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IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE

PROTEASES E SEUS SUBSTRATOS DE FLUIDO

EPIDIDIMÁRIO DE Equus caballus

NATHÁLIA CURTY DE ANDRADE

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ

MARÇO - 2008





Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, com ênfase em Biologia Celular.

ORIENTADOR: Dr. CLAUDIO ANDRÉS RETAMAL MARTÍNEZ

CO-ORIENTADORA: Drª. MARIA LUISA LÓPEZ ALVAREZ

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ

2008





Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, com ênfase em Biologia Celular.

Aprovada em ____ de Março de 2008

...................................................................... Dr. Milton Masahiko Kanashiro

......................................................................

Drª. Kátia Valevski Sales Fernandes

................................................................. Dr. Marco Antônio de Oliveira

..................................................... Dr. Claudio Retamal (orientador)

.....................................................

Drª. Maria Luisa Lopez Alvarez (co-orientadora)

i

Dedico, aos meus pais: Mariléa

e Bertoni: Vocês me

transmitiram os valores mais

importantes: Amor, amizade,

carinho, compreensão, perdão,

companheirismo, honestidade e

paciência. Obrigada!!!

ii

Agradecimentos

Primeiramente a DEUS, por oferecer seu amor, por todas as bênçãos que me

concedeu e por ter me permitido chegar até aqui.

À minha família: meu pai e minha mãe, Ronaldo Carpi, meus irmãos que, em

todos os momentos, me apoiaram e me fortaleceram com muito amor e

carinho. Obrigada por existirem em minha vida!

A Marco Augusto Seabra por oferecer seu amor, paciência, apoio e carinho,

muito obrigada.

Ao professor Claudio Andrés Retamal Martínez, pela orientação, grande

amizade e confiança.

À professora Maria Luisa López, pela amizade e orientação.

À amiga Thaisa Domingos que desde o primeiro dia de aula somos como

irmãs. Muito obrigada pretinha!

Aos amigos de laboratório: Paula Amorin, Roberta Fernandes, Glauber Dias,

Joseph Albert e Renata Vasconcelos. Obrigada pela amizade,

companheirismo, pelos ensinamentos e paciência comigo!

Ao técnico do laboratório Arthur Rodrigues pela amizade e auxílio na

preparação de soluções.

Às amigas: Ana Carolina Mercadante, que me deu apoio nas horas difíceis e

pelas risadas nos momentos de descontração.

Ao pessoal do LQFPP, LBT, LBR e do CCTA pelo apoio.

À TECNORTE, FAPERJ, CNPq e UENF pelo auxílio financeiro.

E a todos que de alguma forma contribuíram para o meu trabalho e que

infelizmente não conseguiria listar a todos, muito obrigada.

iii

RESUMO

Os espermatozóides de mamíferos sofrem uma seqüência de mudanças

estruturais durante sua passagem pelo epidídimo, adquirindo

concomitantemente, um padrão motilidade maduro e capacidade fertilizante.

Algumas dessas modificações podem resultar de um processamento

proteolítico específico. Em contraste com as proteases do testículo e de células

espermáticas, as proteases epididimárias têm sido menos estudadas. Assim, o

objetivo deste trabalho foi caracterizar a atividade proteolítica no fluido

epididimário de cavalo. Amostras coletadas das diferentes regiões

epididimárias foram submetidas a eletroforese em géis de gelatina incubados

com diferentes inibidores e pHs, sob condições redutoras e não redutoras.

Tendo verificado uma migração anómala de proteases em SDS-PAGE com

gelatina, as massas moleculares aqui relatadas foram calculadas com base em

géis 2D (SDS-PAGE/SDS-PAGE 0,4% gelatina). Nossos resultados mostraram

uma distribuição regionalizada no epidídimo de metaloproteases que possuem

um pH ótimo neutro variando de 40 a 117 kDa. Na região epididimária de

cabeça proximal foram detectadas proteases de 117, 100 e 62 kDa. Na cauda

epididimária, as principais bandas de atividade foram proteínas de 117, 62, 45 e

40 kDa. O comportamento da enzima com e sem β-mercaptoetanol reflete a

existência de pontes dissulfeto e sugere a possibilidade de interações

transitórias entre proteases ou com os seus substratos/inibidores. Os

substratos endógenos foram identificados através da adição das atividades

proteolíticas isoladas de cauda a este mesmo fluido e foi observado a

diminuição da concentração das proteínas de 117, 80, 69, 57, 50, 44, 35, 68 e

60 kDa, indicando que sejam alvo da atividade proteásica. A proteína de 66

kDa se mantém o que permite descartar-la como substrato de proteases. O Rf

de algumas proteínas se altera e também aumenta a concentração de algumas

bandas (manchas) como é caso das proteínas de massas moleculares 66, 50,

49, 44, 35, 33,5 e 32,8 kDa. Analisados em conjunto, esses dados sugerem

que podemos estar frente a substratos e produtos resultantes da ação

enzimática. Isto sugere o papel biológico destas enzimas como reguladoras de

proteínas presentes em uma forma inativa e que, após seu processamento no

fluido, tornam-se ativas.

iv

ABSTRACT

Mammalian spermatozoa undergo a sequence of structural changes as

they pass through epididymis, acquiring concomitantly a mature motility pattern

and fertilizing ability. Some of these modifications would result from a specific

proteolytic processing. In contrast to the proteases of the testis and sperm cell,

epididymal proteases have been less studied. The aim of this work was to

characterize the proteolytic activities detected in stallion epididymal fluid.

Samples collected from different epididymis regions were submitted to gelatin

gel under nonreducing or reducing conditions and treated with different

protease inhibitors and pHs. Having verified an anomalous migration of

proteases in SDS-PAGE with gelatin, and molecular weights here reported were

calculated based on 2D SDS-PAGE/SDS-PAGE 0.4% gelatin gels. Our results

showed a regionalized distribution of proteolytic activity in the epididymis, which

has a neutral pH, and allowed metalloproteases detection ranging from ~40 to

117 kDa. In the proximal caput epididymidis 117, 100 and 62 kDa proteases

were detected. In the tails epididymidis the main reactive band were 117, 62, 45

and 40 kDa kDa proteins. The enzyme behavior with and without β-

mercaptoethanol likely reflects sulfhydryl cross-linking and suggests the

possibility of transient interactions, between proteases or with their

substrates/inhibitors. The endogenous substrates were identified through the

isolated proteolytic activity from tail added to this same fluid and showed that

proteins of molecular weight 117, 80, 69, 57, 50, 44, 35, 68 and 60 kDa

disappear, indicating that they are targets of protease activity. A protein of 66

kDa remains allowing discard it as a substrate for proteases. The Rf of certain

proteins changes also appear in new bands (spots) such as molecular weights

of proteins of 66, 50, 49, 44, 35, 33.5 and 32,8 kDa. Together, these data

suggest that we may be facing the substrates and products resulting from the

enzymatic action. This suggest the biological role of these enzymes, like

regulate proteins present in an inactive form and become functional after its

processing in the fluid.

v

Este trabalho foi desenvolvido no

laboratório de biologia celular e

tecidual, no setor biologia da

reprodução do centro de

biociências e biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense sob orientação dos

pesquisadores Cláudio Andrés

Retamal e Maria Luisa López

Alvarez.

Apoio financeiro:

CNPq

UENF

FAPERJ

TECNORTE

vi

Lista de abreviaturas:

PH-20- Proteína com atividade hialuronidase de 30kDa.

PH30- Proteína com atividade hialuronidase de 30kDa.

HE4- Proteína relacionada à fertilida.

CRES - Cistatina relacionada com a espermatogênese epididimária.

PC4- Co-ativador transcricional p15 (PC4).

MMPs- Metaloproteases de matriz.

TIMPs- Inibidores de Metaloproteases Tecido Específicas.

BSp66- Protease de Espermatozóide Bovino de 66kDa.

MT-MMP- Metaloproteínas de membrana.

ADAM- Proteínas com um domínio desintegrina e metaloprotease.

FN- Fibronectina.

mmp- genes de MMPs.

JUN- Oncogene celular Jun.

FOS- Oncogene celular FOS.

AP1- Complexo ativador de proteínas 1.

MAPK- Proteínas quinases ativadas por mitógenos.

ERKs- Proteínas quinases reguladas por sinais extracelulares.

JNK- Proteína quinase do N-terminal de JUN ativada por estresse.

P38- Proteína quinase p38 ativada por mitógenos (MAPK).

PKC- Proteína quinase C.

EGF- Fator de crescimento epitelial.

MDC9- Metaloprotease desintegrina MDC9 (ADAM9).

BSA- Albumina sérica bovina.

SDS - Dodecil sulfato de sódio.

PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida.

HCl- Ácido clorídrico.

H2O- Água.

CaCl2 - Cloreto de cálcio.

NaCl- Cloreto de sódio.

PMSF- Fenil metil sulfonil fluoreto.

EDTA - Ácido etilenodiaminotetraacético.

RNA - Ácido Desoxirribonucléico.

vii

Kr- Constante de retardação na mobilidade eletroforética.

Rf - Mobilidade relativa.

1D- Eletroforese unidimensional (primeira eletroforese).

2D- Eletroforese bidimensional (segunda eletroforese).

UV- Luz ultra-violeta

PBS- Tampão fosfato-salino.

anti-MMP- Anticorpo anti- metaloproteases de matriz.

ScPrB- Protease Schizophyllum commune B (metaloprotease).

CE9- Glicoproteína integral de membrana plasmática chamada CE9.

1

ÍNDICE

I. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 3

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 5

1. Epidídimo e o processo de maturação espermática ....................................................... 5

2. Proteases ..................................................................................................................... 7

3. Metaloproteases de Matriz Extracelular (MMPs) ....................................................... 10

4. Maturação espermática e atividade proteolítica .......................................................... 14

III. OBJETIVOS ............................................................................................................. 16

1. Objetivo geral ............................................................................................................ 16

2. Objetivos específicos ................................................................................................. 16

IV. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 17

1. Obtenção das amostras .............................................................................................. 17

2. Determinação da concentração de proteínas ............................................................... 18

3. Análise do perfil eletroforético de amostras de fluido epididimário ............................ 18

4. Detecção de proteólise endógena no fluido epididimário ........................................... 18

5. Detecção de atividade metaloproteásica ..................................................................... 20

6. Ação de inibidores sobre as atividades proteolíticas ................................................... 20

7. Verificação do pH ótimo ........................................................................................... 20

8. Determinação do grau de anomalia das proteases na migração eletroforética ............. 21

9. Determinação das massas moleculares das proteases de fluido epididimário .............. 22

10. Purificação das atividades proteolíticas detectadas no fluido epididimário de cauda 24

10.1 Purificação das atividades proteolíticas a partir de géis unidimensionais ....................... 24

10.2 Purificação das atividades proteolíticas a partir de géis 2D SDS/SDS com gelatina ...... 25

10.3 Purificação das atividades proteolíticas a partir de géis nativos 10% ............................. 26

11. Detecção e identificação de substratos endógenos de fluido de cauda com atividades proteolíticas purificadas desta mesma região .................................................................... 28

12. Purificação dos substratos endógenos das atividades proteolíticas ........................... 29

12.1 Purificação dos substratos endógenos, presentes em fluido de cauda, a partir de géis nativos 10% ......................................................................................................................... 29

12.2 Purificação dos substratos endógenos, presentes em fluido de cauda, a partir de géis nativo/SDS-PAGE 12% ....................................................................................................... 31

13. Identificação dos produtos endógenos gerados pelas proteases purificadas e substratos purificados ....................................................................................................... 33

14. Western blotting .................................................................................................... 34

15. Análise densitométrica ........................................................................................... 34

V. RESULTADOS ......................................................................................................... 35

1. Análise do perfil eletroforético de amostras de fluido epididimário ............................ 35

2. Efeito da proteólise endógena no fluido epididimário ................................................ 35

3. Detecção e caracterização de proteases epididimárias ................................................ 38

3.1 Atividade proteásica no fluido epididimário, ação de inibidores sobre as atividades proteolíticas e verificação do pH ótimo ................................................................................ 38

4. Determinação da constante de retardação de proteases: eletroforeses de proteínas epididimárias em géis desnaturantes na presença de gradiente de gelatina 0 - 0,6% .......... 41

4.1 Comparação de proteínas/atividades proteásicas em géis bidimensionais SDS/SDS e SDS/gelatina 0,4% ............................................................................................................... 45

5. Detecção da atividade proteásica de fluido epididimário na ausência e presença de agente redutor .................................................................................................................. 47

6. Determinação das massas moleculares de proteases no fluido epididimário ............... 52

7. Purificação das Proteases ........................................................................................... 54

2

7.1 Purificação de proteases a partir de géis unidimensionais ............................................... 54

7.2 Purificação de proteases a partir de géis 2D SDS/SDS com gelatina ............................... 56

7.3 Purificação de proteases a partir de géis nativos 10% ..................................................... 58

8. Detecção dos substratos endógenos ........................................................................... 61

9. Purificação dos substratos endógenos das atividades proteolíticas .............................. 69

9.1 Purificação dos substratos endógenos a partir de géis nativos 10% ................................. 69

9.2 Purificação dos substratos endógenos a partir de géis nativo/SDS-PAGE 12% ............... 69

10. Identificação dos produtos endógenos gerados pelas proteases purificadas e substratos purificado ........................................................................................................ 71

10.1 Ensaio de incubação da protease P3 purificada com substrato (66kDa) purificado a partir do gel nativo 10% ................................................................................................................ 71

10.2 Ensaio de incubação das proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas com substrato S2 purificado a partir de gel nativo/SDS 12% ............................................................................ 73

10.3 Ensaio de incubação das proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas a partir de géis nativo 10% com os substratos S1, S2, S3 e S8 purificados a partir do gel nativo/SDS 12% ............. 76

11. Proteólise endógena ............................................................................................... 83

12. Western Blotting .................................................................................................... 86

VI. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 87

VII. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 96

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................... 97

3

I. INTRODUÇÃO

A fertilização é um processo complexo, que envolve uma cascata de eventos

ligados que progridem em forma seqüencial e altamente regulada, finalizando com a

fusão dos pró-núcleos, integração dos genomas haplóides e ativação do programa

de desenvolvimento do zigoto que dará origem a um novo indivíduo. Os

espermatozóides passam por uma série de processos preparatórios prévios à

fertilização, entre eles maturação espermática (no conduto epididimário) e

capacitação (nas vias genitais da fêmea). Somente espermatozóides maduros,

capacitados e com acrossoma intacto penetram o cumulus atingindo a zona pelúcida

do gameta homólogo (RETAMAL, 1999).

O processo de maturação espermática compreende uma série de

modificações nas características morfológicas, bioquímicas, biofísicas e funcionais

do gameta, entre elas a aquisição da motilidade progressiva unidirecional e o

potencial fertilizante. Uma expressão deste processo é a remodelação de proteínas,

glicoproteínas e lipídeos da membrana. Devido à capacidade biossintética limitada

do espermatozóide, postula-se que estas remodelações pós-testiculares estariam

fortemente influenciadas pelo microambiente epididimário (EDDY & O´BRIAN, 1994;

LÓPEZ, 1996; RETAMAL et al., 2000 a,b). Algumas destas modificações são

conseqüências de uma clivagem pré-programada e regulada de moléculas integrais,

enquanto outras podem resultar da adição ou absorção de moléculas presentes no

fluido epididimário (AMMAN, 1995; RETAMAL et al., 2000a; DIAS et al., 2004).

Estudos prévios realizados em nosso laboratório, utilizando como modelo

experimental espermatozóides de Equus caballus, têm demonstrado diferenças na

distribuição e concentração relativa de proteínas, glicoproteínas e lipídeos de

espermatozóides imaturos e maduros, obtidos das diferentes regiões do epidídimo

(LÓPEZ et al., 1987; LÓPEZ & DE SOUZA, 1991; LÓPEZ, 1996; RETAMAL, 1999;

DIAS, 2002). Essas diferenças podem estar relacionadas com a ruptura proteolítica

de componentes pré-existentes e redistribuição dos componentes clivados em

diferentes domínios da membrana (LIU et al., 2001; RUTLLANT & MEYERS, 2001).

Como exemplo, os trabalhos de PHELPS et al. (1990) e JONES et al. (1996)

demonstraram o processamento endoproteolítico das proteínas PH20 e PH30,

4

distribuídas em toda a região da cabeça nos espermatozóides testiculares, e

exclusivamente no domínio pós-acrossomal em espermatozóides epididimários.

Esses trabalhos reforçam o conceito que algumas moléculas-chave seriam

primeiramente sintetizadas como precursores e logo se ativariam - no tempo e local

apropriado - para cumprirem sua função, permitindo assim, um grau de auto-

regulação em células que estão transcricionalmente inativas (JONES et al., 1996).

Os espermatozóides são ricos em diferentes proteases, as quais se localizam,

principalmente, na vesícula acrossomal (TULSIANI et al., 1998; MÉTAYER et al.,

2002). A manutenção do equilíbrio entre proteases e seus inibidores é fundamental

na conservação da barreira hemato-testicular e no desenvolvimento do gameta.

Manter as proteases acrossomais inativas é crucial para manutenção da integridade

física desta célula. Em contraste com as proteases e seus inibidores do testículo e

da célula espermática, as proteases envolvidas na função epididimária têm sido

menos estudadas. Proteases e seus inibidores têm sido detectados no fluido

epididimário de algumas espécies (MÉTAYER et al., 2002), o que sugere um papel

similar no processo de maturação espermática e na plasticidade deste órgão, ou em

ambos.

