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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: SAÚDE COLETIVA ____________________________________________________________

Emanuelle Dayana Vieira Dantas

EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA

ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.

Dissertação de Mestrado

Natal, 2011

2




Dissertação de Mestrado

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva.

Orientador: Prof Dr Kenio Costa Lima.

Natal, 2011

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Dantas, Emanuelle Dayana Vieira.

Efeito in vitro da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em suspensão e

na formação de biofilme: ensaio com azul de metileno e toluidina ativados por

luz halógena.\ Emanuelle Dayana Vieira Dantas. – Natal, RN, 2011.

67 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa Lima.

Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em

Odontologia.

1. Fotoquimioterapia – Dissertação. 2. Halogenação – Dissertação. 3. Azul de

metileno – Dissertação. 4. Cloreto de tolônio – Dissertação. 5. Biofilmes -

Dissertação – Dissertação. 6. Cárie dentária. I. Lima, Kenio Costa. II. Título.

RN/UF/BSO Black D17

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva.

Aprovada em: _______/_______/__________

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________________ Prof. Dr. Kenio Costa de Lima

Orientador

_______________________________________________________________ Profa. Dra Isauremi Vieira de Assunção Pinheiro

Examinador Interno – UFRN

_______________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Antônio Japiassú Resende Montes

Examinador Externo – UPE

5

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Jacinto Moreira Dantas e Sônia Maria Vieira Dantas,

pelo amor incondicional e pelo esforço em tornar possível cada um dos meus

sonhos. Obrigada por sempre acreditarem em mim! Todas as minhas conquistas

sempre serão dedicadas a vocês... Amo muito!!!

Aos meus irmãos, Emanuell e Ellyommany, pela amizade e pela certeza

de saber que sempre poderei contar com vocês.

Ao meu sobrinho, Emanuell Júnior, por me fazer conhecer uma nova

forma de amor e por encher nossa família de alegria com a sua chegada.

A Igor, meu amor e melhor amigo, pelo apoio, paciência, generosidade, e

por tantas outras razões que não caberiam aqui em palavras, mas que foram

essenciais ao longo desta jornada. Amo você!

6

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Ao meu orientador, o Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela amizade,

ensinamentos e paciência ao longo deste trabalho. Agradeço a oportunidade de

estar ao seu lado e poder aprender com você. Admiro sua competência, seu

caráter e sua inquietude em busca de conhecimento. Sem dúvida, uma fonte de

inspiração... Muito obrigada por tudo!

À Profa Dra Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, minha orientadora

durante a iniciação científica e em parte deste curso de mestrado, pela

contribuição em minha formação acadêmica, pelo desprendimento e por ter me

permitido seguir em busca de novos anseios. Sempre lhe serei grata.

Aos alunos de iniciação científica, Annie Karoline e Hugo Lopes, pela

dedicação e empenho na etapa final deste trabalho. Meus sinceros

agradecimentos!

7

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, na pessoa de sua

Magnífica Reitora Profa. Dra. Ângela Maria Paiva Cruz; à Faculdade de

Odontologia, na pessoa de seu chefe de departamento Prof. Dr. Antonio

Ricardo Calazans e do coordenador do Programa de Pós-Graduação em

Odontologia, Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela participação desta

conceituada instituição no meu crescimento profissional e pessoal.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão de bolsa de mestrado.

A todos os professores que integram o corpo docente do Programa de

Pós-Graduação em Odontologia da UFRN, pela contribuição acadêmica ao

longo deste curso de mestrado.

Às professoras Dra. Maria Celeste Nunes de Melo e Dra. Isauremi

Vieira de Assunção Pinheiro, membros da banca de qualificação, pelas

sugestões dadas para finalização deste trabalho.

Aos secretários Sandra Abrantes de Souza e Lucas Soares de Araújo,

pelo incentivo e inestimável ajuda.

Às queridas Amanda, Ana e Isabel, pela colaboração constante durante

os experimentos realizados no Laboratório de Microbiologia.

Às bibliotecárias Mônica Reis e Cecília dos Santos, pelo auxílio

dispensado para a organização deste trabalho.

Aos colegas de turma, em especial a Ângela Medeiros, Camila

Resende, Jônia Cybele e Neusa Sales, que trilharam comigo esse caminho,

compartilhando angústias e alegrias.

Às melhores amigas que alguém poderia ter, Adélia Danielli, Mércia

Cunha, Saziane de Sá, Silvana Nobre, Sofia Mariz e Virgínia Helena, pelo

apoio e incentivo constantes.

Ao Sr. Ronaldo Martins e Sra. Francilene Martins, meus sogros, por

terem me acolhido como uma filha.

E enfim, a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram

para concretização desta pesquisa.

Meus sinceros agradecimentos.

8

“O homem é do tamanho do seu sonho”.

- Fernando Pessoa

9

RESUMO

A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido proposta como um método alternativo para o tratamento de doenças orais biofilme-dependentes, como a cárie dentária. Tal terapia consiste na ação simultânea de uma fonte luminosa (FL) e de um agente fotossensibilizante (FS), na presença de oxigênio tecidual, levando à produção de radicais livres que ao interagirem com componentes celulares bacterianos, promovem a morte celular. Este estudo tem como objetivo avaliar a ação antimicrobiana da TFD sobre bactérias orais em suspensão, bem como na formação de biofilmes mono e multiespécies, in vitro, a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente. Os corantes azul de metileno (CM) e azul de toluidina (CT) foram administrados na concentração de 100 mg/L e ativados por luz halógena (600 a 750 nm) proveniente de um aparelho fotopolimerizador modificado (Ultralux®, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.). Suspensões monoespécies e mistas foram preparadas e submetidas a diferentes condições experimentais: 1. TFD na presença de CT; 2. TFD na presença de CM; 3. irradiação sem administração de qualquer corante; 4. sensibilização com CT e ausência de luz; 5. sensibilização com CM e ausência de luz; 6. ausência de irradiação e sem qualquer corante (controle negativo) e 7. administração de solução de digluconato de clorexidina a 0,12% (controle positivo) (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA). A ação imediata e mediata da TFD sobre as suspensões bacterianas, bem como seu efeito sobre a formação de biofilme foram verificados, a partir do número de unidade formadoras de colônias por mL (UFC/mL) e de medidas de densidade ótica (DO). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente através dos Testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, para o nível de significância de 5%. De acordo com os resultados, a TFD não apresentou ação antibacteriana sobre as suspensões de S. mutans, independente do corante utilizado. A TFD com CM ativado por luz halógena foi capaz de reduzir em 86,6% o número de UFC/mL diante de suspensões multiespécies, entretanto, tal redução não foi significativa (p > 0,05). A TFD apresentou efeito antibacteriano, mediato, sobre suspensões mistas, quer na presença de CT (p < 0,001) ou CM (p < 0,001), ativados por luz halógena. A TFD preveniu a formação de biofilme multiespécie, através da ativação de CT por luz halógena (p = 0,01). Conclui-se que a ativação dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, pela luz halógena (TFD) apresentou ação antimicrobiana, frente a suspensões multiespécies preparadas a partir de amostras de saliva, ressaltando a possibilidade da utilização da terapia fotodinâmica como um método coadjuvante no tratamento de lesões de cárie dentária.

Palavras-Chave: Terapia fotodinâmica. Luz halógena. Azul de metileno. Azul de

toluidina. Bactérias orais. S. mutans. Cárie dentária.

10

ABSTRACT

Photodynamic therapy (PDT) has been proposed as an alternative method for

the treatment of biofilm-dependent oral diseases like dental caries. This therapy

consists of simultaneous action of a visible light (L) and a photosensitizer (FS) in

the presence of oxygen, which leads to production of different reactive oxygen

species that can interact with the bacterial cell components, and promote cell

death. This study aims to evaluate the antimicrobial action of PDT on oral

bacteria in suspension, as well as the formation of mono and multi-species

biofilms, in vitro, from a standard strain of Streptococcus mutans (ATCC 25175)

and saliva samples, respectively. The dye methylene blue (MB) and toluidine

blue (TB) were used at a concentration of 100 mg/ L and activated by halogen

light (600 to 750 nm) from a modified hand held photopolymerizer (Ultralux ®,

Dabi Atlante, Ribeirão Preto , São Paulo, Brazil.). Planktonic cultures were

prepared and submitted to different experimental conditions: 1. PDT using TB 2.

PDT using MB, 3. L+ FS- , 4. TB + L - ; 5. MB+ L-; 6. L- FS- (negative control)

and 7. administration of 0.12% chlorhexidine digluconate (positive control)

(Periogard ®, Colgate-Palmolive Company, New York, USA). The immediate and

mediated action of PDT on bacterial suspensions, as well as its effect on biofilm

formation were observed from the number of colony-forming units per milliliter

(CFU/mL) and measures optical density (OD). The data were statistically

analyzed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test for the significance

level of 5%. According to the results, the PDT showed no antibacterial action on

suspensions of S. mutans, regardless of the dye used. PDT with MB activated by

halogen light was able to reduce 86.6% CFU/mL multi-species planktonic

cultures, however, this reduction was not significant (p > 0.05). PDT showed

antibacterial effect, mediate on multi-species planktonic cultures with TB (p <

0.001) and MB (p < 0.001), activated by halogen light. PDT was able to prevent

the formation of multispecies biofilm, through the activation of TB by halogen light

(p = 0.01). We conclude that activation of the dye toluidine blue and methylene

blue, by halogen light (PDT) showed antimicrobial activity, compared to multi-

species planktonic cultures prepared from saliva samples.

Keywords: Photodynamic therapy. Halogen light. Methylene blue. Toluidine

blue. Oral bacteria. S. mutans. Dental caries.

