influÊncia da inativaÇÃo fotodinÂmica sobre a …

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA

Programa de Pós-graduação em Ciência de Materiais

INFLUÊNCIA DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA

SOBRE A VIABILIDADE E DINÂMICA DE

CRESCIMENTO DE Candida albicans

TARQUIN FREITAS TRESCHER

BARRA DO GARÇAS – MT

2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA

Programa de Pós-graduação em Ciência de Materiais

INFLUÊNCIA DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA

SOBRE A VIABILIDADE E DINÂMICA DE

CRESCIMENTO DE Candida albicans

TARQUIN FREITAS TRESCHER

Orientadora Profª. Dra Nara Cristina de Souza

Co-orientador Prof. Dr. Josmary Rodrigues Silva

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Materiais (PPGMat) da Universidade Federal de Mato Grosso, como requisito para obtenção do Título de Mestre em Ciência de Materiais.

BARRA DO GARÇAS – MT

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.

Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a)

autor(a).

Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.

F866i Freitas Trescher, Tarquin.INFLUÊNCIA DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA SOBRE A

VIABILIDADE E DINÂMICA DE CRESCIMENTO DE Candidaalbicans / Tarquin Freitas Trescher. -- 2014

vii, 67 f. : il. color. ; 30 cm.

Orientadora: Nara Cristina de Souza.Co-orientador: Josmary Rodrigues da Silva.Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso,

Campus Universitário do Araguaia, Programa de Pós-Graduaçãoem Ciência de Materiais, Barra do Garças, 2014.

Inclui bibliografia.

1. Inativação Fotodinâmica. 2. Candida albicans. 3. Eosina. 4.Susceptibilidade. 5. Dinâmica de Crescimento. I. Título.

Cuide para que todo o seu foco na vida esteja nas soluções, não nos

problemas. (Anthony Robbins do livro Desperte o gigante interior).

Dedicatória

Ao meu filho Filipe, pelos momentos ausentes em que ele mesmo

pergunta todos os dias:

Filho: aonde você vai papai?

Eu: para a faculdade!

Filho: de novo!!!

Melhor amor que esse não existe.

A minha esposa Viviane, por me aguentar durante esse período de

minha vida, (pela paciência), sempre apoiando. Obrigado por fazer parte de

tudo isso.

São poucas pessoas a quem dedico esse trabalho, mas são pessoas

especiais!

Enfim a Deus pela minha saúde e da minha família e demostrar que

sua palavra é forte, basta acreditar.

Agradecimentos

Primeiramente, minha orientadora Profa. Dra. Nara Cristina de Souza,

além de ser professora, amiga e companheira, obrigado por acreditar em mim

e pela paciência. Obrigado pelas críticas construtivas, aprendemos mais com

os erros do que com os acertos.

Ao meu coorientador, Prof. Dr. Josmary Rodrigues Silva pelas suas

ideias, opiniões e conselhos.

A Profa. Dra. Paula por sua gentileza em ceder às amostras de Candida

albicans e dispor de tempo para repassar técnicas microbiológicas.

Á Capes, pela bolsa sem esta possivelmente não poderia estar

disposto a estudar sem algum tipo de renda.

Aos colegas e amigos que fiz neste período durante o mestrado, ao

grupo do qual faço parte, GMN, e alguns colegas especiais por fazerem parte

diretamente do meu trabalho: ao Romário, pelas dicas e discussões, obrigado

parceiro! Aos colegas de mestrado Filipe e Graciela pelas viagens e

conhecimentos compartilhados.

SUMÁRIO

Resumo..........................................................................................i

Abstrat...........................................................................................ii

Lista de Figuras e Tabela...........................................................iii

Lista de Abreviaturas e Símbolos.............................................vi

Introdução.....................................................................................1

1.1 – Candida albicans..................................................................................2

1.2 – Resistência Fúngica.............................................................................4

1.3 – Inativação fotodinâmica antifúngica...................................................6

1.3.1 – Mecanismos de inativação fotodinâmica.............................7

1.3.2 – Fontes de luz...........................................................................8

1.3.2.1 – Fluência ou dose.......................................................9

1.3.3 – Fotossensibilizadores.............................................................9

1.3.3.1 – Eosina......................................................................10

1.4 – Análise do crescimento fractal..........................................................11

1.5 – Objetivos ............................................................................................13

1.6 – Estrutura da dissertação....................................................................13

Considerações Teóricas............................................................14

2.1 – Fractais................................................................................................14

2.2 – Dimensão Fractal.................................................................................16

2.3 – Leis de Escala......................................................................................17

2.4 – Modelos de Crescimento....................................................................18

2.4.1 – Modelo de Eden.....................................................................19

2.4.2 – Deposição via epitaxia por feixe molecular (MBE).............19

2.4.2.1 – Teoria linear................................................................20

2.4.2.2 - Teoria não-linear.........................................................20

Materiais e Métodos...................................................................22

3.1 – Cultivo de Candida albicans...............................................................22

3.2 – Fotossensibilizador Eosina................................................................23

3.3 – Contagem de colônias........................................................................23

3.4 – Experimento de susceptibilidade.......................................................25

3.5 – Análise da dinâmica de crescimento das colônias.........................26

3.6 – Espectroscopia na região de ultravioleta a visível..........................26

3.7 – Microscopia Óptica.............................................................................27

3.7.1 – Microscopia de Fluorescência.............................................28

3.8 – Microscopia de força atômica............................................................29

3.9 – Processamento das imagens para análise fractal............................31

Resultados e Discussões..........................................................33

4.1 – Espectroscopia na região do UV-Vis.................................................33

4.2 – Susceptibilidade da C. albicans.........................................................34

4.2.1 – Microscopia de fluorescência..............................................36

4.3 – Efeito da inativação fotodinâmica na morfologia da C. albicans...37

4.4 – Dinâmica de crescimento..................................................................40

Conclusão...................................................................................48

Referências.................................................................................50

Apêndice – Divulgação Científica.............................................64

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- i

RESUMO

O fungo Candida albicans é responsável pela maioria das infecções

nosocomiais que acometem indivíduos imunocomprometidos. Ele possui alto

poder invasivo sendo capaz de destruir ou modificar os constituintes da

membrana celular do hospedeiro induzindo a disfunção ou aniquilamento físico.

Embora a maioria dos isolados de Candida albicans sejam susceptíveis às

drogas antifúngicas, o uso sem controle de fármacos tem promovido a

resistência e a formação de fungos patogênicos com tolerância aos

antifúngicos atuais. A implicação clínica do aparecimento de linhagens

resistentes é a busca por fármacos mais seguros e eficazes ou terapias

alternativas como a fotodinâmica, que visa eliminar o patôgeno pela

combinação de luz + fotossensibilizador. Neste trabalho investigamos a

combinação do fotossensibilizador eosina e luz laser (532 nm) para inativação

fotodinâmica do fungo Candida albicans. O corante eosina é comumente

utilizado em cosméticos ou fármacos e foi o primeiro fotossensibilizador a ser

utilizado em estudos de inativação de microrganismos. O comprimento de

onda de 532 nm usado para a irradiação com laser é adequado para testes de

fotoinativação visto que a eosina tem absorbância máxima em 512 nm. Os

resultados indicaram susceptibilidade do fungo para valores de fluência

superior a 150 J/cm2 ou alto tempo de pré-irradiação. As microscopias de

fluorescência e força atômica corroboram o resultado de inativação e indicam

que a morte celular deve ocorrer devido a danos na parede celular. O

crescimento das colônias também é influenciado pela combinação de luz +

fotossensibilizador e pode ser descrito por meio de modelos de crescimento de

interfaces fractais. Foi possível concluir que a proliferação do fungo deve ser

inibida no centro das colônias e que a análise das bordas fornecem uma

indicação a respeito da dinâmica de crescimento ou reprodução celular. Esses

resultados podem ser um ponto de partida na busca de novas estratégias

clinicas.

Palavras chave: inativação fotodinâmica, Candida albicans, eosina,

susceptibilidade, dinâmica de crescimento

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- ii

ABSTRACT

Fungus Candida albicans is responsible for most of the nosocomial infections

which affect immunocompromised individuals. It is highly invasive and capable

of destroying or modifying constituents of host cell membrane inducing

dysfunction or physical annihilation. Although most isolates of Candida albicans

are susceptible to antifungal drugs, uncontrolled use of drugs has promoted the

development of resistance and tolerance to fungal pathogens with current

antifungals. The clinical implication of the appearance of resistant strains is the

search for safer and more effective drugs and also alternative therapies, such a

photodynamic, which aims to eliminate the pathogen by the combination of light

+ photosensitizer. In this work we have investigate the combination of eosin

photosensitizer and laser light (532 nm) in order to photodynamic inactivation of

Candida albicans. The dye eosin is commonly used in cosmetics or

pharmaceuticals and was the first photosensitizer to be used in studies of the

inactivation of microorganisms. The wavelength of 532 nm used for laser

irradiation is suitable for photoinactivation because eosin has a maximum

absorbance at 512 nm. The results indicated susceptibility of the fungi to

fluency values higher than 150 J/cm2 or high pre-irradiation time. Fluorescence

and atomic force microscopy corroborate the inactivation results and indicate

that and cell death must occur due to damage to the cell wall. Colony growth is

also influenced by the combination of light + photosensitizer and can be

described by means of growth models of fractal interfaces. It was concluded

that the proliferation of the fungi should be inhibited in the center of the colonies

and the analysis of the edges give an indication about the dynamics of growth

and cell reproduction. These results can be a starting point in the search for

new clinical strategies.

