giardia duodenalis: caracterização da diversidade genética...
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MAURÍCIO DURIGAN
Estudos genético-moleculares em Giardia duodenalis: caracterização da diversidade genética e
análises populacionais em amostras clínicas e ambientais na região metropolitana de
Campinas, São Paulo, Brasil
Genetic and molecular studies in Giardia duodenalis: molecular characterization of genetic
diversity and population genetic analyses in clinical and environmental samples in the
metropolitan region of Campinas, São paulo, Brazil
Campinas
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
Maurício Durigan
Estudos genético-moleculares em Giardia duodenalis: caracterização da diversidade genética e
análises populacionais em amostras clínicas e ambientais na região metropolitana de Campinas,
São Paulo, Brasil
Genetic and molecular studies in giardia duodenalis: molecular characterization of genetic
diversity and population genetic analyses in clinical and environmental samples in the
metropolitan region of Campinas, São Paulo, Brazil
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutor em Genética e Biologia
Molecular na área de Genética de Microorganismos
Thesis presented to the Institute of Biology of the University
of Campinas in partial fulfillment of the requirements for
the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology, in
the area of Genetics of Microorganisms
CAMPINAS
2015
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RESUMO
Giardia duodenalis é um protozoário flagelado que parasita o homem e diversos animais
domésticos e selvagens. Este parasito causa a doença giardiose que é uma das mais prevalentes
doenças parasitárias de veiculação hídrica do mundo, responsável por aproximadamente 280 milhões
de casos anualmente. Existe uma considerável variabilidade genética em G. duodenalis, de modo
que seus isolados foram divididos em oito grupos genéticos (A-H), dois dos quais (A e B) são
encontrados tanto em humanos quanto em animais. Os demais grupos (C-H) parasitam outros
animais e apresentam maior especificidade a determinados hospedeiros não humanos. A
contaminação ambiental por Giardia tem sido amplamente descrita embora esses estudos, em sua
maioria, são realizados no nível de identificação de espécie. Há falta de estudos que correlacionam a
contaminação ambiental e infecções clínicas na mesma região. O presente trabalho teve como
objetivo principal contribuir para o conhecimento da diversidade genética da espécie Giardia
duodenalis. Primeiramente, foi realizada a genotipagem multilocos dos principais grupos genéticos
de G. duodenalis na região metropolitana de Campinas. Foram encontrados grupos genéticos
associados principalmente a infecções humanas bem como isolados com potencial zoonótico em
amostras ambientais e obtidas de outros animais. Foi encontrado um alto percentual (25%) de
amostras com grupos genéticos mistos e um elevado número de haplótipos distintos, indicando
grande diversidade genética do parasito nessa região. Na segunda parte deste trabalho, foi realizado
um estudo populacional com amostras clínicas de Giardia provenientes de hospital, creche e centro
de controle de zoonoses e amostras ambientais de esgoto hospitalar, efluente de estação de
tratamento de esgoto e amostras hídricas de importantes rios e córregos urbanos. As análises
populacionais, com exceção das amostras caninas, evidenciaram grande similaridade genética entre
essas populações de Giardia. Na terceira parte do presente trabalho, foi realizada uma busca por
repetições microssatélites (SSRs) nos genomas publicados de Giardia para desenvolvimento,
caracterização e avaliação de polimorfismo de novos marcadores microssatélites. Foram encontrados
506, 438, 402 e 507 microssatélites correspondentes aos genomas AI, AII, B e E, respectivamente.
Foram selecionados 80 SSRs específicos aos grupos genéticos A, B e E (40, 20 e 20,
respectivamente), além de 36 SSRs compartilhados entre os três genomas. A análise de amplificação
confirmou a existência de marcadores específicos aos grupos genéticos A, B e E, além de
marcadores compartilhados entre os grupos. A caracterização dos SSRs permitiu a detecção de 12
locos SSRs polimórficos do grupo genético A e sete locos SSRs polimórficos do grupo genético B.
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Dentre os marcadores compartilhados, o loco GduABE01 apresentou polimorfismo. Os locos
polimórficos podem servir para futuros estudos populacionais e os marcadores desenvolvidos podem
ser utilizados para identificação dos principais grupos genéticos de G. duodenalis em amostras
clínicas e ambientais. Os resultados apresentados contribuem para um melhor entendimento sobre a
diversidade genética do parasito bem como sobre a presença de grupos com potencial zoonóticos
inter-relacionados em diferentes regiões. Os novos marcadores moleculares disponibilizados podem
contribuir para novos estudos populacionais, promovendo melhor discriminação entre os genótipos e
possibilitando assim identificar a contaminação e promover o rastreamento da doença.
.
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ABSTRACT
Giardia duodenalis is a flagellate protozoan that that parasites humans and several domestic and
wild animals. This parasite causes giardiasis, one of the most common waterborne diseases in the
world responsible for, approximately 280 million cases per year. There is a great genetic diversity in
this species and its isolates have been grouped into eight distinct genetic assemblages (A-H). While
groups A and B parasitize different hosts and have zoonotic potential, groups C, D, E, F, G and H
usually found in animals and show greater specificity to the parasitized host. Environmental
contamination for Giardia has been widely reported however, most of these studies have been
performed only at species level. The present study aimed to contribute to the knowledge of the
genetic diversity of the species Giardia duodenalis. In the first chapter of this document, multilocus
sequence-based genotyping using three gene loci assigned most of the samples as belonging to
human genotypes although isolates with zoonotic potential have also been identified in
environmental and non-human clinical samples. A high percentage (25%) of mixed assemblages and
a high number of different haplotypes were detected, which indicates high genetic diversity of this
parasite in this region. In the second chapter, a population genetics study was performed with
clinical samples from hospital, day-car center and a center for zoonosis control of the city and
environmental samples from hospital sewage, effluent of a wastewater treatment plant and important
water samples from rivers and urban streams. With the exception of the canine population,
population genetic analysis showed consistent similarity between clinical and environmental
populations. In the last chapter, we performed a search for microsatellites (SSRs) in the published
genomes of Giardia to develop and characterize the polymorphism of new microsatellite markers.
Our group identified 506, 438, 402 and 507 microsatellites of the genomes AI, AII, B and E,
respectively. We have selected 80 markers specific to the genetic assemblages A, B and E (40, 20
and 20, respectively) and 36 shared SSRs between the three genomes. Analysis of amplification
reactions confirmed the existence of specific loci of each genetic assemblage as well as shared loci
among assemblages. Characterization of all loci allowed the detection of 12 polymorphic loci for
group A and seven polymorphic loci for group B. Among the shared markers, GduABE01 presented
polymorphism. The polymorphic markers can be used in future population genetic studies and the
developed markers can contribute to the identification of the main genetic assemblages of G.
duodenalis in clinical and environmental samples. The results presented here contribute to a better
understanding of the genetic diversity of the parasite as well as the presence of zoonotic potential
x
genotypes, related in different regions. The new molecular markers provided can contribute with
population genetic studies in a high level of discrimination that allows identifying the source of
contamination and molecular tracking of the disease.
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SUMÁRIO
vii Resumo
ix Abstract
xiii Agradecimentos
xvii Prefácio
1 Introdução
7 Revisão bibliográfica
33 Objetivos
37 Capítulo I
Genetic Diversity of Giardia duodenalis: Multilocus Genotyping Reveals Zoonotic
Potential between Clinical and Environmental Sources in a Metropolitan Region of
Brazil
89
113
Capítulo II
Genética de Populações em Giardia duodenalis: Diversidade Genética e
Compartilhamento de Haplótipos em Amostras Clínicas e Ambientais
Capítulo III
Microssatélites em Giardia duodenalis: Identificação e caracterização de novos
marcadores para identificação de grupos genéticos específicos, estudos
populacionais e de diversidade
147
Considerações finais
153 Resumo dos resultados
157 Conclusões
161 Perspectivas
165 Literatura citada
181 Anexos
xii
xiii
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Laldecir e Lázara que, ao longo de todos esses anos, sempre me deram toda
educação e amor que um filho poderia ter. Acompanhei de perto, desde pequeno, os inúmeros
esforços e o apoio irrestrito em todas as atividades que ajudaram a me tornar uma pessoa melhor.
Serei eternamente grato a essas duas pessoas maravilhosas e incríveis que em muitos momentos
foram capazes de abrir mão de seus sonhos, para que eu pudesse viver os meus. O agradecimento se
estende também à toda família Durigan e família Zeferino representadas por tios (as) e primos (as)
muito queridos, que me fortaleceram a cada encontro.
Aos meus irmãos, Alessandra, Gabriela e David, juntamente com meus cunhados Samuel, Juliano e
Valéria, por sempre estarem ao meu lado na maioria dos momentos e, especialmente, por terem me
dado a alegria de ser tio da Luísa, Clara, do Gustavo, Miguel, Rafael e João que, com toda
espontaneidade e amor que podem demonstrar a um tio, estão entre as pessoas mais importantes da
minha vida. Ao meu irmão e amigo David, faço um agradecimento especial por ter sempre me
mostrado os caminhos corretos e esforços necessários para se atingir o objetivo. Mais que um amigo
e um irmão, será sempre o maior ídolo que tive a sorte de conhecer.
À minha namorada Mariana, por todo amor, companheirismo e inspiração nos últimos três anos. Seu
apoio incondicional e motivação foram essenciais para que eu pudesse ter a calma e tranquilidade
necessárias para cumprir essa importante etapa. Obrigado por ser essa pessoa iluminada, dotada de
um excelente coração, que foi capaz de me mostrar os caminhos quando eu me senti perdido e
desmotivado. Juntos, sempre seremos mais fortes! Obrigado à toda família Silveira e família Derami
por me tratarem como um filho em todos os momentos.
À professora Dra. Anete Pereira de Souza, que aceitou me orientar mesmo em um assunto tão
diferente ao que estava habituada a trabalhar. Seu entusiamo e motivação foram contagiantes e me
permitiram sempre sonhar muito a frente do que imaginava ser possível. Obrigado por me ensinar
os caminhos da ciência sempre pautados na ética e responsabilidade e por ter sempre acreditado em
mim, mesmo nos momentos em que enfrentamos dificuldades e resistências.
À professora Dra. Regina Maura Bueno Franco, que me abriu as portas para o mundo da
Parasitologia e que decidiu apostar em mim, mesmo quando eu era apenas um aluno de graduação
que tentava fazer um trabalho voluntário. Sua competência e honestidade foram os primeiros de
xiv
muitos ensinamentos que tive ao longo de todos esses anos. Obrigado por apostar e confiar que eu
seria capaz de desenvolver a pesquisa em uma área com tantos desafios. Sempre levarei comigo o
ensinamento que devemos ter a cabeça nas alturas e os pés no chão.