Tendo em vista estes antecedentes, o propósito deste trabalho é caracterizar

as metaloproteases detectadas no fluido epididimário de E. caballus, bem como

identificar e caracterizar seus principais substratos endógenos. A caracterização de

proteínas comprometidas na diferenciação do gameta possibilitará uma melhor

compreensão dos processos de maturação espermática e fertilização em mamíferos.

5

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1. Epidídimo e o processo de maturação espermática

O conhecimento a respeito das mudanças que ocorrem no espermatozóide

durante o trânsito epididimário é fundamental para compreensão dos mecanismos

envolvidos na aquisição do potencial fertilizante em mamíferos.

Convencionalmente, o epidídimo é dividido em quatro regiões

macroscopicamente bem definidas: cabeça proximal, cabeça distal, corpo e cauda

(Figura 1); porém, suas características morfológicas podem variar entre diferentes

espécies (LÓPEZ et al., 1989).

Figura 1. EPIDÍDIMO DE Eqqus caballus. 1- região de cabeça proximal. 2- região de cabeça distal. 3- região de corpo e 4- região de cauda.

O conduto epididimário oferece condições que permitem o bom

desenvolvimento do processo de maturação espermática e também a viabilidade e

transporte do gameta. Vários tipos celulares encontram-se no epitélio epididimário:

células principais, ciliadas (exclusivamente na região proximal da cabeça), basais,

apicais e leucócitos intra-epiteliais. As células principais possuem propriedades de

absorção, secreção e síntese de vários compostos do fluido epididimário (LÓPEZ et

al., 1989; FOURNIER DELPECH & THIEBAULT, 1993; RETAMAL et al., 2000b) e

apresentam diferenças regionais tanto na sua morfologia, como na sua função. Na

região proximal, há uma considerável absorção de água e fluido provenientes da

rete testis; nas regiões de cabeça e corpo os espermatozóides adquirem o potencial

6

fertilizante; e a região de cauda é o local de armazenamento dos espermatozóides

até o momento da ejaculação. Estruturalmente, o retículo endoplasmático rugoso

abundante e membranas do sistema de Golgi muito desenvolvidas refletem as

propriedades de síntese e secreção protéica destas células (ROBAIRE & HERMO,

1988; LÓPEZ et al., 1989). Na região apical, as células principais estão fortemente

unidas pela zona oclusiva que forma parte da barreira hemato-epididimária, o que

permite a manutenção de um microambiente no lúmen do conduto (LÓPEZ et al.,

1997), bem como a proteção imunológica do espermatozóide (HINTON et al., 1995).

O fluido epididimário é hiperosmótico e difere em composição do plasma

sangüíneo, do fluido testicular e do plasma seminal. Entre os constituintes orgânicos

do fluido epididimário, além de L-carnitina, mioinositol, glicerilfosforilcolina, ácido

siálico, esteróides e outros, encontram-se diferentes íons e várias proteínas como

transferrina, albumina, clusterina, imobilina, metaloproteínas e enzimas

(glicosidases, glicosiltransferases, glutationa-peroxidase, superóxido-dismutase,

transpeptidases, entre outras (SETCHELL et al., 1994). As proteínas detectadas

neste fluido podem ser de origem epididimária ou ter origem testicular, chegando via

fluido da rete testis ao lúmen deste órgão (FOUCHÉCOURT et al., 2000). A ação de

cada uma destas moléculas na fisiologia do epidídimo não está bem definida, mas

tem-se sugerido que poderiam estar envolvidas na osmoregulação, na maturação

espermática e no metabolismo de espermatozóides e células epiteliais epididimárias

(SETCHELL et al., 1994).

Além de promover o processo de maturação espermática e ser local de

armazenamento de espermatozóides até o momento da ejaculação, o epidídimo

facilita o transporte de espermatozóides, os quais se encontram em estado

quiescente por fatores do fluido luminal (ROBAIRE & HERMO, 1988). A produção e

movimento constantes do fluido proveniente dos testículos, a corrente que produzem

os cílios e as microvilosidades das células epiteliais, a reabsorção de água na região

proximal do conduto e as contrações peristálticas das células mióides e da

musculatura lisa que envolve o epitélio epididimário, facilitam o transporte dos

gametas (TURNER, 1979).

O epidídimo possui vários mecanismos de proteção ao espermatozóide, além

de barreiras estruturais como a barreira hemato-epididimária (LOPÉZ et al., 1987).

São eles: a produção de proteínas que protegem da proteólise, como a HE4 -

polipeptídio ácido rico em cisteína (10kDa), as proteínas cistatinas, relacionadas

7

com a espermatogênese epididimária (CRES - cystatin-related epididymal

spermatogenic), da superfamília de inibidores de cisteíno proteases ou as proteínas

pertencentes à família desintegrina metaloproteases (ADAM) descritas em roedores

e macacos (BLOBEL, 2000; FRAYNE et al., 1997; PRIMAKOFF & MYLES, 2000;

EVANS, 2001). Estas proteínas podem proteger os espermatozóides e/ou o epitélio

epididimário de dano proteolítico resultante da liberação prematura de enzimas

acrossomais durante o armazenamento de espermatozóides (MÉTAYER et al.,

2002). Um outro mecanismo de proteção ao gameta, constitui a presença de enzimas

antioxidantes contra espécies reativas de oxigênio e substâncias xenobióticas. Todas

essas funções epididimárias estão precisamente coordenadas e reguladas de forma a

assegurar a produção de espermatozóides viáveis e funcionais.

2. Proteases

As proteases foram inicialmente associadas ao catabolismo protéico; no

entanto, tem-se aceito que a alta especificidade de hidrólise de peptídeos pode

regular uma gama de processos biológicos (FREDERIKS & MOOK, 2004).

Proteases e seus inibidores desempenham papéis-chave em processos fisiológicos,

como migração, sinalização celular, remodelação da superfície de células e tecidos.

Estas enzimas podem pertencer a cinco diferentes famílias dependendo da natureza

do sítio ativo: 1) proteases aspárticas, como as catepsinas D e E e pepsinas; 2)

cisteíno proteases, como as catepsinas B, L, S, K e Q, calpaínas e caspases; 3)

metaloproteases, que envolvem as gelatinases, 4) serino proteases, como os

ativadores de plasminogênio, a plasmina e algumas quinases e 5) treonino

proteases, como os proteassomos (FREDERIKS & MOOK, 2004).

Um grande número de proteases e seus inibidores têm sido detectados no

testículo, órgão que experimenta importantes remodelações durante a

espermatogênese. Várias destas proteases, tais como a procatepsina L, furina tipo

PC4, ou neprilisinas estão relacionadas com processamento de proteínas

específicas (ERICKSON-LAWRENCE et al., 1991; MBIKAY et al., 1997; GHADDAR

et al., 2000), enquanto outras, como o ativador de plasminogênio e metaloproteases

da matriz (MMPs), estariam envolvidas na remodelação tecidual, migração celular ou

interações célula-célula (GUNNARSSON et al., 1999; LONGIN et al., 2001;

HOEBEN et al., 1996; ROBINSON et al., 2001; MÉTAYER et al., 2002). A presença

8

de inibidores de protease como α2-macroglobulina e cistatina (inibidor de proteína

C) e inibidores mais específicos como metaloproteinases tecido específicas (TIMPs)

tem sido descrita no testículo (CHENG et al., 1990; UHRIN et al., 2000; NOTHNICK

et al., 1998). O desequilíbrio entre estes componentes resulta em uma série de

patologias, entre elas, o câncer (LIU et al., 2001).

Os espermatozóides também são ricos em diferentes tipos de proteases

(TULSIANI et al., 1998; KOHNO et al., 1998). Uma das proteases mais bem

estudada é a acrosina, a qual apresenta um importante papel na interação do

espermatozóide com a zona pelúcida (YAMAGATA et al., 1998). Uma serino

protease com atividade do tipo tripsina, denominada BSp66 (Bovine Sperm

Protease, 66 kDa), localizada na região acrossomal tem sido observada em

espermatozóides de bovinos, roedores e humanos. Imunologicamente, BSp66 não

está relacionada com outras proteases descritas nos espermatozóides (CESARI et

al., 2004). Uma indicação da presença de cisteíno - proteases no trato reprodutor de

alguns mamíferos é a expressão de proteínas CRES, pertencentes à superfamília

das cistatinas, inibidores de cisteíno proteases (SUTTON et al., 1999). A proteína

CRES localiza-se no acrossoma e é liberada durante a reação acrossomal. A

presença desta proteína no acrossoma, sítio de alta atividade hidrolítica, sugere sua

participação na regulação do processamento de proteínas intra-acrossomais

(SYNTIN & CORNWALL, 1999). Elas são sintetizadas no epidídimo e apresentam

localizações específicas. CRES 19 e 14 kDa estão presentes em espermatozóides

obtidos do testículo e da cabeça proximal do epidídimo. Entretanto, a CRES 14 kDa

foi a forma predominante no espermatozóide epididimário maduro, obtido da região

da cauda (SYNTIN & CORNWAL, 1999). Outra função para proteases no trato

reprodutor masculino é a atividade proteásica associada com ubiquitina, um

marcador proteolítico, que foi demonstrada mediante técnicas imunológicas em

espermatozóides defeituosos no trato reprodutor masculino de homens e touros.

Também foi investigada a ubiquitinação de espermatozóides epididimários e

testiculares de garanhão. Os dados mostrados sugerem que o espermatozóide é

diferencialmente ubiquitinado durante a maturação espermática e que esta

ubiquitinação pode refletir mudanças na qualidade do sêmen (SUTOVSKY, 2003).

Diversas funções têm sido associadas a estas enzimas, como a proteólise de

moléculas do acrossoma, a participação nas cascatas de transdução de sinais que

desencadeiam a reação acrossomal, o controle destas macromoléculas, a ruptura

9

das coberturas ovocitárias e a participação como ligante na interação primária com o

ovócito (MORALES et al., 2003; SUTOVSKY, 2003; HONDA et al., 2002; HOWES &

JONES, 2002).

A maturação espermática envolve grandes mudanças em diferentes domínios

da membrana do espermatozóide, principalmente, modificações das proteínas e

glicoproteínas que fazem parte da sua composição. Algumas destas modificações

resultam de um processamento proteolítico específico, que conduz ao

desaparecimento ou a redistribuição de proteínas entre os diferentes domínios

(YANAGIMACHI, 1994; PHELPS et al., 1990). Exemplos de processamento

proteolítico são: a transformação que experimentam proteínas da família ADAMs, em

roedores e macacos (BLOBEL, 2000; FRAYNE et al., 1997; PRIMAKOFF & MYLES,

2000; EVANS, 2001), do antígeno CE9 de espermatozóides em ratos (PETRUSZAK

et al., 1991), da proteína pH20 / 2B1 (SEATON et al., 2000), de manosidase de javali

(OKAMURA et al., 1992) e da alfa D-glicosidase (DIAS et al., 2004). Algumas MMPs

e várias serino proteases com atividade gelatinolítica e inibidores de proteases têm

sido observadas no fluido testicular e epididimário de mamíferos domésticos

(MÉTAYER et al., 2002). Contudo, a presença, características e papel fisiológico

destas enzimas no epidídimo de diferentes espécies não estão bem caracterizados.

10

3. Metaloproteases de Matriz Extracelular (MMPs)

As Metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs), coletivamente

chamadas de matrixinas, são proteinases que participam da degradação da matriz

extracelular (VISSE & NAGASE, 2003). Estas enzimas pertencem a uma família de

pelo menos 20 membros, produto de genes, homólogos ou pseudo-homólogos,

relacionados entre si (WOESSNER, 1991).

As MMPs de vertebrados podem ser classificadas em seis grupos com base

na especificidade pelo substrato, similaridade na seqüência e organização dos

domínios: colagenases (MMP1, MMP8, MMP13 e MMP18), gelatinases (MMP2 e

MMP9), estromelisinas (MMP3, MMP10 e MMP11), matrilisinas (MMP7 e MMP26) e

metaloproteínas de membrana (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP24 e

MMP25, também conhecidas como MT1-MMP a MT6-MMP, respectivamente.) Há

também outras MMPs que possuem características especiais que impedem sua

inserção nos grupos citados (VISSE & NAGASE, 2003), tais como a metaloelastase

de macrófago (MMP12) (BELAAOUAJ et al., 1994), a estromelisina-3 (BASSET et

al., 1990), MMP-19 (PENDÁS et al.,1997) e a enamelisina (MMP20) (LLANO et al.,

1997) dentre outras. (Tabela I).

11

Tabela I - A família das metaloproteases de matriz e seus substratos

Número

Nome (Referência Bibliográfica)

P M

Substrato

MMP-1 Colagenase tipo I (Goldberg et al.,

1986)/ Colagenase intersticial

57 L

52 A

Colágeno I, II, III, VII, VIII e X

Gelatinas, Agrecan, Tenascina

MMP-2 Colagenase tipo IV (Collier et al., 1988)/

Gelatinase A (72kDa)

72 L

67 A

Colágeno I,IV,VII,X,XI,FN, LM, Elastina, Agrecan,

Gelatinas

MMP-3 Estromalisina 1 (Whitham et al., 1987)

57 L

45 A

Colágeno I,III,IV,V,VIII,IXe XI

Agrecan, FN, LM, VN, Elastina, Gelatinas,

Tenascina, Decorina, Proteoglicanases,

procolagenases ativadas, procolágeno

MMP-7 Matrilisina (Quantin et al., 1989) 28 L

19 A

Gelatinas;

Fibronectina

MMP-8 Colagenase PMN (Hasty et al., 1990)

Colagenase de neutrófilo

75 L

65 A

Colágeno I, II, III, VII e X;

Agrecan

MMP-9 Colagenase IV (Wilhelm et al., 1989)

Gelatinase B

92 L

84 A

Colágeno I, III, IV e VII, X e XI;

Gelatinas, VN, Elastina, Agrecan,, Colagenase V

MMP-10 Estromalisina 2 (Muller et al., 1988)

57 S

45 A

Colágeno I,III,IV,V,VIII,IX e XI; FN, LM, Elastina e

Agrecan; Gelatinas I,III,IV eV

MMP-11 Estromalisina 3 (Basset et al., 1993) 55 S

28 A

Caseína (domínio N-terminal); 1-1-anti-tripsina

MMP-12 Metaloelastase (Shapiro et al., 1993) 53 L

Elastina

MMP-13 Colagenase 3 (Freije et al., 1994) 57 L Colágeno I, II, III, VII e X, agrecan, gelatina

MMP-14 Metaloprotease de membrana tipo I

MT1-MMP (Sato et al., 1994)

66 L Ativa proMMP-2 e possivelmente outras MMPs;

Colágeno I, II e III, dermatan sulfato, cadeia B da

LM, FN, Gelatina e VN

MMP-15 Metaloprotease de membrana tipo 2

MT2-MMP (Will & Hinzmann, 1995)

72 L Colágeno fibrilar, proMMP-2, proMMP-13, gelatinas,

LM, FN


MT3-MMP (Takino et al., 1995)

64 L ProMMP-2


MT4-MMP (Puente et al., 1996)

nd Provavelmente ativa fatores de crescimento

MMP-18 Colagenase 4 (Stolow, 1996) 55 Colágenos fibrilares

MMP-20 Enamelisina (Llano et al., 1997) 56 Amelogenina

MMp-24 Metaloprotease de membrana tipo 5

MT5-MMP (Llano et al., 1999)

nd ProMMP-2


MT6-MMP (Llano et al., 1999)

nd ProMMP-2

MMP-26 (Liekens et al., 2001;Lafleur et al., 2002) nd desconhecido

L = latente; A = ativa; nd = não determinado

12

Embora as MMPs sejam classificadas de acordo com o substrato pela qual

possuem afinidade, nota-se que há sobreposição entre as subclasses, significando

que as MMPs não têm necessariamente um substrato definido. Isto se torna mais

notório em processos patogênicos como a proteólise relacionada à invasão tumoral.

Além disso, as atividades das MMPs interferem umas com as outras, podendo ativar

outras proenzimas, o que sugere que a ativação controlada das mesmas pode

envolver uma cascata, englobando diferentes membros da família das MMPs

(CAWSTON, 1998).

Todas as MMPs têm algumas características em comum, incluindo, dentre

estas: 1) um peptídeo sinal que direciona o produto para secreção, 2) um domínio

pro-peptídico, 3) domínio catalítico que acomoda um átomo de Zn+2, essencial para

a manutenção de sua latência enzimática e é removido quando a enzima é ativada

(SHIMA et al., 1992). A maioria das MMPs, com exceção das MMP7, MMP26 e

MMP23, também possui um domínio C-terminal com uma seqüência de homologia a

hemopexina, que constitui um sítio de ligação para os inibidores teciduais. As

gelatinases –A e –B (MMPs 2 e 9) diferem das demais por apresentarem um

domínio semelhante a fibronectina (Fn) (Figura 2) (VISSE & NAGASE, 2003). A

gelatinase B possui ainda um domínio semelhante ao colágeno. As MT-MMPs são

caracterizadas por um domínio transmembrana que é responsável pela ancoragem

da enzima à membrana plasmática (NGUYEN et al., 2001; LIEKENS et al, 2001).

