avaliaÇÃo do efeito da inativaÇÃo fotodinÂmica … · diários e por tornarem o laboratório...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA

SOBRE A Leptospira interrogans E OÓCITOS BOVINOS

Denize Silva Brazil

Orientador: Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza

GOIÂNIA

2017

Balcão parede

Caixa de texto

ii

iii

DENIZE SILVA BRAZIL

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA

SOBRE A Leptospira interrogans E OÓCITOS BOVINOS

Dissertação apresentada para a obtenção do título

de Mestra em Ciência Animal ao Programa de

Pós-graduação em Ciência Animal da Escola de

Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal

de Goiás.

Área de concentração:

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de

Alimentos

Linha de pesquisa:

Etiopatogenia, epidemiologia, diagnóstico e

controle das doenças infecciosas dos animais

Orientador:

Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza – PPGCA/UFG

Comitê de Orientação:

Prof. Dra. Valéria de Sá Jayme – PPGCA/UFG

Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares– PPGCA/UFG

GOIÂNIA

2017

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.

CDU 639.09

Brazil, Denize Silva AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA SOBREA Leptospira interrogans E OÓCITOS BOVINOS [manuscrito] / DenizeSilva Brazil, Guilherme Rocha Lino de Souza, Valéria de Sá Jayme . - 2017. LXV, 65 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza; coorientadora Dra. Valéria de Sá Jayme ; co-orientador Dr. GuidoFontgalland Coelho Linhares. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Escolade Veterinária e Zootecnia (EVZ), Programa de Pós-Graduação emCiência Animal, Goiânia, 2017. Bibliografia. Anexos. Apêndice. Inclui siglas, fotografias, abreviaturas, gráfico, tabelas, lista defiguras, lista de tabelas.

1. fotossensibilizador. 2. leptospirose. 3. oócito. 4. PDI. I. Souza,Guilherme Rocha Lino de . II. Jayme , Valéria de Sá . III. Souza,Guilherme Rocha Lino de, orient. IV. Jayme , Valéria de Sá , coorient. V. Título.

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Balcão parede

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vii

Dedico aos meus espelhos, meus pais,

Byron Brazil

Aldenice Araújo Silva

E à minha amiga e querida irmã

Cynthia Silva Brazil.

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço hoje e sempre ao Senhor, Reis dos Exércitos, por me encher de

esperança e me permitir tentar ser uma pessoa melhor a cada nascer do sol, crendo fielmente

que a batalha já foi vencida.

Ao meu mais novo amigo e orientador, Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza,

por acreditar em mim e se disponibilizar por inteiro na realização deste trabalho, um de vários

que ainda irão por vir.

À minha coorientadora Valéria de Sá Jayme, bem como à técnica Lurdes e toda a

equipe do Laboratório de Diagnóstico de Leptospirose, pela paciência e grande ajuda durante

todo o experimento.

Aos professores Luiz Artur, toda a sua equipe, e Ivan Nicolau, pelos ensinamentos

diários e por tornarem o Laboratório de Bioquímica e Engenharia Genética um ambiente

familiar no qual há gosto de se trabalhar.

Aos professores Pablo José Gonçalves e Rodrigo Costa e Silva, pelos

ensinamentos de física e química, compartilhamento de ideias e por todo auxílio.

À minha colega e amiga Aline Barichello, por caminhar junto comigo; ao amigo

Bruno Gonzaga, por me incentivar a voltar às pesquisas e aos estudos acadêmicos; e ao meu

colega e amigo Tiago Diesel, por se disponibilizar e fazer parte deste trabalho.

À “dona Eleuza”, “Sr. Edson” e familiares da minha eterna amiga irmã Cinira

Leopoldina Batista dos Santos (in memorian), por me acolherem em seus corações. O meu

infindável agradecimento.

Aos meus pais, irmã e familiares, por serem o meu orgulho e o meu alicerce. Não

há palavras tamanhas para a demonstração do meu amor por vocês.

À toda equipe do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal

(PPGCA/EVZ/UFG) por todo profissionalismo, competência e dedicação para com todos os

integrantes do programa.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de estudos, permitindo dedicar-me de forma integral e plena aos meus

estudos.

À todos que conviveram e convivem comigo, contribuindo de alguma forma ao

meu crescimento profissional e pessoal. Os meus sinceros agradecimentos.

ix

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 3

2.1. Leptospira spp. ................................................................................................................................. 3

2.1.1. Classificação ................................................................................................................................. 3

2.1.2. Biologia das leptospiras ................................................................................................................ 4

2.1.3. Enfermidade causada pelas leptospiras patogênicas ..................................................................... 5

2.2. Terapia Fotodinâmica (PDT) ........................................................................................................... 6

2.2.1. Histórico ........................................................................................................................................ 6

2.2.2. Princípios da Inativação Fotodinâmica (PDI) ............................................................................... 7

2.2.3. Fontes de luz para a PDI ............................................................................................................... 9

2.2.4. Fotossensibilizadores (PS) .......................................................................................................... 10

3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 12

3.1. Objetivos gerais .............................................................................................................................. 12

3.2. Objetivos específicos...................................................................................................................... 12

4. HIPÓTESES ........................................................................................................................ 13

5. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 14

5.1. Local de desenvolvimento .............................................................................................................. 14

5.2. Cultivo e manutenção da Leptospira .............................................................................................. 14

5.3. Preparo das soluções de PSs ........................................................................................................... 14

5.4. Inativação Fotodinâmica da Leptospira ......................................................................................... 14

5.5. Soluções e composição de meios para a PIVE .............................................................................. 15

5.6. Composição dos meios para PIVE ................................................................................................ 15

5.6.1. Meio de maturação - MIV ........................................................................................................... 15

5.6.2. Meio de maturação de bancada – MIV t ..................................................................................... 16

5.6.3. Meio de fecundação .................................................................................................................... 16

5.6.4. Meio CAP ................................................................................................................................... 16

5.6.5. Meio de cultivo ........................................................................................................................... 16

5.6.6. Meio LAV de bancada ................................................................................................................ 16

5.7. Inativação Fotodinâmica de oócitos ............................................................................................... 16

5.7.1. Colheita de oócitos ...................................................................................................................... 17

5.7.2. PDI de CCO´s imaturos............................................................................................................... 17

5.7.3. PDI de CCO´s maturados ............................................................................................................ 19

5.8. Análise estatística ........................................................................................................................... 20

x

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 21

6.1. Inativação fotodinâmica da Leptospira .......................................................................................... 21

6.2. Inativação Fotodinâmica de CCO´s imaturos ................................................................................ 33

6.3. Inativação Fotodinâmica de CCO´s maturados .............................................................................. 37

7. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 40

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 41

xi

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Classificação taxonômica de espiroquetas de importância médica. ...................... 3

FIGURA 2 - Leptospira biflexa observada em iluminação unilateral em campo escuro.

Nota-se sua extremidade anterior em forma espiralada (S-end), o cilindro

protoplasmático (PC) e sua extremidade posterior em forma de gancho (H-

end). ....................................................................................................................... 5

FIGURA 3 – Leptospiras (setas) em embrião bovino (A a D) e suíno (E). (A) L.

borgpetersenii sorovar hardjo na membrana celular e no citoplasma. Bar =

0,40 µM; (B) L. borgpetersenii sorovar hardjo na matriz da ZP. Bar = 0,33

µM; (C) L. borgpetersenii sorovar hardjo no espaço intercelular. Bar = 0,44

µM; (D) L. borgpetersenii sorovar hardjo na superfície da ZP. Note a

estrutura da ZP com inúmeros poros que podem ser penetrados pela

Leptospira. Bar = 0,53 µM; (E) Aderência da Leptospira na superfície da ZP.

1300x. .................................................................................................................... 6

FIGURA 4 - Diagrama de Jablonski modificado – processos de ativação

fotoquímica/fotofísica. (S0) estado fundamental, (Sn) estado excitado

singleto, (S1) primeiro estado excitado singleto, (A) absorção de um fóton,

(RV) relaxamento vibracional, (CI) cruzamento interno, (CIS) cruzamento

intersistemas, (T1) estado excitado tripleto de menor energia, (F)

Fluorescência, (P) Fosforescência, (PS) Fotossensibilizador. ............................... 8

FIGURA 5 - Propagação da luz através dos tecidos ................................................................ 10

FIGURA 6 – Estruturas moleculares. A) porfirina; B) clorina; C) ftalocianina; D)

fenotiazínico azul de metileno. ............................................................................ 11

FIGURA 7 - Relação das DOs entre os tratamentos controle pré (dia do experimento) e pós

(sete dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa). ........ 21

FIGURA 8 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete

dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS

TMPP irradiado por 30 min. ............................................................................... 23

xii



ZnTMPP irradiado por 30 min. ........................................................................... 24


dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS HP

irradiado por 30 min. ........................................................................................... 25

FIGURA 11 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias após a manutenção da

cultura de Leptospira hardjo em estufa) das porfirinas TMPP, ZnTMPP e HP

irradiadas por 30 min. .......................................................................................... 27


dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) dos PSs

ZnPc (em A) e AlPc (em B) irradiados por 30 min. ........................................... 28



ZnTMPP irradiado por 60 min. ........................................................................... 30



ZnTMPP irradiado por 30 e 60 min. ................................................................... 31


dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS MB

irradiado por 60 min. ........................................................................................... 32

FIGURA 16 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias após a manutenção da

cultura de Leptospira hardjo em estufa) da ZnTMPP e MB irradiadas por 60

min. ...................................................................................................................... 33

xiii

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Grupos de CCO´s imaturos, tratamentos e dias de suas avaliações em

estereomicroscópio. .......................................................................................... 19

QUADRO 2 - Grupos de CCO´s maturados, tratamentos e dias de suas avaliações em

estereomicroscópio. .......................................................................................... 20

QUADRO 3 - Grupos de CCO´s imaturos e os dias de suas avaliações em

estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e

percentuais de clivagem e embriões por grupo. ................................................ 35

QUADRO 4 - Grupos de CCO´s maturados e os dias de suas avaliações em

estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e

percentuais de clivagem e embriões por grupo. ................................................ 38

xiv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

µM - micromolar

µl - microlitro

nm - nanômetro

mW - miliwatt

AlPC - Ftalocianina metalada com alumínio

CCO´s - complexos cumulus-ovócitos

DO - densidade óptica

J - joule

HP - Hematoporfirina

MB - Azul de metileno

PDI - inativação fotodinâmica

PIVE - produção de embriões in vitro

PS - fotossensibilizador

ROS - espécies reativas de oxigênio

TMPP - porfirina meso-tetrametilpiridil

ZnPC - Ftalocianina metalada com zinco

ZnTMPP - porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco

ZP - zona pelúcida

xv

RESUMO

A leptospirose é uma importante zoonose e traz consideráveis perdas econômicas em

decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade e queda da produção de leite em rebanhos

acometidos. A doença pode ser disseminada pela urina, água, solos contaminados, via

venérea, transplacentária e há risco de transmissão pela manipulação de embriões in vitro.

