UERGS, Bento Gonçalves, RSDisciplina: Genética de micro organismos

Dra. Adriana Dantas

Plasmídio são elementos extra cromossômicos Capacidade de existir em estado autônomo como também integrados ao cromossomo

(epissomo); Todos os epissomos são plasmídios;

Mapa circular da virulência do plasmídeo de Mapa circular da virulência do plasmídeo de ShigellaShigella•Anel externo representa ORFs ("open reading frame", que poderia ser traduzido como sequência de leitura aberta, que corresponde á porção do genoma que contém a sequência de bases que pode potencialmente codificar uma proteína.

•O início e o final de uma ORF não são equivalentes às terminações do mRNA, mas eles normalmente estão contidos no mRNA. Em um gene, ORFs se localizam entre o códon de iniciação e o códon de terminação.•Suas orientações de cores, codificam segundo a categoria funcional:

•1. idênticos ou essencialmente idêntica à virulência conhecidos proteínas associadas (vermelho); •2, homólogos aos conhecidos patogênese proteínas associadas (rosa),•3. É altamente homólogo de elementos ou transposases (azul), •4. fracamente homóloga a IS elementos ou transposases (azul claro),• 5. homóloga com proteínas envolvidas na replicação, manutenção, ou funções do plasmídeo de ADN de outros metabólicas (amarelo), •6. nenhuma semelhança significativa com qualquer proteína ou ORF no banco de dados (castanho)•, 7. homóloga ou idêntica à ORFs conservadas hipotéticas, isto é, proteínas de função desconhecida (laranja), e •8. Tn501 inserção genes associados (verde).

•O segundo anel mostra completa está elementos.

•O terceiro anel de teor G+ C gráficos, calculados para cada ORF e traçada em torno do valor médio de todos os ORFs, com cada valor de cor codificadas para a ORF correspondente. A escala é, em pares de bases.• O locus de invasão virulência do plasmídeo a Shigella é uma ilha de patogenicidade, que consiste de 38 ORFs do operons ipa-MXI-spa dentro uma extensão de 32 kb do plasmídeo.

Os plasmídios não são essenciais. Podem estar presentes ou ausentes na célula e sua ausência não implica na inviabilidade da célula. Podem existir células com perda de fragmentos cromossômico ,

somente a perda de genes essenciais é letal. Podem existir no estado autônomo, podem ocorrer

independentemente do cromossomo bacteriano; Podem se duplicar independentemente do cromossomo

bacteriano, o que significa que uma divisão do cromossomo podem corresponder a varias divisões dos plasmídios;

No estado integrado a duplicação depende do cromossomo bacteriano;

Os estado integrado e autônomo são reversíveis, isto é, o epissomo ligado ao cromossomo pode se desligar dele e vice-versa; Na volta do estado integrado ao autônomo, o epissomo pode

levar alguns genes bacteriano consigo;

Uma vez ausentes, os plasmídios só podem ser recuperados por infecção, o que vale dizer que tais elementos não podem ser formados “de novo”. O plasmídio tem de provir de outro já existente;

Certas drogas podem interferir nos plasmídios, como é o caso das acridinas, que eliminam plasmidios das células, denominada de cura (curing);

São constituídos por DNA circular e superespiralizado (supercoiled DNA), muitos centenas de vezes menor que o cromossomo bacteriano, Variados de 0,2% a 4% do cromossomo; grandes (100 a

200 genes), como o R,F, colIV e colI, ou pequenos (15 genes) os plasmídios bacteriocinogênicos.

Em Escherichia coli e em outras bactérias bem estudadas geneticamente, fica fácil detectar um plasmídio,uma vez que nessas bactérias são conhecidos numerosos marcos genéticos cromossômicos;

Plasmídios essenciais são conhecidos por plasmídios F´ que podem carregar genes cromossômicos essenciais, nesse caso se esse plasmídio for perdido a célula morre;

Indicações: Presença de plasmídio é a ocorrência de certas características

determinadas por fatores não ligados a genes do cromossomo; Propriedade de promover conjugação, sua densidade em

gradiente de centrifugação é diferente do DNA principal; Demonstração de duplicação autônoma a do cromossomo

bacteriano Eletroforese separa-se fragmentos (banda) do DNA plasmidial

do DNA cromossomal.

(A) Estratégia para detectar a localização de cpe.

(B) Os produtos de PCR para determinação de cpe cromossômica e plasmídio.

Colunas : 1-4 – estirpe cromossômica cpe NCTC

8239; 5-8 - um plasmídio estirpe cpe T102 M - marcador, 1 e 5 - PCR com um primer cpe definido

ETP-KF e ETP-K-R1; 2 e 6 - os produtos de PCR do fragmento

entre uapC cromossômica e CPE com um conjunto de iniciadores e uapC ETP -K-R1

3 e 7 - os produtos de PCR do fragmento cromossômico entre cpe e NADC com um conjunto de iniciadores ETP-KF e NADC;

4 e 8 - os produtos de PCR do fragmento entre DCM e cpe plasmídeo com um conjunto de iniciadores dcm e ETP-K-R2.