Todas as MMPs requerem um pH neutro e Ca+2 para poderem atuar e são inibidas

por uma família específica de proteínas, que se denominam inibidores tissulares de

MMP (TIMP) (MATRISIAN ,1990; NGUYEN et al., 2001). Atualmente, são

conhecidos quatro membros da família das TIMPs que são capazes de se ligar e

inibir a atividade de todos os membros da família das MMPS. Eles demonstram,

entretanto, diferenças na sua distribuição nos tecidos e na habilidade de formar

complexos com a forma inativa da MMP (MCCAWLEY & MATRISIAN, 2000).

13

Figura 2. ESTRUTURA DAS METALOPROTEINASES DE MATRIZ MMP-2 E MMP-9.

As MMPs estão amplamente distribuídas no organismo humano onde

desempenham uma série de funções fisiológicas como, por exemplo, na cicatrização

(WOLF et al., 1992), na reabsorção óssea (DELAISSÉ & VAES, 1992), na involução

mamária (TALHOUK et al., 1992) e em outras funções fisiológicas associadas a

gravidez e parto (JEFFREY, 1991). Recentemente, tem-se demonstrado que as

MMPs também estão implicadas em processos patológicos variados como na artrite

reumatóide (HARRIS, 1990), na enfermidade periodontal (PAGE, 1991), na

esclerose múltipla (CHANDLER et al., 1997), em algumas doenças cardiovasculares

(TAMARINA et al., 1997) e certas alterações hematológicas (GUEDEZ et al., 1996).

Em condições fisiológicas normais, a atividade das MMPs é regulada por

expressão gênica, por ativação da pró-enzima e por inativação da enzima ativa, por

inibidores tissulares específicos e por interação com componentes específicos da

matriz extracelular (VISSE & NAGASE, 2003).

A expressão de MMPs é induzida por fatores de crescimento, interação

célula-célula e interação célula-matriz. Muitos genes de MMPs (mmp1, mmp3,

mmp7, mmp9, mmp10, mmp12 e mmp13) são induzíveis por estímulos

extracelulares que ativam um fator de transcrição dimérico, o complexo ativador de

proteínas 1 (AP1), composto pelas proteínas JUN e FOS, que interage com o

promotor de genes MMPs e ativa sua transcrição. A indução da expressão e

atividade de AP1 é mediada por três classes de proteínas quinases ativadas por

mitógenos (MAPK), quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs), quinase do

N-terminal de JUN ativada por estresse (JNK) e proteína p38 (WESTERMARCK &

KAHARI, 1999). A proteína quinase C (PKC) ativa a via de sinalização de

14

ERK1/ERK2. Recentemente, tem-se mostrado que a super expressão de isoformas

de PKC resulta na ativação do promotor de MMP1. PKC também desempenha

função importante na expressão de MMP9 em células de gliomas malignos

(YABKOWITZ et al., 1999). As células endoteliais também sintetizam várias MMPS:

MMP-1, MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP. Dentre estas a MMP-2 (gelatinase-A, 72kDa),

MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) e a MT1-MMP foram descritas como exercendo

importante papel na angiogênese (STETLER-STEVENSON, 1999).

4. Maturação espermática e atividade proteolítica

As mudanças observadas durante a diferenciação do gameta são de natureza

bem diversa e afetam tanto características estruturais (núcleo, acrossoma,

membranas), funcionais (padrão metabólico, grau de motilidade) como a

suscetibilidade do gameta às condições do meio. Algumas delas são provavelmente

necessárias à interação gamética, enquanto outras permitem a estabilização de

estruturas e a sobrevida do gameta no percurso pelo epidídimo (FOURNIER

DELPECH & THIEBAULT, 1993; LÓPEZ, 1996).

A qualidade do espermatozóide, em termos de mobilidade e reconhecimento do

ovócito, é fortemente dependente de diferenciações pós-testiculares que ocorrem no

epidídimo (GATTI et al., 2004). Essas modificações surgem, possivelmente, como

resultado da liberação e/ou degradação de componentes testiculares, absorção e

integração de proteínas secretadas pelo epidídimo ou por modificação de resíduos

oligossacarídicos ligados a proteínas ou lipídeos de membrana. Glicosilações,

proteólise, re-localização de componentes pré-existentes são alguns mecanismos já

descritos (DACHEUX et al., 2003; TULSIANI et al., 1995).

Há na literatura a descrição de uma série de proteínas espermáticas

proteoliticamente processadas durante o trânsito epididimário, entre elas:

hialuronidase, pH20, proteína CE9 e galactosidase, a qual existe como uma forma

de 90 kDa em espermatozóides obtidos da região de cabeça proximal e é

gradualmente convertida para uma forma majoritária de 74 kDa em espermatozóides

de cauda (CHAYKO et al., 2000). Outro exemplo de processamento proteolítico é a

fertilina. Esta é um heterodímero transmembranar com domínios pro-

metaloprotease, disintegrina, rico em cisteína e EGF, e que pertence a família ADAM

15

(YUAN et al., 1997). Esta proteína (previamente chamada PH30) sofre pelo menos

dois processamentos proteolíticos distintos: um no testículo e outro no epidídimo

(LUM & BLOBEL, 1997). Estes dados indicam que algumas proteínas podem ser

secretadas ou estarem presentes em uma pró-forma e tornam-se ativadas após o

processamento no fluido (GATTI et al., 2004). A análise da maturação intracelular e

atividade catalítica de uma desintegrina metaloprotease amplamente expressa, a

MDC9, sugere que o pro-domínio da MDC9 é removido por uma convertase tipo

furina da via secretora, depois que a proteína emerge na superfície, e que a

atividade catalítica da MDC9 pode ser inibida por inibidores de metaloprotease. A

remoção de um pró-domínio inibitório da MDC9 é um pré-requisito para a atividade

proteásica. Passos adicionais, como o de proteínas quinases C dependentes de

fosforilação, podem estar envolvidos na regulação da atividade enzimática da MDC9

(ROGHANI et al., 1999). Manter estas proteases em um estado inativo durante a

passagem do gameta pelas vias seminais é crítico para assegurar sua função

reprodutiva (UHRIN et al., 2000; ZHENG et al., 1994).

16

III. OBJETIVOS

1. Objetivo geral

Contribuir ao estudo do processo de maturação espermática de E. caballus

analisando a ocorrência de atividade metaloproteásica, bem como seus substratos e

produtos endógenos, no fluido epididimário.

2. Objetivos específicos

Detectar e caracterizar atividade de metaloproteases nos fluidos das diferentes

regiões do epidídimo de eqüinos.

Selecionar e purificar algumas metaloproteases do próprio fluido epididimário da

região de cauda.

Detectar a presença de substratos endógenos nas diferentes regiões do

epidídimo de eqüinos.

Selecionar e purificar alguns substratos endógenos das metaloproteases

purificadas.

Identificar os produtos de hidrólise mediante ensaios de metaloproteases

isoladas da região de cauda epididimária incubadas com substratos endógenos

isolados desta mesma região.

17

IV. MATERIAIS E MÉTODOS

1. Obtenção das amostras

Os epidídimos foram obtidos por castração cirúrgica de animais sadios,

sexualmente maduros, de haras da Região Norte Fluminense. As gônadas e vias

espermáticas superiores foram cuidadosamente dissecadas retirando-se o tecido

conjuntivo adjacente. Os epidídimos foram divididos em quatro regiões: (1) cabeça

proximal, (2) cabeça distal, (3) corpo e (4) cauda (Esquema 1). Cada região foi

colocada em uma placa de Petri contendo PBS, pH 7,2 e fragmentada com uma

tesoura de forma a liberar o conteúdo luminal em 5 mL de tampão na região de

cabeça proximal e em 10 mL nas demais regiões epididimárias. O conteúdo foi

filtrado em gaze dupla e centrifugado a 700 g por 30 min. a 4°C, numa centrífuga

Hitachi, para a separação do fluido epididimário dos espermatozóides. O fluido foi

novamente centrifugado, nas mesmas condições, para a remoção de células

espermáticas. As diferentes amostras foram devidamente aliquotadas, identificadas

e estocadas a -20°C, após determinação da concentração de proteínas totais.

1 2

3

4

Esquema 1: DIAGRAMA MOSTRANDO AS DIFERENTES REGIÕES DO EPIDÍDIMO: 1 – cabeça proximal, 2 – cabeça distal, 3- corpo e 4 - cauda.

18

2. Determinação da concentração de proteínas

As diferentes amostras foram devidamente identificadas e estocadas a -20°C,

após determinação da concentração de proteínas totais de cada uma delas

(BRADFORD, 1976). Na curva padrão foi utilizada albumina sérica bovina (BSA) com

concentração variando entre 0 e 20 µg, com intervalos de 2 µg. As leituras foram

realizadas em um leitor de Elisa (Lab System modelo mult-scan), a 595 nm de

comprimento de onda ou em um espectrofotômetro FEMTO 600 plus, sob mesmo

comprimento de onda.

3. Análise do perfil eletroforético de amostras de fluido epididimário

As amostras foram analisadas em SDS-PAGE 12% (LAEMMLI, 1970) (50 µg

de proteínas por poço – quantidade de proteína padronizada para a maioria dos

experimentos). Posteriormente, os géis foram corados com azul de Coomassie R-250

0,1% (v/v). As análises da mobilidade eletroforética, e a quantificação relativa das

bandas foram realizadas mediante um programa computacional "Gel Perfect" (BOZZO

& RETAMAL, 1991; RETAMAL et al., 1999). A determinação da massa molecular foi

realizada relacionando a mobilidade das proteínas das amostras em estudo, com a

mobilidade de proteínas de massa molecular conhecida, utilizando o mesmo

programa.

4. Detecção de proteólise endógena no fluido epididimário

Visando detectar proteólise endógena no fluido epididimário, amostras das

diferentes regiões epididimárias foram incubadas a 37ºC (Esquema 2A). Alíquotas de

cada amostra foram retiradas em diferentes intervalos de tempo (30 min.; 1h; 3h; 6h,

12h, 24h, 36h, 48h, 72h) e congeladas a -20ºC. Como controle uma alíquota de fluido

de cada região epididimária não foi incubada e foi mantida congelada a -20ºC. As

alíquotas foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 15%, na presença de β-

mercaptoetanol 10% (v/v) para a visualização dos resultados.

Outra estratégia foi utilizada para detectar a proteólise endógena. Neste caso, a

amostra de fluido epididimário de cauda foi submetida a eletroforese em um gel de

19

poliacrilamida 10%, em condições nativas (adaptado de DAVIS, 1964). As tiras de gel

nativo foram cortadas e mantidas em tampão de amostra 2x (Tris-HCl 0,5M pH 6,8,

SDS 10% (v/v), azul de bromofenol 1%, glicerol 10% (v/v)), na temperatura ambiente,

por diferentes intervalos de tempo (24h, 48h, 72h, 96h e 120h) e congeladas a -20ºC.

Posteriormente, as tiras foram descongeladas e submetidas a uma segunda

eletroforese em géis SDS-PAGE 12% (Esquema 2B).

Esquema 2. DETECÇÃO DE PROTEÓLISE ENDÓGENA NO FLUIDO EPIDIDIMÁRIO. A- Incubação das amostras de fluido das diferentes regiões epididimárias a 37ºC; alíquotas foram retiradas em diferentes intervalos de tempo (30 min.; 1h; 3h; 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h). A visualização do experimento foi realizada em SDS-PAGE 15%. B- Esquema da incubação das tiras de gel nativo, de fluido epididimário de cauda, a temperatura ambiente, alíquotas foram retiradas em diferentes intervalos de tempo (24h, 48h, 72h, 96h e 120h).

20

5. Detecção de atividade metaloproteásica

As amostras de fluido das diferentes regiões epididimárias, de diferentes cavalos,

foram submetidas a eletroforese em SDS-PAGE 12%, 0,4% (v/v) gelatina (HUMMEL et

al., 1996, MÉTAYER et al., 2002). Os géis contendo gelatina foram incubados em Triton

X-100 2,5% (v/v) durante 3h. Posteriormente, foram lavados 3x (5 min) em H2O destilada

sob agitação e incubados em tampão de incubação (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, CaCl2 4

mM, pH 7,5) (adaptado de MÉTAYER et al., 2002) a 37ºC por 72h e visualizados sob UV.

Em seguida, os géis foram corados com azul de Coomassie R-250 e descorados em

água destilada em ciclos de lavagem de 2 min em microondas (LG comercial) com

potência máxima. As bandas de atividade aparecem brancas em um fundo azul.

6. Ação de inibidores sobre as atividades proteolíticas

A caracterização da atividade proteolítica foi realizada mediante o uso de

diferentes inibidores de proteases. As amostras de fluido das diferentes regiões

epididimárias foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 12% com gelatina

0,4% (v/v). Posteriormente, os géis foram incubados com Triton X-100 2,5% durante

3h e lavados conforme já descrito anteriormente. Cada gel foi incubado com tampão

de incubação (descrito no item 5) contendo separadamente diferentes inibidores de

proteases: PMSF 100 µM, inibidor para serino protease; EDTA 10 mM, inibidor para

metaloprotease e iodoacetamida 10 mM, inibidor para cisteíno proteases. Um gel

controle foi incubado com tampão de incubação sem inibidores (adaptado LUM &

BLOBEL, 1997).

7. Verificação do pH ótimo

A caracterização da atividade proteolítica também foi realizada mediante a

verificação das atividades a diferentes pHs. As amostras de fluido das diferentes

regiões epididimárias foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 12% com

gelatina 0,4% (v/v). Os géis foram incubados com Triton X-100 2,5% durante 3h e

lavados. Cada gel foi incubado com tampão de incubação (descrito no item 5)

ajustado a diferentes pHs: 2,5; 4,5; 6,5; 7,5; 10 e 12.

21

8. Determinação do grau de anomalia das proteases na migração

eletroforética

O grau de anomalia das proteases na migração eletroforética foi detectado

através da análise das amostras em estudo por SDS-PAGE 10% na presença de um

gradiente de gelatina 0 – 0,6% (v/v). Nestes géis, uma faixa larga (1,5 cm) de SDS-

PAGE 10% sem gelatina foi polimerizada ao lado da porção do gel gradiente

(Esquema 3). As amostras das diferentes regiões epididimárias foram submetidas a

este tipo de gel em uma concentração de 100 µg (poço único) sem agente redutor.

Após a eletroforese os géis foram incubados com Triton X-100 2,5% (v/v) durante 3h,

lavados, incubados em tampão de incubação (descrito no item 5) e corados com azul

de Coomassie. Foram feitos gráficos de Ferguson para a determinação da constante

de retardação (FERGUSON, 1964). A constante de retardação (Kr) das proteases foi

determinada em um gradiente de gelatina tendo como suporte uma concentração

constante de acrilamida.

Outra abordagem para determinação do grau de anomalia na migração

eletroforética causada pela gelatina foi a sobreposição de géis 2D desnaturantes

(DIAS, 2002) com e sem gelatina 0,4% (v/v). As proteínas de fluido epididimário das

diferentes regiões foram submetidas a eletroforese em SDS-PAGE 12%. As tiras

correspondentes aos poços foram cortadas e incubadas durante 20 min. em tampão

de amostra 2x (citado no item 4) sem β-mercaptoetanol e com este agente redutor a

uma concentração de 10%. Cada tira foi então submetida a uma segunda

eletroforese (re-eletroforese) em SDS-PAGE 12% com e sem gelatina 0,4% (v/v).

Estes géis SDS/SDS e SDS/SDS com gelatina foram sobrepostos em quatro

imagens. Algumas imagens foram invertidas no programa computacional Photo

Impact. Além disso, foi feito um gráfico para ilustrar de maneira didática a variação

no coeficiente angular das retas de diferentes mobilidades relativas (Rfs) que foram

geradas pela presença de gelatina.

22

Esquema 3. DETERMINAÇÃO DO GRAU DE ANOMALIA DAS PROTEASES NA MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA. SDS-PAGE 10% gradiente de gelatina de 0 – 0,6% (v/v) com uma tira de SDS-PAGE 10% sem gelatina utilizado para a determinação do grau de anomalia das proteases na migração eletroforética. A seta indica o sentido crescente da concentração de gelatina.

9. Determinação das massas moleculares das proteases de fluido

epididimário

Devido à anomalia causada pela presença de gelatina nos géis (HUMMEL et

al., 1996) foram feitos géis bidimensionais (modificado de SUN & PAN, 1999; DIAS,

2002) para determinação das massas moleculares das atividades gelatinolíticas

(Esquema 4). Na primeira eletroforese (1D), as amostras de fluido epididimário das

diferentes regiões foram submetidas a SDS-PAGE 12% na ausência do polímero

gelatina (LAEMMLI, 1970). Em seguida, foram cortadas tiras do gel correspondendo

aos canais de amostra. Cada tira foi incubada durante 20 min. em tampão de amostra

2x (citado no item 4) contendo β-mercaptoetanol 10% e também sem este agente

redutor. As tiras foram submetidas a uma segunda eletroforese (2D), realizada nas

mesmas condições desnaturantes na presença de gelatina 0,4% (HUMMEL et al.,

1996; MÉTAYER et al., 2002). Os géis com gelatina foram incubados em Triton X-

100 2,5% e lavados conforme descrito anteriormente e incubados em tampão de

incubação (descrito no item 5) (adaptado de MÉTAYER et al., 2002) e visualizados

com luz ultravioleta e /ou reveladas com azul de Coomassie R-250 para sua

identificação. A determinação da massa molecular relativa das proteases foi estimada

relacionando a mobilidade das proteínas das amostras do gel 1D com a mobilidade de

23

proteínas que apresentam massa molecular conhecida, indicadas pelas atividades

proteolíticas do gel 2D.