À professora Maria Imaculada Zucchi pela colaboração na presente tese e por me ensinar genética de
populações com muita alegria e dedicação. Sua participação no trabalho foi essencial para que hoje
nós possamos começar a colher os frutos.
Aos professores Dr. Sérgio Furtado dos Reis, Dr Marcelo Cavallari, Dra. Selma Giorgio, Dr. Romeu
Cantúsio Neto e Dra. Maísa Ciampi-Guillard por participarem de etapas essenciais ao
desenvolvimento da tese e por contribuírem de forma bastante significativa com os resultados da
presente pesquisa.
Aos assessores científicos, revisores de periódicos científicos e membros da banca do presente
projeto que aceitaram contribuir em etapas de avaliação, essenciais para seu cumprimento.
Aos colegas e amigos Nilson Branco e Melissa de Oliveira Santos-Garcia pelo acolhimento e pelos
enormes ensinamentos no Laboratório de Protozoologia e no Laboratório de Análise Genética e
Molecular, respectivamente.
Aos meus colegas e amigos do Laboratório de Análise Genética e Molecular e do Laboratório de
Protozoologia por todo companheirismo e ensinamentos ao longo dos últimos anos. É impossível
citar o nome de todos, mas saibam que, cada um com suas particularidades, promoveram grandes
contribuições ao meu trabalho e no meu conhecimento, além de terem proporcionado grandes
momentos em nossos churrascos e inúmeros bolos.
Dentre todos os colegas, alguns participaram de maneira mais próxima de momentos essenciais
através de parcerias, ensinamentos e mesmo apoio em etapas difíceis. Obrigado Melissa, Prianda,
Melina, Camila, Patrícia, Guilherme, Benício, Gustavo, André, Fernanda e Rebecca do LAGM e
Nilson. Ricardo, Diego, Clarisse, Mayra, Taís, Sandra, Juliane e Luciana do L1.
Aos colegas Guilherme e Gustavo que, a partir de uma convivência diária, se transformaram em
verdadeiros amigos e companheiros. A contribuição de cada um na minha vida profissional e pessoal
é inestimável e só posso guardar boas lembranças de todas as conversas, desafios, shows, viagens,
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congressos entre muitas outras situações que passamos juntos. Que a vida de vocês seja frenética
como Nuketown e magnífica como um show do Rush.
Aos funcionários e técnicos do CBMEG, LAGM, L1 e biblioteca do IB por todo trabalho e auxílio
prestados, essenciais para o desenvolvimento pleno das atividades de ensino e pesquisa promovidos
pela UNICAMP. Um agradecimento especial ao Dr. Juverlande por todo apoio e amizade e por estar
sempre presente quando precisamos.
Aos professores Dra. Maria do Carmo Estanislau do Amaral e Dr. Volker Bittrich por terem sido os
primeiros a me ensinar os caminhos da ciência. O tempo me levou para uma área diferente mas seus
ensinamentos permanecem constantemente comigo.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia
Molecular que, com toda estrutura e oportunidades, me permitiram entender a fundo o significado
das palavras ensino, pesquisa e extensão.
À todas as escolas e instituições de ensino que fizeram parte de minha formação desde a idade pré-
escolar até os dias atuais. Agradeço especialmente ao Instituto Educacional Imaculada, responsável
pela minha educação formal ao longo de doze anos, nos quais pude aprender os valores para ser uma
pessoa ética e digna.
Aos amigos queridos que passaram importantes momentos de sua vida ao meu lado. Aos que pude
conhecer no Instituto Educacional Imaculada (Turma dos Smurfs), na UNICAMP (Bio04) e em
tantos outros locais que pude conhecer. Hoje muitos se encontram em diferentes cidades, estados e
até países, mas a alegria e entusiamo que me proporcionam a cada encontro e a cada mensagem
representaram mais uma dose de motivação e incentivo em todos esses anos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelas bolsas de doutorado
concedidas referentes aos processos no 2008/55972-9 e 2011/50413-4 e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo projeto universal que permitiram a
realização deste trabalho.
xvi
xvii
PREFÁCIO
A presente tese busca elucidar aspectos relativos à epidemiologia molecular do protozoário
Giardia duodenalis (sinonímia G. intestinalis e G. lamblia). Apesar desse organismo ser bastante
estudado, em função de ser o causador da doença giardiose, que infecta milhões de hospedeiros
todos os anos, muitos aspectos relativos ao seu perfil molecular permanecem incompreendidos.
Além disso, existe uma notável ausência de estudos que tentem correlacionar o perfil genético de
populações oriúndas de amostras clínicas e populações oriúndas de amostras ambientais. Os
resultados obtidos durante o período de doutoramento são apresentados na presente tese através de
três artigos distribuídos em três capítulos, dos quais um já se apresenta publicado (Capítulo I).
O primeiro artigo, intitulado “Genetic Diversity of Giardia duodenalis: Multilocus
Genotyping Reveals Zoonotic Potential between Clinical and Environmental Sources in a
Metropolitan Region of Brazil” e apresentado no Capítulo I foi publicado na revista Plos One
(DOI:10.1371/journal.pone.0115489). Esse artigo refere-se à caracterização (por meio de genes
conservados) de populações de G. duodenalis de origem clínica e ambiental na região metropolitana
de Campinas. Nesse capítulo, foram avaliados os principais grupos genéticos da espécie nos
diferentes locais de coleta, bem como a taxa de genótipos mistos em um mesmo isolado. Por fim,
foram avaliados os haplótipos mais frequentes e sua ocorrência nos diferentes locais e hospedeiros
amostrados. Nesse trabalho, foi possível realizar uma primeira avaliação da diversidade genética de
G. duodenalis nessa região além de verificar uma notável relação entre os diferentes grupos
amostrados.
No segundo capítulo, foram estabelecidas parcerias que tornaram possível aumentar em
muito o número de populações de Giardia duodenalis amostradas, tanto de origem clínica quanto
ambiental. Foram obtidas populações ambientais provenientes de esgoto e de um rio, além de uma
população clínica obtida no centro de controle de zoonoses de Campinas. O aumento do número de
populações disponíveis permitiu que fossem utilizados análises de genética de populações para
comparar os isolados de G. duodenalis obtidos e assim estimar o grau de similaridade genética entre
essas populações. Além disso, foram analisados os haplótipos mais frequentes e o compartilhamento
de haplótipos entre as populações.Dessa forma, foi realizada uma ampla análise do perfil genético de
Giardia duodenalis na região metropolitana de Campinas. Esse artigo ainda será submetido para
publicação.
xviii
O terceiro capítulo apresenta a identificação e o desenvolvimento de marcadores moleculares
do tipo microssatélites presentes no genoma de G. duodenalis. Foram desenvolvidos 56 novos
marcadores microssatélites específicos a determinados grupos genéticos e quatro novos marcadores
que são compartilhados entre todos os grupos genéticos de G. duodenalis. Este é o primeiro estudo
que trata do desenvolvimento de marcadores microssatélites nessa espécie e tais marcadores podem
ser utilizados para identificação do parasito (ou de seus grupos genéticos). Além disso, foram
identificados marcadores polimórficos que correspondem a ferramentas com alto poder de
discriminação dos genótipos, o que os tornam ferramentas ideais para estudos populacionais e de
diversidade. Esse artigo ainda será submetido para publicação. Foi identificada a possibilidade da
utilização dos marcadores desenvolvidos em kits comerciais para identificação de Giardia e seus
principais grupos genéticos em amostras clínicas e ambientais. Assim, previamente à publicação dos
resultados detalhados de cada marcador, incluindo suas sequências, os marcadores serão patenteados
de forma que esse conhecimento seja protegido no âmbito nacional. Por esse motivo, as sequências,
bem como informações mais detalhadas acerca dos iniciadores desenvolvidos, não são apresentadas
no Capítulo III.
Os resultados apresentados na presente tese de doutorado trazem conhecimentos inéditos
para a espécie em estudo. Tais informações, em conjunto com os marcadores moleculares a serem
publicados, poderão ser aplicadas em futuros estudos que irão contribuir para um maior
conhecimento da biologia do organismo bem como de características relevantes da epidemiologia
molecular do parasito.
1
Introdução
2
3
INTRODUÇÃO
Giardia duodenalis (sinonímia G. intestinalis e G. lamblia) é um protozoario flagelado
da ordem Diplomonadida que parasita o homem e diversos animais domésticos e selvagens
causando a doença giardiose. O gênero Giardia consiste em seis espécies: G. agilis, G. ardeae,
G. microti, G. duodenalis, G. psittaci e G. muris que parasitam uma ampla gama de
hospedeiros vertebrados e se distinguem com base na morfologia e ultraestrutura de seus
trofozoítos (Adam, 2001).
A doença giardiose possui distribuição global e causa aproximadamente 280 milhões de
casos por ano sendo considerado o mais comum protozoário parasita humano, tanto em países
desenvolvidos como em países em desenvolvimento (Lane e Lloyd, 2002). Os sintomas mais
comumente associados à doença são: diarréia aguda à crônica, dor abdominal, vômitos,
desidratação e perda de peso. A infecção pode ser responsável por redução do crescimento e do
desenvolvimento cognitivo de crianças (Ortega e Adam, 1997 e Adam, 1991). Mais de 1,7
milhões de pessoas morrem todos os anos devido à falta de higiene, ausência de infraestrutura
sanitária e falta de acesso á água tratada (WHO, 2002).
Os dados de prevalência de Giardia em hospedeiros não humanos são basicamente
restritos a cães, gatos e animais de interesse pecuário (Thompson et al, 2008). A considerável
prevalência nesses animais é de grande preocupação de uma perspectiva de saúde pública
(Palmer et al, 2008) e pode ser uma importante causa de significativas perdas econômicas no
setor pecuário (Geurden et al, 2012).
De uma perspectiva ambiental, surtos de giardiose humana são frequentemente
associados à contaminação de água tratada (Zhang et al, 2012). Elevada prevalência de Giardia
tem sido detectada em águas superficiais em diversos países (Franco et al, 2001 e Haramoto et
al, 2012), mas poucos estudos têm avaliado o nível da contaminação ambiental do parasito.
Recentemente, um elevado risco de contaminação por Giardia foi evidenciado em quatro
regiões densamente povoadas no estado de São Paulo ao se avaliar amostras hídricas de nove
distintas bacias hidrográficas. Entre essas regiões, a região metropolitana de Campinas foi a
que apresentou as maiores taxas de contaminação (Sato et al, 2013).