Keywords: photodynamic inactivation , Candida albicans , eosin , susceptibility,

growth dynamics

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- iii

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

FIGURA 1 – Representação esquemática de (a) uma célula procarionte e (b)

uma célula eucarionte..........................................................................................2

FIGURA 2 – Representação das principais formas de vida da Candida.............3

FIGURA 3 – Diagrama esquemático da parede celular de fungos patógenos

incluindo a Candida albicans...............................................................................4

FIGURA 4 – Esquema das etapas fotoquímicas / fotofísicas envolvidas na

fotossensibilização. Diagrama de Jablonski........................................................7

FIGURA 5 – Estrutura química dos derivados de Xantenos..............................10

FIGURA 6 – Representação fractais auto-similares: (a) conjunto de Cantor, (b)

triângulo de Sierpinski, (c) processo para obtenção da curva de Koch e (d)

esponja de Menger............................................................................................15

FIGURA 7 – Comparação entre a dimensão Euclidiana e a dimensão fractal

...........................................................................................................................17

FIGURA 8 – Representação esquemática de agregados formados a partir do

modelo de Eden.................................................................................................19

FIGURA 9 – Imagens da autoclave Vitale Plus; capela de fluxo laminar vertical SENTINEL e estufa para cultura bacteriológica OdontoBras............................22

FIGURA 10 – Procedimento da diluição seriada e imagens das placas de petri referentes a cada etapa de diluição...................................................................23

FIGURA 11 – Imagem do laser de diodo Flex B&W TEK. Montagem do procedimento de irradiação por luz laser das soluções com C. albicans. Laboratório GMN...............................................................................................24

FIGURA 12 – Espectrofotômetro THERMO, modelo Genesys 10s.Laboratório

GMN...................................................................................................................26

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- iv

FIGURA 13 – Microscópio de fluorescência Eclipse Ci/L (Nikon Ltd., Japão), e representação esquemática das partes constituintes do equipamento. Laboratório GMN...............................................................................................28

FIGURA 14 – a) Representação esquemática do sistema de obtenção de imagens; b) equipamento Nanosurf® EasyScan II utilizado para realização das imagens. Laboratório GMN................................................................................29 FIGURA 15 – Representação da interface do programa ImageJ para tratamento das imagens....................................................................................30

FIGURA 16 – Representação do método de contagem de caixas e gráfico log log da contagem de caixas em função do tamanho..........................................31

FIGURA 17 – Espectro UV-Vis do FS eosina e da dispersão de C. albicans +

FS antes e após irradiação de luz laser por 10 min...........................................33

FIGURA 18 – Frações de sobrevivência da dispersão de C. albicans (controle)

e C. albicans + FS sem pré-irradiação, em função da fluência aplicada ( = 532 nm; 3 mW).........................................................................................................34

FIGURA 19 – Frações de sobrevivência da dispersão de C. albicans (controle) e C. albicans + FS com diferentes tempo de pré-irradiação. A fluência aplicada

foi de 80J/cm2 ( = 532 nm; 3 mW)...................................................................35 FIGURA 20 – Microscopia de fluorescência para C. albicans A) sem irradiar (aumentos de 40 e 100x); B) irradiada com fluência de 80 J/cm2 e C) irradiada com fluência de 200 J/cm2. Para B e C, tempo de pré-irradiação foi igual a 10 min e aumento de 40x.......................................................................................36

FIGURA 21 – Imagens de AFM para C. albicans antes e após a irradiação com o FS e fluência de 80J/cm2................................................................................37 FIGURA 22 – Perfis de altura de C. albicans antes e após inativação com FS + laser...................................................................................................................38 FIGURA 23 – Influência do processo de irradiação na evolução temporal do crescimento de colônias de C. albicans.............................................................40

FIGURA 24 – Evolução temporal do contorno das colônias de C. albicans. Cada contorno corresponde a um tempo de captura das imagens dos crescimentos das colônias.................................................................................41

FIGURA 25 – Raio médio da colônia em função do tempo para C. albicans sem irradiação...........................................................................................................42

FIGURA 26 – Raio médio da colônia em função do tempo para C. albicans irradiada por 10 min...........................................................................................42

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- v

FIGURA 27 – Raio médio da colônia em função do tempo para C. albicans com eosina irradiada por 10 min...............................................................................43

FIGURA 28 – Representação de uma colônia quase circular e linearização dessa expansão radial.......................................................................................44

TABELA 1 – Dados morfométricos da análise de crescimento de colônias de C. albicans em função da exposição à luz laser....................................................43

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

α Expoente de Rugosidade

β Expoente de Crescimento

λ Comprimento de Onda

Diâmetro médio

% Porcentagem

nm Nanômetro

µm Micrometro

mm Milímetros

mg Miligrama

mL Mililitro

mM Milimolar

mW Miliwatts

h Horas

min Minutos

cm Centímetros

t0 Tempo correspondente ao início do crescimento

ts Tempo correspondente ao início da saturação do

crescimento

vcres Taxa de expansão radial da colônia

Rmax Raio máximo da colônia

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans- vii

AFM Microscopia de Força Atômica

C. albicans Candida albicans

DF Dimensão fractal

D dimensão

2D bidimensional

3D tridimensional

EROs Espécies reativas de oxigênio

FS Fotossensibilizador

FSs Fotossensibilizadores

GMN Grupo de Materiais Nanoestruturados

He-Ne Hélio-Neônio

J/cm2 Joule por centímetro quadrado

LED Diodo Emissor de Luz

PDI Inativação Fotodinâmica

SD Agar sabouraud Dextrose

PDT Terapia Fotodinâmica

UFC Unidades Formadoras de colônia

UV-Vis Espectroscopia de Ultravioleta-visível

Viabilidade e dinâmica de crescimento de Candida albicans 1

1 – INTRODUÇÃO

Em novembro de 2013 a Sociedade Brasileira para o Progresso da

Ciência (SBPC) anunciou que o Brasil contará com o apoio de um órgão

específico para lidar com problemas relacionados a infecções causadas por

fungos, que respondem por 1,3 milhões de mortes anuais no mundo

(MONTEIRO, 2013). Esse órgão, denominado de Fundo de Ação Global para

Infecções Fúngicas (GAFFI, Global Action Fund for Fungal Infection) é uma

organização não governamental internacional, gerenciada por grandes

executivos europeus e pela comunidade científica, com a missão de reduzir a

mortalidade provocada por infecções fúngicas no mundo (MONTEIRO, 2013).

De acordo com os dados apresentados pelo GAFFI, em todo o mundo as

doenças fúngicas são negligenciadas pelas políticas públicas e o número de

pessoas, em todas as faixas etárias, que sofrem com uma infecção grave a

cada ano é acima de 300 milhões. O número de mortos chega a mais de 1,3

milhões, valor comparável as mortes por malária e tuberculose: 1,2 e 1,4

milhões, respectivamente (GAFFI, 2013; MERKEROVÁ, 2006). A redução de

infecções e mortes por doenças fúngicas é a meta estabelecida pelo GAFFI.

No Brasil, será necessário desenvolver políticas públicas de investimento,

programa de educação continuada para agentes de saúde e criação de

documentos técnicos, já que raramente a doença é diagnostica e tratada

corretamente (GAFFI, 2013; MONTEIRO, 2013)

Infecções fúngicas graves podem ser encobertas por outros problemas

de saúde tais como AIDS, pacientes em tratamento contra câncer,

transplantados ou imunossuprimidos. Elas podem ser separadas em cinco

grupos: i) infecções fúngicas invasivas que podem ser fatais (meningite,


pneumonia, histoplasmose, aspergilose pulmonar invasiva e infecção da

corrente sanguínea por Candida); ii) infecção de pele, cabelos e unhas; iii)

infecção da mucosa (candidíase oral, esofágica e vaginite); iv) doença fúngica

alérgica (aspergilose broncopulmonar alérgica) e iv) pulmonar crônica ou

infecção dos tecidos profundos (especialmente aspergilose pulmonar crônica

e micoses endêmicas) (PECHLIVANOGLOU, 2014).

O terceiro grupo trata especificamente de infecções de mucosa tais

como boca, revestimento de intestino, vias aéreas, trato urinário e genitais.

Boca, esôfago e parede vaginal são frequentemente infectados por fungos,

sendo que apenas um é adaptado para causar infecção nestes três locais:

Candida albicans.

1.1– Candida albicans

Os fungos são organismos eucarióticos, quimio-heterotróficos, de

nutrição absortiva com digestão extracorpórea parcial predominantemente

aeróbicos ou fermentadores facultativos. Apresentam estrutura pluricelular

micelial (fungos filamentosos) ou unicelular leveduriforme (leveduras)

(CONCEIÇÃO, 2010) e são mais complexos (SMITH, 1984) que seres

procariontes que não apresentam seu material genético delimitado por uma

membrana,como representado na FIGURA 1.

FIGURA 1. - Representação esquemática de (a) uma célula procarionte e (b) uma célula eucarionte (Adaptado de http://www.netnature.wordpress.com).


O gênero Candida é constituído de microrganismos unicelulares,

pleomórficos, de ciclo sexual incompleto e pertencentes ao Reino Fungi,

divisão Eumycota, subdivisão Deuteromycotina, classe Blastomycetes e

Família Cryptococcaceae. São considerados oportunistas e estão presentes

na microbiota normal da pele, cavidade bucal, tratos gastrointestinais e

urogenitais do homem (SANTANA, 2012; KIM, 2011; RUHNKE, 2011; REX,

1995). É um fungo dimórfico que pode se apresentar como leveduras

esféricas com dimensões de 2 a 4 µm ou na forma alongada, denominada hifa

(MIOTTO, 2004; MALUCHE, 2008; VALLE, 2010). A Figura 2 mostra as

principais formas da Candida.

Figura 2. - C. albicans a) levedura, b) pseudo-hifa e c) hifas (Adaptado de

SANTANA, 2012)

Candida albicans é reconhecida por sua patogenicidade e é

responsável pela maioria das infecções nosocomiais que acometem

indivíduos imunocomprometidos, embora não ocasione patologias em

indivíduos saudáveis é entre as espécies existentes dentro do gênero

Candida, a que possui maior poder invasivo (NAGLIK, 2003). Ela é capaz de

degradar, destruir ou modificar constituintes da membrana celular do

hospedeiro induzindo a uma disfunção e/ou aniquilamento físico (SANTANA,

2012). É um dos patógenos humanos que mais vem sendo investigados com

relação à constituição de sua parede celular, com o objetivo de produção de

novas drogas antifúngicas (GEORGOPAPADAKOU, 1995; POULAIN, 2004;

SHIBATA, 1995; KANEKO, 2013; MAKI, 2013).

A parede celular constitui a superfície de contato da célula fúngica com

o meio externo e é uma estrutura sujeita a modificações químicas e estruturais


durante o ciclo de vida do fungo. Na maioria das vezes é composta por

elementos microfibrilares insolúvel em água (quitina e glucanos), imersos em

matriz amorfa de polissacarídeos solúveis (FUKUDA, 2009). A parede celular

da Candida albicans é composta principalmente por manana, glucano e

quitina. Mananas representam cerca de 23%, glucanas 40-60%, as proteínas

de 6-25%, lipídios 1-7%, e quitinas 0,6–9% da massa seca da parede celular.

A Figura 3 é uma representação esquemática da parede celular do fungo C.

albicans. Estudos relacionados à estrutura da parede celular evidenciam uma

grande complexidade e variação em sua arquitetura que pode estar associado

com a fase ou forma de desenvolvimento (GARZON, 1989). Por exemplo, em

sua forma filamentosa (hifas) as células contêm 3 vezes mais quitina do que

na forma de levedura (CHAFFIN,1998).

FIGURA 3. - Diagrama esquemático da parede celular de fungos patógenos incluindo a Candida albicans (Adaptado de KARTSONIS, 2003).

1.2 - Resistência fúngica

A maioria dos isolados de C. albicans são susceptíveis às drogas

antifúngicas. Os antifúngicos podem ser agrupados em três grandes classes

com base no sítio de atuação: azoles, que inibem a síntese de ergosterol que

é o principal esterol de fungos (miconazol, cetoconazol, fluconazol e

Quitina


itraconazol); polienos, que interagem físico-quimicamente com os esteróis da

membrana fúngica (anfotericina B, nistatina), e inibidores de ácido nucléico

(5-fluorocitosina) (GHANNOUM, 1999; ANDRIOLE, 1999). Na Figura 3 é

possível identificar os sítios de atuação dos fármacos citados.

