histomorfometria de lesÃo cutÂnea induzida...
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Centro Universitário de Caratinga
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação
Mestrado Acadêmico
HISTOMORFOMETRIA DE LESÃO CUTÂNEA
INDUZIDA SUBMETIDA A DIFERENTES
TRATAMENTOS
Por
Gabriela Chaves Mendes Justino
Orientador
Prof.Dr. Marcus Vinícius de Mello Pinto
Co-Orientadora
Profa.Dra.Lamara Laguardia Valente Rocha
Caratinga – março/2011
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por me conceder sabedoria, sustento e orientação. Nos
momentos onde tudo parecia impossível de realizar, me fez ter paciência e
descansar Nele, e principalmente me ensinando a confiar não em meus
conhecimentos ou ações, mas sim na força de seu poder. Se hoje aqui estou
foi porque Ele me usou como vaso em suas mãos e me permitiu alcançar mais
esta vitória.
Aos meus pais, irmãos e familiares pelas palavras de incentivo, apoio,
carinho e compreensão em todos os momentos e situações.
Ao meu esposo pelo amor, companheirismo, paciência, por estar ao meu
lado nas noites de estudo. A minha amada e querida filha Rebeca, pelo
carinho, pelo sorriso sempre presente, o abraço gostoso, pela compreensão
nos momentos em que precisei me ausentar. Por você eu busquei mais esta
conquista.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcus Vinícius de Mello Pinto, pela
coordenação deste trabalho, pelos momentos de conversa, pelas colaborações
e incentivos que levaram o meu crescimento e concretização deste trabalho.
A Profa. Dra. Lamara Laguardia Valente Rocha que com sua
incomparável paciência e dedicação, permitiu o desenvolvimento deste
trabalho, auxiliando em todo experimento e análise.
A Profa. Elcinéia Tavares pelo suporte e apoio na condução do
experimento.
Ao Jesus, técnico do Centro de Estudos da Biologia (CEB), pela grande
ajuda no experimento e cuidado com os animais.
Expresso a todos os meus sinceros agradecimentos.
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RESUMO
HISTOMORFOMETRIA DE LESÃO CUTÂNEA INDUZIDA
SUBMETIDA A DIFERENTES TRATAMENTOS
O reparo tecidual é um estado dinâmico que compreende diferentes processos,
entre eles, inflamação, proliferação e remodelação, sendo que cada fase
apresenta células e funções específicas. O LED é uma fonte de luz que tem
sido utilizada na modalidade fototerapêutica no processo de cicatrização de
feridas. A própolis também apresenta características em sua composição que
favorece o reparo cicatricial. O presente estudo utilizou como terapias o LED, a
própolis e seus usos associados, com o objetivo de compreender a ação
desses diferentes tratamentos na resposta inflamatória induzida considerando
a cinética do infiltrado inflamatório. O modelo experimental consistia na indução
de ferida cirúrgica no dorso de 40 camundongos. Os animais foram divididos
em 4 grupos: Controle, LED, Própolis e LED e Própolis, todos apresentaram
subgrupos com animais sacrificados aos sete dias e quatorze dias após
indução da lesão. A avaliação da histomorfometria foi realizada através de
imagens capturadas e avaliadas por sistema de captura de imagens. Os
achados da análise nos permitiram concluir que o LED isoladamente tem
atividade biomoduladora positiva sobre o número de fibrócitos/fibroblastos e na
neovascularização, no entanto, age como antiinflamatório sobre o infiltrado de
células do sistema imune. O tratamento isolado com própolis age como
proinflamatorio e não apresenta efeito estimulador na proliferação de
fibrócitos/fibroblastos, determinando, porém aumento de colágeno e
neovascularização enquanto inibe o aumento de SFA. O uso concomitante da
própolis e LED atuou como agente antiinflamatório, além de exacerbar a ação
do LED na produção de colágeno e na neovascularização.
Palavras-Chave: reparo tecidual, própolis, Diodos Emissores de Luz (LEDs)
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ABSTRACT HISTOMORPHOMETRY OF INJURY INDUCED SKIN UNDER DIFFERENT TREATMENTS Tissue repair is a dynamic state that includes several processes, including inflammation, proliferation and remodeling, with each phase cells and has specific functions. The LED is a light source that has been used in phototherapeutic modality in the healing of wounds. Propolis also has features in its composition which promotes the repair scar. This study used the LED as therapies, propolis and their associated uses, in order to understand the action of different treatments on inflammatory response considering the kinetics of the inflammatory infiltrate. The experimental model consisted in the induction of a surgical wound in the back of 40 mice. The animals were divided into four groups: Control, LED, LED and Propolis and Propolis, all presented subgroups of animals sacrificed at seven days and fourteen days after injury induction. The evaluation of histomorphometry was performed using images captured and evaluated by image capture system. The findings of the analysis we concluded that the LED alone has biomodulator positive activity on the number of fibrocytes / fibroblasts and neovascularization, however, acts as anti-inflammatory on the infiltration of immune cells. The single treatment with propolis acts as a proinflammatory and has no stimulatory effect on proliferation of fibrocytes / fibroblasts, determined, but an increase of collagen and neovascularization while inhibiting the increase in SFA. Concomitant use of propolis and LED served as anti-inflammatory agent, and exacerbates the action of the LED in the production of collagen and neovascularization. Words-key: tissue repair, propolis, light emitting diodes (LEDs).
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LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Sistema Tegumentar.......................................................................14
FIGURA 2. Fases da cicatrização de feridas.....................................................15
FIGURA 3. Fases da cicatrização de feridas.....................................................18
FIGURA 4. Cascata de eventos angiogênicos..................................................20
FIGURA 5. Cicatrização por primeira intenção numa ferida fechada, não
infectada, como uma ferida cirúrgica incusional................................................23
FIGURA 6. Cicatrização por segunda intenção primeiramente em uma ferida
aberta e não infectada, no segundo momento uma ferida aberta e
infectada............................................................................................................24
FIGURA 7. Ação antiinflamatória da própolis....................................................27
FIGURA 8. Diodo Emissor de Luz.....................................................................28
FIGURA 9. Profundidade de penetração dos comprimentos de onda na
pele....................................................................................................................29
FIGURA 10. Tricotomia no dorso do animal......................................................36
FIGURA 11. Ferida cirúrgica realizada com bisturi............................................36
FIGURA 12. Aplicação da ledterapia.................................................................38
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LISTA DE TABELAS Tabela 1. Grupos experimentais........................................................................35
Tabela 2. Intervalo de tratamento para aplicação do LED, após a indução da
ferida na região dorsal de camundongos, em diferentes períodos....................38
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LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1. Percentual médio de fibroblastos/fibrócitos nos grupos controle e
tratados com própolis, LED, LED+própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................40
Gráfico 2. Percentual médio de macrófagos nos grupos controle e tratados com
própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................41
Gráfico 3. Percentual médio de linfócitos nos grupos controle e tratados com
própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................42
Gráfico 4. Percentual médio de neutrófilos nos grupos controle e tratados com
própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................43
Gráfico 5. Percentual médio de substância fundamental amorfa nos grupos
controle e tratados com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................44
Gráfico 6. Percentual médio de fibras de colágeno nos grupos controle e
tratados com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................46
Gráfico 7. Percentual médio de neovascularização nos grupos controle e
tratados com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de
tratamento..........................................................................................................47
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SUMÁRIO RESUMO...........................................................................................................03
ABSTRACT........................................................................................................04
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................05
LISTA DE TABELAS..........................................................................................06
LISTA DE GRÁFICOS.......................................................................................07
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................09
1.1. Aspectos Gerais..........................................................................................09
2. OBJETIVOS...................................................................................................12
2.1. Objetivo geral..............................................................................................12
2.2. Objetivos Específicos..................................................................................12
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.....................................................................13
3.1. O Sistema Tegumentar...............................................................................13
3.2. Cicatrização de feridas...............................................................................15
3.3. Própolis.......................................................................................................24
3.4. Ledterapia...................................................................................................27
4. METODOLOGIA DE TRABALHO..................................................................35
4.1. Grupos experimentais.................................................................................35
4.2. Indução da ferida........................................................................................36
4.3. Produção do creme de própolis..................................................................37
4.4. Ledterapia...................................................................................................37
4.5.Obtenção de material histológico.................................................................38
4.6. Histomorfometria.........................................................................................39
4.7. Análise estatística.......................................................................................39
5. RESULTADOS...............................................................................................40
6. DISCUSSÃO..................................................................................................49
7. CONCLUSÕES..............................................................................................57
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................58
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................59
9
1-INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos gerais
A população está cada vez mais exigente com a qualidade do produto
que consome e se preocupa em usar produtos menos agressivos de origem
natural ou o mais próximo possível desta origem. Por isso torna-se tão
necessária a pesquisa de produtos extraídos de fitoterápicos e produtos
naturais com valor conhecido (PACKER & LUZ, 2007).
Dentre esses produtos a própolis tem se destacado devido a sua
aplicabilidade na indústria de alimentos e cosméticos, sendo utilizada como
princípio ativo em vários produtos. Isto ocorre devido às suas diversas
propriedades terapêuticas, como: antimicrobiana, anti-tumoral, anestésica, anti-
inflamatória, cicatrizante e anti-viral (MARRUCCI, 1995; LONGHINI et al., 2007;
PACKER & LUZ, 2007 ).
A própolis tem sido grandemente utilizada, em todo o mundo, no uso de
produtos naturais, porém apesar de haver grande quantidade de informações
disponíveis referente aos aspectos químicos e biológicos da própolis, sua
aplicação terapêutica ainda tem sido pouco estudada (FUNARI & FERRO,
2006).
Segundo Lustosa et al., (2008) há registro na internet de
aproximadamente noventa produtos a base de própolis (dentre eles cápsulas,
condicionador, xampu, sabonete, dentrifícios, batom, bala, chá, protetor solar,
gel pós-barba, creme, pomada, etc) disponíveis no mercado brasileiro. A
própolis tem seu uso empregado em cosméticos e também na indústria
alimentícia na forma de alimentos funcionais (SFORCIN et al., 2000).
Apesar de já estarem bem estabelecidos no meio científico os efeitos
antiinflamatórios da própolis e os efeitos da ledterapia, são escassos os
trabalhos que relacionam o uso da própolis associado ao LED.
Como o uso da própolis tem acontecido de forma grandiosa e tem
encontrado boa aceitação popular, esta surge como uma opção no tratamento
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de feridas, pois é de baixa toxicidade e pode ser de uso tópico (SFORCIN et
al., 2000).
O reparo tecidual, de acordo com Whelan et al, (2001) é um estado
dinâmico que compreende diferentes processos, entre eles, inflamação,
proliferação e remodelação. Cada fase apresenta células e funções
específicas.
Whelan et al., (2001) ressaltaram que o processo de cicatrização possui
três fases: a primeira, a degradação do substrato, a segunda, a proliferação
celular e a terceira, a remodelagem do tecido. Estudos destes autores
demonstraram que as mitocôndrias ao receber radiação da luz vermelha e
infravermelho próximo aumentam o metabolismo respiratório de certas células.
A fototerapia de baixa intensidade produz efeitos biomoduladores nos
tecidos. Através dela os pacientes podem se beneficiar tendo diminuição no
tempo de tratamento e melhora do aspecto da cicatrização. Há muita
divergência no tipo de laser ou led a ser usado, comprimento de onda,
dosimetria, tempo de aplicação, número de aplicações e intervalo entre elas.
Os parâmetros devem ser revisados para cada tipo de lesão, relacionando com
a profundidade, características teciduais, estágio da lesão e condições
fisiológicas dos pacientes (WHELAN et al., 2001).
A radiação tecidual com fontes de luz de baixa intensidade Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation - (LASER) e Light Emitting
Diode (LED) – na faixa do vermelho ao infra-vermelho próximo, tem sido
indicada como um tratamenro efetivo na modulação da dor e favorecimento do
processo de cicatrização tecidual (KANA et al., 1981).