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I ............................................................................................................................. 24

Figura 2: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II ............................................................................................................................. 24

Figura 3: Fórmula molecular do corante azul de metileno.................................. 27

Figura 4: Fórmula molecular do corante azul de toluidina................................... 27

Figura 5: Esquema ilustrativo da obtenção de cultura a partir de uma cepa padrão de S. mutans............................................................................................ 32

Figura 6: Esquema ilustrativo da obtenção de culturas multiespécies, a partir de amostras de saliva.......................................................................................... 33

Figura 7: Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado................................................................................................................ 34

Figura 8: Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda............................................................. 34

Figura 9: Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies....................................................... 36

Figura 10: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito imediato da TFD............................................................ 37

Figura 11: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD............................................................ 38

Figura 12: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécies........................................................................................................ 39

Figura 13: Fotografia demonstrando grande crescimento bacteriano................. 44

Figura 14: Fotografia demonstrando ausência de crescimento bacteriano......... 44

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, 2011................................................................................................................... 39

Tabela 2. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 40

Tabela 3. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 41

Tabela 4. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.................................................................................................................. 42

Tabela 5. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans. Natal, 2011................................................................................................................... 43

Tabela 6. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 45

Tabela 7. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 46

Tabela 8. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de metileno. Natal, 2011................................................................................................................... 47

Tabela 9. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011................................................................................................................... 48

Tabela 10. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies, e significância estatística, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 50

Tabela 11. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies, e significância estatística, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.......................... 51

Tabela 12. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies e significância estatística, com o corante azul de metileno. Natal, 2011............................................................................................................... 52

13

Tabela 13. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies e significância estatística, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011...................................................................................................................

53

14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

FA - : ausência de fotoativação

FS - : ausência de fotossensibilizante

% : por cento

FA + : sem fotoativação

°C: graus Celsius

AlPcS2: fitalacionia dissulfonado de alumínio

ATCC: American Type Culture Collection / Coleção de Culturas Americanas BHI : brain heart infusion / infusão cérebro coração

CLX: clorexidina CM: corante azul de metileno CT: corante azul de orto-toluidina

DNA: deoxyribonucleic acid / ácido desoxirribonucleico

DO: densidade ótica

ERO: espécies reativas de oxigênio

FA: fotoativação

FL: fonte luminosa

FS: fotossensibilizante

h: hora

LED: light emmiting diode /diodo emissor de luz

M: meio puro

mg/L: miligrama por litro

mL: mililitro

mW/cm2: miliWatt por centímetro quadrado

nm: nanometro

PPgO: Programa de Pós-graduação em Odontologia

Q 25-75: quartis 25 e 75

RPM: rotações por minuto

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S. mutans: Streptococcus mutans SPSS: Statistical Package for Social Sciences / Programa Estatístico para Ciências Socias

TFD: terapia fotodinâmica

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Zn: zinco

µl: microlitro

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 17 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................... 19 2.1. Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie.................... 19 2.2. Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva................... 21 2.3. Terapia Fotodinâmica................................................................................ 22 2.3.1. Substâncias fotossensíveis....................................................................... 25 2.3.2. Corantes fenotiazínicos............................................................................. 26 2.3.3. Fontes de luz............................................................................................ 28 2.3.4. Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia.................................. 29 3. OBJETIVOS.............................................................................................. 30 3.1. Objetivo geral ............................................................................................ 30 3.2. Objetivos específicos ................................................................................ 30 4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................ 31 4.1. Tipo do estudo........................................................................................... 31 4.2. Ensaios in vitro.......................................................................................... 31 4.2.1. Linhagem bacteriana padrão..................................................................... 31 4.2.2. Preparo das suspensões de S. mutans..................................................... 32 4.2.3. Obtenção de amostras de saliva estimulada............................................. 32 4.2.4. Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa.................................... 33 4.2.5. Preparação das placas.............................................................................. 34 4.2.6. Terapia Fotodinâmica................................................................................ 36 4.2.7. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica............................... 37 4.2.8. Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica................................ 37 4.2.9. Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e

multiespécie............................................................................................... 38

4.3. Análise estatística...................................................................................... 39 5. RESULTADOS.......................................................................................... 40 5.1. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do

corante azul de toluidina............................................................................ 40 5.1.1. Suspensões multiespécies........................................................................ 40 5.1.2. Suspensões de S. mutans......................................................................... 41 5.2.

Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno............................................................................

42

5.2.1. Suspensões multiespécies........................................................................ 42 5.2.2. Suspensões de S. mutans........................................................................ 43 5.3. Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com

utilização do corante azul de toluidina....................................................... 43 5.3.1. Análise a partir da contagem do número de UFC/mL............................... 43 5.3.2. Análise a partir da densidade ótica........................................................... 45 5.3.2.1. Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio de

cultura puro................................................................................................ 45 5.3.2.2. Suspensões multiespécies........................................................................ 46 5.3.2.3. Suspensões de S. mutans......................................................................... 47 5.4. Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com

utilização do corante azul de metileno....................................................... 48 5.4.1. Análise a partir da densidade ótica........................................................... 48

17

5.4.1.1. Suspensões multiespécies .................................................................. 48 5.4.1.2. Suspensões de S. mutans........................................................................ 49 5.5. Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de

biofilme com utilização do corante azul de toluidina.......................... 50 5.5.1. Análise a partir da contagem do número de UFC/mL............................... 50 5.5.2. Análise a partir da densidade ótica............................................................ 50 5.5.2.1. Suspensões multiespécies................................................................... 50 5.5.2.2. Suspensões de S. mutans......................................................................... 51 5.6. Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de

biofilme, com utilização do corante azul de metileno................................ 52 5.6.1. Análise a partir da densidade ótica............................................................ 52 5.6.1.1. Suspensões multiespécies........................................................................ 52 5.6.1.2. Suspensões de S. mutans......................................................................... 52 6. DISCUSSÃO.............................................................................................. 55 7. CONCLUSÃO............................................................................................ 61 REFERÊNCIAS........................................................................................ 62

18

1. INTRODUÇÃO

A terapia fotodinâmica consiste em um processo fotoquímico, no qual uma

substância fotossensibilizante (FS) é ativada pela exposição a uma luz, de

comprimento de onda específico, na presença do oxigênio26. Após ativação,

componentes moleculares da FS transferem energia para o oxigênio tecidual,

ocasionando a produção de formas iônicas altamente reativas, capazes de

promover oxidação de componentes essenciais à célula bacteriana, levando à

morte celular 50;57.

A terapia fotodinâmica tem sido estudada há mais de 100 anos, desde

que a morte de um microrganismo unicelular foi observada por Oscar Raab41,

em consequência da aplicação de um corante associado a uma fonte luminosa.

A partir da década de 70, seu uso clínico passou a ser difundido na área médica

devido aos bons resultados terapêuticos frente a diferentes tipos de câncer, além

de desordens oftalmológicas e dermatológicas 24. Desde a década de 90, o

interesse pelo efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica tem crescido e sua

aplicação no tratamento de infecções localizadas tem sido proposta7.

Nesse contexto, pesquisas envolvendo o desenvolvimento de terapias

antimicrobianas alternativas, como a fitoterapia e a TFD, têm sido conduzidas.

Uma das razões para justificar o desenvolvimento de tais terapias tem sido o

gradativo aumento da resistência de inúmeras espécies bacterianas frente às

terapias convencionais, pautadas basicamente no uso de antibióticos25.

A terapia fotodinâmica apresenta algumas vantagens frente à utilização

dos antimicrobianos químicos usuais: sua ação está confinada ao local de

aplicação, restrita à área de interesse; apresenta baixo risco de ocorrência de

resistência bacteriana, devido ao curto período de tempo necessário para causar

dano ou morte à célula bacteriana; é seletiva às células-alvo, diminuindo o risco

de lesar células do hospedeiro; e ainda não há relatos de ocorrência de reações

sistêmicas, mesmo após repetições de sua aplicação29.

No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é

relativamente recente e tem sido investigada no tratamento das infecções orais

mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças periodontais e infecções do canal

radicular 53;55.Os resultados obtidos em alguns trabalhos mostram seu efeito

antibacteriano, in vitro, frente a S. mutans 1; S. sobrinus59 e lactobacilos19. P.

19

gingivalis 28 e F. nucleatum 43, além de E. faecalis 48, patógenos frequentemente

envolvidos no desenvolvimento de infecções orais.

Diante disso, a terapia fotodinâmica poderia ser empregada como um

método coadjuvante ao tratamento conservador de lesões de cárie dentária,

devido à sua ação antibacteriana. Trata-se de um método não-invasivo, o que

contribuiria sobremaneira para a diminuição da quantidade de tecido dentinário a

ser removido, e conseqüentemente, preveniria o comprometimento do órgão

pulpar 55.

O aprimoramento do protocolo de aplicação da terapia fotodinâmica deve

visar além de segurança e efetividade, fatores como praticidade e custo, para

que sua adoção clínica seja viável. Logo, a utilização de aparelhos

fotopolimerizadores, como fontes de irradiação de luz, tem sido experimentada e

incentivada pelo fato destes equipamentos estarem usualmente presentes na

prática odontológica clínica e em nível de saúde pública 38;21;6.

Diante da grande variabilidade de metodologias descritas na literatura,

ainda se faz necessária a realização de estudos in vitro que busquem avaliar o

efeito TFD sobre bactérias orais, envolvidas com o desenvolvimento da cárie

dentária, quer em suspensões, quer organizadas em biofilme. Tais estudos irão

contribuir para a consolidação da terapia fotodinâmica como método coadjuvante

ao tratamento da cárie dentária, e conseqüentemente, para preservação de um

maior número de elementos dentários.

