importante tem tudo

5/10/2018 Importante tem TUDO - slidepdf.com

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Preparación de colorantes

1.

Acido-Alcohol: (decolorante para tinción Ziehl-Neelsen)o Ácido clorhídrico concentrado ..........................................................3 mlo Etanol 95% ....................................................................................97 ml

2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tinción de flagelos.o Azul de metileno................................................................................1 go Agua destilada...............................................................................100 ml

3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples.o Solución de hidróxido potásico al 1%.................................................1 mlo Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 mlo Agua destilada...............................................................................100 ml

4. Colorante para esporas:o Solución acuosa saturada de verde malaquita

5. Colorante para flagelos de Leifson: o Solución A

Fucsina básica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml

o Solución B Ácido tánico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml

o Solución C Cloruro sódico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml

Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de lassoluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado herméticamente enla nevera donde es estable durante varias semanas.

6. Cristal violeta: Para tinción Gram y tinción simple.o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 go Agua destilada.................................................................................100 ml

7. Eosina: Para observación de células sanguíneas.o Eosina...............................................................................................0,3 go Ácido acético glacial......................................................................0,025 mlo Agua destilada...................................................................................100 ml

8. Fucsina diluida: Para tinción Gram y tinción simple.o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 mlo Agua destilada.................................................................................100 ml

9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente.o Fucsina básica......................................................................................1 go Etanol 95%........................................................................................10 mlo Fenol 5% en solución acuosa............................................................100 ml

10. Hematoxilina: Para observación de células sanguíneas.o Hematoxilina.........................................................................................2 go Agua destilada......................................................................................1 l

11. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos.o Ácido láctico.....................................................................................100 mlo Fenol................................................................................................100 g



o Glicerol.............................................................................................200 mlo Agua.................................................................................................100 ml

12. Lactofenol al Azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos.o Solución de azul algodón

Sol. saturada de azul algodón (azul anilina soluble)......................10 ml Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml

Mezclar esta solución con lactofenol a partes iguales13. Lugol: Solución de yodo para tinción Gram.

o Yodo...................................................................................................1 go Yoduro potásico..................................................................................2 go Agua destilada.................................................................................300 ml

14. Orceína A: Tinción de cromosomas.o Orceína................................................................................................2 go Ácido acético.....................................................................................45,8 mlo Ácido clorhídrico 1 mol/l......................................................................8,3 mlo Agua..................................................................................................45,8 ml

15. Orceína B: Tinción de cromosomas.o Orceína................................................................................................2 go Ácido acético.....................................................................................55 mlo Agua..................................................................................................55 ml

16. Safranina: Colorante de contraste para tinción Gram (preferible a la fucsina) yesporas.

o Safranina.........................................................................................0,25 go Agua destilada..................................................................................100 m

17. Sudán III: Tinción específica de grasas.o Alcohol etílico...................................................................................100 mlo Sudán III...................................................................................hasta saturación

18. Verde de metilo acético: Igual composición que la eosina (num. 7)

Prueba de la Catalasa

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra ella mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienencitocromo. La principal excepción es Streptococcus .

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientesgéneros:



• Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).• Bacillus (+) de Clostridium (-).• Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones

de C.pyogenes y C.haemolyticum , ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacersesiguiendo dos técnicas:

1. Método del portaobjetos (recomendado):

• Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

• Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre elmicroorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).• Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.• Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua

oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Método del tubo de ensayo:

• Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar enslant densamente inoculado.

• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agarsangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa alretirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y supresencia dará un falso resultado positivo.

Prueba del Citrato

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Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citratocomo única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente denitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre lasenterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:Enterobacter , Klebsiella , Serratia , Citrobacter y algunas especies de

Salmonella . Sin embargo, Escherichia , Shigella , Salmonella typhi y Salmonella

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paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contienecitrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógenorespectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias

capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarániones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará unafuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color delindicador de pH, de verde a azul.

Fenilalanina Desaminasa

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Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar elaminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática defenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividadenzimática es característica de todas las especies del género Proteus y delgrupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras

enterobacterias

Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie delslant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente seañade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inundetodo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) semanifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

Foto de los resultados de esta prueba

Prueba del Indol

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano.Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante elenzima triptofanasa.

Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas enun caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundantetriptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs

que se puede preparar con los siguientes ingredientes:



• Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml• p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g• HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente aesta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizarcultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas lasespecies de Klebsiella (indol-).

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas delreactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo

y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, laprueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba noen el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de élasépticamente.




Prueba de la Lactosa

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y elgrupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importanciadebido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores decontaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se defineel grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobiosy anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan lalactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupotaxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas deorigen intestinal.

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en

enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que estemedio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial yaque contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimientodebido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán lasenterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes)liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectarágracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violetacontrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).


Manitol-Movilidad-Nitratos



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Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que se puedenrealizar cultivando el microorganismo en un único medio, el Manitol Movilidad,que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubándose a37ºC durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas enotros medios y por separado.

Prueba del Manitol

Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitolliberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo defenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidadincluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las

enterobacterias, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae .Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve paradiferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

Prueba de la Movilidad

Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienenmovilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre losbacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.

El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser

semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, lasbacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido ala distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacteriasinmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.

Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el géneroKlebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).

Dentro del género Bacillus , nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otrasespecies generalmente (+).

Prueba de la reducción de nitratos

Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato ennitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato ypara revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden losreactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambiode color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultadopositivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y seobserva el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza

la interpretación final.




Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utilizaprincipalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los génerosHaemophylus y Neisseria .

Foto de los resultados de manitol-movilidad

Foto de los resultados de nitratos



Prueba de la Oxidasa

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Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacciónde la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activala oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produceagua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa portanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora deelectrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en losorganismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, enalgún microaerófilo (Vibrio fetus ), pero los anaerobios estrictos carecen deactividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción decatalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de lacatalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya

acumulación es tóxica.

http://joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/catalasa.htm







La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

• Identificar todas las especies de Neisseria (+)• Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las

enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% dediclorhidrato de tetrametil-p -fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menostóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo(reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las coloniasoxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzcointenso.

Realización de la prueba:

1. Método en placa directa

• Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. Noinundar toda la placa y no invertirla.

• Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción seproduce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon yMcLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Método indirecto sobre papel

• Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una

placa de Petri.• Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.• Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.

• La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer

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Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten ladiferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes . Lasenterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dosfases: primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica)consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar

metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:




• Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli ylos productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético,láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial delmedio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que

permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.• Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo

Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales soncompuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndoseacetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medioKOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un colorrojo característico.

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldoRMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 díascomo mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dosporciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.

• Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) desolución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y seobserva la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa sipermanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba

• Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:o 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol5% en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso.

o 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%).Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo.Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.



Prueba de la Ureasa

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Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dosmoléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimáticaes característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo paradiferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivoretardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este mediose complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta serádegradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa.Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de

amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta eltiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio pocodespués de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienenactividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.





PRUEBA RESULTADO POSITIVOCatalasa Aparición de burbujas de O2

Citrato Medio de color azulFenilalanina desaminasa Aparición de color verde oscuroIndol Aparición de un anillo rojoLactosa Colonias de color violetaManitol Aparición de color amarilloMovilidad Difusión a partir de la línea del inóculo

Nitratos Cambio de color (rojo oscuro)Oxidasa Aparición de color azulRojo de Metilo Aparición de color rojoUreasa Aparición de color rojoVoges-Proskauer Aparición de color rojo

/03/2009

Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar TSI

http://microbiologiabrasil.blogspot.com/2009/01/prova-de-kligler-iron-agar-ou-de-triple.html




Esta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das

Enterobacteriaceae e para distinguir esta família de outros bacilos Gram negativo de

origem intestinal. Esta diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos

hidratos de carbono presentes no meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S).

Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contêm glicose em

pequena concentração (0,1%), lactose em concentração superior (1%), o indicador de pH,

vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos

hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de

ferro para a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meios diferenciais

é que o TSI possui mais um açúcar, a sacarose, em concentração igual à da lactose (1%).

Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. É essencial

que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h de incubação para evitar que os hidratos

de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradação das peptonas,

formando produtos finais alcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da

sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Após incubaçãopodem ser determinadas as actividades fermentativas, a produção de gás e a produção de

H2S, podendo ocorrer vários resultados: Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina

(vermelha): Só a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente,

a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato está presente em concentração

mínima, a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície

da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio são também usadas na produção de

substâncias alcalinas. No cilindro, a reação ácida é mantida devido à tensão reduzida do

oxigênio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol,muda para amarelo devido à persistência da formação de ácido no cilindro. Cilindro ácido

(amarelo) e rampa ácida (amarela): Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose,

para além da glicose. Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altas

concentrações são substratos para a atividade fermentativa contínua com manutenção da

reação ácida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produção de gás: Nota-se

pela ocorrência de fraturas no meio de cultura. Produção de H2S: Ocorre enegrecimento,

principalmente na zona intermédia do cilindro. Isto deve-se ao fato do microrganismo em

estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrogênio (H2S), que se conjuga com umcomposto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo

http://1.bp.blogspot.com/_HDwUiVSMtu8/SWAWsxfH9-I/AAAAAAAAAR4/YYfcH-U2LI8/s1600-h/Tripe+sugar+Iron.jpg



insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterada

(tijolo): Não ocorreu fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio, nem

produção de gás ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condições

anaeróbias e/ou aeróbias, resultando num pH alcalino devido à produção de amônia. Se só

ocorrer degradação aeróbia das peptonas, a reação alcalina só é evidenciada na superfícieda rampa. Se houver degradação aeróbia e anaeróbia das peptonas, a reação alcalina é

visível em todo o meio.

Postado por Horikini às 1/03/2009 05:46:00 PM

Marcadores: Bioquimica, Enterobacteriaceae, H2S, Kligler Iron Agar, Lactose, Prova,

Teste, Tripli Sugar Iron, Triplice de acuçar e ferro, TSA

/03/2009

Prova do sulfureto de hidrogênio (H2S)

Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de

hidrogênio (H2S) a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos

sulfurados inorgânicos.

Muitas proteínas são ricas em aminoácidos sulfurados, como a cisteína. Quando

estas proteínas estão presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimasmicrobianas a aminoácidos que são utilizados como nutrientes. O aminoácido cisteína, na

presença da enzima cisteína desulfurase, perde o seu átomo de enxofre que por sua vez é

reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar H2S. O H2S é então produzido

pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína.

Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela redução de compostos sulfurados

inorgânicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-).

Quando o meio contém tiossulfato de sódio alguns microrganismos têm capacidade para o

reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertação de H2S. Os átomos



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de enxofre atuam como aceitadores de hidrogênio durante a oxidação dos compostos

inorgânicos.

O meio de cultura agar SIM contém peptonas (a cisteína é um dos componentes) e

tiossulfato de sódio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2

SO4) que atua como indicador da presença de H2S. Como o H2S é incolor, e porconseguinte não é visível, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro

combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel. A

presença deste composto ocorre ao longo da linha de inoculação e indica que houve

produção de sulfureto de hidrogênio (reação positiva). A ausência do precipitado negro

evidencia uma reação negativa.

O meio de SIM é um meio semi-sólido que também pode ser usado para detectar a

presença ou ausência de mobilidade nas bactérias e a produção de indol.

Postado por Horikini às 1/03/2009 06:42:00 PM Marcadores: Bacteriana, bacterias, Bioquimismo, H2S, Hidrogênio, Prova, Sulfureto, Teste

1/03/2009

Prova da Coagulase

As coagulases são enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de um

mecanismo similar ao da coagulação normal.

A atividade da coagulase é utilizada para distinguir espécies patogenicas de

Staphylococcus de espécies não patogenicas, sendo um bom indicador da patogenicidade doS.aureus .

A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma

(obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo oxalato, citrato,

heparina) uma suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de

um meio sólido e incubar a 37º C. A formação de coágulos às 2 h, às 6 h ou às 24 h de

incubação é interpretada como uma prova positiva. A ausência de coagulação após 24 horas

de incubação é uma prova negativa.




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Esta prova pode ser realizada de um modo mais rápido (prova em lâmina) colocando-se duas

porções de bactérias da espécie em estudo nos extremos de uma lâmina, fazendo-se de

seguida uma pequena suspensão, sendo depois adicionado a uma delas uma gota de água

destilada (controle) e a outra uma gota de plasma. Homogeneiza-se bem e observa-se, no

fim de uns minutos. Se o aspecto é idêntico a prova é negativa ou se ocorreu formação depequenos agregados resultantes do fato das bactérias ficarem aprisionadas na rede de

fibrina então formada a prova é positiva.

