influÊncia de probiÓtico sobre a saÚde intestinal de …§ão... · 2018. 1. 10. · em frangos...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

INFLUÊNCIA DE PROBIÓTICO SOBRE A SAÚDE INTESTINAL

DE FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella

HEIDELBERG EM DIFERENTES TEMPOS DE JEJUM PÓS-

ECLOSÃO

Thiago Dias Matias

Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora Andrade

GOIÂNIA

2016

ii

THIAGO DIAS MATIAS

INFLUÊNCIA DE PROBIÓTICO SOBRE A SAÚDE INTESTINAL

DE FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella

HEIDELBERG EM DIFERENTES TEMPOS DE JEJUM PÓS-

ECLOSÃO

Dissertação apresentada para

obtenção do título de Mestre em

Ciência Animal junto à Escola

de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás.

Área de Concentração:

Sanidade Animal, Tecnologia e

Inspeção de Alimentos.

Orientadora:

Profª. Drª. Maria Auxiliadora Andrade – EVZ/UFG

Comitê de Orientação:

Profª. Dra. Cintia Silva Minafra e Rezende

Prof. Dr. José Henrique Stringhini

GOIÂNIA

2016

iii

Aos meus pais,

Osmar Dias e Selma Matias Dias

iv

AGRADECIMENTOS

Como não lembrar, inicialmente, pelo espírito de luz maior que concebeu a

vida aos meus pais a fim de que me criassem como futuro Médico Veterinário? Assim

Ele fez e assim agradeço: obrigado Deus, por estar comigo durante toda a vida e,

principalmente, durante esse período de pós-graduação, onde tive contato com

provações que me fizeram louva-Lo ainda mais, muito obrigado.

Ao Amor, que possibilitou a união dos meus pais permitindo que eu pudesse

ser gerado e criado: obrigado Amor, por ser o sentimento mais poderoso da Terra.

Àqueles que, independentemente do meu estado de humor e de saúde,

sempre estiveram ao meu lado, dando broncas, conselhos, comida, casa, roupas, bens

materiais que garantiram meu conforto e o principal: deram-me muito daquele Amor

que os uniram: obrigado aos meus pais, Osmar Dias e Selma Matias Dias.

À minha metade, minha cúmplice, minha amiga, minha consanguínea,

minha irmã: Patrícia Dias Matias, obrigado pelas inúmeras demonstrações de afeto

quando eu menos esperava e mais precisava, pelos conselhos e histórias compartilhadas.

Àquelas que sempre me deixavam desconcertado com demonstrações de

carinho e atenção em momentos aleatórios, fazendo-me mimos culinários deliciosos ás

seis de manhã de um domingo, me chamando para ir á feira numa segunda ás sete da

manhã, me dando beijos e abraços com o cheiro dela: obrigado vovó Otalia Rosa Dias.

Agraçode, também, à vovó Clementina Orlando Mathias(in memorian), que segue

caminho me inspirando como influenciando positivamente.

À memória da minha infância, à minha amiga mais antiga por todo amor

ofereicido gratuitamente, apoio prestado e por todas as noites de festas maravilhosas

que me permitiram distrair e espairecer um pouco (ou muito, em alguns casos):

obrigado, grande amiga Bruna dos Reis Aquino. Vinicius Correia e Alfredo Luis, nossa

amizade e cumplicidade ultrapassam os anos que nos conhecemos, obrigado por

fazerem parte da minha vida e compartilharem comigo momentos únicos.

À amizade inesperada, ao ombro amigo, ao eterno vizinho, àquele que se

tornou um grande amigo sem que me desse conta: obrigado Alessandro Lapot, sem o

seu apoio durante todo esse período, eu não teria conseguido.

v

Ao grande amigo Renato Vasconcellos por ter me dado a oportunidade de

compartilhar experiências boas e ruins, juntos. Obrigado pelos conselhos, puxões de

orelha, abraços e drinks!

À dona do abraço mais acolhedor de todos, Suzana Medeiros de Oliveira,

por ser minha alma gêmea e minha querida amiga. Obrigado por pelo apoio nos

momentos conflituosos e pelas risadas que surgiam logo após.

Àqueles que foram meu espelho durante todo o período de graduação e

seguem na pós-graduação: muito obrigado a todos os professores e funcionários da

Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG. Agradecimentos especiais ao Prof. Dr. José

Henrique Stringhini e Profª Cintia Silva Minafra e Rezende, obrigado pelo apoio,

empenho e dedicação em co-orientar-me.

Meu muitíssimo obrigado à Prof. Dra. Maria Auxiliadora Andrade por todos

os conhecimentos passados, todas as horas dedicadas dentro e fora da sala de aula a

ensinar-me um pouco mais sobre avicultura, por ter permitido que pudesse crescer uma

relação ultrapassa a aluno-professor e alcança a aluno-amiga. Obrigado por ter honrado,

literalmente, o papel de orientadora que foi conferido a senhora.

Aos meus companheiros da vida pós-acadêmica: Samantha, Camila,

Amanda, Angélica, Ana Maria e Leda; por serem as mulheres mais poderosas do prédio

da preventiva, por me auxiliarem em todos os momentos fora e dentro do experimento.

Não teria sido possível sem a “mão na massa” de vocês.

À empresa BioCamp, pelo financiamento do projeto e por toda ajuda

indispensável para condução do experimento.

Por fim, agradeço à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade

Federal de Goiás, ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal e a CAPES, pela

oportunidade concedida.

vi

“Ninguém pode voltar atrás e fazer um novo começo. Mas

qualquer um pode recomeçar agora e fazer um novo fim”

Chico Chavier

vii

SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................................xii

ABSTRACT..................................................................................................................xiii

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................14

REFERÊNCIAS..............................................................................................................21

CAPÍTULO 2 – EFEITO DE PROBIÓTICO NO DESEMPENHO ZOOTÉCNICO E

NA INTEGRIDADE INSTESTINAL DE FRANGOS DE CORTE INOCULADOS

EXPERIMENTALMENTE COM Samonella enterica SOROVAR

HEIDELBERG...............................................................................................................26

RESUMO........................................................................................................................26

ABSTRACT....................................................................................................................28

1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................27

2. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................30

2.1. Local.........................................................................................................................30

2.2. Delineamento experimental......................................................................................30

2.3. Preparação do inoculo..............................................................................................32

2.4 Inoculação das Aves.................................................................................................32

2.5. Programa Alimentar.................................................................................................32

2.6. Desempenho.............................................................................................................33

2.7. Histomorfometrial intestinal.....................................................................................34

2.8. Pesquisa de Salmonella enterica sorovar Heidelberg...............................................35

2.9 Exame biométrico de intestino..................................................................................35

2.10 Análises estatísticas.................................................................................................35

3. RESULTADOS .........................................................................................................36

4. DISCUSSÃO.............................................................................................................42

5. CONCLUSÃO...........................................................................................................45

viii

REFERENCIAS............................................................................................................46

CAPÍTULO 3 – EFEITO DE PROBIÓTICO SOB A ATIVIDADE IMUNOLÓGICA

DE FRANGOS DE CORTE EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM

Salmonella enterica SOROVAR HEIDELBERG........................................................50

RESUMO......................................................................................................................50

ABSTRACT..................................................................................................................51

1.INTRODUÇÃO.........................................................................................................52

2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................54

2.1. Local.......................................................................................................................54

2.2. Delineamento experimental....................................................................................54

2.3. Preparação do inoculo............................................................................................56

2.4. Inoculação das Aves..............................................................................................56

2.5. Pesquisa de Salmonella entrerica sorovar Heidelberg...........................................56

2.6. Exame biométrico de órgãos.................................................................................57

2.7. Contagem de linfócitos.........................................................................................57

2.8. Pesquisa de anticorpos contra o vírus da Doença de NewCastle............................58

2.9. Análise Estatística.................................................................................................58

3. RESULTADOS.......................................................................................................59

4. DISCUSSÃO..........................................................................................................64

5. CONCLUSÃO........................................................................................................67

REFERENCIAS.........................................................................................................68

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS.........................................................73

ix

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO 2

QUADRO 1 – Delineamento experimental dos tratamentos...........................................30

CAPÍTULO 3

QUADRO 1 – Delineamento experimental dos tratamentos.........................................54

QUADRO 2 – Graus de depleção linfoide de acordo com os percentuais obtidos pelas

médias das contagens dos grupos inoculados em relação ao grupo

controle...............................................................................................................57

x

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2

TABELA 1 – Composição percentual das rações experimentais fornecidas às aves

durante o período experimental (1-35 dias de idade)............................32

TABELA 2 – Peso inicial (PI), peso médio (PM), ganho de peso (GP), consumo de

ração (CR), conversão alimentar (CA) de frangos de corte submetidos a

diferentes tempos de jejum pós-eclosão, inoculados experimentalmente

com Salmonella enterica sorovar Heidelberg (SH) e alimentados com

probiótico no período de 1-7 dias de idade..........................................35





















TABELA 7 – Alturas médias dos vilos (AV), profundidades de criptas (PC) e relação

vilo:cripta do duodeno e jejuno de frangos de corte submetidos a



probiótico até os 10 dias de idade.....................................................38

TABELA 8 – Isolamento semanal de Salmonella sp. em excretas de frangos de corte

submetidos a diferentes tempos de jejum pós-eclosão, inoculados

experimentalmente com Salmonella enterica sorovar Heidelberg e

alimentados com probiótico até os 33 dias de idade...........................39

TABELA 9 – Peso relativo de intestino aos 10 e 35 dias de idade de frangos de corte


xi

experimentalmente com Salmonella enterica sorovar Heidelberg (SH) e

alimentados com probiótico até os 35 dias de idade.............................39

CAPITULO 3

TABELA 1 – Resultado da pesquisa de Salmonella sp. ao décimo e 35º dias de idade no

fígado, baço, tonsila cecal, conteúdo cecal e bursa de fabricius de frangos

de corte submetidos a diferentes tempos de jejum pós-eclosão,

inoculados experimentalmente com Salmonella enterica sorovar

Heidelberg (SH) e alimentados com probiótico....................................59

TABELA 2 – Valores de peso relativo (g/100g peso vivo da ave x 100) órgãos de

frangos de corte submetidos a diferentes tempos de jejum pós-eclosão,

inoculados experimentalmente com Salmonella enterica sorovar

Heidelberg (SH) e alimentados com probiótico....................................60

TABELA 3 – Graus de depleção linfoide no baço, bursa e tonsila cecal de frangos de

corte submetidos a diferentes tempos de jejum pós-eclosão, inoculados


alimentados com probiótico...................................................................61

TABELA 4 - Média geométrica dos títulos (MGT) de anticorpos conta o vírus da

Doença de NewCastle (NDV) ao 10º e 35º dia de idade.........................62

TABELA 5 – Mortalidade transformada e desvio padrão da mortalidade.....................62

xii

RESUMO

Neste estudo foram utilizados 570 pintos machos com um dia de idade, linhagem Cobb,

com o objetivo de avaliar os efeitos da adição de substâncias probióticas sobre as

variáveis de desempenho zootécnico, saúde intestinal e produção de imunoglobulinas

em frangos de corte desafiados ou não com Salmonella enterica sorovar Heidelberg

(SH). As aves foram divididas em oito tratamentos com seis repetições cada.

Tratamento (T) 1 – jejum de 24 horas, não recebeu o probiótico e nem o inoculo; T2 -

jejum de 24 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução salina tamponada e

esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de SH e não

recebeu o probiótico na ração; T3 - jejum de 24 horas, recebereu o probiótico na

proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100 g/t nas demais rações, mas não foi

inoculado; T4 - jejum de 24 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução salina

tamponada e esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de SH

e recebeu o probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100 g/t nas demais

rações; T5 - jejum de 36 horas, não recebeu o probiótico e nem o inoculo; T6 - jejum de

36 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução salina tamponada e esterilizada

a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de SH e não recebeu o

probiótico na ração; T7 - jejum de 36 horas, recebeu o probiótico na proporção de

500g/t de ração pré-inicial e 100 g/t nas demais rações, mas não foi inoculado; T8 -


esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de SH e recebeu o

probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100 g/t nas demais rações. As

aves que foram inoculadas receberam o inoculo ao terceiro dia de idade. Nos oito

tratamentos, semanalmente, foram verificados índices zootécnicos através da pesagem

das aves e rações. Além disso, atividades como a avaliação da saúde intestinal através

de análises histomorfométricas, a pesquisa de SH em bacteriologia convencional de

órgãos e excretas, a biometria de órgãos e a quantificação da resposta celular através da

contagem de linfócitos e a avaliação da resposta imunitária humoral pela titulação de

anticorpos em ELISA, também foram realizadas. O probiótico propiciou dados de

desempenho zootécnico mais favoráveis e beneficiou a histomorfometria dos frangos

com aumento da relação vilo:cripta no duodeno e íleo. Além disso, demonstrou

controlar excreção de SH e interferir na colonização e migração da bactéria em órgãos

extra-intestinais. O peso dos órgãos não sofreu influência, independente do tratamento.