A luz LED foi desenvolvida para oferecer uma alternativa efetiva à luz
laser. Os LEDs estimulam o processo de energia nas mitocôndrias de cada
célula, particularmente quando a luz vermelha perto do infravermelho é usada
em comprimentos de onda específicos para ativar os constituintes
mitocondriais, tais como: sistemas de citocromos e cromóforos. Os
comprimentos de onda, mais adequados, que aceleram a cicatrização de
feridas são: 680, 730 e 880 nm (WHELAN et al., 2001).
11
Baseado em achados na prática clínica encontrados em pacientes em
tratamento de feridas, na Clínica Regenere em Caratinga-MG, observou-se que
na terapêutica associando a aplicação da própolis e posteriormente o LED,
ocorreu melhora na cicatrização das feridas dos pacientes. Daí então surgiu tal
questionamento se estas duas terapêuticas em uso associado poderiam
potencializar os efeitos do tratamento de feridas.
Desta maneira, é relevante desenvolver novas alternativas nos
tratamentos de afecções, através do desenvolvimento de pesquisas que
objetivem avaliar o possível papel potencializador do LED sobre o efeito
antiinflamatório da própolis, além de compreender melhor a cinética da
resposta inflamatória, seja no tratamento isolado ou associado das terapêuticas
citadas.
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2 – OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral:
• Analisar a ação de diferentes tratamentos na resposta inflamatória
induzida considerando a cinética do infiltrado inflamatório.
2.2. Objetivos Específicos:
• Deteminar a cinética da resposta inflamatória nos tratamentos isolados
ou associados de LED e propólis.
• Comparar a ação isolada da própolis e do LED em resposta inflamatória
induzida.
• Avaliar a possível ação sinérgica ou potencializadora do uso associado
de LED e própolis no tratamento da inflamação em modelo experimental
.
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3 – Fundamentação Teórica
3.1- O Sistema Tegumentar
O revestimento externo do corpo constitui o chamado tegumento
comum. Constituindo este sistema a pele, seus anexos e a camada subcutânea
ou hipoderme (FIGURA 1). A pele apresenta múltiplas funções, atuando na
proteção do organismo contra agentes físicos, químicos e infecciosos
(bactérias), além de prevenir a eliminação excessiva de água por evaporação,
ou o seu ganho. Funciona como sistema refrigerador, uma vez que as
glândulas sudoríparas secretam um fluido para resfriar o corpo, enquanto os
pêlos e uma camada subjacente de gordura isolam contra o frio
(SILVERTHORN, 2010).
A pele é composta de três camadas, denominadas de epiderme, derme
e hipoderme, sendo as duas primeiras as principais. Cada uma delas é
formada por tecidos diferenciados e funções distintas (SAMPAIO & RIVITTI,
2001).
A epiderme, camada mais externa da pele é composta de proteínas
fibrosas denominadas de queratina. Na diferenciação epidérmica, há, também
importante participação da derme através de inter-relações entre fibroblastos e
queratinócitos (sintetizadores de queratina). A modulação da diferenciação
epidérmica é influenciada por meio de fator de crescimento epitelial (EGF),
fator transformador de crescimento (TGF-α), fator transformador de
crescimento de queratinócitos (KGF), fator transformador de crescimento beta
(TGF-ß), interleucinas (IL-1a, IL-6, IL-8), GM-CSF, vitamina A, retinóides e
chalonas (SAMPAIO & RIVITTI, 2001).
A derme é a segunda e também mais espessa camada da pele. Tem
como função o oferecimento de resistência, suporte, sangue rico em nutrientes
e oxigênio a pele. É subdividida em outras duas camadas: a papilar e a
reticular. A derme papilar está logo abaixo da epiderme, sendo composta
principalmente por células de fibroblasto que são responsáveis por produzir
uma forma de colágeno, que compõe o tecido conjuntivo. Já a camada reticular
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está localizada sob a camada papilar e também produz colágeno e fibras
elásticas. O colágeno e a elastina proporcionam resistência a pele e são
responsáveis pelo rechaço cutâneo. A derme também apresenta vasos
sanguíneos e linfáticos, nervos, glândulas sudoríparas e sebáceas e raízes
pilosas (FIGURA 1). A ligação entre a derme e o tecido conjuntivo e as
estruturas de suporte subjacentes, como fáscia, músculos e ossos, é realizado
por espessos feixes de colágeno.
A camada ou tela subcutânea é composta de tecidos adiposo e
conjuntivo, além de grandes vasos sanguíneos, nervos e vasos linfáticos. A
espessura da epiderme, da derme e da tela subcutânea, irão depender das
pessoas e das partes do corpo, exercendo desta forma uma ação protetora
para o corpo humano diante de agentes agressores.
FIGURA 1: Sistema Tegumentar
FONTE: Bear MF, Connors BW, Paradiso MA 2002. Neurociências-Desvendando o Sistema Nervoso. Porto Alegre 2ª ed. Artmed Editora. Disponível em: <http://www.mundo vestibular.com.br/content_images/sistema_tegumentar.gif>. Acesso em: 06 maio 2010.
15
3.2- Cicatrização de feridas
A cicatrização é uma seqüência de eventos que ocorre de forma
coordenada e são desencadeadas pelo organismo, com objetivo de reconstituir
estrutural e funcionalmente o tecido lesado (SILVA et al., 2007; MENDONÇA &
COUTINHO-NETTO, 2009).
Quando um organismo sofre uma agressão local, ocorre uma reação
tecidual e vascular, dando início ao processo de inflamação (FIGURA 2). O
tecido conjuntivo é formado por células e pela matriz extracelular. Diferentes
tipos celulares podem estar envolvidos na resposta inflamatória como os
fibroblastos, miofibroblastos, pericito, adipócito e leiomiócitos A matriz
extracelular é constituída por colágeno, elastina, proteoglicanos, glicoproteínas
estruturais e glicosaminoglicanos (MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
FIGURA 2: Fases da cicatrização de feridas.
FONTE: Contran et al., 2000.
As células que compõem o tecido conjuntivo principalmente os
fibroblastos sintetizam o colágeno sob uma forma solúvel: o pró-colágeno.
Suas fibras são dispostas inicialmente ao acaso, orientadas em várias direções
no abundante material amorfo, formado principalmente por proteoglicanos. Este
padrão inicialmente frouxo é gradualmente substituído por padrão denso,
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quando acontece uma compactação das fibras colágenas em feixes paralelos e
bem orientados (MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
A estabilização do colágeno ocorre aos poucos com ligações intra e
intermoleculares entre as cadeias alfas, geralmente por intermédio de cadeias
de lisina. Este processo é chamado de reticulação (cross-linking) que conduz
ao “amadurecimento” do colágeno o que lhe confere maior força tênsil e maior
resistência à degradação enzimática. Ocorre ainda um processo semelhante de
reticulação com a elastina que é essencial para consistência e elasticidade das
fibras elásticas (MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
As células do tecido conjuntivo proliferam e secretam os componentes
da matriz extracelular através dos mensageiros químicos, sob forma de
polipeptídeos secretados por vários tipos celulares (citocinas) As citocinas
fibrogênicas mais importantes são o fator de transformação do crescimento
beta (TGF-beta), o fator de estimulação fibroblástica (FSF), o fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e a interleucina 1 (IL-1). Estes
fatores exercem ações de potencialização e inibição da síntese de colágeno,
destacando o interferon-alfa e gama e o fator de necrose tumoral beta (TNF-
beta) (MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
A remodelação ou reabsorção da matriz ocorre paralelo a sua formação.
Quando há um predomínio da síntese, tem uma formação de excesso de matriz
extracelular, chamada fibrose. Quando ocorre um predomínio da degradação
se tem o desaparecimento parcial ou total da fibrose. O reparo pode ocorrer de
duas formas: quando as células parenquimatosas morrem e o estroma continua
íntegro, o reparo se faz a partir de células do mesmo tipo das que perderam,
voltando o órgão à sua estrutura normal, este processo é chamado de
regeneração. Quando o estroma é destruído, o reparo se faz a partir do tecido
conjuntivo, ocorrendo então a cicatrização. Este processo quase sempre
acontece combinado à regeneração de elementos epiteliais. O processo de
cicatrização pode ser considerado um segmento do processo inflamatório que
provocou perda de substâncias. Nas duas situações o reparo ocorre após
perda de tecido por infarto, hemorragias, por ressecção cirúrgica, etc
(MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
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A classificação das feridas é dada de acordo com o comprometimento
tecidual, sendo da seguinte forma: feridas de espessura parcial (ou feridas
epidérmicas) – nas quais a lesão acomete a epiderme e a camada superficial
da derme; feridas de espessura total (ou feridas dérmicas) – nas quais ocorre
comprometimento de toda a epiderme, derme e tecido subcutâneo, podendo se
estender ao tecido muscular e ósseo (SILVA et al., 2007).
Na cicatrização de feridas de espessura parcial, primeiramente ocorre
um preenchimento das feridas por sangue, restos celulares desvitalizados e
partículas de tecidos, que formam uma crosta. As células epiteliais separam-se
da membrana basal, migram em direção à área lesionada e depois se
incorporam à camada epitelial. Ao findar a cicatrização a crosta se desprende,
então inicia o processo de queratinização das células proliferadas. Ao processo
de regeneração é dado o nome de reepitelização. A cicatrização de feridas de
espessura parcial resulta em uma cicatriz imperceptível (SILVA et al., 2007).
Segundo Biondo-Simões et al., (2006) o processo de cicatrização é um
fenômeno local onde há a participação de elementos comuns a vários setores
do organismo. Sendo assim fica fácil imaginar que fatores ambientais e
fisiológicos tenham grande impacto na evolução da cicatrização, podendo
influenciar na qualidade e no tempo da cicatrização, e na presença ou não de
complicações. O mesmo autor realizou um estudo em feridas induzidas em
ratos e observou que a hipertensão arterial dificulta o processo de cicatrização,
sendo observado devido a densidade de colágeno ser maior em ratos
normotensos, além de que as cicatrizes em hipertensos serem menos
resistentes que as do grupo controle normotenso no primeiro momento.
A cicatrização de feridas de espessura total é bem complexa e de longa
duração, compreendendo três fases a inflamatória, a fibroblástica e a de
remodelamento (FIGURA 3).
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FIGURA 3: Fases da cicatrização de feridas
FONTE: < http: //www.aad.org/education/students/_img >. Acesso em 06 maio de 2010.
Na fase Inflamatória ocorre o preparo da ferida para a cicatrização,
retirando restos celulares e tecidos desvitalizados. Logo após o surgimento da
ferida, começa o processo de inflamação que consiste em respostas vascular e
celular, que são responsáveis pelo controle do sangramento e pela remoção de
microrganismos, material inorgânico e tecidos desvitalizados. No início do
processo inflamatório ocorre uma vasoconstrição transitória de vasos
sanguíneos e linfáticos para inibir a perda sanguínea. Simultaneamente ocorre
desencadeamento da cascata de coagulação que no seu termino converte o
fibrinogênio em fibrina pela ação da trombina. Depois ocorre uma
vasodilatação, onde a permeabilidade do vaso é aumentada, ocorrendo
extravasamento de liquido plasmático para o meio extravascular. Tampões de
fibrina vindos do plasma extravasado bloqueiam o fluxo linfático, localizando a
inflamação e inibindo a disseminação da infecção. Durante a vascularização
ocorre a marginação leucocitária, com a orientação periférica dos leucócitos,
depois estes migram para o tecido intersticial, processo denominado de
emigração. Os neutrófilos são atraídos por agentes quimiotáticos e migram
para o tecido da ferida, evento chamado de quimiotaxia. Então inicia o
processo de fagocitose, onde os leucócitos realizam digestão enzimática, para
eliminar bactérias, tecidos desvitalizados, restos celulares e demais
substâncias estranhas. Os neutrófilos apresentam vida curta predominando nas
primeiras 6 a 24 horas, sendo substituídos pelos monócitos. À medida que
ocorre a morte dos neutrófilos, ocorre a liberação de enzimas intracelulares que
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somado a outros produtos da degradação celular, fazem parte do exsudato da
ferida. Os monócitos são leucócitos mononucleares que estão envolvidos em
todas as fases da cicatrização. Os monócitos chegam ao local da lesão,
transformando-se em macrófagos para realizar a fagocitose de substâncias
estranhas. Os macrófagos vão eliminar da ferida todo o material que não foi
solubilizado pelos neutrófilos. Quando a fase inflamatória vai chegando ao fim a
atividade fagocitária dos macrófagos reduzem, assim como o edema e os
outros sinais clínicos de inflamação com calor, rubor e dor. Dando inicio a
segunda fase do processo de cicatrização (SILVA et al., 2007). Esta primeira
fase também pode ser chamada de Limpeza, onde após a lesão os tecidos
liberam mediadores químicos da inflamação. Surge então um processo
inflamatório agudo e o exsudato fibrinoso na superfície, que em contato com o
ar fica ressecado, formando uma crosta. Esta crosta tem uma importância para
auxiliar a conter a hemorragia e a proteger o ferimento de contaminações
externas. As células inflamatórias dirigem ou removem detritos celulares,
bactérias, corpos estranhos, passo essencial para que o crescimento reparador
ocorra. Enquanto não se findar a inflamação ativa, o processo de cicatrização
não se completa (MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
A Fase fibroblástica inicia-se com o processo de migração de células
endoteliais da periferia para o centro da lesão. As células endoteliais proliferam
e dão origem ao tecido de granulação. O tecido de granulação é um tecido
especializado, com aspecto róseo e granular, com intensa proliferação de
novos vasos sanguíneos e fibroblastos. Nesta fase, os macrófagos continuam
presentes no tecido de granulação, porém em menos intensidade, eliminando
os restos de material, fibrina e outros corpos estranhos do local. Os novos
vasos originam-se por meio de brotação, a partir de vasos pré-existentes, a
esse processo biológico é dado o nome de angiogênese ou neovascularização
(MONTENEGRO & FRANCO, 2004) (FIGURA 4).