Dessa forma, com o avanço das biotécnicas reprodutivas, a preocupação com a sanidade de

animais ou rebanhos frente a qualquer enfermidade também transmitida por sêmen ou

embriões tem aumentado. Como alternativa para a inativação de agentes infecciosos, a técnica

de inativação fotodinâmica (PDI) vem ganhando destaque por não causar resistência

microbiana natural. O método consiste na combinação de um fotossensibilizador (PS), luz e

oxigênio molecular, resultando na formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que em

altos níveis induzem a morte celular. Neste trabalho, com o objetivo de inativar a Leptospira

interrogans in vitro, seis PSs foram testados na concentração de 10 µM e em tempos de

irradiações de 30 e ou 60 min. As Porfirinas TMPP e ZnTMPP mostraram-se eficientes, a

primeira na irradiação de 30 min, a segunda em ambos os tempos de irradiação testados. O

Azul de Metileno (MB) demonstrou uma inativação satisfatória quando irradiado por 60 min.

Hematoporfirina e Ftalocianinas testadas não demostraram eficiência na inativação das

leptospiras nos parâmetros experimentais analisados. Ao avaliar a ação da ZnTMPP e do MB

sobre a viabilidade dos oócitos, ambos demonstraram ser inócuos aos complexos cumulus-

ovócitos (CCO’s) maturados no tempo de 30 min, o que os torna potenciais candidatos à

utilização para a desinfecção de materiais biológicos ou subprodutos de origem animal em

substituição aos antibióticos, conhecidamente causadores de resistência bacteriana.

Palavras-chave: fotossensibilizador, leptospirose, oócito, PDI.

xvi

ABSTRACT

Leptospirosis is an important zoonosis and it causes economic losses due to abortion, mastitis,

infertility, and drop in milk production in affected herds. The disease may be disseminated

through urine, water, contaminated soils, venereal and transplacental routes, and there is a risk

of transmission by in vitro embryo manipulation. Thus, with the advancement of reproductive

biotechnology, the concern with the sanity of animals or herds in the face of any disease also

transmitted by semen or embryos has increased. As an alternative for the inactivation of

infectious agents, the technique of photodynamic inactivation (PDI) has became prominent as

it does not cause natural microbial resistance. The method consists in the combination of a

photosensitizer (PS), light, and molecular oxygen, resulting in the formation of reactive

oxygen species (ROS) that at high levels induce cell death. In this study, in order to inactivate

in vitro Leptospira interrogans, six PSs were tested at a concentration of 10 μM and at the

irradiation times of 30 and or 60 min. The TMPP and ZnTMPP porphyrins were efficient, the

first one in the 30 min irradiation, the second one in both irradiation times. Methylene Blue

(MB) demonstrated satisfactory inactivation when irradiated for 60 min. Hematoporphyrin

and phthalocyanines did not demonstrate efficiency in the inactivation of leptospires in the

experimental parameters used. When evaluating the action of ZnTMPP and MB on oocyte

viability, both demonstrated to be innocuous to cumulus-oocyte (CCOs) complexes matured

in the 30 min, which makes them potential candidates for the disinfection of biological

materials or by-products of animal origin in place of antibiotics, known to cause bacterial

resistance.

Key words: photosensitizer, leptospirosis, oocyte, PDI.

1. INTRODUÇÃO

A resistência microbiana aos antibióticos é uma preocupação mundial. Entretanto, o

uso desses fármacos vem crescendo a cada década com a finalidade de combater as numerosas

doenças existentes, tanto humanas quanto animais. Além disso, os antibióticos são utilizados

também com o objetivo de promover desinfecções de materiais biológicos, dentre eles o sêmen

e embriões bovinos.

É fato que as biotécnicas reprodutivas têm contribuído de forma significativa ao

desenvolvimento técnico-científico e econômico das nações1. As técnicas de inseminação

artificial, a produção de embriões in vitro (PIVE) e a transferência de embriões têm

impulsionado o melhoramento genético e a eficiência produtiva de rebanhos bovinos em todo o

mundo2,3

, inclusive no Brasil4. Contudo, são infundados os investimentos de tais tecnologias

em rebanhos ou em animais com problemas sanitários, como enfermidades que podem ser

transmitidas por sêmen ou embriões, e que provocam, entre outros males, abortamentos,

repetição de cio, infertilidade e esterilidade5.

Para que haja controle sanitário dos embriões e oócitos na PIVE, a International

Embryo Transfer Society (IETS) desenvolveu um manual de procedimentos, com instruções de

tratamentos celulares com tripsina ou antibióticos em lavagens alternadas com meio de cultura

e, também, lavagens sequenciais, com a finalidade de inativar ou remover agentes infecciosos

que podem interferir no produto final6.

Dentre os agentes que podem acometer os embriões a Leptospira sp. merece

destaque7. A bactéria é aeróbia, do tipo espiroqueta, Gram-negativa e causadora de uma

enfermidade da esfera reprodutiva, a leptospirose. A doença causa consideráveis perdas

econômicas em decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade8, repetições de cio,

nascimento de bezerros fracos ou prematuros, natimortos9 e queda da produção de leite nos

bovinos10

. Além de assumir um papel relevante na área da saúde animal, destaca-se também do

ponto de vista da Saúde Pública, uma vez que se trata de uma importante zoonose9.

A leptospirose tem como agente a L. interrogans que dentre as duas espécies

conhecidas de Leptospira spp., é a considerada patogênica9. Ela é de distribuição cosmopolita,

sendo mais comum em regiões de clima tropical, e possui inúmeros sorovares10

. No estado de

Goiás, a enfermidade é considerada endêmica, bem como na microrregião de Goiânia11

.

Os bovinos, uma vez infectados, podem eliminar a leptospira na urina por até mais

de um ano12,13

. São considerados reservatórios do sorovar hardjo, e podem transmitir a doença

2

pelo modo indireto - contato com água e solos contaminados; e modo direto - via venérea14

e

transplacentária15

. Foi confirmada a transmissão por meio do sêmen contaminado, durante a

monta natural e a inseminação artificial16

. Há também o favorecimento do risco da transmissão

de doenças pela manipulação de embriões in vitro17

.

Diante do exposto, este trabalho sugeriu o uso da inativação fotodinâmica (PDI)

sobre a Leptospira interrogans sorovar hardjo in vitro e oócitos bovinos, uma vez que a técnica

é destacada por não causar resistência microbiana natural18

.

A PDI consiste na combinação sinérgica de um composto fotossensibilizador (PS),

luz (a um comprimento de onda adequado) e oxigênio molecular, resultando na formação de

espécies reativas de oxigênio (ROS)19

. As ROS são subprodutos do metabolismo normal do

oxigênio e desempenham importante função nos processos de sinalização e homeostase celular.

Contudo, em altos níveis provocam danos às estruturas celulares induzindo a morte celular,

demonstrando sua eficácia para inativar patógenos infecciosos20-23

.

Os PSs mais utilizados na terapia fotodinâmica são as porfirinas, clorinas e

ftalocianinas. Eles possuem propriedades fotofísicas semelhantes, porém, apresentam estruturas

moleculares diferentes e características específicas. Isso resulta em divergências em relação à

eficácia da PDI24

. Outra classe utilizada é a dos fenotiazínicos, dentre eles destaca-se o azul de

toluidina e o azul de metileno25

.

Neste trabalho foram utilizados seis fotossensibilizadores - porfirina meso-

tetrametilpiridil (TMPP), porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco (ZnTMPP),

Hematoporfirina (HP), Ftalocianina metalada com zinco (ZnPC), Ftalocianina metalada com

alumínio (AlPC) e Azul de metileno (MB) - para a avaliação da PDI in vitro da L. interrogans

sorovar hardjo e em oócitos bovinos.

3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Leptospira spp.

2.1.1. Classificação

Leptospira spp. são bactérias que compõem a ordem Spirochaetales e a família

Leptospiraceae. Podem ser classificadas de duas maneiras: patogênicas ou saprófitas, baseada

em técnicas moleculares (gênicas) ou a determinantes antigênicos (forma sorológica)26

.

A classificação genotípica, após demonstrações da heterogeneidade genética de

espécies agrupadas num mesmo sorovar, vem ganhando destaque27

. O gênero Leptospira pode

ser agrupado em: subgrupo patogênico, saprofítico e intermediário28,29

. No subgrupo

patogênico estão classificadas as espécies consideradas de importância médica: L. interrogans,

L. kirschneri, L. noguchii, L. borgpetersenii, L.weilii, L. santarosai, L. alexanderi e L. alstoni

(Figura 1). No saprofítico as espécies consideradas ambientais: L. biflexa, L. wolbachii, L.

kmetyi, L. meyeri, L. vanthielii, L. terpstrae e L. yanagawae. E no intermediário as espécies L.

inadai, L. broomii, L. fainei, L. wolffii e L. licerasiae30

.

FIGURA 1 - Classificação taxonômica de espiroquetas de importância médica.

Fonte: Siqueira31

.

Apesar de análises filogenéticas dos genes RNAs ribossomais 16S dividirem as

espécies de leptospiras nesses três grupos32,33

, a classificação sorológica ainda é a base

taxonômica para as leptospiras. Portanto, esse gênero é tradicionalmente dividido em duas

4

espécies: não-patogênicas ou saprófitas, cujo destaque dar-se-á para a L. biflexa; e patogênicas,

das quais se sobressai a L. interrogans32

.

2.1.2. Biologia das leptospiras

Bactérias do gênero Leptospira são microrganismos móveis flagelados

denominados espiroquetas34

. Possuem o formato alongado, fino e helicoidal, exibindo espiras

curtas e regulares para o lado direito, e tamanho de 0,1 a 0,15 µm de diâmetro por 6,0 a 12,0

µm de comprimento33

. Crescem otimamente em temperaturas de 28 a 30°C, pH de 7,2 a 7,6 e o

tempo de crescimento é lento (aproximadamente 20h)35

.

O agente é aeróbico obrigatório34

e não pode ser observado em microscópio ótico

comum, e sim em microscópio de campo escuro ou contraste de fase33

. A maioria não é corada

pela coloração de Gram, mas todas podem ser coradas por impregnação por sais de prata.

Apesar de ser classificado como Gram-negativo, possui características atípicas e

comuns a de Gram-positivos. A parede celular desta bactéria é composta por uma membrana

interna, peptidoglicano, dois flagelos periplasmáticos e membrana externa. A presença de duas

membranas na parede celular e a presença de lipopolissacarídeo (LPS) na membrana externa

são características comuns a bactérias Gram-negativas, no entanto, o fato de o peptidoglicano

estar ancorado na membrana interna é comum a bactérias Gram-positivas36

.