20

2. REVISÃO DE LITERATURA

Com o intuito de tornar a revisão de literatura mais elucidativa, essa foi

dividida, didaticamente, em três tópicos. O primeiro versará a respeito do

biofilme dentário e seu papel na rede de causalidade da cárie; o segundo

discorre sobre a cárie e a nova abordagem terapêutica em curso, menos

invasiva – Odontologia Minimamente Invasiva; e por fim, o terceiro, acerca da

terapia fotodinâmica e sua aplicação na Odontologia, como um método

coadjuvante no tratamento da cárie dentária, devido ao seu potencial

antibacteriano.

2.1 Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie

A cavidade oral dos seres humanos é colonizada por uma grande

diversidade de microrganismos: fungos, protozoários, vírus e em maior número,

por bactérias31. A manutenção desses microrganismos na cavidade é

dependente da capacidade de se manterem aderidos a estruturas orais, diante

do desafio imposto por fatores locais como a função salivar de limpeza; as ações

de mastigação e de deglutição, além da descamação das superfícies mucosas

14.

Nesse sentido, certas bactérias orais apresentam vantagens competitivas,

principalmente, devido à sua capacidade de aderir seletivamente às superfícies

dentárias, estruturas duras, que não sofrem descamação, favoráveis à formação

e maturação do biofilme dentário 48. O termo biofilme é usado para descrever

uma comunidade de microrganismos aderidos a uma superfície, encerrados em

uma matriz extracelular e organizados em estrutura tridimensional 33.

A formação do biofilme dentário se dá minutos após a limpeza das

superfícies dos dentes, quando se inicia a deposição de uma camada acelular

sobre o esmalte, denominada película adquirida 36. Componentes salivares e do

fluido gengival (proteínas, glicoproteínas e lípidios), além de remanescentes

celulares bacterianos são os principais constituintes da película,

desempenhando papel determinante na colonização dos microrganismos

pioneiros 8.

Os estreptococos são os colonizadores iniciais, principalmente o S. mitis,

S. sanguinis e S. oralis, os quais juntos, correspondem a cerca de 95% da

21

microbiota total inicial, a qual ainda se somam o Actinomyces spp., Haemophilus

spp. e Neisseria spp. 14.

A especificidade da colonização bacteriana nos estágios iniciais é

mediada por interações físico-químicas entre moléculas presentes na superfície

bacteriana e proteínas salivares adsorvidas no esmalte, as quais atuam como

receptores no mecanismo de adesão bacteriana 15. O crescimento das bactérias

pioneiras aderidas leva à formação de microcolônias distintas, que através de

relações interbacterianas como coagregação, interações nutricionais e liberação

de bacteriocinas, mediam a sucessão microbiana, contribuindo para o aumento

da diversidade de espécies, até que uma comunidade clímax seja atingida 33.

A formação, crescimento e maturação dos biofilmes dentários ocorrem de

forma natural, logo após as superfícies dentárias serem limpas. Devido a

relações metabólicas e competitivas, as bactérias constituintes do biofilme

dentário conferem proteção frente à colonização do ambiente oral por

microrganismos potencialmente patogênicos. A manutenção de níveis de saúde

está intimamente relacionada à capacidade do indivíduo de controlar o acúmulo

do biofilme sobre as superfícies dentárias 57.

O surgimento de doenças, dentre elas a cárie dentária, ocorre quando um

desequilíbrio é formado, predispondo à seleção de microrganismos patogênicos

específicos. A cárie dentária é uma doença socialmente determinada, que se

configura como o mais prevalente agravo à saúde bucal, acometendo indivíduos

em todas as faixas etárias 35;38. Trata-se de uma doença crônica, progressiva e

localizada, causada pela dissolução ácida dos tecidos duros do elemento

dentário 39.

Dentre os fatores que compõem a rede de causalidade da cárie, o biofilme

dentário pode ser apontado como o fator etiológico primário 32. A produção de

ácidos por microrganismos presentes no biofilme, a partir da degradação de

carboidratos fermentáveis oriundos da dieta, é essencial para o processo de

desmineralização da estrutura dentária 48. As frequentes quedas de pH levam à

seleção de espécies bacterianas acidúricas e acidogências, dentre elas S.

mutans e Lactobacillus casei, responsáveis, respectivamente, pela iniciação e

propagação das lesões cariosas 13.

Atualmente, novas abordagens terapêuticas vêm sendo propostas como

métodos auxiliares no tratamento de doenças biofilme-dependentes, como a

22

cárie dentária, convencionalmente pautado na remoção mecânica e no controle

químico do acúmulo de biofilme dentário.

2.2 Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva

A cárie dentária é uma doença infecciosa causada por bactérias orais

aderidas à superfície dos elementos dentários, que se não tratada, pode

culminar na perda dentária 60. É sem dúvida a afecção oral mais pesquisada,

tendo seu processo histopatológico bem fundamentado na literatura, sendo

considerada como a mais prevalente dentre as doenças que acometem o meio

ambiente oral 10. Embora dados apontem para a redução na prevalência de cárie

dentária ao redor do mundo, essa ainda pode ser tida como um sério problema

de saúde pública em populações menos favorecidas economicamente 35.

Devido à complexa rede de causalidade que envolve a doença, o que se

preconiza é que o controle da cárie dentária englobe desde ações de promoção

à saúde e de prevenção dos agravos, como ações de recuperação, reabilitação

e manutenção da saúde 3. O que nos parece ser bastante óbvio, na verdade,

contrasta com a prática odontológica adotada tradicionalmente, pautada quase

que exclusivamente no tratamento cirúrgico restaurador das lesões cariosas, e

não da doença em si.

Com o avanço das pesquisas que aprimoraram as técnicas restauradoras

adesivas e, principalmente, no aprofundamento do conhecimento da doença e

sua rede de causalidade, tendo como novo enfoque o processo saúde-doença

que acomete o indivíduo, procedimentos restauradores menos invasivos vêm

sendo adotados 5. Neste contexto, o conceito de Odontologia minimamente

invasiva ou de mínima intervenção, baseia-se nos novos conhecimentos acerca

do processo carioso, bem como no uso de materiais de proteção capazes de

estimular a recuperação dos tecidos dentários e/ou de materiais restauradores

adesivos, a fim de realizar uma abordagem preventiva e conservadora, na

medida em que busca a paralisação da lesão, pautada na preservação da

estrutura dentária sadia e do órgão pulpar 42;5.

A paralisação da lesão cariosa seria possível, a partir da remoção do

biofilme presente, dependendo da capacidade do complexo dentino-pulpar de

recuperar-se, ativando o processo de deposição de dentina reparadora e

23

esclerótica 27. De acordo com Fejerskov e Kidd 14, a lesão pode ser paralisada

pelo controle do biofilme presente. Logo, a remoção da dentina cariada, ao

diminuir o número de microrganismos presentes no tecido dentinário, auxiliaria

na interrupção da progressão da lesão.

Quanto à sua estrutura química e morfológica, a lesão de cárie pode ser

dividida em duas camadas distintas. A camada superficial, denominada camada

infectada, é bastante desmineralizada, amolecida e com grande quantidade de

bactérias. Localizada abaixo dessa, a camada afetada, apresenta-se mais

endurecida, apenas parcialmente desmineralizada, com menor carga bacteriana.

É constituída de fibras colágenas e ainda passível de sofrer o processo de

remineralização 47. Daí, em situações clínicas que houvesse risco de exposição

do tecido pulpar, a remoção apenas da camada superficial, infectada, com

preservação da dentina afetada, proporcionaria uma maior proteção do órgão

pulpar 16;22.

Desde o início dos anos 90, muitos estudos vêm sendo realizados com o

objetivo de propor técnicas capazes de eliminar ou reduzir ao máximo a carga

microbiana na porção de dentina afetada remanescente, em lesões profundas de

cárie, onde a remoção total do tecido cariado poderia levar á exposição pulpar

52.

Nesse contexto, a realização de um maior número de estudos envolvendo

a aplicação da terapia fotodinâmica ainda é necessária, a fim de consolidar sua

abordagem preventiva na formação de biofilmes orais cariogênicos, bem como

sua ação terapêutica na paralisação de lesões de cárie ativas, quer em estágios

iniciais, como na lesão branca de esmalte, quer em estágios avançados, nos

quais a remoção total do tecido cariado pode levar ao comprometimento do

órgão pulpar.

2.3. Terapia fotodinâmica

A terapia fotodinâmica, também denominada fotoquimioterapia ou

fototerapia, representa uma promissora alternativa para o tratamento de algumas

doenças.

Os primeiros trabalhos publicados envolvendo o estudo da terapia

fotodinâmica datam do início do século XX, quando Oscar Raab e Von

24

Tappeiner, através de seus experimentos, perceberam o efeito letal da

associação do corante vermelho acridina e a luz solar sobre o protozoário

causador da malária 41. Desde então, a TFD tem sido proposta como um método

alternativo para algumas áreas da Medicina, como no diagnóstico e tratamento

de determinados tipos de câncer 11 e de infecções virais, bacterianas e fúngicas,

devido à sua ação antimicrobiana 26;4.

No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é

relativamente recente e tem sido investigada como uma alternativa para o

tratamento das infecções orais mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças

periodontais e infecções do canal radicular 53;55.

De maneira geral, o mecanismo de ação da TFD é o mesmo,

independentemente do tipo de células-alvo, quer sejam células tumorais, quer

sejam microrganismos patogênicos. É decorrente da ação simultânea de um

agente sensibilizante, também chamado de corante fotossensível, e de uma

fonte de luz, na presença do oxigênio dos tecidos 21.

Após irradiação, a molécula da FS absorve fótons de energia, passando a

um primeiro estágio excitado singleto, altamente instável, podendo retornar ao

estado fundamental, pela liberação de energia na forma de luz visível

(fluorescência), ou por conversão interna de mesma multiplicidade, sendo

convertida ao estado excitado tripleto, através de cruzamento intersistema. O

estado tripleto, apesar de ser menos energético do que o estado singleto, possui

tempo de vida longo, o bastante para permitir a interação da substância

fotossensível com as moléculas vizinhas 23.