Ocorre a sintetização de fibroblastos a partir de células mesenquimais
indiferenciadas, que são responsáveis pela produção de colágeno, entre outros
componentes da matriz extracelular do tecido conjuntivo (fibras elásticas,
proteoglicanos, fibronectina) (SILVA et al., 2007).
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Os fibroblastos compreendem subpopulações celulares diferenciadas
que no intersticio se arranjam para sintetizar e modificar os componentes da
matriz que conferem apoio estrutural, resultando nos arcabouços, cápsulas ou
túnicas adventícias de órgãos, no estabelecimento de comunicações celulares,
no desempenho de papéis contráteis, endócrinos ou no armazenamento de
vitamina A, observados no estroma de órgãos como fígado, baço, rins, pele,
pulmões e gônadas, sem, no entanto, perderem a capacidade de amplificar
funções que levam à fibrilogênese ou à deposição de grandes quantidades de
matriz extracelular (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2003; KOMURO, 1990;
FRANK, 1999).
FIGURA 4: Cascata de eventos angiogênicos
FONTE: The Angiogenesis Foundation (2000).< http://www.angio.org/understanding/content_understanding.html>Acesso em: 05 out. 2010.
Os fibroblastos têm como função a proliferação, diferenciação, produção
e degradação de matriz extracelular, e também a apoptose, envolvendo a
ativação de vias de sinalização intracelulares induzidas por citocinas
multifuncionais (CARVALHO & COLLARES-BUZATO, 2005).
A deposição de fibroblastos é maior nos tecidos fetais do que em
adultos. Os fibroblastos fetais produzem uma matriz rica em
glicosaminoglicanos de alta massa molecular, particularmente o ácido
21
hialurônico que garante ambiente favorável a migrações celulares quando
comparado a tecidos adultos, havendo excessiva deposição de colágeno e
neovascularização, acompanhados do decréscimo do conteúdo de ácido
hialurônico e aumento de glicosaminoglicanos sulfatados, favorecendo a
formação de fibras colágenas adaptadas para resistir ao aumento das forças de
tensão que atuam sobre a derme na vida pós-natal (NODDER & MARTIN,
1997).
O colágeno é responsável pela integridade da ferida, por proporcionar
resistência e rigidez. Com o avançar da proliferação tecidual e o preenchimento
da ferida por tecido de granulação, ocorre a epitelização gradual, com uma fina
cobertura sobre a pele. À medida que o processo de reepitelizacao se completa
inicia-se outro evento: a contração da ferida, que consiste na mobilização dos
tecidos ao redor, causando um movimento centrípeto da pele normal em toda
sua espessura. As células responsáveis pela contração da ferida são os
miofibroblastos, que se originam a partir da diferenciação dos fibroblastos. Os
miofibroblastos aderem às margens da ferida e puxam toda epiderme para
dentro. A contração da ferida recompõe toda a lesão, formando o tecido
cicatricial. O número de fibroblastos na ferida é reduzido gradativamente, na
medida em que a cicatriz vai se formando, o que caracteriza o final da fase
fibroblástica (SILVA et al., 2007).
Este estágio também pode ser chamado de retração, tendo início após 2
a 3 dias do ferimento. Após ocorrer o ferimento, os miofibroblastos proliferam e
se diferenciam nos tecidos vizinhos e estabelecem junções entre si, formando
um arcabouço contrátil, responsável pela formação de bordas na ferida.
Quando há uma ação exagerada dos miofibroblastos surgem as contraturas,
que são comuns após queimaduras extensas (MONTENEGRO & FRANCO,
2004).
A fase de remodelamento consiste na reorganização das fibras de
colágeno e na substituição das fibras do tipo III pelas do tipo I. Esta fase inicia
a partir da formação do tecido cicatricial, altera a forma, tamanho e resistência
da cicatriz. Ao mesmo tempo em que ocorre a formação do tecido cicatricial,
ocorre a produção e degradação de colágeno. A cicatriz fica densa e com fibras
22
de colágeno desorganizadas, que são reorganizadas em um processo que
permite que o tecido cicatricial depositado aleatoriamente seja arranjado tanto
em orientação linear, como lateral. O processo de remodelamento geralmente
varia de 12 a 15 meses (SILVA et al., 2007).
De acordo com Montenegro & Franco, (2004) após as fases de limpeza
e retração, ocorre a fase chamada de tecido de granulação e a fase de
reepitelização. Na fase de granulação há proliferação de fibroblastos e de
capilares no seio de uma matriz abundante, edemaciada e basófila. Há ainda
um processo de angiogênese onde as células endoteliais secretam proteases
que degradam a matriz extracelular, depois migram nos espaços
perivasculares, proliferam e se alinham para formar novos vasos (FIGURA 3).
As células endoteliais se agrupam e fazem protrusão por entre os fragmentos
das membranas basais, a princípio formando fileiras sólidas de células. Vários
são os fatores ou sinais responsáveis pela angiogênese como, fatores
produzidos por macrófagos (fator de angiogênese derivado de macrófago),
mastócitos (heparina), plaquetas (fator de crescimento derivado de plaquetas,
fator de transferência do crescimento, beta) e fibroblastos (fator de crescimento
de fibroblastos). Os novos capilares ao crescerem se dirigem para a superfície
da lesão e se encurvam para baixo, formando um pequeno arco ou cajado,
conferindo um aspecto granuloso e avermelhado à superfície. A matriz
extracelular vai se tornando densa com o passar dos dias, adquirindo cada vez
mais fibras colágenas. No início apresenta um padrão frouxo, mas pouco a
pouco as fibras se dispõem em feixes paralelos, compactos, enquanto os vasos
sanguíneos vão se tornando menos proeminentes e desaparecem. Então o
tecido de granulação é substituído por uma cicatriz fibrosa, dura,
esbranquiçada e retraída.
Na fase de reepitelização, as células epiteliais sofrem mitoses e
começam a se intrometer por debaixo da crosta, porém a reepitelização total do
ferimento ocorre no término do processo de reparo. Ao final as células epiteliais
crescem rapidamente e restabelecem a continuidade do revestimento. No início
a camada epitelial de revestimento é fina e transparente, possibilitando a
visualização do tecido conjuntivo avermelhado que está abaixo, porém com o
23
tempo o tecido conjuntivo se torna denso e o epitélio de revestimento mais
espesso (MONTENEGRO & FRANCO, 2004).
De acordo com a perda tecidual o processo de cicatrização pode ocorrer
de duas formas: cicatrização por primeira intenção e cicatrização por segunda
intenção. A cicatrização por primeira intenção também chamada de fechamento
primário, ocorre quando há lesão da pele com perda mínima de tecido
(FIGURA 5). O processo de cicatrização ocorre sem contaminação bacteriana
significativa e evolui rapidamente (SILVA et al., 2007).
FIGURA 5: Cicatrização por primeira intenção numa f erida fechada, não infectada, como uma ferida cirúrgica incisional.
FONTE: http://www.forp.usp.br/restauradora/laser/Luciana/Image95.gif
A cicatrização por segunda intenção também conhecida de fechamento
secundário ocorre quando a lesão se desenvolve com maior perda celular e
tecidual (FIGURA 6). As lesões são mais extensas e demoram um tempo maior
para cicatrização, aumentando o risco de uma infecção. Tem a formação de
uma grande quantidade de tecido de granulação e intensa contração da ferida.
Quando a ferida tem o seu fechamento primário adiado devido a presença de
infecção, a cicatrização é chamada de cicatrização por primeira intenção
retardada ou fechamento primário retardado ou ainda fechamento por terceira
intenção. No momento em que o processo infeccioso é controlado, a ferida é
suturada e a cicatrização se dá por reepitelização (SILVA et al.,2007).
24
FIGURA 6: Cicatrização por segunda intenção primeiramente em uma ferida aberta e não infectada, no segundo momento uma ferida aberta e i nfectada.
FONTE: http://www.forp.usp.br/restauradora/laser/Luciana/Image96.gif
É importância lembrar que de acordo com STARKEY, (2001) a
velocidade e a qualidade da cicatrização são reguladas pela quantidade de
trifosfato de adenosina (ATP) produzido. O ATP corresponde a fonte primária
de energia da célula, sendo fundamental para fornecer a energia metabólica
necessária para restaurar as propriedades da membrana celular, realizando por
meio da entrada e saída de sódio e potássio da célula, para construir e
sintetizar novas proteínas.
3.3- Própolis
A palavra própolis é de origem grega e resulta da combinação entre
duas expressões, pró (defesa) e polis (cidade). As abelhas utilizam da própolis
para se protegerem de insetos e microrganismos (MARCUCCI, 1996).
A própolis contém 50 - 60% de resinas e bálsamos, 30 - 40% de ceras, 5
– 10% de óleos essenciais, 5% de grão de pólen, além de microelementos
como alumínio, cálcio, estrôncio, ferro, cobre, manganês e pequenas
quantidades de vitaminas B1, B6, C e E (FUNARI & FERRO, 2006).
25
A composição química da própolis inclui flavonóides, ácidos aromáticos
e ésteres, aldeídos e cetonas, terpenóides e fenilpropanóides, esteróides,
aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e vários outros
compostos em quantidades menores (MATSUDA et al., 2002; ROCHA et al.,
2003). Há também na constituição elementos inorgânicos como o cobre,
manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e silício (MARCUCCI, 1996). Aos
flavonóides e ácidos fenólicos são atribuídas as propiedades antibacteriana,
antiviral e antioxidante (VOLPI & BERGONZINI, 2006).
Portanto, parece está havendo um crescente empenho na produção e
exploração da própolis, sendo que esse interesse global de pesquisas em
própolis tem duas justificativas: a primeira devido a suas características de
panacéia (várias atividades biológicas). De certa maneira essas características
também atrapalham sua aceitação, já que os médicos e outros profissionais
tendem a desconfiar da sua eficácia devido a lhe serem atribuída dezenas de
atividades biológicas simultaneamente. A segunda é devida ao seu alto valor
agregado, com o que um frasco do extrato alcoólico é vendido no Brasil por
cerca de 5 a 10 reais, mas chegando a custar 150 dólares em Tóquio
(NOTHENBERG, 1997; PEREIRA et al., 2002). Este alto valor agregado em
Tóquio pode justificar em parte o interesse dos japoneses na própolis,
principalmente a brasileira (sendo hoje a terceira maior produção mundial,
perdendo apenas para a Rússia e a China). Embora produza de 10 a 15% da
produção mundial, o Brasil atende a cerca de 80% da demanda japonesa.