Esquema 4. DETERMINAÇÃO DAS MASSAS MOLECULARES DAS PROTEASES NO FLUIDO EPIDIDIMÁRIO. As amostras de fluido epididimário foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 12% (1D), as tiras foram submetidas a uma segunda eletroforese em SDS-PAGE 12% contendo gelatina 0,4%. PM- Padrão de Massa Molecular. As setas indicam o sentido da migração das proteínas na análise eletroforética.

24

10. Purificação das atividades proteolíticas detectadas no fluido epididimário de

cauda

10.1 Purificação das atividades proteolíticas a partir de géis

unidimensionais

As bandas com atividade proteásica foram purificadas a partir de géis

unidimensionais segundo RETAMAL et al. (1999). A atividade foi purificada de géis de

poliacrilamida 12%, SDS 0,1% (v/v) na presença de gelatina 0,4% (v/v) (Esquema 5).

As proteases foram extraídas dos locais que apresentaram atividade, seguindo como

parâmetro uma tira lateral do gel cortada e corada e também através da visualização

das mesmas sob luz UV. Em seguida, as bandas extraídas do gel foram maceradas

com 100 µl de tampão Tris HCl 5mM pH 7,4 e sonicadas, em gelo, (Sonic Dismembrator

60 Fisher Science) 20 vezes por 30 segundos, com pausa 30 de segundos, para a

extração das proteases (RETAMAL et al.,1999). As bandas extraídas, maceradas e

sonicadas foram centrifugadas a 17000 g por 30 min. (centrífuga Hermle Z 252 NK), e

os sobrenadantes coletados foram estocados em microtubos de propileno a -200C para

posterior análise.

Esquema 5. PURIFICAÇÃO DAS ATIVIDADES PROTEOLÍTICAS DETECTADAS NO FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA A PARTIR DE GÉIS UNIDIMENSIONAIS. Purificação das proteases a partir de SDS-PAGE 12% com gelatina. A- Uma tira lateral do gel foi cortada, corada com Coomassie e usada como parâmetro para o corte das bandas de atividade. B- Outra abordagem para o corte das bandas de atividade foi a visualização das mesmas em luz UV.

25

10.2 Purificação das atividades proteolíticas a partir de géis 2D SDS/SDS

com gelatina

As bandas com atividade proteásica também foram purificadas a partir de géis

bidimensionais segundo RETAMAL et al. (1999), dos quais, a primeira eletroforese foi

realizada em um gel de poliacrilamida 12%, SDS 0,1% (v/v) e, a segunda eletroforese

foi realizada em um gel nas mesmas condições na presença de gelatina 0,4% (v/v)

(Esquema 6). As proteases foram extraídas do local que mostra atividade em círculos

de 1 mm de diâmetro, com o auxílio de uma ponteira de 200 µl. Os círculos cortados de

uma mesma protease foram estocados em microtubos a -200C . Em seguida, foram

macerados com 100 µl de tampão Tris, sonicados e centrifugados (conforme descrito no

item 10.1) para a extração das proteases (RETAMAL et al.,1999). Os sobrenadantes

coletados foram estocados em microtubos a -200C para posterior análise.

Esquema 6. PURIFICAÇÃO DAS ATIVIDADES PROTEOLÍTICAS DETECTADAS NO FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA A PARTIR DE GÉIS 2D SDS/SDS COM GELATINA. A- Representação do gel SDS/SDS com gelatina corado e utilizado como parâmetro para o corte das bandas. B- Representação do gel não corado utilizado para a extração das bandas de atividade.

26

10.3 Purificação das atividades proteolíticas a partir de géis nativos 10%

As proteases também foram purificadas a partir de géis nativos 10% para evitar o

efeito da presença da gelatina sobre estas, depois de purificadas (Esquema 7). Para

isso foi necessário que a atividade proteásica fosse localizada em géis nativos. Assim,

foram realizados géis bidimensionais onde a primeira eletroforese foi feita em um gel

nativo e a segunda eletroforese em um gel de poliacrilamida 12%, SDS 0,1% (v/v) na

presença de gelatina 0,4% (v/v) (Esquema 7A). As proteases foram localizadas no gel

nativo 10% a partir do gel bidimensional (Esquema 7B) e assim, seguindo como

parâmetro o gel SDS bidimensional com gelatina, as bandas foram cortadas de géis

unidimensionais em condições nativas. (Esquema 7C). Em seguida, as bandas

extraídas do gel foram maceradas com 100 µl de tampão Tris (citado no item 10.1),

sonicadas e centrifugadas, conforme já descrito, para a extração das proteases. Os

sobrenadantes obtidos foram estocados em microtubos a -200C para posterior análise.

27

Esquema 7. PURIFICAÇÃO DAS ATIVIDADES PROTEOLÍTICAS DETECTADAS NO FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA A PARTIR DE GÉIS NATIVOS 10%. Purificação das proteases a partir de géis nativos 10%. A- Gel 2D nativo/SDS. B- Localização das bandas de proteínas correspondentes às bandas de atividade. C- Esquema do corte das bandas de atividade a partir do gel nativo. P1-Protease 1; P2- Protease 2; P3- Protease 3 e P4- Protease 4.

28

11. Detecção e identificação de substratos endógenos de fluido de cauda com

atividades proteolíticas purificadas desta mesma região

Para identificar os substratos endógenos das proteases extraídas de fluido

epididimário de cauda estas foram incubadas com fluido epididimário da mesma região

(Esquema 8). As diferentes proteases purificadas a partir de géis com gelatina 0,4%

foram incubadas com fluido epididimário de cauda, de forma separada. Os círculos de 1

mm de diâmetro, contendo as proteases, foram misturados com 200 µl de fluido

epididimário e macerados em microtubos. Os microtubos contendo a mistura foram

mantidos a 37ºC numa estufa durante 72h. Posteriormente, os ensaios foram

visualizados em géis de poliacrilamida gradiente 5 - 15%, tanto na presença de SDS

0,1% (v/v) quanto em condições nativas (adaptado de DAVIS, 1964). Também foram

analisados em géis bidimensionais nativo/SDS (SUN & PAN, 1999). Os tubos contendo

os ensaios foram armazenados a -20ºC. O resultado foi novamente analisado em SDS-

PAGE gradiente 5 - 15%. Todos os géis foram corados com azul de Coomassie,

descorados em microondas e os possíveis substratos e produtos foram visualizados,

identificados e quantificados, através da análise no programa computacional “Gel

Perfect”.

Esquema 8. DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTRATOS ENDÓGENOS DE FLUIDO DE CAUDA COM ATIVIDADES PROTEOLÍTICAS PURIFICADAS DESTA MESMA REGIÃO. Incubação das amostras de fluido de cauda a 37ºC com as proteases purificadas desta mesma região. P1+F- Protease 1 + Fluido de cauda; P2+F- Protease 2 + Fluido de cauda; P3+F- Protease 3 + Fluido de cauda; P4+F- Protease 4 + Fluido de cauda; F- Fluido de cauda incubado como controle. A visualização foi realizada em géis gradiente de acrilamida com e sem SDS e géis nativo/SDS 6-15%.

29

12. Purificação dos substratos endógenos das atividades proteolíticas

12.1 Purificação dos substratos endógenos, presentes em fluido de

cauda, a partir de géis nativos 10%

Os substratos identificados através da metodologia descrita no item anterior

foram isolados de géis nativos 10%. Para tanto, os substratos foram previamente

localizados em géis bidimensionais, nas quais a primeira eletroforese foi em um gel de

poliacrilamida nativo 10% e a segunda eletroforese em um gel gradiente de

poliacrilamida 5-15%, SDS 0,1% (Esquema 9). As proteínas de fluido epididimário de

cauda foram submetidas a géis (1D) nativos 10%. Uma vez realizada a eletroforese e

antes de corar o gel, os géis foram cortados em tiras correspondentes aos canais de

amostra e, uma delas foi corada com azul de Coomassie para servir como controle.

Outra tira foi incubada em tampão de amostra 2x (descrito no item 4). Posteriormente,

esta tira foi submetida a uma segunda eletroforese (2D) em um gel gradiente de

poliacrilamida 5-15%, SDS 0,1% (v/v) (Dias, 2002). Após a eletroforese, o gel gradiente

foi corado com azul de Coomassie e o substrato pôde ser localizado no gel nativo 10%

(Esquema 9B). Onde o substrato foi localizado foram extraídas as bandas dos géis

nativos não corados, que foram armazenadas em microtubos. Em seguida, foi

adicionado tampão de incubação (descrito no item 5) às bandas em uma proporção de

1:1 e, estas foram sonicadas, em gelo, (Sonic desmembrator 60 Fisher Science) em 12

ciclos de 30s em potência máxima, a fim de extrair do gel as proteínas candidatas a

substratos. Após isto, foram centrifugadas a 17000 g durante 10 min. a 4ºC e uma

alíquota do sobrenadante, contendo o substrato purificado, foi congelada a -20ºC.

30

Esquema 9. PURIFICAÇÃO DOS SUBSTRATOS ENDÓGENOS DAS ATIVIDADES PROTEOLÍTICAS, PRESENTES EM FLUIDO DE CAUDA, A PARTIR DE GÉIS NATIVOS 10%. A- Visualização dos possíveis substratos após a incubação das proteases com fluido em SDS-PAGE 5-15%. B- Localização do substrato em condições nativas a partir de um gel bidimensional Nativo 10%/SDS-PAGE 5-15%. C- Esquema do corte da banda de substrato a partir do gel nativo 10%. PM- Padrão de Massa Molecular. P+F- Protease + Fluido de cauda; F- Fluido controle; S- Substrato.

31

12.2 Purificação dos substratos endógenos, presentes em fluido de

cauda, a partir de géis nativo/SDS-PAGE 12%

Os substratos identificados também foram isolados de géis nativos 10%/SDS-

PAGE 12% (Esquema 10). As proteínas de fluido epididimário de cauda foram

submetidas a géis (1D) nativo 10%. Uma vez realizada a eletroforese e antes de corar

o gel, os géis foram cortados em tiras correspondentes aos canais de amostra e, uma

delas, foi corada com azul de Coomassie. As outras foram incubadas em tampão de

amostra 2x (descrito no item 4) e submetidas a uma segunda eletroforese (2D) em géis

de poliacrilamida 12%, SDS 0,1% (v/v) (Dias, 2002). Foram feitos 6 géis bidimensionais

e um deles foi corado com azul de Coomassie e utilizado como padrão para o corte das

bandas de substratos dos outros géis bidimensionais não corados. Os substratos foram

visualizados e extraídos em círculos de diâmetros variados com o auxílio de diferentes

ponteiras. Os círculos cortados foram armazenados em microtubos. Ao todo foram

isolados 8 possíveis substratos. Foi adicionado aos círculos (contendo as bandas de

substratos) tampão de incubação em uma proporção de 1:1 e, em seguida, sonicados,

em gelo, (Sonic desmembrator 60 Fisher Science) em 12 ciclos de 30s em potência

máxima, a fim de extrair as proteínas do gel. Após isto, foram centrifugados a 17000 g

durante 10 min. a 4ºC e uma alíquota do sobrenadante, contendo o substrato purificado,

foi congelada a -20ºC.

32

Esquema 10. PURIFICAÇÃO DOS SUBSTRATOS ENDÓGENOS DAS ATIVIDADES PROTEOLÍTICAS, PRESENTES EM FLUIDO DE CAUDA, A PARTIR DE GÉIS NATIVO/SDS-PAGE 12%. A- Esquema do gel nativo 10% utilizado para a visualização dos possíveis substratos após a incubação das proteases com fluido. B- Esquema da visualização dos possíveis substratos no gel bidimensional nativo 10%/SDS-PAGE 5-15%. C- Esquema dos cortes das bandas de substrato a partir de géis nativo/SDS 12% não corados utilizando como parâmetro as bandas de substratos visualizadas. S- Substrato; P- Produtos; P+F- Protease + Fluido de cauda; F- Fluido controle.

33

13. Identificação dos produtos endógenos gerados pelas proteases purificadas

e substratos purificados

As proteases purificadas do fluido epididimário de cauda foram incubadas com

os substratos purificados desta mesma região visando identificar os produtos

endógenos da ação proteolítica das proteases sobre estes substratos.

A protease P3 purificada a partir de SDS-PAGE 12% com gelatina e de géis

SDS/SDS-PAGE com gelatina foi incubada com o substrato (66 kDa) purificado a partir

de géis nativos 10%. O sobrenadante contendo o substrato purificado escolhido foi

congelado a -20º C, para servir como controle. O restante do sobrenadante foi

adicionado à P3 e o ensaio foi mantido a 37 ºC, sendo retirado em diferentes intervalos

de tempo (4, 16, 25, 90 e 120h) e congelados a -20 ºC. Como outro controle, uma

alíquota do sobrenadante contendo o substrato não foi adicionada à protease, porém

também foi mantida na estufa, e retirada nos mesmos intervalos de tempo.

Posteriormente, foi realizada com estas amostras uma eletroforese em SDS-PAGE

gradiente 5 - 15%.

Também foram realizados ensaios de incubação das proteases P1, P2, P3 e P4,

purificadas a partir de SDS-PAGE 12% com gelatina uni- e bidimensionais, com o

substrato S2 purificado a partir de géis nativo/ SDS 12%. E também ensaios das

proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas a partir de géis nativos 10% com os substratos

S1, S2, S3 e S8 purificados a partir de géis nativo/ SDS12%. Neste caso o tempo de

incubação foi fixo com 72 h de duração. Os resultados dos ensaios foram visualizados

em SDS-PAGE 12% com e sem gelatina e em géis gradiente de poliacrilamida 12 -18%

na presença de uréia gradiente 3,5 – 7,0 M e SDS 0,1% (v/v) (modificado HASHIMOTO

et al., 1983). Os géis foram corados com azul de Coomassie, descorados em

microondas. Alguns géis foram corados para prata depois de descorados.

34

14. Western blotting

As amostras de fluido das diferentes regiões epididimárias foram submetidas à

SDS-PAGE 10%. Ao término da análise, as proteínas foram eletrotransferidas a 100V,

durante 1h e 30 min, para uma matriz de nitrocelulose com poros de 0,45 µm, de acordo

com TOWBIN et al., (1979), utilizando um equipamento de transferência úmida da

BioRad e tampão fosfato 50 mM pH 7,4. Após a transferência das proteínas, a

membrana foi incubada com solução bloqueadora (5% de leite desnatado – Molico

Nestlê - em PBS) durante 1 h sob agitação a temperatura ambiente. Em seguida, a

membrana foi incubada com anticorpos policlonais anti-metaloproteases de serpente

(cedidos pelo Prof. Milton Masahiko) por 2 h a temperatura ambiente. A membrana foi

lavada três vezes em PBS Tween 0,005% (v/v). Após a lavagem, foi incubada com o

anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (Southern

Biotechnology Associates, Inc.), diluído a 1:200, por 1 h. A membrana foi lavada três

vezes, nas mesmas condições descritas acima. Posteriormente, a membrana foi

revelada com DAB.

15. Análise densitométrica

A análise densitométrica dos géis foi realizada no programa computacional "Gel

Perfect" (BOZZO & RETAMAL, 1991; RETAMAL et al., 1999), após obtenção de uma

imagem cinza em formato TIFF através de um scanner comercial em 400 dpi. As

massas moleculares relativas foram obtidas por comparação da sua mobilidade

eletroforética com proteínas de massa molecular conhecida, que co-migraram no

mesmo gel. O programa calcula a mobilidade relativa (Rf) de cada banda e a área

ocupada por ela, dando também uma representação diagramática das bandas protéicas

e sua concentração relativa em relação ao total de proteínas por canal.

35

V. RESULTADOS

1. Análise do perfil eletroforético de amostras de fluido epididimário

Proteínas de fluido epididimário apresentaram heterogeneidade nas diferentes

regiões do conduto epididimário. Algumas proteínas da região de cauda epididimária

aparecem em menor quantidade nas regiões proximais (cabeça proximal e distal)

deste órgão. Há uma proteína de, aproximadamente 66 kDa que se distribui por todas

as regiões epididimárias, e outra, de aproximadamente 70 kDa, que é mais intensa na

região de cauda (Figura 3).

2. Efeito da proteólise endógena no fluido epididimário

A proteólise endógena no fluido epididimário foi testada através da incubação

(37ºC) de fluido de cabeça proximal, cabeça distal, corpo e cauda em diferentes

intervalos tempos. O efeito da proteólise endógena foi analisado em SDS-PAGE 15%

contendo β-mercaptoetanol 10%. Os resultados demonstraram que a concentração de

algumas proteínas aumenta e de outras diminui à medida que aumenta o tempo de

incubação (Figura 4). Este efeito é mais evidente no fluido da região de cauda e menos

pronunciado na região de cabeça proximal. Este experimento sugere fortemente a

ocorrência de atividade proteolítica endógena no fluido.

36

Figura 3. PERFIL PROTÉICO DE FLUIDO DAS DIFERENTES REGIÕES DO EPIDÍDIMO. SDS- PAGE 12% com β-mercaptoetanol 10%; 50 µg de proteínas por poço. PM 1- Padrão de massa molecular (baixo peso). PM 2- Padrão de massa molecular (alto peso); 1- Fluido epididimário de cabeça proximal; 2- Fluido epididimário de cabeça distal; 3- Fluido epididimário de corpo; 4- Fluido epididimário de cauda. As setas correspondem à banda de 66 kDa presente no fluido de todas as regiões epididimárias e à banda de aproximadamente 70 kDa mais evidente no fluido epididimário de cauda.