Os dois flagelos periplasmáticos axiais apresentam-se ancorados em ambas as

extremidades da célula, características únicas entre as bactérias, e sua mobilidade se dá por

rotação, impulsionada pelos flagelos. A extremidade anterior tem uma forma espiral longa (S-

end) e a extremidade posterior é em forma de gancho (H-end). Ligando as extremidades têm-se

o cilindro protoplasmático (PC) (Figura 2). Há três tipos de movimentação possíveis: rotação

sobre um eixo central, movimento progressivo (reto) e movimentação circular37

. A S-end,

juntamente com o PC, está correlacionada à velocidade de natação e a H-end às mudanças da

taxa de rotação38

.

5

FIGURA 2 - Leptospira biflexa observada em iluminação unilateral em

campo escuro. Nota-se sua extremidade anterior em forma

espiralada (S-end), o cilindro protoplasmático (PC) e sua

extremidade posterior em forma de gancho (H-end).

Fonte: Nakamura et al.38

.

2.1.3. Enfermidade causada pelas leptospiras patogênicas

As espécies patogênicas possuem grande importância na área da saúde, uma vez

que podem levar à leptospirose - uma importante zoonose de curso agudo a crônico35

que

acomete, além do homem, espécies silvestres e as principais espécies domésticas como: cães,

suínos, caprinos, ovinos, equinos e bovinos39

. A doença é de distribuição cosmopolita, sendo

mais comum em regiões de clima tropical40

e causa perdas econômicas significativas em

decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade35

, repetições de cio, nascimento de

bezerros fracos ou prematuros, natimortos39

e queda da produção de leite nos bovinos40

.

A Leptospira pode persistir no trato reprodutivo por meses ou até anos após a

infecção41

. Apesar da zona pelúcida (ZP) do oócito servir tanto de barreira mecânica quanto

fisiológica, sabe-se que alguns patógenos, mesmo não penetrando através da ZP, podem estar

firmemente aderidos à sua superfície externa42

. Em estudo realizado com mórulas expostas por

altas concentrações de Leptospira via in vitro, a micrografia eletrônica (ME) mostrou que essa

espiroqueta pode penetrar os canais da ZP e invadir a matriz, os espaços perivitelino e

intercelular dessas células embrionárias. Apesar desse achado, não se sabe qual a concentração

de leptospira pode ser encontrada no trato reprodutivo de animais naturalmente infectados7

(Figura 3).

6

FIGURA 3 – Leptospiras (setas) em embrião bovino (A a D) e suíno (E). (A) L. borgpetersenii

sorovar hardjo na membrana celular e no citoplasma. Bar = 0,40 µM; (B) L.

borgpetersenii sorovar hardjo na matriz da ZP. Bar = 0,33 µM; (C) L. borgpetersenii

sorovar hardjo no espaço intercelular. Bar = 0,44 µM; (D) L. borgpetersenii sorovar

hardjo na superfície da ZP. Note a estrutura da ZP com inúmeros poros que podem ser

penetrados pela Leptospira. Bar = 0,53 µM; (E) Aderência da Leptospira na superfície

da ZP. 1300x.

Fonte: Adaptado de Bielanski et al.7 e Shisong et al.

43

No estado de Goiás, a leptospirose é considerada endêmica, predominando as

coaglutinações, os sorovares wolffi, hardjo, grippotyphosa e shermani, nesta ordem44

. Bem

como na microrregião de Goiânia, cujos destaques são os sorovares wolffi e hardjo, também

nesta ordem de prevalência11

.

2.2. Terapia Fotodinâmica (PDT)

2.2.1. Histórico

A PDT teve início há quatro mil anos no Egito antigo onde se tratava vitiligo

combinando-se a ingestão de plantas e a exposição à luz solar45

. Além do Egito, na China e na

7

Índia também se utilizavam o método46

. Contudo, as pesquisas foram iniciadas apenas no

século XIX.

A partir de 1900, os efeitos fotodinâmicos de compostos químicos são estudados na

inativação de microrganismos. Oscar Raab foi o primeiro a publicar que a combinação de luz

com o corante acridina era tóxico para o protozoário Paramecium caudatum. Em 1903, a

descoberta da necessidade da presença do oxigênio em associação a luz para que a reação

funcionasse, denominada de “efeito fotodinâmico”, foi de seu orientador Herman von

Tappeiner18,47

.

Vinte anos depois (1924), Policard A. publicou as primeiras observações clínicas.

Em seu estudo, tumores malignos apresentavam uma fluorescência vermelho tijolo e descobriu-

se que o acúmulo de porfirinas produzidas por bactérias hemolíticas que proporcionava esta

cor. Esses compostos eram atóxicos no escuro, contudo na presença de oxigênio e de luz

visível, se tornavam prejudiciais ao tecido celular48

.

No fim da década de 60, Lipson et al.49

, utilizaram um novo fármaco no tratamento

de câncer de mama. Esse fármaco era sintetizado a partir da purificação da hematoporfirina

(Hp) e chamado de derivado da hematoporfirina (HPD).

O reconhecimento da PDT como terapia alternativa para o tratamento do câncer

deu-se na década de 70, a partir dos trabalhos de Thomas Dougherty et al. e inspirou outras

modalidades de fototerapia, como a inativação fotodinâmica (PDI) para eliminação de

microrganismos patogênicos, e o fotodiagnóstico50-52

.

2.2.2. Princípios da Inativação Fotodinâmica (PDI)

A PDI provém da PDT e é baseada nos mesmos princípios. O objetivo de ambas é a

indução da morte celular. Esta última é utilizada em tratamentos de tumores neoplásicos e

benignos e tem como principais alvos (em células de mamíferos) os lisossomos, mitocôndrias e

membranas plasmáticas. A primeira tem como foco a eliminação de microrganismos

patogênicos, tais como fungos, vírus e bactérias18

.

Os dois métodos utilizam-se basicamente de um composto químico atóxico, em sua

maioria pigmentado e sem toxicidade no escuro, chamado fotossensibilizador (PS). Esse

composto ao ser irradiado, por uma fonte de luz em um determinado comprimento de onda em

um determinado tempo, absorve o fóton e sofre uma série de processos fotoquímicos e

fotofísicos. Na presença de oxigênio, essa reação gera espécies reativas de oxigênio (ROS) e

oxigênio singleto (1O2), que induz a toxicidade

19,53,54. Quando os produtos da

8

fotossensibilização danificam a membrana plasmática e a mitocôndria, levam à necrose e

quando as doses são mais baixas e subletais, levam à apoptose55

.

Ao interagir com as moléculas de oxigênio, a luz pode ser dispersa, refletida ou

absorvida obtendo, portanto, a fluorescência, fosforescência ou transferência de energia não

radiativa56-58

. O diagrama de Jablonski (Figura 4) ilustra o processo responsável pela

luminescência. As moléculas, ao absorverem a radiação, são promovidas do estado eletrônico

fundamental (S0) para um estado excitado singleto (Sn). Elas então, por efeito de conversão

interna (CI), se desativam por relaxamento vibracional (RV) até atingir o primeiro nível

vibracional do estado eletrônico de menor energia (S1). Neste estágio a molécula pode seguir

diferentes caminhos quanto à utilização da energia: 1) ela perde energia para o solvente e

retorna ao estado S0, por efeito de CI; 2) ela emite luz visível através do processo de

fluorescência (F); ou 3) ela passa para o estado excitado tripleto de menor energia (T1), por

efeito de cruzamento intersistemas (CIS) onde há a passagem de singleto para tripleto com

inversão do spin59,60

.

FIGURA 4 - Diagrama de Jablonski modificado – processos de ativação

fotoquímica/fotofísica. (S0) estado fundamental, (Sn) estado excitado

singleto, (S1) primeiro estado excitado singleto, (A) absorção de um fóton,

(RV) relaxamento vibracional, (CI) cruzamento interno, (CIS) cruzamento

intersistemas, (T1) estado excitado tripleto de menor energia, (F)

Fluorescência, (P) Fosforescência, (PS) Fotossensibilizador.

Fonte: Adaptado de Frackowiak61

.

Do estado T1 a molécula pode seguir por dois caminhos: 1) emitir luz visível, a

fosforescência (P), e voltar para S0; ou 2) transferir energia para o oxigênio molecular (O2).

Esse último mecanismo pode se dar de duas formas, o tipo I e o tipo II. No primeiro há uma

9

transferência de elétrons entre o PS e os componentes do sistema, resultando na formação de

radicais livres (OH) ou peróxido de hidrogênio (H2O2). Esses por sua vez podem levar à

formação de ROS19,53,60

. As ROS desempenham normalmente importante função nos processos

de sinalização e homeostase celular. Contudo, em altos níveis provocam danos irreversíveis às

membranas celulares incluindo a citoplasmática, a mitocondrial, a lisossomal e a nuclear, além

de causarem alterações protéicas62,63

induzindo a morte celular19,21-23

.

No segundo mecanismo há uma transferência de energia do PS para O2 que se

encontra em seu estado excitado tripleto (3O2), formando o oxigênio singleto (

1O2). O

1O2

possui alta reatividade para o ataque de biomoléculas e, por possuir tempo de vida muito curto,

leva à destruição somente de células vizinhas. Por isso, torna o alvo de destruição celular mais

específico e localizado64

. Essa molécula necessita do PS como precursor do estado tripleto, que

possui tempo de vida mais longo19,53,60

.

Os dois mecanismos geram ROS, mas na PDI, as produzidas pelo mecanismo do

tipo II (oxigênio singleto) são as mais expressivas60,65,66

. Ambos podem ocorrer

simultaneamente, contudo a proporção entre eles dependerá da presença de oxigênio, da

concentração do substrato e do PS utilizado.

2.2.3. Fontes de luz para a PDI

A luz é necessária para que ocorra a reação e a intensidade de irradiação, dose e

tempo de exposição ao agente, dependerá do PS utilizado, bem como do próprio

microrganismo que se deseja inativar. Existem diversos tipos de fontes de luz, elas se agrupam

em coerentes e não coerentes.

As fontes de luz coerentes produzem um comprimento de onda monocromático que

permite o fácil cálculo da dosimetria e irradiação em um comprimento de onda específico para

cada PS67

. Como exemplo tem-se os lasers que podem ser focados, transmitidos por uma fibra

óptica ou diretamente entregues ao local alvo68

.

As fontes de luz não coerentes liberam um amplo espectro de comprimentos de

onda, portanto há uma dificuldade no controle da intensidade da luz. Além disso, possuem

outras desvantagens como efeitos térmicos e baixa intensidade de luz68

. No entanto, são mais

seguras, fáceis de utilizar e possuem baixo custo. Como exemplo tem-se as lâmpadas

convencionais69

.