A transmissão da doença por veiculação hídrica, contaminação alimentar e contato com
animais tem sido um grande campo para estudos epidemiológicos. Embora seja muito
discutido, há evidências muito fortes que comprovam o potencial zoonótico de Giardia, no
4
qual, um cisto de uma determinada linhagem pode ser responsável pela contaminação de
diferentes hospedeiros como cães, gatos, bovinos e humanos (Thompson, 2004).
Diversos ensaios moleculares foram desenvolvidos para desvendar a complexa
epidemiologia dessa doença (Luján e Svard, 2011). Esses ensaios determinaram que Giardia
duodenalis possui grande diversidade genética de forma que seus isolados foram divididos em
oito grupos genéticos (A-H). Os grupos genéticos A e B apresentam subestruturação (AI, AII,
AIII, BIII e BIV) e parasitam uma ampla gama de hospedeiros como cães, gatos, animais de
campo e outros mamíferos. São os únicos grupos que comumente parasitam humanos, de
forma que existe uma constante preocupação com o potencial zoonótico de seus isolados. Os
demais grupos genéticos (C-H) apresentam maior uniformidade quanto aos hospedeiros
parasitados de modo que são considerados hospedeiro-específicos (Caccio e Ryan, 2008 e
Bowman e Lucio-Forster, 2010).
Quando comparados aos estudos em amostras clínicas, existem poucos estudos
moleculares que buscam identificar os grupos genéticos de G. duodenalis em amostras
ambientais. Também é notável a grande lacuna em estudos que busquem correlacionar grupos
genéticos de amostras clinicas e ambientais em uma mesma região. A vocação de grupos de
pesquisa em se trabalhar com apenas um tipo de amostra, associado com a maior dificuldade
em se trabalhar com amostras ambientais e a recente capacitação de grupos de pesquisa com as
ferramentas moleculares, podem ser consideradas como as principais causas de tal limitação
detectada.
O estudo da variação genética em populações naturais de parasitas e vetores pode
propiciar acesso a informações essenciais na ecologia e potencial evolutivo desses organismos
(Combes, 2001). Nesse contexto, a genética de populações surge como ferramenta de estudo
para caracterização de populações de parasitas e também para avaliar a similaridade genética
entre diferentes populações clínicas e ambientais de Giardia. Tais comparações podem
fornecer importantes respostas sobre os meios de veiculação do parasito bem como a
identificação de sua fonte de contaminação.
Até o presente momento, quatro diferentes genomas de Giardia duodenalis foram
completamente sequenciados (WB_AI, DH_AII, GS_B e P15_E) e importantes informações
sobre este parasito foram obtidas. G. duodenalis apresenta genoma pequeno e compacto com
alta densidade gênica e poucos íntrons. O isolado sequenciado do grupo B é o que apresenta
5
maior taxa de heterozigosidade, consideravelmente baixa na espécie e excessivamente baixa no
grupo genético A (Morrison et al, 2007, Franzén, et al.2009, Jerlström-Hultqvist et al, 2010 e
Adam et al, 2013). Os grupos genéticos apresentam grande diversidade genética quando
comparados entre si, de forma que esta é, as vezes, superior à encontrada quando comparada a
diversidade entre diferentes espécies de protozoários (Mayrhofer et al, 1995 e Jerlström-
Hultqvist et al, 2010). Dessa forma, Giardia duodenalis pode ser considerada como um
complexo de espécies e uma nova divisão na espécie tem sido proposta (Monis et al, 2009).
Caccio e Ryan (2008) sugerem que sejam feitos estudos que busquem locos
hipervariáveis, que possam acessar mais profundamente as diferentes linhagens de Giardia, a
fim de monitorar a sua transmissão com mais precisão. Nesse contexto, os marcadores
moleculares microssatélites, por serem altamente polimórficos, multialélicos e presentes em
grandes quantidades em genomas eucariotos, aparecem como ideais para estudos populacionais
e de diversidade (Powel, 1996). Os marcadores de alta resolução permitem que sejam
identificadas variações de genótipos não detectados pelos marcadores genéticos convencionais.
A caracterização de isolados em um nível maior de discriminação pode ser explorada para
investigar a epidemiologia da doença, o papel de portadores assintomáticos e para rastreamento
da doença através de água e alimentos contaminados (Smith et al, 2007).
A publicação de diversos genomas de Giardia duodenalis nos últimos anos permite que
novas buscas por marcadores com maior resolução sejam efetuadas. Considerando a elevada
quantidade de informação disponibilizada pelos genomas recém-publicados, associados à
necessidade de desenvolvimento de novos marcadores que possuam um nível maior de
discriminação, decidiu-se desenvolver marcadores moleculares microssatélites para Giardia
duodenalis. A utilização de um marcador genético de alta resolução, como os microssatélites,
poderá servir para o entendimento da dinâmica de populações de Giardia duodenalis, bem
como para a estimativa de parâmetros populacionais como estruturação genética dos grupos
genéticos e diversidade genética. Essas análises possibilitarão um maior conhecimento das
populações de Giardia duodenalis presentes no Brasil. Todas as informações obtidas na
presente tese são de especial relevância em saúde pública e contribuirão para a elucidação de
aspectos relativos á epidemiologia molecular de Giardia duodenalis.
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Revisão Bibliográfica
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REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O gênero Giardia
A taxonomia de Giardia tem sido controversa ao longo de mais de 100 anos, o que
gerou grande confusão em sua nomenclatura, com diferentes nomes sendo utilizados para as
mesmas espécies. Essa confusão gerou grande incerteza na epidemiologia das infecções por
Giardia e também na questão que envolve a especificidade ao hospedeiro e transmissões
zoonóticas (Luján e Svärd, 2011).
A descoberta do organismo, hoje denominado Giardia, ocorreu em 1681 por Antony
Van Leeuwenhoek ao analisar suas próprias amostras de fezes (Adam, 1991). A primeira
descrição detalhada de Giardia foi realizada por Lambl (1859), na qual o organismo flagelado
intestinal foi denominado Cercomonas intestinalis. Entretanto, anos depois, foi verificado que,
anteriormente à denominação de Lambl, o organismo Bodo intestinalis havia sido transferido
para o gênero Cercomonas o que gerou homonímia pelo Código Internacional de
Nomenclatura Zoológica vigente na época (Filice, 1952).
Davaine (1875) descreveu uma forma muito similar a Giardia encontrada em um
coelho, a qual foi denominada Hexamita duodenalis. Sete anos após, Kunstler (1882)
encontrou o mesmo flagelado em girinos e o denominou Giardia agilis. A denominação
sugerida por Davaine (1875) tem grande importância uma vez que, se um único determinado
nome específico deve ser utilizado para todas as formas de Giardia encontradas em humanos e
demais mamíferos, o termo duodenalis tem prioridade sobre intestinalis de acordo com as
regras do Código de Nomenclatura Zoológica (Filice, 1952). Desde 1859 até 1952, 51 espécies
haviam sido descritas baseadas principalmente no organismo hospedeiro onde haviam sido
identificadas (Adam, 2001 e Thompson e Monis, 2004).
O trabalho de Filice (1952) foi, sem dúvidas, o que apresentou maior contribuição na
questão de reorganização das espécies taxonômicas de Giardia. Após desconsiderar a
influência das diferenças entre os organismos hospedeiros, Filice se concentrou em caracterizar
a variação morfológica entre os diferentes isolados de Giardia. Por fim, baseado nas diferenças
encontradas no formato dos corpos medianos internos, bem como no formato e comprimento
do organismo, o autor concluiu que o correto seria considerar a existência de três grupos
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morfologicamente distintos. Assim, foram denominadas as espécies Giardia duodenalis,
Giardia muris e Giardia agilis (Filice, 1952 e Monis, 1999).
Nos anos posteriores, a caracterização ultraestrutural, com o auxílio de microscópios
eletrônicos de varredura, permitiu a identificação de duas diferentes espécies em aves: Giardia
psitacci e Giardia ardeae (Erlandsen e Bemrick, 1987 e Erlandsen, 1990). Com base na
morfologia e composição do cisto, uma sexta espécie foi descrita identificada de hospedeiros
roedores. Essa espécie foi denominada Giardia microti (Feely, 1988).
Giardia duodenalis
Giardia duodenalis (sinonímia G. lamblia e G. intestinalis) é um protozoário flagelado
da ordem Diplomonadida pertencente ao super-grupo Excavata (Cavalier-Smith, 2002 e Adl et
al, 2005) que parasita o homem e diversos animais domésticos e selvagens, entre eles cães,
gatos, humanos, primatas não humanos, cavalos, bois, porcos, roedores, ovelhas e coiotes,
entre outros, causando a doença giardiose. A giardiose apresenta distribuição global e é
considerada o mais comum protozoário parasita humano tanto em países desenvolvidos como
em países em desenvolvimento (Lane e Lloyd, 2002). A infecção ocorre exclusivamente pela
ingestão de cistos através de bebidas ou alimentos, ingestão acidental de águas recreacionais,
contato direto através de práticas de higiene insuficientes ou atividade sexual. Em 1981,
Giardia foi adicionada à lista dos patógenos parasitas pela Organização Mundial da Saúde
(WHO, 1981).
Giardia duodenalis apresenta dois estádios distintos em seu ciclo de vida. No interior
do hospedeiro, sob condições ideais (temperatura ao redor de 37oC e pH ácido) estão presentes
os trofozoítos, que costumam parasitar o duodeno e o íleo, anexando-se ao epitélio intestinal.
Os cistos, forma de resistência do protozoário, costumam ser encontrados no ambiente e são
muito resistentes à cloração e ozonização, podendo permanecer viáveis por bastante tempo. Ao
serem ingeridos, mudam para a forma de cisto no início do intestino e, por divisão binária, cada
cisto gera dois trofozoítos. (Lane e Lloyd, 2002).
Os sintomas mais comumente associados à doença são: diarreia aguda à crônica, dor
abdominal, vômitos, desidratação e perda de peso. A infecção pode ser responsável por
redução do crescimento e do desenvolvimento cognitivo de crianças (Ortega e Adam, 1997 e
Adam, 1991). Em indivíduos imunocomprometidos, quando o número de linfócitos CD4+ é
11
reduzido, o risco de infecção sintomática por Giardia aumenta, com tendência ao
desenvolvimento de diarreia crônica (Dwivedi et al, 2007). A doença também pode ser
assintomática, o que consequentemente reduz a procura por auxílio médico e pode tornar o
portador da parasitose um reservatório disseminador de cistos.