O uso sem controle de fármacos leva a resistência e a formação de

fungos patogênicos com tolerância aos antifúngicos atuais, afetando

principalmente indivíduos com AIDS, em quimioterapia e transplantados

(KARKOWSKA-KULETA, 2009; PFALLER, 2010; PHILIP, 2005). O termo

resistência é usado para descrever uma insensibilidade relativa ou perda de

suscetibilidade temporária ou permanente de um microrganismo frente a um

medicamento antimicrobiano (LOEFFLER, 2003; SANTANA, 2012). Nos

últimos anos as infecções por Candida albicans (DAGDEVIREN, 2005)

aumentaram principalmente em pacientes dependentes de próteses ou

enxertos (PRATES, 2010) e em pacientes queimados (PRATES, 2009).

Embora novas drogas tenham sido introduzidas para combater o

problema do aumento da incidência de infecções invasivas em pacientes com

imunossupressão grave, o desenvolvimento de resistência a drogas

antifúngicas, tornou-se cada vez maior (LOEFFLER, 2003). Pacientes e

profissionais da área da saúde poderiam adotar estratégias simples para

evitar o desenvolvimento de resistência aos antibióticos tais como: completar

o ciclo do tratamento prescrito para evitar a proliferação de microrganismos

resistentes e prescrever fármacos específicos em vez de antibióticos de amplo

espectro de ação, o que minimizaria a chance de resistência na flora normal

do paciente (TORTORA, 2012).

A implicação clínica da resistência microbiana é a busca por

mecanismos de ações para o tratamento de infecções causadas por

organismos resistentes, tais como o desenvolvimento de fármacos mais

seguros e eficazes (LOEFFLER, 2003) ou terapias alternativas como a

fotodinâmica.


1.3–Inativação fotodinâmica antifúngica

A terapia fotodinâmica (PDT do inglês, photodynamic therapy) é um

procedimento clínico que visa eliminar uma patologia utilizando a combinação

de um fotossensibilizador (corante) excitado por fótons com comprimento de

onda específicos, que podem ocasionar a morte celular por intermediários

citotóxicos do oxigênio molecular ou outros radicais livres que estão presentes

nos tecidos biológicos e são ativados pela combinação de luz + corante

(LAPINSK, 2008; MROZ, 2010; CHOI, 2010; MACHADO, 2000).

A PDT tem sido utilizada com eficácia no tratamento de doenças

infecciosas, sendo verificada a efetividade na inativação bactericida e fúngica,

sem relatos de resistência microbiana (BAGNATO, 2008). A morte celular de

bactérias, vírus ou fungos após fotossensibilização é denominada inativação

fotodinâmica (PDI do inglês, photodynamic inactivation) e já havia sido

identificada por Oscar Raab em 1900 que observou a inativação de

Paramecium caudatum pela ação de luz solar e corante vermelho de eosina

e laranja de acridina (DOUGHERTY, 1998; HOCKBERGER, 2002; MAISCH,

2004; MACHADO, 2000). Posteriormente, em 1903 von Tappeiner e Jesionek

empregaram eosina no tratamento de tumores e criaram o termo reação

fotodinâmica (MAISCH, 2007; PERUSSI, 2007). Embora o processo de

inativação tenha sido observado no século anterior, os estudos não foram

aprofundados provavelmente devido ao surgimento da penicilina. Entretanto,

nas últimas décadas, com o aparecimento das resistências microbianas houve

uma retomada na utilização de fotossensibilizadores (FS) e fontes de luz,

como tratamento alternativo a microrganismos resistentes a fármacos e

também no tratamento de tumores que podem ser acessados por uma fonte

de luz (BAGNATO, 2008).

Há um menor número de estudos envolvendo PDT ou PDI com fungos

quando comparados com bactérias, provavelmente devido à maior resistência

dos fungos conferida pela membrana nuclear que pode atuar como uma

barreira adicional de proteção celular, ou pela diferença dimensional entre as

células, visto que as fúngicas podem possuir tamanho de 10 a 50 vezes maior

que o de bactérias (BAGNATO, 2008). O trabalho de Demidova (DEMIDOVA,


2005) admite que a C. albicans apresenta maior resistência quando

comparada com os resultados obtidos para as bactérias Staphylococcus

aureus e Escherichia coli. Esses microrganismos foram fotossensibilizados

com luz laser e diferentes FS (azul de toluidina, rose bengal e pl-ce6).

Bertoloni observou que a inativação da C. albicans era dependente do tempo

de irradiação e da concentração do FS (BERTOLINI, 1989). Foi verificado que

a C. albicans na forma de hifas é mais susceptível a PDI quando comparada

com a forma de leveduras (JACKSON, 1999). A maioria dos trabalhos é

realizada in vitro e os resultados sugerem que testes in vivo devem ser

realizados para tratar infecções causadas pela Candida (RODRIGUES, 2013).

Há alguns testes in vivo que indicam erradicação de C. albicans em ratos com

candidíase induzida (MARTINS, 2011; MIMA, 2010; TEICHERT, 2002), porém

ou a concentração do FS ou a dose de irradiação necessária para inativação

são consideradas muito elevadas para aplicações clinicas (BAGNATO, 2008).

1.3.1 - Mecanismos de inativação fotodinâmica

As reações envolvidas na inativação fotodinâmica de um

microrganismo podem ser explicadas através da representação esquemática

mostrada na FIGURA 4.

FIGURA 4. - Esquema das etapas fotoquímicas/fotofísicas envolvidas na

fotossensibilização. Diagrama de Jablonski (RODRIGUES, 2012).

Após irradiação no estado fundamental (S0) o FS sofre excitação para

o seu estado singlete excitado (Sn). Este estado excitado tem um tempo de

vida curto de interação efetiva com as moléculas vizinhas e normalmente


perde energia através de processos radiativos (emissão de fluorescência) ou

não radiativos (conversão interna ou cruzamento intersistemas). Para a PDI,

o processo mais importante é o cruzamento intersistemas, que leva o FS ao

seu estado triplete excitado (Tn). A partir do estado triplete, o FS pode retornar

para o estado fundamental por conversão interna ou pelo processo de

emissão de fosforescência. A partir do estado excitado (Tn) os processos que

o FS pode sofrer são extremamente importantes (PELOI, 2007) e podem ser

classificados em tipo I e II.

No mecanismo do tipo I, o FS no estado excitado pode remover um

átomo de H de uma molécula biológica ou transferir elétrons de modo a gerar

espécies reativas de oxigênio (EROs) que podem reagir com o oxigênio no

estado fundamental e resultar na formação de radicais livres tais como o

superóxido, peróxido de hidrogênio ou radical hidroxila que são oxidantes de

biomoléculas (BAGNATO, 2008). Por outro lado, o FS em seu estado excitado

pode transferir energia para o oxigênio molecular no estado fundamental e

formar o oxigênio singleto (reação tipo II) que é uma forma altamente reativa

de oxigênio causadora de danos fotoquímicos a células (CARDOSO, 2012;

HAMBLIN, 2002).

De acordo com a literatura os dois mecanismos podem ocorrer

simultaneamente e são dependentes dos fatores experimentais tais como o

tipo de FS, concentração de oxigênio e tipo de microrganismo (BAGNATO,

2008).

1.3.2 – Fontes de luz

A PDT e PDI são dependentes do FS e da fonte de luz, portanto a

escolha apropriada confere maior eficácia nos procedimentos (CARDOSO,

2012). Tecidos biológicos são geralmente, transparentes na faixa do espectro

eletromagnético entre 600 e 800 nm. Esta região é conhecida como janela

terapêutica para PDT e quanto maior o comprimento de onda maior a

penetração da luz no tecido (KOCHEVAR, 1996; BAGNATO, 2008).

Geralmente são utilizadas fontes incandescentes, fluorescentes, LEDs

(dispositivos emissores de luz) e luz laser (CARDOSO, 2012).


1.3.2.1 – Fluência ou dose

Um dos parâmetros mais importantes na escolha do tipo de tratamento

por irradiação de células e tecidos biológico é a grandeza física relacionada à

densidade de energia. A fluência ou dose é a quantidade de energia aplicada

ao tecido biológico por unidade de área (BAGNATO, 2008) e deve ser

calculada de acordo com a Eq. 1.1:

Fluência ou Dose =P× t

A (1.1)

sendo P a potência da radiação incidente (Watts), t o tempo (segundos) e A a

área irradiada (m2). Através da análise dimensional é possível encontrar as

unidades dessa grandeza:

Fluência ou Dose =W.s

m2 =J

s.s

m2 =J

m2. (1.2)

1.3.3 – Fotossensibilizadores

Os fotossensibilizadores devem possuir comportamento ativo apenas

durante o processo fotodinâmico e podem ser atóxicos ou não (JORI, 2006).

Os principais requisitos para um corante ser considerado um FS são: (a)

apresentar baixa toxidade local e sistêmica na ausência da irradiação; (b) ser

solúvel e estável em condições fisiológicas; (c) ser metabolizado rapidamente

de modo a minimizar efeitos colaterais (BAGNATO, 2008; PERUSSI, 2007;

MÜLLER, 2006).

Entre as várias classes de agentes fotossensíveis, destacam-se os

derivados de hematoporfirinas, xantenos e ftalocianinas (SHARMAN, 1999).

Os FSs denominados xantenos são compostos cíclicos que absorvem luz na

região do visível e possuem três anéis aromáticos em arranjo linear com um

átomo de oxigênio substituinte no anel central (BRITO, 2012). Alguns

exemplos de xantenos são: eosina, fluoresceína, eritrosina, e rose bengal,

representados na FIGURA 5.


FIGURA 5. - Estrutura química dos derivados de Xantenos. (Adaptado de

GOULART, 2009).

1.3.3.1 – Eosina

A eosina é solúvel em água e apresenta coloração vermelho-rosado

sendo utilizada para tingir vários tipos de materiais além de corar citoplasma,

colágeno e fibras musculares para análise microscópica (ROHDE,2006). O

corante é obtido pela reação do bromo com a fluoresceína, sua fórmula

química é C20H8Br4O5, possui massa molar de 647,89 mol.L-1 (PERUSSI,

2007). Seu uso é liberado pelo FDA (Food and Drug Administration) para

produção de bases líquidas, batons, medicamentos de uso tópicos ou de

ingestão. Segundo a ANVISA (Agencia Nacional de Vigilância Sanitária),

resolução no 79/2000 o corante eosina ou vermelho 45380 faz parte da lista

de substancias corantes permitidas para utilização em produtos de higiene

pessoal, cosméticos e perfumes, com campo de aplicação autorizado para

todos os tipos de produtos, desde que obedeçam as especificações de

identidade e pureza estabelecidas pelos organismos internacionais de

referência (ANVISA, 2000).

Além de ter sido utilizada em 1903 como o primeiro FS no tratamento

de tumores, a eosina vem sendo empregada como marcador para estudo in

vitro de liberação de fármacos (JOSUÉ,2000) e como FS em inativação

fotodinâmica de bactérias e fungos (PERUSSI, 2007; WANG, 2006). Por


exemplo, uma comparação entre os xantenos eosina e rose bengal na

inativação de C. albicans mostrou-se que a eficiência dos dois FS é similar

(FREIRE, 2013) no processo de inativação.

1.4 – Análise do crescimento fractal

O conhecimento de como as células reagem após o processo de

irradiação, pode dar indicação da forma de crescimento das colônias. Esta

análise pode ser feita a partir de resultados microscópicos e processamento

de imagens.