Dados da Federação de Apicultores de Minas Gerais revelam que a própolis
produzida no estado é considerada a melhor do mundo no mercado japonês,
onde o quilograma do produto aumentou consideravelmente de US$ 5 para
US$ 200 nos últimos anos (PEREIRA et al., 2002).
Estudos realizados com extratos de própolis comercializados no Brasil
mostraram melhor atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas, em
comparação à atividade contra gram-negativos, isto ocorre porque, apesar das
bactérias gram-negativas apresentarem uma estrutura de parede celular menos
rígida em comparação as gram - positivas, têm uma parede celular
quimicamente mais complexa, sendo que um dos constituintes desta parede, o
lipopolissacarídeo, é que determina a antigenicidade, toxicidade e
26
patogenicidade destes microrganismos. Além do que as bactérias gram-
negativas possuem um teor lipídico maior do que as gram-positivas (VARGAS
et al., 2004; PACKER & LUZ, 2007). A própolis também demonstrou excelentes
atividades fungicida e fungistática, em testes in vitro contra leveduras
identificadas como causadores de onicomicoses (LONGHINI et al., 2007).
Independente de sua origem a própolis sempre apresenta atividade
antimicrobiana, uma vez que seu efeito bactericida e fungicida é indispensável
para preservar a vida da colméia (BURIOL et al., 2009).
Acredita-se que a atividade antiinflamatória da própolis ocorre devido a
presença de flavonóides que exercem uma atividade inibitória contra a
ciclooxigenase (COX) e lipooxigenase, além do ácido fenil éster caféico (CAPE)
que inibe a liberação de ácido aracdônico da membrana celular, suprimindo as
atividades das enzimas COX-1 e COX-2 (FIGURA 7)(BORRELLI et al., 2002).
A ação antiinflamatória da própolis também se dá pela inibição da síntese de
prostaglandinas, ativando a glândula do timo, auxiliando o sistema imune pela
promoção da atividade fagocitária e estimulando a imunidade celular
(KOSALEC et al., 2005).
A ação antioxidante também está relacionada aos flavonóides. Existe
uma correlação entre o alto conteúdo de flavonóides totais e a atividade anti-
radicais livres em extratos de própolis da Argentina (AHN et al., 2007).
Marcucci, (1995) se refere a uma ação virucida da própolis nos vírus de herpes
simples (HSV) e da estomatite vesicular (VSV).
A propriedade cicatrizante da própolis também está relacionado a
presença de flavonóides e ácidos fenólicos. Um estudo comparando a atividade
cicatrizante de um creme de própolis com um de sulfadiazina de prata,
demonstrou que os ferimentos tratados com própolis apresentaram menos
inflamação e mais rápida cicatrização do que aqueles tratados com sulfadiazina
de prata (GREGORY et al., 2002).
27
FIGURA 7: Ação antiinflamatória da própolis
FONTE: http: //www.arthrits.co.za/cox.html
A pomada de própolis quando utilizada em portadores de feridas
crônicas apresentam um tempo médio de cicatrização de 13,10 semanas,
sendo considerado um estimulo para a cicatrização, além de ser uma ação
terapêutica asséptica e uma ferramenta de fácil utilização e baixo custo para o
cuidado tópico de feridas crônicas (SANTOS et al., 2007).
Segundo Vieira et al., (2008) os ratos que foram tratados em seu estudo
com própolis a 20% tiveram os diâmetros da lesão inferiores em comparação
com as lesões tratadas com chá verde e as feridas tratadas com o creme-base.
Relatou ainda que as lesões tratadas com própolis e chá verde evoluíram
melhor durante o tratamento e não apresentaram sangramentos, infecções
secundárias e tecido necrótico durante o tratamento.
3.4 - Ledterapia
O LED é uma fonte de luz contínua com alta eficiência
luminescente (FIGURA 8). Constitui-se de um diodo semicondutor (junção P-N)
que quando energizado emite luz visível, encaixado em uma cúpula clara de
epoxy que atua como uma lente (MAVROPOULOS et al., 2005). A luz é
monocromática e é produzida pelas interações energéticas do elétron. Emite
uma estreita faixa de radiação eletromagnética que varia de comprimentos de
28
onda que vão do ultravioleta ao visível e infravermelho (POSTEN et al., 2005).
Este tipo de fonte de luz vem apresentando vantagens em relação à luz laser,
uma vez que se apresenta mais economicamente viável, pode irradiar uma
maior área de superfície e requer menos energia para operação (BRANDON et
al., 2008).
FIGURA 8: Diodo Emissor de Luz
FONTE: <http://www.casadofuturo2009.blogspot.com> Acesso em: 06 maio2010.
A luz emitida pelo LED é ausente de coerência e colimação (BAGNATO,
2002). A coerência da luz é distinguida por dois aspectos: o efeito físico que
promove e a ação desta luz com as moléculas ou tecidos. A absorção da luz de
baixa intensidade pelo sistema biológico, em condições fisiológicas, é não
coerente, devido a taxa de excitação da decomposição da coerência em níveis
de elevada magnitude em relação à taxa de fotoexcitação. A determinação da
interação da luz com as moléculas adjacentes, é determinada pelo tempo de
decomposição da coerência de fotoexcitação, sobre condições menores do que
10¹² segundos. Este tempo médio de excitação irá depender da intensidade da
luz, sendo que, em 1mW/cm², o tempo é em torno de 1 segundo, o que
determina que a coerência é retida ao longo dos primeiros extratos da pele,
antes que produza a absorção da luz pelas moléculas fotorreceptoras
especializadas (melanina, porfirina, citocromo e oxidase e hemoglobina)
(KARU, 2003).
29
De acordo com Low & Reed, (2001) a profundidade de penetração está
relacionada ao comprimento de onda da radiação, sendo 0,5 a 2mm para luz
vermelha (635-670 nm) e de 2 a 4 mm para a luz infravermelha (820-904 nm)
(FIGURA 9).
FIGURA 9: Profundidade de penetração dos compriment os de onda na pele.
FONTE: SIMUNOVIC, Z; TROBONJACA,T.(2000) Lasers in Medicine and Dentistry-Basic Scienc andu p-to-date Clinical Aplication of Low Energy-Level Laser Therapy.
A radiação tecidual com fontes de luz de baixa intensidade- LASER e
LED– na faixa do vermelho ao infra-vermelho próximo, tem sido indicada como
um tratamento efetivo na modulação da dor e favorecimento do processo de
cicatrização tecidual (KANA et al., 1981).
Quando a irradiação é feita em uma ferida de forma pontual com laser,
observa-se um pequeno espalhamento da luz, para áreas ao redor do ponto
irradiado, já quando se irradia com um LED, observa-se um espalhamento
maior da luz. Este efeito de espalhamento pode otimizar a terapia, contribuindo
para a diminuição dos pontos de aplicação. Esta é uma outra condição que
facilita o uso do LED, porque enquanto o laser tem alto custo e dificilmente
encontra-se dispositivos de laser com mais de uma feixe de luz, o LED é
comercialmente mais barato e de fácil reprodução, podendo criar um
dispositivo com várias lâmpadas, podendo irradiar uma área maior em um
tempo menor (FIÓRIO, 2008).
O espectro de ação eletromagnética da luz emitida pelo LED é mais
amplo em relação ao laser. O laser é caracterizado por uma maior
concentração da fluência em uma pequena faixa espectral (660nm ±5nm). Já o
30
LED, a densidade de energia está distribuída em uma banda eletromagnética
maior (635nm ± 35nm), podendo interagir com um maior grupo de
fotorreceptores específicos. Pode-se concluir que há uma grande janela
biológica de absorção da luz nos tecidos biológicos diante da aplicação dessas
luzes terapêuticas, permitindo a ação bioestimuladora nos respectivos
receptores de luz (CORAZZA, 2005).
De acordo com Lagan et al., (2000), a terapia com luz traz vários
benefícios como fotobiomodulação, sendo decorrentes da energia luminosa por
fotorreceptores biológicos (cromóforos), que são capazes de modular as
atividades bioquímica e fisiológica das células.
A terapia por diodo emissores de luz (LED) com comprimento de onda
na faixa espectral do vermelho (630nm) ao infravermelho próximo (880nm) leva
a melhora na irrigação local, além de formação de tecido de granulação e
cicatricial e redução da área das feridas em tratamento de lesões venosas,
podendo ser considerado uma alternativa interessante para o tratamento
destas lesões (SILVA et al., 2009).
Segundo Minatel et al., (2009) a associação de LED’s (32 LED’s de
890nm e 4 LED’s de 660nm, 500mW) duas vezes por semana com sulfadiazina
de prata a 1% tópica diária mostrou uma eficácia na cicatrização ainda maior
em comparação a 1 LED de 660 nm, 5mW. O uso do LED é uma terapia
bioestimuladora, não invasiva, de fácil e rápida aplicação, com efeito
analgésico no tratamento de ulceras de perna em pacientes diabéticos
(MINATEL et al., 2009).
O uso do LED, com comprimento de onda de 625 nm, em individuo
portador de úlcera em ambos os membros inferiores, mostra a potencialidade
desta alternativa de tratamento na evolução cicatricial e redução da dor,
relatando ainda um possível efeito tardio do LED no processo de reparação
tecidual (SIQUEIRA et al., 2009).
A laserterapia está indicada para processo inflamatório agudo, sendo
que a dosagem de 30J apresenta efetiva inibição da evolução do edema. O
laser diodo invisível com comprimento de onda 904nm, potência 27mW e
31
densidade de energia de 4J/cm², exerce ação antiinflamatória e analgésica
sobre os tecidos (JÚNIOR et al., 2007). Ainda segundo Pinto et al., (2008) o
tratamento com laser As-Ga de 904 nm tem um efeito antiinflamatório ainda
melhor quando comparado com o ultra-som pulsado de 1mHz, quando aplicado
em músculo estriado esquelético inflamado de ratos wistar.
O uso do laser As-Ga (150mV, 60J/cm², 820 a 904nm) inicialmente
acelera a resposta inflamatória, depois promove maior ativação de células
monocíticas e fibroblastos, permitindo melhor modulação da resposta
inflamatória e da cicatrização da ferida (ROCHA et al., 2007).
De acordo com Júnior et al., (2006) a terapia a laser de baixa
intensidade é eficaz no processo de modulação da reparação tecidual,
favorecendo a cicatrização tecidual mais rápida e organizada.
A laserterapia de baixa intensidade (comprimento de onda de 870 nm,
potencia de pico de 70 mW, potencia media de saída de 0,5 a 3,5mW e
aplicação através de fibra ótica) obtém bons resultados no processo de
modulação da reparação tecidual, resultando em uma cicatrização tecidual
mais rápida e organizada (JUNIOR et al., 2006).
Whelan et al., (2001) comprovaram in vitro a resposta, muito favorável,
do aumento de fibroblastos em células derivadas da pele de ratos, quando
expostos ao LED (comprimentos de onda combinados 680nm, 730nm, 880nm;
8 J/cm2). O crescimento celular aumentou em 150-200% quando comparado
com as células controle. Isto também ocorre in vivo, em organismo saudável, o
qual irá regenerar o tecido cicatrizante, mas o crescimento celular cessa
quando a cicatrização está completa. Ressalta-se a importância que o
tratamento com LED acelera a cicatrização normal e a regeneração do tecido,
não produzindo excesso no crescimento celular, nem tampouco células
neoplásicas.
A terapia com LED melhora o processo de reparo tecidual em casos de
feridas crônicas, economizando não somente o tempo, bem como recursos
tanto para pacientes como para as instalações de cuidados com a saúde. Além
do que reduz o risco de infecções para o paciente, diminui a quantidade de
32
medicação e faz com que o paciente retorne mais rapidamente a suas
atividades (WHELAN et al, 2003).
O LED pode funcionar como uma alternativa ao laser por produzir vários
comprimentos de onda, permitindo o tratamento de grandes feridas, além de
não produzir calor. Também é importante salientar que o uso do LED, segundo
a Food and Drug Administration (FDA) não oferece risco significante, sendo
aprovado seu uso em seres humanos (WHELAN et al., 2003).