37

Figura 4. PROTEÓLISE ENDÓGENA NO FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE DIFERENTES REGIÕES DE EPIDÍDIMO. SDS-PAGE 15%; com β-mercaptoetanol 10%; 50 µg de proteínas por poço de fluido epididimário de cabeça proximal, fluido epididimário de cabeça distal, fluido epididimário de corpo e fluido epididimário de cauda previamente incubadas a 370C por diferentes intervalos tempos: 1- 0h; 2 - 0,5h; 3- 1h; 4- 3h; 5-6h; 6- 12h; 7-24h; 8-36h; 9-48h; 10-72h. As setas negras indicam as proteínas que tiveram a sua concentração diminuída e as setas vermelhas indicam as proteínas que tiveram sua concentração aumentada.

38

3. Detecção e caracterização de proteases epididimárias

3.1 Atividade proteásica no fluido epididimário, ação de inibidores sobre

as atividades proteolíticas e verificação do pH ótimo

As amostras de fluido epididimário das regiões de cabeça proximal, cabeça

distal, corpo e cauda de diferentes cavalos, foram submetidas a SDS-PAGE 12%,

gelatina 0,4% e β-mercaptoetanol 10% (Figura 5). Nossos resultados confirmaram a

presença de proteases com atividade gelatinolítica nas quatro regiões epididimárias,

com pequenas diferenças entre o perfil de atividade proteásica das amostras dos

diferentes cavalos (Figura 5A). Além disso, foram mostradas de três a cinco bandas

majoritárias de proteases com uma expressão diferencial entre as diferentes regiões

epididimárias estudadas (Figura 5B), sendo mais intensa a atividade no fluido da região

de cauda epididimária, onde foram detectadas aproximadamente cinco bandas de

atividade proteolítica (Figura 6).

A caracterização da atividade proteolítica das diferentes regiões epididimárias,

através do uso de diferentes inibidores indica que as enzimas detectadas são

metaloproteases, já que o EDTA interfere na atividade (Figura 7).

Além disso, o ensaio de incubação a diferentes pHs demonstrou que a atividade

da enzima é mantida em uma ampla faixa de pH (pH 6,5 – 10), sendo o pH ótimo em

torno de 7,5 (Figura 8).

39

Figura 5. ATIVIDADE PROTEÁSICA DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO ISOLADO DE DIFERENTES CAVALOS. A- SDS-PAGE 12% com gelatina 0,4%, sem β-mercaptoetanol. Cavalo A, Cavalo B, Cavalo C e Cavalo D, 50 µg de proteínas por poço de: 1- Fluido epididimário da região de cabeça proximal; 2- Fluido epididimário da região de cabeça distal; 3- Fluido epididimário de corpo; 4- Fluido epididimário de cauda. B- Análise densitográfica do gel contendo amostras das diferentes regiões epididimárias do Cavalo C.

40

Figura 6. ANÁLISE QUANTITATIVA DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA EM FLUIDO EPIDIDIMÁRIO. Gel SDS-PAGE 10% sem β-mercaptoetanol contendo proteínas das diferentes regiões epididimárias junto aos resultados da análise quantitativa de cada atividade. A- Fluido epididimário de cabeça proximal; B- Fluido epididimário de cabeça distal; C- Fluido epididimário de corpo e D- Fluido epididimário de cauda.

Figura 7. EFEITO DE INIBIDORES SOBRE PROTEASES DO FLUIDO DAS DIFERENTES REGIÕES EPIDIDIMÁRIAS. SDS-PAGE 10% na presença de gelatina 0,4% incubados com diferentes inibidores: EDTA 10mM, Iodoacetamida 10mM e PMSF 100µM; 1- Fluido epididimário da região de cabeça proximal; 2- Fluido epididimário da região de cabeça distal; 3- Fluido epididimário de corpo; 4- Fluido epididimário de cauda.

41

Figura 8. ENSAIO DE VERIFICAÇÃO DO PH ÓTIMO DE PROTEASES DE FLUIDO. SDS-PAGE 10% na presença de gelatina 0,4% incubados a diferentes pHs: 2,5; 4,5; 6,5; 7,5; 10 e 12. 1- Fluido epididimário da região de cabeça proximal; 2- Fluido epididimário da região de cabeça distal; 3- Fluido epididimário de corpo; 4- Fluido epididimário de cauda.

4. Determinação da constante de retardação de proteases: eletroforeses de

proteínas epididimárias em géis desnaturantes na presença de gradiente de

gelatina 0 - 0,6%

Quando as proteínas das diferentes regiões epididimárias foram submetidas a

SDS-PAGE 10% gradiente de gelatina 0 – 0,6%, com uma faixa de SDS-PAGE 10%

sem gelatina (Figura 9) foi possível determinar o grau de anomalia na migração

eletroforética causada pela presença do polímero de gelatina. A análise

densitográfica permitiu verificar a linearidade do gradiente de gelatina co-polimerizada

com acrilamida (Figura 9 B e C). Os géis gradiente de gelatina de fluido das diferentes

regiões demonstraram que há um retardo na migração das proteases à medida que a

concentração de gelatina aumenta (Figura 10). Os gráficos de Ferguson para a

determinação da constante de retardação permitiram a obtenção do Kr (constante de

retardação) de cada banda proteásica conforme indicado na Figura 11 A, B, C e D. No

gráfico se visualiza a superposição de géis em relação às suas massas moleculares e

se observa claramente o efeito de retardação na migração das proteases (Figura 11

E).

42

Figura 9. GRADIENTE DE GELATINA CO-POLIMERIZADO COM ACRILAMIDA 10%. A- Gel gradiente de gelatina (0-0,6%), acrilamida 10% com uma faixa larga de gel de acrilamida 10% sem gelatina polimerizada ao lado do gel gradiente. B e C- Gráficos obtidos da varredura da imagem com o programa computacional “Gel Perfect”, indicando a linearidade do gradiente de gelatina co-polimerizada com acrilamida.

43

Figura 10. MIGRAÇÃO ANÕMALA DE PROTEASES DAS DIFERENTES REGIÕES EPIDIDIMÁRIAS. Análise de fluido das diferentes regiões epididimárias em SDS-PAGE 10% gradiente de gelatina 0-0,6% sem agente redutor. A- Análise de fluido epididimário da região de cabeça proximal; B- Análise de fluido epididimário da região de cabeça distal; C- Análise de fluido epididimário de corpo; D- Análise de fluido epididimário de cauda.

44

Figura 11. DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE RETARDAÇÃO (Kr) DAS PROTEASES DE DIFERENTES REGIÕES DO EPIDÍDIMO. GRÁFICOS DE FERGUSON A-B-C-D. No gráfico (E) estão representados os Kr obtidos de cauda em relação às suas massas moleculares e se observa que existe o efeito de retardação na migração das proteases. Estes gráficos foram construídos com base na migração das proteases em géis de acrilamida 10%, gradiente de gelatina (0-0,6%).

45

4.1 Comparação de proteínas/atividades proteásicas em géis bidimensionais

SDS/SDS e SDS/gelatina 0,4%

Outra abordagem para determinação do grau de anomalia na migração das

proteases, causada pela presença de gelatina, foi a sobreposição de géis 2D

desnaturantes com e sem gelatina 0,4% das proteínas de fluido epididimário das

diferentes regiões. Estes géis (SDS/SDS e SDS/SDS com gelatina) foram sobrepostos

em imagens no programa computacional Photo Impact, onde algumas foram

invertidas (Figura 12). Nossos resultados confirmam a anomalia na migração das

proteases em géis com gelatina em relação aos géis sem gelatina. Além disso, foi feito

um gráfico para ilustrar de maneira didática a variação no coeficiente angular das retas

de diferentes Rf (Figura 12.3), onde foram utilizadas as imagens dos géis de proteínas

e proteases de fluido de cauda sobrepostas. Conforme a massa molecular das

proteínas decresce, o grau de desvio aumenta, o que significa que o polímero de

gelatina altera mais efetivamente a migração de proteínas de massas moleculares

pequenas. Esta técnica permite também localizar proteases em géis que não contêm

gelatina, com a prévia correção do valor do coeficiente angular das retas que originam

as proteínas.

46

Figura 12. MIGRAÇÃO ANÔMALA DE PROTEASES: SOBREPOSIÇÃO DE GÉIS 2D DESNATURANTES COM E SEM GELATINA 0,4%. A amostra de fluido epididimário de cauda foi analisada em géis 2D: SDS-PAGE 12% /SDS-PAGE 12% e SDS-PAGE 12% /SDS-PAGE 12% com gelatina. 1- sem β-mercaptoetanol. 2- com o agente redutor e as imagens destes géis foram sobrepostas. 1a e 2a- imagens invertidas no Photo Impact

® das imagens 1b e 2b, respectivamente. PM- Padrão de massa molecular. 3- gráfico da variação no coeficiente angular das retas de diferentes Rfs, conseqüência da presença de gelatina (amostra de fluido de cauda).

47

5. Detecção da atividade proteásica de fluido epididimário na ausência e

presença de agente redutor

A atividade proteásica de fluido de cabeça proximal (Figura 13A), cabeça

distal (Figura 13B), corpo (Figura 13C) e cauda (Figura 13D) foi detectada em géis

bidimensionais SDS-PAGE 12% / SDS-PAGE 12% com gelatina 0,4%, com e sem β-

mercaptoetanol na 2D (Figura 13). Os resultados demonstraram que o perfil

eletroforético das bandas de atividade é alterado na presença do agente redutor, o

que sugere que estas proteases possuem pontes dissulfetos (RS-SR) em sua

estrutura e podem estar formando agregados. A sobreposição das imagens dos géis

2D SDS/SDS com SDS/SDS gelatina 0,4% (com e sem agente redutor), das

proteínas das diferentes regiões epididimárias, demonstrou um retardo na migração

das proteases (migração anômala) causado pela presença do polímero de gelatina

co-polimerizado com a solução de poliacrilamida, como já observado no resultado

anterior (Figura 12).

48

Figura 13A. ANÁLISE 2D DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CABEÇA PROXIMAL. 1- Géis 2D: SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% sem e com β-mercaptoetanol. 2- Géis SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% na presença de gelatina sem e com β-mercaptoetanol. 3- Sobreposição das imagens (1 e 2).

49

Figura 13B. ANÁLISE 2D DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CABEÇA DISTAL. 1- Géis 2D: SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% sem e com β-mercaptoetanol. 2- Géis SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% na presença de gelatina sem e com β-mercaptoetanol. 3- Sobreposição das imagens (1 e 2).

50

Figura 13C. ANÁLISE 2D DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CORPO. 1- Géis 2D: SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% sem e com β-mercaptoetanol. 2-. Géis SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% na presença de gelatina sem e com β-mercaptoetanol. 3- Sobreposição das imagens (1 e 2).

51

Figura 13D. ANÁLISE 2D DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA. 1- Géis 2D: SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% sem e com β-mercaptoetanol. 2- Géis SDS-PAGE 12%/ SDS-PAGE 12% na presença de gelatina sem e com β-mercaptoetanol. 3- Sobreposição das imagens (1 e 2).

52

6. Determinação das massas moleculares de proteases no fluido epididimário

Devido à anomalia na migração das proteínas em géis com gelatina em relação

a géis sem gelatina (HUMMEL et al., 1996), a determinação da massa molecular

relativa das proteases das diferentes regiões epididimárias foi realizada relacionando a

mobilidade das proteínas no gel 1D (SDS-PAGE 12%) com a mobilidade das proteases

no gel 2D (SDS-PAGE 12%, gelatina 0,4%) (Figura 14). As massas moleculares das

diferentes proteases de fluido epididimário estão resumidas na Tabela II. Neste órgão,

predomina uma protease de 45 kDa, que não é observada na cabeça proximal. Na

região de cauda, foi observada atividade em uma proteína de aproximadamente 40 kDa

que não está presente nas demais regiões do epidídimo.

Tabela II- Massas moleculares relativas das proteases de fluido das diferentes

regiões epididimárias.

Região do Epidídimo Massas moleculares relativas

Cabeça Proximal 117, 100 e 62 kDa

Cabeça Distal 117, 62 e 45 kDa

Corpo 117, 62 e 45 kDa

Cauda 117, 62, 45 e 40 kDa

53

Figura 14. DETERMINAÇÃO DAS MASSAS MOLECULARES DE PROTEASES DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO. Géis SDS-PAGE 12%/SDS-PAGE 12%, gelatina 0,4% com β-mercaptoetanol. A- Fluido epididimário de cabeça proximal. B- Fluido epididimário de cabeça distal. C- Fluido epididimário de corpo e D- Fluido epididimário de cauda. PM- Padrão de massa molecular.

54

7. Purificação das Proteases

7.1 Purificação de proteases a partir de géis unidimensionais

As atividades proteolíticas da região de cauda foram isoladas mediante excisão da

proteína do gel (RETAMAL et al., 1999), a partir de SDS-PAGE 12% contendo gelatina,

utilizando-se como referência para o corte das bandas tanto a visualização em uma

lâmpada UV, quanto a comparação com uma tira lateral do gel corada com azul de

Coomassie (Figura 15A). As proteases purificadas foram visualizadas em SDS-PAGE

12% com gelatina (Figura 15B). Foi possível observar que, apesar das proteases

isoladas apresentarem diferentes massas moleculares, as 4 bandas majoritárias obtidas,

passaram a apresentar o mesmo perfil de atividades (indicado pelas setas). Comparando

o SDS-PAGE 12% com o SDS-PAGE 12% com gelatina 0,4% é possível observar que as

proteases possuem uma alta atividade específica, pois, apesar de não estarem visíveis,

mesmo após o SDS-PAGE 12% ter sido corado com prata (Figura 15C), ainda assim

apresentaram atividade gelatinolítica.

55

Figura 15. PROTEASES PURIFICADAS DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA A PARTIR DE GÉIS UNIDIMENSIONAIS. A- SDS-PAGE 12%, gelatina 0,4%, visualizado em UV e, posteriormente, corado com azul de Coomassie, utilizados como parâmetro para a excisão das proteases. B- Análise das proteases purificadas em gel SDS-PAGE 12%, gelatina 0,4%. C- Análise das proteases purificadas em gel SDS-PAGE 12%. P1- Protease 1, P2- Protease 2, P3- Protease 3, P4- Protease 4. PM- Padrão de Massa Molecular. UV- Luz ultravioleta. As setas apontam para as atividades proteolíticas.

56

7.2 Purificação de proteases a partir de géis 2D SDS/SDS com gelatina

Para obter proteases melhor purificadas, as manchas de atividade proteásica do

fluido epididimário de cauda também foram isoladas a partir de géis SDS/SDS-PAGE

12% gelatina 0,4% (Figura 16A). Após purificadas estas foram visualizadas em SDS-

PAGE 12% com gelatina. De forma semelhante aos resultados anteriores, as 4

manchas de diferentes proteases, após a re-eletroforese, apresentaram o mesmo perfil

de atividade proteásica (indicado pelas setas), ou seja, a mesma massa molecular

(Figura 16B e C). Comparando a análise das proteases purificadas em SDS-PAGE 12%

com gelatina (Figura 16B e C) e sem gelatina (Figura 16D) é possível observar,

novamente, que apesar de não estarem visíveis, mesmo após o SDS-PAGE 12% ter sido

corado com prata, ainda assim apresentaram atividade gelatinolítica.

57

Figura 16. PROTEASES PURIFICADAS DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA A PARTIR DE GÉIS BIDIMENSIONAIS. A- Esquema da purificação das proteases de fluido epididimário de cauda, a partir de géis SDS-PAGE 12%/SDS-PAGE 12% gelatina 0,4%. Este gel 2D foi corado para servir como parâmetro para o corte das manchas de atividade. B- Análise das proteases purificadas em SDS-PAGE 12%, gelatina 0,4%. C- Imagem invertida de B. D- Análise das proteases purificadas em SDS-PAGE 12% corado com prata. P1- Protease 1, P2- Protease 2, P3- Protease, P4- Protease 4. PM- Padrão de Massa Molecular.

58

7.3 Purificação de proteases a partir de géis nativos 10%

As proteases também foram purificadas a partir de géis em condições nativas

para verificar se a gelatina poderia interferir na migração destas. Primeiramente, foi

realizada uma eletroforese (1D) em gel nativo 10% das amostras de fluido epididimário

e, em seguida, uma segunda eletroforese (2D) em gel desnaturante 12% com gelatina

0,4% (Figura 17). Observando o gel 2D foi possível verificar manchas de atividade

proteolítica de mesma massa molecular (setas vermelhas), correspondentes a

diferentes proteínas em condições nativas (vários rfs). Também foi possível observar

uma única mancha de atividade, de massa molecular maior que as demais proteases

(setas negras), correspondente a um rf em condições nativas (seta verde). Analisando a

Figura 17, é possível notar que este referido rf possui duas atividades proteásicas. Além

disso, é possível observar um aumento na intensidade das atividades nas regiões de

corpo e cauda quando comparadas à região de cabeça proximal.