Figura 1. Dois cistos de Giardia duodenalis visualizados após reação de imunofluorescência
direta. No detalhe destacado em vermelho, os dois cistos são visualizados com contraste de fase. Foto
de Maurício Durigan.
Prevalência de Giardia duodenalis em humanos
A doença giardiose possui distribuição global e causa aproximadamente 280 milhões de
casos por ano em humanos sendo considerado o mais comum protozoário parasita humano
tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (Lane e Lloyd, 2002).
Mais de 200 milhões de pessoas na África, Ásia e América Latina apresentam a doença com
sintomas e mais de 500 mil casos são reportados todos os anos (WHO, 1996).
Aproximadamente 1,2 milhão de novos casos da doença ocorrem nos Estados Unidos
anualmente (Yoder, et al, 2012), onde a incidência pode ser superior a 0,7% da população
(Hlavsa et al, 2007). Anualmente, mais de 1,7 milhão de pessoas morrem, a cada ano, por
péssimas condições de higiene, falta de estrutura sanitária e ausência de tratamento de água e
12
esgoto (WHO, 2002). As doenças diarreicas, entre elas a giardiose, são responsáveis por 15%
de todas as mortes de crianças com idade inferior a cinco anos (WHO, 2011).
Crianças fazem parte do grupo com alta susceptibilidade para infecção por Giardia
duodenalis, particularmente as que frequentam creches, escolas primárias e orfanatos (Feng e
Xiao, 2011 e Muhsen e Levine, 2012). Em um estudo realizado em 13 creches urbanas do
Município de Campinas, 17,91% das crianças apresentavam-se parasitadas com algum tipo de
protozoário intestinal sendo que 10,09% do total de crianças apresentavam-se parasitadas por
Giardia duodenalis (Franco, 2007). Resultados semelhantes foram encontrados em João
Pessoa, em um trabalho com 290 crianças, nas quais 9,3% foram identificadas como positivas
para Giardia duodenalis (Moreno et al, 2008). Em Cuba, a prevalência total do parasito foi de
7,2% (Escobedo et al, 2011) entretanto, foi detectada em 22,7% das amostras provenientes de
crianças cubanas (Puebla et al, 2014).
No final do século XX, devido à identificação de um elevado e inesperado número de
casos da doença em crianças frequentadoras de creches e também em animais como bezerros,
cães e gatos, giardiose foi considerada uma doença re-emergente (Thompson, 2000). Em 2004,
para reafirmar a associação com a pobreza, tanto Giardia quanto Cryptosporidium foram
incluídos na Iniciativa das Doenças Negligenciadas (Neglected Disease Initiative) o que elevou
a preocupação em relação aos efeitos que essas doenças causam na saúde das pessoas (Savioli
et al, 2006).
Prevalência de Giardia duodenalis em amostras clínicas não humanas
Os dados sobre incidência de contaminações de Giardia duodenalis em hospedeiros
não humanos são confinados principalmente a cães, gatos e animais de interesse pecuário.
Embora as infecções humanas sejam de primário interesse, Giardia duodenalis tem sido
reportada em cães e gatos em todo o mundo (Thompson et al, 2008). Pesquisas que abordam a
presença de G. duodenalis em cães têm reportado uma elevada prevalência (Paz e Silva et al,
2012). Palmer et al, (2008) detectaram Giardia como o parasita mais prevalente em cães com
9,4% de contaminação na população amostrada. Levantamentos em diferentes populações
caninas reportaram a prevalência de 10% em cães domésticos, 36-50% em filhotes e
aproximadamente 100% em estabelecimentos de criação e canis (Hahn et al., 1988;
13
Kirkpatrick, 1988). Ao avaliar 200 cães provenientes de abrigos e ambientes domésticos,
Meireles et al, (2008) encontraram 16,5% de prevalência na cidade de Curitiba, Paraná.
Em gatos, também existe grande preocupação com índices de prevalência da doença
tanto de uma perspectiva clínica quanto do ponto de vista de saúde pública (Palmer et al, 2008
e Paoletti et al, 2010). Devido à elevada presença de cães e gatos em domicílios (72,1 milhões
de cães e 81,2 milhões de gatos em domicílios, apenas nos Estados Unidos, segundo a
Associação dos Médicos Veterinários dos Estados Unidos - AVMA, 2007), cães e gatos têm
sido indicados como fontes regulares de infecção humana por G. duodenalis e transportadores
desse agente zoonótico (Bowman e Lúcio-Forster, 2010).
Elevada prevalência de Giardia e Cryptosporidium tem sido reportada em todo mundo
tanto em gado leiteiro quanto em animais de corte (Coklin et al 2010 e O’Handley et al 2000).
Infecção por Giardia é muito comum em bovinos, particularmente em bezerros, nos quais as
taxas de prevalência chegam a atingir perto de 100% (Geurden et al, 2010 e Geurden et al,
2012). Essas infecções possuem importante significado econômico uma vez que há prejuízo no
desempenho dos animais (O’Handley, 2002).
Prevalência de Giardia sp em amostras ambientais
De uma perspectiva ambiental, surtos de giardiose humana são frequentemente
associados á contaminação de água tratada (Zhang et al, 2012). Ao revisar 199 surtos
reportados entre 2004 e 2010, Baldurson e Karanis (2011) demonstraram que 35% destes
foram causados por Giardia duodenalis. Alta prevalência de Giardia tem sido detectada em
águas superficiais em diversos países (Franco et al, 2001 e Haramoto et al, 2012), mas poucos
estudos têm avaliado o nível da contaminação ambiental do parasito. Franco et al (2001),
identificaram a presença de Giardia em 100% das amostras de águas superficiais do rio
Atibaia. As principais sub-bacias hidrográficas do estado de São Paulo apresentaram
positividade para cistos de Giardia, sendo que o ponto de captação do rio Atibaia foi
considerado um ponto crítico do estado de São Paulo, com densidade de 521 cistos por litro
(Hachich et al, 2004). Cantúsio-Neto e Franco (2004) encontraram positividade para Giardia
em mais de 90% das amostras tanto de afluente como do efluente de duas estações de
tratamento de água da cidade de Campinas. Mesmo processos avançados de desinfecção por
14
luz UV (tratamento terciário), não foram suficientes para eliminar a capacidade infectante dos
cistos (Santos et al, 2013).
Recentemente, um elevado risco de contaminação por Giardia foi evidenciado em
quatro regiões densamente povoadas no estado de São Paulo ao se avaliar amostras hídricas de
nove distintas bacias hidrográficas. Entre essas regiões, a região metropolitana de Campinas foi
a que apresentou as maiores taxas de contaminação (Sato et al, 2013). A detecção de Giardia
em águas superficiais fornece importantes pistas sobre a epidemiologia ambiental do parasito
(Santos et al, 2004).
Vulnerabilidade a infecções por Giardia duodenalis devido à falta de
infraestrutura do sistema de esgotamento sanitário nacional
O Brasil ainda apresenta grande carência no que diz respeito à infraestrutura do sistema
de esgotamento sanitário. Dados publicados pelo Sistema Nacional de Informações Sobre
Saneamento mostram que, dos 5564 municípios brasileiros, em média 82% das residências
possuem acesso à rede de água e apenas 38% do esgoto brasileiro é tratado (SNIS - 2014). A
região sudeste, que possui os melhores índices, trata 43% de seu esgoto ao passo que a região
norte trata apenas 14% de todo seu esgoto gerado. Dessa forma, há progressiva contaminação
das águas superficiais e subterrâneas devido à deficiente infraestrutura do sistema de
esgotamento sanitário (FUNASA – Fundação Nacional de Saúde; Ministério de Saúde, 2002).
Nesse contexto, o Brasil ainda possui poucos estudos sobre a ocorrência de Giardia em águas
superficiais não tratadas. (Franco et al, 2001).
Bacias Hidrográficas da Região Metropolitana de Campinas
A Região Metropolitana de Campinas (RMC) é composta por 20 cidades e possui
aproximadamente 2.800.000 habitantes, sendo a nona maior região metropolitana do país. A
cidade de Campinas, com 1.080.999 habitantes e representando 0,96% do PIB brasileiro,
constitui-se como a mais dinâmica da RMC e está assentada sobre três bacias hidrográficas
(Bacia do Rio Atibaia, Bacia do Ribeirão Quilombo e Bacia do Rio Capivari). Todas as bacias
convergem suas águas para o Rio Tietê e, em sequência, para o Rio Paraná. O Ribeirão
Anhumas, pertencente à bacia do Rio Atibaia, é formado pela união dos córregos Proença e
Serafim e passa pela região mais urbana e industrializada de Campinas antes de desaguar no
15
Rio Atibaia (IBGE, 2010). O Rio Atibaia é um dos rios pertencentes à bacia hidrográfica dos
rios Piracicaba, Capivari e Jundiaí, a qual também é formadora dos reservatórios do Sistema
Cantareira, que abastece 52% da Região Metropolitana de São Paulo. Nesse rio, ocorre
captação de 95% da água utilizada no abastecimento de água da cidade de Campinas, realizada
pela Sociedade de Abastecimento de Água e Saneamento S/A (SANASA).
Origem Evolutiva e Diversidade Genética de Giardia duodenalis
A origem evolutiva de Giardia tem sido muito debatida, embora exista um razoável
número de evidências de que esse protozoário seja um ramo primitivo da divisão dos
eucariotos, o que o torna um organismo chave para o entendimento da evolução das células
eucarióticas. A ausência de importantes organelas eucarióticas como mitocôndrias e
peroxissomos e um sistema pouco desenvolvido de membranas intracelulares são evidências
que colocam esse protozoário como um eucarioto primitivo (Thompson e Monis, 2004). A
identificação de genes relacionados à mitocôndria, bem como a demonstração da existência de
mitossomos, uma organela similar às mitocôndrias envolvida com maturação proteica
relacionada a ferro-enxofre propõe que a ausência de mitocôndria em Giardia talvez seja
derivada (Tovar et al, 2003).
Giardia apresenta dois núcleos diploides (2N) bastante similares e transcricionalmente
ativos (Morrison et al, 2007) em seu estado vegetativo (trofozoítos). Nesse estádio, seu
conteúdo genético se duplica e o organismo se torna tetraploide (4N) e, em seguida, a célula se
torna octaplóide antes da divisão binária em dois novos trofozoítos (4X2N e em seguida duas
células 2X2N). Durante o processo de formação do cisto, o trofozoítos passa por dois
processos consecutivos de duplicação (4X2N – 4x4N) e o cisto totalmente formado possui
quatro núcleos 4N. Assim, a célula nesse momento é 16N. Posteriormente, inicia-se o processo
de formação de trofozoítos, no qual são geradas quatro células contendo dois núcleos diploide
cada (Bernander et al, 2001). Uma ilustração do ciclo é apresentada na Figura 2.