Desde a década de 90 a aplicação de programas para análise de

imagem permitiu a extração de informações quantitativas e caracterização

detalhada de variações morfológicas, encontradas no processo de formação

e crescimentos de sistemas complexos (DONNELLY, 1995; PAPAGIANNI,

2006). A análise de imagens é um método extremamente rápido, de baixo

custo e não destrutivo para exame de sistemas biológicos e vem sendo

aplicado em estudo de células, fibras musculares, sequenciamento de DNA,

crescimento de culturas microbiológicas entre outros (VECHT-LIFSHITZ,

1992; AMARAL, 1997).

Embora as imagens por si só revelem informações úteis, a

interpretação plena só é conseguida através da aplicação de técnicas de

tratamento de imagens. Quando desejamos trabalhar com dados quantitativos

como, por exemplo, a determinação de áreas nas imagens, geralmente isso é

feito através dos softwares que acompanham câmeras e microscópios (de

SOUZA, 2002). Especificamente, com relação ao crescimento de colônias de

bactérias ou fungos, os parâmetros morfológicos quantitativos mais utilizados

incluem: o número de colônias, o comprimento principal de hifas, frequência

de ramificação, área, perímetro, compactação, rugosidade, circularidade entre

outros (AMARAL, 1997). Apesar de ter sido introduzido um grande número de

parâmetros, a estrutura irregular das colônias e sua capacidade de ocupar

espaço ainda são difíceis de serem descritas visto que, como em muitas

estruturas irregulares observadas na natureza, as colônias apresentam

padrões fractais (PAPAGIANNI, 2006).


O conceito de fractal tem sido aplicado para descrever estruturas

irregulares e complexas e foi proposto por Mandelbrot em 1975 (BARABASI,

1995) como um modo de descrever as dimensões existentes entre as

convencionais (1D, 2D e 3D) e estruturas que não são nem linhas, superfícies,

ou sólidos. A análise da geometria fractal tem contribuído para a compreensão

da formação e crescimento de sistemas inorgânicos em processos

envolvendo formação de agregados e/ou estruturas dendríticas e em biologia,

a geometria fractal foi previamente aplicada, para descrever sistemas de

ramificação nas vias aéreas do pulmão e da espinha dorsal e na investigação

de estrutura das proteínas (AMARAL, 1997).

A análise fractal foi introduzida na microbiologia como descritor de

parâmetros de crescimento (OBERT, 1990) e é de importância fundamental

no que se refere a variações morfológicas das estruturas que podem estar

correlacionadas a patogenicidade (HUBBARD, 1986), atividade metabólica e

produção enzimática (HERMERSDORFER, 1987). O crescimento de

colônias de bactérias e fungos tem sido estudado por biólogos e físicos com

o propósito de entender os mecanismos cooperativos que levam a formação

de estruturas complexas (BARABASI, 1995).

Uma das maiores vantagens de uso de leis de escala em superfícies

fractais são a investigação do padrão morfológico de colônias e o

comportamento dos contornos frente à variação temporal. Por exemplo, a

investigação do crescimento de colônias in vitro e o desenvolvimento de

tumores in vivo exibem a mesma dinâmica de formação, independente do tipo

de célula analisada (BRU, 2003). O modelo prevê um crescimento

exponencial de células e um decaimento também exponencial devido à

restrição de nutriente. O mecanismo responsável pela progressão das células

tumorais pode estar associado com a difusão de células através das bordas

do tumor, de modo que o conhecimento e o controle da fractalidade das

colônias pode ser um fator importante a ser considerado em estratégias

clínicas.


1.5 – Objetivos

O principal objetivo deste trabalho foi investigar a viabilidade do fungo

Candida albicans frente aos efeitos da inativação fotodinâmica, combinando

a utilização do FS eosina e luz laser (532 nm). Para isso, a susceptibilidade

da C. albicans usando o método de contagem de colônias em placa e análise

de resultados de microscopia de fluorescência e de força atômica foram

analisados. Além disso, foi investigada a variação morfológica e a dinâmica

de crescimento da colônia do fungo C. albicans (irradiado ou não) a luz da

teoria de análise fractal, como modelo com potencialidade de ser utilizado em

estudos de dinâmica de crescimento celular. Este tipo de análise além de

indicar os mecanismos responsáveis pela reprodução do fungo pode guiar os

pesquisadores na busca de identificação de novas estratégias clínicas.

1.6 – Estrutura da dissertação

Além do capítulo de introdução a dissertação contém mais 6 capítulos.

No Capítulo 2 são apresentadas algumas considerações teóricas referente à

teoria fractal e modelos de crescimento. Os materiais e métodos

experimentais são descritos no Capítulo 3. Os resultados e discussões estão

no Capítulo 4, seguido das conclusões (Capítulo 5), referências (Capítulo 6) e

Apêndice com divulgação do trabalho.


2 – CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS

Neste capitulo são apresentados os conceitos básicos referentes a

teoria fractal e aos modelos de crescimento. Através de análise de imagens é

possível investigar o crescimento de colônias, acompanhando a alteração da

morfologia da superfície que pode ser definida como um conjunto de

partículas agregadas com alturas diferentes (BARABÁSI, 1995).

2.1 – Fractais

A palavra fractal significa irregular ou quebradiço e foi utilizada pela

primeira vez por Benoit Mandelbrot para descrever objetos cuja forma

permanece inalterada conservando a estrutura original conforme as variações

na escala observada (ASSIS, 2008).

Fractais isotrópicos são auto-similares ou self-similar: sua forma não

varia sob transformações de escala isotrópica, ou seja, aumentando a escala

por um mesmo fator obtém-se o mesmo tipo de estrutura. O conjunto de

Cantor (Figura 6.a), o triângulo de Sierpinski (Figura 6.b), a curva de Koch

(Figura 6.c) e a esponja de Menger mostrado na Figura 6.d são exemplos de

fractais self-similar.

George F. L. Cantor apresentou um conjunto fechado que pode ser

dividido em intervalos com 3 partes iguais, sendo que a parte do meio deve

ser excluída. Em divisões sucessivas, nota-se que as extremidades não se

alteram no decorrer do processo e que em cada nível restam 2 segmentos

que podem novamente ser divididos (BARABÁSI, 1995). Waclav Sierpinski


mostrou a obtenção de fractais self-similar a partir de um triangulo equilátero

que tem sua porção central retirada, resultando na formação de três novos

triângulos (BARABÁSI, 1995). A repetição deste passo gera uma figura

geométrica onde as partes são similares ao todo.

Figura 6. – (a) conjunto de Cantor, (b) triângulo de Sierpinski, (c) processo para obtenção da curva de Koch e (d) esponja de Menger.

(a) (b)

(c)

(d)


A curva de Koch proposta por Fabian Helge von Koch se inicia de um

segmento de reta, dividido em três partes iguais, sendo que a parte do meio

deve servir como base da construção de um triângulo equilátero e

posteriormente deverá ser excluída da figura. A curva agora é representada

por 4 segmentos. O processo de construção deve ser repetido em cada um

destes seguimentos e o resultado é uma figura com estrutura de floco de neve.

A esponja de Menger proposta por Karl Menger, segue a idéia apresentada

no triangulo de Sierpinski, mas com uma figura geométrica diferente: o cubo

(BARABÁSI, 1995).

A maioria das estruturas na natureza são fractais auto-afins ou self-

affine como, por exemplo, as copas de árvores, superfície da couve-flor, perfil

de altura de uma montanha, entre outros (BARABÁSI, 1995). Em cultura de

microrganismos, teorias sobre fractais foram introduzidas para descrever

padrões de crescimento e morfologia celular (MEAKIN, 1986; MATSUYAMA

1993; OBERT, 1990). Quando a mudança de escala é a mesma em todas as

direções, a morfologia de objetos self-affine muda. Por outro lado, quando a

mudança de escala é feita de forma diferente em cada direção, a morfologia

da interface permanece a mesma (de SOUZA, 2002).

2.2 – Dimensão Fractal

Em geral a morfologia de um objeto depende do comprimento de escala

de observação. Para descrever a morfologia de algo que é plano aos olhos e

rugoso ao microscópio é necessário caracterizar quantitativamente a

interface. A dimensão fractal, ao contrário da euclidiana, onde linhas têm

apenas uma dimensão, superfícies têm duas e volumes são tridimensionais,

não é uma dimensão inteira e sim fracionária. Enquanto a dimensão

topológica de uma linha é sempre 1 a dimensão fractal pode ser qualquer

número real entre 1 e 2 (de SOUZA, 2002). A Figura 7 mostra uma

representação comparativa entre as dimensões euclidiana e fractal.


Figura 7. – Comparação entre a dimensão Euclidiana e a dimensão fractal.

(Adaptado de http://www.insite.com.br/fractarte/artigos.php).

2.3– Leis de escala

Uma superfície fractal pode ser definida como um conjunto de

partículas com alturas diferentes. Conceitos como rugosidade podem ser

substituídos por expoentes que não se referem à rugosidade propriamente

dita, mas à forma com que a rugosidade muda quando a escala de observação

também muda (de SOUZA, 2002; BRITO, 2012).

Para descrever quantitativamente a formação de uma superfície,

introduzimos duas funções:

a) a altura média da superfície, h , que é definida por

L

i

tihL

th1

),(1

)( , (2.1)

sendo h(i,t) a altura da coluna i no tempo t e L o tamanho da janela analisada.

Se a taxa de deposição for constante, a altura média aumenta linearmente

com o tempo,

tth ~)( (2.2)


b) a largura da interface, que caracteriza a rugosidade da interface, é

definida pela flutuação na altura,

L

i

thtihL

tLW1

2

)(),(1

),( (2.3)

A rugosidade de uma superfície, W, é monitorada pela medida da altura

de cada ponto da interface em função do tempo (de SOUZA, 2002). A

rugosidade varia com o tempo e com o valor da largura da interface (janela de

observação). Para tempos menores que o tempo de saturação da rugosidade,

W(L,t) aumenta como uma potência do tempo

ttLW ~),( , (2.4)

sendo o expoente chamado de expoente de crescimento que caracteriza a

dependência temporal do processo de rugosidade (processo de formação da

superfície).

Quando a observação é feita em tempos superiores ao tempo de

saturação do valor de rugosidade, existe uma relação entre o tamanho da

matriz de amostragem L e o valor de W(L,t). Esta relação é expressa por:

LLWsat ~)( (2.5)

sendo chamado de expoente de rugosidade; é o segundo expoente crítico

que caracteriza a rugosidade de uma interface saturada.

O expoente de rugosidade está relacionado com a dimensão fractal de

uma superfície, DF, por:

)(tDDF (2.6)

sendo D a dimensão de imersão do objeto fractal (1, 2 ou 3).

2.4 – Modelos de crescimento

O estudo de leis de escala no crescimento de superfícies é uma

importante ferramenta para determinar os mecanismos que governam a


evolução morfológica de uma superfície. O comportamento de escala e os

expoentes críticos (ou dimensão fractal) observados experimentalmente são

frequentemente comparados com modelos que envolvem agregação de

partículas (BARABÁSI, 1995).