A depleção linfocitária foi observada mais acentuada nos tratamentos que foram

inoculados com SH. O probiótico conseguiu beneficiar tanto a resposta imune celular,

pelo controle da depleção de linfócitos, quanto a resposta imune humoral, através do

aumento da titulação de anticorpos.

Palvaras-chave: aves, probióticos, linfócitos, anticorpos, melhorador de desempenho,

salmonelose.

xiii

ABSTRACT

Were used in this study 570 male chickens of one-day old, Cobb, in order to assess the

effects of adding probiotic substances on the variables zootechnical performance,

intestinal health and production of immunoglobulins of broilers challenged or not with

Salmonella enterica serovar Heidelberg (SH). The birds were divided into eight

treatments with six replicates each. Treatment (T) 1 - 24 hours fasting, not received

probiotic neither inoculum; T2 - fasting for 24 hours, orally inoculated with 0.5 ml of

sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing approximately 5.0 X 105 CFU /

mL SH and not received the probiotic; T3 - 24 hours fasting, received probiotic in the

proportion of 500g / t of pre-initial feed and 100 g / t in the other feeds, but was not

inoculated; T4 - fasting for 24 hours orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate

buffered saline and 0.85% containing approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and the

probiotic in the proportion of 500g / t of feed pre-initial and 100 g / t in the other feed;

T5 - 36 hours fasting, not received probiotic neither inoculum; T6 - fasting for 36 hours

orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing

approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and not received the probiotic; T7 - 36 hours

fasting, received the probiotic in the proportion of 500g / t of pre-initial feed and 100 g /

t in the other feeds, but was not inoculated; T8 - fasting for 36 hours orally inoculated

with 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing approximately 5.0

X 105 CFU / mL SH and the probiotic in the proportion of 500g / t of feed pre-initial

and 100 g / t in the other diets. The birds that were inoculated received the inoculum on

the third day of age. In the 8 treatments, weekly, they were checked zootechnical

indices by weighing the birds and feed. Futhermore, activities such as the evaluation of

intestinal health by histomorphometric analysis, SH research in conventional

bacteriology in organs and excreta, biometrics organs and quantification of cellular

response by cell count and evaluation of the humoral immune response by antibody

titration by ELISA were also analyzed. The probiotic propitiated more favorable

production performance data and benefited histomorphometry of chickens with

increased villus : crypt ratio in the duodenum and ileum. Moreover, it demonstrated

meddling excretion control of SH and with colonization and migration of bacteria in

extra-intestinal organs. The weight of the organs was not affected, regardless of

treatment. Lymphocyte depletion was observed more pronounced in treatments that

have been inoculated with SH. The probiotic was able to benefit both the cellular

immune response, by the control of lymphocyte depletion, as the humoral immune

response by increasing the antibody titration.

Keywords: birds, probiotics, lymphocytes, antibodies, enhancing performance,

salmonellosis.

14

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS

O Brasil se destaca como o maior exportador de carne de frango e o segundo

maior produtor de commodities avícolas do mundo, não ultrapassando, apenas, os Estados

Unidos. A produção brasileira de carne de frango conseguiu subir de 9,34 MT em 2006 para

13,14 MT em 2015. De toda carne de frango produzida, 32,7% foram para o mercado externo

e 67,3% para o interno. Neste contexto, Goiás aparece como o quinto maior exportador de

carne de frango do Brasil em 20151.

Esta projeção mundial da avicultura se deve aos avanços tecnológicos e científicos

em áreas como a nutrição, genética e sanidade aviária. Contudo, visando a redução dos custos

de produção e a maior produtividade, os produtores avícolas têm se sustentado na alta

densidade de alojamento de frangos e seleção genética precoce. Estes dois pontos, somados a

outros, que influem e desafiam a sanidade das aves, como falhas nos programas de

biossegurança e negligência de notificações de enfermidades, comprometem o bom

desempenho zootécnico da produção por interferirem na saúde das aves. A seleção genética

intensiva de frangos com alta eficiência alimentar, ao longo das últimas seis ou sete décadas,

resultou em aves que convertem eficientemente alimentos, em massa corporal, tornando o

frango o animal mais eficiente em termos de produção de carne de alta qualidade proteica2.

Além disso, a qualidade produtiva do frango de corte está sujeita a influências

como a idade da matriz, o momento de incubação do ovo e a condição da ave ao alojamento.

Neste ultimo caso, a condição do pinto está diretamente relacionada com o período pós-

eclosão, se considerado que existem diferentes intervalos de tempo desde o nascimento do

pinto até sua instalação na granja. Este tempo, que é gasto desde a eclosão dos ovos, sexagem

dos pintos e transporte das aves do incubatório aos galpões de produção, ocasiona período de

jujum incerto, que pode influenciar no desempenho do pinto3. O intervalo pós-eclosão

acarreta em período de restrição hídrica e alimentar, o que ocasiona desidratação, diminuição

do desenvolvimento do TGI, baixa atividade imunológica e perdas energéticas capazes de

afetar negativamente o desempenho das aves4,5.

Comumente, 12 horas antes de se iniciar o transporte dos pintos desde o

incubatório até as granjas, cerca de 20 a 30% dos pintainhos já nasceram. Com base nisto, a

duração do jejum torna-se ainda maior, visto que o tempo de acesso à primeira alimentação

não se restringe apenas ao período de transição incubatório-granja, deve-se levar em conta

também, o intervalo de nascimento dos pintos6.

15

Após o nascimento do pinto, o saco vitelino é o principal responsável pelo

fornecimento de macroléculas intactas, como imunoglobulinas e fosfolipídios, que servirão

como matéria prima para finalização da maturação do sistema imunológico do frango.

Posteriormente à eclosão, o TGI da ave está anatomicamente completo, contudo, sua

funcionalidade apresenta-se imatura frente às aves adultas e a demanda por energia e proteína

aumenta, visando à completa maturação do TGI. Tal amadurecimento ocorre

independentemente da presença de nutrientes exógenos. Nos casos em que estes nutrientes

não são fornecidos via alimentação, como acontece nos intervalos de alojamento, os pintos

utilizam a energia e a proteína oriundas do saco vitelino, interferindo, assim, na eficiência da

maturação imunológica, acarretando na perda de proteção frente aos microrganismos

infecciosos capazes de interferir na saúde da ave7,8, como Salmonella.

Em casos de desequilíbrio sanitário, a vulnerabilidade à Salmonella, além de

prejudicar o estado de saúde do frango, constitui ameaça à saúde publica, podendo estar

amplamente distribuída no sistema de produção avícola9. Essa distribuição contempla desde o

matrizeiro, onde pode ocorrer transmissão vertical da matriz ao embrião; o incubatório, com a

contaminação do fluxo de ar e infecção dos pintos no nascedouro ou com o contato dos

pintainhos com material contaminado; e até o galpão de produção, após a ingestão de

cascudinhos (Alphitobius diaperinus) ou ração contaminada10,11. Há, ainda, a possibilidade de

roedores e aves silvestres servirem de vetor da bactéria para o ambiente de produção das

aves12.

Diversos sorovares de Salmonella podem apresentar resistência ao meio ambiente

em condições variáveis, como na presença de esterco, cama úmida, excretas de aves

silvestres, equipamentos mal sanitizados, no solo dos arredores do aviário, sujidades de

poeira, etc. Além disso, a própria ave infectada pode servir como meio de disseminação de

Salmonella, nos casos de se apresentar como portadora assintomática13,14.

O resultado da infecção por Samonella depende, principalmente, do estado do

hospedeiro e da bactéria. Por sua vez, o estado da bactéria é determinado pela presença ou

ausência de genes e fatores de virulência e, ainda, se estes fatores serão expressos na bactéria

antes ou durante a infecção. Este estado é caracterizado de acordo com o sorovar em

questão15,16.

As salmoneloses são provocadas pelas duas espécies de Salmonella: enterica e

bongori. Aproximadamente 90 tipos de Salmonella se caracterizam como os sorovares mais

comumente envolvidos em quadros de infecção em animais e humanos12. As Salmoneloses

Aviárias se divivem em três, quanto ao agente etiológico que determina a doença. Deste

16

modo, o Tifo Aviário é a Salmonelose ocasionada por Salmonella Gallinarum; a Arizonose, a

enfermidade resultante da infecção por Salmonella enterica subespécie arizonae; e o Paratifo

Aviário, que pode ser desencadeado por qualquer tipo de Salmonella, com exceção das

mencionadas anteriormente.

As sorovariedades de salmonelas paratíficas nas produções de aves costumam

cursar com enfermidades subclínicas em aves portadores assintomáticas, fato que dificulta sua

detecção em meio à produção. A presença de portadores assintomáticos num plantel de

poedeiras pode implicar em contaminação endógena pela via transovárica, durante a formação

do ovo, gerando ovo contaminado que pode acarretar risco à saúde pública17.

O Paratifo Aviário é reconhecido em aves desde o final do século XIX, sendo

observado primariamente em pombos. Após essa observação e caracterização da enfermidade

como salmonelose, foi descrita em diversas outras espécies de aves no mundo. Nas ultimas

décadas do século XX, surtos de toxinfecção alimentar em humanos ocasionados pela

ingestão de produtos de origem avícola, reforçou a necessidade de evitar a presença dos

agentes etiológicos desta enfermidade na avicultura industrial12,18.

Como a etiologia desta salmonelose pode estar associada a vários tipos de

Salmonella, praticamente todos os países onde haja produção de aves, há presença de

salmonelas paratíficas19. No Brasil, alguns sorovares mais comumente encontrados em aves

incluem Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Derby, Salmonella

Heidelberg, Salmonella Senftenberg, Salmonella Agona e Salmonella Mbandaka20,21.

As aves jovens são mais susceptíveis a colonização de salmonelas paratíficas do

que as adultas. Isto se deve ao fato de que, além do sistema imune ainda não estar totalmente

desenvolvido em aves jovens, é necessário uma quantidade pequena de Salmonella para

promover a infecção, quando comparado a aves adultas22. A resposta imunológica das aves

frente a infecções por salmonelas paratíficas varia, de modo geral, com a instalação gradual

de uma microbiota intestinal comensal, que torna a ave menos susceptível a essas bactérias.

Essa susceptibilidade está relacionada com a maturação do sistema imune, que contribui para

tornar as aves mais resistentes, impedindo as manifestações sistêmicas do paratifo aviário23,24.

Em aves jovens, devido a uma resposta imune ainda ineficaz, incapaz de eliminar

salmonelas paratíficas do trato intestinal, pode ocorrer a disseminação bacteriana pelo

organismo, causando um quadro de infecção sistêmica. Neste caso, geralmente, a ave

manifesta sintomas clínicos de paratifo e, quando não morre, se reestabelece e torna-se

portadora inaparente de Salmonella23,24, colocando em risco a saúde pública.

17

De modo geral, a implicação direta ou indireta da ocorrência de Salmonella na

saúde pública, costuma estar relacionada ao consumo ou manuseio de ovos e carne de frango

crua com outros produtos crus que serão assim consumidos, ocasionando contaminação

cruzada. Não obstante, relaciona-se, também, com o consumo de carne de frango mal

cozida25. Por sua vez, a ocorrência e a quantidade de Salmonella na carne de frango variam

em função das condições de manejo na criação e dos cuidados higiênicos nas operações de

abate e manipulação das carcaças26.

Esta infecção por Salmonella é a causa mais frequente de surtos infeciosos de

origem alimentar na União Europeia, onde, anualmente, é reportado mais de 90 mil casos de

salmoneloses em humanos27. De 2007 a 2013, mais de 300 mil casos de infecção por

Salmonella Enteritidis foram notificados ao The European Surveillance System (TESSy -

Sistema de Vigilância Europeu) em 27 países da União Europeia, como Alemanha e

Republica Tcheca. Apenas no primeiro trimestre de 2014, 2076 casos de salmonelose foram

relatados a TESSy. Os casos foram atribuídos ao consumo de ovos e derivados de frango28.

No segundo semestre de 2014, o French Institute for Public Health Surveillance

(InVS – Instituto Francês de Vigilância da Saúde Publica) reportou 45 casos de salmonelose

em humanos no leste da França, todos relacionados com o consumo de ovos29,30. Neste

mesmo período, na Áustria, o Federal Ministry of Healt in Áustria (Ministério Federal da

Saúde na Áustria), relatou 61 casos de infecção por Salmonella, atribuídos ao consumo de

carne de frango31.

Na Alemanha, no inicio de 2014, o National Reference Centre at the Robert Koch

Institute (RKI - Centro Nacional de Referência do Instituto Robert Koch) reportou 24 casos

de salmonelose em humanos que se infectaram por Salmonella pelo consumo de ovos. Casos

similares foram notificados em Luxemburgo, pelo Public Heath Institute in Luxemburg (INS

– Instituto de Saúde Pública de Luxemburgo) e na Inglaterra, pelo Public Health England

(PHE – Saúde Pública da Inglaterra)32,33.