Segundo Whelan et al., (2003) a ledterapia estimula genes que
codificam a melhora do reparo tecidual e regeneração da membrana. Ainda
não se tem uma resposta bioquímica de como o LED aprimora o processo de
cicatrização da ferida. Acredita-se que a luz infravermelha é absorvida por
alguns fotorreceptores, que acionam uma cascata de reações na célula.
Usando técnicas de detecção de genes podemos começar a entender o
mecanismo bioquímico que é acionado pelo LED e que podem exercer um
papel importante no processo de reparação da ferida. Os efeitos do LED na
expressão dos genes envolvidos no reparo da ferida é que possivelmente
reduzem a dor e modulam o reparo tecidual (WHELAN et al., 2003).
Farouk et al., (2003) fez um estudo utilizando terapia com LED no reparo
de feridas de queimaduras em ratos diabéticos e não-diabéticos, com um
programa de tratamento de três vezes por semana. Foi observado que a
ledterapia policromática atua na cicatrização dependendo das doses a serem
utilizadas. As doses e 5 e 10 J/cm² foram menos eficazes na aceleração do
reparo tecidual nos ratos não-diabéticos, em contra partida tiveram excelentes
resultados nos ratos diabéticos utilizando as doses de 5, 10, 20, e 30 J/cm².
O tratamento utilizando a luz, tem um efeito aumentando a
vasodilatação, já seus efeitos nas células inflamatórias precisam de mais
estudos, principalmente em modelos diabéticos, pelos comprometimentos na
microcirculação e na resposta inflamatória (FAROUK et al., 2003).
O uso da ledterapia policromática ainda está em fase inicial, em questão
de estudos científicos, ainda é necessário pesquisas mais rigorosas,
33
orientações aos fabricantes e controle de qualidade dos equipamentos de LED.
São necessários estudos complementares direcionando o comprimento de
onda e a dosagem a ser utilizada para aumentar a sua eficácia e o nosso
conhecimento sobre seus mecanismos e seus efeitos (FAROUK et al., 2003).
Uma outra forma de utilização do LED é como fonte de luz na Terapia
Fotodinâmica, que é mais uma técnica no arsenal de tratamentos que usam
aparelhos para o controle das diversas doenças da pele, diminuindo a
necessidade do uso de medicamentos e o índice de efeitos colaterais e, ao
mesmo tempo, visando facilitar a vida dos indivíduos
(http://www.dermatologia.net/neo/base/artigos/terapia_fotodinamica.htm, acessado em Janeiro
de 2010).
A terapia fotodinâmica é um tipo de tratamento baseado em uma reação
fotoquímica citotóxica. Para que esta reação ocorra é preciso do oxigênio
molecular, da droga fotossensibilizadora e de uma fonte de luz intensa. Este é
um tipo de tratamento bastante promissor devido ao baixo índice de efeitos
colaterais, por apresentar um alto grau de seletividade (JUNIOR & PINHEIRO,
1998).
A terapia fotodinâmica tem mostrado bons resultados com relação a
terapia do câncer em suas diversas formas (MACHADO, 2000). Além de um
grande potencial em outros tratamentos como destruição de infestações
bacterianas resistentes a tratamentos tradicionais a base de antibióticos (VAN
DER MEULEN, 1997).
A terapia fotodinâmica — também chamada de PDT (na sigla em inglês
para Photodynamic Therapy) — não é um tratamento tão moderno quanto
parece, existe a mais de 40 anos. O que aconteceu foram algumas mudanças
na maneira de se fazer a técnica. Isto pode ter acontecido pelo conceito básico
da PDT: a combinação de um fotossensibilizante, drogas e luz, que são
relativamente inofensivos por si mesmos, mas combinado (na presença de
oxigênio) acaba por causar mais destruição do tumor ou menos seletiva
(http://transamerica.tv.br/index.php/Saude/Terapia-Fotodinamica.html,
acessada em Janeiro de 2010 ).
34
Estudos multicêntricos controlados e randomizados demonstram a alta
eficácia e resultado cosmético final superior dessa modalidade terapêutica em
relação aos tratamentos convencionais. Para condições cutâneas não
oncológicas, como acne vulgar, verrugas virais e esclerodermia localizada, há
também relatos e série de casos confirmando o potencial terapêutico da terapia
fotodinâmica (TOREZAN et al., 2009).
O desenvolvimento de fotossensibilizantes tópicos, ácido 5-
aminolevulínico (ALA) ou seu metiléster (MAL), frente aos derivados da
hematoporfirina de aplicação sistêmica, permitiu um grande avanço na
popularidade da terapia fotodinâmica na dermatologia, uma vez que tanto ALA
quanto MAL tópicos não induzem mais fotossensibilidade generalizada
prolongada. A produção de intermediários reativos de oxigênio, como oxigênio
singlet, depende da concentração, da localização do fotossensibilizante no
tecido alvo, assim como da dose de luz utilizada. Tanto as lâmpadas de amplo
espectro quanto os LEDs constituem fontes de luz adequadas para que os
efeitos citotóxicos da terapia fotodinâmica resultem na destruição do tumor ou
seus efeitos imunomodulatórios atuem melhorando as condições inflamatórias
cutâneas (TOREZAN et al., 2009).
35
4 – Material e métodos
4.1. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados 40 camundongos, todos machos com
aproximadamente dois meses de idade, do Biotério Central da Universidade
Federal de Minas Gerais. Os animais foram mantidos no Centro de Estudo da
Biologia (CEB) do Centro Educacional de Caratinga (UNEC) em ciclo de
luminosidade 12 horas claro/escuro e temperatura de 22°C, permaneceram em
gaiolas individuais e receberam ração comercial e água em quantidades
adequadas durante o decorrer do experimento. Os animais foram pesados, e
posteriormente divididos em 4 grupos como descrito na Tabela 1.
Tabela 1 - Grupos experimentais n=40
Não-tratados
A Indução da ferida e sacrifício após 7 dias 5
B Indução da ferida e sacrifício após 14 dias 5
Tratado com própolis N° de animais
C Indução da ferida e uso da própolis com sacrifício após 7 dias. 5
D Indução da ferida e uso da própolis com sacrifício após 14 dias 5
Tratado com LED
E Indução da ferida e uso do LED com sacrifício após 7 dias. 5
F Indução da ferida e uso do LED com sacrifício após 14 dias 5
Tratado com própolis e LED
G Indução da ferida e uso da própolis e LED com sacrifício após 7
dias
5
H Indução da ferida e uso da própolis e LED com sacrifício após
14 dias
5
36
4.2. Indução da ferida:
Os animais no momento da indução da ferida foram anestesiados com
Pentobarbital 50mg/Kg i.p. e Lidocaína, anéstesico local 0,5mg/20gs.c. e após
serem dispostos em decúbito ventral foi realizada tricotomia em seu dorso com
diâmetro aproximado de 3 cm (FIGURA 10). A anti-sepsia da área foi realizada
com aplicação de éter e posteriormente álcool iodado. A indução da ferida foi
feita com auxílio de um bisturi cirúrgico, com a ferida no tamanho de 1 cm
(FIGURA 11).
FIGURA 10: Tricotomia no dorso do animal (Foto reti rada no CEB)
FIGURA 11: Ferida cirúrgica realizada com bisturi ( Foto retirada no CEB)
37
4.3- Produção do creme de própolis:
Na produção de 60g do creme foi utilizado creme base contendo
própolis na concentração de 20%. Para o preparo do creme foram pesados
todos os componentes da fase oleosa (F1) com 15.70% de cera não iônica
(cosmowax), 7.00% de óleo mineral (vaselina liquida), 0.10% de propilparabeno
(nipazol) e 0.07% de BHT, Em seguida foram aquecidos á 80°C. Como
componentes da fase aquosa (F2) nas seguintes proporções: metilparabeno
(Nipagim) (0.20%), propilenoglicol (5.00%), EDTA (0.14%) e água destilada
q.s.p., em seguida foram também aquecidos até 80°C; Posteriormente, a F2 foi
vertida sobre a F1, e em seguida submetida as fases a homogeinização lenta
até o resfriamento (aproximadamente 30°C); Foram, e ntão, adicionados a
mistura silicone volátil (2.80%) e germal a 50% (0.85%), que foram
homogeinizadas novamente e o pH corrigido até 6.0. A própolis, então, foi
incorporada ao creme base na proporção de 20% (VIEIRA et al., 2008 ).
4.4. Ledterapia:
Utilizou-se o equipamento de fototerapia, da marca Gentle Waves,
modelo LED, com os seguintes parâmetros: saída de 45w, comprimento de
onda 670nn, feixe de luz de cor vermelha, emissão contínua. O aparelho foi
aferido previamente ao inicio do trabalho pelo medidor de radiação Power
Metter.
Os animais em tratamento foram colocados em um recipiente de vidro,
de forma que os mesmos permaneceram a uma distância das lâmpadas do
LED de 8 cm. Os camundongos foram submetidos à ação da ledterapia em um
único disparo, com duração de 9 minutos. Estes permaneceram 24 horas,
antes do experimento, com água e ração ad libium, e a fototerapia teve inicio
24 horas após a indução da ferida conforme tabela 2. Nos tratamentos das
feridas utilizou-se 10 sessões realizadas diariamente (FIGURA 12).
38
Tabela 2 - Intervalo de tratamento para aplicação do LED, após a indução da ferida na região dorsal de camundongos, em diferentes períodos
Grupos Ledterapia
E,F,G,H 24h após cirurgia.
E,F,G,H 48h após cirurgia.
E,F,G,H 72h após cirurgia.
E,F,G,H 5 dias após cirurgia
E,F,G,H 7 dias após cirurgia
F,H 10 dias após cirurgia
FIGURA 12: Aplicação da ledterapia (Foto retirada no CEB)
4.5. Obtenção de material histológico:
Os 40 animais dos grupos tratados e não-tratados foram sacrificados
com sobre-dose de anestesia Pentobarbital 7 e 14 dias após a indução da
ferida.
Após a eutanásia, a cicatriz cirúrgica foi ressecada, com 0,5cm das
margens superior e inferior e 2 cm das margens laterais, distendendo o retalho
sobre papel alumínio.
39
O material foi fixado usando formol cálcio a 20%, desidratado em série
alcoólica crescente e incluído em parafina histológica. Foram feitas secções de
5µm e preparadas uma lâmina por animal com dez fragmentos por lâmina.
Estas foram coradas com Hematoxilina - Eosina, montadas sobre lamínula e
observadas em microscopia óptica para a morfometria.
4.6. Histomorfometria
A histomorfometria foi realizada no Laboratório Multifuncional do
Mestrado em Reabilitação do Centro Universitário de Caratinga, através de
imagens capturadas e avaliadas por sistema de captura de imagens. Foram
realizadas captura de trinta e sete campos aleatórios de cada lâmina
histológica com câmera digital (Samsung ES10) em microscópio Ultraphot
Zeiss, com objetiva de 40x. As imagens foram gravadas em CD e submetidas à
contagem de células no programa IMAGE PRO-PLUS avaliando os seguintes
critérios: áreas de hemorragia, hiperemia, fibra de colágeno fina/fibrina, fibra de
colágeno grossa, monócito/macrófagos, plasmócitos, neutrófilos, linfócitos,
neovascularização, células epiteliais normais, áreas de degeneração, artefatos.
4.7. Análise estatística
Para análise estatística foi utilizado o software Sigmastat Statistical
Analysis System, versão 1.0 (Jandel Scientific). Serão aplicados testes
paramétricos ou não paramétricos conforme a natureza dos dados obtidos e
considerando a significância em p<0,05.