A ação da terapia fotodinâmica, sobre as células-alvo, pode ocorrer a

partir de dois mecanismos distintos, denominados: reação de Tipo I ou reação

de Tipo II 24. Na primeira, o corante interage com o substrato, desencadeando a

produção de radicais livres, os quais, posteriormente, irão reagir com o oxigênio

molecular, produzindo espécies altamente reativas (Figura 1). Na segunda, o

agente fotossensibilizante interage diretamente com a molécula de oxigênio,

dando origem ao oxigênio singleto (Figura 2) 9.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas - superóxido,

hidroxila, peróxido e oxigênio singleto – são altamente instáveis e reativas,

sendo responsáveis por causar danos às células-alvo, seja devido ao efeito

lesivo sobre estruturas essenciais, como membrana plasmática e DNA, ou por

25

provocar alterações irreversíveis em atividades metabólicas, levando à morte

celular 7.

FIGURA 1 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I.

Fonte: Elaboração própria.

FIGURA 2 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II.


26

Para que a reação fotoquímica ocorra, é necessário que o agente

fotossensibilizante seja capaz de absorver a energia irradiada pela fonte de

luminosa 57. Embora alguns componentes bacterianos apresentem tal

capacidade, a grande maioria das bactérias orais não possui esses

componentes, sendo indispensável o uso de fotossensibilizadores exógenos,

para o sucesso da TFD 30.

2.3.1 Substâncias fotossensíveis

Uma substância fotossensibilizante deve ser inócua aos tecidos; seus

componentes em estado excitado devem apresentar tempo de vida suficiente

para interagir com células vizinhas e com oxigênio molecular eficientemente; e

ainda, deve apresentar alta absortividade, com picos de absorção próximos ao

comprimento de onda da luz utilizada 26;21. Características inerentes a uma

substância fotossensibilizante podem ser vistas no Quadro 1.

QUADRO 1 - Resumo das propriedades requeridas para uma substância fotossensibilizante ideal

PROPRIEDADES DE UM FOTOSSENSIBILIZANTE IDEAL

Ser quimicamente puro e ter composição constante e conhecida

Ter mínima toxicidade no escuro

Seletividade às células-alvo

Ser rapidamente eliminado do organismo

Ser solúvel em água

Facilidade de obtenção em escala industrial

Características fotofísicas favoráveis

Fonte: Bonnett 2.

27

O termo “características fotofísicas favoráveis” refere-se basicamente a

duas características ideais para os agentes fotossensibilizantes, sendo a

primeira, a capacidade de absorver luz na região de 600-800 nm, faixa espectral

conhecida como janela terapêutica, na qual devido aos maiores comprimentos

de onda, há uma maior penetração do FS nos tecidos e, consequentemente, um

maior efeito terapêutico12. Comprimentos de onda abaixo dessa faixa sofrem

maior espalhamento e podem ser absorvidas por cromóferos endógenos,

diminuindo a penetração de luz, ao passo que comprimentos acima de 800 nm,

além de serem absorvidas pela água, não possuem energia suficiente para

produção de oxigênio singleto 49.

A segunda característica fotofísica favorável seria uma alta reatividade

foquímica, para que um alto rendimento do estado excitado tripleto seja

alcançado, o qual deve possuir um tempo de vida longo para produzir outras

espécies reativas de oxigênio, como o estado singleto 2.

Em muitos estudos, uma grande variedade de agentes

fotossensibilizantes tem sido empregada diante de microrganismos orais. O

corante rosa-bengala 38; os derivados de fitalacionina, como fitalacionina

dissulfonado alumínio (AlPcS2) e fitalacionina catiônica com Zn (II) 54; porfirinas

23; verde de malaquita 40; além do azul de metileno e azul de orto-toluidina 61.

Estes dois últimos são as substâncias fotossensíveis mais testadas,

representantes do grupo dos corantes fenotiazínicos.

2.3.2 Corantes fenotiazínicos

Os corantes fenotiazínicos são compostos catiônicos com estrutura

fundamental composta por um anel aromático tricíclico planar, constituindo um

sistema altamente conjugado, o qual funciona como o componente cromóforo

destes corantes 44. Os compostos fenotiazínicos possuem propriedades

adequadas para utilização na terapia fotodinâmica devido à sua intensa

absorção de luz na região de 620-660 nm, região espectral inserida na faixa que

compreende a janela 18.

Os corantes azul de metileno e azul de toluidina são representantes dos

compostos fenotiazínicos e vêm sendo largamente empregados nas pesquisas

envolvendo a TFD 37. Trata-se de compostos similares no tocante às suas

28

estruturas químicas (Figuras 3 e 4) e propriedades físico-químicas 44. O pico de

absorção de energia para cada um desses compostos pode ser observado no

Quadro 2.

FIGURA 3 - Fórmula molecular do corante azul de metileno

Fonte: Soukos

44. FIGURA 4 - Fórmula molecular do corante azul de toluidina

Fonte: Soukos 44.

QUADRO 2 - Compostos fenotiazínicos mais utilizados, com seus respectivos picos de absorção

de luz em nm.

COMPOSTOS FENOTIZÍNICOS PICO DE ABSORÇÃO DE LUZ (nm)

Azul de metileno 660

Azul de toluidina 625

Fonte: Gonçalves 21.

29

Grande parte da capacidade de uma substância atuar como agente

sensibilizante é dependente de sua capacidade de absorver a luz no

comprimento de onda complementar àquele emitido pela fonte de luz 56.

2.3.3 Fontes de luz

Embora os lasers de baixa potência sejam, convencionalmente, utilizados

como fonte de irradiação na TFD, o uso dos diodos emissores de luz (LED) tem

se intensificado 19. Em parte, devido a certas propriedades dos LED que

resultam em bandas de emissão mais largas, favorecendo a complementaridade

com a substância fotossensível, e conseqüentemente, a absorção de energia

luminosa por parte dessa 30;62.

A maioria dos trabalhos ainda apresenta a associação da terapia

fotodinâmica com lasers ou LED, entretanto, outras fontes luminosas têm sido

testadas, como as lâmpadas de tungstênio 57 ou halogênio 38, o que reduz o

custo da terapia, já que os equipamentos, tradicionalmente utilizados,

apresentam alto valor de mercado.

A terapia fotodinâmica, decorrente da associação entre o corante rosa-

bengala e luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador,

apresentou atividade antimicrobiana, in vitro, frente a suspensões de S. mutans

38. Resultados semelhantes foram apresentados por Gonçalves 21, que observou

uma redução percentual na viabilidade bacteriana de 99,5% , quando da

associação do corante azul de metileno e luz halógena proveniente de um

aparelho fotopolimerizador, frente a suspensões de S. mutans, in vitro.

Além dos bons resultados obtidos, mediante o uso do aparelho

fotopolimerizador, como fonte luminosa, sua utilização reduz os custos da

terapia, na medida em que tal equipamento já se faz presente no conjunto de

tecnologias duras da prática odontológica 38;21. Nesse sentido, a aquisição de um

novo aparelho para realização da TFD não seria necessária, o que tornaria a

técnica mais acessível, principalmente, em nível de setor público.

De maneira geral, o efeito antimicrobiano da TFD sobre microrganismos

orais envolvidos no processo carioso tem sido descrito na literatura, seja sobre

culturas planctônicas 38;51;45, seja sobre bactérias organizadas em biofilmes

58;37;17;57;34.

30

2.3.4 Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia

Pesquisas vêm sendo realizadas, visando à aplicação da Terapia

Fotodinâmica em diferentes áreas da Odontologia como: Periodontia,

Endodontia, Implantondontia e Cariologia 28;40;44;19. A consolidação da TFD na

Odontologia, como método auxiliar no tratamento da cárie dentária, poderia

contribuir na paralisação de inúmeras lesões, em razão de sua ação

antimicrobiana sobre bactérias envolvidas no processo carioso, como o S.

mutans 61. A interrupção da atividade de cárie, principalmente, no que diz

respeito à progressão de lesões profundas, contribuiria para adoção de

procedimentos menos invasivos, com consequente conservação de tecido

dentário, adiando, ou mesmo, evitando a realização de métodos mais invasivos

e onerosos, como o tratamento endodôntico e, mais importante, evitaria a perda

dentária, nos casos em que a única medida terapêutica possível seria a

exodontia, meramente, devido a limitações financeiras.

31

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

A presente pesquisa tem como objetivo avaliar o efeito in vitro da terapia

fotodinâmica, com ativação por luz halógena, sobre bactérias orais em culturas

planctônicas e na formação, de biofilmes mono e multiespécies, a partir de uma

cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva,

respectivamente.

3.2 Objetivos Específicos

Avaliar a ação, in vitro, dos corantes azul de metileno e azul de orto-

toluidina, na concentração de 100mg/L, sobre microrganismos orais em

culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies.

Avaliar a ação, in vitro, da luz halógena, proveniente de um aparelho

fotopolimerizador com espectros de emissão entre 600 e 750 nm, como

fonte luminosa, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na

formação de biofilmes mono e multiespécies.

Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas

planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da

fotoativação do corante azul de metileno por luz halógena com espectro

de emissão entre 600 e 750nm.

Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas

planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da

fotoativação do corante azul de toluidina por luz halógena com espectro

de emissão entre 600 e 750nm.

32

4. MATERIAIS E MÉTODOS

A avaliação da eficácia antimicrobiana da TFD foi realizada a partir de

ensaios in vitro, nos quais foram utilizados os agentes fotossensibilizantes azul

de metileno e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L. O aparelho

fotopolimerizador Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, Brasil) foi usado na

reação de fotoativação.