Na América do Sul, durante o ano de 2011, surtos de infecções por Salmonella

afetaram a região metropolitana do Chile, onde centenas de pessoas apresentaram quadros de

toxinfecção alimentar após cosumo de produtos derivados de aves34. No Brasil, segundo

dados da Secretaria de Vigilância em Saúde, ocorreram mais de 1500 surtos de salmonelose

entre os anos de 2000 a 2013, associados ao consumo de carne de frango e ovos, que são os

principais veículos deste microrganismo, embora muitos outros alimentos possam estar

contaminados.

18

O aparecimento destes e de outros surtos bacterianos ao longo das últimas

décadas, pôde favorecer com que os conhecimentos vinculados à capacidade de resistência

bacteriana e as consequências que tal característica poderia implicar no âmbito da produção e

sanidade animal e, direta ou indiretamente, na saúde humana, servindo de grande contribuição

para a Medicina Veterinária. Desde estudos mais detalhados e criteriosos em farmacologia,

métodos de ação e abrangência de medicamentos, até simples observações dentro dos

sistemas de produções, feitas por profissionais de campo, possibilitaram mostrar que o uso

indiscriminado de medicamentos para controle de enfermidades, deveria ser controlado.

Desta forma, a utilização de novos suplementos na alimentação de animais de produção

ganhou nova visão, onde a descoberta e fabricação de produtos em substituição aos

antimicrobianos mostraram-se via alternativa à capacidade de manter a qualidade produtiva

das aves.

Dentro desse contexto e, tendo em vista que o uso de antimicrobianos como

promotores de crescimento (APC) na alimentação animal foi vetado em 2006 pela União

Europeia, os programas de suplementação da alimentação de frangos de corte foram

ressaltados como uma alternativa aos APC por promover exclusão competitiva frente a

patógenos como Salmonella35-39. Resultados produtivos demonstraram que podem ser obtidos

através do fornecimento de alimentação equilibrada com probiótico, por estimularem o

desenvolvimento do TGI e aumentar a secreção de enzimas digestivas, melhorando, assim, a

capacidade de digestibilidade e absorção dos nutrientes do alimento39-41. A extração de

energia e nutrientes a partir de alimentos requer interação entre enzimas gastrintestinais do

frango e da microbiota presente no trato gastrintestinal (TGI). Atualmente é possível

influenciar ganhos de produtividade e resultados frente à sanidade animal por estimulação do

sistema imunológico, através da seleção e manipulação da microbiota do TGI41-44 como os

probióticos se propõem a fazer.

Os compostos probióticos recebem classificação quanto à sua natureza e emprego

científico na nutrição e são analisados em classes pelo modo de ação ou característica

funcional específica45. Especificamente, para aferir a eficácia e utilidade de probióticos

baseando-se em suas classificações, parâmetros como o efeito do aditivo sobre o agente

patogênico de interesse e os efeitos que implicará na microbiota gastrointestinal do

hospedeiro são avaliados47.

Abrangendo, em conceito, a atuação dos probióticos, estes podem ser definidos

como suplementos alimentares não patogênicos que resistem ao ácido gástrico e bile, aderem

ao epitélio e muco intestinal, persistem no TGI, produzem componentes inibitórios frente a

19

agentes infecciosos ou substâncias tóxicas e alteram a microbiota local, estimulando o sistema

imune associado ao intestino. Em suma, “são microrganismos vivos que conferem benefícios

á saúde do hospedeiro, quando administrados em quantidade adequada”47-49.

As diferentes atuações dos probióticos podem estar relacionadas com gêneros,

espécies ou estirpes dos microrganismos utilizados. Para isso, uma vertente viável quanto à

aplicação de probióticos pode ser a utilização de “blends” ou misturas de estirpes pertencentes

a diferentes gêneros ou espécies, a fim de atingir o máximo do espectro de ação do aditivo50.

Há algumas décadas atrás, Nurmi e Rantala, relataram que a administração de

microrganismos como probióticos para neonatos, reduziria a colonização de agentes

patogênicos devido à exclusão competitiva, ou seja, sugeriram que os microrganismos

competiam entre si pelo o espaço e nutrientes. Desde o proposto por Nurmi e Rantala,

diversas pesquisas foram feitas relatando a capacidade dos probióticos de reduzirem a

colonização de patógenos por outros métodos de ação51-54. Contudo, a exclusão competitiva

tem sido descrita como o principal método para prevenir a infecção por Salmonella55.

Com a mobilização cientifica em prol de pesquisas a fim de determinar a

abrangência dos probióticos, progressos significantes na legislação sobre avaliação de

segurança alimentar destes compostos tem sido feitos nos USA, Canadá e Europa, contudo,

não existe um padrão a ser seguido mundialmente56,57. No USA, os microrganismos

probióticos devem ser classificados como GRAS (Generally Recognized as Safe) pela FDA

(Food and Drug Administration). Na Europa, a EFSA (European Food Safety Authority) tem

introduzido o conceito de QPS (Qualified Presumption of Safety) que é similiar ao GRAS58,59.

No Brasil, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) segue basicamente os

mesmos moldes da classificação de probióticos como GRAS60.

Dentre os microrganismos classificados como probióticos para uso em

alimentação animal, Enterococcus, Lactobacillus, Saccharomyces, Bifidobacterium e

Bacillus, são os mais utilizados na para aves de produção61,62.

Devido as variáveis que cercam e desafiam a produção avícola industrial e, entre

elas, o intervalo de alojamento e a consequente susceptibilidade infecciosa à Salmonella, a

constante atualização frente a essas vertentes deve ser vista como prioridade entre os

produtores de frango. Com base nisto, os estudos e pesquisas com probióticos tornam-se cada

vez mais como chaves para a inovação de alternativas viáveis ao bom desempenho do frango

de corte. Contribuindo para este cenário, este trabalho se propôs a avaliar os efeitos da adição

alimentar de substâncias probióticas (cultura indefinida de microrganismos, parede celular de

levedura, leite desnatado em pó e antiumectante) sobre as variáveis de desempenho

20

zootécnico, saúde intestinal e imunidade em frangos de corte submetidos a diferentes tempos

de jejum e desafiados ou não com Salmonella enterica sorovar Heidelberg.

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26

CAPÍTULO 2 – EFEITO DE PROBIÓTICO NO DESEMPENHO ZOOTÉCNICO E

NA INTEGRIDADE INSTESTINAL DE FRANGOS DE CORTE INOCULADOS

EXPERIMENTALMENTE COM Samonella enterica SOROVAR HEIDELBERG

RESUMO: Neste estudo foram utilizados 570 pintos machos com um dia de idade, linhagem

Cobb, com o objetivo de avaliar os efeitos da adição de substâncias probióticas sobre as

variáveis de desempenho zootécnico e integridade intestinal de frangos de corte desafiados ou

não com Salmonella enterica sorovar Heidelberg (SH). As aves foram divididas em oito

tratamentos com seis repetições cada. Tratamento T1 – submetido a jejum de 24 horas, não

recebeu probiótico e nem inoculo; T2 – submetido a jejum de 24 horas, inoculado via oral

com 0,5 mL de solução salina tamponada e esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente

5,0 X 106UFC/mL de SH e não recebeu probiótico na ração; T3 – submetido a jejum de 24

horas, recebeu probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais

rações, mas não foi inoculado; T4 – submetido a jejum de 24 horas, inoculado por via oral

com 0,5 mL de solução salina tamponada e esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente

5,0 X 105 UFC/mL de SH e recebeu o probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e

100g/t nas demais rações; T5 – submetido a jejum de 36 horas, não recebeu probiótico e nem

o inoculo; T6 – submetido a jejum de 36 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução

salina tamponada e esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de

SH e não recebeu probiótico na ração; T7 – submetido a jejum de 36 horas, recebeu

probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais rações, mas não foi

inoculado; T8 – submetido a jejum de36 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução

salina tamponada e esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de

SH e recebeu o probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais

rações. As aves que foram inoculadas receberam o inoculo ao terceiro dia de idade. Nos oito

tratamentos, semanalmente, foram verificados índices zootécnicos através da pesagem das

aves e rações. Além disso, ao décimo e 35º dia de idade, seis aves por tratamento foram

pesadas, eutanasiadas e necropsiadas para que a avaliação da saúde intestinal através de

análises histomorfométricas, biometria de intestino e investigação da eficiência do probiótico

frente à colonização bacteriana através da pesquisa de SH em excretas pela bacteriologia

convencional, fossem realizadas. O probiótico propiciou dados de desempenho zootécnico

mais favoráveis e beneficiou a histomorfometria dos frangos com aumento da relação

vilo:cripta no duodeno e íleo. Além disso, demonstrou controlar excreção de SH. O peso dos

órgãos não sofreu influência, independente do tratamento.

Palavras-chave: aves, probióticos, morfometria intestinal, desempenho zootécnico,

salmonelose.

27

CHAPTER 2 - EFFECT OF PROBIOTIC ON THE PERFORMANCE AND

INTEGRITY OF BROILER INSTESTINAL INOCULATED WITH Salmonella

enterica SEROVAR HEIDELBERG

ABSTRACT: Were used in this study 570 male chickens of one-day old, Cobb, in order to

assess the effects of adding probiotic substances on the variables zootechnical performance

and intestinal integrity of broilers challenged or not with Salmonella enterica serovar

Heidelberg (SH). The birds were divided into eight treatments with six replicates each.

Treatment (T) 1 - 24 hours fasting, not received probiotic neither inoculum; T2 - fasting for

24 hours, orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85%

containing approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and not received the probiotic; T3 - 24

hours fasting, received probiotic in the proportion of 500g / t of pre-initial feed and 100 g / t

in the other feeds, but was not inoculated; T4 - fasting for 24 hours orally inoculated with 0.5

ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing approximately 5.0 X 105 CFU /

mL SH and the probiotic in the proportion of 500g / t of feed pre-initial and 100 g / t in the

other feed; T5 - 36 hours fasting, not received probiotic neither inoculum; T6 - fasting for 36

hours orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing

approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and not received the probiotic; T7 - 36 hours fasting,

received the probiotic in the proportion of 500g / t of pre-initial feed and 100 g / t in the other

feeds, but was not inoculated; T8 - fasting for 36 hours orally inoculated with 0.5 ml of sterile

phosphate buffered saline and 0.85% containing approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and

the probiotic in the proportion of 500g / t of feed pre-initial and 100 g / t in the other diets.

The birds that were inoculated received the inoculum on the third day of age. In the 8

treatments, weekly, they were checked zootechnical indices by weighing the birds and feed.

Futhermore, activities such as the evaluation of intestinal health by histomorphometric

analysis, SH research in conventional bacteriology in excreta, biometrics analysis in, were

held. The probiotic led to more favorable production performance data and benefited

histomorphometry of chickens with increased villus : crypt ratio in the duodenum and ileum.

Moreover, it showed salmonella excretion control. The intestine weight was not affected,

regardless of treatment.

Keywords: birds, probiotics, intestinal morphology, growth enhancer, salmonellosis.

28

1. INTRODUÇÃO

A integridade intestinal consiste em um dos principais fatores para que ocorra a

digestão e absorção dos nutrientes, os quais refletem em parâmetros zootécnicos. Como

tentativa de favorecer estes parâmetros, antibióticos melhoradores de desempenho (AMP) têm

sido adicionados à alimentação animal e contribuído para controlar patógenos e favorecerem,

em conjunto, a conversão alimentar e o ganho de peso das aves. Entretanto, é provável que o

indiscriminado destes fármacos tenha permitido que as bactérias se tornassem resistentes aos

efeitos bacteriostáticos.

Em resposta a essa resistência bacteriana, a União Europeia apresentou, em 2006,

sugestões como a restrição ou, até mesmo, a proibição da utilização de AMP’s na alimentação

animal, apoiando-se no “princípio da precaução”1. Este princípio tem possibilitado a utilização

de aditivos alimentares alternativos, como os probióticos. Compostos probioticos não apresentam

efeitos colaterais conhecidos e são considerados seguros na cadeia alimentar. Estes aditivos são

como ferramentas microbianas vivas que possibilitam desenvolvimento equilibrado da

microbiota intestinal de frangos, através da manutenção da mucosa saudável, favorecendo a

melhora na arquitetura do epitélio e estimulando a motilidade intestinal. Além disso, facilitam

a metabolização de substâncias citotóxicas e a supressão de patógenos pela competição por

sitos de adesão na mucosa e, ainda, pela produção de componentes antimicrobianos, o que

favorece a atuação do sistema imunológico contra patógenos como Salmonella2,3.

Salmonella pertence à família das Enterobacteriaceae, atualmente com mais de 2650

sorovares descritos4. Amplamente disseminada pelo fluxo de produção de frango, apresenta-se

como desafio à saúde pública, visto que a prevalência de distintos sorovares favorece a sua

epidemiologia5,6 Na Europa, diferentes sorovares como Salmonella Typhimurium e Salmonella

Enteritidis, têm sido comumente associados a surtos de doenças em humanos, principalmente pelo

contato com carne, ovos ou derivados de frango contaminados com Salmonella e exportados do

Brasil7-9. Dentre os sorovares mais reportados nos último ano, Salmonella Heidelberg e

Salmonella Minnesota ganham destaque entre as cepas paratíficas11-14.