16
Figura 2. Ilustração do ciclo de vida de Giardia duodenalis indicando a variação na ploidia do
organismo ao longo de seu ciclo (Extraído de Bernander et al, 2001).
A detecção de variação em Giardia a partir de marcadores moleculares
As metodologias parasitológicas tradicionalmente utilizadas pelos laboratórios
(métodos de concentração seguidos por coloração e ensaios de determinação antigênica) não
são aptas para separar as espécies de Giardia e nem seus grupos genéticos. As metodologias
moleculares, através da utilização de enzimas, antígenos e análises baseadas em DNA possuem
grandes vantagens como especificidade, sensibilidade e rapidez quando comparadas às
metodologias tradicionais (Bertrand et al, 2007). Além disso, marcadores moleculares são
ferramentas robustas que podem apresentar maior poder de discriminação na caracterização de
um determinado organismo.
Em 1989, Andrews et al. foram os primeiros a detectar a existência de quatro principais
grupos dentro da espécie G. duodenalis através de técnicas moleculares, ao examinar cinquenta
diferentes enzimas como marcadores genéticos. O trabalho foi motivado pelas recentes
17
detecções de variabilidade dentro da espécie G. duodenalis no que se referia a antígenos (Smith
et al, 1982), alozimas (Baveja et al, 1986) e dados genômicos (Nash et al, 1985). Esses quatro
grupos seriam mais tarde chamados de AI, AII, BIII e BIV (Traub et al, 2004).
Homan et al, 1992 também identificaram, através de alozimas e RFLP, variação dentro
da espécie G. duodenalis que foi denominada grupo Polish e grupo Belgian, mais tarde
chamados de grupos genéticos A e B, respectivamente. No mesmo ano, Nash et al. também
descreveram a presença de pelo menos três grupos dentro da espécie e encontraram uma
marcador (GLORF-C4) restrito a um único grupo. O termo genetic assemblages foi utilizado
pela primeira vem por Mayrhofer et al,(1995), que analisaram 27 locos enzimáticos e detectou
a existência dos grupos AI e AII, BIII e BIV ao comparar a variação existente dentro da
espécie G. duodenalis e também da espécie G. muris.
Um gene específico de Giardia, denominado beta-giardin e associado com a formação
dos microtúbulos foi sequenciado por Baker et al.(1988) e utilizado por Mahbubani et
al.(1992) para desenvolver uma reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction –
PCR) que fosse específica para o gênero Giardia e outra para a espécie G. duodenalis. Para
tanto, diferentes espécies de Giardia e diversos organismos foram utilizados, até que se
chegassem aos iniciadores GGL639-658, GGR789-809, GGL405-433, GGR592-622. Tais
marcadores são utilizados até hoje para diagnóstico molecular de giardiose (Guiguet-Leal et al,
2011).
Identificação de subestruturação e grupos hospedeiro-específicos
Após a maior parte dos trabalhos, no final dos anos 80 e início dos anos 90, detectarem
variação com marcadores enzimáticos, a segunda metade dos anos 90 foi marcada pelo uso
definitivo dos marcadores genômicos. Monis et al, (1996) utilizaram a técnica de PCR-RFLP e
conseguiram identificar os quatro grupos já citados apenas com a variação do gene glutamato
desidrogenase (gdh). Assim, a mesma variação identificada com marcadores enzimáticos
também foi verificada com marcadores genômicos o que definitivamente evidenciou a
existência de dois grupos principais, embora outros não estivessem descartados.
No ano seguinte, Hopkins et al,(1997) trabalharam com o gene SSU-rRNA através de
amplificação e sequenciamento de uma região de 292pb e conseguiram identificar, além de
dois grupos genéticos distintos oriundos de amostras clínicas humanas, dois grupos distintos de
18
amostras recuperadas de fezes de cães. Foi o primeiro trabalho que se propôs a comparar
amostras humanas e de cães que viviam em uma mesma localidade. No ano seguinte, Monis et
al,(1998) utilizaram 26 locos de alozimas, além de análises filogenéticas com fragmento do
gene gdh e também identificaram, não só os dois grupos isolados a partir de amostras clínicas
humanas (grupos A e B), como também dois grupos obtidos apenas de amostras obtidas de
cães (denominadas grupos C e D).
Em um dos trabalhos mais citados e completos da década, Monis et al.(1999) utilizaram
quatro genes conservados (glutamato desidrogenase, triose fosfato isomerase, fator de
elongação 1α e 18S ribossomal RNA), além de dados de eletroforese após análise de 21
enzimas e concluíram que G. duodenalis poderia ser considerado um grupo monofilético e que
possuía pelo menos sete linhagens monofiléticas no interior desse grupo. Para tanto, foram
utilizadas amostras de G. duodenalis obtidas de humanos, cães, gatos, porcos e ratos, além de
amostras de G. ardeae obtidas de uma garça azul, e G. muris obtida de ratos. Dessa forma,
ficaram definidos os grupos genéticos E (que já havia sido proposto por Ey, 1997), que parasita
gado e outros animais de campo, grupo F que parasita felinos e grupo G que parasita ratos.
Além disso, em todas as filogenias geradas foi identificada uma proximidade maior entre os
grupos A, E e F. Já a associação entre os clados B, C, D e G, apesar de recorrente, não foi
considerada tão suportada entre as filogenias. Baseado na alta taxa de variação encontrada no
gene tpi, Sulaiman et al.(2003) desenvolveram uma nested-PCR, cujo sequenciamento do
produto da segunda amplificação permite a discriminação dos sete grupos genéticos de Giardia
duodenalis.
Na década seguinte, grande parte dos projetos envolvendo G. duodenalis buscou
caracterizar amostras dentre os grupos propostos por Monis et al.(1999). Traub et al.(2004)
concluíram que os genes SSU r-RNA e ef1-α apresentavam uma baixa resolução para
discriminar esses grupos, quando comparados ao gene tpi.
O sequenciamento de fragmento do gene beta-giardin também passou a ser utilizado
como ferramenta para identificar os grupos genéticos de G. duodenalis. Dentro do grupo A,
além dos dois genótipos comumente encontrados (AI e AII), um novo genótipo (AIII) também
foi encontrado inicialmente associado a animais ungulados. Em relação às amostras
pertencentes ao grupo B, quatro genótipos foram determinados (BI, BII, BIII e BIV). Todos os
grupos descritos foram identificados a partir de amostras clínicas humanas (Caccio et al, 2002).
19
Lasek-Nesselquist et al, (2010), ao pesquisarem cistos de Giardia provenientes de
vertebrados marinhos, descreveram a o grupo genético H, descrito como uma variação do
grupo G. Entretanto, sua identificação foi feita apenas com base no sequenciamento de
fragmento do gene gdh, de forma que sequenciamentos com outros marcadores devem ser
realizados para que a comunidade científica passe a utilizar essa novo grupo (Feng e Xiao,
2011).
Diversidade genética e potencial zoonótico de Giardia duodenalis
A transmissão da doença por veiculação hídrica, contaminação alimentar e contato com
animais tem sido um grande campo para estudos epidemiológicos. Embora seja muito
discutido, há evidências muito fortes que comprovam o potencial zoonótico de Giardia, no
qual, um cisto de uma determinada linhagem, pode ser responsável pela contaminação de
diferentes hospedeiros como cães, gatos, bovinos e humanos (Thompson, 2004).
Após diversos ensaios moleculares com diferentes marcadores moleculares, foi
determinado que G. duodenalis apresenta grande diversidade genética, de maneira, que seus
isolados foram divididos atualmente em oito grupos genéticos (A-H). Os grupos genéticos A e
B parasitam uma ampla gama de hospedeiros como cães, gatos, animais de campo e outros
mamíferos. São os únicos grupos que comumente parasitam humanos, de modo que existe uma
constante preocupação com o potencial zoonótico de seus isolados. Esses grupos apresentam
subestruturação e aproximadamente 75% dos isolados do grupo AI costumam ser identificados
em parasitas cujos hospedeiros não são humanos. Já as amostras de Giardia obtidas de
humanos apresentam perfil oposto, sendo responsáveis por 75% dos isolados do grupo AII, de
forma que o restante é encontrado em animais (Sprong et al, 2009). O grupo AIII costuma ser
restrito a ruminantes selvagens.
Os genótipos BIII e BIV têm sido observados em bois, cães, cavalos e macacos, além
de humanos. Nesses últimos, esses genótipos têm sido encontrados em frequências semelhantes
(Caccio e Ryan, 2008 e Bowman e Lucio-Forster, 2010). Em animais selvagens como castores
e ratos selvagens, o genótipo BIV é predominantemente encontrado. Já macacos e animais
marinhos são ambos infectados pelos grupos BIII e BIV. Assim, sob a perspectiva de genótipos
que já foram identificados tanto em humanos quanto em outros animais, os grupos AI, AII,
BIII e BIV apresentam potencial zoonótico.
20
Os demais grupos genéticos apresentam maior uniformidade quanto aos hospedeiros
parasitados e são considerados hospedeiro-específicos. Os grupos C e D costumam parasitar
cães, gatos, lobos e coiotes, o grupo E costuma ser encontrado em animais de campo como bois
e porcos, o grupo F é comumente encontrado em gatos. Embora sejam considerados eventos
extremamente raros e pouco documentados, genótipos dos grupos C, D, E e F já foram
detectados em amostras obtidas de humanos (Gelanew et al, 2007, Sprong et al, 2009 e
Soliman et al, 2011). O grupo G e o grupo H, até o presente momento, foram identificados
apenas em ratos e vertebrados marinhos, respectivamente (Monis et al, 1999, Thompson et al,
2000 e Lasek-Nesselquist et al, 2010).
Estudos de Giardia duodenalis com ferramentas moleculares realizados no
Brasil
No Brasil, poucos estudos moleculares com Giardia foram desenvolvidos até o
presente momento. Em um estudo que analisou uma sequência do gene beta-giardin (bg) de
amostras positivas para G. duodenalis oriunda de cães, gatos e humanos da cidade do Rio de
Janeiro, somente o grupo A foi encontrado, sendo que o genótipo AI (que apresenta potencial
zoonótico) foi verificado em humanos, cães e gatos. Algumas amostras humanas também
evidenciaram a presença do genótipo AII (humano específico) e os demais grupos não foram
encontrados (Volotão et al, 2007). Já na cidade de São Paulo, ao utilizar o gene glutamato
desidrogenase (gdh), foi verificada a presença dos grupos AII e B em humanos, F e AI em
gatos, C e D em cães e E e AI em gados (Souza, et al 2007).