Para purificar as proteases observadas na 2D estas foram correlacionadas às

proteínas no gel 1D (Figura 18A). As mesmas, após a purificação, foram analisadas em

SDS-PAGE 12% com gelatina 0,4% (Figura 18B) e os resultados demonstraram que,

apesar de terem sido purificadas de proteases de diferentes rfs em condições nativas,

estas apresentaram o mesmo perfil de atividade proteásica, mesmo rf e,

conseqüentemente, a mesma massa molecular no gel de gelatina. Além disso, foi

comparado o perfil das proteases purificadas com o perfil do SDS-PAGE 12 % sem

gelatina (Figura 18C) e foi observado que estas proteínas se encontram em baixa

concentração, conforme já observado anteriormente.

59

Figura 17. LOCALIZAÇÃO DAS PROTEASES EM GÉIS NATIVOS. Géis Nativo 10%/ SDS-PAGE 12% gelatina 0,4% utilizados para a localização das atividades proteolíticas em condições nativas. Foram localizadas as atividades de fluido das diferentes regiões epididimárias: A- Cabeça Proximal, B- Cabeça Distal, C- Corpo e D- Cauda. As setas vermelhas indicam as diferentes manchas de atividade de mesma massa molecular e a seta negra indica uma mancha de atividade de maior massa molecular, encontrada no Rf indicado pela seta verde.

60

Figura 18. PROTEASES PURIFICADAS DE FLUIDO EPIDIDIMÁRIO DE CAUDA A PARTIR DE GÉIS NATIVO 10%. A- Esquema da purificação das proteases de fluido epididimário de cauda a partir de géis Nativo 10%. Gel corado para servir como parâmetro para o corte das bandas de atividade. B- Análise das proteases purificadas em SDS-PAGE 12%, gelatina 0,4%. C- Análise das proteases purificadas em SDS-PAGE 12% corado com azul de Coomassie. P1- Protease 1, P2 – Protease 2, P3- Protease, P4- Protease 4. PM- Padrão de Massa Molecular.

61

8. Detecção dos substratos endógenos

A detecção dos substratos endógenos foi realizada mediante a incubação de

proteases isoladas com o fluido epididimário de cauda a 37 ºC por 72 h. A proteólise

resultante da incubação do próprio fluido, com as proteases isoladas a partir de géis

bidimensionais foi analisada em SDS-PAGE gradiente 5-15% (Figura 19). Foram

observadas proteínas de aproximadamente 105, 66 kDa e duas de massa molecular

entre 30 e 15 kDa que foram provavelmente proteolisadas, já que estas apresentaram

sua concentração diminuída (setas vermelhas). Também foram observadas proteínas de

aproximadamente 35 e 32 kDa, que apresentaram sua concentração aumentada, o que

sugere que sejam produtos da ação proteolítica.

A proteólise resultante da incubação do próprio fluido, com as proteases isoladas

a partir de géis unidimensionais foi analisada em SDS-PAGE gradiente 6-15% e em gel

nativo gradiente 6-15% (Figura 20). Os dados demonstram uma série de proteínas que

diminuem a concentração ou enfraquecem (setas vermelhas) e proteínas que aumentam

a concentração ou aparecem (setas roxas). Foi possível notar uma maior diferença entre

o perfil protéico, das amostras proteolisadas e não proteolisadas, em condições

desnaturantes (Figura 20A) que em condições nativas (Figura 20B).

62

Figura 19. DETERMINAÇÃO DOS SUBSTRATOS ENDÓGENOS DE PROTEASES PURIFICADAS A PARTIR DE GÉIS BIDIMENSIONAIS. SDS-PAGE gradiente 5-15% contendo amostras de fluido epididimário da região de cauda incubadas a 37ºC, durante 72h, com diferentes proteases purificadas de géis bidimensionais. É possível visualizar o aumento (setas roxas) e a diminuição (setas vermelhas) na concentração de algumas proteínas. PM- Padrão de Massa Molecular. C -20ºC- Controle de fluido congelado a -20ºC. C 37ºC- Controle de fluido incubado sem proteases a 37ºC. F+P1- Fluido incubado com protease 1. F+P2- Fluido incubado com protease 2. F+P3- Fluido incubado com protease 3. F+P4- Fluido incubado com protease 4.

63

Figura 20. DETERMINAÇÃO DOS SUBSTRATOS ENDÓGENOS DE PROTEASES PURIFICADAS A PARTIR DE GÉIS UNIDIMENSIONAIS. Géis contendo amostras de fluido epididimário da região de cauda incubadas a 37ºC, durante 72h, com diferentes proteases purificadas de géis unidimensionais. É possível visualizar o aumento (setas roxas) e a diminuição (setas vermelhas) na concentração de algumas proteínas. A- SDS-PAGE gradiente 6-15%; B- Gel nativo gradiente 6-15%; A- Albumina; FF- Fluido mantido como controle no freezer -20ºC; FE- Fluido mantido como controle na estufa 37ºC. P1+F- Protease 1 + fluido epididimário de cauda. P2+F- Protease 2 + fluido epididimário de cauda. P3+F Protease 3 + fluido epididimário de cauda. P4+F- Protease 4 + fluido epididimário de cauda.

O resultado também foi visualizado em géis Nativo/SDS 6-15% (Figura 21), o

que permitiu uma visualização mais clara das proteínas que aparecem (setas roxas) e

desaparecem (setas vermelhas), e demonstra que proteínas de massa molecular 117,

80, 69, 57, 50, 44 e 35kDa desaparecem e proteínas de massa molecular 50 e 44kDa,

bem como uma mancha que engloba 32,8, 33,5 e 35kDa aparecem (Figura 22). Estes

géis foram analisados tanto em função do Rf das proteínas nas condições nativas da 1ª

Dimensão (Figura 23) quanto em função do Rf das proteínas nas condições

desnaturantes da 2ª Dimensão (Figura 24). Isto permitiu uma verificação quantitativa

das proteínas de fluido epididimário antes e após a adição de proteases.

O ensaio de incubação de proteases e fluido epididimário de cauda foi mantido a

-20ºC durante alguns dias, após ter sido visualizado nos géis das figuras 21 a 24, e foi

novamente visualizado em SDS-PAGE gradiente 6-15% (Figura 25). Foi verificado que as

proteínas apresentaram um comportamento diferenciado. Após o congelamento,

proteínas de alta massa molecular que não haviam desaparecido tiveram a sua

64

concentração diminuída, como a proteína de 66kDa. Além disso, apareceram proteínas

de massa molecular entre 31 e 21 kDa.

Figura 21. VISUALIZAÇÃO DOS SUBSTRATOS ENDÓGENOS DE PROTEASES PURIFICADAS A PARTIR DE GÉIS BIDIMENSIONAIS. Visualização do experimento realizado com proteases isoladas de géis bidimensionais SDS/SDS com gelatina. Gel SDS-PAGE 6-15%. É possível visualizar o aumento (setas roxas) e a diminuição (setas vermelhas) na concentração de algumas proteínas. PM- Padrão de Massa Molecular (alto e baixo peso). FF- Fluido mantido como controle no freezer -20ºC. FE- Fluido mantido como controle na estufa 37ºC. P1+F- Protease 1 + fluido epididimário de cauda; P2+F- Protease 2 + fluido epididimário de cauda; P3+F Protease 3 + fluido epididimário de cauda; P4+F Protease 4 + fluido epididimário de cauda;

65

Figura 22. VISUALIZAÇÃO DOS SUBSTRATOS ENDÓGENOS EM GÉIS NATIVO/SDS. Géis bidimensionais Nativo/SDS 6-15% para a análise dos ensaios de proteases isoladas a partir de géis bidimensionais SDS/SDS com gelatina. Géis controle contendo amostras de fluido epididimário de cauda incubadas a 37ºC e géis contendo amostras de proteases isoladas da região de cauda + Fluido Epididimário de Cauda. P1 + F - Protease 1 + Fluido de Cauda; P2 + F - Protease 2 + Fluido de Cauda; P3 + F - Protease 3 + Fluido de Cauda. É possível visualizar o aumento (setas roxas) e a diminuição (setas vermelhas) na concentração de algumas proteínas.

66

Figura 23. DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DOS POSSÍVEIS SUBSTRATOS E PRODUTOS ENDÓGENOS. Géis bidimensionais Nativo/SDS 6-15%. FCd- Gel controle contendo amostras de fluido epididimário de cauda incubadas a 37ºC. F + P3- Gel contendo protease P3 isolada da região de cauda incubada com fluido epididimário de cauda.

67

Figura 24. ANÁLISE DENSITOMÉTRICA EM FUNÇÃO DO Rf DA 1D. Análise dos géis Nativo/SDS controle e P3 + Fluido. A- As faixas coloridas indicam onde foi feita cada análise com base nos Rf do gel nativo da primeira dimensão. B- Gráficos resultantes da análise no programa computacional Gel Perfect, identificados com a mesma cor da tira correspondente. C- Gráfico representando o total da análise.

68

Figura 25. ANÁLISE DENSITOMÉTRICA EM FUNÇÃO DO Rf DA 2D. Análise dos géis Nativo/SDS controle e P1 + Fluido. As faixas coloridas indicam onde foi feita cada análise com base nos Rf do gel desnaturante da segunda dimensão. Cada gráfico resultante da análise no programa computacional Gel Perfect está identificado com o mesmo número da tira correspondente.

69

9. Purificação dos substratos endógenos das atividades proteolíticas

9.1 Purificação dos substratos endógenos a partir de géis nativos 10%

Os substratos foram isolados de géis Nativos 10% após serem localizados em

géis bidimensionais, nas quais a primeira eletroforese foi um gel de poliacrilamida nativo

10% e a segunda eletroforese um gel de poliacrilamida 5-15%, SDS 0,1%. Na Figura

26 está representado o esquema desta purificação, onde a proteína de

aproximadamente 66kDa foi purificada.

9.2 Purificação dos substratos endógenos a partir de géis nativo/SDS-

PAGE 12%

Os substratos identificados também foram isolados de géis Nativos 10%/SDS-

PAGE 12%. Ao todo foram isoladas oito proteínas candidatas a substratos,

demonstradas na Figura 27. Foi possível observar através da análise eletroforética do

substrato S2 purificado (Figura 28), que este não apresentou diferenças entre seu perfil

quando mantido na estufa a 37ºC e quando mantido no freezer -20ºC (Figura 28A). O

substrato purificado também foi analisado em SDS-PAGE 12% com gelatina 0,4% (Figura

28B) e, inesperadamente, este apresentou atividade proteolítica quando mantido a 37ºC

e a -20ºC (seta azul). No entanto, o substrato mantido a -20ºC apresentou uma segunda

banda de atividade mais intensa que no substrato mantido a 37ºC (seta negra). A seta

vermelha indica uma banda de atividade só encontrada na amostra mantida no freezer.

70

Figura 26. PURIFICAÇÃO DO SUBSTRATO A PARTIR DE GÉIS NATIVOS. A. Gel nativo 10%/SDS-PAGE 5-15% utilizado para a localização do substrato em condições nativas. A proteína da amostra de fluido epididimário de cauda de aproximadamente 66 kDa (círculo negro), foi purificada de gel nativo 10%. B. Tira corada utilizada como padrão para o corte da proteína substrato do gel nativo 1D não corado como indicado pela linha pontilhada.

Figura 27. PURIFICAÇÃO DOS SUBSTRATOS A PARTIR DE GÉIS NATIVO/SDS. Gel Nativo 10%/SDS-PAGE 12% corado com azul de Coomassie utilizado como parâmetro para a purificação dos substratos. Os substratos escolhidos para alguns ensaios estão circulados em vermelho e os substratos que não foram utilizados estão circulados em preto.

71

Figura 28. VISUALIZAÇÃO DO SUBSTRATO S2 PURIFICADO. A- Análise do substrato purificado de fluido mantido a 37ºC e a -20ºC em SDS-PAGE 12% corado com prata. B- Análise do substrato purificado mantido a 37ºC e a -20ºC em SDS-PAGE 12% com gelatina 0,4%. PM- Padrão de Massa Molecular.

10. Identificação dos produtos endógenos gerados pelas proteases purificadas

e substratos purificado

10.1 Ensaio de incubação da protease P3 purificada com substrato

(66kDa) purificado a partir do gel nativo 10%

A protease P3 isolada de géis uni- e bidimensionais com gelatina foi incubada

com o substrato (66kDa) purificado a partir de gel nativo, durante diferentes

intervalos de tempo, para verificar a proteólise deste. O resultado foi visualizado em

SDS-PAGE gradiente 5-15% (Figura 29). Foi possível verificar a diminuição gradual

de proteínas menores que 66kDa, massa aproximada do substrato purificado.

Assim, o resultado demonstra uma diminuição nas proteínas de baixo peso e não da

proteína isolada como substrato. O resultado da proteólise endógena também foi

analisado em gel gradiente de uréia e de acrilamida (Figura 30). Neste caso não foi

possível observar alterações entre o perfil protéico do substrato controle e do

substrato incubado com a protease, demonstrando que não houve proteólise

endógena.

72

Figura 29. ATIVIDADE PROTEÁSICA (P3) SOBRE SUBSTRATO (66kDa) PURIFICADO A PARTIR DE GEL NATIVO. Análise do ensaio de proteases purificadas de fluido da região de cauda do epidídimo incubadas com amostras de substrato (66kDa) purificado em SDS-PAGE gradiente 5-15%. As amostras foram retiradas em intervalos de tempo (0, 12, 24, 36, 48, 60 e 72h). Há uma diminuição gradual das proteínas de massas moleculares menores que 66kDa.

73

Figura 30. ATIVIDADE PROTEÁSICA (P1 E P2) SOBRE SUBSTRATO (66kDa) PURIFICADO A PARTIR DE GEL NATIVO. Análise do ensaio de proteases purificadas de fluido da região de cauda do epidídimo incubadas com amostras de substrato (66kDa) purificado em SDS-PAGE gradiente 12 - 18% na presença de uréia 3,5- 7,0 M. As amostras foram retiradas em diferentes intervalos de tempo (0, 4, 16, 25, 90, 120h). Não há alterações entre o perfil protéico do substrato controle e do substrato incubado com a protease.

10.2 Ensaio de incubação das proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas

com substrato S2 purificado a partir de gel nativo/SDS 12%

As proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas a partir de géis de gelatina

unidimensionais foram incubadas com o substrato S2 visando identificar os produtos

endógenos. Neste caso, o S2 foi isolado a partir de géis bidimensionais nativo/SDS,

para obter o substrato endógeno puro. O S2 foi selecionado dentre os outros possíveis

substratos por ter sido a proteína que teve a sua concentração mais reduzida no ensaio

de detecção dos substratos endógenos.

O resultado foi analisado em SDS-PAGE 12% com gelatina, sem gelatina e em

géis gradiente de acrilamida e uréia (Figura 31). O resultado demonstrou que tanto o

substrato isolado quanto a mistura de substrato e proteases apresentaram atividade

proteásica de mesmo (rf) (Figura 31A). A análise em gel SDS sem gelatina demonstrou

uma banda de alta massa molecular, não apresentando proteínas na mobilidade relativa

correspondente à atividade (Figura 31B). A análise em gel gradiente de acrilamida e

uréia demonstrou o aparecimento de peptídeos (Figura 31C).

74

Figura 31. ATIVIDADE PROTEÁSICA PURIFICADA A PARTIR DE GÉIS UNIDIMENSIONAIS SOBRE SUBSTRATO (S2) PURIFICADO A PARTIR DE GEL NATIVO/SDS. Análise das proteases purificadas a partir de SDS-PAGE 12% com gelatina incubadas com o substrato purificado S2, durante 72h. A- SDS-PAGE 12% gelatina 0,4%. B- SDS-PAGE 12% corado com prata. C- SDS-PAGE gradiente de acrilamida 12 - 18% na presença de uréia 3,5- 7,0 M corado com prata. SE- Substrato purificado mantido na estufa a 37ºC. P1+S- Protease 1 adicionada ao substrato, P2+S- Protease 2 adicionada ao substrato, P3+S- Protease 3 adicionada ao substrato.

As proteases isoladas de géis bidimensionais também foram incubadas com o

substrato S2 e o resultado foi analisado em SDS-PAGE 12% com gelatina e sem

gelatina (Figura 32). De forma semelhante ao resultado anterior, foi demonstrado que

tanto o substrato isolado quanto a mistura de substrato e proteases apresentam

atividade proteásica de mesmo (rf) (Figura 32A). No entanto, o número de bandas de

atividade observadas foi menor que no ensaio realizado com proteases purificadas a

partir de géis unidimensionais. A análise em gel SDS sem gelatina demonstrou uma

banda de aproximadamente 70kDa, que coincide com a banda de substrato (S2)

purificada (Figura 32B).

75

Figura 32. ATIVIDADE PROTEÁSICA PURIFICADA A PARTIR DE GÉIS BIDIMENSIONAIS SOBRE SUBSTRATO (S2) PURIFICADO A PARTIR DE GEL NATIVO/SDS. Análise das proteases purificadas a partir de géis bidimensionais SDS/SDS com gelatina incubadas com o substrato purificado S2, durante 72h. A- SDS-PAGE 12% gelatina 0,4%. B- SDS-PAGE 12% corado com prata. SE- Substrato purificado mantido na estufa a 37ºC. SF- Substrato purificado mantido no freezer a -20ºC. P1+S- Protease 1 adicionada ao substrato, P2+S- Protease 2 adicionada ao substrato, P3+S- Protease 3 adicionada ao substrato, P4+S- Protease 4 adicionada ao substrato.