Apesar das diferenças entre os tipos de fontes de luz, as coerentes e as não

coerentes apresentam eficácias semelhantes70

. Portanto, a escolha da melhor fonte de luz deve

ser baseada na escolha do PS, ou seja, aquela que tem a habilidade de excitar o PS escolhido,

10

em seu comprimento de onda específico, sem provocar efeitos adversos nas células não alvo;

da localização do patógeno (profundidade no tecido e acessibilidade); e custo71

.

A profundidade que a luz irá penetrar no tecido está relacionada com, o

comprimento de onda72

. As luzes ideais para a PDI são as que atendem a chamada “janela

terapêutica”, cujo comprimento de onda se estende da faixa de 600 à 800nm. As que possuem

comprimentos de ondas abaixo de 600nm não penetram nas profundidades desejadas e as que

possuem comprimentos de ondas acima de 800nm não possuem energia suficiente para gerar

1O2 e iniciar uma reação

73.

A luz azul penetra menos eficientemente através do tecido porque possui um menor

comprimento de onda, enquanto que as radiações vermelha e infravermelha penetram mais

profundamente por possuírem um maior comprimento de onda72,73

(Figura 5).

FIGURA 5 - Propagação da luz através dos tecidos

Fonte: Adaptado de Agostinis et al.72

2.2.4. Fotossensibilizadores (PS)

PS são compostos químicos atóxicos capazes de absorver a energia da luz irradiada

e gerar fluorescência ou ROS74

. Podem ser administrados por via tópica, intralesional e

sistêmica75

e geralmente, pertencem às famílias das porfirinas, clorinas e ftalocianinas24

.

Entretanto, alguns fenotiazínicos também estão sendo utilizados25

(Figura 6).

11

As porfirinas são pigmentos fortemente corados e que apresentam a cor púrpura76

.

Elas conferem a cor vermelha característica nos animais e cor verde nas plantas uma vez que

são unidades centrais de moléculas como a clorofila, vitamina B12 e hemoglobina77

. Possuem

vinte átomos de carbono ao redor de um anel central com quatro átomos de nitrogênio. E são

moléculas que absorvem luz na região do vermelho (500-650nm)59,76

. Porfirina meso-

tetrametilpiridil (TMPP), porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco (ZnTMPP) e

Hematoporfirina (HP) são alguns exemplos de porfirinas e os PS análogos comercialmente

mais utilizados são: Photofrin® (Canadá), Photosan® (Alemanha) e Photogem® (Rússia)18

.

As clorinas se diferem das porfirinas por apresentarem uma dupla ligação na

periferia do sistema macrocíclico. Isso permite que absorvam fortemente na região do azul e do

vermelho (650-800nm), bem como confere a elas maior tempo de vida no estado tripleto78

. No

mercado estão disponíveis: Foscan®, Photochlor®, Photoditazine®, Radaclorina® e

Visudyne™18

.

As ftalocianinas já possuem quatro núcleos benzoindólicos unidos por pontes de

nitrogênio. São corantes sintéticos, cuja coloração é a azulada e podem se ligar com vários

tipos de metais, principalmente ao alumínio (Ftalocianina Alumínio - AlFC) e zinco

(Ftalocianina Zinco - ZnFC) em sua região central, conferindo-lhes características fotofísicas

específicas. A banda de absorção se encontra na região de 600-800nm79-81

. Comercialmente há

o Photosense®82

.

Os fenotiazínicos são corantes aromáticos heterocíclicos solúveis em água ou em

álcool, relativamente lipofílicos e possuem carga positiva. Isso garante a permeabilidade em

membranas e também acúmulo em mitocôndrias devido ao potencial negativo da matriz

mitocondrial. Exibem intensa absorção na região de 600-660 nm18

e os mais utilizados são azul

de toluidina e azul de metileno25

.

FIGURA 6 – Estruturas moleculares. A) porfirina; B) clorina; C) ftalocianina; D)

fenotiazínico azul de metileno.

12

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivos gerais

Inativar pelo método da PDI a L. interrogans sorovar hardjo e avaliar a ação dos

fotossensibilizadores sobre a viabilidade de oócitos bovinos.

3.2. Objetivos específicos

1. Testar diferentes classes de fotossensibilizadores para a inativação fotodinâmica da L.

interrogans sorovar hardjo.

2. Avaliar diferentes tempos de irradiação na inativação fotodinâmica da Leptospira em uma

concentração de 10 µM de cada fotossensibilizador.

3. Avaliar diferentes tempos de irradiação na inativação fotodinâmica de oócitos bovinos

utilizando o fotossensibilizador de escolha.

4. Avaliar a integridade dos oócitos pós-inativação fotodinâmica.

5. Analisar a quantidade de estruturas clivadas e a produção de embriões pós-inativação

fotodinâmica.

13

4. HIPÓTESES

A Inativação Fotodinâmica pode ser utilizada para a eliminação de Leptospira

interrogans.

A Inativação Fotodinâmica pode ser utilizada em oócitos bovinos.

14

5. MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi submetido e aprovado pelo comitê de ética no uso de animais

(CEUA/UFG – protocolo N. 086/2016) (Anexo).

5.1. Local de desenvolvimento

O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Engenharia Genética

(LBEG) no Instituto de Ciências Biológicas II (ICB II) da Universidade Federal de Goiás

(UFG), em Goiânia, no Laboratório de Diagnóstico de Leptospirose (LDL) e no Laboratório de

Reprodução da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da mesma instituição.

5.2. Cultivo e manutenção da Leptospira

Os procedimentos de multiplicação e manutenção da Leptospira foram realizados

no Laboratório de Diagnóstico de Leptospirose (LDL) da Escola de Veterinária e Zootecnia

(EVZ/UFG). As amostras de bactéria foram multiplicadas em meio Ellinghausen-McCullough-

Johnson-Harris (EMJH) e repicadas de sete em sete dias até o término do experimento.

5.3. Preparo das soluções de PSs

Os PSs foram preparados no Laboratório de Biofísica do Instituto de Física da

Universidade Federal de Goiás e suas concentrações determinadas pelo espectrofotômetro

LAMBDA 1050 UV/Vis/NIR spectrophotometer - PerkinElmer Inc. (Waltham, Massachusetts

02451, USA). Posteriormente as amostras foram diluídas em tampão fosfato-salino (PBS) pH

7.4 1x autoclavado para obtenção de 2-4 ml.

5.4. Inativação Fotodinâmica da Leptospira

Nesta etapa foram testados cinco PSs: porfirina meso-tetrametilpiridil (TMPP),

porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco (ZnTMPP), Hematoporfirina (HP),

Ftalocianina metalada com zinco (ZnPC) e Ftalocianina metalada com alumínio (AlPC).

Para a realização da Inativação Fotodinâmica (PDI) da Leptospira, 800 µl de

cultura foram incubados à temperatura ambiente por 1 h ao abrigo da luz juntamente com cada

PS, separadamente, na concentração final de 10 µM (concentração testada anteriormente com

outros microrganismos pela equipe laboratorial) em um microtubo de 2 ml. Após a incubação,

250 µl da solução foram diluídos em 1 ml de meio EMJH e desta, 1 ml foi utilizado para a

leitura da quantidade inicial de bactérias em espectrofotômetro Bel Photonics® S-05, em uma

15

DO de 600 nm. Posteriormente, as amostras foram colocadas em uma placa de microtitulação,

em duplicata, e irradiadas a 5 cm de distância da fonte, durante 30 min, por um sistema de

irradiação constituído por uma lâmpada halógena (500 W), de baixo custo, emitindo em toda a

região do visível do espectro eletromagnético, de 470 a 750 nm, conforme descrito por Almeida

et al.19

. Todas as amostras foram irradiadas numa intensidade de 180 mW/cm2.

Para evitar o aquecimento da amostra foi usado um filtro de água acoplado à saída

da fonte. Como controle, para avaliar o crescimento de forma natural da bactéria, foi utilizada a

cultura bacteriana sem a presença de PS e sem irradiação. Para a avaliação apenas da ação da

luz sobre o patógeno, foi utilizada a cultura bacteriana sem a presença de PS e com irradiação.

E para a avaliação apenas da ação do PS sobre o patógeno, outro controle foi realizado com a

cultura bacteriana juntamente com o PS e sem irradiação.

Em seguida, 250 µl de cada amostra e suas duplicatas foram adicionadas

separadamente a tubos de ensaio de vidro contendo 1 ml de meio EMJH para avaliar o

crescimento da cultura em estufa com temperatura controlada a 29,3º C, durante sete dias. Após

esse período, uma alíquota de cada amostra foi plaqueada em meio LB Ágar para identificação

de possível contaminação com outro microrganismo, caso houvesse contaminação, a amostra

era descartada e refeita; para a avaliação da eficiência da PDI, 30 µl das amostras foram

submetidas à microscopia de campo escuro; e 1ml das amostras foram lidas em

espectrofotômetro utilizando uma DO 600nm.

Com o PS considerado mais eficiente, isto é, àquele que inativou grande parte das

bactérias, foi realizado o experimento novamente, com o tempo de 60 min de irradiação para a

avaliação do efeito do tempo de irradiação sobre a viabilidade das bactérias. Testou-se também

nesse tempo outro PS chamado azul de metileno (MB). Os melhores PSs identificados para a

inativação fotodinâmica da Leptospira foram utilizados posteriormente para os ensaios com os

oócitos selecionados.

5.5. Soluções e composição de meios para a PIVE

Os meios de maturação, fecundação, CAP e cultivo utilizados foram adquiridos da

empresa Progest Biotecnologia em Reprodução e Saúde Animal Ltda, previamente testados

com ovários de abatedouro. As demais soluções foram preparadas no laboratório.

5.6. Composição dos meios para PIVE

5.6.1. Meio de maturação - MIV

16

Meio TCM 199 com sais Earle e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand

Island, NY, USA) suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v), 0,2 mM piruvato, 5 mg/ml

hormônio luteinizante (Lutropin-V®, Bioniche Co., Belleville, ON, Canada), 1 mg/ml

hormônio folículo estimulante (Folltropin®, Bioniche Co., Belleville, ON, Canada), 75 µg/ml

amicacina e 1 mM cistamina.

5.6.2. Meio de maturação de bancada – MIV t

Meio TCM 199 com sais de Hank´s e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand

Island, NY, USA) tamponado com Hepes e suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v), 0,2

mM piruvato, 5 mg/ml hormônio luteinizante (Lutropin-V®, Bioniche Co., Belleville, ON,

Canada), 1 mg/ml hormônio folículo estimulante (Folltropin®, Bioniche Co., Belleville, ON,

Canada), 75 µg/ml amicacina e 1 mM cistamina.

5.6.3. Meio de fecundação

TALP-FIV suplementado com 6 mg/mL albumina sérica bovina livre de ácido

graxo, 0,2 mM piruvato, 30 µg/ml heparina, 20 µM penicilamina, 10 µM hipotaurina, 1,0 µM

epinefrina e 75 µg/ml amicacina.

5.6.4. Meio CAP

Meio tamponado Tyrode's HEPES, suplementado com 0,2 mM piruvato e 75 µg/ml

amicacina.