Ao analisar amostras provenientes de macacos Bugio (Alouatta clamitans), Volotão et
al, (2008) identificaram todas as amostras positivas pertencentes ao subgrupo AI. Leal et al,
(2011) demonstraram a presença de G. duodenalis em moluscos bivalves comestíveis em um
complexo estuarino localizado no Vale do Ribeira, São Paulo. Souza et al, (2012),
caracterizaram uma amostra hídrica através do gene bg como pertencente ao grupo genético A.
Essa amostra era proveniente do Rio Bucheler, intensamente contaminado e relativamente
próximo a tanques de cultivo de ostras em Florianópolis, Santa Catarina. Em 2013, Santos et
al, demonstraram infectividade de cistos de G. duodenalis caracterizados como pertencentes ao
grupo genético A, através de sequenciamento do fragmento do gene gdh em amostras obtidas
21
de efluente de esgoto de uma estação de tratamento de esgoto da cidade de Campinas, São
Paulo.
Genotipagem multilocos em Giardia duodenalis
Diferentes níveis de resolução podem ser abordados quando se deseja caracterizar
cistos de Giardia duodenalis. Ao longo dos anos, uma maior subestruturação foi encontrada,
acrescentando maior complexidade à genotipagem desse parasito.
Inicialmente, os cistos de G. duodenalis podem ser caracterizados em seus respectivos
grupos genéticos (genetic assemblages), através da comparação com linhagens de referência
disponibilizadas em bancos de dados (A-H). Um segundo nível de resolução pode ser abordado
quando se analisa sequências de isolados pertencentes aos grupos A e B. Estes foram
subestruturados em subgrupos (subassemblage) denominados AI, AII, AIII, BIII e BIV
baseados na avaliação de polimorfismos em sítios específicos que caracterizam cada um desses
grupos. Visto que existe alta heterogeneidade de sequências dentro de cada subgrupo, a
denominação genótipos ou subtipos (subtypes) foi atribuída aos grupos de sequências que
compartilham exatamente os mesmos polimorfismos. Essa abordagem pode ser utilizada para
amostras pertencentes a todos os grupos genéticos. A análise é realizada individualmente em
um determinador marcador e seus resultados informam os haplótipos encontrados em cada
marcador.
Um quarto nível de complexidade de análise é estabelecido ao se unificar os dados
obtidos por diferentes marcadores. Tal abordagem, denominada genotipagem multilocos
(MLG), tem sido sugerida para Giardia para, entre outras possibilidades, estimar a ocorrência
de transmissão zoonótica através da comparação de genótipos multilocos (MLGs) provenientes
de isolados humanos e animais (Caccio et al, 2008; Sprong et al, 2009; Lebbad et al, 2010;
Gomez-Munoz et al, 2012). Dessa forma, isolados que podem ser idênticos para um
determinado marcador podem ser diferentes para outro. A análise conjunta dos marcadores
permite a caracterização dos isolados em genótipos distintos e os genótipos multilocos mais
comuns em uma determinada região podem ser determinados.
A utilização de apenas um loco tem gerado preocupações quanto às limitações nas
informações adquiridas para identificação dos grupos genéticos, tanto em amostras humanas,
quanto animais (Caccio, et al, 2008). Por outro lado, a utilização de MLGs pode melhorar
22
significativamente a atribuição de cada isolado a um subtipo específico e contribuir com novas
informações para esclarecer a epidemiologia da giardiose (Gomez-Munoz et al, 2012, Caccio
et al, 2008).
Infecções mistas e recombinação genética em Giardia
Dois fatos atuais e recorrentes tem influenciado a interpretação de dados genotípicos e
tem atraído atenção de grande parte dos pesquisadores da área. São eles: a ocorrência de perfis
heterogêneos em determinadas posições de nucleotídeos (picos duplos) e também a
insegurança na atribuição de um isolado a um determinado grupo genético (determinado pela
identificação de mais de um grupo genético em uma mesma amostra), o que sugere a
possibilidade de trocas genéticas (genetic exchanges) em Giardia. Para explicar esses dois
fenômenos, existem duas possibilidades. A primeira seria a existência de infecções mistas, nas
quais o mesmo hospedeiro estaria contaminado com diferentes grupos genéticos, subgrupos ou
genótipos de Giardia duodenalis. A segunda possibilidade é que esse fenômeno realmente
corresponda à variação alélica, de forma que trocas de material genético, recombinação ou
introgressão gênica possam estar presentes e representar mecanismos pelos quais Giardia pode
apresentar variação genética, além de mutações acumuladas nos dois núcleos ao longo da
evolução (Ankarklev et al, 2012 e Caccio e Sprong, 2010).
Independentemente de qual mecanismo seja o responsável pela dificuldade na
determinação de um genótipo ou grupo genético, os isolados que costumam apresentar essas
características não são considerados para genotipagem multilocos, uma vez que não se pode
cometer o erro de unir genótipos de cistos diferentes. Embora tais casos possam representar
trocas genéticas entre cistos ou mesmo eventos de recombinação ou introgressão, a
possibilidade de infecções mistas não pode ser excluída e parece, na maioria dos casos, ser a
principal responsável por esses perfis heterogêneos encontrados (Sprong et al, 2009; Beck et
al, 2012). Assim, para completa distinção entre infecções mistas e isolados recombinantes faz-
se necessário a análise de células únicas, cuja possibilidade já foi demonstrada (Miller e
Sterling, 2007 e Ankarklev et al, 2012).
Tradicionalmente, as espécies do gênero Giardia são consideradas como desprovidas
de reprodução sexual em seu ciclo de vida (Adam, 2001). Muitos estudos recentes têm
desafiado esse paradigma através de evidências que corroboram a existência de trocas
23
genéticas em G. duodenalis o que leva a importantes implicações na taxonomia, genética de
populações, biologia evolutiva e epidemiologia de Giardia (Luján e Svärd, 2011). Essas
evidências têm mostrado possíveis recombinações em diferentes níveis. Primeiro, entre
genótipos AII, locos de diferentes cromossomos apresentarem diferentes árvores filogenéticas
indicando que não compartilham da mesma história evolutiva (Cooper et al, 2007).
Posteriormente, foram detectadas evidências de recombinação entre subgrupos AI e B ao
avaliar distintos locos (Teodorovic et al, 2007) e, por fim, entre diferentes grupos genéticos
(Lasek-Nesselquist et al, 2009). Ao encontrar cinco genes envolvidos especificamente na
meiose no genoma de Giardia duodenalis, Ramesh et al (2005) sugeriram que Giardia seja
capaz de realizar meiose e reprodução sexuada. A possibilidade de recombinação genética em
Giardia aparece cada dia mais como um cenário possível (Siripattanapipong et al, 2011 e
Caccio e Sprong, 2010).
Ensaios de amplificação específicos aos grupos genéticos
Ao longo do desenvolvimento de marcadores moleculares para identificação e
caracterização de grupos genéticos de Giardia duodenalis, o foco no desenvolvimento desses
marcadores sempre foi baseado em iniciadores denominados genéricos devido a sua
capacidade de anelamento em qualquer grupo genético da espécie G. duodenalis. Apenas o
sequenciamento da região interna aos iniciadores (ou a clivagem específica por enzimas de
restrição) é que determinavam a atribuição a um determinado grupo. Ao longo dos últimos
anos, novos estudos têm mostrado vantagens ao se utilizar iniciadores específicos para
determinados grupos de forma que, amostras anteriormente caracterizadas como negativas, tem
sido genotipadas e muitos novos casos de infecções mistas têm sido descritos.
Leveck et al, (2009) identificaram um número elevado de infecções mistas em amostras
obtidas de primatas não humanos (NHP) ao utilizarem iniciadores específicos para os grupos
genéticos A e B. Os autores sugerem o uso de iniciadores específicos como uma forma de
eliminar o viés causado por iniciadores genéricos que costumam apresentar amplificação
preferencial por genótipos em maior concentração na amostra. Resultados semelhantes foram
obtidos por Anklarkev et al, (2012) ao comparar resultados obtidos com iniciadores genéricos
e específicos. Quatro novas infecções mistas foram encontradas apenas quando utilizados os
iniciadores específicos para os grupos genéticos A e B.
24
Lebbad et al, (2010) detectaram limitações na amplificação e sequenciamento de
isolados pertencentes aos grupos genéticos C e D, com iniciadores descritos por Sulaiman et al,
(2003), que amplificavam fragmentos do gene tpi. Foi realizado o sequenciamento do
fragmento maior da nested PCR e foi verificado que as amostras pertencentes aos grupos C e D
possuíam polimorfismos na região de anelamento dos iniciadores da segunda reação da nested-
PCR, o que impedia a amplificação destes grupos. Após desenhar novos iniciadores específicos
para esses dois grupos e repetir a análise, amostras identificadas anteriormente como negativas
foram genotipadas e algumas amostras que já haviam sido caracterizadas, foram novamente,
porém com o acréscimo de outro grupo (C ou D).
Ao analisar amostras pertencentes as dois grupos que comumente são encontradas em
humanos (A e B), Vanni et al, (2012), desenharam novos iniciadores específicos para os
grupos A e B e conseguiram obter alta sensibilidade. Ao misturar isolados dos genótipos A e
B, foi possível amplificar ambos mesmo quando estavam desbalanceados em uma proporção
9:1. Em outros marcadores, foi possível verificar amplificação preferencial por um dos dois
grupos ou mesmo por grupos genéticos que estavam mais amostrados. A utilização de
iniciadores grupo-específicos tem mostrado bastante sucesso para identificar novos casos de
infecções mistas (mais comuns do que reportados na literatura com iniciadores genéricos),
além de identificar grupos genéticos diferentes, que podem estar presentes em menor
quantidade em uma amostra e, provavelmente, não seriam detectados pelos iniciadores
genéricos.
Genomas de protozoários parasitas
Com o advento dos projetos de sequenciamento em larga escala, diversos genomas de
protozoários parasitos foram sequenciados na última década, o que resultou em grande
acúmulo de informações sobre esses organismos, causadores de várias doenças em humanos e
outros animais.