4.1 Tipo do estudo

Trata-se de um estudo experimental, in vitro, realizado no Laboratório de

Microbiologia do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, referente à Linha de Pesquisa Prevenção dos agravos à saúde

bucal em sua expressão individual e coletiva, Área de concentração em Saúde

Coletiva, Grupo de Estudos em Saúde Bucal, do Programa de Pós-Graduação

em Odontologia/UFRN.

4.2 Ensaios in vitro

A fase experimental foi dividida em duas etapas. A primeira foi realizada a

fim de avaliar o efeito da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em culturas

planctônicas, obtidas a partir de uma linhagem bacteriana de referência e de

amostras de saliva. A segunda etapa teve como objetivo avaliar o efeito

preventivo da terapia fotodinâmica, frente à formação de biofilmes mono e

multiespécies, in vitro.

Os ensaios foram realizados com a utilização de microplacas estéreis de

poliestireno inerte de fundo chato, contendo 96 poços (Nunclon®; InterMed,

Roskilde, Dinamarca), adaptado de Stepanovic 46.

4.2.1 Linhagem bacteriana padrão

Na presente pesquisa foi utilizada uma amostra de referência para

Streptococcus mutans (ATCC 25175), obtida mediante solicitação à Fundação

Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ), a partir da qual culturas de células

planctônicas e biofilmes monoespécies foram preparados.

33

4.2.2. Preparo das suspensões de S. mutans

A partir do estoque, uma alíquota da cepa padrão foi semeada por

esgotamento em placa de Petri contendo ágar Brain Heart Infusion (BHI),

(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) e incubada por 24 horas a 37º C, em

microaerofilia. Passado o tempo de incubação, três colônias foram retiradas da

placa e então repicadas para um tubo de ensaio contendo 2 mL de caldo BHI,

suplementado com sacarose 10%. Após homogeneização, o tubo contendo o

inóculo foi armazenado em estufa a 37 ºC, por 24 horas em microaerofilia

(Figura 5).

FIGURA 5 - Esquema ilustrativo da obtenção da cultura planctônica a partir de uma cepa padrão de S. mutans.


4.2.3 Obtenção de amostras de saliva estimulada

Nesta etapa experimental, três pesquisadores envolvidos no estudo

tiveram sua saliva coletada. A estimulação foi feita através da mastigação de um

tablete de parafina (Parafilm “M” – Laboratory Film – American National Can –

Chicago, IL.) por um minuto. Passado esse tempo, o pesquisador deglutiu toda a

saliva e, em seguida, passou a expelir a saliva produzida em um Becker estéril,

34

durante 5 min. As amostras de saliva coletadas foram armazenadas no gelo

durante o experimento (Figura 6).

FIGURA 6 - Esquema ilustrativo da obtenção da culturas planctônicas mistas, a partir de amostras de saliva.

Fonte: Elaboração própria

4.2.4 Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa

As soluções contendo azul de metileno e azul de orto-toluidina foram

obtidas a partir de diluições dos corantes em água destilada e mantidas no

escuro até sua utilização. A concentração de 100mg/L foi testada para ambas

substâncias fotossensibilizantes 1; 62.

Com o propósito de tornar a técnica acessível clinicamente, em caso de

sucesso in vitro, foi utilizada nesta metodologia a fotoativação por luz halógena,

o aparelho fotopolimerizador de luz halógena Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão

Preto, São Paulo, Brasil), com potência entre 350 e 500 mW/cm² e filtro de luz

capaz de produzir luz de comprimento de onda na faixa entre 400 e 500 nm.

Para realização dos experimentos, o filtro de onda foi removido (Figuras 6 e 7), a

fim de obter-se luz visível com comprimento de onda na faixa de 600 e 750nm,

compatível com os corantes utilizados, mantendo-se, entretanto, o filtro para

radiações infravermelho 21.

35

Figura 7 – Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado.

Fonte: Elaboração própria Figura 8 – Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda.


4.2.5 Preparação das placas

Para cada suspensão bacteriana obtida foram preparados 05 grupos de

comparação e 02 grupos experimentais relativos à terapia fotodinâmica

propriamente dita:

Controle positivo: 90 µl de solução de digluconato de clorexidina

a 0,12% foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl

de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura

em teste (S. mutans ou amostra de saliva, previamente

preparadas).

Controle negativo: suspensão contendo 990 µl de caldo BHI

sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.

36

Controle (CT + FA- ): 90 µl de solução do corante azul de toluidina

(100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl

de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.

Controle (CM + FA-): 90 µl de solução do corante azul de metileno

(100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl

de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.

Controle (FS - FA + ) : uma suspensão, contendo 990 µl de caldo

BHI sacarosado a 10% e 10 µl do inóculo.

Terapia fotodinâmica (CT + FA +): 90 µl de solução do corante

azul de toluidina (100mg/L) foram adicionados a um tubo de

ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e

inoculado com 10 µl da cultura.

Terapia fotodinâmica (CM + FA +): 90 µl de solução do corante

azul de metileno (100mg/L) foram adicionados a um tubo de

ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e

inoculado com 10 µl da cultura.

Cada uma das sete condições experimentais preparadas, a partir de

suspensões de células mono (S. mutans) e multiespécies (amostras de saliva),

foram dispensadas em tubos de ensaio estéreis, perfazendo um volume total de

01 mL para cada tubo.

Os tubos de ensaio foram agitados, para homogeneização das

suspensões. Em seguida, 200 µL foram retirados de cada tubo e repicados para

os poços da placa de microtitulação, em triplicata.

A Figura 9 apresenta de maneira esquemática a preparação dos grupos

experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies.

37

FIGURA 9 - Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies.


4.2.6 Terapia fotodinâmica

Após preparação das placas, os poços destinados à terapia fotodinâmica

foram irradiados. Como protocolo para aplicação da TFD, os corantes foram

mantidos em contato com as suspensões microbianas durante 5 minutos,

correspondendo ao tempo de pré-irradiação. Em seguida, realizou-se a

fotoativação de cada poço por 60 segundos. Durante a irradiação, a ponteira do

aparelho fotopolimerizador foi mantida em contato com a embocadura do poço,

para evitar variação nessa distância. Um anteparo negro fosco foi utilizado para

evitar o espalhamento de luz. Anteriormente à irradiação de cada placa, a

intensidade de luz visível emitida pelo aparelho fotopolimerizador foi aferida,

através de um radiômetro (Radiômetro RD-7, ECEL, Ribeirão Preto, SP, Brasil).

O mesmo protocolo de fotoativação foi seguido para os grupos controle

Fa + FS -, no quais o efeito da luz halógena foi verificado na ausência de

qualquer corante.

38

4.2.7 Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica

Imediatamente após o experimento, uma alíquota de 10 µL de suspensão

bacteriana foi retirada de cada poço e diluída em 5mL de solução salina estéril,

homogeneizada e semeada em placas contendo ágar BHI, suplementado com

sacarose a 10%, para posterior avaliação do efeito imediato da terapia

fotodinâmica sobre as suspensões mistas e de S. mutans, a partir da contagem

do número de unidades formadoras de colônia por mL. As placas de Petri e de

microtitulação foram então incubadas a 37 ºC, em microaerofilia, durante

overnight (Figura 10).

Após o período de incubação, o número de unidades formadoras de

colônia foi obtido, e a conversão para a unidade UFC/mL, foi realizada a partir da

multiplicação do valor obtido pelo fator de diluição em questão (2 X 10-3).

Figura 10 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito imediato da TFD.


4.2.8 Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica

Após o tempo de incubação, foi realizada a leitura das placas de

microtitulação através de um aparelho espectofotômetro (μQuant®, BioTek,

Londres, Inglaterra), ajustado em 570 nm, para obtenção da medida de

densidade ótica de cada poço. A DO foi uma das medidas utilizadas nesta

pesquisa para aferição do crescimento bacteriano. Obtida a DO inicial,

novamente uma alíquota de 10 µL foi retirada, repetindo-se os mesmos

39

procedimentos descritos anteriormente, desta vez, para avaliação do efeito

mediato da terapia fotodinâmica, a partir da contagem de UFC/mL (Figura 11).

Figura 11 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD.


4.2.9 Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e

multiespécie

O sobrenadante foi aspirado de cada poço e em seguida descartado.

Foram realizadas três lavagens com solução salina estéril, a fim de remover as

células não aderidas. Em sequência, com o auxílio de alças estéreis

descartáveis, o biofilme aderido foi desalojado das paredes dos poços e

ressuspendido com a adição de 200 µL de solução salina estéril, adaptado de

Stepanovic 46.

Para avaliação da viabilidade dos microrganismos ora aderidos, uma

terceira alíquota de 10 µL de suspensão foi retirada de cada poço e diluída em

5ml de solução salina estéril, homogeneizada e semeada em triplicata em placas

contendo ágar BHI, suplementado com sacarose a 10%. As placas de Petri

foram então incubadas a 37 ºC, em microaerofilia, durante 48 horas.

40

Ao fim do experimento, as placas de microtitulação foram submentidas a

uma segunda leitura através do espectofotômetro, para obtenção da DO final,

correspondendo à medida de densidade ótica dos biofilmes multiespécies

formados a partir das amostras de saliva e dos biofilmes monoespécie, a partir

das suspensões de S. mutans (Figura 12).

Figura 12 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécies.


4.3 Análise Estatística

Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente através dos

testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, já que os dados não apresentaram

uma distribuição normal. O nível de confiança utilizado para os testes foi de

95%.

Os dados foram analisados mediante o emprego do programa SPSS

(Statistical Package for Social Sciences), versão 17.0.