40
5- RESULTADOS
Os resultados da morfometria estão representados nos gráficos de
número 1 até o 7, onde encontram-se registrados os percentuais de fibrócitos/
fibroblastos, macrófagos, neutrófilos, linfócitos, substancia fundamental amorfa,
fibras de colágeno, vasos sanguíneos, neovascularização e artefatos. Para a
obtenção destes dados, utilizou-se de imagens obtidas no sistema de captura
de imagens, considerando-se 37 campos/animal. Para a contagem das
estruturas realizadas em um programa de analise de imagem, contaram-se os
pontos em uma grade com 176 pontos, considerando-se como 100% o total de
6512 pontos/animal.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
controle própólis LED LED +Proposlis
controle própólis LED LED +Proposlis
7 dias 14 dias
% d
e ne
utró
filos
/651
2 po
ntos
Diferenças significativas para *Controle 7 dias e Própolis 7 dias (p= 0,0015), •Controle 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0012), ■Controle 14 dias e LED 14 dias (p= 0,00794),▲Controle 14 dias LED + Própolis 14 dias (p= 0,00794), □ Controle 7 dias e Controle 14 dias (p= 0,0004),▼LED 7 dias LED 14 dias (p= 0,00794), ▬ LED + Própolis 7 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,00794)
Gráfico 1 – Percentual médio de neutrófilos nos grupos controle e tratados com
própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40 animais)
O percentual de neutrófilos apresentou variações significativas em
algumas das comparações feitas e os resultados encontram-se registrados no
gráfico 1. Observa-se, então, que aos sete dias o grupo controle
(0,844±0,0541) apresenta menores valores para neutrófilos do que o
encontrado nos animais submetidos ao tratamento com o própolis
(1,052±0,0829) e maiores quando se compara ao grupo onde foram associados
LED e própolis (0,552± 0,1219). Aos quatorze dias, o grupo controle
□
• *
*
▼
▬ •
■ ▲ □
■ ▼ ▲ ▬
41
(0,47±0,14) apresentou valores maiores para estes tipos celulares em relação
aos tratados com LED (0,05±0,10) e LED associado à própolis (0,00±0,00). Ao
final do tratamento o percentual de neutrófilos diminui de forma significativa na
maioria das comparações feitas, ou seja, entre os dois grupos controles (sete
dias: 0,844±0,0541; quatorze dias: 0,47±0,14), nos grupos submetidos ao
tratamento exclusivo com LED (sete dias: 0,72±0,21; quatorze dias: 0,05±0,10)
e entre os animais tratados com LED e propólis aos sete (0,55±0,10) e
quatorze dias (0,00±0,00).
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
controle própólis LED LED +Proposlis
controle própólis LED LED +Proposlis
7 dias 14 dias
% d
e Li
nfóc
itos/
6512
pon
tos
Diferenças significativas para: * Controle 7 dias e Própolis 7 dias (p= 0,0001), • Controle 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0012), ■ Própolis 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001),▲ Controle 14 dias e Própolis 14 dias (p= 0,00794), □ Controle 14 dias e LED 14 dias (p= 0,0317),▼Controle 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,00794), ▬ Própolis 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,00794), + Controle 7 dias e Controle 14 dias (p= 0,0001), ○ LED + Própolis 7 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0,0001).
Gráfico 2 – Percentual médio de linfócitos nos grupos controle e tratados com
própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40 animais)
Na análise do percentual de linfócitos descrito no gráfico 2, registrou-se
aumento significativo destas células nos grupos tratados e sacrificados com
sete dias, com própolis (5,87±0,33) e LED associado a própolis (1,95±0,29),
quando comparados ao controle (1,24±0,12). No entanto, o percentual de
linfócitos no final de sete dias foi estatisticamente menor naqueles animais
submetidos a terapia com LED e própolis (1,95±0,29) em comparação com os
percentuais obtidos no grupo tratado apenas com própolis (5,87±0,33).
+ * •
* ■
○ ■ •
+ □ ▼ ▲
▬ ▲ □
○ ▼▬
42
Ainda segundo o registrado no gráfico 2, as formas de tratamento
utilizadas no estudo, própolis (4,24±1,15), LED (2,79±1,83), e LED com
própolis (0,78±0,09) determinaram aumento do percentual de linfócitos aos
quatorze dias em comparação ao controle (0,57±0,06) aos quatorzes dias.
Nenhuma diferença significativa foi observada na maioria das comparações
feitas entre os tipos de tratamento, somente entre própolis (4,24±1,15) e o
grupo tratado com LED e própolis (0,78±0,09) ao quatorze dias mostrou
diferenças significativas, com diminuição dos linfócitos naqueles indivíduos que
receberão o tratamento associado.
Com relação à cinética dos linfócitos durante a inflamação induzida,
observou-se uma diminuição significante nos percentuais ao se comparar o
grupo controle com quatorze dias (0,56±0,05) e o controle aos sete dias
(1,24±0,12). Resultado semelhante pode ser observado em relação aos grupos
tratados com LED e própolis, ocorrendo diminuição aos 14 dias (0,78±0,09) em
comparação aos 7 dias (1,95±0,30) (gráfico 2).
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
cont
role
próp
ólis
LED
LED
+
Pro
posl
is
cont
role
próp
ólis
LED
LED
+
Pro
posl
is
7 dias 14 dias
% d
e m
acró
fago
s/65
12 p
onto
s
Diferenças significativas para: * Controle 14 dias e Própolis 14 dias (p= 0,0007), • Própolis 14 dias e LED+Própolis 14 dias (p=0.00794), ■ Controle 7 dias e Controle 14 dias (p=0,0030), ▲Própolis 7 dias e Própolis 14 dias (p= 0,0303), □ LED + Própolis 7 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,0036)
Gráfico 3 – Percentual médio de macrófagos nos grupos controle e tratados
com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40
animais)
■ ▲
□
* ■
▲ • *
• □
43
No gráfico 3 encontram-se registrados os dados relativos a contagem de
macrófagos nos diferentes grupos aos sete e quatorze dias. A análise deste
dado permite observar que aos sete dias não ocorreram variações significativas
nos percentuais deste fagócito entre os grupos. No entanto, aos quatorze dias
houve aumento significativo neste tipo celular, nos animais tratados com
própolis (6,97±0,98) quando comparados ao controle (4,28±0,51) do mesmo
período. Identifica-se também aos quatorze dias redução significativa do
percentual de macrófagos nos animais submetidos ao tratamento associado de
LED e própolis (3,68±0,29) quando se compara aos valores observados nos
tratados apenas com própolis (6,97±0,99).
Além disso, os percentuais de macrófagos variaram significativamente
na comparação entre os controles de 7 dias (5,33±0,21) e 14 dias (4,28±0,51),
apresentado declínio ao final do tratamento (gráfico 3).
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
cont
role
próp
ólis
LED
LED
+
Pro
posl
is
cont
role
próp
ólis
LED
LED
+
Pro
posl
is
7 dias 14 dias
% F
ibró
cito
s/fib
robl
asto
/651
2 po
ntos
Diferenças significativas para: *Controle 7 dias e LED 7 dias (P= 0,0279); ○ Controle 7 dias e LED + própolis 7 dias (P= 0,0037); ● Controle 14 dias e própolis 14 dias (P= 0,0011), ■ Controle 14 dias e LED 14 dias (P= 0,0067), ▲ Controle 14 dias e LED + própolis 14 dias (P= 0,002), □ Controle 7 dias e Controle 14 dias (P= 0,0167) Gráfico 4 – Percentual médio de fibroblastos/fibrócitos nos grupos controle e
tratados com própolis, LED, LED+própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40
animais).
Ao considerarmos o percentual de fibrócitos/fibroblastos (gráfico 4),
observam-se diferenças significativas somente entre os controles e os grupos
tratados. Aos sete dias de tratamento, o grupo tratado com LED (8,68±1,52) e
* ○ □
□ • ■ ▲
○ * •
■
▲
44
LED associado à própolis (8,86±1,07) apresentou percentuais
significativamente maiores de fibrócito/fibroblasto quando comparado ao
controle (6,78±0,40) neste mesmo período. Aos quatorze dias, os grupos
tratados com LED (LED: 10,62±2,91; LED+própolis: 9,21±0,96) também
apresentaram aumento significativo no percentual destes tipos celulares
quando comparados ao controle (5,79±0,61).
Na avaliação da cinética de fibrócito/fibroblasto considerando seus
percentuais aos sete e quatorze dias do tratamento, não se obteve diferenças
significativas entre os grupos tratados. Somente obtiveram-se diferenças
significativas na comparação dos controles, observando-se valores
significativamente menores naquele grupo de 14 dias (5,79±0,61) quando
comparado ao de sete dias (6,79±0,40).
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
controle própólis LED LED +Proposlis
controle própólis LED LED +Proposlis
7 dias 14 dias
% d
e F
ibra
s de
col
ágen
o/65
12 p
onto
s
Diferenças significativas para:* Controle 7 dias e Própolis 7 dias (p= 0,0001), •Controle 7 dias e LED 7 dias (p= 0,0001), ■Controle 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001), ▲ Própolis 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001), □ Própolis 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,0001),▼LED 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,0317), ▬ Controle 7 dias e Controle 14 dias (p=0.0038), + LED + Própolis 7 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0.0001). Gráfico 5 – Percentual médio de fibras de colágeno nos grupos controle e tratados com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40 animais)
No gráfico 5 observou-se que os tratamentos propostos apresentaram
maiores percentuais de fibras de colágeno quando comparados ao grupo
controle (43.5±2.04) aos sete dias de experimento. Os animais do grupo LED
associado à própolis (62.2±0.702) apresentou os maiores percentuais aos sete
dias na comparação com o controle do que os valores encontrados nos
tratados com própolis (55.4±1.26) e com LED (59.3±4.83). Aos sete dias,
■ • ▬ *
▲ * • ■ ▲ +
▬ □
▼ ▼ □ +
45
somente houve diferença significativa nos animais submetidos ao tratamento
de LED+própolis (62.2±0.70) quando comparados ao tratamento exclusivo com
própolis (55.4±1.26), com os primeiros apresentando percentuais mais
elevados de fibras de colágeno.
Aos 14 dias de experimento, não foram observadas diferenças
significativas entre o controle e os diferentes grupos de tratamento ao
considerar-se o percentual de fibras de colágeno (gráfico 5). No entanto, o
grupo tratado com própolis (59.2±3.49), ao final do experimento, apresentou
valores significativamente menores para essas estruturas teciduais quando
comparado aquele que foi submetido a LED associado à própolis (72.5± 0.92).
A associação de LED + própolis (72.7±71.8) induziu também maior percentual
para essas estruturas teciduais do tecido conjuntivo quando comparado aos
valores indicados nos animais tratados apenas com LED (61.9±59.2) ao final
do experimento.
Ainda, segundo o gráfico 5, ao se comparar os percentuais de fibras de
colágeno em grupos submetidos aos mesmos tratamentos, mas em intervalos
de tempo diferentes, observou-se que os controles de sete dias apresentam
maiores valores para essas fibras quando comparado ao controle com quatorze
dias. Houve também diferença significativa entre os grupos submetidos ao
tratamento associado ao LED e própolis nos diferentes períodos de tempo, com
aqueles com 14 dias de tratamento apresentando valores maiores do que o
que se observou aos sete dias.
46
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
controle própólis LED LED + Proposlis controle própólis LED LED + Proposlis
7 dias 14 dias
% d
e ne
ova
scul
ariz
ação
/651
2 po
nto
s
Diferenças significativas para: * Controle 7 dias e Própolis 7 dias (p= 0,0001), • Controle 7 dias e LED 7 dias (p= 0,0001), ■ Controle 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001), ▲ Própolis 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001), □ LED 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001),▼Controle 14 dias e LED 14 dias (p= 0,0236), ▬ Controle 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0.0001), + Própolis 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0.0001), ►LED 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0.0004),◄ Controle 7 dias e Controle 14 dias (p=0.0061), ◊ Própolis 7 dias e Própolis 14 dias (p=0.0053), ⌂ LED 7 dias e LED 14 dias (p=0.0171), ○LED + Própolis 7 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,0002)
Gráfico 6 – Percentual médio de neovascularização nos grupos controle e tratados com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40 animais) Ao se analisar a formação de novos vasos sanguíneos no processo
inflamatório induzido, obteve-se resultados significativamente diferentes entre
os grupos usados e nos períodos considerados. Estes resultados estão
registrados no gráfico 6 e apontam para maior percentual de vasos sanguíneos
neoformados, aos sete dias, nos grupos submetidos aos diferentes tratamentos
propostos, como própolis (1.08±0.07), LED (1.15±0.14) e LED associado ao
própolis (2.05±0.20) em relação ao controle (0.11±0.05).