2.4.1 – Modelo de Eden

O modelo de Eden proposto em 1961 para investigação da formação

de colônia de bactérias e culturas de tecidos (BARABÁSI, 1995; WAKITA,

1994) propõe que o crescimento ocorre a partir de uma região de nucleação

que pode ser uma linha, por exemplo. Novas partículas ocuparão sítios vazios

e a escolha será aleatória, com a mesma probabilidade de ocupação para

todos os sítios da interface. O resultado é uma estrutura compacta (exceto por

alguns sítios vazios próximos a borda) com superfície bastante sinuosa, como

representado na Figura 8. Os resultados numéricos para os expoentes de

rugosidade e crescimento, quando D=2, obtidos por simulação computacional

são respectivamente ~0,5 e ~0,33 (BARABÁSI, 1995).

Figura 8. – Representação esquemática de agregados formados a partir do modelo de Eden (Adaptado de BARABÁSI, 1995).

2.4.2 – Deposição via epitaxia por feixe molecular (MBE)

As teorias que descrevem interfaces que crescem governadas pelo

modelo de deposição via epitaxia por feixe molecular (molecular beam

epitaxy, MBE) levam em consideração efeitos de deposição, dessorção e


difusão na superfície.

2.4.2.1 - Teoria linear

No sistema de deposição MBE as partículas são arranjadas

aleatoriamente ligando-se a superfície. A dessorção compete com esse

fenômeno durante o crescimento e depende dos tipos de ligações que foram

realizadas e da geometria local da interface. No modelo MBE as partículas

difundem pela superfície buscando uma posição mais estável (BARABÁSI,

1995).

A equação diferencial estocástica que descreve a formação da interface

é dada por (BARABÁSI, 1995):

∂h

∂t= −K∇4h + η(x, t) (2.7)

sendo K a representação da difusão na superfície. O termo −𝐾∇4ℎ descreve

o relaxamento da superfície (GOMES, 2013).

Os resultados numéricos para os expoentes de rugosidade e

crescimento são dados pelas seguintes equações:

𝛼 = 4−𝑑

2 ; 𝛽 =

4−𝑑

8 (2.8)

2.4.2.2 - Teoria não-linear

Para análise em grandes comprimentos de escalas é necessário

considerar efeitos não lineares no mecanismo de difusão. Neste sentido, Lai-

Das Sarma e Villain simultaneamente propuseram a adição do termo não

linear 𝜆∇2 (∇ℎ2) na equação:

𝜕ℎ

𝜕𝑡= −𝐾∇4ℎ + 𝜆∇2 (∇ℎ2) + 𝜂(𝑥, 𝑡) (2.9)

Este termo está relacionado à probabilidade das estruturas difundirem para

posições energeticamente mais estáveis e sua relevância no processo de

crescimento aumenta com a temperatura.

Os resultados numéricos (BARABÁSI, 1995) para os expoentes de


rugosidade e crescimento são dados pelas seguintes equações:

𝛼 =4−𝑑

3; 𝛽 =

4−𝑑

8+𝑑 (2.10)


3 – MATERIAIS E MÉTODOS

Neste capítulo são descritos os materiais utilizados e métodos de

caracterização. Todos os procedimentos foram realizados nos laboratórios do

Grupo de Materiais Nanoestruturados – GMN

(http://araguaia2.ufmt.br/gmn/index.html).

3.1 – Cultivo de Candida albicans

O fungo da espécie Candida albicans (ATCC1 14053) foi utilizado no

desenvolvimento deste trabalho. Todos os procedimentos foram elaborados

utilizando a metodologia padrão para cultivo de microrganismos (HARTUNG,

2002). A vidraria utilizada foi lavada, seca e esterilizada em autoclave modelo

Vitale Plus (Figura 9.a). Foram utilizadas placas tipo petri com diâmetro de

90,0 e 50,0 mm para repique e observação de crescimento do fungo,

respectivamente. Todo procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar

modelo ESCO com painel de controle microprocessador SENTINEL® (Figura

9.b). O crescimento da C. albicans ocorreu em estufa para cultura

bacteriológica a 36 1ºC, modelo Odonto Bras ECB1 Digital (Figura 9.c).

A cultura estoque de C. albicans foi mantida no escuro em água

destilada e temperatura ambiente. A partir da cultura estoque, foram

preparados repiques em meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose, SD,

(Prodimol Biotecnologia®) em concentração de 65 g.L-1 de acordo com

1 ATCC - American Type Culture Collection


indicação do fabricante. Os meios de cultura foram esterilizados a 121 ºC

durante 15 minutos e armazenados a uma temperatura entre 2 e 5ºC.

Figura 9. – (a) autoclave Vitale Plus, (b) capela de fluxo laminar vertical SENTINEL

e (c) estufa para cultura bacteriológica OdontoBras.

A partir das placas de repique com auxílio de uma alça de platina, a

solução estoque foi preparada com 9 mg de massa fúngica dispersa em 10

mL de solução fisiológica.

3.2 – Fotossensibilizador Eosina

A eosina utilizada neste trabalho foi obtida da Merck Chemical em

solução alcoólica a 2%. A concentração utilizada nos testes de PDI foi de 1

mM.

3.3 – Contagem de colônias

Existem dois métodos para quantificação da população de

microrganismos: o método da contagem em placa e a espectrofotometria.

Enquanto o método de contagem em placa indica o número de

microrganismos viáveis (vivos) a espectrofotometria indica o número total, ou

seja, microrganismos vivos e mortos (PERES, 2012).

Neste trabalho utilizou-se a contagem em placas que consiste na

repetida diluição de uma amostra em solução fisiológica até que o resultado

(a) (b) (c)


seja suficiente para a contagem na placa. É necessário alcançar entre 25 e

250 colônias por placa. Menos que 25 ou mais que 250 não são considerados

resultados confiáveis. Cada colônia visualmente separada de outra é indicada

como uma unidade formadora de colônias (UFC).

Neste trabalho, foi retirado 1 mL da solução estoque descrita

anteriormente e adicionado a um tubo de ensaio com 9 mL de solução

fisiológica. Esta é a diluição 1/10 ou 10-1. Desta dissolução foi retirado 1 mL e

adicionado a outro tubo de ensaio com 9 mL de solução fisiológica, resultando

na diluição 10-2. A repetição destes passos é conhecida como diluição

seriada. Foi retirada uma alíquota de 0,3 mL de cada diluição, para

espalhamento na placa com meio SD que posteriormente foram incubadas

por 24 horas. A representação do procedimento é visualizada na FIGURA 10.

FIGURA 10. - Procedimento da diluição seriada e imagens das placas de petri

referentes a cada etapa de diluição.

Este procedimento indica o número de colônias por mL. Após contagem

das colônias em placas ficou constatado que a diluição apropriada para

estudo foi a 10-4 que apresentou 156 colônias. Este procedimento foi repetido

em triplicata e os resultados das contagens indicaram sempre o mesmo fator


de diluição. Os cálculos foram realizados com a seguinte expressão:

UFC = (número de colônias) x 10 x (diluição utilizada para contagem)

Neste trabalho:

UFC = 156 x 10 x 104 = 1,56 x 107 UFC/mL

indicando que a quantidade de Candida viva por mL de solução utilizada é da

ordem de 107.

3.4 - Experimento de susceptibilidade

Para o experimento de susceptibilidade da C. albicans frente a PDI,

foi utilizado um laser de diodo (Flex/B&W TEK®) (detalhe na FIGURA 11) com

luz de comprimento de onda de 532 nm e potência de 3 mW, no escuro e

temperatura de 22 ºC (CARDOSO, 2012).

FIGURA 11. - No detalhe, laser de diodo Flex B&W TEK. Montagem do procedimento de irradiação por luz laser das soluções com C. albicans. Laboratório GMN.

Para os experimentos de PDI e análise da dinâmica de crescimento

das colônias, foram utilizadas as diluições 10-4 do fungo, preparadas em


solução fisiológica ou em solução do FS eosina (1 mM). A distância de

separação entre o laser e o microtubo com a solução (medida a partir da saída

do feixe laser e o fundo do microtubo) foi de 10,0 cm. As dispersões com

volume de 300 L foram irradiadas em microtubos e posteriormente utilizadas

para inoculação em placas de petri ou análise microscópica. A montagem do

procedimento para irradiação do fungo é mostrada na FIGURA 11.

3.5 – Análise da dinâmica de crescimento das colônias

Para análise do crescimento das colônias de C. albicans foram

inoculados 5L da solução com 107 UFC/mL na parte central de placas de

petri ( 50 cm) com meio SD. A fim de analisar a influência da irradiação com

e sem a presença do FS foram realizados experimentos similares, sendo que

o fungo foi irradiado com e sem a presença do FS. Para estes experimentos,

o tempo de contato ou tempo de pré-irradiação entre o fungo e o FS foi igual

a 5 min. A fluência utilizada para as dispersões irradiadas foi de 80 J/cm2 (10

min e potência de 3mW). Após irradiação, 5 L das soluções foram inoculadas

em placas de petri, de modo que foi possível analisar o crescimento do fungo

sem irradiar e irradiado na presença e ausência do FS. Os experimentos foram

realizados em triplicata. O crescimento foi acompanhado com registro

fotográfico de 24 em 24h utilizando uma câmera digital Samsung ES25 (12.2

MP).

3.6 – Espectroscopia na região de ultravioleta a visível

Os espectros de absorção na região ultravioleta-visível (190 - 900nm)

foram obtidos em espectrofotômetro Thermo Genesys 10 UV, (FIGURA 12)

utilizando cubeta de quartzo.

A obtenção dos espectros está relacionada com a emissão de um feixe

de luz que sofre difração em um prisma que incide sobre a amostra a ser


analisada. Esta por sua vez, absorve parte da emissão em um comprimento

de onda especifico sendo que quanto maior for a quantidade e a concentração

do material a ser analisado maior será sua absorbância (PAVIA, 2010).

FIGURA 12. - Espectrofotômetro THERMO, modelo Genesys 10s.Laboratório GMN.

3.7 – Microscopia Óptica

A microscopia óptica possibilita o aumento de imagens através da luz

que, após incidir sobre determinada amostra, passa por um conjunto de

lentes. O microscópio óptico possui dois sistemas de lentes convergentes: a

objetiva e a ocular. A objetiva fornece uma imagem real e aumentada da

amostra, enquanto a ocular projeta uma imagem virtual e aumentada da

imagem real que se formou com a objetiva (CERIDÓRIO, 2011).

Além de ampliar a imagem de um objeto, o microscópio aumenta o

poder de resolução do olho humano, ou seja, a capacidade de distinguir dois

pontos muito próximos um do outro. Geralmente, microscópios têm um limite

denominado “poder de resolução” da ordem de ~ 0,2 µm, assim as lentes

conseguem mostrar dois pontos distintos se estes estiverem separados por

distâncias de pelo menos 0,2 µm. O aumento total do objeto observado é

calculado multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular

(COELHO, 2011).

O microscópio óptico é usado na caracterização e exame de materiais,

sendo que as informações são obtidas através de luz transmitida ou refletida.