Além da complexidade epidemiológica da bactéria, uma característica que

dificulta o controle de Salmonella na cadeia de produção de aves é a ausência de sinais

clínicos ou lesões em aves contaminadas por sorovares paratifoides, o que determina, na

maioria dos casos, frangos portadores assintomáticos que pode contribuir para a contaminação

do produto final, interferindo na segurança alimentar.

29

Diante do exposto, o objetivo do trabalho foi avaliar a influência de probiótico no

desempenho zootécnico e integridade intestinal de frangos de corte inoculados

experimentalmente com Salmonella Heidelberg e mantidos sobre diferentes tempos de jejum

pós-eclosão.

30

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Local

O experimento foi conduzido no Núcleo Experimental de Doenças de Aves e no

Laboratório de Bacteriologia, ambos localizados no Departamento de Medicina Veterinária da

Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (DMV/EVZ/UFG).

O protocolo experimental utilizado nessa pesquisa foi aprovada pela Comissão de

ética no Uso de Animais/CEUA – UFG sob o nº029/16.

2.2. Delineamento experimental

Foram adquiridos 570 pintos (Gallus gallus domesticus) linhagem Cobb, machos

de um dia de idade, os quais foram, após pesagem, distribuídos em delineamento inteiramente

casualizado em oito tratamentos com seis repetições cada e alojados em grupos de 12 aves por

unidade experimental, seguindo o delineamento apresentado no Quadro 1, conforme descrito

a seguir:

TRATAMENTO 1:constituiu o grupo que foi submetido a jejum de 24 horas, não

recebeu o probiótico e nem o inoculo (Controle 24h);

TRATAMENTO 2: constituiu o grupo que foi submetido a jejum de 24 horas, foi

inoculado experimentalmente no terceiro dia de vida com o inoculo bacteriano

contendo aproximadamente 5,0 X 105UFC/mL de SH e não receberam o

probiótico na ração (SH 24h);

TRATAMENTO 3: constituiu o grupo que foi submetido á jejum de 24 horas,

recebeu o probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas

demais rações, mas não foi inoculado (Prob. 24h);

TRATAMENTO 4: constituiu grupo que foi submetido a jejum de 24 horas, foi


contendo aproximadamente 5,0 X 105UFC/mL de SH e receberam o probiótico na

proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais rações (SH + Prob.

24h);



31





TRATAMENTO 7: constituiu o grupo que foi submetido a jejum de 36 horas,



TRATAMENTO 8: constituiu o grupo que foi submetido jejum de 36 horas, foi




36h);

QUADRO 1 – Delineamento experimental dos tratamentos

Tratamento Nº de

repetições

Nº de aves

por

repetição

Nº de aves

por

tratamento

Tempo de

Jejum

Inoculados

com

Salmonella

Heidelberg

Alimentados

com

probiótico

T1 6 12 72 24h NÃO NÃO

T2 6 12 72 24h SIM NÃO

T3 6 12 72 24h NÃO SIM

T4 6 12 72 24h SIM SIM

T5 6 12 72 36h NÃO NÃO

T6 6 12 72 36h SIM NÃO

T7 6 12 72 36h NÃO SIM

T8 6 12 72 36h SIM SIM

As aves inoculadas e não inoculadas foram mantidas em alojamentos separados,

em baterias de aço galvanizado com quatro andares, equipadas com comedouros e bebedouros

do tipo lineares e bandejas para retirada de excretas, mantendo-se a mesma ambiência entre os

alojamentos. As baterias foram aquecidas com uma lâmpada incandescente de 60W por andar

até os 35 dias de idade.

Os pintos de um dia de idade utilizados no experimento foram adquiridos de um

incubatório comercial que realiza a vacinação das aves contra Marek e New Castle, conforme

Certificado Satinário 006/2016/DF.

32

2.3. Preparação do inoculo

O inoculo foi elaborado com Samonella enterica sorovar Heidelberg isoladas de

amostras provenientes de frangos de corte, concedidas pelo Laboratório de Bacteriologia da

Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás e tipificada pelo

Laboratório FIOCRUZ-RJ.

A cepa foi repiada em ágar verde brilhante e posteriormente mantida em

temperatura de incubação de 37ºC por 24 horas. Em seguida, as células foram suspensas em

solução salina tamponada a 0,85% e armazenada a 4ºC. A concentração de 5,0 X 106

UFC/mL para Salmonella enterica sorovar Heidelberg foi ajustada com o auxílio da escala de

Mac Farland e confirmada por plaqueamento das diluições seriadas em ágar verde brilhante,

com posterior incubação a 37ºC e contagem das Unidades Formadoras de Colônia UFC da

bactéria15.

2.4 Inoculação das Aves

Com três dias de idade, utilizando seringas de 1mL, foram inoculados os pintos

por via oral com 0,5mL de solução salina tamponada a 0,85%, contendo aproximadamente 5,0

X 106 UFC/mL de Salmonella enterica sorovar Heidelberg.

2.5. Programa Alimentar

O programa alimentar foi composto por três rações experimentais, destinadas a

diferentes fases da criação: pré-inicial, 1 a 7 dias de idade; inicial, 8 a 21 dias de idade; e

crescimento, 22 a 35 dias de idade (Tabela 1). As rações fornecidas aos animais, farelada à

base de milho moído e farelo de soja, foram formuladas de acordo com a composição dos

alimentos e exigências nutricionais preconizadas por Rostagno16. O probiótico composto por

cultura indefinida de microrganismos, parede celular de levedura, leite desnatado em pó e

antiumectante, foi adicionado à ração em substituição ao material inerte, de acordo com a

recomendação do produto.

Durante todo o período experimental, as aves receberam alimentação e água ad

libitum.

33

TABELA 1 – Composição percentual das rações experimentais fornecidas às aves durante o

período experimental (1-35 dias de idade)

Ingredientes¹ Pré-inicial

(1-7 dias)

Inicial

(8-21 dias)

Crescimento

(22-35 dias)

Milho grão 55,4 59,7 62,0

Farelo de soja (45%) 38,2 34,64 31,33

Óleo de sola 2,09 1,99 2,99

Fosfato bicálcico 1,90 0,99 1,70

Calcário 0,91 1,26 0,51

Sal comum 0,50 0,48 0,41

DL-metionina 0,36 0,29 0,24

L-lisina HCL 0,29 0,21 0,20

L-treonina 0,11 0,06 0,30

Premix-vitamínico* 0,10 0,10 0,10

Premix mineral** 0,05 0,05 0,05

Inerte (amido) 0,10 0,20 0,40

Total 100,00 100,00 100,00

Nutrientes Atendimento

Energia metabolizável

(kcal/kg)

2.960 3.050 3.150

Proteína bruta 22,40 21,20 19,80

Cálcio (%) 0,92 0,841 0,75

Fósforo disponível (%) 0,47 0,40 0,38

Sódio (%) 0,22 0,21 0,20

Lisina (%) 1,34 1,21 0,82

Metionina + cistina***(%) 0,96 0,87 0,82

Metionina***(%) 0,68 0,60 0,59 ¹Quantidade por kg de produto.

*Suplemento vitamínico (níveis de garantia por kg do produto): vit. A, 1.680.000 UI; vit.D 3, 400.000 UI; vit. E,

3500 mg; vit. K, 360 mg; vit. B1, 436,50 mg; vit. B2, 1.200 mg; vit. B6, 624 mg; vit. B12, 2.400mcg; ác. Fólico,

200 mg; ác. pantotênico, 3.120 mg; niacina, 8.400 mg; biotina, 10.000 mcg.

** Suplemento mineral (níveis de garantia por kg do produto): zinco, 17.500 ppm; ferro, 12.500 ppm; cobre,

2.000 ppm; iodo, 187,50 ppm; selênio, 75 ppm.

*** Digestível.

2.6. Desempenho

As pesagens das aves, assim como das rações, aconteceram semalmente, aos sete,

14, 21, 28 e 35 dias de idade, para cálculo de consumo de ração, ganho de peso e conversão

alimentar, sendo observado o seguinte:

Peso Médio (PM): calculado pela divisão do peso total das aves de cada parcela pelo

número total das aves da parcela, PM=PF/NMA;

Ganho de Peso (GP): obtido pela diferença entre o peso final e o peso inicial das aves

somado ao peso da ave morta e dividido pelo número médio de aves, GP=[(PF-PI) + Peso

da ave morta]/NMA;

34

Consumo de Ração (CR): calculado pela razão entre o consumo de ração total (fornecido –

sobra) e o número total de aves;

Conversão Ailmentar (CA): calculada pela divisão CR/PM;

Mortalidade Corrigida: para análise estatística o valor em percentagem de mortalidade será

transformado em Arc seno ((%Mort./100)+0,05)0,5.

2.7. Histomorfometrial intestinal

Ao 10º e 35º dia de idade, seis aves por tratamento foram submetidas a jejum de 8

horas, eutanasiadas, necropsiadas e os intestinos foram coletados. Fragmentos do duodeno, na

flexura do pâncreas e do íleo, um terço antes da inserção dos cecos, foram coletados,

seccionados longitudinalmente e abertos de forma que as extremidades foram fixadas com

grampo em pedaços de isopor com tamanho proporcional aos fragmentos.

Cada amostra foi armazenada em frascos contendo formol a 10% durante 24h.

Após a fixação, cada fragmento foi recortado, dispostos em cassetes e identificados.

Posteriormente foram lavados em água corrente e desidratados com álcool etílico de forma

crescente, desde 70% até o álcool absoluto. Em seguida, cada fragmento foi clarificado com

xilol e impregnado em parafina histológica, para que cortes de 5μm fossem feitos em cada

amostra e, assim, serem distendidos sobre lâminas histológicas e corados por Hematoxilina e

Eosina17 para, então, serem submetidas ao exame histomorfométrico com a utilização do

software Image J18 onde foram feitas as seguintes aferições:

Altura de vilosidade: medida do ápice do vilo até a base da junção do vilo com a cripta;

Profundidade de cripta: medida através da profundidade da invaginação da cripta com os

vilos adjacentes;

Em cada lâmina de fragmento de tecido intestinal foram feitas cinco leituras,

padronizadas sempre da direita para esquerda, a fim de aferir a altura de vilo e outras cinco

para profundidade de cripta. Cada imagem obtida foi digitalizada do microscópio de campo

claro para o computador, utilizando câmera de vídeo analógica juntamente com placa de

captura.

35

2.8. Pesquisa de Salmonella enterica sorovar Heidelberg

Semanalmente, ao sétimo, 14º, 21º e 28º dia de idade, amostras de 25g de excreta

das bandejas das gaiolas de todos os tratamentos, incluindo suas repetições, foram coletadas

assepticamente para análise bacteriológica. As amostras foram acondicionadas em stomachers

contendo 250 mL de água peptonada e incubadas a 37ºC/24h.

Após a incubação das amostras, alíquotas de 1,0 mL da água peptonada foram

transferidas para tubos de caldo seletino cistina e 0,1 mL para tubos de caldo Rappaport

Vassiliadis e incubados a 41ºC por 24 horas. Após o enriquecimento seletivo, de cada caldo

foram feitos repiques no ágares verde brilhante e Xylose-Lysine-Tergitol4 (XLT4) e

incubadas a 37ºC/24h. De cada um dos ágares, foram selecionadas três a cinco Unidades

Formadoras de Colônia (UFC) sugestivas da bactéria e repicadas em ágar tríplice açucar-ferro

(TSI), seguindo-se incubação de 37ºC/24h. Os TSI que apresentaram crescimento sugestivo

para Salmonella, foram submetidos ao teste da urease, produção de indol, vermelho de metila,

motilidade, utilização do malonato e lisina descarboxilase.

2.9 Exame biométrico de intestino

Também ao décimo e 35º dia de idade, seis aves por tratamento foram submetidas

a jejum de 8 horas, pesadas e eutanasiadas. O peso das aves e do intestino foram considerados

para o cálculo do peso relativo do órgão/100g peso vivo da ave x 10019.

2.10 Análises estatísticas

Os dados de desempenho zootécnico, exame histomorfométrico e biometria foram

submetidos à análise de variância e as médias comparadas, quando necessário, pelo teste de

Tukey a 5%. O isolamento de Salmonella foi avaliado por teste descritivo, onde foram

consideradas apenas as frequências encontradas nas variáveis. Para realização dos testes, foi

utilizado o programa estatístico R versão 3.3.0.

36

3. RESULTADOS

Os dados das variáveis analisadas foram submetidos ao teste de regressão, no qual

não houve ajuste significativo. Realizados os testes, fez-se análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey a 5%.

Nas Tabelas 2, 3, 4, 5 e 6 encontram-se os dados referentes às variáveis de

desempenho dos frangos.