41

5. RESULTADOS

Os resultados ora apresentados se referem aos ensaios realizados com

as amostras de saliva e de S. mutans.

5.1 Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização

do corante azul de toluidina

5.1.1 Suspensões multiespécies

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre

as suspensões obtidas a partir das amostras de saliva, com a utilização do

corante azul de toluidina, imediatamente após o experimento, uma diferença

estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre

os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 1.

TABELA 1 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CT a 9 10.000 5.000 – 13.000

< 0,001

Controle negativo a 9 30.000 21.000 – 101.000

Controle positivo b 9 0 0

FA+ FS- a 9 76.000 16.000 – 113.000

FA- CT+ a 9 59.000 33.000 – 68.500

Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.

A partir da análise da Tabela 1, podemos observar que há uma redução

nos valores de mediana obtidos para o grupo em que se aplicou a TFD e a

solução de clorexidina 0,12%, representando uma redução percentual de 66,7%

e 100%, respectivamente, ambos em relação ao controle negativo. Não foi

observada redução nos valores de mediana para os grupos nos quais se avaliou

a ação isolada da luz halógena e do corante azul de toluidina. Ao contrário, a

42

ação destes aumentou aos valores de mediana. No entanto, a diferença

significativa, foi mantida apenas para a comparação 2 a 2, realizada entre o

controle positivo e demais grupos, com o valor de p permanecendo sempre

menor do que 0,05.

5.1.2 Suspensões de S. mutans


as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de toluidina,

imediatamente após o experimento, uma diferença estatisticamente significativa

foi observada para a comparação realizada entre os grupos experimentais,

conforme pode ser observado na Tabela 2.

TABELA 2 - Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25 p

TFD CT a 3 2.000 0

0,02

Controle negativo a 3 2.000 2.000

Controle positivo a 3 0 0

FA+ FS- a 3 2.000 2.000

FA- CT+ a 3 8.000 4.000


A partir da análise da Tabela 2, podemos observar que não houve

qualquer alteração no valor de mediana obtido para os grupos em que se aplicou

a TFD, em relação controle negativo. No entanto, naquele em que a solução de

clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma redução percentual de 100%,

também em relação ao controle negativo. Não foi observada redução nos

valores de mediana para os grupos nos quais se avaliou a ação isolada da luz

halógena e do corante azul de toluidina. Ao contrário, a ação deste último

aumentou o valor de mediana. No entanto, a diferença significativa previamente

encontrada, não se manteve após comparação grupo a grupo.

43

5.2 Avaliação do efeito imediato da terapia Fotodinâmica com utilização

do corante azul de metileno

5.2.1 Suspensões multiespécies


as suspensões obtidas a partir das amostras de saliva, com a utilização do

corante azul de metileno, imediatamente após o experimento, uma diferença

estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre

os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 3.

TABELA 3 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.


TFD CM a, b 9 4.000 1.000 – 14.000

< 0,001

Controle negativo a 9 30.000 21.000 – 101.000

Controle positivo b 9 0 0

FA+ FS- a 9 76.000 16.000 – 113.000

FA- CM+ a 9 42.000 16.000 – 48.000


A partir da análise da Tabela 3, podemos observar que houve uma

redução nos valores de mediana obtidos para os grupos em que se aplicou a

TFD e a solução de clorexidina 0,12%, representando uma redução percentual

de 86,6% e 100%, respectivamente, ambos em relação ao controle negativo.

Não foi observada redução nos valores de mediana para os grupos nos quais se

avaliou a ação isolada da luz halógena e do corante azul de metileno. Ao

contrário, a ação destes, aumentou aos valores de mediana. No entanto, a

diferença significativa foi mantida apenas para a comparação 2 a 2, realizada

entre o controle positivo e os seguintes grupos: controle negativo (p = 0,01), FA

+ FS – (p = 0,02) e FA + CM – (p = 0,01). Não foi encontrada nenhuma

44

diferença significativa entre o controle positivo e o grupo no qual se aplicou a

terapia fotodinâmica (p = 0,17), nem entre este último e o controle negativo,

mesmo diante da acentuada redução provocada no valor de mediana (86, 6%).

5.2.2 Suspensões de S. mutans


as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de metileno,

imediatamente após o experimento, não foi observada qualquer diferença

estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos

experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 4.

TABELA 4 - Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans. Natal, 2011.


TFD CM 3 4.000 2.000

0,07

Controle negativo 3 2.000 2.000

Controle positivo 3 0 0

FA+ FS- 3 2.000 2.000

FA- CM+ 3 2.000 2.000


5.3 Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com

utilização do corante azul de toluidina

5.3.1 Análise a partir da contagem do número de UFC/mL

Após o período de incubação, o número de UFC/mL de algumas placas

não foi possível de ser obtido devido ao grande crescimento bacteriano

observado, inviabilizando a contagem, tanto para as supensões de S. mutans,

quanto para aquelas obtidas a partir da saliva (Figura 13). Mesmo naquelas

45

onde se foi possíver fazer a contagem, o número de UFC/mL foi bastante

elevado. Esta situação foi semelhante para todos os grupos experimentais, com

exceção para aqueles em que se utilizou a solução de digluconato de clorexidina

a 0,12%, para os quais não foi verificado crescimento bacteriano, sendo o

número de UFC/mL igual a zero (Figura 14).

Figura 13 – Fotografia demonstrando grande crescimento bacteriano.

Fonte: Acervo do pesquisador

Figura 14 – Fotografia demonstrando ausência de crescimento bacteriano.

Fonte: Acervo do pesquisador

46

5.3.2 Análise a partir da densidade ótica

5.3.2.1 Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio

de cultura puro

Inicialmente, foi vista a necessidade de avaliar se a presença dos

corantes azul de metileno e azul de toluidina e da solução de clorexidina alteraria

a densidade ótica do meio de cultura puro. Tal alteração poderia causar erros

quando da interpretação dos resultados, já que a DO final poderia estar

aumentada, mas não devido ao crescimento bacteriano, e sim, pelo aumento na

densidade ótica causada pelas substâncias adicionas ao meio de cultura. Os

resultados dessa avaliação encontram-se na Tabela 5.

TABELA 5 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, 2011.

Condição n MED Q 25-75 p

Meio Puro 3 0,074 0,072-0,074

0,021

Meio + Clorexidina 3 0,075 0,073-0,086

Meio + Azul de Toluidina 3 0,339 0,327– 0,341

Meio + Azul de Metileno 3 0,189 0,187– 0,196


Conforme observado na Tabela 5, os valores das medianas das DO foram

mais altos, quando o meio de cultura foi adicionado de CT ou CM. A adição

destas substâncias ao meio provocou um aumento no valor de densidade ótica,

quando comparado ao meio puro, e este aumento foi estatisticamente

significativo. Daí, para os cálculos subseqüentes, foi realizado um ajuste no

valor da DO obtido para cada poço, a fim de se compensar o efeito da presença

dos corantes sobre o valor da densidade ótica do meio puro.

47

5.3.2.2 Suspensões multiespécies

Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as

suspensões mistas, com a utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir

da densidade ótica, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente

significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais,


TABELA 6 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011.


TFD CT a 9 0,143 0,049 – 0,364

< 0,001

Controle negativo b 9 1,039 0,931 – 1,094

Controle positivo a 9 0,084 0,079 – 0,093

FA+ FS- b 9 0,897 0,833 – 0,994

FA- CT+ a 9 0,154 0,095 – 0,448


De acordo com a Tabela 6, os menores valores de densidade ótica

exibidos foram referentes aos grupos TFD CT, FA – CT + e o controle positivo.

Tal redução foi estatisticamente significativa quando da comparação entre o

controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p < 0,001), bem como

entre os controles positivo e negativo (p < 0,001) e entre o grupo FA – CT + e o

controle negativo, evidenciando a atividade antibacteriana do corante azul de

toluidina, mesmo na ausência de fotoativação (p = 0,05).

48

5.3.2.3 Suspensões de S. mutans


as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de toluidina,

aferida a partir da densidade ótica, após overnight, foi verificada ocorrência de

diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os

grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 7.

TABELA 7 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.


TFD CT a 3 0,613 0,561

0,013

Controle negativo a 3 0,655 0,589

Controle positivo a 3 0,067 0,063

FA+ FS- a 3 0,716 0,673

FA- CT+ a 3 0,343 0,305


A partir da análise da Tabela 7, é possível observar que houve apenas

uma pequena redução no valor da mediana obtido para o grupo em que se

aplicou a TFD, em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a

solução de clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma acentuada redução,

apresentando valor próximo ao zero, também em relação ao controle negativo.

Uma redução também foi observada no valor de mediana obtido para o grupo

FA- CT+, referente à ação do corante azul de toluidina. No entanto, a diferença

significativa previamente encontrada, não se manteve após comparação grupo a

grupo (p > 0,05).

49

5.4 Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica, com

utilização do corante azul de metileno



Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as

suspensões mistas, com a utilização do corante azul de metileno, aferida a partir

da densidade ótica, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente

significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais,


TABELA 8 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de metileno. Natal, 2011.


TFD CM a 9 0,421 0,304 – 0,503

< 0,001


Controle positivo c 9 0,084 0,079 – 0,093

FA+ FS- b 9 0,897 0,833 – 0,994

FA- CM+ a, b 9 0,307 0,254 – 0,947



exibidos foram referentes aos grupos TFD CM, FA – CM + e o controle positivo.


controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p < 0,001), bem como

entre os controles positivo e negativo (p < 0,001). O corante azul de metileno

(FA – CM+), apesar de apresentar redução nos valores de densidade ótica,

quando comparado ao controle negativo, tal diferença não se mostrou

significativa (p > 0,05).

50



as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de metileno,

aferida a partir da densidade ótica, após overnight, foi verificada ocorrência de

diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os

grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 9.