A comparação entre os grupos tratados aos sete dias indicou maior
neovascularização no grupo submetido a associação de LED e própolis
(2.05±0.20) em relação aqueles animais que receberam tratamento exclusivo
com própolis (1.08±0.07) ou somente LED (1.15±0.14) (gráfico 7).
Em relação aos resultados para neovascularização aos 14 dias
demonstradas no gráfico 6, apontam para diferenças significativas entre o
controle (0.968±0.518) e o grupo tratado só com LED (1.91±0.55) e com LED e
própolis (4.28±0.74), com percentuais maiores nos grupos tratados. Em relação
aos tipos de tratamentos, observou-se que o grupo submetido a associação de
* ■ ◄ •
◊ ▲ * • □ ⌂
○ □ ▲ ■
◄ ▼ ▬ ◊ +
⌂▼►
○ ▬ + ►
47
LED e própolis (4.28±0.74) apresentou maior formação de novos vasos do que
o visto nos animais que receberam própolis e LED (1.91±0.55) isoladamente.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
controle própólis LED LED +Proposlis
controle própólis LED LED +Proposlis
7 dias 14 dias
% d
e S
ubst
anci
a F
und
amen
tal A
mo
rfa/
6512
pon
tos
Diferenças significativas para: * Controle 7 dias e Própolis 7 dias (p= 0,0001), • Controle 7 dias e LED 7 dias (p= 0,0001), ■ Controle 7 dias e LED + Própolis 7 dias (p= 0,0001), ▲Controle 14 dias e Própolis 14 dias (p= 0,0018), □ Controle 14 dias e LED 14 dias (p= 0,0006), ▼Controle 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,0001), ▬ Própolis 14 dias e LED 14 dias (p=0.0363), + Própolis 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0.0001), ►LED 14 dias e LED + Própolis 14 dias (p=0.0004),◄Controle 7 dias e Controle 14 dias (p=0.0109), ◊ Própolis 7 dias e Própolis 14 dias (p=0.0496), ⌂ LED 7 dias e LED 14 dias (p=0.0037)○ LED + Própolis 7 dias e LED + Própolis 14 dias (p= 0,0004) Gráfico 7 – Percentual médio de substância fundamental amorfa nos grupos controle e tratados com própolis, LED, LED + Própolis aos 7 e 14 dias de tratamento (n= 40 animais) Em relação ao percentual de SFA no material analisado, observou-se
que aos sete dias, os animais controle (39.8±2.38) apresentam valores maiores
deste componente tecidual do que todos os outros grupos submetidos aos
tratamentos sejam exclusivamente com própolis (20.2±2.68) ou LED
(21.7±3.55), ou naquele onde se associou LED à própolis (15.8±3.97) (gráfico
7).
O gráfico 7 registra ainda que esta diminuição do percentual de SFA nos
grupos tratados (própolis: 17.1±1.44; LED: 13.4±2.95; LED+Própolis:
4.95±1.48) quando comparados ao controle (30.1±6.16) também foi observado
aos 14 dias. Além disso, observaram-se também diferenças relativas ao tipo de
tratamento e o percentual de SFA. Desta forma, o grupo dos animais tratados
com própolis (17.1±1.44) apresentou maiores percentuais de SFA quando
comparados com aqueles tratados com LED (13.4±2.95) e no grupo onde se
associou LED e própolis (4.95±1.48). O tratamento com LED (13.4±2.95)
apresentou valores significativamente maiores do que o percentual de SFA
encontrado no grupo onde se aplicou LED e própolis (4.95±1.48).
◄ ■ • *
◊ * • ⌂ ○ ■
▲ ▼ ◄ □
▲ ◊ ▬ + ⌂ □ ► ▬
▼ ► ○ +
48
Na comparação do percentual de SFA (gráfico 7) observou-se
diminuição nestes valores do sétimo ao décimo quarto dia. Tal fato foi
identificado na comparação entre os controles com sete (39.8±2.38) e quatorze
dias (30.1±6.16), nos tratados com própolis nestes mesmos períodos (7 dias:
20.2±2.68; 14 dias: 17.1±1.44) e nos grupos de sete dias e quatorze dias
submetidos ao LED (7 dias: 21.7±3.55; 14 dias: 13.4±2.95) e ao LED e
própolis (7 dias: 15.8±3.97; 14 dias: 4.95±1.48).
49
6- DISCUSSÃO
Os tratamentos com LED e própolis aplicados isoladamente ou de forma
associada em ferida de primeira intenção, sugere ação significativamente
diferentes entre eles. Estas diferenças são relativas a cinética do infiltrado de
células que participam da resposta inflamatória, assim como nos eventos
relacionados ao reparo cicatricial aos sete e quatorze dias após induzida a
lesão.
A ação biomoduladora do LED foi descrita por outros autores como
Whelan, et al., (2001) e Al Watban & Andres (2003) que afirmam que este tipo
de fototerapia tem efeitos benéficos e semelhantes ao laser principalmente no
reparo tecidual e que o comprimento de onda mais indicado para promover
este efeito é o de 670nm. Em nosso modelo experimental também foi
empregado LED com este comprimento de onda, garantindo assim a ação
benéfica da fototerapia no tratamento de feridas.
A resposta inflamatória é caracterizada pelo envolvimento de vasos
sanguíneos, células do sangue e elementos teciduais. A cinética deste
infiltrado caracteriza a inflamação aguda e crônica, com a presença marcante
de neutrófilos nas primeiras 48 horas seguida de decréscimo em seus valores
até que se tornam raras, o que é registrado em torno dos 6 dias de inflamação.
Macrófagos apresentam pico entre dois e quatro dias tendendo também a
diminuição a medida que a inflamação se prolonga. Fibroblastos apresentam
valores maiores em torno do sexto dia e tendem a diminuir a partir deste ponto.
Linfócitos ocorrem mais tardiamente, entre 6 e 7 dias com queda a medida que
a inflamação evolui para o reparo (SILVA et al., 2007; MONTENEGRO &
FRANCO, 2004)
Nossos resultados são coerentes com esses dados, ao se considerar a
cinética das células como neutrófilos, macrófagos, linfócitos e
fibrócitos/fibroblastos na comparação feita entre os controles com 7 e 14 dias,
com a diminuição do infiltrado ao final do experimento.
Outros trabalhos desenvolvidos com LED de diferentes comprimentos de
onda defendem sua possível influência na resposta inflamatória. Desta
50
maneira, segundo Fiório (2008) o uso do LED de 630 ± 20 nm em modelo
experimental de queimadura, utilizando ratos wistar, concluiu que a fototerapia
apresenta ação biomoduladora ocasionando a diminuição do infiltrado celular
aos 8 e 16 dias após a indução da lesão, na comparação feita com o grupo
controle.
Em outro trabalho, que utilizou ratos como modelo e que também induziu
ferida cutânea no dorso dos animais, afirmou-se a ação anti-inflamatoria do
LED, principalmente do LED vermelho de 700 nm aos oito dias após lesão
(Sousa, 2008).
Conforme Whelan et al., (2001) os efeitos biomoduladores da luz no
processo inflamatório caracterizam-se por inicialmente determinar um aumento
das células inflamatórias no local da lesão, para remover rapidamente o
excesso de detritos celulares e posteriormente induz a redução do número de
células inflamatórias e dinamização da sua funcionalidade na produção de
fatores de crescimento. Tal achado parece ser incoerente com nossos
resultados, uma vez que, tanto aos sete quanto aos quatorze dias após
indução da lesão, os animais tratados com LED apresentaram menor número
de todas as células presentes no infiltrado celular que caracteriza a inflamação
aguda ou crônica. Esta diferença pode se relacionar ao tempo em que foi
realizada a morfometria do material histológico no presente trabalho. Como se
observou os tecidos lesados aos sete e quatorze dias, a inflamação nestes
períodos seria caracterizada como crônica e com o pico de células da fase
aguda acontecendo em dias anteriores aos períodos considerados, impedindo
que se observasse seu efeito pro-inflamatório nesta fase.
Em outros tipos de fototerapia, como a laserterapia, há relatos da ação
biomoduladora destes tratamentos. Conforme Vinck et al (2003), segundo
estudos feitos na NASA, o LED tem efeito na fotoestimulação celular
semelhante ao encontrado com laser de baixa potencia. Desta maneira,
Silveira (2008) em um estudo aplicou laser de baixa intensidade sobre três
regiões de tecidos gengivais sem lesão anterior e observou que estas
apresentaram após tratamento menor número de neutrófilos em comparação
ao grupo controle, principalmente quando a irradiação foi feita utilizando laser
51
infravermelho e vermelho. Nestes mesmos pacientes submetidos a laserterapia
de baixa intensidade, no entanto, a contagem de macrófagos no fluido gengival
era maior do que nos controles.
Rocha et al., (2007), em trabalho de indução de inflamação
granulomatosa em camundongos, separados em grupos controle e tratados
com laserterapia, observou que há maior número de linfócitos e plasmócitos
em relação aos neutrófilos tanto no grupo tratado como no grupo controle,
durante 21 dias de experimento. No entanto, a cinética destas células sofreu
mudanças significativas em relação ao tempo e ao tipo de tratamento. Assim,
no sétimo dia, os animais tratados apresentaram número significativamente
maior destes tipos celulares. Esta diferença continuou significativa na 14ª
semana, no entanto, nos controles ocorre diminuição do número destas
células, enquanto que, entre os camundongos sujeitos a laserterapia,
plasmócitos e linfócitos encontram-se aumentados em número, alcançando os
valores máximos, e os neutrófilos não foram mais observados. No 21º dia,
ocorreu diminuição de plasmócitos e linfócitos entre os tratados, já nos
controles estes tipos celulares apresentaram mais elevados do que aos 14
dias.
Nossos dados também apontam para a ação biomoduladora negativa do
LED sobre a contagem de neutrófilos em relação ao controle aos 14 dias após
indução da lesão, o que é semelhante aos achados de Rocha et al., (2007)
descritos anteriormente. Em relação a contagem de linfócitos, o aumento
observado aos 14 dias em nossos resultados é também coerente com o
encontrado por Rocha et al., (2007), em seu modelo experimental.
Na avaliação do processo de reparo tecidual induzido pelo LED neste
estudo, identificou-se seu papel estimulador na atividade de
fibrócitos/fibroblastos e produção de colágeno. O mesmo resultado foi
encontrado por Faria (2006) em seu estudo que investigou os efeitos da luz
coerente e não coerente no processo de reparação tendínea de ratos, e
constatou que os grupos tratados com LED apresentaram remodelação
tecidual, maturação (fibroblastos) e tipo de fibras colágenas depositadas no
processo de reparação tendínea superiores aos demais grupos tratados com
luz, principalmente durante a primeira semana do processo inflamatório.
52
Alteração no número de fibrócitos/;fibroblastos e na quantidade de
colágeno induzida pelo tratamento com laser, foi também observada por
Rocha et al., (2007). Esses autores quantificaram o material fibroso no grupo
tratado com laser e grupo controle (fibrina/colágeno), e observaram diferenças
significativas, com menor incidência deste parâmetro na primeira semana
entre aqueles que receberam tratamento, este comportamento, no entanto,
sofre mudança aos 14 e 21 dias, quando a ocorrência de colágeno/fibrina
torna-se significativamente maior com a aplicação do laser.
A ação positiva do LED na contagem de fibrócitos indicada em nossos
resultados também é coerente com Vinck et al., (2003) que sugerem esta
mesma ação para o LED (660nm) com potencias de 80mW e terapia laser de
baixa potencia (670nm) com 40 mW em cultura de fibroblastos.
Muitos trabalhos descrevem como principais efeitos das fototerapias
aqueles que envolvem o processo cicatricial (CORAZZA, 2005), o combate ao
edema e a dor (RUARO, 2006) outra ação biomoduladora positiva também é
descrita sobre a microcirculação e a formação de novos vasos (PEREIRA,
2005). Nossos resultados indicaram também o efeito positivo dos tratamentos
usados sobre a neovascularização, tanto aos sete quanto aos quatorze dias.