5.6.5. Meio de cultivo

SOFaa83

suplementado com 2,7 mM mio-inositol, 0,2 mM piruvato, 2,5% soro fetal

bovino (v/v), 5 mg/mL albumina sérica bovina livre de ácido graxo, 75 µg/ml amicacina.

5.6.6. Meio LAV de bancada

Meio TCM 199 com sais Hank´s e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand

Island, NY, USA) suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v).

5.7. Inativação Fotodinâmica de oócitos

17

5.7.1. Colheita de oócitos

As amostras de ovários de vacas mestiças (Bos indicus x Bos taurus) foram doadas

por frigorífico sob Serviço de Inspeção Federal (SIF), localizado na microrregião de Goiânia.

Os ovários foram colhidos no momento do abate e armazenados em garrafa térmica

contendo aproximadamente 500 ml de solução salina esterilizada (0,9%) pré-aquecida à

temperatura média de 35°C, e mantidos à mesma temperatura por um período máximo de

quatro horas até o momento da aspiração dos folículos para retirada do líquido folicular e

seleção dos oócitos.

As aspirações dos folículos com 3 a 8 mm de diâmetro ocorreram manualmente,

empregando-se seringa de 10 ml e agulha 40x1,2 mm, ambas descartáveis, para a retirada dos

complexos cumulus-ovócitos (CCO´s), também chamados de oócitos. Estes foram

armazenados em tubos cônicos e mantidos em banho-maria a 36 °C por 10 min até a

decantação.

Os CCO´s foram classificados segundo Stojkovic et al.84

e separados com

qualidade grau 1 e 2 em grupos de 15-20, também em duplicata (G1 a G8).

A colheita foi realizada em dois momentos, a primeira para a realização do

experimento na qual a inativação fotodinâmica fora realizada em CCO´s imaturos, e a segunda

para a realização do experimento na qual a inativação fotodinâmica fora realizada em CCO´s já

maturados.

5.7.2. PDI de CCO´s imaturos

Este experimento foi realizado concomitantemente à parte final da PDI das

leptospiras e a PDI dos CCO´s foi realizada no mesmo dia da coleta, dia chamado de DC.

Posteriormente à classificação e avaliação morfológica em estereomicroscópio (Av

1), o grupo G1 e G2 foram transferidos para uma placa de petri contendo gotas de 150 μl de

meio de maturação (MIV) e incubados em estufa a 38,5 °C em atmosfera de 5% de CO2 e

umidade relativa saturada sem condensação. Uma vez que os CCO´s destes grupos não se

submeteram a nenhum tipo de tratamento, os grupos G1 e G2 foram chamados de Controle da

estufa (Cont estufa).

Os grupos G3 a G8 foram avaliados em estereomicroscópio (Av 1) e levados em

meio de maturação de bancada (MIV t) ao tratamento de PDI por 60 min, com mesma distância

e fonte de luz utilizada no experimento realizado com as leptospiras. As amostras foram

colocadas em uma placa de microtitulação num volume final de 250 µl, e posteriormente

também transferidas à placa de petri contendo meio de maturação e incubadas por iguais

18

condições aos grupos G1 e G2. Os grupos G3 e G4 foram tratados somente com a luz, por isso

foram chamados de Controle da luz (Cont luz); os grupos G5 e G6 foram tratados com MB

numa concentração final de 10 µM e irradiados, denominados assim de Tratados MB (Trat

MB); e os grupos G7 e G8 foram tratados com ZnTMPP também numa concentração final de

10 µM e irradiados, chamados portanto de Tratados ZnTMPP (Trat ZnTMPP).

Após as irradiações, os grupos tratados (G3 a G8) foram avaliados novamente (Av

2), lavados em dez gotas de meio LAV de bancada e posteriormente transferidos para uma

placa de petri contendo gotas de 150 μl de meio de maturação e incubados em estufa a 38,5 °C

em atmosfera de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação.

Após 22 horas, dia chamado de D0, realizou-se mais uma avaliação (Av 3 para

tratados e Av 2 para não tratados) e todos os grupos (G1 a G8) foram transferidos para gotas de

150 µl de meio de fecundação cobertas com óleo mineral.

O sêmen utilizado foi o de um touro holandês de fertilidade conhecida. O material

foi descongelado a 37 °C por 30 s, depositado sobre coluna de gradiente Percoll 45-90%85

e

centrifugado a 700 g por 5 min. O sedimento de espermatozóides foi ressuspendido em 1,0 ml

de meio CAP e centrifugado a 700 g por 3 min. O pellet formado foi diluído em 100 μl de meio

de fecundação. Após observação da motilidade e do vigor, cada gota foi fertilizada com uma

concentração final de 1,0 x 106 espermatozoides vivos/ml. As placas foram incubadas a 38,5 °C

em atmosfera de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação por 18 h, sendo o

dia da inseminação in vitro considerado o D0.

Os possíveis zigotos foram parcialmente desnudados, lavados e transferidos para

gotas de 200 μl de meio de cultivo sob óleo mineral por sete dias (D7) a 38,5 °C em atmosfera

de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação. Durante os sete dias, no D3 foi

realizada mais uma avaliação em estereomicroscópio quanto à clivagem (Av 4 para os tratados

e Av 3 para não tratados), posteriormente procedeu-se com a suplementação do meio de cultivo

(feeding) substituindo-se 50% do volume de cada gota e no D7 foram avaliados pela última

vez quanto a taxa de mórula e blastocisto (Av 5 para tratados e Av 4 para não tratados). A

síntese dos grupos, os tratamentos e dias das avaliações estão demonstrados no Quadro 1.

19

QUADRO 1 - Grupos de CCO´s imaturos, tratamentos e dias de suas avaliações em estereomicroscópio.

Grupo Denominação Tratamento

PS

Tratamento

Luz

DC

após

seleção

DC

após

PDI

D0 D3 D7

G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 NÃO Av 2 Av 3 Av 4

G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 NÃO Av 2 Av 3 Av 4

G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5


G5 Trat MB SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5


G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5


5.7.3. PDI de CCO´s maturados

Este experimento foi realizado após a PDI dos CCO´s imaturos e a irradiação das

amostras foi feita um dia após a coleta, dia chamado de D0.

Posteriormente à classificação e avaliação morfológica em estereomicroscópio (Av

1), os grupos (G1 a G8) foram transferidos para uma placa de petri contendo gotas de 150 μl de

meio MIV e incubados em estufa de igual forma aos CCO´s imaturos. Após 22h de incubados,

dia chamado de D0, avaliou-se novamente todos os grupos (Av 2) e os grupos G3 a G8 (exceto

G1 e G2 - Cont estufa) foram levados em meio MIV t ao tratamento de PDI, desta vez por 30

min. A metodologia para a irradiação dos grupos foi a mesma realizada com os CCO´s

imaturos (G3 e G4 – Cont luz; G5 e G6 – Trat MB; G7 e G8 – Trat ZnTMPP).

Após as irradiações, os grupos tratados (G3 a G8) foram avaliados novamente (Av

3), lavados em dez gotas de meio LAV de bancada e posteriormente transferidos, juntamente

com os grupos G1 e G2, para gotas de 150 µl de meio de fecundação cobertas com óleo

mineral.

O sêmen, a metodologia de descongelamento, a avaliação do material e a

inseminação in vitro foram idênticos ao experimento anterior.

Os possíveis zigotos foram parcialmente desnudados, lavados e transferidos para

gotas de 200 μl de meio de cultivo sob óleo mineral por sete dias (D7) a 38,5 °C em atmosfera

de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação. Durante os sete dias, no D3 foi

realizada mais uma avaliação em estereomicroscópio quanto à clivagem (Av 4 para os tratados

e Av 3 para não tratados), posteriormente procedeu-se com a suplementação do meio de cultivo

(feeding) e no D7 foram avaliados pela última vez quanto a taxa de mórula e blastocisto (Av 5

20

para tratados e Av 4 para não tratados). A demonstração dos grupos, os tratamentos e dias das

avaliações estão sintetizados no Quadro 2.

QUADRO 2 - Grupos de CCO´s maturados, tratamentos e dias de suas avaliações em

estereomicroscópio.

Grupo Denominação Tratamento

PS

Tratamento

Luz

DC

após

seleção

D0

antes

da

PDI

D0

após

a PDI

D3 D7

G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 Av 2 NÃO Av 3 Av 4

G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 Av 2 NÃO Av 3 Av 4







5.8. Análise estatística

Todos os ensaios foram realizados em duplicata. Nos testes realizados com as

bactérias, os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (SD) e para analisar a

diferença entre os tratamentos com as bactérias foi utilizada a Análise de variância (ANOVA),

seguido de teste de Tukey. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente

significativos. Os testes com os oócitos foram analisados de forma descritiva.

21

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. Inativação fotodinâmica da Leptospira

Os tratamentos controle da cultura bacteriana, da luz e dos PSs, estão demonstrados

na Figura 7.

FIGURA 7 - Relação das DOs entre os tratamentos controle pré (dia do

experimento) e pós (sete dias após a manutenção da cultura de

Leptospira hardjo em estufa).

Legenda: Ct Cult – controle da cultura (sem PS, sem luz); Ct Luz –

controle da luz (sem PS, com luz); Ct ZnTMPP - controle do PS

ZnTMPP (com PS, sem luz); Ct TMPP - controle do PS TMPP

(com PS, sem luz); Ct HP - controle do PS HP (com PS, sem luz);

Ct ZnPc - controle do PS ZnPc (com PS, sem luz); Ct AlPc -

controle do PS AlPc (com PS, sem luz); Ct MB - controle do PS

MB (com PS, sem luz); Pré – DO avaliada no dia do tratamento,

após incubação de 1h da cultura em temperatura ambiente; Pós –

DO avaliada sete dias após a manutenção da cultura em estufa; * –

significativo; ns – não significativo.

Os controles da cultura (Apêndice A – Figura 1A) e da luz cresceram de forma

esperada. Além de atestar a viabilidade da cultura bacteriana, esses resultados indicam que a

irradiação na ausência do PS, não afetou o crescimento bacteriano. De igual forma, Wainwright

et al.86

verificaram que a aplicação isolada da luz não afetou o crescimento das amostras de

22

Staphylococcus aureus quando expostas à luz não coerente (Exal light Box), no comprimento

de onda entre 350 e 800 nm, taxa de fluência de 1,7 mW/cm2 por uma hora.