TABELA 9 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.


TFD CMa 3 0,630 0,464

0,013



FA+ FS- a 3 0,716 0,673

FA- CM+ a 3 0,270 0,259



uma pequena redução no valor da mediana obtido para os grupos em que se

aplicou a TFD em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a




FA- CM+, referente à ação do corante azul de metileno. No entanto, a diferença


grupo (p > 0,05).

51

5.5 Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de

biofilme com utilização do corante azul de toluidina

5.5.1 Análise a partir da contagem do número de UFC/mL

Após o período de incubação, o número de UFC/mL de algumas placas

não foi possível de ser obtido devido ao grande crescimento bacteriano

observado, inviabilizando a contagem, tanto para as supensões de S. mutans,

quanto para aquelas obtidas a partir da saliva, quer para TFD aplicada com o

corante azul de toluidina, quer com o azul de metileno. Mesmo naquelas onde se

foi possível fazer a contagem, o número de UFC/mL foi bastante elevado. Esta

situação foi semelhante para todos os grupos experimentais, com exceção para

aqueles em que se utilizou a solução de digluconato de clorexidina a 0,12%,

para os quais não foi verificado crescimento bacteriano, sendo o número de

UFC/mL igual a zero.



Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre a

formação de biofilmes multiespécies, a partir de suspensões mistas, com a

utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir da densidade ótica, foi

verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a

comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser

observado na Tabela 10.

52

TABELA 10 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies, e significância estatística, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011.


TFD CT a 9 0,131 0,081 – 0,246

< 0,001


Controle positivo a 9 0,052 0,049 – 0,055

FA+ FS- b 9 0,528 0,387 – 0,630

FA- CT+ a 9 0,047 0,045 – 0,074



exibidos foram referentes aos grupos TFD CT, controle positivo e o FA – CT +.


controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p = 0,01), bem como entre

os controles positivo e negativo (p < 0,001) e entre o grupo FA – CT + e o

controle negativo, evidenciando a atividade antibacteriana do corante azul de

toluidina, prevenindo assim a formação de biofilme, mesmo na ausência de

fotoativação (p = 0,01).



formação de biofilmes monoespécies, a partir de suspensões de S. mutans, com

a utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir da densidade ótica, após

overnight, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa

para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser


53

TABELA 11 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies, e significância estatística, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.


TFD CT a 3 0,229 0,228

0,016



FA+ FS- a 3 0,621 0,261

FA- CT+ a 3 0,173 0,157








FA- CT+, referente à ação do corante azul de toluidina. No entanto, a diferença


grupo (p > 0,05).

5.6 Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de

biofilme, com utilização do corante azul de metileno



Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre a

formação de biofilmes multiespécies, a partir de suspensões mistas, com a

utilização do corante azul de metileno, aferida a partir da densidade ótica, foi

54

verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a

comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser


TABELA 12 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies e significância estatística, com o corante azul de metileno. Natal, 2011.


TFD CM a 9 0,532 0,366 – 0,576

< 0,001

Controle negativo a 9 0,558 0,494 – 781

Controle positivo b 9 0,052 0,049 – 0,055

FA+ FS- a 9 0,528 0,387 – 0,630

FA- CM+ a 9 0,338 0,142 – 0,457



exibidos foram referentes ao controle positivo e ao grupo FA – CM +, embora tal

redução só tenha sido estatisticamente significativa quando da comparação

entre o controle positivo e o negativo (p < 0,001). Com relação à pequena

redução nos valores de DO, causada pela ação da TFD, essa não foi

significativa, quando comparada ao controle negativo (p > 0,05).


A ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre formação de

biofilmes monoespécies, a partir de suspensões de S. mutans, com a utilização

do corante azul de metileno, foi aferida a partir da densidade ótica. A presença

de diferença estatisticamente significativa foi encontrada para a comparação

entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 13.

55

TABELA 13 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies e significância estatística, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.


TFD CMa 3 0,185 0,133

0,016



FA+ FS- a 3 0,621 0,261

FA- CM+ a 3 0,208 0,159








FA- CM+, referente à ação do corante azul de metileno. No entanto, a diferença

significativa previamente encontrada não se manteve após comparação grupo a

grupo (p > 0,05).

56

6. DISCUSSÃO

Até o início dos anos 90, a aplicação da terapia fotodinâmica como

modalidade terapêutica para doenças causadas por microrganismos sofreu

poucos avanços, muito embora sua descoberta tenha se dado, exatamente,

devido à sua ação antimicrobiana 41. Tal intervalo pode, em parte, ser justificado

em razão do desenvolvimento dos antibióticos na mesma época 22. Tais

medicamentos representavam uma promissora alternativa para o tratamento de

doenças de origem microbiana e sua eficácia tem sido, de fato, comprovada ao

longo dos últimos 50 anos 23. Entretanto, o rápido crescimento do número de

patógenos antibiótico-resistentes tem contribuído, sobremaneira, para o aumento

no desenvolvimento de pesquisas que objetivam o aprimoramento de terapias

antimicrobianas alternativas 49.

Neste sentido, desde os anos 90 tem sido observada a retomada pelo

interesse acerca do efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica frente a um

variado número de microrganismos 7. O mecanismo de ação da TFD é

decorrente da ativação de uma substância fotossensibilizante por uma fonte de

luz visível, com comprimento de onda específico, na presença de oxigênio,

podendo gerar produtos de reação como o oxigênio singleto e superóxidos 55.

Essas espécies de oxigênio são altamente reativas e têm capacidade de causar

danos irreversíveis a componentes celulares, levando à morte da célula

bacteriana 50.

O efeito da TFD frente a bactérias orais em suspensão tem sido descrito

na literatura, a partir de seus resultados promissores 53-45-51-1. O mesmo tem sido

observado em relação aos biofilmes mono e multiespécies 58;60;37;19.

Recentemente, um estudo realizado in situ também demonstrou a ação

microbiana frente a bactérias envolvidas no processo cariogênico 29.

Entretanto, a maioria desses trabalhos discorre sobre o efeito da terapia

fotodinâmica, decorrente da ativação de fotossensibilizantes específicos, a partir

da irradiação por aparelhos de alto custo como lasers e alguns tipos de LED.

Os lasers de baixa intensidade têm sido as fontes de radiação

convencionalmente utilizadas para a aplicação da terapia fotodinâmica, embora

recentemente, outras fontes venham sendo experimentadas, como aquelas

emissoras de luz halógena, com o objetivo de tornar a disseminação da técnica

57

mais viável clinicamente 49;21;38. Um fator de fundamental importância para

escolha da fonte luminosa, diz respeito à ressonância que deve haver entre o

corante fotossensível e a luz irradiada, no que diz respeito a seus espectros de

absorção e irradiação, respectivamente. Nesse sentido, uma alternativa viável e

mais econômica em relação aos lasers é a o emprego dos LED 60;30, os quais

cobrem praticamente todo o espectro visível. Mais recentemente, aparelhos

fotopolimerizadores, emissores de luz halógena, foram utilizados em pesquisas

com o objetivo avaliar o efeito da TFD sobre microrganismos orais, bem como

associar o uso dessa terapia a um equipamento comumente usado na prática

odontológica 21;38.

Nesse contexto, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito

da terapia fotodinâmica, com ativação por luz halógena, sobre bactérias orais em

culturas planctônicas e na formação, in vitro, de biofilmes mono e multiespécies,

a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e

amostras de saliva, respectivamente.

Para tal, foram utilizados os agentes fotossensibilizantes azul de metileno

e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L 1;62, fotoativados através

da irradiação de luz visível na faixa de 600 a 750 nm, obtida a partir de um

aparelho fotopolimerizador Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo,

Brasil). Esta escolha se deu pelo fato do fotopolimerizador ser um equipamento

largamente utilizado na prática odontológica, quer em nível privado, quer em

nível público, o que possibilitaria a realização da terapia, sem a necessidade de

aquisição de um novo equipamento por parte de clínicos e serviços públicos de

saúde.

Dentre a variedade de substâncias fotossensibilizantes disponíveis para

utilização na TFD, os compostos fenotiazínicos, azul de toluidina e azul de

metileno têm sido os mais frequentemente utilizados no processo fotoquímico

53;52;19. Além da variabilidade do tipo de corante empregado, também há variação

no que diz respeito à concentração de FS utilizada, e tempo de pré-irradiação a

que o fotossensibilizante deve ser submetido.

O tempo de pré- irradiação se refere ao período de tempo necessário para

que o corante possa interagir com as células-alvo, antes da sua fotoativação 1.

Ainda não existe um consenso por parte dos pesquisadores quanto a esse

tempo, tendo o mesmo variado geralmente de 1 a 5 minutos na maioria dos

58

trabalhos 50. Com o objetivo de provocar a sensibilização das células bacterianas

em suspensão, estas foram colocadas em contato com as substâncias

fotossensibilizantes por 5 minutos, previamente à irradiação.

A metodologia adotada nesta pesquisa foi semelhante à desenvolvida por

Gonçalves 21, que utilizou em seu trabalho um aparelho fotopolimerizador, cujo

filtro de comprimento de onda foi removido, com o objetivo de aumentar o

comprimento de onda da luz emitida (550 nm e 730 nm). Entretanto, o filtro para

radiações infravermelho foi mantido, a fim de se prevenir efeitos térmicos

indesejados. Ainda em relação a esse estudo, os corantes azul de metileno e

azul de toluidina foram utilizados frente a suspensões de S. mutans, ambos na

concentração de 25mg/L, e irradiados durante um minuto, após tempo de pré-

irradiação de 5 minutos.