76

10.3 Ensaio de incubação das proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas a

partir de géis nativo 10% com os substratos S1, S2, S3 e S8 purificados

a partir do gel nativo/SDS 12%

As proteases P1, P2, P3 e P4 purificadas a partir de géis nativo 10% foram

incubadas com os substratos S1, S2, S3 e S8, visando identificar os produtos

endógenos.

O resultado foi analisado em SDS-PAGE 12% corado com prata e foram

observadas pequenas diferenças na intensidade de algumas bandas entre o perfil

protéico dos substratos isolados e o perfil protéico da mistura de substratos com

proteases (Figura 33).

O resultado também foi analisado em SDS-PAGE gradiente de acrilamida e uréia

(Figura 34) e está em concordância com as observações citadas acima. A análise em

géis SDS-PAGE 12 % com gelatina (Figura 35) reafirmou resultados anteriores de que,

tanto o substrato isolado, quanto a mistura de substratos com proteases, apresentaram

atividade proteásica de mesma massa molecular.

77

Figura 33. ATIVIDADE PROTEÁSICA PURIFICADA A PARTIR DE GÉIS NATIVOS SOBRE SUBSTRATOS PURIFICADOS A PARTIR DE GEL NATIVO/SDS. Análise das diferentes proteases adicionadas aos diferentes substratos, durante 72h, em SDS-PAGE 12% corados com prata. PM- Padrão de Massa Molecular. S1+P1- Substrato 1 + Protease 1. S1+P2- Substrato 1 + Protease 2. S1+P3- Substrato 1 + Protease 3. S1+P4- Substrato 1 + Protease 4. S2+P1- Substrato 2 + Protease 1. S2+P2- Substrato 2 + Protease 2. S2+P3- Substrato 2 + Protease 3. S2+P4- Substrato 2 + Protease 4. S3+P1- Substrato 3 + Protease 1. S3+P2- Substrato 3 + Protease 2. S3+P3- Substrato 3 + Protease 3. S3+P4- Substrato 3 + Protease 4. S8+P1- Substrato 8 + Protease 1. S8+P2- Substrato 8 + Protease 2. S8+P3- Substrato 8 + Protease 3. S8+P4- Substrato 8 + Protease.

78

Figura 34. ANÁLISE DOS PRODUTOS DA ATIVIDADE PROTEÁSICA PURIFICADA A PARTIR DE GÉIS NATIVOS SOBRE SUBSTRATOS PURIFICADOS A PARTIR DE GEL NATIVO/SDS. Análise das diferentes proteases adicionadas aos diferentes substratos em géis SDS gradiente de acrilamida e uréia, corados com prata. PM- Padrão de Massa Molecular. S1+P1- Substrato 1 + Protease 1. S1+P2- Substrato 1 + Protease 2. S1+P3- Substrato 1 + Protease 3. S1+P4- Substrato 1 + Protease 4. S2+P1- Substrato 2 + Protease 1. S2+P2- Substrato 2 + Protease 2. S2+P3- Substrato 2 + Protease 3. S2+P4- Substrato 2 + Protease 4. S3+P1- Substrato 3 + Protease 1. S3+P2- Substrato 3 + Protease 2. S3+P3- Substrato 3 + Protease 3. S3+P4- Substrato 3 + Protease 4. S8+P1- Substrato 8 + Protease 1. S8+P2- Substrato 8 + Protease 2. S8+P3- Substrato 8 + Protease 3. S8+P4- Substrato 8.

79

Figura 35. ANÁLISE DA ATIVIDADE PROTEÁSICA PURIFICADA SOBRE SUBSTRATOS PURIFICADOS EM GÉIS DE GELATINA. Análise das diferentes proteases adicionadas aos diferentes substratos em géis SDS-PAGE 12% gelatina 0,4%. P1- Protease 1; S1+P1- Substrato 1 + Protease 1; S1+P2- Substrato 1 + Protease 2; S1+P3- Substrato 1 + Protease 3; S1+P4- Substrato 1 + Protease 4; S1- Substrato 1; P2- Protease 2; S2+P1- Substrato 2 + Protease 1; S2+P2- Substrato 2 + Protease 2; S2+P3- Substrato 2 + Protease 3; S2+P4- Substrato 2 + Protease 4; S2- Substrato 2; P3- Protease 3; S3+P1- Substrato 3 + Protease 1; S3+P2- Substrato 3 + Protease 2; S3+P3- Substrato 3 + Protease 3; S3+P4- Substrato 3 + Protease 4; S3- Substrato 3; P4- Protease 4; S8+P1- Substrato 8 + Protease 1; S8+P2- Substrato 8 + Protease 2; S8+P3- Substrato 8 + Protease 3; S8+P4- Substrato 8 + Protease 4; S8- Substrato 8;

80

Na Figura 36 é possível observar que as amostras de proteases isoladas de géis

nativos (Figura 36A), ao serem analisadas em SDS-PAGE 12% (Figura 36B), apresentam

várias proteínas de diferentes massas moleculares, que correspondem aos agregados

protéicos presentes em uma região do gel nativo. A Tabela III demonstra a mobilidade

relativa das proteases purificadas, no gel nativo de onde foram retiradas.

Tabela III – Mobilidade relativa aproximada das proteases purificadas a partir

de géis nativos.

Protease

Purificada

Rf aproximado

P1 0 a 0,1

P2 0,1 a 0,2

P3 0,2 a 0,3

P4 0,3 a 0,4

81

É possível observar que o mesmo ocorre com os substratos isolados de géis

SDS/SDS 12% (Figura 36C), que ao serem analisados em SDS-PAGE12% (Figura 36D)

também apresentaram proteínas de diferentes massas moleculares, que correspondem

aos agregados protéicos presentes em uma região do gel nativo. A Tabela IV demonstra

as massas moleculares e a mobilidade relativa correspondente, em condições nativas, de

onde os substratos foram purificados.

Tabela IV – Massa molecular e mobilidade relativa correspondente dos substratos

purificados a partir de géis Nativo/SDS.

Substrato

Purificado

Massa Molecular

Aproximada

Rf aproximado

S1 200kDa 0 a 0,2

S2 70kDa 0,1 a 0,1

S3 50 a 31 kDa 0 a 0,1

S8 66kDa 0,6 a 0,8

82

Figura 36. VISUALIZAÇÃO DAS PROTEASES E SUBSTRATOS PURIFICADOS. A- Gel Nativo 10%/SDS 12% com gelatina 0,4% demonstrando as manchas de atividade utilizadas como parâmetro para a excisão das proteínas correspondentes às proteases, a partir de gel Nativo 10%. B- Análise das proteases isoladas de gel nativo em SDS-PAGE 12% corado com prata. C- Gel Nativo 10%/SDS 12% demonstrando as proteínas isoladas candidatas a substratos. D- Análise dos substratos isolados de gel Nativo 10%/SDS-PAGE 12% em SDS-PAGE 12% corado com prata. P1- Protease 1. P2- Protease 2. P3- Protease 3. P4- Protease 4. S1- Substrato 1. S2- Substrato 2. S3- Substrato 3. S8- Substrato 8. PM- Marcador de Massa Molecular.

83

11. Proteólise endógena

Partindo do princípio que em condições nativas em um mesmo Rf, como,

por exemplo, de 0 a 0,1, existe atividade proteásica (Figura 37 A) e várias proteínas

(Figura 37B), foram utilizados géis nativos para o corte de diferentes tiras. Com base

nisto, foi realizado um ensaio de proteólise endógena com estas tiras contendo

proteínas de fluido de cauda, incubadas a diferentes tempos em temperatura ambiente

(Figura 38). Foi possível observar com a análise das proteínas presentes na tira a

(Figura 38B) que, após 72h, as proteínas de alta massa molecular ficam mais intensas,

enquanto que a proteína de 70 kDa começa a diminuir a sua concentração. Além disso,

aparecem proteínas de menor massa molecular, provavelmente produtos, de

aproximadamente 60, 40, 25 e 20kDa. A análise das proteínas presentes na tira f

(Figura 38C) demonstra que a proteína de aproximadamente 66kDa não sofre

proteólise.

84

Figura 37. VISUALIZAÇÃO DE PROTEASES E PROTEÍNAS PRESENTES EM UM MESMO Rf. A- Análise do fluido epididimário de cauda em gel Nativo 10%/SDS-PAGE 12% com gelatina. B- - Análise do fluido epididimário de cauda em gel Nativo 10%/SDS-PAGE 12%. Comparando os dois géis é possível observar que em um mesmo Rf em condições nativas (1D) corresponde a proteases (2D A) e diferentes proteínas (2D B), inclusive proteínas candidatas a substratos (circuladas em preto).

85

Figura 38. PROTEÓLISE ENDÓGENA. A- SDS-PAGE 12% com a tira a do gel nativo mantida a diferentes tempos a temperatura ambiente. B- SDS-PAGE 12% com a tira f do gel nativo mantida a diferentes tempos a temperatura ambiente (0, 24, 48, 72, 96 e 120h).

]

86

12. Western Blotting

As proteínas de fluido das regiões epididimárias analisadas em SDS-PAGE 10%

foram transferidas para a matriz de nitrocelulose e marcadas com anticorpos anti-MMP

de veneno de serpente (Figura 39). Os anticorpos reconheceram algumas proteínas

sugerindo homologia entre metaloproteases de veneno com as de fluido.

Figura 39. WESTERN BLOT. A e B- SDS-PAGE 10% contendo amostras de fluido das diferentes regiões epididimárias duplicata do gel transferido para a membrana de nitrocelulose. C- SDS-PAGE 10% contendo amostras de fluido das diferentes regiões epididimárias, transferido para a membrana de nitrocelulose. D- Membrana de nitocelulose incubada com anticorpos anti-MMP. PM- Padrão de Massa Molecular (alta massa); 1- Fluido epididimário de cabeça proximal; 2- Fluido epididimário de cabeça distal; 3- Fluido epididimário de corpo; 4- Fluido epididimário de cauda.

87

VI. DISCUSSÃO

Os espermatozóides passam por uma série de processos preparatórios prévios a

fertilização, entre eles maturação espermática (no conduto epididimário) e capacitação

(nas vias genitais da fêmea). Somente espermatozóides maduros, capacitados e com

acrossoma intacto penetram o cumulus atingindo a zona pelúcida do gameta homólogo

(FOURNIER-DELPECH & THIBAULT, 1993; LÓPEZ et al., 1987; 1989; LÓPEZ & DE

SOUZA, 1991; RETAMAL et al., 2000ab; RETAMAL, 1999). A qualidade do

espermatozóide, em termos de mobilidade e reconhecimento do ovócito, é fortemente

dependente de diferenciações pós-testiculares que ocorrem no epidídimo durante o

processo de maturação (GATTI et al., 2004).

Uma expressão do processo de maturação espermática é a profunda

remodelação dos diferentes domínios da membrana. Diversos pesquisadores têm

demonstrado modificações nas cargas de superfície, na distribuição e/ou densidade de

receptores de lectinas, nos antígenos de superfície, e no perfil protéico, glicoproteico e

lipídico de espermatozóides imaturos e maduros de mamíferos (FOURNIER-DELPECH

& THIBAULT, 1993; LÓPEZ et al., 1987; 1989; LÓPEZ & DE SOUZA, 1991; RETAMAL

et al., 2000b). Essas modificações surgem, possivelmente, como resultado da liberação

e/ou degradação de componentes testiculares, absorção e integração de proteínas

secretadas pelo epidídimo ou por modificação de resíduos oligossacarídeos ligados a

proteínas ou lipídeos de membrana. Glicosilações, proteólise, re-localização de

componentes pré-existentes são alguns mecanismos já descritos (DACHEUX et al.,

2003; TULSIANI et al., 1995).

Neste trabalho foi demonstrada a presença de proteases, mais

especificamente metaloproteinases, no fluido epididimário de eqüinos. A atividade

destas enzimas apresenta diferenças regionais na sua expressão; de forma similar

ao observado com o perfil eletroforético das proteínas obtidas de fluido coletado das

regiões de cabeça, corpo e cauda do epidídimo. A composição do fluido luminal é

fortemente modificada ao longo do conduto, provavelmente como resultado das

funções de absorção e secreção desenvolvidas pelo epitélio deste órgão

(SETCHELL et al., 1988). Tendo em consideração o menor nível de atividade

enzimática nas amostras de fluido epididimário na região de cabeça proximal, e seu

aumento nas regiões de corpo e cauda epididimária, sugere-se que estas enzimas

88

sejam secretadas e/ou ativadas no epitélio epididimário (MÉTAYER et al., 2002)

Resultados similares foram descritos por DIAS (2002) para algumas glicosidases (α-

glucosidase, α-manosidase, N-acetil glucosaminidase, entre outras. E também por

MÉTAYER et al. (2002) para proteases mediante a utilização de géis de gelatina uni

e bidimensionais. Estes autores descrevem a atividade metaloproteásica (MMPs) de

uma proteína de aproximadamente 60kDa, presente em todas as regiões

epididimárias em carneiro e cavalo, porém em javali se detecta principalmente na

região de cauda epididimária. E sugerem que as proteínas de massa molecular

maiores 54 kDa seriam proteases, entretanto, gelatinases menores seriam sensíveis

a inibidores de serino-proteases.

Os resultados aqui relatados demonstraram que as proteases

detectadas foram fortemente inibidas por inibidores de metaloproteases (EDTA). As

proteínas que contêm um domínio metaloprotease, ancorado na membrana, têm

sido relacionadas com interações célula-célula e portanto com a fertilização

(SHILLING et al., 1997; BLOBEL, 2000). Entretanto, elas foram fracamente inibidas

nos ensaios com PMSF e iodoacetamida, inibidores contra cisteíno e serino

proteases. É possível que existam proteases pertencentes a outras classes, que não

foram detectadas quer seja pelos inibidores utilizados ou por não serem gelatinases.

Neste trabalho, também foi realizado um ensaio de incubação das proteases a

diferentes pHs. Os géis de atividade foram incubados em uma faixa de pH de 2,5 a

12. Foi possível observar que as proteases de fluido epididimário possuem pH ótimo

por volta de 7,5. Sabe-se que as MMPs requerem um pH neutro e Ca+2 para

poderem atuar (MATRISIAN ,1990; NGUYEN et al., 2001). Além disso, as proteases

das diferentes regiões do epidídimo de eqüinos foram caracterizadas

qualitativamente e quantitativamente. Usando esta abordagem duas proteases foram

encontradas na região de cabeça proximal e distal, quatro proteases na região de

corpo e seis na região de cauda. Também foi demonstrado que há ligação cruzada

entre anticorpos policlonais anti-metaloproteases de serpente com as proteases de

fluido epididimário. Este resultado sugere uma homologia entre metaloproteases

destas diferentes espécies.

Há décadas atrás foi introduzido o procedimento baseado na utilização de

géis de poliacrilamida SDS contendo gelatina, caseína ou fibrina como substratos

para a localização da atividade de proteases. Estas enzimas têm a habilidade de

renaturar após a remoção do SDS e de exercer atividade proteolítica no substrato

89

co-polimerizado, e assim, serem analisadas com este método (FREDERIKS &

MOOK, 2004). Sabe-se que a presença do polímero de gelatina pode reduzir a

migração de proteínas de massa molecular conhecida de 15 a 20%. Em géis de

acrilamida a 7,5% a adição de gelatina reduz a mobilidade dos padrões 13 ± 3,4%;

em gel de acrilamida a 10% a redução é 16 ± 3,8%; e em géis 12,5%, a redução é

de 15± 2,8% (HUMMEL et al., 1996). Um retardo similar foi observado com proteínas

não proteásicas de Schizophyllum commune. As proteases migram muito mais

devagar em SDS-PAGE com gelatina do que os padrões. Para as proteases

testadas, a redução da mobilidade com a adição de gelatina em acrilamida T 10% foi

de 48% para quimiotripsina, 44% para elastase, 43% para tripsina e 41% para

papaína. (HUMMEL et al., 1996). A retardação não é constante entre proteases.

Portanto, a massa molecular das proteases não pode ser estimada precisamente em

géis SDS com gelatina. Neste trabalho a detecção da atividade proteásica foi

realizada através de géis de poliacrilamida desnaturantes. Foi observado o efeito de

retardação na migração das proteases e determinada a constante de retardação (Kr)

das mesmas das diferentes regiões do epidídimo. Foram feitos gráficos construídos

sob diferentes concentrações de gelatina e sob uma base constante de outro

polímero, a acrilamida, que permaneceu em uma concentração de 10% (v/v).

FERGUSON (1964) descreveu estes gráficos para o polímero de acrilamida e o

comportamento das proteínas neste contexto. Os géis a concentração constante de

poliacrilamida (10%) na presença de um gradiente de outro polímero (gelatina), de 0

a 0,6%, têm como propósito avaliar o efeito peneira (“sieving”) dos géis, sem alterar

a carga líquida das proteínas. Assim, tem-se sugerido várias metodologias para

determinar o tamanho das proteínas não desnaturadas utilizando esta estratégia

(FERGUSON,1964; HEDRICK & SMITH 1968; RETAMAL & BABUL, 1988;

WESTERHUIS et al., 2000).