Procedimento

• Em um tubo contendo 0,3 mL de plasma de coelho adicione o mesmo volume da

cultura líquida do microrganismo.

• Incube a 37 oC por cerca de 2 horas.

Interpretação

• O teste de coagulase tem a finalidade de demonstrar se o microrganismo produz a

enzima capaz de coagular o plasma.


Marcadores: Coagulase, Prova, Staphylococcus, Teste

1/03/2009

Prova da utilização do citrato



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Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como

única fonte de carbono.A prova é feita no meio de citrato ou meio de Simmons. Na ausência

de glicose ou lactose fermentáveis, alguns microrganismos são capazes de usar o citrato

como única fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presença

de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vezdentro da célula o citrato é degradado pela enzima citrase, produzindo ácido oxalacético e

acetato. Estes produtos são depois convertidos enzimaticamente em ácido pirúvico e CO2.

O meio de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, NH4+ como

fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova é feita em tubos em

rampa, uma vez que o O2 é necessário para a utilização do citrato. Quando o microrganismo

remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertação de CO2. Durante esta reação o meio

torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sódio (fornecido pelo citrato de sódio)

e água para formar carbonato de sódio, que é um produto alcalino. A presença de carbonatode sódio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte.

Após incubação, as culturas citrato positivo são identificadas pela presença de

crescimento, na superfície da rampa, acompanhado de coloração azul no meio de cultura.

Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantém-se verde e não apresentam

crescimento no meio de cultura.


Marcadores: bacterias, Bioquimismo, Citrato, Prova, Teste

1/03/2009

Prova de Voges-Proskauer - VP







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O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não

ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da

metabolização da glicose. Prova feita no meio MR - VP (Methyl Red, Voges - Proskauer).

A adição do reagente de Barritt’s (solução 40% KOH e solução de - naftol em etanol

absoluto) permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol (acetoína) que é percursor dasíntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formação de um complexo rosa/vermelho que dá

essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15

minutos após a adição do reagente de Barritt’s representa uma prova positiva. A ausência

dessa cor é uma prova negativa.

Este tipo de fermentação da glicose é característico do E.aerogenes .


Marcadores: Prova, Teste, Voges - Proskauer

Prova Vermelho de Metila - MR

Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com

produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Fazer a prova no

meio MR - VP (Methyl Red, Voges-Proskauer).

A glicose é o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais

para a produção de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam,dependendo do equipamento enzimático presente na bactéria.

Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produção inicial

de ácidos orgânicos, há uns (ex. Escherichia coli) que mantêm um pH de 4 até ao fim da

incubação, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o último período de

incubação convertem esses ácidos a produtos finais não ácidos como o etanol e a acetoína,

resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubação.

Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes

concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, overmelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6,






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apesar de ainda ser ácido, como há menos ions de hidrogénio, o indicador muda para

amarelo e é uma prova negativa.


Marcadores: Bacteriana, Bioquimismo, Enterobacteriaceae, Methyl Red, MR-VP, Teste,

Vermelho de Metila, Voges - Proskauer

1/03/2009

Prova do Indol

O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano

(presente em quase todas as proteínas) até indol.

O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades

enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é

mediada pela enzima triptofanase.

Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e

acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve comomarcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem

metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol.

Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex.: água

peptonada. Após o crescimento pesquisa-se a presença de indol adicionando o reagente de

Kovac’s (cor amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio

de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado.

As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do

reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstraque o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.







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1/03/2009

Hidrólise de Gelatinase

O objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzimahidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina (gelatinase).

A gelatina é uma proteína produzida pela hidrólise do colagénio que abaixo dos 25º C

mantém as suas propriedades de gel e é sólida, enquanto acima dos 25º C é líquida.

Determinados microrganismos têm capacidade para produzir a gelatinase, que atua

hidrolisando a gelatina em aminoácidos. Se a degradação ocorre não se consegue restaurar

as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas (fica líquido).

A hidrólise da gelatina é uma característica importante na diferenciação dosmicrorganismos e pode também ser usada para determinar a sua patogenicidade.

A liquefacção da gelatina pode ser determinada inoculando-se por picada um meio de

cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de gelatina. Após incubação a 37º C

durante 24 a 48 h, as culturas são colocadas no frigorífico a 4º C durante 30 minutos ou

em banho de gelo durante 3 a 5 minutos. Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o

meio mantém-se líquido após refrigeração (reação positiva). Se o microrganismo não possui

gelatinase, o meio resolidifica durante o período em que está no frigorífico (reação

negativa).








