZER, P.C.J. Citrus psyllid, a vector of the Greening

disease of sweet orange. S. Afri. J. Agric. Sci., v. 8, p. 297-298, 1965.

MILLER, A.M.; SILVA, M.R.L.; BARRETO T.P.; LEITE JUNIOR, R.P. Indução

comprovada. Revista Cultivar HF, v. 66, p. 6-7, 2011.

MORAES, J.C.; COSTA, R.R. Efeitos do ácido salicílico e do acibenzolar-S-methyl

sobre Schizaphis graminium (Rondani) (Hemiptera: Aphididae) em plantas de trigo.

Neotropical Entomology, v.35, n.6, p.834-839, 2006.

MURRAY, M.G; THOMPSON, W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant

DNA. Nucleic Acids Research, v. 8, n. 19, 1980.

NEVES, M.F.; TROMBIN, V.G.; MILAN, P.; LOPES, F.F.; CRESSONI, F.; KALAKI,

R. Retrato da citricultura brasileira. MARKESTRAT: Centro de Pesquisa e Projetos em

Marketing e Estratégia, FEA-USP, Ribeirão Preto, 2010.

PARKINSON L.E.; CREW K.S.; THOMAS J.E.; DANN, E.K. Efficacy of acibenzolar-

S-methyl (Bion®) treatment of Australian commercial passionfruit, Passiflora edulis f.

53

sp. flavicarpa, on resistance to Passionfruit woodiness virus (PWV) and activities of

chitinase & β-1,3-glucanase. Australasian Plant Pathology. v. 44, p. 311-318, 2015.

PASCHOLATI, S.F. Resultados com resistência sistêmica induzida no Brasil. In:

Simpósio de biologia molecular de resistência de plantas a patógenos: aplicações no

manejo integrado de fitodoenças, Lavras, v. 1, p. 120-124, 2002.

PELZ-STELINSK, K.S.; BRLANSKY, R.H.; EBERT, T.A.; ROGERS, M.E.

Transmission parameters for ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ by Asian Citrus Psillid

(Hemiptera; psillidae). Journal Economic Entomology. v. 103, p. 1531-1541, 2010.

REINKING O.A. Diseases of economic plants in South China. Philippine Agriculturist.

v. 8, p. 109-135, 1919.

SECHLER A.; SCHUENZEL E.L.; COOKE P.; DONNUA S.; THAVEECHAI N.;

POSTNIKOVA E.; STONE A.L.; SCHNEIDER W.L.; DAMSTEEGT V.D.; SCHAAD

N.W. Cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, ‘Ca. L. africanus’, and ‘Ca. L.

americanus” associated with Huanglongbing. Phytopathology. v. 99(5), p. 480-486,

2009.

SILVA, L.H.C.P.; RESENDE, M.L.V. Resistência induzida em plantas contra patógenos.

In.: SILVA, L.H.C.P.; CAMPOS, J.R., NOJOSA, G.B.A. Manejo integrado de doenças

e pragas em hortaliças. Lavras: UFLA. p. 221-239, 2001.

SMITH, C. J. Accumulation of phytoalexins: defense mechanisms and stimulus response

system. The New Phytologist. v. 132, p. 1-45, 1996.

SU, H.L. Research and Health Management of Citrus Huanglongbing in Taiwan. In:

Proceedings of the International Research Conference on Huanglongbing. Orlando,

USA. p.57-91, 2008.

SUR, R.; STORK, A. Uptake, translocation and metabolism of imidacloprid in plants.

Bull. Insectol. v. 56, p. 35-40, 2003.

54

TEIXEIRA, D.C.; AYRES, A.J.; KITAJIMA, E.W.; TANAKA, F.A.O.; DANET, J.L.;

JAGOUEIX-EVEILLARD, S.; SAILLARD, C.; BOVÉ, J.M. First report of a

huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State, Brazil, and association of a new

liberibacter species, ‘Candidatus Liberibacter americanus’, with the disease. Plant

Disease. v. 89, p. 107, 2005a.

TEIXEIRA, D.C.; DANET, J.L.; EVEILLARD, S.; MARTINS, E.C.; JESUS JUNIOR,

W.C.; YAMAMOTO, P.T.; LOPES, S.A.; BASSANEZI, R.B.; AYRES, A.J.;

SAILLARD, C.; BOVÉ, J.M. Citrus huanglongbing in São Paulo state, Brazil: PCR

detection of the ‘Candidatus’ Liberibacter species associated with the disease. Molecular

and Cellular Probes. v. 19, p. 173-179, 2005b.