Neste trabalho, foi utilizado um novo procedimento para determinar a massa

molecular das proteases em géis de gelatina bidimensionais SDS/SDS com gelatina,

e relacionar as massas moleculares obtidas na primeira dimensão com a posição

das proteases na segunda dimensão. Assim, foram determinadas as massas

moleculares das bandas de atividade proteásica sem o efeito anômalo causado pelo

polímero de gelatina. Na região de cabeça proximal (que em eqüinos é formada

exclusivamente por dutos eferentes) foram detectadas proteases de massas relativas

de 117, 100 e 62 kDa e nas regiões mais distais do epidídimo foram detectadas

90

proteases de massas moleculares de 117, 62 e 45 kDa. Neste órgão, predomina uma

protease de 45 kDa, que não é observada na cabeça proximal. Na região de cauda,

foi observada atividade em uma proteína de aproximadamente 40 kDa, que não se

observa em outras regiões. Estas massas moleculares diferem das calculadas por

outros autores pela sobreposição de géis unidimensionais com e sem gelatina.

Porém, o perfil eletroforético das proteases é similar.

Há dados na literatura descrevendo uma série de proteínas espermáticas

proteoliticamente processadas durante o trânsito epididimário, entre elas:

hialuronidase, pH20, proteína CE9, galactosidase (a qual existe como uma forma de

90 kDa em espermatozóides obtidos da região de cabeça proximal e é,

gradualmente, convertida para uma forma majoritária de 74 kDa em

espermatozóides de cauda) (CHAYKO et al., 2000). Outro exemplo interessante de

processamento proteolítico é a fertilina. Esta é um heterodímero transmembrana

com domínios pró- metaloprotease, disintegrina, rico em cisteína e EGF, que

pertence a família ADAMs (YUAN et al., 1997). Esta proteína (previamente chamada

PH30) sofre pelo menos dois processamentos proteolíticos distintos: primeiro, no

testículo, e outro no epidídimo (LUM & BLOBEL, 1997). Estes achados indicam que

algumas proteínas podem ser secretadas ou estarem presentes em uma pró-forma e

tornam-se ativadas após o processamento no fluido epididimário (LÓPEZ et al., 1989;

RETAMAL et al., 2000; GATTI et al., 2004, ORGEBIN-CRIST & JAHAD, 1978;

FOUCHECOURT et al., 2000). A análise da maturação intracelular e atividade

catalítica de uma desintegrina metaloprotease amplamente expressa, a MDC9,

sugere que o pró- domínio da MDC9 é removido por uma convertase tipo furina da

via secretora, depois que a proteína emerge na superfície da membrana e que a

atividade catalítica da MDC9 pode ser inibida por inibidores de metaloprotease. A

remoção de um pró-domínio inibitório da MDC9 é um pré-requisito para a atividade

proteásica. Depois do pró-domínio removido, passos adicionais, como o de

proteínas quinases C dependentes de fosforilação, podem estar envolvidos na

regulação da atividade enzimática da MDC9 (ROGHANI et al., 1999).

Sabe-se que o epidídimo modula a composição de seu conteúdo luminal pelas

funções de secreção seletiva e absorção das células epiteliais, as quais apresentam

variações regionais. Flutuações no volume do fluido, eletrólitos, proteínas e outros

componentes do fluido epididimário são presumivelmente críticas para a maturação e

sobrevida do gameta (LÓPEZ et al., 1989; RETAMAL et al., 2000; GATTI et al., 2004,

91

ORGEBIN-CRIST & JAHAD, 1978; FOUCHECOURT et al., 2000). Uma hipótese é

que além da atuação de proteases epididimárias sobre as proteínas espermáticas,

também exista uma ação proteolítica sobre as proteínas do próprio fluido. Os

resultados deste trabalho demonstraram que existe ação de proteases sobre a

fração total de proteínas de fluido da mesma região (Figuras 19, 20, 21 e 22). Estas

proteínas ativadas poderiam ter um efeito no espermatozóide ou no fluido e fazer

parte da cascata de eventos ligados ao processo de maturação. Assim as proteases

poderiam estar participando em processos de remodelação ou ativação de

componentes do fluido epididimário, remodelação e/ou redistribuição de proteínas na

superfície espermática e remoção de espermatozóides defeituosos, papéis que são

crucias na fertilização.

Uma análise proteômica parcial do fluido epididimário reflete que ambos os

processos de degradação de proteínas e adição de novos componentes ocorrem no

epidídimo (GATTI et al., 2004). Gelatinases como MMP-2 (gelatinase A, 72 kD) e

MMP-9 (gelatinase B, 92 kD) foram detectadas em zymogramas de gelatina e MMP-

7 em géis de caseína. Segundo FREDERIKS & MOOK (2004), MMPs são

secretadas das células em uma forma proteoliticamente inativa (zimogênio),

aproximadamente 10 kDa maior do que a forma ativada. A pró-forma se ativa

durante processo de desnaturação e renaturação depois da eletroforese. Ambas as

formas degradam gelatina e são detectadas em zimografias. MMPs em solução

estão frequentemente associadas com inibidores teciduais endógenos de

metaloproteases (TIMPs) (GATTI et al., 2004). Durante a eletroforese, os inibidores

são dissociados da MMP e não interferem na atividade enzimática (FREDERIKS &

MOOK, 2004) sendo mais uma indicação de que existe um processamento

proteolítico de proteínas do meio e da superfície espermática, muitas vezes sobre as

próprias proteases. A grande maioria das proteínas detectadas no epidídimo são

produtos secretados pelo epidídimo. Isto representa mais de cem proteínas diferentes,

com um alto polimorfismo (tanto na massa molecular, quanto no ponto isoelétrico)

provavelmente por glicosilações e outras modificações pós – tradução (GATTI et al.,

2004).

Neste trabalho foi demonstrada, nos experimentos de proteases isoladas

incubadas com fluido epididimário, a atividade proteásica endógena sugerindo que

as proteínas de massa molecular 117, 80, 69, 57, 50, 44 e 35kDa são substratos e

que as proteínas de massa molecular 50 e 44kDa, bem como uma mancha que

92

engloba 32,8, 33,5 e 35kDa, são produtos (Figuras 19, 20, 21 e 22). Também é

evidente que as proteases possuem um comportamento semelhante, sugerindo uma

afinidade pelo mesmo substrato. Além disso, a combinação do uso de géis Nativo

PAGE e SDS-PAGE para a análise de proteínas (géis bidimensionais) pode ser

usada para o estudo de interações proteína-proteína (SUN & PAN, 1999).

Resultados aqui relatados demonstraram que proteínas de diferentes massas

moleculares possuem o mesmo Rf em condições nativas, indicando a possibilidade

de agregados. Um exemplo é o resultado da análise das proteínas de Rf 0,1 do gel

Nativo/SDS com amostra controle (Figura 36).

Assim, tendo em vista que existe ação de proteases sobre a fração total de

proteínas de fluido da mesma região foi feito um experimento para verificar os

produtos da atividade proteásica. Para tanto, foram feitos ensaios com diferentes

proteases purificadas incubadas com diferentes substratos purificados (Figuras 29 à

35). Nestes ensaios, foi possível constatar que a proteína de aproximadamente

66kDa, não diminuiu em quantidade após sua incubação com proteases isoladas.

Além disso, com a proteína do substrato, apareceram algumas impurezas de menor

peso. Estas sim diminuíram ao longo do tempo, após a incubação com a protease

P3 (Figura 29). Uma possibilidade é que estas impurezas sejam resultantes da

proteólise da proteína de 66kDa durante o processamento desta. No entanto, uma

hipótese é a de que esta proteína esteja agregada aos inibidores de proteases

(MCCAWLEY & MATRISIAN, 2000). Esta proteína só desaparece após a incubação

de proteases com o extrato bruto de fluido, após o congelamento deste ensaio a -

200C, ou seja, após um período maior de contato entre as proteases e as proteínas

do fluido (Figura 21). Assim, esta proteína passou a ser considerada em nos

experimentos como um controle negativo. Também foram utilizadas outras proteínas

candidatas a substratos para os ensaios de detecção dos produtos. Após a

incubação destas proteínas com as diferentes proteases isoladas foi possível

observar pequenas diferenças entre o perfil eletroforético dos substratos antes e

após a incubação, demonstrando que ocorre a proteólise. No entanto, esta não foi

muito efetiva, provavelmente, pela presença de algum inibidor, quantidade de

protease ou substratos insuficientes, tempo de incubação muito curto e/ou outros

possíveis fatores.

Foram demonstradas diferentes manchas de atividades proteásicas,

tanto em géis de gelatina unidimensionais na presença de SDS quanto em géis de

93

gelatina bidimensionais (Figura 5 e 14, respectivamente), indicando proteases de

diferentes massas moleculares. Diferentemente os géis Nativo/SDS com gelatina

demonstram diferentes manchas de atividades de proteases de similar massa, ao

longo de uma faixa que corresponde ao gel nativo (Figura 17). Esta discrepância

pode ser explicada pela presença de detergente na amostra antes das eletroforeses

em géis SDS unidimensionais, que enfraquece a ligação das proteínas e,

provavelmente, dos peptídeos inibitórios ligados às proteases e/ou substratos que

estavam conformando grandes agregados protéicos, e assim, os inibidores se

desassociam das enzimas, e estas se ligam mais facilmente aos seus substratos,

interação esta mais forte do que o efeito do detergente. Ao realizar o gel

bidimensional SDS com gelatina as proteases permanecem ligadas aos seus

substratos e co-migram com estes e são visualizadas em manchas de atividades

com diferentes massas moleculares. Outro experimento que confirma esta idéia foi

quando se realizou uma eletroforese de substratos purificados em géis com gelatina

(Figuras 28 e 35), pois, os substratos isolados também apresentaram atividade

proteásica. Assim, especula-se que em géis SDS as proteases permanecem

associadas aos seus substratos apresentando uma massa molecular que é a soma

da sua própria massa com a do substrato. No entanto, quando realizado um gel

unidimensional nativo, como a amostra é preparada em condições nativas, co-

migram diversas proteínas juntas, incluindo inibidores de proteases. O perfil

eletroforético das proteases encontrado nos géis nativo/SDS com gelatina pode ser

devido a macro-complexos compostos por proteases, substratos, seus inibidores e,

possivelmente, outras proteínas que co-migram em condições nativas. E quando

estes complexos são submetidos à re-eletrofore em gel SDS, a incubação da tira do

gel nativo em tampão 2x com SDS pode não ser o suficiente para separar as

proteases dos seus inibidores a ponto destas enzimas se ligarem aos seus

substratos e co-migrarem com estes, explicando o fato de não serem observadas

diferentes massas.

Esta idéia pode ser reforçada pelos experimentos com proteases purificadas.

Estas proteases foram isoladas dos géis em condições nativa tomando como base as

manchas de atividade proteásica dos géis nativo/SDS com gelatina e, como já

mencionado, resultou em manchas de atividade proteásica de idêntica massa

molecular. Resultados similares foram encontrados por METÁYER et al. (2002) com

géis 2D. Neste caso, o autor realizou após a focalização isoelétrica das amostras de

94

fluido, géis desnaturantes com e sem gelatina. Estes, demonstraram manchas de

atividade de protease de diferentes pontos isoelétricos que, semelhantemente aos

nossos resultados, apresentam mesma massa. As proteínas correspondentes a

mancha de atividade de mesma massa foram isoladas de géis nativo e, como

esperado, ao serem analisadas em géis SDS com gelatina foi possível observar

atividades proteásicas de mesma massa molecular. No entanto, quando as atividades

proteásicas foram isoladas de géis SDS com gelatina, tanto unidimensionais quanto

bidimensionais SDS/SDS com gelatina, mesmo tendo sido retiradas de diferentes

massas, foi possível observar o mesmo resultado, ou seja, proteases de mesma

massa molecular (Figuras 15 e 16). Uma possibilidade é de que isto pudesse ser o

efeito da gelatina sobre a protease purificada, já que as proteases foram purificadas

deste tipo de gel. Para verificar se a presença da gelatina estaria influenciando no

perfil das proteases purificadas, estas foram isoladas a partir de géis nativos 10%. Os

resultados se mantiveram os mesmos, ou seja, as proteases purificadas de diferentes

Rfs do gel nativo, ao serem analisadas em géis desnaturantes, apresentaram a

mesma massa molecular (Figura 18). Provavelmente, trata-se da mesma protease

que em géis SDS com gelatina, por estarem fortemente ligadas ao substrato,

apresentam diferentes massas relativas. Mas, quando estas proteases são isoladas,

os substratos ligados se desassociam ou são metabolizados, consequentemente, as

proteases não co-migram com os substratos para diferentes massas. E além dos

substratos isolados terem apresentado atividade proteásica, como já mencionado, de

forma semelhante aos experimentos com proteases purificadas, estes substratos,

mesmo isolados de diferentes massas moleculares apresentaram atividade de mesma

massa. E esta banda de atividade foi a mesma encontrada na analise das amostras

de proteases purificadas em géis de gelatina. Ou seja, trata-se da mesma protease,

que co-migrou com diferentes substratos. O resultado do Western blot também

contribui para esta idéia (Figura 39), pois, foi possível observar um reconhecimento de

proteínas de diferentes massas do fluido epididimário pelos anticorpos anti-

metaloproteases, mostrando que existem metaloproteases de diferentes massas

moleculares. Os resultados, indicam nos experimentos com proteases purificadas e

substratos purificados demonstram que estas possuem um perfil protéico similar, o

que está de acordo com os dados discutidos anteriormente, de que as proteases

estariam co-migrando com seus substratos.

95

Foi realizado um experimento com tiras de gel nativo, contendo proteínas de

fluido de cauda, incubadas a diferentes tempos em temperatura ambiente (Figura

38). Foi possível observar, na análise da tira a, que após 72h as proteínas de alto

peso ficaram mais intensas enquanto que a banda de 70 kDa começou a

desaparecer. Além disso, apareceram proteínas de menor massa molecular,

provavelmente produtos, de aproximadamente 60, 40, 25 e 20 kDa. Isto indica que,

possivelmente, as proteínas presentes nesta tira do gel sofrem a ação de proteases

também existentes na mesma. E assim, a protease e as proteínas estariam

presentes no mesmo Rf (Figura 37). Além disso, foi possível observar na análise

desta mesma tira de gel que algumas proteínas de alto peso aumentaram a sua

concentração ao longo do tempo de incubação, indicando que os produtos da ação

proteolítica se agregam. Uma possibilidade é que a banda de 200 kDa, por exemplo,

seja um agregado formado pelas proteínas de 70, 50, 40 e 30 kDa, ou seja, um

agregado entre os substratos, proteases e produtos. Simultaneamente, conforme o

substrato é consumido, os peptídeos e as proteínas de menor peso se tornam mais

intensos, ou seja, o agregado se desfaz e tornam-se visíveis os possíveis produtos

da proteólise. Outra possibilidade é que as proteínas de 70, 60 e 25 kDa estejam se

agregando e formando a proteína de 145kDa, ou ainda as proteínas de 60 e 70 kDa

formando a proteína de aproximadamente 130 kDa. Este resultado corrobora com os

ensaios de proteólise endógena, onde o extrato bruto de fluido de cauda foi

incubado com proteases purificadas, pois, ambos demonstram que existe a ação de

proteases sobre a proteína de aproximadamente 70 kDa. Ao ser analisada a tira de

gel f, contendo a proteína de aproximadamente 66 kDa, foi demonstrado, mais uma

vez, que esta não é o substrato preferencial das proteases em estudo. No gel

Nativo/SDS com gelatina (figura 37) é evidente que no Rf da tira f não há atividade

proteásica, logo, não poderia haver proteólise das proteínas presentes nesta tira de

gel reforçando a idéia de que as proteases co-migram com seus substratos.

Assim a proteína de 70 kDa representa um substrato pela qual as proteases

possuem alta afinidade, e consequentemente co-migram com esta, enquanto que a

proteína de 66 kDa, ao contrário, corresponde a um substrato pelo qual as proteases

possuem menor afinidade, conforme discutido anteriormente. Outra possibilidade é

que existam inibidores que impedem a ação das proteases sobre esta proteína, no

entanto, esta tese não foi testada neste trabalho.

96

VII. CONCLUSÕES

- O presente trabalho demonstra a presença de atividade proteásica no fluido

epididimário de E. caballus, com diferenças regionais ao longo do conduto.

- O estudo com inibidores, indica que as proteases de fluido correspondem

majoritariamente a metaloproteases (MMPs). Na região proximal se detectaram

proteases de massas moleculares 117, 100 e 62 kDa. Na região distal predominara

aquelas de massas moleculares relativas 117, 62 e 45 kDa. Neste órgão, predomina uma

protease de 45 kDa, que não é observada na cabeça proximal. Na região de cauda, foi

observada atividade em uma proteína de aproximadamente 40 kDa. Em termos gerais,

as proteases presentes na região proximal do ducto são de maior massa molecular

relativa que aquelas detectadas na região distal.

- O estudo de incubação a diferentes pHs demonstrou que tratam-se de enzimas que

apresentam um pH ótimo neutro.

- No presente trabalho se detectou a constante de retardação das proteases, provocada

pela presença do polímero de gelatina nos géis. Assim, foi estabelecida uma abordagem

diferente para se determinar a massa molecular das proteases sem o efeito anômalo

causado pela presença de gelatina.

- O comportamento destas proteínas com β-mercaptoetanol sugere a presença de pontes

dissulfeto em sua estrutura. Estas proteínas podem estar formando agregados entre

proteases ou estar agregadas aos seus substratos.

- A caracterização das proteases após serem isoladas sugere que estas proteínas

podem estar formando agregados de proteases com proteases ou de proteases com

seus substratos.

- O presente estudo contribuiu para a compreensão da função epididimária e da

participação de proteases na função de remodelação de proteínas de fluido.

97

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

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