TABELA 2 – Peso inicial (PI), peso médio (PM), ganho de peso (GP), consumo de ração

(CR), conversão alimentar (CA) de frangos de corte submetidos a diferentes

tempos de jejum pós-eclosão, inoculados experimentalmente com Salmonella

enterica sorovar Heidelberg (SH) e alimentados com probiótico no período de

1-7 dias de idade

Tratamentos PI(g) PM(g) GP(g) CR(g) CA(g/g)

Controle 24h 44,94 179,05ab 134,16ab 149,83 1,11ab

Prob. 24h 44,85 184,55a 139,11a 146,27 1,05b

Controle 36h 45,08 175,41ab 130,61b 148,86 1,13ab

Prob. 36h 45,05 183,16ab 138,11ab 144,86 1,05b

SH 24h 44,77 175,41b 130,61b 149,00 1,14ab

SH + Prob. 24h 44,94 180,77ab 135,83ab 144,58 1,06b

SH 36h 44,88 174,97b 130,08b 149,83 1,15a

SH + Prob. 36h 44,85 180,97ab 136,11ab 145,66 1,07ab

P > F 0,088 0,005 0,005 0,062 0,001

C.V.(%) 0,330 2,700 3,610 2,530 4,770

a,bMédias com letras diferentes diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% (P≤0,05).

Observa-se na Tabela 2 que, no período de 1-7 dias de idade, Salmonella

Heildelberg influenciou negativamente o desempenho das aves, diminuindo os valores de PM

e GP e aumentando a CA das aves aos sete dias de idade. O probiótico adicionado à ração das

aves proporcionou resultados de avaliação de desempenho melhores que outros tratamentos.

Por outro lado, frangos que receberam probiótico e foram inoculados com Salmonella

obtiveram dados de desempenho semelhantes aos do grupo controle. Além disso, como

também pode ser notado, o tempo jejum exerceu influência sobre as variáveis analisadas.

Aves que foram submetidas a 36 horas de jejum pós-eclosão obtiveram resultados menores

quando comparadas àquelas que foram submetidas a 24 horas, independente do tratamento.

37





1-14 dias de idade

Tratamentos PM(g) GP(g) CR(g) CA(g/g)

Controle 24h 503,90 458,92 565,49 1,23

Prob. 24h 506,90 462,04 57,07 1,24

Controle 36h 502,26 457,17 558,78 1,22

Prob. 36h 506,15 450,09 562,36 1,24

SH 24h 488,59 456,17 577,36 1,26

SH + Prob. 24h 504,82 459,87 583,36 1,26

SH 36h 483,43 438,55 554,74 1,26

SH + Prob. 36h 502,74 447,88 567,54 1,26

P > F 0,340 0,336 0,404 0,867

C.V.(%) 4,110 4,500 4,110 4,580

Os dados apresentados na Tabela 3, quanto aos parâmetros de avaliação de

desempenho, não apresentaram diferenças significativas entre os diferentes tratamentos no

período de 1-14 dias de idade.





1-21 dias de idade


Controle 24h 936,87b 918,98b 1403,20 1,52c

Prob. 24h 973,74a 929,56a 1426,92 1,53c

Controle 36h 934,75b 918,70b 1388,12 1,51c

Prob. 36h 964,31a 925,49a 1405,69 1,51c

SH 24h 877,91d 833,13d 1387,59 1,66ab

SH + Prob. 24h 931,74bc 915,03bc 1468,70 1,76a

SH 36h 865,19d 830,30d 1370,37 1,65ab

SH + Prob. 36h 919,06c 910,20c 1412,34 1,55b

P > F <0,001 <0,001 0,326 0,013

C.V.(%) 4,220 4,520 4,780 4,49 a,bMedias com letras diferentes diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% (P≤0,05).

38





1-28 dias de idade


Controle 24h 1783,99ab 1739,42ab 2161,83 1,24c

Prob. 24h 1853,08a 1808,22a 2147,07 1,18d

Controle 36h 1701,07bc 1656,25bc 2139,08 1,29c

Prob. 36h 1790,48a 1745,42a 2104,37 1,20cd

SH 24h 1659,08cd 1613,99cd 2224,83 1,37ab

SH + Prob. 24h 1700,07c 1655,29c 2255,10 1,36ab

SH 36h 1590,53d 1545,65d 2245,07 1,45a

SH + Prob. 36h 1674,07c 1629,21c 2141,85 1,31b

P > F <0,001 <0,001 0,472 <0,001

C.V.(%) 2,620 2,690 5,45 5,02

a,bMedias com letras diferentes diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% (P≤0,05).





1-35 dias de idade


Controle 24h 2241,10ab 2196,88ab 3281,05 1,49ab

Prob. 24h 2272,31a 2227,45a 3109,18 1,39c

Controle 36h 2229,83ab 2184,97ab 3382,44 1,54a

Prob. 36h 2264,94a 2219,88a 3101,45 1,39c

SH 24h 2019,18cd 1974,41cd 3038,81 1,53a

SH + Prob. 24h 2215,68ab 2170,79ab 3117,97 1,43b

SH 36h 1983,42d 1938,53d 2996,57 1,54a

SH + Prob. 36h 2127,78bc 2082,69bc 3167,45 1,52a

P > F <0,001 <0,001 0,086 <0,001

C.V.(%) 3,360 3,430 5,400 5,980

a,bMedias com letras diferentes diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% (P≤0,05).

Como pode ser observado nas Tabelas 4, 5 e 6, com exceção do consumo de

ração, que parece não ter sofrido alterações significativas (P<0,05), as variáveis de

desempenho dos frangos mantiveram o mesmo padrão notado na Tabela 2. Os valores de PM,

GP e CA demonstraram ser mais positivos nos tratamentos que receberam probiótico e os

tratamentos que foram inoculados com SH apresentaram valores de desempenho menores

39

quando comparado aos demais, em todos os períodos de avaliação, indicando que houve

influência negativa da presença de SH sobre a obtenção dos valores de desempenho

zootécnico positivos.

Além disso, os tratamentos que foram submetidos a 36h de jejum continuaram

com os valores mais inferiores dentre os tratamentos. Observa-se também que, o tratamento

SH + Prob. 24h, alcançou os dados de desempenho dos grupos controle negativos nos dois

períodos de tempo de jejum, com exceção dos valores de consumo de ração e conversão

alimentar.

Na tabela 7 são apresentados os resultados dos exames histomorfométricos aos

dez dias de idade.

TABELA 7 – Alturas médias dos vilos (AV), profundidades de criptas (PC) e relação

vilo:cripta do duodeno e jejuno de frangos de corte submetidos a diferentes


enterica sorovar Heidelberg (SH) e alimentados com probiótico até os 10

dias de idade

Duodeno

Tratamento AV PC Vilo : Cripta

Controle 24h 959,02b 209,06 4,58ab

Prob. 24h 1002,72a 212,43 4,72a

Controle 36h 945,00b 210,11 4,49ab

Prob. 36h 1002,05a 212,52 4,71a

SH 24h 814,43d 198,02 4,11c

SH + Prob. 24h 895,97c 210,08 4,26b

SH 36h 814,01d 198,01 4,11c

SH + Prob. 36h 893,09c 208,00 4,29b

P > F 0,004 0,091 0,006

C.V. (%) 12,760 20,31 16,33

Tratamento Jejuno

Controle 24h 612,03b 189,06 3,23b

Prob. 24h 657,54a 188,12 3,49a

Controle 36h 612,23b 194,01 3,15c

Prob. 36h 647,05a 186,43 3,47a

SH 24h 512,01d 158,06 3,23b

SH + Prob. 24h 597,91c 176,20 3,39a

SH 36h 510,00d 158,90 3,20b

SH + Prob. 36h 581,68c 181,34 3,20b

P > F 0,004 0,870 0,008

C.V. (%) 11,34 18,90 17,31 a,bMedias com letras diferentes diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% (P≤0,05).

Como pode ser observado na Tabela 7, aos dez dias de idade, Salmonella

interferiu na conformação histomorfométrica do TGI dos frangos. Houve diminuição da altura

40

de vilosidade e da relação vilo : cripta, em ambos os fragmentos intestinais avaliados. Além

disso, o tempo de jejum demonstrou influenciar a obtenção de dados histomorfométricos mais

positivos, independente do tratamento. O probiótico também parece ter beneficiado a estrutura

dos vilos e criptas, resultando em AV e relação vilo : cripta mais altas que as demais.

Semanalmente foram avaliadas as frequências de isolamento de Salmonella em

amostras de excretas dos frangos, conforme apresentado na Tabela 8.

TABELA 8 – Isolamento semanal de Salmonella sp. em excretas de frangos de corte



alimentados com probiótico até os 33 dias de idade

Tratamentos 5 dias 12 dias 19 dias 26 dias 33 dias

Controle 24h - - - - -

Prob. 24h - - - - -

Controle 36h - - - - -

Prob. 36h - - - - -

SH 24h + + + + +

SH + Prob. 24h + + + + -

SH 36h + + + + +

SH + Prob. 36h + + + + -

Observa-se na Tabela 8 que SH não foi isolada em nenhuma das amostras de

excretas de frangos dos tratamentos que não receberam o inoculo bacteriano. Por outro lado,

entre os tratamentos que foram inoculados com SH, conseguiu-se isolar em todas as datas de

coleta e em quase todas as amostras de excretas destes grupos. Entretanto, aos 33 dias, nota-se

que não houve isolamento de SH nos tratamentos que foram inoculados e receberam

probiótico na dieta.

TABELA 9 – Peso relativo de intestino aos 10 e 35 dias de idade de frangos de corte.



alimentados com probiótico até os 35 dias de idade

Intestino (g)

Tratamentos 10 dias de idade 35 dias de idade

Controle 24h 7,86 2,54

Prob. 24h 8,20 2,97

Controle 36h 7,50 2,44

Prob. 36h 8,08 2,86

41

TABELA 9 – Peso relativo de intestino aos 10 e 35 dias de idade de frangos de corte submetidos

a diferentes tempos de jejum pós-eclosão, inoculados experimentalmente com

Salmonella enterica sorovar Heidelberg (SH) e alimentados com probiótico até os

35 dias de idade (continuação)

Intestino (g)

Tratamentos 10 dias de idade 35 dias de idade

SH 24h 7,06 2,34

SH + Prob. 24h 7,90 2,83

SH 36h 7,12 2,30

SH + Prob. 36h 7,88 2,80

P > F 0,064 0,215

C.V. (%) 9,20 16,54

Pode ser observado que, nas duas idades que foram realizadas a avaliação do peso

do intestino, não houve diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos.

42

4. DISCUSSÃO

Os dados de desempenho zootécnico dos frangos, com exceção dos resultados

obtidos no período de 1-14 dias, demonstraram que houve padrão entre as variáveis

analisadas, onde, independente do tratamento, SH e os diferentes tempos de jejum

influenciaram negativamente os resultados e o probiótico proporcionou valores mais

positivos.

Montzouris et al.20 também observaram que Salmonella pode reduzir os

desempenho em frangos de corte por interferir na integridade intestinal. É possível que o dano

que a bactéria promova na mucosa no TGI dos frangos ao lesionar o epitélio intestinal,

interfira na digestão e na absorção de nutrientes21

A manutenção da integridade morfofuncional do TGI é essencial para se obter

bons resultados zootécnicos22, e compreender a importância da microbiota presente no TGI

dos frangos e as possíveis influências desta sobre a nutrição das aves também é

fundamental23. Além disso, a microbiota do TGI exerce importante papel na proteção contra

patógenos, agentes tóxicos e no desenvolvimento do sistema imunológico24 e, com o

favorecimento ao desenvolvimento desta microbiota, promovido pelo probiótico, sua

capacidade de interação com o meio, aumenta25,26, o que pode ter favorecido os resultados da

avaliação de desempenho zootécnico observados entre os tratamentos que receberam

probiótico.

Desta forma, o aumento da altura das vilosidades intestinais, bem como o

favorecimento da relação vilo : cripta entre os tratamentos que foram suplementados com

probiótico na dieta de frangos, se apoia no fato do TGI das aves poder responder a estímulos

internos e externos, possibilitando a manipulação de características morfofuncionais27,28 e

beneficiando o desempenho das aves. Estes resultados foram semelhantes aos observados por

outros autores29,30, que constataram que a suplementação probiótica em aves pode favorecer a

histomorfometria intestinal, refletindo em parâmetros de avaliação zootécnica mais positivos,

em decorrência do aumento da superfície intestinal de absorção de nutrientes.

Acrescenta-se ainda que, que a suplementação com probiótico influenciou a

excreção de Salmonella, corrobando com Valaja et al.31, os quais, observaram que a adição de

compostos probióticos na dieta de frangos pode controlar a colonização intestinal por

Salmonella. Possivelmente, os compostos probióticos não agem diretamente frente

Salmonella, no entanto, podem ocasionar efeitos benéficos pela desintoxicação de

metabólitos32 que podem ser oriundos da interação Salmonella X Hospedeiro; reforço na

43

morfologia da mucosa intestinal29,33; estímulo à produção de enzimas gastrintestinais34 e pela

exclusão competitiva entre os microrganismos probióticos e Salmonella35-37.