Não houve diferença significativa entre os controles tratados com PSs, exceto o

controle MB, após sete dias de incubação em estufa. Esse dado corrobora com vários

autores52,87-90

que afirmam ser necessária a absorção da luz pelo PS para que se iniciem as

reações fotoquímicas e fotofísicas para a produção de compostos fototóxicos. Contudo, ao

analisar o controle ZnTMPP pôde-se observar que houve uma diferença significativa de

crescimento bacteriano quando comparado ao crescimento do controle da luz. Apesar do

cuidado de se realizar toda esta etapa com a lâmpada do fluxo desligada e os eppendorfs terem

sido envolvidos por papel laminado, neste caso provavelmente pode ter havido entrada de luz

ao pipetar as soluções fazendo com que o PS ZnTMPP fosse ativado realizando a PDI em

algumas bactérias, que por sua vez, podem ter sofrido morte celular.

No gráfico observa-se também uma diferença significativa do controle MB frente

aos outros controles com PSs. Usacheva et al.91

constataram que a permanência do MB por

uma hora, nas concentrações de 4 e 200 µM, sem aplicação da luz, apresentou efeito

bactericida contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O mesmo efeito foi observado

nas concentrações de 44 a 230 µM. Isso se deve ao fato desse corante ser naturalmente

hidrofílico e poder passar através dos canais de proteína, que são preenchidos por água, da

membrana externa das bactérias. O baixo peso molecular, a carga positiva e a hidrofilia do MB

permitem a este penetrar com sucesso a membrana plasmática bacteriana.

Quando avaliada a ação dos PSs irradiados sobre as bactérias in vitro, podemos

observar que as bactérias do controle TMPP cresceram de forma esperada, ou seja, o PS não

apresentou nenhuma toxicidade no escuro (Figura 8).

23

FIGURA 8 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do

experimento) e pós (sete dias após a manutenção da

cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS TMPP

irradiado por 30 min.

Legenda: Ct TMPP - controle do PS TMPP (com PS,

sem luz); TMPP – tratamento com TMPP (com PS,

com luz); Pré – DO avaliada no dia do tratamento,

após incubação de 1h da cultura em temperatura

ambiente; Pós – DO avaliada sete dias após a

manutenção da cultura em estufa; * – significativo.

Observa-se também que o tratamento com TMPP, na irradiação de 30 min, foi

eficaz na diminuição da carga microbiana. As meso-porfirinas tem se mostrado bastante

eficientes na PDI de vários patógenos e a TMPP é uma delas92,93

. Devido à substituição de

carbonos na posição meso, as meso-porfirinas passam a ter cargas e a ter um caráter mais

lipofílico, isto faz com que haja uma maior interação entre o PS e as membranas dos patógenos,

visto que são lipoproteicas, melhorando a eficácia da fotoinativação94,95

.

A TMPP tem carga positiva e os PSs catiônicos têm se mostrado mais eficientes no

controle de bactérias Gram-negativas devido à interação eletrostática que ocorre entre eles e os

grupos funcionais carregados negativamente, característicos dos fosfolipídeos presentes na

superfície celular96

. Essa interação foi também referida por Casteel et al.97

que avaliaram a

eficácia da TMPP, numa concentração de 0,01 µM e taxa de fluência de 2,2 mW/cm2 contra o

vírus da Hepatite A (RNA, fita simples, não envelopado). Os autores atribuíram o ótimo

24

resultado do tratamento à atração eletrostática entre as porfirinas catiônicas e os capsídeos

virais carregados negativamente.

O tratamento com ZnTMPP, na irradiação de 30 min, foi tão eficiente na

diminuição da carga microbiana que houve uma diferença significativa à de DO de entrada. A

alta intensidade da ação fotodinâmica pode ter levado à uma desagregação das moléculas da

bactéria, diminuindo a absorção da luz no comprimento de onda utilizado (Figura 9).


experimento) e pós (sete dias após a manutenção

da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS

ZnTMPP irradiado por 30 min.

Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP

(com PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com

ZnTMPP (com PS, com luz); Pré – DO avaliada

no dia do tratamento, após incubação de 1h da

cultura em temperatura ambiente; Pós – DO

avaliada sete dias após a manutenção da cultura

em estufa; * – significativo.

Esse tratamento culminou na destruição de grande quantidade de bactérias,

observado em microscopia de campo escuro (Apêndice A – Figura 1B).

Pavani et al.98

constataram que as porfirinas metaladas apresentam melhores

resultados quando comparadas com as porfirinas de base livre, uma vez que o metal no anel

central da porfirina diminuiu a ligação com a mitocôndria celular e aumentou as interações com

a membrana. Em síntese, a metalização aumenta a eficiência fotodinâmica.

25

Nas amostras tratadas com a HP, podemos observar um aumento da DO do controle

e do tratado. Apesar de haver diferença significativa entre elas, os dados demonstram a

ineficiência do tratamento desse PS na cultura testada. Tal fato fora também observado em

microscopia de campo escuro (dados não demonstrados) (Figura 10).




HP irradiado por 30 min.

Legenda: Ct HP - controle do PS HP (com PS, sem

luz); HP – tratamento com HP (com PS, com luz);

Pré – DO avaliada no dia do tratamento, após

incubação de 1h da cultura em temperatura


manutenção da cultura em estufa; * – significativo.

A HP utilizada em nosso experimento foi um derivado da HP (HPD). Esse

composto é uma mistura e foi criada no intuito de se obter uma substância mais refinada, de

maneira a conseguir resultados mais reprodutíveis e confiáveis99

.

Eaglesome et al.100

, no intuito de obterem um PS que pudesse desinfectar sêmen

bovino, testaram o tratamento da HP e da HPD em algumas culturas de microrganismos, dentre

elas a de Leptospira pomona e de Leptospira hardjo. Ambas foram incubadas, separadamente,

com as culturas por 15 min e irradiadas posteriormente com luz de laser hélio/neon

(comprimento de onda 632,8 nm) com potência de 7,3 mW até atingir a taxa de fluência de

0,068 J/cm2. Os autores verificaram que tanto a HP quanto a HPD não foram eficazes de

26

eliminar estes microrganismos. Entretanto, neste mesmo estudo, tais porfirinas foram testadas

também em outros microrganismos como o BHV- 1, BVDV, M. bovigenitalium, M. canadense,

e U. diversum, porém em outras condições, e verificaram que esses compostos obtiveram

sucesso em reduzir os microrganismos a níveis não detectáveis.

Diferentes porfirinas têm diferentes propriedades fotossensibilizadoras. É de

considerável interesse separar os componentes da HPD para identificá-los quimicamente e

conhecer suas propriedades físicas, possibilitando assim a determinação de suas propriedades

individuais. Todavia, apesar de numerosos estudos no sentido de identificar todos os

componentes da mistura HPD, ainda há uma quantidade de impurezas, pequena em

porcentagem, mas não identificadas. Acredita-se que os componentes desta mistura ultrapassem

de 100 porfirinas.

Diante do exposto, a impureza do composto, a concentração de HP utilizada e o

tempo de irradiação, bem como a fonte de luz podem ter influenciado para o insucesso da

técnica, nestas condições. Mantareva et al.101

relataram que a dose de luz e concentração do PS

são essenciais na PDI, uma vez que foi observada variações entre diferentes microrganismos.

Em nosso estudo foi utilizada a concentração de 10 µM do PS e taxa de influência de 180

mW/cm2.

Em resumo, dentre as porfirinas irradiadas por 30 min, destacaram-se a TMPP e a

ZnTMPP na diminuição da carga microbiana (Figura 11). Apesar de ambas não terem

diferenças significativas em seus resultados, o tratamento com ZnTMPP obteve uma melhor

destruição celular (dados observados em microscopia de campo escuro, porém não

demonstrados). E o tratamento com a HP não foi eficiente na diminuição da carga microbiana.

27

FIGURA 11 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias

após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em

estufa) das porfirinas TMPP, ZnTMPP e HP

irradiadas por 30 min.

Legenda: TMPP – tratamento com TMPP (com PS,

com luz); ZnTMPP – tratamento com ZnTMPP (com

PS, com luz); HP – tratamento com HP (com PS, com

luz); Pós – DO avaliada sete dias após a manutenção

da cultura em estufa; * – significativo; ns – não

significativo.

Além das porfirinas, outro grupo de PSs foram também avaliados na irradiação de

30 min, os resultados dos testes com as ftalocianinas ZnPc e AlPc estão demonstrados na

Figura 12.

28

FIGURA 12 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete dias

após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) dos PSs ZnPc (em

A) e AlPc (em B) irradiados por 30 min.

Legenda: Ct ZnPc - controle do PS ZnPc (com PS, sem luz); ZnPc – tratamento

com ZnPc (com PS, com luz); Ct AlPc - controle do PS AlPc (com PS, sem luz);

AlPc – tratamento com AlPc (com PS, com luz); Pré – DO avaliada no dia do

tratamento, após incubação de 1h da cultura em temperatura ambiente; Pós – DO

avaliada sete dias após a manutenção da cultura em estufa; * – significativo; ns –

não significativo.

As bactérias dos controles das duas ftalocianinas cresceram de forma esperada. E

ao analisar os gráficos, observa-se que ambos os tratamentos não foram eficazes. As amostras

tratadas foram levadas à microscopia de campo escuro, onde pôde-se observar ainda uma alta

motilidade das bactérias no meio de cultura (dados não demonstrados).

A ZnPc e a AlPc utilizadas neste experimento foram as zinco-

tetracarboxiftalocianina (ZnTcPc) e alumínio-tetracarboxiftalocianina (AlTcPc). Ambas

possuem carga negativa, então uma hipótese seria a ineficiência da interação eletrostática que

ocorreria entre os PSs e os grupos funcionais também carregados negativamente presentes na

superfície celular de bactérias Gram-negativas96

.

As substâncias podem também ter sofrido agregação, uma vez que as ftalocianinas

são compostos sintéticos que podem se ligar a várias moléculas, inclusive aos metais zinco e

alumínio, e serem substituídas por diferentes componentes na periferia. A substituição

periférica do anel da ftalocianina (sulfonação) determina a solubilidade do corante, a

lipofílicidade, a quantidade de cargas periféricas, o tamanho da molécula e, por conseguinte, a

captação e a retenção celular79,80

. Em síntese, quanto maior o número de sulfonados, menor

será sua lipofilicidade, não permitindo uma penetração celular suficiente e consequentemente

um menor poder fotossensibilizador102

.

29

Ademais, a depender do pH do meio, alguns complexos de metalo-ftalocianinas,

podem sofrer agregação devido às interações entre os orbitais de moléculas adjacentes. As

agregações, por sua vez diminuem a quantidade de oxigênio singleto, um dos responsáveis pela

destruição celular103

. Souza et al.103

observaram que a ZnTcPc apresentou-se em estado

desagregado em pH 3 e 4, e agregado nos demais. Já a AlTcPc apresentou-se em estado

desagregado apenas em pH 14. Além disso, se mostrou insolúvel na faixa de pH de 3 a 5.

Alguns solventes são capazes de afetar o processo de agregação nesses complexos.

Solventes orgânicos, por exemplo, são responsáveis por reduzir o processo de agregação,

enquanto, solventes aquosos conduzem a complexos altamente agregados104,105

. O meio EMJH

possui pH final de 7,5 ± 0,2, podendo provavelmente favorecer a agregação desses corantes,

aumentando a ineficiência da PDI.