O genoma de Plasmodium falciparum, publicado em 2002 por Gardner et al, foi o
primeiro genoma de um protozoário parasita sequenciado completamente (Taco et al. 2006). O
genoma apresenta aproximadamente 5.300 genes distribuídos em 14 cromossomos com um
total de 22,8 MB, o dobro do tamanho da levedura Schizosaccharomyces pombe (Gardner et al,
25
2002). A maior expectativa é que essas sequências poderão oferecer novos alvos para drogas e
vacinas anti-maláricas (Ashburner, 2002).
Em 2004 foi publicado o genoma de duas espécies de Cryptosporidium,
Cryptosporidium parvum (Abrahamsen et al, 2004) e Cryptosporidium hominins (Xu et al,
2004). Ao ser comparado com o genoma de P. falciparum, o genoma das espécies de
Cryptosporidium apresenta algumas características interessantes como tamanho reduzido (9
MB), alta densidade gênica e elevado conteúdo de GC. A distribuição das anotações realizadas
no Gene Ontology (GO) para os organismos Cryptosporidium, Plasmodium e Saccharomyces é
bastante semelhante, o que sugere que suas diferenças fenotípicas resultem de famílias gênicas
não conservadas ou mesmo não descritas, ao invés de especializações funcionais de famílias
gênicas conservadas (Xu et al, 2004).
No ano seguinte, foram concluídos os projetos-genoma das mais importantes espécies
dentre as espécies da ordem Kinetoplastida. O genoma de Leishmania major, publicado em
2005 por Ivens et al, apresentava-se como o maior genoma de protozoários até a data de sua
publicação com 32,8 MB e mais de 8.000 genes ao longo de seus 36 cromossomos. O tamanho
foi superado pelo genoma de Trypanosoma cruzi com 60 MB, publicado no mesmo ano.
Surpreendentemente, o genoma de Trypanosoma brucei (Berriman et al, 2005) apresenta
menos da metade do tamanho do genoma de T. cruzi (26 MB). Essa discrepância pode ser
explicada pela alta quantidade de sequências repetitivas no genoma de T cruzi, que
representam mais de 50% de seu genoma (El-sayed et al, 2005). Os genomas das duas espécies
de Trypanosoma sequenciadas apresentam consideráveis frequências de polimorfismos, o que
não ocorre em Leishmania, com menos de 0,1%. Por outro lado, a maioria dos genes de
Leishmania major possuem ortólogos no genoma das duas espécies de Trypanosoma embora
910 genes não tiveram seus ortólogos encontrados (Ivens et al, 2005).
Em 2007, foi publicado por Carlton et al o genoma de Trichomonas vaginalis que, ao
lado de Giardia duodenalis, é considerado um dos mais primitivos organismos do grupo dos
eucariotos. O genoma de Trichomonas é o maior já sequenciado dentre os protozoários com
aproximadamente 160 MB. Assim como ocorre em T. cruzi, esse tamanho pode ser devido á
grande quantidade de elementos repetitivos, que ocupam mais de 65% de seu genoma. A
quantidade de genes em seu genoma é surpreendente. Foram estimados mais de 59 mil genes
codificadores de proteínas ao longo de seus seis cromossomos, o que coloca esse protozoário
26
como o dotado de uma das maiores capacidades de codificação entre os eucariotos.
Surpreendentemente, a maquinaria de transcrição de T. vaginalis se aproxima mais dos
metazoários quando comparada com a maquinaria dos protistas. Além disso, foram
encontrados 152 genes indicadores de uma possível transferência lateral entre procariotos e
eucariotos (Carlton et al, 2007).
Ao comparar sequências oriundas de genomas primitivos (bactéria, archaea e eucariotos
primitivos) com sequências de genomas mais derivados (eucariotos pluricelulares), são
perceptíveis as mudanças em direção á complexidade. Essas mudanças incluem aumento no
número de genes, íntrons, duplicação de sequências e o surgimento de elementos transponíveis
(Lynch e Conery, 2003). Nesse contexto, a existência de um genoma completo de organismos
eucariotos primitivos como diplomonadidas (Giardia), Parabasalides (Trichomonas) e
Microsporídia (Encephalitozoon) é de extrema importância para o entendimento da evolução
dos eucariotos. Um exemplo é a presença do gene cpn60 (mitochondrial-like) e um mitossomo
em Giardia duodenalis. Essas descobertas fornecem subsídios para a hipótese de que Giardia
duodenalis adaptou-se ao ambiente micro-aerofílico, ao invés da hipótese que sugere a
divergência do grupo dos eucariotos primitivos antes da endosimbiose do ancestral
mitocondrial (Morrison et al, 2007). A descoberta do gene mitocondrial hsp60 em Entamoeba
histolytica também contribuiu para essa nova hipótese. Os organismos tradicionalmente
denominados Archezoa (diplomonadidas, Parabasalides e Microsporídia) pela ausência de
mitocôndrias e de vias metabólicas relacionadas, não só possuem proteínas derivadas de
mitocôndrias, como também possuem uma organela de dupla membrana correspondente.
Enquanto Entamoeba spp, Giardia spp e Trichomonas spp vivem em habitats com muito
pouco oxigênio, de modo a não suportar a respiração aeróbica, Cryptosporidium spp e
Encephalitozoon spp reduziram drasticamente suas capacidades metabólicas durante a
adaptação a um estilo de vida intracelular (Embley e Martin, 2006).
A cada dia, novas hipóteses sugerem um novo posicionamento entre os organismos
eucariotos primitivos. As informações filogenéticas obtidas através da análise de genomas e de
seus genes ainda não são totalmente consistentes com as hipóteses acerca da origem dos
eucariotos. Sem dúvida, os genomas refletem um testemunho sobre a origem eucariótica, mas,
novas abordagens e mais rigorosa atenção aos detalhes de inferência filogenética serão
necessárias para decifrar essa mensagem (Embley e Martin, 2006).
27
Projetos genoma de Giardia duodenalis
Cinco genomas, correspondentes a quatro isolados distintos de Giardia duodenalis
(WB_AI, GS_B, P15_E DH_AII) foram publicados nos últimos anos (Morrison et al, 2007,
Franzén et al, 2009, Jerlström-Hultqvist et al, 2010 e Adam et al, 2013). O primeiro genoma de
Giardia a ser sequenciado foi o isolado WB, pertencente ao grupo AI. Organismo chave dentre
os eucariotos, devido à ausência de mitocôndrias e peroxissomos, seus 11,7 MB possuem alta
densidade gênica (0,58) com mais de 6.000 genes distribuídos em cinco cromossomos. Ao
comparar com outros genomas de organismos correlatos, o genoma WB é considerado
compacto em estrutura e conteúdo e possui uma simplificada maquinaria para replicação de
DNA, transcrição, processamento de RNA e para a maioria dos processos metabólicos.
Também foram encontradas repetições do motivo AC, muito comuns em íntrons de
Trichomonas, o que sugere um mecanismo de splicing em Giardia.
O genoma do isolado GS, do grupo genético B apresentou abundante heterozigosidade
alélica e 28 novos genes em relação ao genoma WB. A identidade de nucleotídeos e de
aminoácidos em regiões codantes foi de 77% e 78%, respectivamente (Franzén et al, 2009). O
genoma GS_B é o maior (~12 MB) dentre todos os sequenciados até o presente momento e
possui a maior taxa de heterozigosidade (0,425%) entre todos os sequenciados.
O genoma do isolado P15_E, foi obtido através do sequenciamento de Giardia
proveniente de um leitão e apresentou 5012 genes, a maioria destes conservados em
comparação aos outros genomas publicados. O genoma P15_E apresenta um tamanho
intermediário (~11,5MB) e grande número de arranjos cromossômicos em comparação aos
demais. O genoma DH_AII é o menor dentre os publicados (~10,7 MB), com baixa
heterozigosidade, embora superior ao genoma WB. A comparação entre esses dois genomas
demonstrou maior similaridade entre eles de forma que existe considerável sintenia.
Assim como Trichomonas, Giardia também possui grande parte de seus genes
relacionados a síntese de proteínas kinases (kinoma). Mais de 50% das sequencias codantes do
genoma WB anotadas não foram similares com nenhuma outra proteína nos bancos de dados
públicos, embora alguns genes com anotação funcional podem representar transferência gênica
lateral de bactérias ou Archeae. A presença de dois núcleos sugere a possibilidade de uma
acentuada heterozigosidade no genoma. Notavelmente, essa heterozigosidade é baixa (com
28
variação entre os grupos genéticos) o que sugere a existência de um mecanismo que mantenha
a homozigose entre os núcleos (Morrison et al, 2007).
A comparação entre os genomas de Giardia duodenalis permitiu identificar uma
significante variação entre os grupos tanto em termos de conteúdo gênico, polimorfismos,
estrutura de cromossomos e repertório de moléculas de superfície (Jerlström-Hultqvist et al,
2010). Os genomas estão depositados no Giardia Database (GiardiaDB), uma iniciativa do
National Institute of Health (NIH) que participa do Eukaryotic Pathogen Database Resources.
Nos próximos anos, será necessário um vasto trabalho de bioinformática para que se possa
conhecer a função de tais sequências no genoma. O banco pode ser acessado em
http://www.giardiadb.org/giardiadb/.
Marcadores moleculares do tipo microssatélites (SSR)
Os genomas eucariotos são povoados por sequências simples repetidas, as quais
consistem em um a seis nucleotídeos repetidos em tandem. Essas regiões são denominadas
microssatélites, SSR (Simple Sequence Repeats) ou STR (Short Tandem Repeat). As
sequências de DNA que flanqueiam os microssatélites são geralmente conservadas entre os
indivíduos de uma mesma espécie o que permite seleção de iniciadores específicos que
amplificam, via PCR, fragmentos contendo o DNA repetitivo em todos os genótipos (Borém e
Caixeta, 2006).
Os microssatélites são considerados marcadores ideais para estudos populacionais e de
diversidade. Por serem altamente polimórficos, multialélicos, requererem pequena quantidade
de DNA inicial, apresentarem herança mendeliana codominante, serem neutros em relação á
seleção e estarem distribuídos ao acaso pelo genoma têm sido amplamente utilizados nesses
estudos (Powell, 1996).