Microscópios ópticos consistem basicamente de uma fonte de luz, um

condensador e dois sistemas de lentes, além de outros acessórios e são

capazes de produzir imagens com aumentos variados de 10x a 1000x.

Câmaras fotográficas acopladas a um microscópio óptico permitem o registro

de imagens (WEST, 1992; de SOUZA, 1998).

3.7.1. – Microscopia de Fluorescência

A microscopia de fluorescência utiliza-se de base de um microscópico

óptico com algumas características adicionais. Beneficia-se da capacidade de

alguns materiais que possuem fluorescência própria, mas o uso de corantes

específicos possibilita a visualização da estrutura de vários materiais, que

somente podem ser observados com o auxílio desta ferramenta tornando-se

indispensável em análises biológicas. Os microscópios possuem filtros

especiais chamados de filtros de excitação e filtros de barragem. Algumas

substâncias absorvem a energia da radiação ultravioleta emitindo depois

radiação dentro do espectro de luz visível. Microrganismos corados por um

corante fluorescente aparecem como objetos luminosos quando observados

com luz ultravioleta. (TABOGA, 2001).

Neste trabalho foi utilizado o corante vital laranja de acridina (14 g.L-1)

que fluoresce verde quando as células do fungo estão viáveis e vermelho-

alaranjado quando estão mortas. A solução do corante foi colocada em

contato com a dispersão dos fungos por 5 min. Após este período a solução

é centrifugada com solução fisiológica por 10 min em 2000 rpm. O

procedimento é repetido até completa remoção do corante. O fungo fica no

fundo do microtubo e posteriormente é depositado em lâminas para análise

microscópica.

Para a investigação morfológica das leveduras foi utilizado o

microscópio óptico Nikon Eclipse Ci/L apresentado na FIGURA 13. O

equipamento possui câmera fotográfica digital e refrigerada, pela qual as

imagens são obtidas. A câmara de vídeo de alta resolução, modelo DS-Ri1 é

conectada a uma placa de captura de imagens (NikonDigitalDS-U3 unidade

de controle) que por sua vez está conectada em um computador (Dell, Core

i5).


Figura 13. – Microscópio de fluorescência Eclipse Ci/L (Nikon Ltd., Japão), e

representação esquemática das partes constituintes do equipamento. Laboratório GMN

3.8 – Microscopia de força atômica

A invenção do microscópio de força atômica contribuiu

significativamente para a nanotecnologia e seus criadores receberam o

prêmio Nobel em 1986. A técnica tem promovido grande impacto na ciência

de materiais graças à possibilidade de obter imagens em escalas que podem

chegar ao nível atômico (BRITO, 2012). No microscópio de força atômica


a)

b)

(AFM, do inglês atomic force microscope) as imagens são geradas através da

medida das forças de atração ou repulsão entre a superfície da amostra e uma

sonda ou agulha bem fina que varre a superfície da amostra (CARDOSO,

2012).

Figura 14. - a) Representação esquemática do sistema de obtenção de imagens; b) equipamento Nanosurf® EasyScan II utilizado para realização das imagens.

Laboratório GMN.

A FIGURA 14 mostra o equipamento NanoSurf EasyScan II utilizado

para realização das medidas de caracterização da superfície do filme. As

medidas foram realizadas em condições ambiente no modo contato

intermitente. As imagens foram obtidas em uma janela de varredura de 10 x

10 m com resolução de 512 x 512pixeis. As agulhas utilizadas são de cristal

de silício e cobertura reflexiva de alumínio, com constante de força de 0,2N/m


e frequência de ressonância de 13kHz.

3.9 – Processamento das imagens para análise fractal

As imagens macroscópicas foram capturadas com uma câmera digital

Samsung ES25 (12.2 MP) e armazenadas em formato digital. Foi utilizado o

software livre ImageJ para tratamento das imagens. O programa está

disponível para download em http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. A

FIGURA 15 é a representação do ambiente de trabalho para processamento

de imagens do programa ImageJ.

Figura 15. - Representação da interface do programa ImageJ para tratamento das imagens.

O método para determinação da dimensão fractal é adequado apenas

para imagens binárias, de modo que as cores das imagens não são

importantes para a análise, que processa apenas informações em escala de

cinza. As imagens foram limiarizadas e separadas em dois grupos: um grupo

com pixels com escala de cinza abaixo do limiar e outro com pixels de escala

de cinza acima do limiar. Informações referentes ao meio ou qualquer tipo de

contaminação podem ser removidas durante o tratamento, selecionando


apenas as imagens referentes às colônias.

Figura 16. – Representação do método de contagem de caixas e gráfico log log da

contagem de caixas em função do tamanho.

As dimensões fractais foram obtidas pelo método de contagem de caixa

(box-counting). Esse método consiste em sobrepor à imagem uma malha de

quadrados e contar o número de quadrados necessários para cobrir toda a

forma (COELHO, 1995). O tamanho das caixas é alterado diversas vezes

(FIGURA 16) e a dimensão fractal corresponderá a inclinação da reta de

ajuste em um gráfico logarítmico da contagem de caixas em função do

tamanho das caixas, como ilustrado na FIGURA 16.


4 - RESULTADOS E DISCUSSÕES

A apresentação dos resultados tem início na observação dos espectros

dos materiais utilizados na região do ultravioleta a visível (UV-Vis). Os

resultados são complementados com investigações da susceptibilidade da C.

albicans, morfologia do fungo e análise da dinâmica de crescimento de

colônias.

4.1 – Espectroscopia na região do UV-Vis

A Figura 17 mostra os espectros na região do UV-Vis para o FS eosina,

diluído em solução fisiológica com concentração de 1mM. A banda mais

intensa do FS está entre 440 e 540 nm com absorbância máxima em 512 nm

indicando que o comprimento de onda de 532 nm usado para a irradiação com

laser é adequado para testes de fotoinativação. Os picos em 254, 300, 340 e

512 nm são tipicamente descritos na literatura (ZHANG, 1998) e não sofrem

alteração quando o FS é posto em contato com o fungo, sugerindo que o FS

não agrega e que não há alteração estrutural do fungo na presença do FS. O

processo de irradiação também não altera a posição dos picos, como

mostrado na Figura 17. Para melhor visualização os espectros foram

normalizados. O detalhe na figura mostra a absorção referente à dispersão de

C. albicans, com uma banda entre 240 e 300 nm que pode estar relacionada

a absorção do ergosterol (esterol semelhante ao colesterol em células

animais), que é um dos principais componentes da membrana plasmática em

fungos (ARAMI, 1997).


200 300 400 500 600 700 800

250 300 350 400 450 500

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Ab

so

rbân

cia

Comprimento de onda (nm)

C. albicans

Ab

so

rbâ

nc

ia

Comprimento de onda (nm)

Eosina + C. albicans/ irradiado

Eosina + C. albicans

Eosina 262nm

FIGURA 17. – Espectro UV-Vis do FS eosina e da dispersão de C. albicans + FS

antes e após irradiação de luz laser por 10 min. O detalhe na figura mostra o espectro de UV-Vis da C. albicans.

4.2 – Susceptibilidade da C. albicans

O método de contagem de colônias em placas de petri (JORI, 2006)

inoculadas com o fungo irradiado com e sem a presença de eosina foi utilizado

para avaliar a eficiência da inativação da C. albicans, sem pré-irradiação, ou

seja, o FS foi colocado em contato com o fungo e imediatamente irradiado. O

gráfico da FIGURA 18 mostra a fração de sobrevivência da C. albicans em

função da fluência aplicada. Os números de colônias avaliados foram

normalizados para permitir a comparação. Os resultados indicam que para

altos valores de fluência a C. albicans pode ser inativada com a combinação

de FS + laser (=532nm). Apenas o uso do laser não produz alterações

significativas na fração de sobrevivência, o que reforça a hipótese de eficácia

do FS eosina + laser na susceptibilidade de C. albicans.


0 100 200 300 400

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

C. albicans sem FS (controle)

C. albicans com FS F

raç

ão

de

so

bre

viv

en

cia

Fluência (J/cm2)

FIGURA 18. – Frações de sobrevivência da dispersão de C. albicans (controle) e C.

albicans + FS sem pré-irradiação, em função da fluência aplicada ( = 532 nm; 3 mW)

Embora a susceptibilidade tenha sido alcançada, os altos valores de

fluência (150 e 400 J/cm2) podem causar hipertermia (BROWN, 2003; SILVA,

2014). Neste trabalho escolhemos utilizar a fluência de 80 J/cm2 com base em

outros trabalhos que indicam que a C. albicans associada a diferentes FSs

pode ser inativada com fluências que variam de 18 a 100 J/cm2 (BAGNATO,

2008; DEMIDOVA, 2005; BARBÉRIO, 2013).

O gráfico da FIGURA 19 mostra a fração de sobrevivência da C.

albicans em função do tempo de contato ou de pré-irradiação. Os resultados

confirmam que este é um parâmetro que deve ser considerado e que a fração

de sobrevivência do fungo é reduzida à medida que forem aumentados os

tempos de pré-irradiação.


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Candida albicans

C. albicans + laser + FS ( 10min)

C. albicans + laser + FS ( 30 min)

C. albicans + laser + FS ( 2h30)

C. albicans + laser + FS (12h00)

Fra

çã

o d

e S

ob

rev

ivê

nc

ia

FIGURA 19. – Frações de sobrevivência da dispersão de C. albicans (controle) e C. albicans + FS com diferentes tempo de pré-irradiação. A fluência aplicada foi de

80J/cm2 ( = 532 nm; 3 mW).

De acordo com Wainwright (WAINWRIGHT, 1998) pouco tempo de

contato entre o FS e o microrganismo pode causar alguns danos na parede

celular após a exposição a luz, ao passo que um maior tempo de pré-

irradiação pode ocasionar ruptura de ácidos nucléicos. Segundo Demidova

(DEMIDOVA, 2005) a C. albicans bem como outros fungos são mais

resistentes a fotoinativação devido à presença de uma membrana nuclear que

atua como uma barreira adicional. Entretanto, deve-se levar em consideração

que tempos menores são desejáveis para o controle clínico de candidíase,

principalmente em bebes e crianças (BARBÉRIO, 2013).

4.2.1 – Microscopia de fluorescência

A microscopia de fluorescência associada a marcadores adequados

dão indicação da viabilidade celular. O corante vital, laranja de acridina,

penetra nas células, intercala o DNA intacto e fluoresce verde. Se lesada, as

células aparecerão vermelha-alaranjada (WARTIG, 1992). A FIGURA 20 A

mostra imagens de C. albicans corada com laranja de acridina. A FIGURA 20


B e C são imagens do fungo após processo de fotoinativação com tempo de

pré-irradiação igual a 10min e fluência de 80 e 200 J/cm2, respectivamente.

As imagens de microscopia corroboram os resultados de viabilidade.

A) C. albicans

B) C. albicans + FS (80 J/cm2) C) C. albicans + FS (200 J/cm2)

FIGURA 20. – Microscopia de fluorescência para C. albicans A) sem irradiar

(aumentos de 40 e 100x); B) irradiada com fluência de 80 J/cm2 e C) irradiada com fluência de 200 J/cm2. Para B e C, tempo de pré-irradiação foi igual a 10 min e aumento de 40x.