No intuito de garantir a destruição total das células bacterianas, foi testado o PS que

obteve a melhor eficiência, irradiado por um período mais longo. Neste caso a irradiação da

ZnTMPP foi avaliada por um período de 60 min (Figura 13), uma vez que no tratamento com

30 min algumas bactérias foram ainda visualizadas em microscopia de campo escuro com uma

baixa motilidade.

30




ZnTMPP irradiado por 60 min.

Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP

(com PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com

ZnTMPP (com PS, com luz); Pré – DO avaliada no

dia do tratamento, após incubação de 1h da cultura

em temperatura ambiente; Pós – DO avaliada sete

dias após a manutenção da cultura em estufa; * –

significativo.

Assim, como no teste com irradiação de 30 min, o tratamento com ZnTMPP

irradiado por 60 min, foi bastante eficiente na diminuição da carga microbiana havendo

também uma diferença significativa em relação a DO de entrada. O tratamento culminou na

destruição de grande quantidade de bactérias, da mesma forma de quando irradiado por 30 min,

não havendo portanto, diferença significativa nos resultados da ZnTMPP irradiada por 30 e 60

min. As bactérias do controle ZnTMPP, mais uma vez cresceram de forma esperada (Figura

14).

31


experimento) e pós (sete dias após a manutenção da

cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS ZnTMPP

irradiado por 30 e 60 min.

Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP (com

PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com ZnTMPP

(com PS, com luz); Pré – DO avaliada no dia do

tratamento, após incubação de 1h da cultura em

temperatura ambiente; Pós – DO avaliada sete dias após

a manutenção da cultura em estufa; ns – não

significativo.

Apesar de ter conseguido os parâmetros adequados utilizando com o PS ZnTMPP e

o tempo de 30 min para a fotoinativação da Leptospira interrogans sorovar hardjo, resolveu-se

avaliar também um sexto PS por 60 min de irradiação, o fenotiazínico MB. Isso porque, o PS

em questão possui uma acessibilidade maior e menor custo, quando comparado aos demais PSs

testados neste estudo (Figura 15).

32




MB irradiado por 60 min.

Legenda: Ct MB - controle do PS MB (com PS,

sem luz); MB – tratamento com MB (com PS,

com luz); Pré – DO avaliada no dia do

tratamento, após incubação de 1h da cultura em

temperatura ambiente; Pós – DO avaliada sete

dias após a manutenção da cultura em estufa; * –

significativo; ns – não significativo.

Mesmo havendo uma diferença significativa do controle MB frente aos outros

controles com PSs (dados anteriormente demonstrados e discutidos – Figura 7), ainda pôde-se

observar um crescimento bacteriano. Apesar de não ter havido diferença significativa em

relação à DO de entrada controle pré, na amostra tratada com MB foi verificado um decréscimo

da carga bacteriana (dados observados também por microscopia de campo escuro - Apêndice A

– Figura 1C) em relação ao Ct MB Pós. A motilidade das bactérias foi comparada ao

tratamento pós da ZnTMPP.

O MB é um composto positivo. Por ser uma molécula catiônica, o MB pode ter se

ligado aos fosfolipídeos constituintes das paredes celulares. Os danos aumentam a

permeabilidade das membranas e facilita a penetração do PS para o interior das células

bacterianas ocasionando destruição do conteúdo interno106

. Quanto maior a habilidade do PS

difundir-se através da membrana, maior será o grau de destruição bacteriana.

A Figura 16 demonstra a eficiência dos tratamentos com a ZnTMPP e o MB, ambos

irradiados por 60 min.

33

FIGURA 16 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias

após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em

estufa) da ZnTMPP e MB irradiadas por 60 min.

Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP (com

PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com ZnTMPP

(com PS, com luz); Ct MB - controle do PS MB (com

PS, sem luz); MB – tratamento com MB (com PS,

com luz); Pré – DO avaliada no dia do tratamento,

após incubação de 1h da cultura em temperatura


manutenção da cultura em estufa; * – significativo; ns

– não significativo.

A DO de entrada dos controles de ambos PSs foram equivalentes. A carga

bacteriana dos controles de ambos cresceu de forma esperada após sete dias, todavia há

destaque de um menor crescimento do controle MB indicando seu efeito bactericida mesmo

sem a presença de luz91

. Apesar dos dois tratamentos terem sido eficientes, o tratamento com

ZnTMPP foi mais efetivo (dado comprovado em microscopia de campo escuro) (Apêndice A –

Figura 1).

6.2. Inativação Fotodinâmica de CCO´s imaturos

Denominamos CCO´s imaturos os CCO´s que não atingiram o estágio da metáfase

II. In vivo, a maturação meiótica do oócito ocorre próxima à ovulação, quando o folículo atinge

o seu diâmetro folicular máximo, mas in vitro a maturação meiótica inicia-se imediatamente

34

após a remoção do oócito do interior do folículo42

. Autores confirmam que a maioria dos

oócitos atingem a metáfase II, estágio da maturação nuclear, somente após 16-20 h de iniciado

a meiose107,108

. Cerca de 80 a 90% dos oócitos completam a maturação nuclear in vitro109

.

Neste estudo, a PDI das amostras dos grupos foi realizada seis horas após iniciada a aspiração

dos CCO´s.

Não houve diferenças morfológicas visualizadas em estereomicroscópio em

nenhum grupo tratado, quando comparados aos grupos controles. As figuras Av 1 a Av 5 de

cada grupo podem ser observadas no Apêndice B.

Considerando como parâmetros médios para PIVE o percentual de clivagem de 85

a 90% e percentual de produção de embriões de 32,9 a 41,2%4(dados de PIVE com sêmen

convencional e CCO’s provindos de Aspiração folicular guiada por ultrassom - OPU), os

percentuais de clivagem dos controles foram satisfatórios (80 a 100%) e o de produção de

embriões (20-33%) levemente abaixo do considerável médio para a técnica (Quadro 3).

35

QUADRO 3 - Grupos de CCO´s imaturos e os dias de suas avaliações em estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e

percentuais de clivagem e embriões por grupo.

% clivada – clivados/total incub.; % embriões – prod. embrião/total incub.

Grupo Denominação Trat.

PS

Trat.

Luz

DC

após

seleção

Total

selec.

DC

após

PDI

Total

incub.

D0 D3 Total

cliv.

%

cliv.

D7 Total

prod.

emb.

%

emb.

G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 15 NÃO 15 Av 2 Av 3 13 86% Av 4 5 33%

G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 15 NÃO 15 Av 2 Av 3 15 100% Av 4 5 33%

G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 15 Av 2 15 Av 3 Av 4 12 80% Av 5 3 20%

G4 Cont luz NÃO SIM Av 1 15 Av 2 15 Av 3 Av 4 14 93% Av 5 5 33%

G5 Trat MB SIM SIM Av 1 15 Av 2 14 Av 3 Av 4 12 85% Av 5 0 0%

G6 Trat MB SIM SIM Av 1 15 Av 2 13 Av 3 Av 4 9 69% Av 5 2 15%

G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 15 Av 2 15 Av 3 Av 4 10 66% Av 5 0 0%

G8 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 15 Av 2 14 Av 3 Av 4 10 71% Av 5 0 0%

36

Apesar de ter sido realizada a classificação dos CCO’s para posteriormente levá-los

ao cultivo in vitro, acredita-se que estas células possam ter vindo com qualidade intrínseca

inferior, culminando na baixa produção dos grupos controles.

Dentre as várias diferenças existentes entre os embriões produzidos in vitro e os

produzidos in vivo (em relação ao metabolismo, à morfologia, à densidade, ao número de

células e às características de ZP), a qualidade dos produzidos in vitro é inferior109

. Há uma

relação estrita entre a qualidade do embrião gerado e a qualidade do oócito que o produziu.

A qualidade da população de CCO’s é determinada pela técnica de coleta de

oócitos utilizada. No caso da OPU, a maioria dos CCO’s são provindos de folículos crescentes

e saudáveis110

, bem como de animais previamente selecionados com idades111,112

e escores

ideais109

. Todavia, os CCO’s aspirados de ovários provindos de abatedouro podem vir de todos

os estádios possíveis do folículo (em fase de dominância, em sua regressão, ou atrésica de

desenvolvimento), uma vez que as doadoras se encontram em diferentes escores, idades e

ciclos estrais110

.

Entretanto, ao comparar os percentuais de clivagem (66 a 85%) e de produção de

embriões dos grupos controles com os grupos tratados (0 a 15%), percebemos um considerável

decréscimo dos números destes últimos. Neste caso, além da qualidade inferior dos oócitos, a

baixa produção de embriões provavelmente baseia-se no déficit de maturação das células, uma

vez que está bem estabelecido que a taxa de produção de embriões se relaciona, além da

qualidade intrínseca do oócito, às condições de maturação113,114

.

A PDI pode ter ocasionado modificações (bioquímicas e microestruturais) de

grande parte das células do cumulus que envolvem os CCO´s, que por sua vez, são células

somáticas cuja participação é ativa no mecanismo de crescimento e maturação dos oócitos.

Apesar das células do cumulus não serem essenciais para a maturação nuclear dos oócitos, a

maturação citoplasmática é bastante comprometida na ausência desse tipo celular42

, que por sua

vez é de fundamental importância para o desenvolvimento embrionário115

.

Outro fator analisado foi o tempo de exposição das amostras à irradiação. Talvez

em irradiações mais curtas que 60min os percentuais de embriões tivessem sido melhores.

Os dados deste estudo comprovam que a PDI diminuiu a percentagem de estruturas

clivadas, bem como a percentagem de embriões viáveis nos grupos tratados com MB e

ZnTMPP. Apesar de não ter havido diferenças morfológicas em ambos os grupos tratados, o

MB e o ZnTMPP foram prejudiciais, nas condições experimentais utilizadas, para os CCO´s

imaturos.

37

6.3. Inativação Fotodinâmica de CCO´s maturados

Neste estudo, a PDI foi realizada quando os CCO´s já haviam atingido o estágio da

metáfase II.

Assim como no estudo anterior, não houve diferenças morfológicas visualizadas em

estereomicroscópio em nenhum grupo tratado, em relação aos grupos controles. As figuras Av

1 a Av 5 de cada grupo podem ser observadas no Apêndice C.

Pôde-se observar (Quadro 4), que todos os grupos, exceto o G5, tiveram bons

índices de clivagem (80 a 95%). Entretanto, todos os grupos tratados, inclusive o G5, obtiveram

percentuais de produção de embriões (36 a 61%) dentro dos parâmetros consideráveis médios

para a técnica.

38

QUADRO 4 - Grupos de CCO´s maturados e os dias de suas avaliações em estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e

percentuais de clivagem e embriões por grupo.

Grupo Denominação Trat.