Possivelmente, o probiótico adicionado à dieta dos frangos, favoreceu o equilíbrio

dessa microbiota através da manutenção do ambiente do TGI, como pôde ser observado nos

obtidos de peso médio, ganho de peso e conversão alimentar. Uma das atuações dos

probióticos é formar uma barreira física que impeça a colonização de agentes patogênicos na

parede do intestino que podem interferir na saúde intestinal38. Para manter o equilíbrio da

microbiota, os microrganismos estabelecem relações de cooperação e os microrganismos

benéficos exercem a “exclusão competitiva” para impedir a colonização do intestino por

patógenos. Para isso os microrganismos benéficos ocupam os pontos de ligação da superfície

da mucosa o que leva a competição por locais de aderência e também promovem competição

por nutrientes e liberação de bacteriocinas, regulando a ecologia microbiana e influenciando o

bom desempenho zootécnico39,40.

Quanto à influência dos tempos de jejum alimentar sobre as variáveis analisadas,

notou-se que o tempo de jejum influenciou negativamente a obtenção de valores de

desempenho zootécnico mais favoráveis, com pouca diferença significativa entre as duas

diferentes horas de jejum. Lorenço e Burkholder et al.41,42 tambem observaram que o tempo

de jejum prolongado aliado ao consequente estresse, podem influenciar no arranjo da

microbiota do TGI, na composição dos microrganismos que irão compô-la, bem como

influenciar o desempenho zootécnico e a suscetibilidade a patógenos.

Dessa forma, pintos que recebem alimento logo após a eclosão, podem apresentar

melhor desempenho quando comparados àqueles que são submetidos a tempos prolongados

de jejum. Também Uni e Maiorka et al.43,44 observaram que tempo de jejum de até 24 horas já

pode prejudicar o desenvolvimento da mucosa do TGI de frangos de corte. Paralelamente ao

efeito benéfico do fornecimento precoce de alimentos, a adição probiótica logo na fase pré-

inicial na dieta das aves pode resultar em parâmetros de desempenho mais positivos que

podem ser obtidos já nas primeiras avaliações de peso médio, ganho de peso e conversão

alimentar45, como pôde ser observado entre os tratamentos

Além disso, o probiótico pareceu influenciar na excreção de Salmonella dos

frangos, como foi observado no isolamento negativo aos 33 dias de idade dos frangos. De

acordo com Hermann46, Salmonella sp, após a colonização instestinal no TGI de frangos,

multiplicam-se e são eliminadas pelas fezes, estabelecendo-se, assim, contaminação do

ambiente pela disseminação horizontal da bactéria. Uma das principais características dos

compostos probióticos é promover alterações conformacionais no ambiente do TGI das

http://ps.fass.org/search?author1=K.+M.+Burkholder&sortspec=date&submit=Submit

44

aves47, através do bloqueio dos potenciais locais de fixação de patógenos no epitélio do

intestino31, aumentando assim, a resistência frente à colonização de Salmonella sp em frangos

e favorecendo sua excreção via fecal.

Isoladamente, os resultados obtidos na Tabela 3, onde os dados de desempenho

não demonstraram diferenças significativas entre os tratamentos, e isso possivelmente

ocorreu, pois o desafio bacteriano imposto por Salmonella foi atenuado em decorrência dos

efeitos do probiótico, nivelando os parâmetros de desempenho zootécnico aos outros

tratamentos. Resultados similares foram obtidos por e Amerah et al.47, que observaram que as

variáveis de desempenho não foram afetadas pela inoculação de Salmonella Heidelberg em

frangos de corte. Por outro lado, Muniz et al.11, ao inocular frangos com Salmonella

Minessota, chegaram a concluir que as aves que receberam o desafio bacteriano apresentaram

maior peso entre as demais. Sendo assim, os mecanismos da relação Salmonella:ave que

podem ocasionar os resultados obtidos, não estão totalmente esclarecidos.

45

5. CONCLUSÃO

A adição de probiótico à ração de frangos de corte, independente do

tratamento, favoreceu os resultados de desempenho zootécnico, bem como controla a

excreção de Salmonella Heildelberg e contribui para a integridade intestinal das aves.

46

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50

CAPÍTULO 3 – EFEITO DE PROBIÓTICO SOB A ATIVIDADE IMUNOLÓGICA

DE FRANGOS DE CORTE EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM

Salmonella enterica SOROVAR HEIDELBERG

RESUMO: Neste estudo foram utilizados 570 pintos machos com um dia de idade, linhagem

Cobb, com o objetivo de avaliar os efeitos da adição de substâncias probióticas sobre o

sistema imune de frangos de corte desafiados ou não com Salmonella enterica sorovar

Heidelberg (SH). As aves foram divididas em oito tratamentos com seis repetições cada.

Tratamento T1 – submetido a jejum de 24 horas, não recebeu probiótico e nem inoculo; T2 –

submetido a jejum de 24 horas, inoculado via oral com 0,5 mL de solução salina tamponada e

esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 106UFC/mL de SH e não recebeu

probiótico na ração; T3 – submetido a jejum de 24 horas, recebeu probiótico na proporção de

500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais rações, mas não foi inoculado; T4 – submetido

a jejum de 24 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução salina tamponada e


probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais rações; T5 –

submetido a jejum de 36 horas, não recebeu probiótico e nem o inoculo; T6 – submetido a


esterilizada a 0.85% contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/mL de SH e não recebeu

probiótico na ração; T7 – submetido a jejum de 36 horas, recebeu probiótico na proporção de

500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais rações, mas não foi inoculado; T8 – submetido

a jejum de 36 horas, inoculado por via oral com 0,5 mL de solução salina tamponada e


probiótico na proporção de 500g/t de ração pré-inicial e 100g/t nas demais rações. As aves

inoculadas receberam o inoculo ao terceiro dia de idade. Ao décimo e 35º dias de idade, seis

aves por tratamento foram submetidas a jejum de oito horas, pesadas, eutanasiadas e

necropsiadas para que, assim, fosse coletadas amostras para avaliação biométrica de órgãos,

isolamento de Salmonella e contagem de linfócitos. Ao 14º e 35º dia de idade foram coletadas

amostras de sangue para extração de soro destinado a pesquisa de anticorpos em ELISA. O

probiótico demonstrou controlar excreção de SH e interferir na migração e colonização da

bactéria em órgãos extra-intestinais. O peso dos órgãos não sofreu influência, independente

do tratamento. A depleção linfocitária foi observada mais acentuada nos tratamentos que

foram inoculados com SH. O probiótico conseguiu beneficiar tanto a resposta imune celular,

pelo controle da depleção de linfócitos, quanto a resposta imune humoral, através do aumento

da titulação de anticorpos.

Palavras-chave: bacteriologia, biometria, imunidade, ELISA, salmonelose.

51

CHAPTER 3 - EFFECT OF PROBIOTIC IN THE IMMUNE ACTIVITY AND

BROILER OF SYSTEMIC HEALTH EXPERIMENTALLY INOCULATION OF

Salmonella enterica serovar HEIDELBERG

ABSTRACT: Were used in this study 570 male chickens of one-day old, Cobb, in order to

assess the effects of adding probiotic substances on the immune system of broilers challenged

or not with Salmonella enterica serovar Heidelberg (SH). The birds were divided into eight

treatments with six replicates each. Treatment (T) 1 - 24 hours fasting, not received probiotic

neither inoculum; T2 - fasting for 24 hours, orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate

buffered saline and 0.85% containing approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and not

received the probiotic; T3 - 24 hours fasting, received probiotic in the proportion of 500g / t

of pre-initial feed and 100 g / t in the other feeds, but was not inoculated; T4 - fasting for 24

hours orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing

approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and the probiotic in the proportion of 500g / t of feed

pre-initial and 100 g / t in the other feed; T5 - 36 hours fasting, not received probiotic neither

inoculum; T6 - fasting for 36 hours orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate buffered

saline and 0.85% containing approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and not received the

probiotic; T7 - 36 hours fasting, received the probiotic in the proportion of 500g / t of pre-

initial feed and 100 g / t in the other feeds, but was not inoculated; T8 - fasting for 36 hours

orally inoculated with 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline and 0.85% containing

approximately 5.0 X 105 CFU / mL SH and the probiotic in the proportion of 500g / t of feed

pre-initial and 100 g / t in the other diets. The birds that were inoculated received the

inoculum on the third day of age. At the tenth and 35th days old, six birds per treatment were

fasted eight hours, weighed, euthanized and necropsied to thereby biometric samples were

collected for evaluation of organs, Salmonella isolation and lymphocyte count. At 14 and 35

days of age blood samples were collected for serum extraction for the search for antibodies in

ELISA. The probiotic demonstrated control excretion of SH and interfere with migration and

colonization of bacteria in extra-intestinal organs. The weight of the organs was not affected,

regardless of treatment. Lymphocyte depletion was observed more pronounced in treatments

that have been inoculated with SH. The probiotic could benefit both the cellular immune

response, for the control of lymphocyte depletion, as the humoral immune response by

increasing the antibody titer.

Keywords: bacteriology, biometrics, immunity, ELISA, salmonellosis.

52

1. INTRODUÇÃO

A cadeia avícola se sustenta sobre importantes pilares os quais desempenham

papel fundamental para a obtenção de produtos de qualidade e com segurança alimentar.

Existe um complexo sinergismo entre estes pilares, principalmente entre nutrição, bem estar e

saúde animal, que pode influenciar a resposta imune da ave, acarretando em queda na

produtividade.

A manutenção da saúde de animais de produção pode ser favorecida com o uso de

probióticos que atuam em conjunto com a microbiota do TGI, beneficiando a saúde intestinal

e refletindo sobre a saúde sistêmica. Além da atuação dos probióticos na microbiota intestinal,

a modulação da resposta imunológica das aves frente a patógenos pode ocorrer,

principalmente, pela ativação do sistema imune associado ao intestino1-3.

A modulação da imunidade promovida por probióticos é realizada de forma

contínua, acompanhando a homeostasia das aves, pela aderência ao epitélio intestinal,

persistência no TGI e produção de componentes inibitórios frente a substâncias tóxicas ou

patógenos4,5 como Salmonella. Acredita-se que uma ferramenta empregada para diminuir

Salmonella em aves é acrescendo resistência à ave frente ao microrganismo, por meio da

estimulação do sistema imunológico6.

As aves são susceptíveis a infecção por Salmonella principalmente nos primeiros

dias de vida, pois a microbiota intestinal ainda não está totalmente estabilizada para

influenciar no controle da colonização por bactérias patogênicas7,8. Com base nisto, a

colonização intestinal precoce, advinda de microrganismos probióticos, pode modular a

expressão de genes em células epiteliais e interferir na aderência de Salmonella9.

As sorovariedades de salmonelas paratíficas nas produções de frangos costumam

cursar com enfermidades subclínicas, fato que dificulta sua detecção em meio à produção de

aves, o que coloca em risco a saúde pública, por serem zoonóticas10 De modo geral, a

implicação direta ou indireta de Salmonella na saúde pública, costuma estar relacionada ao

manuseio da carne contaminada de frango crua com outros produtos crus que serão assim

consumidos, ocasionando contaminação cruzada11 ou, ainda, pelo consumo de frango, ovos ou

derivados contaminados12-17.

Na União Europeia, um dos grandes importadores e consumidores de carne de

frango produzida no Brasil, a salmonelose é a uma das principais causas de gastroenterites

bacterianas em humanos, com mais de 90 mil casos anuais reportados e a segunda zoonose

mais relatada18-20. De 2007 a 2013, mais de 300 mil casos de infecção por Salmonella

53

Enteritidis foram notificados ao The European Surveillance System (TESSy - Sistema

Europeu de Vigilância) em 27 países da União Europeia. Apenas no primeiro trimestre de

2014, 2076 casos de salmonelose foram relatados a TESSy. Os casos foram atribuídos ao

consumo de ovos e derivados de frango21.

Na América do Sul, durante o ano de 2011, surtos de infecções por Salmonella

afetaram a região metropolitana do Chile, onde centenas de pessoas apresentaram quadros de

toxinfecção alimentar após cosumo de produtos derivados de aves22. Desde o surto de

Salmonella Heidelberg nos Estados Unidos, que afetou centenas de pessoas em 2013, este

sorotipo de bactéria ganhou destaque no cenário da avicultura global23. No Brasil, já

houveram relatos de frangos contaminados com este mesmo sorotipo24. Uma característica

que pode ser atribuída à alta incidência de salmonelas paratíficas, como Heidelberg, é o alto

grau de diversidade antigênica que o gênero possui e que pode favorecer sua adaptação ao

meio.

Cepas destes surtos demonstraram resistência a antibióticos comumente

prescritos23,25 o que indica, possivelmente, a resistência bacteriana adquirida ao longo dos

anos e reforça a importância de alternativas frente ao uso de AMP’s na alimentação animal.

Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de probiótico sobre a

resposta imunológica e saúde sistêmica de frangos de corte inoculados experimentalmente

com Salmonella Heidelberg e mantidos sobre diferentes tempos de jejum pós-eclosão

54

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Local

O experimento foi conduzido no Núcleo Experimental de Doenças de Aves e no

Laboratório de Bacteriologia, ambos localizados no Departamento de Medicina Veterinária da

Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (DMV/EVZ/UFG).

O protocolo experimental utilizado nessa pesquisa foi aprovada pela Comissão de

ética no Uso de Animais/CEUA – UFG sob o nº

2.2. Delineamento experimental

Foram adquiridos 570 pintos (Gallus gallus domesticus) linhagem Cobb, machos

de um dia de idade, os quais foram, após pesagem, distribuídos em delineamento inteiramente

casualizado em oito tratamentos com seis repetições cada e alojados em grupos de 12 aves por

unidade experimental, seguindo o delineamento apresentado no Quadro 1, conforme descrito

a seguir:







TRATAMENTO 3: constituiu o grupo que foi submetido á jejum de 24 horas,



TRATAMENTO 4: constituiu grupo que foi submetido a jejum de 24 horas, foi




24h);



55





TRATAMENTO 7: constituiu o grupo que foi submetido a jejum de 36 horas,



TRATAMENTO 8: constituiu o grupo que foi submetido jejum de 36 horas, foi




36h);

QUADRO 1 – Delineamento experimental dos tratamentos.

Tratamento Nº de

repetições

Nº de aves

por

repetição

Nº de aves

por

tratamento

Tempo de

Jejum

Inoculados

com

Salmonella

Heidelberg

Alimentados

com

probiótico

T1 6 12 72 24h NÃO NÃO

T2 6 12 72 24h SIM NÃO

T3 6 12 72 24h NÃO SIM

T4 6 12 72 24h SIM SIM

T5 6 12 72 36h NÃO NÃO

T6 6 12 72 36h SIM NÃO

T7 6 12 72 36h NÃO SIM

T8 6 12 72 36h SIM SIM

As aves inoculadas e não inoculadas foram mantidas em alojamentos separados,

em baterias de aço galvanizado com quatro andares, equipadas com comedouros e bebedouros

do tipo lineares e bandejas para retirada de excretas, mantendo-se a mesma ambiência entre os

alojamentos. As baterias foram aquecidas com uma lâmpada incandescente de 60W por andar

até os 36 dias de idade.

O programa alimentar foi composto por três rações experimentais, destinadas a

diferentes fases da criação: pré-inicial, 1 a 7 dias de idade; inicial, 8 a 21 dias de idade; e

crescimento, 22 a 36 dias de idade. As rações fornecidas aos animais, farelada à base de milho

moído e farelo de soja, foram formuladas de acordo com a composição dos alimentos e

exigências nutricionais preconizadas por Rostagno26. O probiótico composto por cultura

56

indefinida de microrganismos, parede celular de levedura, leite desnatado em pó e

antiumectante, foi adicionado à ração em substituição ao material inerte, de acordo com a

recomendação do produto. Durante todo o período experimental, as aves receberam

alimentação e água ad libitum.

Os pintos de um dia de idade utilizados no experimento foram adquiridos de um

incubatório comercial que realiza a vacinação das aves contra Marek e NewCastle, conforme

Certificado Satinário 006/2016/DF.

2.3. Preparação do inoculo

O inoculo foi elaborado com Samonella enterica sorovar Heidelberg isoladas de

amostras provenientes de frangos de corte, concedidas pelo Laboratório de Bacteriologia da

Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás e tipificada pelo

Laboratório FIOCRUZ-RJ.

A cepa foi repiada em ágar verde brilhante e posteriormente mantida em

temperatura de incubação de 37ºC por 24 horas. Em seguida, as células foram suspensas em

solução salina tamponada a 0,85% e armazenada a 4ºC. A concentração de 5,0 X 106

UFC/mL para Salmonella enterica sorovar Heidelberg foi ajustada com o auxílio da escala de

Mac Farland e confirmada por plaqueamento das diluições seriadas em ágar verde brilhante,

com posterior incubação a 37ºC e contagem das Unidades Formadoras de Colônia UFC da

bactéria24.

2.4. Inoculação das Aves

Com três dias de idade, utilizando seringas de 1mL, foram inoculados os pintos

por via oral com 0,5mL de solução salina tamponada a 0,85%, contendo aproximadamente 5,0

X 106 UFC/mL de Salmonella enterica sorovar Heidelberg.

2.5. Pesquisa de Salmonella entrerica sorovar Heidelberg

Seis aves por tratamento, abrangendo todas as parcelas, ao décimo e 35º foram

submetidas a jejum de 8 horas, eutanasiadas, necropsiadas e amostras de baço, fígado, tonsila

cecal, conteúdo cecal e bursa, foram coletados assepcticamente para análise bacteriológica.

57

Cerca de um grama dos fragmentos dos órgãos foram macerados e transferidos para tubos de

ensaio contendo água peptonada e incubados a 37ºC/24h.

Após a incubação das amostras, alíquotas de 1,0 mL da água peptonada foram

transferidas para tubos de caldo seletino cistina e 0,1 mL para tubos de caldo Rappaport

Vassiliadis e incubados a 41ºC por 24 horas. Após o enriquecimento seletivo, de cada caldo

foram feitos repiques no ágares verde brilhante e Xylose-Lysine-Tergitol 4 (XLT4) e

incubadas a 37ºC/24h. De cada um dos ágares, foram selecionadas três a cinco Unidades

Formadoras de Colônia (UFC) sugestivas da bactéria e repicadas em ágar tríplice açucar-ferro

(TSI), seguindo-se incubação de 37ºC/24h. Os TSI que apresentaram crescimento sugestivo

para Salmonella, foram submetidos aos seguintes testes bioquímicos: produção de H2S, teste

da urease, produção de indol, vermelho de metila, motilidade, utilização do malonato, citrato

de Simmons e descarboxilação da lisina.

2.6. Exame biométrico de órgãos

Também ao décimo e 35º dia de idade, seis aves por tratamento foram submetidas

a jejum de 8 horas, pesadas e eutanasiadas. O peso das aves, baço e bursa de fabricius foram

considerados para o cálculo do peso relativo do órgão/100g peso vivo da ave x 10027.

2.7. Contagem de linfócitos

Uma ave por parcela, totalizando seis por tratamento, ao décimo e 35º dias de

idade, foram submetidas a jejum de 8 horas, eutanasiadas e necropsiadas. Foram coletados

fragmentos do baço e tonsila cecal, acondicionados em formalina neutra a 10% e,

posteriormente, processados através das etapas de clivagem, desidratação, clareamento,

impregnação, inclusão, montagem e coloração pela Hematoxilina-eosina (HE), como proposto

por Luna28.

Foram capturadas imagens de cinco campos de cada um dos fragmentos de baço e

tonsila cecal de cada ave, para posterior contagem de linfócitos, com o auxílio do software

Image J. Um retículo quadrangular constituído por 25 pontos foi sobreposto à imagem

histológica digitalizada e somente foram contados os linfócitos nas intersecções presentes no

campo visual. Os linfócitos do baço e tonsila cecal foram classificados quanto ao grau de

depleção de linfócitos. Inicialmente, foi realizada a contagem de linfócitos nos órgãos do

grupo placebo para efeito de comparação e referência para determinação do grau de depleção

58

presente nos órgãos dos animais dos outros tratamentos. Os graus de depleção linfoide dos

órgãos foram classificados de acordo com o Quadro 2.

QUADRO 2 – Graus de depleção linfoide de acordo com os percentuais obtidos pelas médias

das contagens dos grupos inoculados em relação ao grupo controle

Escore Grau de depleção linfoide Percentual de depleção linfoide

1 Ausente (-) Entre 0 e 5% de depleção linfoide

2 Discreto (+) Entre 6 e 15% de depleção linfoide

3 Moderado (++) Entre 16 e 25% de depleção linfoide

4 Acentuado (+++) Acima de 26% de depleção linfoide

2.8. Pesquisa de anticorpos contra o vírus da Doença de NewCastle

Ao 14º dia de idade, todas as aves foram vacinadas contra Doença de NewCastle,

via óculo-nasal, com vacina liofilizadas, cepa Lasota, viva e atenuada de acordo com as

recomendações do fabricante.

Determinaram-se os níveis de anticorpos contra Newcastle e Salmonella enterica

sorovar Heidelberg presentes no soro sanguíneo das aves por meio dos kits de detecção (nome

comercial)Newcastle Disease Virus Antibody e Salmonella Heidelberg Antibody que

consistem em testes imunoenzimáticos do tipo não competitivo, com imunorreagentes. Os

testes foram realizados de acordo com a metodologia do fabricante aos 14 e 35 dias de idade.

Após reação antígeno-anticorpo, foi executada a leitura da microplaca em

espectrofotômetro com filtro de 650 nm. O espectrofotômetro que foi utilizado para o ensaio

de ELISA foi o TP- READER da TERMO PLATE, e a leitura foi feita no modo absorbância

(ABS). Os resultados da absorbância foram interpretados por meio de Software, seguindo as

recomendações do fabricante.

2.9. Análise Estatística

Os resultados de biometria, titulação de anticorpos foram submetidos à análise de

variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5%. Para os dados de bacteriologia de

Salmonella enterica sorovar Heidelberg e depleção linfoide foi o utilizado o teste descritivo,

considerando apenas a frequência encontrada nas variáveis. Para realização dos testes, foi

utilizado o programa estatístico R versão 3.3.0.

59

3. RESULTADOS

Na tabela 1 encontram-se os dados resultantes do isolamento de Salmonella sp.

nos órgãos ao décimo e 35º dias de idade.


fígado, baço, tonsila cecal, conteúdo cecal e bursa de fabricius de frangos de



alimentados com probiótico

Fígado

Tratamentos 10 dias 35 dias

Controle 24h - -

Prob. 24h - -

Controle 36h - -

Prob. 36h - -

SH 24h - -

SH + Prob. 24h - -

SH 36h - -

SH + Prob. 36h - -

Baço


Controle 24h - -

Prob. 24h - -

Controle 36h - -

Prob. 36h - -

SH 24h - -

SH + Prob. 24h - -

SH 36h - -

SH + Prob. 36h - -

Tonsila Cecal


Controle 24h - -

Prob. 24h - -

Controle 36h - -

Prob. 36h - -

SH 24h + +

SH + Prob. 24h + -

SH 36h + +

SH + Prob. 36h + -

Conteúdo Cecal


Controle 24h - -

Prob. 24h - -

Controle 36h - -

Prob. 36h - -

SH 24h + +

SH + Prob. 24h + -

SH 36h + +

SH + Prob. 36h + -

60


fígado, baço, tonsila cecal, conteúdo cecal e bursa de fabricius de frangos de



alimentados com probiótico (continuação)

Bursa de Fabricius


Controle 24h - -

Prob. 24h - -

Controle 36h - -

Prob. 36h - -

SH 24h + +

SH + Prob. 24h + -

SH 36h + +

SH + Prob. 36h + -

Verifica-se na Tabela 1 que, aos dez dias, Salmonella Heidelberg foi isolada da

tonsila cecal, conteúdo cecal e bursa de Fabricius dos tratamentos que receberam o inóculo,

independente da suplementação probiótica e dos tempos de jejum. Já aos 35 dias, nota-se que,

entre os tratamentos que foram inoculados com Salmonella Heidelberg, independente do

tempos de jejum submetidos, apenas aqueles que não receberam o probiótico na dieta

apresentaram positividade frente da bactéria, com exceção do baço e do fígado.

Ao décimo e 35º dias de idade, o baço, tonsila cecal, bursa de Fabricius e intestino

foram pesados de uma ave por repetição e realizado o cálculo para peso relativo do órgão,

como apresentado na Tabela 2.

TABELA 2 – Valores de peso relativo (g/100g peso vivo da ave x 100) órgãos de frangos de




Tratamentos Baço (g) Bursa (g) Tonsila (g)

10 dias

Controle 24h 0,10 0.20 0,04

Prob. 24h 0,09 0,22 0,06

Controle 36h 0,10 0,20 0,05

Prob. 36h 0,09 0,21 0,04

SH 24h 0,11 0,20 0,08

SH + Prob. 24h 0,09 0,19 0,07

SH 36h 0,13 0,19 0,08

SH + Prob. 36h 0,09 0,19 0,06

P 0,677 0,437 0,670

C.V.(%) 29,86 23,40 28,72

35 dias

Controle 24h 0,09 0,20 0,17

61

TABELA 2 – Valores de peso relativo (g/100g peso vivo da ave x 100) órgãos de frangos de



alimentados com probiótico (continuação)

Tratamentos Baço (g) Bursa (g) Tonsila (g)

35 dias

Prob. 24h 0,08 0,21 0,19

Controle 36h 0,10 0,19 0,17

Prob. 36h 0,08 0,21 0,19

SH 24h 0,12 0,21 0,22

SH + Prob. 24h 0,10 0,20 0,20

SH 36h 0,13 0,20 0,21

SH + Prob. 36h 0,11 0,20 0,20

P 0,643 0,312 0,570

C.V.(%) 24,58 25,47 21,34

A Tabela 2 demonstra que não houve diferenças significativas (P>0,05) entre os

dados obtidos nos diferentes tratamentos, quanto ao peso relativo do baço, bursa de Fabricius

e tonsila cecal dos frangos nas diferentes idades analisadas.