Desta maneira, a própolis e o LED quando aplicados isolados ou de
forma associada apresentam ação estimuladora na formação de vasos
sanguíneos aos sete dias e com efeito sinérgico confirmado ao final dos
quatorze dias, quando os animais submetidos ao tratamento associado, LED e
própolis, apresentaram maiores valores para este parâmetro do que os outros
grupos também tratados.
Coerente com a ação estimuladora na neovascularização encontrada
nos nossos resultados, Corazza et al.,(2005) também destaca que é possível
influenciar o processo de angiogênese com fontes de luz LED e laser de baixa
intensidade empregando baixas doses de energia, em que a terapia luminosa
não depende da coerência, mas sim da absorção da luz em uma determinada
banda espectral.
53
Em outro estudo utilizando modelo animal (Rocha Júnior et al., 2006)
estudaram o comportamento de feridas cutâneas provocadas no dorso de
ratos, irradiados com laser de 870 nm e dose de 3,8 J/cm², e observaram um
aumento da neovascularização e da proliferação fibroblástica, e diminuição da
quantidade de infiltrado inflamatório, sendo eficaz no processo de modulação
da resposta tecidual, contribuindo para a cicatrização tecidual mais rápida e
organizada.
Os efeitos angiogênicos do laser e do LED em feridas cutâneas de ratos
foi também pesquisado por Corazza et al., (2005) constatou uma proliferação
de vasos sanguíneos superior nos grupos irradiados em comparação com o
não irradiado. De acordo com os autores esta fotobiomodulação vascular pode
estar associada com a redução das células inflamatórias e com a estimulação
dos fatores de crescimento através dos macrófagos, linfócitos T, células
endoteliais, fibroblastos e queratinócitos durante a fase inicial de reparação
tecidual.
Nossos resultados registram também a ação inflamatória da própolis,
principalmente em sua ação sobre a elevação do número de linfócitos e
macrófagos seja aos sete ou aos 14 dias.
Tal achado é incoerente com o que defende Khayyal et al. (1993), ao
estudar o mecanismo implicado no efeito antinflamatório de extratos aquosos
de Própolis a 13% em diferentes doses de administração por via oral em ratos
com edema e artrites induzida, e o compararam com um antinflamatório de uso
convencional, para demonstrar um efeito antinflamatório significativo para a
Própolis e uma correlação de sua atividade antinflamatória e a liberação de
vários mediadores, de inflamação. Esta diferença pode estar centrada na forma
de administração utilizado por este autor, possivelmente a via oral age em
mecanismos bioquímicos diferentes, inibindo a cascata do acido araquidônico
garantindo este efeito antiinflamatório (SILVA et al., 2002), o que não foi
observado no uso tópico proposto em nosso modelo experimental.
54
Baracho et al., (2009), testaram o extrato de própolis a 30 % em
cicatrização de feridas em ratos wistar com diabetes tipo I, e observaram após
21 dias de tratamento que na avaliação macroscópica os animais submetidos
ao tratamento com extrato de própolis a 30% apresentaram a cicatriz mais
superficial, mostrando seu efeito benéfico no processo de reparo tecidual.
Embora não ter sido avaliada a cinética da inflamação aos vinte e um dias em
nosso modelo experimental, nossos resultados são coerentes com o observado
pelo autor citado.
Rahal, et al., (2003), realizou um experimento induzindo uma ferida
cirúrgica em 60 ratos wistar, e os dividiu em 3 grupos, sendo um tratado com
pomada de própolis, outro com mel e um grupo controle. A análise da ferida foi
feita em 4 momentos, 3 dias, 7 dias, 14 dias e 21 dias. Os animais tratados
com própolis ao terceiro dia apresentaram infiltrado inflamatório
polimorfonuclear e fibrina na região mais superficial da ferida. A derme
apresentava-se com edema intersticial e infiltrado inflamatório misto. Ao sétimo
dia, as bordas das lesões estavam mais espessas e na região superficial,
verificou-se proliferação de capilares neoformados, discreto infiltrado de células
mononucleares e infiltração de fibroblastos. Na região mais profunda, notou-se
diminuição do número de células inflamatórias e presença de feixes de fibras
colágenas. No 14º dia, a ferida apresentava-se totalmente reepitelizada, com
acentuada redução do número de capilares. A proliferação fibroblástica foi
marcante, bem como a presença de feixes de fibras colágenas dispostas
paralelamente à superfície. Com 21 dias de tratamento, a regeneração do
epitélio foi completa, com a derme apresentando grande quantidade de
fibroblastos e fibras colágenas. Neste estudo foi possível concluir que, embora
as medidas das áreas não tenham diferido estatisticamente entre os grupos
nos diferentes tratamentos, os tratados com mel e própolis revelaram à
histologia a indução de uma melhor cicatrização pela redução da resposta
inflamatória, havendo reepitelização mais rápida com a própolis.
Os resultados descritos acima são semelhantes ao observado em nosso
experimento, no entanto, a ausência de um grupo analisado aos três dias, em
nosso modelo, nos impede de avaliar se aos sete dias o infiltrado sofreu
aumento ou diminuição em relação as fases iniciais da inflamação. O numero
55
maior de linfócitos observados nos grupos tratados com própolis em relação ao
observado nos outros grupos, pode estar ligada a sua ação ativadora sobre o
Timo, auxiliando o sistema imune na promoção da atividade fagocítica e
estimulando a imunidade celular, conforme o descrito por Kosalec et al. (2005).
O aumento do numero de macrófagos aos 14 dias no grupo tratado com
própolis pode estar também relacionado a ação deste sobre o timo e no papel
que os LT CD4 do tipo Th 1 tem na resposta inflamatória, liberando citocinas
ativadoras de macrófagos e, em especial, o fator estimulador de colônias de
monócitos e granulócitos (GM-CSF) que induz também a proliferação e
diferenciação de macrófagos (CARVALHO & COLLARES-BUZATO, 2005).
Nossos achados apontam para ações diferenciadas dos tratamentos
utilizados em nosso experimento, sobre os vários eventos que ocorrem na
resposta inflamatória. Assim, percebe-se que o LED tem ação estimuladora
mais evidente sobre os fenômenos que envolvem os elementos do tecido
conjuntivo e neovascularização, entretanto, age como antiinflamatório ao
reduzir a presença de células que participam da inflamação. Já, a própolis atua
como agente inflamatório, quando aplicado topicamente e na dependência de
sua composição química, principalmente relativa a concentração de flavonóides
e sua ação antioxidante. Esta ação proinflamatória da própolis observada só
poderia ser completamente compreendida se informações como a origem e
concentração dos ativos existentes no creme de própolis por nós utilizado,
fosse conhecido. Desta maneira, torna-se difícil compreender e discutir os
mecanismos que realmente determinaram o efeito observado.
No uso concomitante de LED e própolis foi possível observar mudanças
na ação deste tratamento sobre os eventos analisados quando comparados ao
controle e aos outros grupos tratados.
A ação conjunta de LED e própolis sobre células imunitárias apontam
para possível alteração na conformação molecular da própolis pela ação da luz,
que poderia alterar seu sitio de ligação promovendo sua inativação, ou
exarcebar a sua atuação e até mesmo promover uma ação tóxica. A ação
56
proinflamatoria registrada no uso exclusivo da própolis, foi modificada na
presença da luz emitida pelo LED, caracterizando-se como antiinflamatória.
Quando observada a ação da luz sobre a atividade da própolis na
função reparadora do tecido lesado, mais uma vez houve mudança quando
comparado aos tratamentos isolados de LED e própolis. Na presença de luz a
própolis age com menor intensidade sobre o aumento do numero de
fibrócitos/fibroblastos, diminui a produção de SFA e aumenta em quantidades
maiores do que o observado nos outros grupos a quantidade de colágeno e
neovascularização.
A escassez de artigos que tenham como objetivo comparar a ação de
própolis e LED nos impede de discutirmos nossos resultados com outros
autores.
57
7- CONCLUSÃO
O reparo de lesões cutâneas de primeira intenção com LED e/ ou
própolis ocorre de forma mais rápida do que nos animais que não foram
submetidos a nenhum tratamento. O LED isoladamente tem atividade
biomoduladora positiva sobre o número de fibrócitos e fibroblastos e na
neovascularização, no entanto, age como antiinflamatório sobre o infiltrado de
células do sistema imune. O tratamento isolado com própolis, na forma tópica e
com composição química definida, parece agir como proinflamatorio e não
apresenta efeito estimulador na proliferação de fibrócitos/fibroblastos,
determinando porem aumento de colágeno e neovascularização enquanto inibe
o aumento de SFA. O uso concomitante de própolis e LED promoveu mudança
conformacional nas moléculas presentes nessa substancia, o que resulta em
mudanças nos ativos que atuam no creme de própolis, que passa então a atuar
como agente antiinflamatório, além de exacerbar a ação do LED na produção
de colágeno e na neovascularização.
58
8- CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho apresenta limitações devido a ausência na informação
relativa ao laudo técnico composicional da própolis utilizado na produção do
creme. Além disso, o uso tópico pode não ser tão eficiente na ação
antiinflamatória quanto o que se tem no seu uso oral.
O fato da própolis ser uma substancia fotossensível seria necessário
conhecer com maior exatidão a dose utilizada na aplicação do LED, assim
como o tempo gasto e distancia da lâmpada a área irradiada. Em relação aos
tempos considerados neste experimento, seria recomendável avaliar os
eventos ocorridos em momentos mais iniciais a instalação da lesão, como 3, 7,
14, e 21 dias após lesão..
59
9 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Ciência Rural 34: 159-163.
• Vieira AP, Santos NR, Borges JHS, Vincenzi MPA, Schimitz WO 2008.
Ação dos flavonoides na cicatrização por segunda intenção em feridas
limpas induzidas cirurgicamente em ratos wistar. Semina: Ciências
Biológicas e da Saúde , Londrina 29: 65-74
• Vinck EM, Cagnie BJ, Cornelissen MJ, Declercq HA, Cambier DC 2003.
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power laser irradiation. Laser Med Sci , 18: 95-99.
• Volpi N, Bergonzini G 2006.Analysis of flavonoids from propolis by on-
line HPLC-electrspray mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal 42:
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• Whelan HT, Jr. Smits RL, Buchman EV, Whelan NT, Turner SG,
Margolis DA, Cevenini V, Stinson H, Ignatius R, Martin T, Cwiklinski J,
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• Whelan HT, Buchmann EV, Dhokalia A, Kane MP, Whelan NT, Wong-
Riley MTT, Eells JT, Gould LJ, Hammamieh R, Das R, Jett M 2003.
Effect of NASA Light-Emitting Diode Irradiation on Molecular Changes for
Wound Healing in Diabetic Mice. Journal of Clinical Laser Medicine &
Surgery. v. 21, n. 2, 67-74.
68
7. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES
Cronograma
2010 JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ
Levantament
o
bibliográfico
x x x x
Procediment
o de
pesquisa
x x x x
Procediment
o de análise x x
Conclusão
da pesquisa x
Revisão,
digitação e
entrega do
trabalho
X
69
8.0 - ORÇAMENTO E RECURSOS FINANCEIROS
Materiais Quant. Valor unit (R$)
Valor total (R$)
Álcool Etílico Absoluto pa 99,5% min 5L 5,50 27,50
Artigo Científico 50 30,00 1500
Cartucho impressora HP 3535 Preto 1 80,00 80,00
Cartucho impressora HP 3535 colorido 1 100,00 100,00
Corante Hematoxilina Harris 1L 58,00 58,00
Corante Eosina 1L 15,00 15,00
Encadernação 08 3 24,00
Fixador Bouin 1L 51,00 51,00
Fixador para citologia gotas 100ml 2,50 2,50
Lamina de vidro com extremidade fosca 26 x 7 50 0,08 4,00
Lamínula de vidro para laboratório 22 x 22 50 3,50 175,00
Luva descartável plástica não estéril 100 0,10 10,00
70
Papel A4 1000 0,05 50,00
Parafina Histológica em barra 56-58ºC (similar Paraplast)
1K 5,00 10,00
Xérox 2000 0,12 240,00
Xilol PA 1L 6,00 6,00
Total 2353