identificação e quantificação de cocaína em sôro humano

Laboratório Central de Polícia Técnica

SECRETARIA DA SEGURANÇA

PÚBLICA DO ESTADO DA BAHIA

DEPARTAMENTO DE POLÍCIA TÉCNICA

Seção de Análise

Instrumental

IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE COCAÍNA EM URINA E SANGUE

UTILIZANDO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA E CROMATOGRAFIA

GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETIA DE MASSA ( GC/MS)

Cristóvão Macedo Dantas Químico

Perito Técnico de Polícia Chefe da seção de Analise instrumental do L.C.P.T.





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SUMÁRIO PÁGINA 1. INTRODUÇÃO 1

2. GENERALIDADES 1

3. METABOLISMO DA COCAÍNA 3

4. ASPECTOS DE SEGURANÇA 3

5. NORMAS A CONSULTAR 3

6. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA 3

7. DEFINIÇÕES 4

8. ASPECTOS ANALITÍCOS 4

9. MATERIAL NECESSÁRIO 4

9.1 EQUIPAMENTOS E INSTRUMENTOS 4

9.2 REAGENTES E SOLUÇÕES 5

9.3 BRANCOS DE REFERÊNCIAS 5

10. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 6

11. ANEXOS 7

1- EXTRAÇÃO E SILANIZAÇÃO DE COCAÍNA EM URINA 8

2- PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE P/ QUANT IFICAÇÃO 9

3- CONDIÇÕES CROMATOGRAFICAS 10

4- CROMATOGRAMA DE CASO POSITIVO ( AMOSTRA D E URINA) 11

5- PESQUISA DE SIMILARIDADE 12

6- CASO POSITIVO DE COCAÍNA ( AMOSTRA DE SANGUE ) 13

7- CURVA DE CALIBRAÇÃO P/ QUANTIFICAR COCAÍNA 14

8- ESPECTRO DE MASSA (CODEÍNA-TMS E BENZOILECG ONINA-TMS) 15





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1- INTRODUÇÃO A cocaína é um forte estimulante do sistema nervoso central que, quando utilizado como fármaco de abuso, causa dependência física e psíquica com possibilidade de ocorrência de intoxicação aguda e letal por overdose. Problemas pertinentes à rápida e composta transformação, e possibilidade de hidrólise espontânea e enzimática “in vitro”, fazem com que a quantificação da cocaína em material biológico, represente um problema analítico aos toxicologistas. Com a finalidade de desenvolvimento de uma metodologia para a identificação e quantificação de cocaína nos níveis sangüíneos compatíveis com a intoxicação aguda, foi padronizada uma técnica na qual identificamos este fármaco em urina e em sangue, utilizando-se cromatografia em fase gasosa com o uso de detetor espectrométrico de massa equipado com coluna capilar de polimetilsiloxano com 5% de fenil em sílica fundida, 250 µm de diâmetro interno, 0,25µm de espessura do filme e 25m de comprimento. A otimização da técnica de extração em fase sólida e da quantificação, propiciou um limite de detecção em concentrações sangüíneas acima de 50ηg/mL. 2 - GENERALIDADES Alcalóides são substâncias sintetizadas por vegetais que se caracterizam por apresentarem intensa atividade fisiológica no organismo humano. Possuem na sua cadeia carbônica um heteroátomo de nitrogênio e por isso tem caráter alcalino, de onde deriva-se a palavra alcalóide. São considerados base de Lewis. Os alcalóides do grupo tropano são ésteres de ácidos atrópicos, trópicos e benzóicos entre outros, do qual a cocaína faz parte. A cocaína (Éster Metílico de Benzoilecgonina), fármaco que pertence, juntamente com a atropina e a escopolamina, à família dos alcalóides naturais tipo tropano, apresenta fórmula empírica C17H21NO4, e estrutural descrita a seguir:

Ocorre naturalmente nas folhas provenientes de duas espécies do gênero Erythroxylon, vulgarmente denominado de coca. A Erythroxylon coca é composta por folhas pequenas contendo 0,5 a 2,0% de coca. A droga é extraída destas folhas, em duas etapas: Na primeira, as folhas são prensadas juntamente com ácido sulfúrico e querosene, originando uma pasta que contém aproximadamente 90% de sulfato de cocaína; na segunda etapa, para remover as impurezas remanescentes, a pasta é tratada em meio básico com éter etílico, originando um extrato que contém cocaína na forma alcaloidal 3.