TEIXEIRA, D.C.; SAILLARD, C.; EVEILLARD, S.; DANET, J.L.; DA COSTA, P.I.;

AYRES, A.J.; BOVÉ, J. ‘Candidatus Liberibacter americanus’, associated with citrus

huanglongbing (Greening disease) in São Paulo State, Brazil. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology. v. 55, p. 1857-1862, 2005c.

TEIXEIRA, D.C.; WULFF, N.A.; MARTINS, E.C.; KITAJIMA, E.W.; BASSANEZI,

R.; AYRES, A.J.; EVEILLARD, S.; SAILLARD, C.; BOVÉ, J.M. A phytoplasma closely

related to the pigeon pea witches’-broom phytoplasma (16Sr IX) is associated with citrus

huanglongbing symptoms in the state of Sao Paulo, Brazil. Phytopathology. v. 98, p.

977-984, 2008.

TEIXEIRA, D.C.; WULFF, N.A.; LEITE, A.P.R.; MARTINS, E.C.; AYRES, A.J.;

BOVÉ, J.M. Identification, PCR detection and occurrence is São Paulo state, Brasil, of

citrus huanglongbing-associated agents: Candidatus Liberibacter americanus, ‘Ca. L.

asiaticus’, and the 16Sr group IX phytoplasma. Tropical Plant Pathology, v. 34, 2009.

TEIXEIRA, D.C.; WULFF, N.A.; LOPES, S.A.; YAMAMOTO, P.T.; MIRANDA, M.P.;

SPÓSITO, M.B.; BELASQUE JR, J.; BASSANEZI, R.B. Caracterização e etiologia das

bactérias associadas ao huanglongbing. Citrus Research & Technology, Cordeirópolis,

v.31, n.2, p.115-128, 2010.

TIAN, S.; LU, L.; LABAVITCH, J.M.; WEBB, S.M.; YANG, X.; BROWN, P.H.; HE,

Z. Spatial imaging of Zn and other elements in huanglongbing-affected grapefruit by

55

synchrotron-based micro X-ray fluorescence investigation. Journal of Experimental

Botany, v. 65, p. 953-964, 2014.

USDA. Citrus Forecast. United States Department of Agriculture, National Agriculture

Statistic Service and Florida Field Office, October 2015.

VAHLING, C.M.; BENYON, L.S.; DUAN, Y.P. Genetic and functional characterization

of the zn operon in the intracellular citrus pathogen, ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’.

Proceedings of 2nd International Research Conference on Huanglongbing. Orlando,

FL, EUA. p. 10-14, 2011.

VALLAD, G. E. & GOODMAN, R. M. Systemic acquired resistance and induced

systemic resistance in conventional agriculture. Crop Sci. v. 44, p. 1920- 1934, 2004.

VAN DE MERWE A.J. & ANDERSON F.G. Chromium and manganese toxicity. Is it

important in Transvaal citrus Greening? Farming in South Africa, v. 12, p. 439-440,

1937.

VILLECHANOUX S.; GARNIER M.; LAIGRET F.; RENAUDIN J.; BOVÉ J.M. The

genome of non-cultured, bacterial-like organism associated with citrus Greening disease

contains the nusG-rplKAJL-rpoBC gene cluster and the gene for a bacteriophage type

DNA polymerase. Current Microbiology. v. 26, p. 161-166, 1993.

YAMAMOTO, P.T.; FELIPPE, M.R.; GARBIM, L. F.; COELHO, J.H.C.; XIMENES,

N.L.; MARTINS, E.C. Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Psyllidae): vector of

the bacterium Candidatus Liberibacter americanus. In Proceedings of the

Huanglongbing — Greening International Workshop, Fundecitrus, Araraquara, p.96,

2006.

WALTERS, D.; WALSH, D.; NEWTON, A.; AND LYON, G. Induced resistance for

plant disease control: maximizing the efficacy of resistance elicitors. Phytopathology. v.

95, p. 1368-1373, 2005.

WANG, N.; TRIVEDI, P. Citrus Huanglongbing: an old problem with an unprecedent

challenge. Phytopathology, v. 103, p. 652-665.

56

ZHANG, M.; GUO, Y.; POWELL, C.A.; DOUD, M.S.; YANG, C.; ZHOU, H.; DUAN,

Y. Zinc treatment increases the titer of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in HLB-

affected citrus plants while affecting the bacterial microbiomes. Journal of Applied

Microbiology, 2016.

instituto agronÔmico curso de pÓs-graduaÇÃo em … · tabela 7 efeito da aplicação do indutor...

Documents