PS

Trat.

Luz

DC

após

seleção

Total

selec.

D0

antes

da

PDI

D0

após

a PDI

Total

incub.

D3 Total

cliv.

%

cliv.

D7 Total

prod.

emb.

%

emb.

G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 20 Av 2 NÃO 20 Av 3 19 95% Av 4 5 25%

G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 20 Av 2 NÃO 19 Av 3 18 94% Av 4 6 31%

G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 21 Av 2 Av 3 21 Av 4 19 90% Av 5 18 85%

G4 Cont luz NÃO SIM Av 1 22 Av 2 Av 3 22 Av 4 20 90% Av 5 10 45%

G5 Trat MB SIM SIM Av 1 20 Av 2 Av 3 19 Av 4 13 68% Av 5 7 36%

G6 Trat MB SIM SIM Av 1 22 Av 2 Av 3 21 Av 4 20 95% Av 5 13 61%

G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 22 Av 2 Av 3 22 Av 4 20 90% Av 5 10 45%

G8 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 21 Av 2 Av 3 21 Av 4 17 80% Av 5 8 38%

% clivada – clivados/total incub.; % embriões – prod. embrião/total incub.

39

Os percentuais de produção de embriões do controle luz (45 a 85%) também estão

dentro dos parâmetros esperados indicando que a luz não interfere na qualidade e viabilidade

dos embriões.

Somente os grupos Controle estufa tiveram produção abaixo de 32,9%.

Provavelmente, pode ter havido um atraso da FIV nesses grupos, uma vez que ao aguardar a

irradiação dos outros grupos, para então se iniciar o procedimento, os grupos Controle estufa

foram deixados incubados por mais tempo aumentando, portanto, a duração da maturação.

Gasparrini et al.116

observaram que as taxas de clivagem e de blastocistos

diminuem linearmente com o aumento da duração da maturação in vitro, constatando que o

atraso da FIV tem significante comprometimento no desenvolvimento embrionário.

Os dados deste estudo, portanto, nos indicam que a PDI não afetou a percentagem

de estruturas clivadas, e nem mesmo a percentagem de embriões viáveis nos grupos tratados

com MB e ZnTMPP. Tanto o MB quanto o ZnTMPP não foram prejudiciais para CCO´s

maturados, nas condições experimentais. A irradiação por apenas 30 min também pode ter sido

relevante para o sucesso da técnica.

40

7. CONCLUSÃO

A inativação fotodinâmica da Leptospira interrogans sorovar hardjo se apresentou

eficiente para três dos seis fotossensibilizadores testados neste estudo: TMPP, ZnTMPP e MB,

e dentre eles, a porfirina metalada foi a que obteve melhores resultados.

Os tempos de irradiação de 30 min e de 60 min foram eficazes na inativação

fotodinâmica das leptospiras com ZnTMPP.

Apesar de não ter havido diferenças morfológicas nos CCO´s imaturos pós-

tratamento, os fotossensibilizadores MB e ZnTMPP foram prejudiciais para as estruturas

celulares diminuindo a produção de embriões.

Não houve diferenças morfológicas nos CCO´s maturados pós-tratamento. Tanto o

MB quanto o ZnTMPP não foram prejudiciais para as estruturas celulares evidenciada pela

produção de embriões esperada.

Acredita-se que a técnica poderá vir a ser um potencial método para o controle de

microrganismos em oócitos. Isso poderia evitar o uso de antibióticos na PIVE e

consequentemente a resistência microbiana.

41

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APÊNDICE A - Teste com a Leptospira interrogans sorovar hardjo. Controle da cultura e Tratados com ZnTMPP e MB.

FIGURA 1 – Teste PDI em Leptospira interrogans sorovar hardjo. Resultados observados em microscopia de campo escuro após sete dias de incubação em

estufa. A) Controle da cultura sem PS e sem irradiação. 10x; B) Tratamento com ZnTMPP por 30 min. 20x; C) Tratamento com MB por 60 min.

20x.

APÊNDICE B - Grupos de CCO´s imaturos e suas avaliações em estereomicroscópio (AV1 a

AV5).

APÊNDICE C - Grupos de CCO´s maturados e suas avaliações em estereomicroscópio (AV1

a AV5).

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO


PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO

COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS/CEUA

Comissão de Ética no Uso de Animais/CEUA

Pró-Reitoria de Pesquisa e Inovação/PRPI-UFG, Caixa Postal: 131, Prédio da Reitoria, Piso 1, Campus Samambaia (Campus II) -

CEP:74001-970, Goiânia – Goiás, Fone: (55-62) 3521-1876.

Email: [email protected]

Goiânia, 19 de dezembro de 2016.

PARECER CONSUBSTANCIADO REFERENTE AO PROJETO DE PESQUISA DO

PROTOCOLO N. 086/2016

I - Finalidade do projeto de pesquisa: Mestrado

II - Identificação:

Data de apresentação a CEUA: 03/10/16

Título do projeto: Avaliação do efeito da inativação fotodinâmica sobre a Leptospira interrogans em

oócitos bovinos artificialmente infectados

Pesquisador Coordenador no SAP: Guilherme Rocha Lino de Souza

Pesquisador Responsável/ Unidade: Guilherme Rocha Lino de Souza/ Instituto de Ciências Biológicas

(ICB/UFG)

Pesquisadores Participantes: Denize Silva Brazil e Valéria de Sá Jayme

Médico Veterinário/CRMV: Denize Silva Brazil/4188

Unidade onde será realizado: Instituto de Ciências Biológicas (ICB/UFG)

III - Objetivos e justificativa do projeto:

Objetivos gerais Inativar pelo método da PDI a L. interrogans sorovar hardjo emoócitos bovinos infectados

artificialmente. Objetivos específicos 1. Testar diferentes classes de fotossensibilizadores para a inativação fotodinâmica da L. interrogans sorovar hardjo.

2. Avaliar diferentes tempos de irradiação na inativação fotodinâmica da Leptospira em uma concentração de 10 μM

de cada fotossensibilizador.

3. Realizar a infecção experimental de oócitos bovinos com diferentes concentrações de cultura bacteriana.

4. Realizar a inativação fotodinâmica com o fotossensibilizador e o tempo de escolha em oócitos artificialmente

infectados.

5. Avaliar a integridade dos oócitos pós-inativação fotodinâmica.

De acordo com os autores, entre as enfermidades da esfera reprodutiva, a leptospirose merece destaque. A doença

causa consideráveis perdas econômicas em decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade, repetições de cio,

nascimento de bezerros fracos ou prematuros, natimortos e queda da produção de leite nos bovinos. Além de assumir

um papel relevante na área da saúde animal, destaca-se também do ponto de vista da Saúde Pública, uma vez que se

trata de uma importante zoonose. A doença pode ser transmitida, dentre outros meios, por FIV quando transferidos

embriões infectados. Portanto a atenção ao sêmen e oócitos deve ser redobrada nesta técnica. Usualmente costuma-se

utilizar antibióticos de amplo espectro para eliminação de patógenos nestes materiais, contudo há uma preocupação

mundial quanto ao desenvolvimento da resistência aos antibióticos pelos microrganismos. Portanto, a PDI pode vir

como substituição ao uso de antibióticos por conseguir eliminar vários tipos de patógenos e por, seguramente, não

desenvolver nenhum tipo de resistência. Além disso, ao utilizar PSs de baixo custo a técnica torna-se totalmente

viável.









IV - Sumário do projeto:

Discussão sobre a possibilidade de métodos alternativos e necessidade do número de animais:

Não se aplica.

Prevê Projeto Piloto: Não

Espécie animal utilizada/ número total de animais/ Número de animais por tratamento ou grupo

experimental:

Ovários de 50 fêmeas Bos tauros-indicus coletados em frigorífico.

Descrição do animal utilizado (Explicitar: espécie/ linhagem/ sexo (informar número por sexo)/

peso e/ou idade etc): ovários de 50 fêmeas Bostauros-indicus, pesando aproximadamente 350kg e com

idades entre 24 a 48 meses.

Fonte de obtenção do animal: Frigorífico JBS - Goiânia

Descrição das instalações utilizadas e número de animais/área/qualidade do ambiente (ar,

temperatura, umidade), alimentação/hidratação: Não se aplica.

Utilização de agente infeccioso/gravidade da infecção a ser observada e análise dos riscos aos

pesquisadores/alunos: Incubação de Leptospira Interrogans, sorovar: Hardjo, nas concentrações de 10,

10-2 e 10-4.

Procedimentos experimentais do projeto de pesquisa: Colheita dos ovários no frigorífico, aspiração

dos oócitos e manutenção in vitro, cultivo da L. interrogans, incubação do cultivo de L. interrogans com

os oócitos em diferentes concentrações, utilização dos fotossensibilizadores em diferentes tempos de

irradiação, avaliação da estrutura dos oócitos após inoculação e uso de fotossensibilizadores.

Métodos utilizados para minimizar o sofrimento e aumentar o bem-estar dos animais antes,

durante e após a pesquisa. Pontos Finais Humanitários: Não se aplica

Grau de invasividade: G1

Material utilizado em outros projetos: Não se aplica

Método de eutanásia: Não se aplica, visto que o material a ser utilizado será proveniente da rotina do

abate de bovinos em frigoríficos.

Destino do animal: Os ovários utilizados serão congelados e posteriormente incinerados por empresa

contratada para essa finalidade.

V – Comentários do relator frente às orientações da CEUA:

Quanto aos documentos exigidos pela CEUA/UFG:

O protocolo é composto pela Ficha de Protocolo do Projeto, Certidão de ata, Termo de responsabilidade

por todos os pesquisadores e CD com os itens do protocolo físico gravados em mídia digital.

Quanto aos cuidados e manejo dos animais e riscos aos pesquisadores:

Os animais doadores dos ovários são animais da linha de abate do Frigorífico JBS-Goiânia, que possui

profissionais capacitados na realização do manejo e cuidados dos animais.

Os pesquisadores utilizarão de equipamento de proteção individual quando da manipulação do agente









infeccioso.

VI - Parecer da CEUA:

De acordo com a documentação apresentada à CEUA, consideramos o projeto APROVADO.

Informação aos pesquisadores:

Reiteramos a importância deste Parecer Consubstanciado, e lembramos que a pesquisadora responsável

deverá encaminhar à CEUA-PRPI-UFG o Relatório Final baseado na conclusão do estudo e na incidência de

publicações decorrentes deste, de acordo com o disposto na Lei nº. 11.794 de 08/10/2008, e Resolução

Normativa nº. 01, de 09/07/2010 do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal-CONCEA.

O prazo para entrega do Relatório é de até 30 dias após o encerramento da pesquisa, a qual está prevista para

finalizar suas ações até março de 2017.

VII - Data da reunião: 19/12/2016.

Dra. Marina Pacheco Miguel

Coordenadora da CEUA/PRPI/UFG

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