4.3 – Efeito da inativação fotodinâmica na morfologia da

C. albicans

Embora a microscopia de fluorescência indique a viabilidade celular, a

técnica não revela detalhes sobre os danos que podem ocorrer durante a


morte celular ocasionada pelo processo de fotoinativação. Por outro lado, a

microscopia de força atômica (AFM) pode revelar detalhes da estrutura da

célula o que permite uma análise mais detalhada das irregularidades

causadas durante a fotoinativação.

C. albicans C. albicans (80 J/cm2)

FIGURA 21. – Imagens de AFM para C. albicans antes e após a irradiação com o FS

e fluência de 80J/cm2.

A FIGURA 21 mostra as imagens de AFM em 2D e 3D para C. albicans

sem irradiar e irradiada com FS, tempo de pré-irradiação igual a 10 min e

fluência de 80 J/cm2. Como esperado, é possível notar que as células fúngicas

são aproximadamente esféricas, ou seja, são leveduras com dimensões de 3

a 5m. Após a irradiação, as estruturas apresentam formas irregulares com

reentrâncias consistentes com as encontradas por Kim e colaboradores (KIM,

2011) em investigação de morte celular de C. albicans por ação de

antifúngicos. A estrutura tridimensional da C. albicans foi alterada e os valores

do eixo Z, que correspondem a altura da estrutura celular, diminuíram após o

µm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

1.5

1.75

2

2.25

2.5

2.75

3

0 2 4 6 8 10 µm

µm

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

µm

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

0 2 4 6 8 10 µm

µm

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10


processo de fotoinativação como mostra a FIGURA 22.

FIGURA 22. – Perfis de altura de C. albicans antes e após inativação com FS + laser.

Os perfis foram obtidos de uma seção transversal das imagens da Figura 4.5.

Os perfis de altura da FIGURA 22 obtidos das imagens de AFM revelam

que após o processo de fotoinativação a parede celular do fungo parece ter

sido rompida, levando a uma diminuição da altura do fungo. Os resultados de

AFM indicam que a inativação da C. albicans pode ocorrer com danos na

parede celular gerados pelo efeito combinado do FS associado à exposição

de luz laser. Outros autores também associam a hipótese de danos na

membrana como causadora da morte celular (KIM, 2011; LAMBRECHTS,

2005; MELO, 2012; PRATES, 2010).

De acordo com os resultados apresentados, a fotoinativação é

alcançada usando o corante eosina como FS associado à exposição de luz

laser com = 532nm e 3mW, quando a fluência aplicada for próxima de 150

J/cm2, o que equivale a 19min de irradiação. A inativação também foi

alcançada quando o tempo de pré-irradiação foi de 12h. As duas condições

são extremas principalmente quando pensamos em tratamento de candidíase

bucal, onde o FS pode ser ingerido e alterado pela saliva do paciente. O alto

valor de fluência também aumenta o “tempo de cadeira” do paciente. Uma

alternativa pode estar no aumento da concentração do FS, que certamente

reduzirá os outros dois fatores. Mais estudos precisam ser realizados

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 µm

µm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 µm

µm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2


incluindo testes de toxicidade para análise do limite máximo aceitável para a

concentração de eosina.

Em resumo, os resultados indicam que a eosina é candidata a FS na

inativação da C. albicans que deve ocorrer devido a danos causados nas

paredes celulares. Embora os experimentos tenham sido realizados in vitro,

os parâmetros avaliados na inativação da C. albicans, como o tempo de pré-

irradiação e fluência aplicada, podem nortear a aplicação do FS em terapia

fotodinâmica.

4.4 – Dinâmica de crescimento

A segunda parte desta investigação teve o objetivo de avaliar a

evolução temporal do crescimento de colônias de C. albicans em função da

irradiação das colônias com e sem a presença do FS eosina. Os dados foram

analisados a luz da teoria de análise fractal. Essa avaliação pode indicar os

mecanismos responsáveis pela reprodução e difusão do microrganismo que

por sua vez podem ajudar a identificar novas estratégias clínicas.

A evolução morfológica e a análise de contornos das colônias de C.

albicans foram morfometricamente avaliadas através de imagens fotográficas,

em diferentes condições de crescimento. O comportamento investigado foi a

dependência do crescimento radial das colônias inoculadas em função da

irradiação de luz laser (= 532nm). Para avaliar apenas a influência do laser,

as colônias foram irradiadas com a adição do fotossensibilizador vermelho de

eosina e também na ausência desse corante.

A FIGURA 23 mostra a evolução do padrão morfológico e evidencia

que as colônias crescem bidimensionalmente sobre as placas de ágar. É

possível observar ainda que o procedimento de irradiação interfere na

evolução temporal e espacial do crescimento das colônias e que estas

evoluem para uma forma altamente compacta. Tal comportamento também

foi encontrado no crescimento de Escherichia coli e Bacillus subtilis (FAMILY,

1995).


C. albicans

(sem irradiar)

C. albicans

(irradiada 10min)

C. albicans+eosina

(irradiada 10min)

FIGURA 23. – Influência do processo de irradiação na evolução temporal do crescimento de colônias de C. albicans.

A FIGURA 24 mostra as interfaces fractais correspondentes aos

diferentes tempos de observação do crescimento das colônias. A

dependência do processo de irradiação das células, que interfere no tamanho

e na forma do crescimento, é mais bem visualizada nestas imagens de

contorno. As imagens foram binarizadas usando o software ImageJ.


FIGURA 24. – Evolução temporal do contorno das colônias de C. albicans. Cada

contorno corresponde a um tempo de captura das imagens dos crescimentos das colônias.

A cinética de crescimento do microrganismo pode ser obtida do estudo

da dependência do raio médio, R, das colônias em função do tempo, t. As

FIGURAS 25, 26 e 27 mostram os gráficos log-log que podem ser ajustados

pela lei de potência proposta por Family (FAMILY, 1995):

ttR ~)( , (4.1)

sendo o expoente de crescimento. O valor de é obtido da inclinação dos

gráficos e depende de detalhes dos processos físicos, químicos e biológicos

que controlam o crescimento da colônia. Ou seja, é proporcional ao número

de fungos capazes de se dividirem, disponibilidade de nutriente e espaço

(FAMILY, 1995).

Através dos gráficos mostrados nos detalhes das FIGURAS 25 a 27, é

possível estimar a velocidade de crescimento ou taxa de expansão radial das

colônias, que varia quando o fungo é submetido à exposição de luz laser. Os

resultados morfométricos obtidos para C. albicans são apresentados na

TABELA 1.


10 100

5

10

15

20

0 100 200 300 400 500 600 7002

4

6

8

10

12

14

16

18

Raio

médio

(m

m)

Tempo (h)

Ra

io M

éd

io (

mm

)

Tempo (h)

C. albicans sem irradiar

FIGURA 25. - Raio médio da colônia em função do tempo para C. albicans sem

irradiação.

10 100

5

10

15

0 100 200 300 400 500 6002

4

6

8

10

12

14

Raio

méd

io (

mm

)

Tempo (h)

Ra

io M

éd

io (

mm

)

Tempo (h)

C. albicans irradiada

FIGURA 26. - Raio médio da colônia em função do tempo para C. albicans irradiada

por 10 min.


100 200 300 400 500 6000,1

1

100 200 300 400 5000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Raio

Méd

io (

mm

)Tempo (Horas)

Ra

io M

éd

io (

mm

)

Tempo (h)

C.albicans + eosina (irradiada)2

FIGURA 27. - Raio médio da colônia em função do tempo para C. albicans com eosina irradiada por 10 min.

TABELA 1. – Dados morfométricos da análise de crescimento de colônias de C. albicans em função da exposição à luz laser.

* (t0: tempo correspondente ao início da visualização do crescimento; ts: tempo

correspondente ao início da saturação do crescimento; vcres: taxa de expansão radial

da colônia; Rmax: raio máximo da colônia; : expoente de crescimento; DF: dimensão

fractal e : expoente de rugosidade).

A formação das colônias em meio ágar é 7,5 vezes mais lenta para o

crescimento do fungo na presença do fotossensibilizador, FS, e exposto à luz

* C. albicans

(sem irradiar)

C. albicans

(irradiada)

C. albicans

(com eosina e irradiada)

t0 12 h 12 h 90 h

ts 345 h 350 h 330 h

vcres 58 19 m/h 49 2 m/h 11 1 m/h

Rmax 14,45 0,14 mm 10,96 0,24 mm 1,70 0,05 mm

0,33 0,01 0,37 0,02 0,69 0,05

DF 1,03 0,03 1,09 0,06 1,17 0,06

0,97 0,91 0,83


laser ( = 532nm,10 min, 3mW). Por outro lado, o tempo de saturação do

diâmetro das colônias ocorre após aproximadamente 14 dias de cultivo para

as três configurações investigadas. Provavelmente, esta saturação está

associada à diminuição de nutrientes e/ou ressecamento do meio de cultura.

Como mostrado nos detalhes das FIGURAS 25 a 27, o raio das

colônias aumenta linearmente com o tempo e o raio máximo é alterado pela

incidência de luz laser. As inclinações desses gráficos indicam a velocidade

média ou taxa de expansão do crescimento das colônias que dependem de

uma variedade de fatores externos, tais como disponibilidade de nutriente, pH

do meio e temperatura (BRÚ, 2003). A taxa de expansão foi reduzida na

presença de FS e exposição à luz laser, provavelmente devido ao processo

de inativação fotodinâmica das colônias (BARBÉRIO, 2013). De acordo com

Cardoso (CARDOSO, 2004) uma diminuição na taxa de crescimento pode

gerar alterações na composição da superfície celular, o que afetaria a

susceptibilidade dos microrganismos aos agentes antimicrobianos visto que a

atuação dos antifúngicos está associada ao crescimento e atividade

metabólica.

As sequências de contornos apresentados na FIGURA 24 foram

utilizadas para a determinação da dimensão fractal, DF, através do método de

contagem de caixas. O expoente de rugosidade, , foi determinado através

da relação DF= D- e os valores estão listados na TABELA 1. Vale ressalvar

que embora as colônias cresçam bidimensionalmente sobre o meio de cultura,

os expoentes críticos determinados neste trabalho foram obtidos através da

análise do contorno das bordas das colônias, levando então, o problema para

um escala unidimensional como representado na FIGURA 28.

FIGURA 28. – Representação de uma colônia quase circular e linearização dessa

expansão radial.


Valores com expoente de rugosidade, ~ 1 e de crescimento ~ 0,3

como os encontrados para as colônias cultivadas sem a interferência do FS,

indicam que a dinâmica de crescimento pode ser descrita pela equação 2.9

que propõe o crescimento e a relaxação da interface dominados pelo

processo de difusão. Para D = 1 os expoentes previstos teoricamente são:

=1 e =0,33 (BARABÁSI, 1995). O modelo de crescimento proposto por Eden

(BARABÁSI, 1995) para explicar o processo de proliferação de células

corresponde a proposta mais simples para crescimento celular, baseada na

deposição aleatória de partículas e no fenômeno de agregação. Os resultados

apresentados estão em desacordo com o proposto por Eden e indicam que o

processo de crescimento pode ser caracterizado pela difusão das células na

superfície (-K4h) e que o número de células é conservado (12(h)2), isto

é, a dessorção celular deve ser insignificante.