Plasmídio Plasmídio FF de de Escherichia coliEscherichia coliCélulas F+ de bactérias possuem uma partícula no estado

autônomo capaz de promover conjugação;Célula F+ poder doar a partícula a muitas outras células

F- evidencia que a duplicação da partícula tem de ser mas rápida e , portanto, independente da do cromossomo bacteriano;

Existência de células Hfr, que apresenta o F incorporado cromossomo demonstra que a partícula pode passar do estado autônomo para o estado integrado; Retorno das células Hfr ao estado F+ indica que fenômeno

é reversível, enquanto a incapacidade das células F+

transferirem o cromossomo, ou de células Hfr transferirem o plasmídio F autônomo, indica que os dois estados são exclusivos.

Fagos do Tipo T2 e T4, virulentos não coexistem harmoniosamente com

as bactérias atacadas.

Fagos temperado são capazes de manter uma coexistência harmoniosa com a bactéria atacada.

Fago , após infecção da célula, mantém o fago no estado de profago associado ao cromossomo bacteriano, ou seja, no estado integrado, e nesse estado, duplica-se conjuntamente com o cromossomo;

Por indução, ou mesmo espontaneidade, o profago desliga-se do cromossomo e volta ao estado autônomo, duplicando-se independentemente do cromossomo bacteriano, chegando a lisar a células e infecta novas células;

Existência do estado autônomo e integrado, e reversibilidade entre os dois estado,;

Fago é constituído por DNA com tamanho cerca de 1/100 do cromossomo da bactéria, existência de transdução restrita, em que o profago leva o gene da galactose de uma célula para outra, considera os fagos temperados como plasmídios e, inclusive são epissomos.

Fagos Fagos TemperadosTemperados

Em 1925, antes, portanto de os micro-organismos serem efetivamente usados em pesquisas genéticas, Gratia observou que linhagens de E. coli produzi uma substancia antimicrobiana capaz de lisar outra linhagem da mesma bactéria;

Em 1940 Gratia e Fredericq, denominam a substancia de colicinacolicina, e verificaram que o evento ocorria também em outros gêneros: Aerobacter, Citrobacter, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, etc. As colicinas, tb denominadas bacteriocinas, são proteínas, sendo

então destruídas por enzimas proteolíticas.

A capacidade de lisar as células é semelhante dos fagos; colicinas são adsorvidas por receptores específicos na parede

celular das células sensíveis; Receptor da bacteriocina 336 foi isolado e purificado em Proteus

morganii, comportando-se como uma lipoproteina. Tratamento com pronase impede a atividade do mesmo.

São produtoras de colicina, uma vez que perde essa capacidade não podem ser recuperadas, a não ser por contato com outras da mesma espécie;

Essas células tem um plasmídio colinogênico (colcol) e as células portadoras dele, de colcol++; essas são imunes a sua própria colicina, visto que não tem receptores específicos;

Nem todas as células de uma população colicinogencias produzem colicinas;

Essas células são constituídas de DNA, alguns são capazes de promover conjugação, existem em estado autônomo, podem duplicar-se independentemente do cromossomo e não são essenciais as células que os contem.

A colina foi chamada de V, pois originou-se de uma linhagem virulenta de E. coli;

Cerca de 20% de linhagens de E. coli produzem colinas;

As colinas constituem uma família numerosas de proteínas, assim foram designadas por letras maiúsculas (A,B,E, K, V, etc) cada uma produzida por diferente plasmídio;

Há cerca de 20 colinas descritas; Colinas E ainda são subdivididas em E1, E2, E3; Colinas I em Ia, Ib; Colina K tem peso molecular de 60.600 pb se associa a

carboidratos e lipídios; Algumas colinas são capas proteicas de fagos defectivos – piocina

de Pseudomonas.

Em 1955, no Japão, descobriu-se que a resistência a drogas podia ser transferida de uma bactéria para outra, por infecção, sendo que resistência a varias drogas poderia ser transferida “de uma vez só”de uma vez só”;

Esse fenômeno transferência de resistência “de uma vez só”de uma vez só”, foi observado em estreptomicina, tetraciclina, ampicilina, clorafenicol, sulfonamida, canamicina, neomicina, etc. e em muito gêneros e espécies de bactérias como Shigella, E. coli, Salmonella, Vibrio comma, Serratia, etc;

Essa transferência se faz não só entre espécies como também entre gêneros diferentes, como entre Shigella e Escherichia;

Os plasmídios R são os agentes responsáveis pela transmissão de resistência a drogas, constituídos de DNA,mas são independentes do cromossomo bacteriano;

Parte do plasmídio R, é chamado de RTF (Resistance Transfer Factor) ou seja, transferir resistência múltipla a drogas.