Os graus de depleção linfoide no baço, tonsila cecal e bursa de fabricius

encontram-se na Tabela 3.

TABELA 3 – Graus de depleção linfoide no baço, bursa e tonsila cecal de frangos de




Graus de depleção linfoide

Tratamento 10 dias

Baço Tonsila Cecal Bursa

Controle 24h - - -

Prob. 24h - - -

Controle 36h - - -

Prob. 36h - - -

SH 24h ++ + +

SH + Prob. 24h - + -

SH 36h ++ + +

SH + Prob. 36h - + -

Tratamento 35 dias

Baço Tonsila Cecal Bursa

Controle 24h - - -

Prob. 24h - - -

Controle 36h - - -

Prob. 36h - - -

SH 24h + + + + + +

SH + Prob. 24h - + -

SH 36h + + + + + ++

SH + Prob. 36h + + +

(-): ausente; (+): discreta depleção linfoide; (++): moderada depleção linfoide; (+++): acentuada depleção

linfoide.

62

Na Tabela 3, observa-se que todos as aves inoculadas com Salmonella Heidelberg

que não receberam o probiótico na dieta, apresentaram diminuição na quantidade de linfócitos

em todos os órgãos analisados, em relação aos grupos controle. Além disso, nestes mesmos

tratamentos houve redução de linfócitos quando comparado as duas diferentes idades

analisadas. Entre os tratamentos que foram inoculados e receberam a suplementação

probiótica, houve, também, redução entre as duas idades em quase todos os órgãos analisados,

no entanto, o grau de depleção não alcança aquele notado entre os tratamentos que não foram

suplementados com probiótico.

TABELA 4 - Média geométrica dos títulos (MGT) de anticorpos conta o vírus da Doença de

NewCastle (NDV) ao 10º e 35º dia de idade

Tratamentos NDV (MGT)

10 dias 35 dias

Controle 24h 0,378bc 1,344d

Prob. 24h 0,450a 2,467a

Controle 36h 0,389bc 1,290d

Prob. 36h 0,460a 2,449a

SH 24h 0,322c 2,110c

SH + Prob. 24h 0,410b 2,300b

SH 36h 0,328c 2,120c

SH + Prob. 36h 0,411b 2,283b

P > F 0,028 0,043

C.V. (%) 58,19 69,34 a,bMédias seguidas por letras diferentes na mesma coluna e em mesma faixa etária indicam

diferenças significativas utilizando teste de Tukey a 5%

Na tabela 4 observa-se que os títulos (GMT) de anticorpos contra a Doença de

NewCastle aumentaram após a vacinação contra a mesma. Além disso, aos 35 dias, houve

aumento da titulação nos tratamentos que receberam probiótico na dieta, mesmo entre aqueles

que foram inoculados.

Os dados referentes à mortalidade dos frangos de corte durante todo o período do

experimento é abordado na Tabela 5.

TABELA 5 – Mortalidade transformada e desvio padrão da mortalidade

Tratamentos Mortalidade transformada*

1ª semana 2ª semana 3ª semana 5ª semana

Controle 24h 0,226 0,227 0,220 0,224

Prob. 24h 0,224 0,224 0,222 0,226

Controle 36h 0,224 0,226 0,222 0,227

Prob. 36h 0,224 0,224 0,222 0,227

SH 24h 0,226 0,225 0,222 0,225

63

TABELA 5 – Mortalidade transformada e desvio padrão da mortalidade (continuação)

Tratamentos Mortalidade transformada*

1ª semana 2ª semana 3ª semana 5ª semana

SH + Prob. 24h 0,223 0,226 0,220 0,227

SH 36h 0,224 0,227 0,226 0,222

SH + Prob. 36h 0,226 0,227 0,224 0,223

P > F 0,413 0,366 0,574 0,510

C. V. (%) 4,300 3,260 4,420 4,560

Observa-se que, na Tabela 5, a mortalidade dos frangos não apresentou diferenças

significativas (P>0,05) entre os tratamentos analisados.

64

4. DISCUSSÃO

Salmonella Heidelberg não foi isolada em nenhum órgão estudado, sugerindo que

a influencia do probiótico adicionado à dieta dos frangos. Observa-se também que, com a

idade, houve maior efetividade dos compostos probióticos frente à colonização de Salmonella.

Os probióticos são utilizados, principalmente, para favorecer o desempenho zootécnico das

aves29, embora existam evidências de que o estabelecimento dos compostos probióticos no

TGI de frangos, ao longo do desenvolvimento gastrintestinal, favoreça, também, a diminuição

da colonização de Salmonella29-32. O atraso deste desenvolvimento, que pode ocorrer em

longos períodos de jejum pós-eclosão, como os obtidos, resulta em aumento da

vulnerabilidade da ave frente à enteropatogenos, visto que, pela restrição hídrica e alimentar

ocasionada, há desidratação, diminuição do desenvolvimento do TGI e baixa atividade

imunológica33-36.

A diminuição da colonização de Salmonella no TGI dos frangos ocorreu,

possivelmente, pela exclusão competitiva promovida pelos microrganismos probióticos. Além

da exclusão competitiva, alguns compostos probióticos podem aglutinar agentes patogênicos

e inibir a expressão de fimbrias de aderência na superfície do microrganismo37. A proteção

inicial de frangos frente a patógenos intestinais é, principalmente, física, de modo que a

microbiota autóctone, presente no TGI das aves, adere-se aos sítios de ligação do epitélio

intestinal, bloqueando a fixação de enteropatogenos29,38. Provavelmente o estabelecimento

desta microbiota sofreu influência do período de jejum pós-eclosão, mas, em contrapartida, a

adição de compostos probióticos na dieta dos frangos favoreceu o crescimento de

microrganismos intestinais benéficos.

Microrganismos probióticos são capazes de sobreviver ao trânsito grastrintestinal

por produzir bacteriocinas que não são afetadas pelos ácidos gastrintestinais e sais biliares,

desempenhando atividade antimicrobiana e também exercendo efeito sobre a microbiota

autótocne do animal, regulando-a39,40. Além disso, há aumento da atividade da resposta imune

frente a enteropatogenos, como Salmonella41,42, beneficiando a maturação e integridade do

intestino e servindo como ferramento imunomoduladora.43

A ausência de Salmonella sp. no fígado e baço, aos dez dias de idade, pode ser

explicada pelo tempo de invasibilidade que a bactéria exige para alcançar órgãos além do

intestino. Este tempo de invasibilidade remete-se a barreira inicial que a bactéria encontra no

organismo da ave, o tecido linfoide associado ao trato gastrintestinal (GALT) que, como

órgão lindoide secundário, desempenha importante papel na resposta imune da mucosa

65

entérica44. O GALT está presente em toda a parede do TGI das aves, concentrado,

principalmente, nas Placas de Peyer e tosilas cecais45,46, estas últimas destacadas,

principalmente, pela suscetibilidade local de onde se encontram, na porção inicial do ceco,

local exposto permanentemente por antígenos diversos47; e pela importância no estímulo à

resposta imune contra enteropagenos48-50 como Salmonella sp.

O caráter invasivo de Salmonella sp. depende da persistência às defesas que a ave

apresenta. Após atingir o GALT, Salmonella sp. pode ser fagocitada pelo sistema

mononuclear fagocitário e resistir às enzimas lisossomais. Essa característica de resistência

propicia ambiente favorável para multiplicação da bactéria no interior dos fagolisossomos e

garante sua proteção frente à resposta imune da ave52. Ultrapassando a barreira imune

intestinal, Salmonella sp. pode alcançar outros órgãos linfoides secundários, como o baço, e

promover alterações em órgãos primários, como a bursa de Fabricius53,54.

O peso do baço, tonsila cecal e bursa de fabricius nas avaliações biométricas

realizadas, não demonstraram sofrer alterações com a inoculação de Salmonella Heidelberg, a

adição de probiótico na alimentação e os diferentes tempos de jejum submetidos. Vogt55

observou que o peso dos órgãos linfoides pode refletir a capacidade do organismo produzir

células linfoides, durante um estímulo imune. Mesmo não constatando diferenças entre os

pesos dos órgãos dos tratamentos observados, houve estímulo antigênico com a inoculação de

Salmonella Heidelberg e resposta imune celular e humoral notória, como constatado entre as

diferenças de depleção linfocitária analisadas e no aumento da titulação de anticorpos contra a

Doença de NewCastle. As matrizes dos frangos foram vacinadas contra NewCastlea antes da

postura dos ovos. Geralmente, anticorpos de origem materna extinguem-se em até 20 dias

após a eclosão56 Sendo assim, a titulação observada aos 10 dias pode refletir imunidade

passiva remanescente.

A quantidade de linfócitos em diferentes órgãos linfoides reflete a imunidade

mediada por células e humoral. Como Salmonella é um patógeno intracelular facultativo, a

resposta imune celular é importante para o controle da bactéria57. A depleção linfocitária

ocorre devido a ativação, migração de linfócitos dos órgãos linfoides para os locais onde

Salmonella sp demonstra ter se estabelecido.58 Outros elementos que podem mediar a resposta

imunológica são os heterofilos, fazendo parte das células sanguíneas brancas e as

imunoglobulinas, compreendendo os anticorpos produzidos como IgA, IgY e IgM.59,60

Probióticos podem promover atividade antimicrobiana, seja agindo diretamente sobre o

metabolismo celular dos patógenos ou estimulando a produção de IgA e IgY frente a infecção

por Salmonella61,62.

66

Os óbitos que foram observados não sofreram influência da adição do probiótico à

dieta e da inoculação via oral de Salmonella Heidelberg, o que demonstra que as mortes

observadas ocorreram dentro da normalidade para a linhagem. As taxas de mortalidade de

pintinhos podem variar de números muito baixos, tidos como insignificantes, até 10% a 20%,

embora essa taxa possa ser elevada para acima de 80% em surtos graves de salmonelas

paratíficas. A mortalidade irá depender do ambiente, estirpe de Salmonella infectante e se há

presença de infecções associadas63.

67

5. CONCLUSÃO

A suplementação probiótica à dieta dos frangos impede a migração de Salmonella

Heidelberg para os órgãos e controla a colonização intestinal. Além disso, o probiótico

demonsta ser benéfico frente à resposta imune e saúde sistêmica das aves.

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shanmugasundaram%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22184435

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Selvaraj%20RK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22184435



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CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS

A ocorrência de doenças veiculadas por alimentos, em especial as

salmoneloses, são motivo de preocupação para indústria avícola pelas implicações na

saúde pública, especialmente devido ao aumento global de consumo de carne de frango.

Não obstante, o estado sanitário das aves oriundas dos sistemas de produção com falhas

nos programas de biossegurança, interfere nos parâmetros zootécnicos, o que ocasiona

perdas econômicas pelo comprometimento da carcaça e aumento de gastos com

produtos terapêuticos e profiláticos.

A diversidade dos tipos destes produtos disponíveis no mercado é,

constantemente, renovada. Tal fato propicia aos produtores do ramo da avicultura poder

ter uma visão ampla dos produtos a fim de fazerem escolhas distintas baseadas no

interesse final da produção. Ao se tratar de produtos para o controle de Salmonella em

aves, os compostos probióticos propiciam, além do efeito antimicrobiano, melhores

índices de desempenho zootécnico em frangos.

Neste contexto, o presente estudo constatou efeito positivo da adição

probiótica à ração de frangos de corte, nos parâmetros de avaliação zootécnica e na

integridade intestinal as aves que receberam inóculo de Salmonella enterica sorovar

Heidelberg. Além disso houve implicação benéfica do probiótico sob a atividade

imunológica e saúde sistêmica dos frangos.

A complexidade da organização intestinal das aves ainda é um grande

desafio a ser enfrentado por pesquisadores em busca da descoberta de meios favoráveis

ao bom desempenho das aves de produção. O uso de determinados aditivos que

promovem melhoria nos índices zootécnicos ainda tem suscitado divergências entre as

pesquisas, mesmo aqueles já oficialmente liberados para utilização.

Contudo, ressalta-se que a oficialização do uso não extingue o aditivo de

apresentar características contrárias aquelas anteriormente relatadas. O aditivo seguro

para uso em alimentação em animal hoje, pode não ser o mesmo de amanhã. Por isso,

pesquisas em prol de comprovações acerca deste tema, devem sempre ser mantidas

atualizadas.

influÊncia de probiÓtico sobre a saÚde intestinal de …§ão... · 2018. 1. 10. · em frangos...

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