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Este extrato reage com ácido clorídrico obtendo-se o cloridrato de cocaína, forma na qual é comercializada. Esta mesma substância também pode ser obtida sinteticamente em laboratório. A “droga de rua”, obtida a partir da diluição do cloridrato de cocaína com adição de adulterantes normalmente açúcares, talco e sais de baixo custo, como o sulfato de magnésio. Após a adulteração a droga apresenta concentrações de cocaína entre 15 e 90%. O cloridrato de cocaína é um pó branco cristalino, que apresenta ponto de fusão de aproximadamente 197oC, com decomposição. É solúvel em água, parcialmente solúvel em éter etílico e pouco solúvel em clorofórmio. A forma básica da coca, chamada base livre ou cocaína alcaloidal é substância cristalina, branca ou transparente, com odor característico, levemente volátil e com ponto de fusão entre 96 e 98oC, não se decompondo em temperaturas requeridas para a sua vaporização. É solúvel em etanol, acetona e praticamente insolúvel em água. Em virtude destas propriedades a coca na sua forma básica, ao contrário da forma de cloridrato, presta-se para ser fumada e é comercializada ilicitamente em pequenos pedaços cristalinos que recebem o nome de “Crack” (craque ou rock). O uso da coca nesta forma é feito através de cachimbos ou em cigarros de maconha ou de tabaco. A extensa área de superfície dos pulmões favorece a efetiva absorção. A ação rápida e efeitos intensos, são comparáveis aos que se seguem à administração intravenosa. A meia-vida da absorção para a coca (fumada) é muito rápida - da ordem de 1 minuto, já a utlização de coca via intranasal (aspiração nasal) ou pela mucosa bucal tem baixa velocidade de absorção devido às propriedades vasoconstritoras do fármaco, com meia-vida de absorção na ordem de 30 a 90 minutos 4 . O caráter lipofílico da cocaína faz com que atravesse prontamente as barreiras biológicas. Dados experimentais sugerem que a coca se acumula nos tecidos adiposos e no sistema nervoso central, resultando concentrações até quatro vezes maiores que as plasmáticas, com posterior liberação desses sítios de armazenamento. Em exames toxicológicos realizados em tecidos provenientes de necropsia, em casos de overdose, as concentrações mais elevadas de coca são encontradas na urina e nos rins, seguidas pelas concentrações no cérebro e biles. As dificuldades para se estabelecer as doses teóricas, e mesmo letais, devem-se às características cinéticas que variam com o tipo de eliminação, o grau de pureza da droga e a natureza da ação dos eventuais adulterantes. Os níveis sanguíneos determinados em amostras pós-morte, não podem ser interpretadas como aquelas que levam ao óbito, pois a remoção espontânea ou enzimática da coca, pré e pós-morte, servem, entretanto, como indicadores, pois não há referência de níveis acima de 1,0µg/mL, correlacionados com efeito de euforia, ou seja, concentrações desta ordem, constituem forte indício de que houve intoxicação por overdose 4. De fato, concentrações definidas como letais estão entre 1 e 25µg/mL, embora valores tão altos quanto 211µg/mL tenham sido reportados como casos letais acidentais, devido ao rompimento de sacos plásticos contendo cocaína em estômago de traficantes (as chamadas mulas) 4 .





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3 - METABOLISMO DA COCAÍNA No organismo a cocaína é transformada (hidrólise e conjugação), sendo eliminada principalmente na urina em forma metabolizada e de 10 a 25% na forma inalterada. Devido ao fato de ser rapidamente metabolizada, os efeitos da cocaína são pouco duráveis, e a depressão crônica é uma das razões das repetidas doses em curto espaço de tempo.

Principal Metabólito. (Benzoilecgonina - B E G ) 4. ASPECTOS DE SEGURANÇA Usar luvas cirúrgicas ao manusear as amostras, por se tratarem de potenciais fontes de contaminação de doenças diversas. Observar, também, as recomendações de segurança (uso de óculos e capela) relativas ao manuseio dos reagentes e soluções. 5. NORMAS A CONSULTAR

Manual de Operação do GC/MS Shimadzu (GC17A/QP-5000)

6. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA 1- CLARKE’S. Isolation and identification of drugs, second edition 2- PFLEGER, H. H. MAURER, A. WEBER. Mass Spectral and CG data of drugs,

poisons, pesticides, pollulants and their metabolites, second, revesed and enlarged edition.