São classificados em relação as marcas que carregam ou com relação a outras propriedades, como inibição da fertilidade

Marcas de resistênciaSu – sulfas; Sm – streptomicina; Cm -

cloranfenicolTc – tetraciclina; Km – canamicina; Nm –

neomicinaPenicilina e derivados Ap – ampicilinaSp – spectinomicina; Ge – gentomicinaHg, Co, Ni – sais de metais pesadosCol - colinas

Células que não tem plasmídio são colocadas em células que tem o plasmídio, e ocorre conjugação entre as mesmas e a passagem do plasmídio R. Considerado um plasmídio conjugativo como se fosse um plasmídio F.

Periodato impede temporariamente a infecção, aliado ao fato de que plasmídio R é constituído de DNA, de tamanha semelhante ao plasmídio F e que pode ser eliminado por acridinas, o que torna os dois plasmídios semelhantes.

Duplica-se independentemente do cromossomo bacteriano Pode esporadicamente transferir o cromossomo Plasmidios R são classificados em plasmidios fi+ e fi-.

De acordo com a repressão ou não do plasmidios F: Se uma célula F+ e infectada com um plasmídio Rfi+, cessa a função F,

pois Rfi+ produz um repressor que limita o aparecimento das pontes de conjugação ou F´pili.F´pili.

Se uma célula F+ é infectada por um plasmídio Rfi- a função F não se altera.

Watanabe (1963) sugeriu o que plasmídio R tenha se originado do F;

No plasmídio de F´, o Fo F,, ligando-se a genes que confere resistência a drogas, foi sendo feito seleção natural;

Implica que ocorreu diferentes ligações a diferentes partes do cromossomo bacteriano cada vez que levava um gene consigo;

Transposons (elementos transponíveis) tiveram papel importante ma formação desses plasmidios R;

Gene para resistência a estreptomicina, localizado no plasmídio R, é dominante em relação ao cromossômico em o posição ao strstrrr do cromossomo, que é recessivo em relação ao strstrss.

Feita por mistura de células contendo o plasmídio R com células receptoras;

Condições ótimas obtém 1% de transferência após 1 hora de contato;

Todas as entobacterias atuam como hospedeiros de plasmidios R, e podem ser transferidos a Vibrio, Yersinia, Aemonas, etc.

No sistema chamado HFRT HFRT poderá ter ate 100% de transferência, cuja frequência , após algumas gerações, volta ao normal, em virtude do próprio plasmídio R ter um repressor que inibe a formação de pilus;

È a inibição da fertilidade produzido por genes designados fim;

Além da conjugação também são transferidos por transdução;

Fago P1 carrega todo plasmídio R de uma célula para outra; Fagos P22 eE15, de Samonella, fazem o mesmo,podendo carregar apenas uma parte de R;

Plasmidios R, tipo fi+, tem duas subfrações, primeira delas com baixa percentagem de G+C a segunda, com 56-58% de G+C;

Por deleção o plasmídio pode perder a capacidade de dar resistência a um ou mas antibióticos e isso permite dizer que a porção capaz de dar resistência a tetraciclinas tem 48-50% de G+C e a parte capaz de produzir resistência a sulfonamida, estreptomicina e neomicina tem 51-54% de G+C;

A importância pratica dos plasmidios R tem de ser acentuada, pois é proibido em vários países o uso indiscriminado de antibióticos, principalmente em rações. Em animais, células bacterianas com plasmidios R são frequentemente isoladas; em peixes por exemplo, foi isolada Aeromonas liquefasciens .

Plasmidios que degradam hidrocarbonetos, que causam tumor em plantas;

Encontrados em Agrobacterium tumefaciens e tem sistema de transferência sexual entre bactérias , e entre bactérias e plantas;

O Plasmídeo Ti e suas características genômicas:Contém cerca de 200 Kbases, existindo em cópia

única, com genes que codificam para múltiplas funções, quase todas relacionadas com a transferência e integração deste plasmídeo (o T-DNA) no genoma da célula vegetal.

a) Região T-DNA (ou DNA de transferência) – contém a porção de DNA que será transferida, na forma de um fio único.

Nas extremidades (esquerda e direita) são delimitadas por 25 pares de bases em repetições diretas imperfeitas.

Qualquer seqüência de bases que for inserida entre essas duas extremidades, será integralmente transferida para a planta, independente de seu tamanho, e inserida, ao acaso, ao seu genoma.

b) Genes Vir ou Região Vir (Vir = virulência) Genes desse agrupamento codificam para,

respectivamente: expressão de produtos responsáveis pelo processo de exportação do T-DNA da bactéria para a planta; catabolismo de opinas; transferência conjugacional do plasmídeo Ti para outros isolados de Agrobacterium sp.

Na Região Vir estão os agrupamentos A, B, C, D, E, F e G, que contêm os genes VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirF e VirG, todos participantes ativos do processo geral de transformação da planta pelo patógeno.

c) Região Occ – Nesse grupamento estão os genes que codificam para síntese e catabolismo de opinas.

d) Região Rep – Aqui estão os genes responsáveis pela autoreplicação do plasmídeo ;

e) Região Tra – A expressão de genes situados nessas duas regiões origina produtos que governam a transferência conjugacional do plasmídeo Ti para outras espécies compatíveis de Agrobacterium.