Quando a C. albicans + FS é irradiada, os valores dos expoentes

críticos encontrados através da análise do contorno das bordas são: =0,83

e =0,69. Especificamente com relação ao expoente de crescimento, o valor

determinado é muito maior que o previsto por vários modelos teóricos

(BARABÁSI, 1995, HORVÁTH, 1991). Porém, os resultados encontrados

estão de acordo com o determinado para a evolução de interface em

experimentos com fluidos viscosos em meio poroso (HORVÁTH, 1991) e são

consistentes com a relação de escala proposta por Family (FAMILY, 1990)

+/ = 2, isto é: 0,83 + 0,83/0,69 = 2,03. Esta equação também foi satisfeita

na análise do crescimento do fungo Aspergillus nidulans (MATSUURA, 2000).

O crescimento da C. albicans pode ter sido inibido pelo fenômeno de

fotoinativação (BARBÉRIO, 2013) e alterou os expoentes de escala. Portanto,

a variação na taxa de crescimento da colônia deve ser considerada como um

fator de modificação no padrão do desenvolvimento do fungo.

Da observação experimental, é possível inferir que a proliferação deve

ser inibida em zonas mais interiores das colônias e, portanto, a análise das

bordas pode dar indicações a respeito da relação entre a habilidade de

proliferação e a distribuição espacial do fungo. Esta análise de bordas também

é importante no estudo de crescimento de tumores. Um grupo de

pesquisadores espanhóis (BRÚ, 2003; BRÚ, 1998) propõe que as células dos


contornos dos tumores se tornam mais malignas que as do centro das

colônias devido ao processo de duplicação celular que aumenta o número de

aberrações cromossômicas, ou seja, a malignidade das células aumentaria

com o raio do tumor. Eles investigaram 15 linhas celulares tumorais e todas

exibiram exatamente a mesma dinâmica de crescimento descrita pela classe

universal MBE que é caracterizada pela taxa de crescimento linear, difusão

celular nas bordas das colônias ou tumores e proliferação restrita as bordas,

ou seja, inibição do crescimento no interior das colônias ou tumores. Nossos

resultados, embora realizados em colônias de fungos C. albicans estão de

acordo com o previsto no citado estudo e indicam que é possível alterar essa

dinâmica de crescimento através do fenômeno de fotoinativação. Foi

mostrado que a expansão radial da colônia é significantemente reduzida pela

atuação do FS na presença de luz laser indicando que é possível alterar a

forma e o crescimento das colônias de C. albicans.


5 - CONCLUSÃO

Neste trabalho foi analisado o crescimento do fungo C. albicans e sua

viabilidade frente a inativação fotodinâmica combinando o FS eosina e luz

laser (532 nm). A susceptibilidade foi alcançada para valores de fluência

acima de 150 J/cm2 ou altos tempos de pré-irradiação. Resultados de

microscopia de fluorescência associado ao corante vital laranja de acridina

confirmam os resultados de viabilidade. Microscopia de força atômica indica

que a morte celular deve ocorrer devido a danos ocasionados na parede

celular do fungo gerado pela combinação do FS + laser.

Foi demonstrando que a teoria fractal é adequada na análise da

variação morfológica que ocorre durante o crescimento das colônias. Através

de processamento de imagens foi possível estimar parâmetros referente à

fractalidade do sistema.

O estudo da evolução temporal do crescimento de colônias de

microrganismos pode indicar os mecanismos responsáveis pela reprodução e

difusão que podem ser descritos por meio de modelos de crescimento de

interfaces fractais. Os resultados mostraram que a formação das colônias é

mais lenta para o crescimento do fungo + FS após fotoirradiação e o raio

máximo das colônias também é alterado assim como a taxa de expansão que

foi significantemente reduzida quando comparada aos sistemas sem FS. Este

é um resultado interessante visto que há estudos que indicam que a eficácia

de agentes antimicrobianos está associada ao crescimento das colônias.

Os valores dos expoentes de rugosidade e crescimento indicam que

quando o fungo é irradiado sem a presença do FS, a dinâmica de crescimento

é a mesma encontrada para a C. albicans sem fotoirradiação, que podem ser

descritos por crescimento da colônia com relaxação da interface e dominado

pelo processo de difusão. A presença do FS altera a dinâmica de crescimento


e os valores dos expoentes críticos sugerindo que a fotoirradiação interfere na

dinâmica e na taxa de crescimento das colônias, devendo ser, portanto, um

fator a ser considerado no padrão de desenvolvimento do fungo. De acordo

com os modelos analisados é possível inferir que a proliferação deve ser

inibida em zonas mais interiores da colônia e, portanto, a análise das bordas

de colônias pode dar indicações a respeito da relação entre a habilidade de

proliferação e a distribuição espacial do fungo.

Em resumo, mostramos que a eosina pode ser considerada candidata

a FS na inativação do fungo C. albicans, que o processo de inativação deve

ocorrer devido a danos gerados na estrutura da parede celular e que a

fotoirradiação altera o processo de crescimento das colônias. Estes resultados

podem nortear a aplicação do FS em terapia fotodinâmica e ser considerado

como ponto de partida para investigações futuras relacionados, por exemplo,

na diminuição do tempo de pré-irradiação e/ou fluência utilizada. É provável

que o aumento da concentração do FS reduza os parâmetros mencionados,

e este estudo deve vir acompanhado de uma análise da toxicidade do FS

eosina.


6 – REFERÊNCIAS

AMARAL, A. L.; ALVES, M. M.; MOTA, M.; FERREIRA, E. C., Morphological

Characterisation of Microbial Aggregates by Image Analysis, RecPad’97

– 9th Portuguese Conference on Pattern Recognition, 1997.

ANDRIOLE, V. T. Current and future antifungal therapy: new targets for

antifungal agentes. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 44, 151 – 162,

1999.

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APÊNDICE

DIVULGAÇÃO

As comunicações realizadas neste período foram:

A.1 – Artigos publicados

1) MACIEL, RAFAEL R. G., DE ALMEIDA, ADRIELE A., GODINHO, ODIN

G. C., GORZA, FILIPE D. S.,PEDRO, GRACIELA C., TRESCHER,

TARQUIN F., SILVA, JOSMARY R., DE SOUZA, NARA C., Ascorbic

Acid and BSA Protein in Solution and Films: Interaction and Surface

Morphological Structure. BioMed Research International. v.2013, p.1

- 7, 2013. http://dx.doi.org/10.1155/2013/4613650

2) SOUZA, NARA C. DE, GOMES, MARCIO N., MACIEL, RAFAEL R. G.,

SILVA, ROMÁRIO J. DA, TRESCHER, TARQUIN F., GORZA, FILIPE

D. S., PEDRO, GRACIELA C., CORREA, KENNEDY C. S., SOUZA,

MARCIO C. R., SILVA, JOSMARY R. Evaluation of the Antimicrobial

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A.2 – Artigo submetido

1) FILIPE D.S. GORZA, TARQUIN F. TRESCHER, GRACIELA C.

PEDRO, JOSMARY R. SILVA, NARA C. de SOUZA, Interaction and

surface morphological structure of chlorophyll-BSA complex.


A.3 – Artigos em preparação:

1) TRESCHER, TARQUIN F., da SILVA, ROMÁRIO J., SILVA,

JOSMARY R., de SOUZA, NARA C., Photodynamic inactivation of

Candida albicans

2) TRESCHER, TARQUIN F., da SILVA, ROMÁRIO J., SILVA,

JOSMARY R., de SOUZA, NARA C., Growth dynamic of Candida

albicans colony.

A.4 – Participações em congresso internacional

1) TRESCHER, T. F., GORZA, FILIPE D. S., PEDRO, G. C., ALMEIDA,

A. A., SILVA, J. R., SOUZA, N. C. Complexes ofacetylsalicylicacid-

BSA. In: 21th Latin American Symposium on Solid State Physics,

Villa de Leyva – Colômbia (30/09 – 4/10/2013).

2) GORZA, F. D. S., SILVA, R. J., TRESCHER, T. F., PEDRO, G. C.,

CORREA, K. C. S., MORAES, M. L., SILVA, J. R., SOUZA, N. C.

Photoisomerizationof congo red encapsulated by DPPC vesicles as a

possible approach for release control in drug delivery.In: European

Materials Research Society, Strasbourg – França (27/ – 31/05/2013).

3) GORZA, F. D. S., PEDRO, G. C., TRESCHER, T. F., MORAES, M. L.,

SILVA, J. R., SOUZA, N. C. Interaction and stability of chlorophyll-BSA

complexes In: European Materials Research Society, Strasbourg –

França (27/ – 31/05/2013).


4) PEDRO, G. C., GORZA, F. D. S., TRESCHER, T. F., ALMEIDA, A. A.,

SOUZA, N. C., SILVA, J. R. Fractal structures in casting films from

chlorophyll In: 21th Latin American Symposium on Solid State

Physics, Villa de Leyva – Colômbia (30/09 – 4/10/2013).

5) GORZA, F. D. S., SILVA, R. J., TRESCHER, T. F., PEDRO, G. C.,

CORREA, K. C. S., MORAES, M. L., SILVA, J. R., SOUZA, N. C.

Photoisomerization of congo red encapsulated by DPPC vesicles as a

possible approach for release controlin drug delivery In: 21th Latin

American Symposium on Solid State Physics, Villa de Leyva –

Colômbia (30/09 – 4/10/2013).

A.5 - Participações em congressos nacionais:

1) TRESCHER, T. F., GORZA, F. D. S., PEDRO, G. C., ALMEIDA, A. A.,

SILVA, J. R., SOUZA, N. C. Interaction of acetylsalicylic acid and BSA

complexes In: II Encontro de Física do Centro-Oeste,Brasília/DF,

2012.

2) SOUZA, N. C., GOMES, M. N., MACIEL, R. R. G., SILVA, R. J.,

TRESCHER, T. F., GORZA, F. D. S., PEDRO, G. C., SOUZA, M. C. R,

SILVA, J. R. Evaluation of the antimicrobial activity of Stryphnodendron

barbatiman against Citrobacter freundii In: III Workshop, Barra do

Garças, 2013.

3) GORZA, F. D. S., PEDRO, G. C., ALMEIDA, A. A., TRESCHER, T. F.,

SILVA, J. R., SOUZA, N. C. Interaction and stability of Chlorophyll BSA

complexes In: II Encontro de Física do Centro-Oeste, Brasília/DF,

2012.


A.6 - Participação em banca examinadora

1) Trabalho de conclusão de curso de graduação. Participação em banca

de Marco Antônio de Carvalho Faria, Morfologia e Molhabilidade em

Biossistemas, 2013. Universidade Federal de Mato Grosso, Instituto

Universitário do Araguaia. (N.C. de Souza, J.R. Silva, T.F.Trescher).

influÊncia da inativaÇÃo fotodinÂmica sobre a …

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