Em seu trabalho, Gonçalves 21 verificou uma redução percentual de 99,5

% sobre o número de UFC viáveis para a associação azul de metileno/luz

halógena. Tal associação apresentou resultados superiores, quando

comparados àqueles obtidos para o azul de toluidina. Ainda neste trabalho, um

aparelho de laser vermelho, emissor de luz de comprimento de onda de 660 nm,

foi empregado na fotoativação do corante azul de metileno, frente a suspensões

de S. mutans, mantendo-se a mesma metodologia anteriormente descrita,

obtendo-se uma redução percentual de 81,3%.

Em nosso estudo, logo após a aplicação da terapia fotodinâmica com

utilização dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, ativados por luz

halógena frente a suspensões mistas e de S. mutans, uma alíquota de cada

condição experimental foi retirada, semeada em placas contendo ágar BHI

sacarosado a 10% e incubada em microerofilia, por aproximadamente 20h. A

avaliação da ação bacteriostática da TFD foi verificada a partir da contagem do

número de UFC/mL viáveis, após o período de incubação.

Com relação ao efeito imediato da TFD sobre as suspensões mistas,

preparadas a partir de amostras de saliva, foi verificada uma redução percentual

no número de UFC/mL, em torno de 66,7% para o azul de toluidina, e de 86,6%

no o azul de metileno, ambos associados à luz halógena, e em comparação ao

controle negativo. Os melhores resultados para associação da luz halógena e o

corante azul de metileno, em detrimento do azul de toluidina, corroboram os

resultados obtidos por Gonçalves 21.

59

A terapia fotodinâmica, nas condições experimentadas neste estudo, não

apresentou qualquer atividade antibacteriana diante das suspensões de S.

mutans, nem inibiu a formação de biofilme a partir dessas, independente do

corante utilizado, na reação de fotoativação, pela luz halógena. Analisando os

resultados obtidos com a solução de clorexidina, esta foi capaz de provocar uma

redução de 100% no número de UFC/mL em relação às suspensões de S.

mutans, entretanto essa redução não se apresentou estatisticamente

significativa. Uma possível explicação para orrência desses resultados, é que o

número de amostras usados neste estudo (n =3), pode ter sido insuficiente para

que a TFD, bem como a solução de clorexidina, viessem apresentar ação

antibacteriana significativa frente às suspensões de S. mutans preparadas.

No que diz respeito à ação bactericida, esta foi avaliada a partir de dois

métodos quantitativos para aferição de crescimento bacteriano. O primeiro foi

realizado após o período de incubação, quando se procedeu a leitura das placas

de microtitulação, a fim de se obter os valores da densidade ótica para cada

poço. O segundo foi realizado após a leitura das placas, quando uma nova

alíquota de 10 µL foi retirada de cada poço e semeada, conforme já descrito

anteriormente. Após o período de incubação, o número de UFC/mL viáveis foi

obtido. Para algumas placas, a obtenção desse número não foi possível devido

ao grande crescimento bacteriano observado, inviabilizando a contagem, tanto

para as suspensões de S. mutans, quanto para as suspensões mistas. Mesmo

nas situações nas quais a contagem foi realizada, o número de UFC/mL foi

bastante elevado. Tais resultados foram semelhantes para a TFD aplicada com

azul de toluidina e com azul de metileno, entretanto, não se repetiram para o

controle positivo, para o qual o número de UFC/mL foi igual a zero.

Uma possível explicação para o grande crescimento bacteriano

observado em determinadas placas, poderia ser o fator de diluição, que pode ter

sido baixo. Entretanto, analisando o controle positivo, para o qual o mesmo fator

de diluição foi utilizado, vê-se que a solução de digluconato de clorexidina a

0,12% foi capaz de impedir o crescimento bacteriano. Os efeitos antimicrobianos

das soluções à base de clorexidina já estão bem fundamentados na literatura.

Trata-se de um antimicrobiano de largo espectro de ação, com atividade

bactericida e bacteriostática, bastante utilizado no tratamento e prevenção de

doenças orais como doenças periodontais e cárie dentária 15.

60

O que parece ser razoável, é que mesmo em condição favorável ao

grande crescimento bacteriano, que pode ter acontecido em decorrência de uma

baixa diluição das suspensões, a solução de clorexidina foi capaz de inibir o

crescimento bacteriano devido à sua ação antimicrobiana. Nesse contexto,

recaímos sobre a discussão que envolve a capacidade da terapia fotodinâmica

em matar um número suficiente de microrganismos, ou causar dano irreversível

às estruturas, de maneira a impedir o crescimento bacteriano, a partir dos

microrganismos remanescentes, evidenciando a necessidade de que a terapia

fotodinâmica apresente tanto ação bactericida, quanto bacteriostática para a

eficácia de sua aplicação 23.

Com relação ao efeito mediato da terapia fotodinâmica frente às

suspensões mistas, a partir dos valores de densidade ótica obtidos, verificou-se

a ocorrência de ação antimicrobiana altamente significativa, quer para

associação entre azul de toluidina e luz halógena, quer para o azul de metileno,

ativado por luz halógena. Entretanto, comparando esses resultados, percebeu-

se que a TFD apresentou uma maior redução microbiana, quando da associação

entre o corante azul de toluidina e a luz halógena. A ação antimicrobiana

decorrente dessa associação não apresentou diferença em relação à ação

antimicrobiana da solução de digluconato de clorexidina a 0,12%, frente às

suspensões microbianas mistas. O que pode ser visto como excelente resultado,

tendo em vista à clorexidina ser consensualmente aceita, como um

antimicrobiano considerado padrão ouro no controle de microrganismos orais 20.

Quando analisada a ação mediata do corante azul de toluidina, sobre as

suspensões mistas, a ocorrência de ação antimicrobiana foi verificada, mesmo

na ausência de fotoativação. A ação antibacteriana no escuro, foi descrita para o

azul de toluidina na concentração de 0,127 mg/mL 19 e 100mg/mL 1. No estudo

conduzido por Wilson, Dobson e Sarkar 53, o azul de metileno e azul de toluidina

foram testados, mas apenas o CT apresentou ação bacteriana em ausência de

fotoativação, na concentração de 25 µg/mL.

A terapia fotodinâmica apresentou ação antimicrobiana mediata,

prevenindo a formação de biofilme multiespécies. Entretanto, essa ação só foi

significativa quando a reação fotoquímica foi realizada através da ativação do

corante azul de toluidina por luz halógena, o mesmo não ocorrendo quando o

61

azul de metileno foi utilizado. A ação do corante azul de toluidina, per si, também

provocou tal ação preventiva, embora em menor proporção.

Nas condições experimentadas neste estudo, a luz halógena quando

usada isoladamente na irradiação de suspensões mistas e de S. mutans, não

apresentou qualquer ação antibacteriana, tal resultado está em consonância

com os obtidos em estudos anteriores 6;57;38;53.

Neste estudo, a utilização do azul de toluidina, como fotossensibilizante,

conferiu melhores resultados em relação à ação antimicrobiana da terapia

fotodinâmica, frente a suspensões mistas de microrganismos orais. Tal

constatação encontra suporte na literatura, mediante o grande número de

trabalhos que afirmam a eficácia do azul de toluidina, como substância

fotossensível, na aplicação da TFD 44.

A grande diferença de susceptibilidade entre as suspensões obtidas a

partir da saliva e de S. mutans, frente à ação da terapia fotodinâmica pode ter

ocorrido em decorrência dos poucos casos utilizados neste estudo em relação a

S. mutans (n = 3), em oposição a um maior número de amostras de saliva (n =

9), já que algumas vezes a análise das condições experimentais para as

amostras de S. mutans residiu no limiar de significância.

Os resultados obtidos neste estudo corroboram o proposto por Paulino et

al.38 e Gonçalves21, diante da possibilidade de utilização da luz halógena

proveniente de um aparelho fotopolimerizador, como fonte de irradiação da

terapia fotodinâmica, o que contribuiria para reprodutibilidade, na medida em que

tal aparelho é largamente utilizado na prática odontológica, quer em nível

público, quer em nível privado.

Diante do exposto, a ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica frente a

microrganismos orais, pôde ser comprovada, entretanto a realização de outros

estudos ainda são necessários a fim de se aprimorar seu protocolo de aplicação,

principalmente no tocante à utilização equipamentos, de baixo custo, acessíveis

a maioria dos profissionais, socializando a técnica, e ainda vislumbrando a

realização de estudos in vivo.

62

7. CONCLUSÕES

O corante azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L, apresentou

ação antimicrobiana sobre microrganismos orais em culturas planctônicas

mistas e na prevenção da formação, in vitro, de biofilmes multiespécies,

mesmo em ausência de fotoativação.

O corante azul de metileno, na concentração de 100mg/L, per si, não

apresentou ação antimicrobiana nas condições experimentadas.

A luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador com

espectros de emissão entre 600 e 750 nm, per si, não foi capaz de

provocar morte bacteriana, em nenhuma das condições testadas.

A terapia fotodinâmica apresentou ação antimicrobiana sobre culturas

planctônicas mistas e preveniu a formação, in vitro, de biofilmes

multiespécies, através da fotoativação do corante azul de toluidina por luz

halógena com espectro de emissão entre 600 e 750 nm.

A terapia fotodinâmica apresentou ação antimicrobiana sobre culturas

planctônicas mistas. Entretanto, não preveniu a formação, in vitro, de

biofilmes multiespécies, através da fotoativação do corante azul de

metileno por luz halógena, com espectro de emissão entre 600 e 750 nm.

A terapia fotodinâmica não apresentou ação antimicrobiana sobre culturas

planctônicas de S. mutans, nem impediu a formação, in vitro, de biofilmes

por esses microrganismos, quando da utilização dos corantes azul de

metileno e azul de toluidina, fotoativados por luz halógena com espectro

de emissão entre 600 e 750 nm.

63

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