3- JOHANSON CHRIS-ELLYN. Tudo sobre Drogas- Cocaína- nova cultural 1988 4- CHASIN, ALICE A. DA MATTA. Identificação e quantificação de Cocaína

(Tese de mestrado) USP





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7. DEFINIÇÕES GC/MS - cromatografia a gás/espectrometria de massa IE - impacto de elétrons P.A. - para análise SPE - extração em fase sólida m/z - relação massa carga M+ - ion molecular BEG -TMS - benzoilecgonina trimetilsilanizado ABN - cartucho de extração em fase sólida (BSTFA+1% TMCS) - reagente derivatizante 8 - ASPECTOS ANALÍTICOS Para triagem da presença de cocaína no organismo, a urina é muito importante, pois neste material há uma concentração elevada da referida droga em forma inalterada (cocaína), bem como seu principal produto de biotransformação, a benzoilecgonina (BEG). Após a triagem e constatação positiva, procede-se a extração e quantificação do fármaco no sangue. O armazenamento de amostras de urina deve ser feito sob baixa temperatua para evitar a hidrólise. Já as amostras de sangue, além da recomendação relativa à urina, deve-se acondiciona-las em recipientes contendo fluoreto de sódio, para minimizar a hidrólise química espontânea e enzimática, além de atuar como anticoagulante. Para a quantificação, a codeína (metilmorfina), que é um alcalóide natural extraído do ópio ou obtido por metilação da morfina, foi escolhida como padrão interno, o qual sofre processo de silanização gerando o ion quantificador M+ = 371u.m.a., que é bastante estavel, e de ótima abundancia relativa. o limite de quantificação obtida no método foi acima de 50ηg/mL para a cocaína, prestando-se portanto às análises nos níveis sanguineos típicos dos casos de óbito por overdose. 9 - MATERIAIS NECESSÁRIOS: 9.1 - Equipamentos e Instrumentos a) balança; b) centrífuga Fanem 215; c) banho com controle de temperatura; d) tubo de centrífuga cônico com tampa rosqueável; e) cartucho SPE Speed ABN da Applied Separation; f) sistema de eluição a vácuo (Vacuum Elution Speed-Mate 10); g) agitador de tubos; h) frasco de derivatização de 4mL com tampa rosqueável; i) cromatógrafo a gás com detetor de massa Shimadzu GC17A/QP-5000; j) coluna capilar em sílica fundida com 250 µm de diâmetro interno e 25m de

comprimento SE-30 (com 0,25µm de espessura do filme) k) micro seringa; l) cilindro de Helio de alta pureza; m) cilindro de nitrogênio comercial. n) fôrno de microondas Brastemp.





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9.2 - Reagentes e Soluções a) fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) P.A.; b) fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) P.A.; c) tampão fosfato pH 6;

• 9,073g de fosfato de sódio dibásico em 1 litro de água destilada - Solução A • 9,485g de fosfato de potássio monobásico em 1 litro de água destilada -

Solução B • adicionar 80mL da Solução A a 20mL da Solução B e ajustar o pH para 6

através de gotejamento de ac. acético1M em béquer submetido a agitação magnética e monitorando com potenciômetro;

d) solução de sulfato de zinco 1N; e) hidróxido de amônio P.A.; f) solução de diclorometano/isopropanol 80/20(v/V); g) solução de hidróxido de amônio 2% em diclorometano/isopropanol 80/20 (preparar

no dia da análise); h) metanol P.A.; i) ácido acético P.A. (99,5%); j) solução de ácido acético 1N;

• transferir 57mL para um balão volumétrico de 1000mL; • completar o volume com água destilada.

k) acetato de etila P.A.; l) água destilada; m) BSTFA + 1% de TMS (bistrimetilsililtrifluoracetamida com 1% de trimetilclorosilano); n) solução etanólica de codeína 0,26%P. o) solução de codeína 270,4ng/µL; • transferir 2,6mL da solução de codeína 0,26% para um balão volumétrico de 25mL; • completar o volume com metanol P.A. p) solução de ácido fosfo-tungstico 0,03 M; • dissolver 25g do Ácido fosfotungstico em 250mL de água destilada, aquecida 9.3 - Brancos de Referência

• amostras de urina; • amostras de sangue provenientes de cadáveres humanos sem histórico de uso

de drogas; • às amostras de sangue foram adicionado fluoreto de sódio de maneira a se

obter uma concentração final de 5g/L.