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Foto: (A) negativo, (B) e (C) Positivo.


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Observación microscópica de hongos

OBJETIVOS

1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies demohos.

2. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y noseptadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan

MATERIAL

• Microscopio• Portaobjetos y cubreobjetos (22x22

mm) muy limpios y desengrasados conalcohol

• Aguja enmangada o lanceta

• Trozo enmohecido de fruta o pan oun cultivo de hongos

• Solución de lactofenol al azulalgodón

• Cinta adhesiva transparente

PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS

TÉCNICA

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiadogrande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado

gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar lamuestra.2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas

procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno delos portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso deconidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo querealmente interesa, los conidióforos.

3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será yael definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas ensu interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o seseccionarán con un bisturí.

4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quedeamontonado.










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5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que seformen burbujas entre los dos vidrios.

PREPARACIÓN EN CINTA ADHESIVA

TÉCNICA

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiadogrande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiadogruesa.

2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o

el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una coloniapuede haber una excesiva concentración de esporas.

4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.

RESULTADOS

• Moho del tomate: x600 x1500 • Aspergillus : x150 x600 (foto a / foto b)

• Penicillum : x600 x1500

Aspergillus

Penicillum :



Tinción de esporas

• Microscopio•

Portaobjetos• Cubreobjetos• Asa de siembra

• Cubeta de tinción

• Cultivo bacteriano

• Pinzas•

Frasco lavador• Mechero de alcohol• Papel de filtro• Verde Malaquita

• SafraninaREALIZACIÓN

1. Preparar los frotis bacterianos indicados.2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de

la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min.

Añadir más colorante si la muestra se seca.3. Lavar con agua el resto de colorante.

4. Teñir con safranina 1 min.5. Lavar con agua el resto de colorante.

6. Secar la preparación.7. Observar la preparación al microscopio.

Foto de los resultados



Tinción ácido-alcohol resistente

• Microscopio• Portaobjetos• Cubreobjetos• Asa de siembra• Cubeta de tinción• Cultivo bacteriano

• Pinzas

• Frasco lavador• Mechero de alcohol• Papel de filtro• azul de metileno• fucsina-fenol

• mezcla de ácido y alcohol

REALIZACIÓN

1. Prepara un frotis bacteriano.2. Cubrir la preparación con carbofucsina.3. Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se

evapora, se añade más carbofuxina para que no se seque en ningún momento.

4. Lavar con agua el resto de colorante.5. Decolorar con la mezcla ácido-alcohol.6. Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.7. Teñir con azul de metileno 1 min.8. Lavar con agua el resto de colorante.9. Secar la preparación.

10. Examinar al microscopio.



Gemación de levaduras

MATERIAL

• Microscopio• Portaobjetos• Cubreobjetos

• Levadura

• Agua azucarada• Aguja enmangada

• Lactofenol-safranina

TÉCNICA

1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta quecontenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada.

2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa

de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento seconsigue una doble finalidad:

o Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina.o Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción

desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.

RESULTADOS

Las siguientes fotos han sido obtenidas a partir de preparaciones teñidas con azul demetileno y no con lactofenol-safranina.

• Levadura x600• Levadura x1500

• Gemación de levaduras



Tinción Gram



• Microscopio• Portaobjetos• Cubreobjetos• Asa de siembra• Cubeta de tinción• Cultivo bacteriano

• Pinzas

• Frasco lavador• Mechero de alcohol• Papel de filtro• Cristal violeta• Lugol• Alcohol-acetona

• Safranina

REALIZACIÓN

1. Preparar los frotis bacterianos.2. Teñir con cristal violeta 1min.3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.4. Cubrir con Lugol 1min.

5. Lavar con agua el exceso de Lugol.6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacióndeje de perder color (30seg)

7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.8. Teñir con safranina 1min.9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.10. Secar la preparación.11. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.

Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara labatería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto

a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelenhacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así lostiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientrasduren esos colorantes son fiables.Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es muchomás caro.

FOTOS DE LOS RESULTADOS

foto de tinción mixtafoto de Bacillus foto de Enterobacter

importante tem tudo

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