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Instrumental 6

10 - DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Sendo ínfimos os niveis de cocaína e seus produtos de biotransformação em materiais biológicos, devido as concentrações que causam intoxicação letal por over-dose serem baixas e a rapidez na eliminação da droga pelo organismo humano, dificuldades para sua detecção são gerados. Estes motivos nos levaram ao desenvolvimento de uma metodologia, utilizando extração em fase sólida a qual reduz o consumo de reagentes e produz uma matriz bastante limpa ideal para analises por cromatografia gasosa com detector de massa (GC/MS). A cocaína uma substância orgânica de baixa polaridade, presta-se para ser analisada por comatografia em fase gasosa, o que não acontece com o seu principal produto de biotransformação a benzoilecgonina ( BEG ), que quando encontrada na urina fornece indicios de que o individuo utilizou coca (paciente) ou morreu por over-dose. Por este motivo lançamos mão de técnicas de derivatizacões “Silanização”, usando o N,O-bistrimetilsililtrifluoracetamida (BSTFA+1%TMS), obtendo-se a BEG-TMS, derivado silanizado da benzoilecgonina, que é facilmente detectada por GC/MS. Após esta etapa, no caso de cadáveres, procede-se a quantificação da cocaína remanescente no sangue, usando a codeína no padrão interno e obtendo-se valores de concentrações que nos indicam a posivel dose letal. Como o processo analítico de identificação do fármaco é a GC/MS, que gera o especto de massa da substância questionada, e esta técnica é considerado a impressão digital da substância, comparações do espectro obtido com os presentes nas três bibliotecas do equipamento (QP-5000), as quais perfazem cerca de oitenta e cinco mil, fornecen índices de similaridades superiores a 90%, logo indicam de maneira segura e inequívoca a presença da droga no material periciado.





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ANEXOS





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1- EXTRAÇÃO E SILANIZAÇÃO DE COCAÍNA EM URINA. 4,0mL de Tampão Fosfato pH da amostra ≅≅≅≅ 6,0 2,0mL de Metanol 2,0 mL de H2O 2,0mL Tampão Fosfato 2,0 mL de H2O 1,0mL de Ac. Acético 1,0N 2,0mL de Metanol

50µµµµL de Acetato de etila 50µµµµL de Ag. Derivatizante

Obs. Solvente de Coca Hidróxido de Amônia 2,0% em Fragmentos Pesquisados: Dicloro Metano : Isopropanol (80:20) M+ = 303 - Cocaína µµµµW=Microondas m/z 317 - Coca etileno Ag. Derivatizante ( BSTFA + 1% de TMCS ) m/z 361 - BEG-TMS (ABN) =Cartucho de Extração

5mL de urina

Agitar em vortex

Condicionar cartucho (ABN)

Aspirar amostra no cartucho

Secar Cartucho sob vácuo

Eluir c/ 3mL de solvente de coca

Evaporar o Solvente sob N 2

5 min. µµµµW Potencia = 3

Injetar 1 µµµµL no GC/MS (FULL SCAN)





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2 - Preparação das Amostras de Sangue p/ Quantificação 5,0mL de Sulfato de zinco 500µµµµL de ac. Fosfotungístico 5,0mL de Sangue 20µµµµL de Pad. Codeína 4,0mL de Tampão Fosfato 4,0mL Tampão Fosfato 2,0mL de Metanol 2,0 mL de H2O 2,0mL Tampão Fosfato 2,0 mL de H2O 1,0mL de Ac. Acético 1,0N 2,0mL de Metanol

Obs.

50µµµµL Acetato de etila 50µµµµL Ag. Derivatrizante Fragmentos quantificadores:

Solvente de Coca Hidróxido de Amônian 2,0% em M/Z=182 Cocaína Dicloro Metano : Isopropanol (80:20) M/Z=371 COD-TMS

Tubo de centrifuga (A)

Tubo de centrifuga (B)

Juntar conteudo de B em A

Repousar por 5 minutos

Aspirar amostra no cartucho

Centrifugar por 20 min a 2800

rpm

Secar Cartucho sob vácuo

Eluir c/ 3mL de solvente de coca

Evaporar o Solvente sob N 2

5 min. µµµµW Potencia = 3

Injetar 1 µµµµL no GC/MS (MODO SIM)





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3 - CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS





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4 - CROMATOGRAMA DE CASO POSITIVO (AMOSTRA DE URINA)





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Instrumental 12

5 - PESQUISA DE ÍNDICE DE SIMILADAD E





Seção de Análise

Instrumental 13

6 - CASO POSITIVO DE COCAÍNA

(AMOSTRA DE SANGUE)





Seção de Análise

Instrumental 14

7- CURVA DE CALIBRAÇÃO P/ QUANTIFICAR COCAÍNA





Seção de Análise

Instrumental 15

8 - ESPECTRO DE MASSA

(CODEÍNA-TMS E BENZOILECGONINA-TMS)

identificação e quantificação de cocaína em sôro humano

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