Microssatélites já foram observados em diversos organismos como seres humanos,
plantas, baleias, Drosophila, camundongos, bovinos, caprinos, entre outros (Ferreira e
Grattapaglia, 1998). A presença desse marcador foi detectada também em protozoários. De 224
microssatélites testados em Plasmodium falciparum, 188 apresentaram polimorfismos entre as
diferentes linhagens do parasita (Su e Wellems, 1996). Oliveira et al (1998), encontraram
repetições (CA)n no genoma de Trypanosoma cruzi que se mostraram polimórficas e
possibilitaram análise da estruturação populacional desse parasita. A análise de repetições de di
29
e trinucleotídeos em Cryptosporidium parvum permitiu a caracterização dos isolados de
maneira que estes foram agrupados em subgrupos mais próximos do ponto de vista geográfico
(Caccio et al, 2000). Esses estudos demonstraram êxito na caracterização da diversidade desses
organismos, mas ainda nenhum trabalho foi relatado sobre de marcadores moleculares
microssatélites em Giardia spp.
A importância de se utilizar marcadores de alta resolução refere-se ao fato de que eles
permitem que sejam identificados variações de genótipos não detectados pelos marcadores
conservados convencionais. Essa identificação permite, além de genotipar o parasito em
subtipos pré-existentes, caracterizar os indivíduos coletados em um nível maior de
discriminação o que pode ser explorado para investigar a epidemiologia da doença, o papel de
portadores assintomáticos e para rastreamento da doença através de água e alimentos
contaminados (Smith, et al, 2007).
Caccio e Ryan (2008) sugerem que sejam feitos estudos que busquem locos
hipervariáveis, que possam acessar mais profundamente as diferentes linhagens de Giardia, a
fim de monitorar a sua transmissão com mais precisão. Para organismos morfologicamente
idênticos, a utilização de marcadores de loco único pode levar a ambiguidades ou a conclusões
incorretas (Anderson, 2001). Além disso, o uso de novos marcadores pode permitir que
informações importantes sejam aferidas, como a estruturação dos grupos genéticos desse
protozoário e existência de recombinação entre diferentes linhagens. A vasta utilização de
microssatélites em estudos populacionais e sua presença em Giardia e em organismos
relacionados os colocam como marcadores ideais para a obtenção de tais informações.
Genética de populações aplicadas a organismos de interesse epidemiológico
Em genética de populações, uma população é definida através de um conceito amplo,
proposto por Dobzhansky, no qual um conjunto de indivíduos que se reproduzem
sexuadamente e compartilham a mesma base genética pertencem a uma mesma população. Em
micro-organismos e também em organismos parasitas, esse conceito torna-se mais complexo
uma vez que, tanto a distância geográfica, quanto o modo de reprodução, costumam apresentar
características únicas que tornam esses organismos complexos para estudos populacionais e de
diversidade genética.
30
Importantes conclusões podem ser obtidas a partir de estudos populacionais com
organismos de interesse epidemiológico. A estrutura genética restrita de Salmonella pode
indicar uma composição de populações clonais (Beltran et al, 1988). Uma extensa variação
alélica aliada à ausência de desequilíbrio de ligação pode sugerir a existência de uma
população altamente recombinante em Helicobacter pilori (Go et al, 1996). A avaliação da
diversidade haplotípica em conjunto com análises dos índices de fixação mostra o
estabelecimento de populações distintas do parasita Echinococcus após a introdução do
haplótipo fundador com estrita relação com movimentos antropogênicos (Sharma et al, 2013).
Dentre os estudos levantados, dois são aqui selecionados por possuírem características
semelhantes ao presente projeto.
Em um estudo que verificou a presença de Giardia duodenalis em duas espécies
diferentes de focas da costa oeste e leste dos Estados Unidos, foi verificada a possível
correlação entre diferentes haplótipos de Giardia com diferentes populações de focas (Lasek-
Nesselquist et al, 2010). A hipótese dos autores foi que, se fossem detectadas diferenças nos
haplótipos entre as diferentes populações, isso poderia indicar que a disseminação do parasito
estivesse atrelada a fatores relacionados à localização geográfica ou aos efeitos
comportamentais das focas na transmissão do parasito.
Os resultados do estudo mostraram que alguns haplótipos específicos estão diretamente
relacionados à localização das focas o que indica uma influência geográfica na aquisição do
parasito ou algum outro fator relacionado ao hábito do hospedeiro. A localização do
hospedeiro (costa leste ou oeste) foi o fator mais determinante verificado para aquisição do
parasito. A dinâmica populacional de G. duodenalis nos sistemas marinhos parece refletir a
interação entre um emaranhado de fatores (Lasek-Nesselquist et al, 2010).
Outro estudo populacional interessante foi realizado com diferentes espécies do
parasito pertencente ao gênero Opistorchis (Trematoda). Este organismo possui dois
hospedeiros intermediários (caramujos e peixes) e, após ingestão de pescado mal cozido, pode
infectar o homem e causar sérios prejuízos aos dutos biliares e vesícula biliar. Com a utilização
de marcadores mitocondriais e também nuclear (ITS), importantes informações sobre a
diversidade genética e estrutura populacional do parasito puderam ser estimadas (Brusentov et
al, 2013).
31
Os valores de diversidade nucleotídica e haplotípica foram baixos em todo o território.
Além disso, o haplótipo mais comum foi encontrado em todas as populações e a análise
molecular da variância (AMOVA) mostrou que a variabilidade genética está concentrada
dentro das populações e não entre as mesmas. O índice de fixação entre as diferentes
populações do parasito apresentou valores que variavam de 0,008 a 0,021, que também
evidencia a não diferenciação dessas populações. Dessa forma, os dados mostram que esse
parasito passou recentemente por um processo severo de gargalo populacional que foi seguido
por rápida expansão, a partir de um pequeno grupo de fundadores, com uma variação genética
bastante limitada (Brusentov et al, 2013).
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33
Objetivos
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35
OBJETIVOS
Principal
Contribuir para o conhecimento da diversidade genética de Giardia duodenalis, visando ao
desenvolvimento de uma melhor compreensão da epidemiologia molecular do organismo.
Específicos
Caracterizar a diversidade genética de Giardia de amostras clínicas e ambientais e
utilizar ao dados obtidos para caracterizar o perfil genético de distribuição do parasito
bem como o potencial zoonótico dos isolados na Região Metropolitana de Campinas;
Comparar populações de Giardia duodenalis originárias de amostras clínicas e
ambientais de uma região metropolitana a fim de verificar compartilhamento de
haplótipos e similaridade genética entre as populações;
Identificar marcadores moleculares microssatélites de G. duodenalis nos genomas
publicados presentes no GiardiaDB;
Desenvolver e caracterizar novos marcadores microssatélites específicos e
compartilhados entre grupos, presentes em G. duodenalis.
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Capítulo I
Genetic Diversity of Giardia duodenalis: Multilocus Genotyping
Reveals Zoonotic Potential between Clinical and Environmental
Sources in a Metropolitan Region of Brazil
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Supporting Information
Phylogenetic analysis of the VET group. Phylogenetic analysis of the Giardia triose phosphate isomerase (tpi) gene from the VET group. The alignment was generated with ClustalX and analyzed using maximum likelihood with the Tamura-Nei 93 model with gamma correction (MEGA v5.05). Trees derived using neighbor-joining produced a similar topology. Bootstrap values>50% (10,000 replicates) are shown beside each node. Accession numbers for tpi reference sequences are shown beside the corresponding assemblage.
66
Table S1. Accession numbers for gene sequences obtained from NCBI.
gdh bg tpi
AI L40509 M36728.1 L02120.1
AII L40510 AY072723.1 U57897.1
AIII - DQ648777.1 DQ650648.1
BIII AF069059.1 AY072726.1 AY228628.1
BIV L40508.1 AY072725.1 L02116.1
C U60985.1 JF422719.1 AY228641.1
D U60986.2 AY545647.1 DQ246216.1
E AY178740 AY072729.1 AY655705.1
F AY178744 AY647264.1 AF069558.1
G AY178748.1 EU769221.1 EU781013.1
G. muris - EF455599.1 AF069565.1
G. ardeae AF069060.2 - AF069564.1
G. microti - - AY228649.1
67
Table S2. Molecular characterization and accession numbers of isolates
obtained from hospitals based on sequencing data from gdh, bg, and tpi
genes.
Sample gdh GenBank bg GenBank tpi GenBank
HC01 A JN116442 - - AII KF922892
HC02 A JN116443 - - C KF922893
HC03 - - - - - -
HC04 - - - - C KF922894
HC05 - - - - - -
HC06 - - - - AII KF922895
HC07 B JN116444 BIII KF922976 BIV KF922896
HC08 - - - - C KF922897
HC09 - - AII KF922977 BIV KF922898
HC10 A JN116445 AII KF922978 AII KF922899
HC11 A KF923021 AII KF922979 AII KF922900
HC12 A JN116446 AII KF922980 AII KF922901
HC13 A JN116447 - - C KF922902
HC14 - - - - BIV KF922903
HC15 B JN116448 - - BIV KF922904
HC16 B JN116449 - - BIV KF922905
HC17 - - - - BIV KF922906
HC18 A JN116450 - - - -
HC19 - - - - C KF922907
HC20 - - - - BIV KF922908
HC21 B JN116451 - - AII KF922909
HC22 A JN116452 - - AII KF922910
HC23 B JN116453 - - AII KF922911
HC24 - - - - BIV KF922912
HC25 B JN116454 B KF922981 BIV KF922913
HC26 - - - - - -
HC27 A JN116455 A KF922982 AII KF922914
HC28 A JN116456 - - - -
HC29 - - AII KF922983 AII KF922915
68
HC30 B JN116457 - - BIV KF922916
HC31 A JN116458 AII KF922984 AII KF922917
HC32 B JN116459 BIV KF922985 BIV KF922918
HC33 B JN116460 BIII KF922986 BIII KF922919
HC34 B JN116461 B KF922987 BIV KF922920
HC35 A JN116462 - - AII KF922921
HC36 A JN116463 AII KF922988 AII KF922922
HC37 - - - - BIV KF922923
HC38 B JN116464 - - BIV KF922924
HC39 B JN116465 BIV KF922989 BIV KF922925
HC40 A JN116466 AII KF922990 AII KF922926
HC41 B JN116467 - - BIV KF922927
HC42 A JN116468 AII KF922991 AII KF922928
HC43 B JN116469 - - BIV KF922929
HC44 A JN116470 AII KF922992 AII KF922930
HC45 B JN116471 BIV KF922993 BIV KF922931
HC46 B JN116472 BIV KF922994 BIV KF922932
HC47 B JN116473 BIV KF922995 BIV KF922933
HC48 A JN116474 AII KF922996 AII KF922934
HC49 A JN116475 AII KF922997 AII KF922935
HC50 A JN116476 AII KF922998 AII KF922936
HC51 A JN116477 AII KF922999 AII KF922937
HC43A* - - - - BIV KM495706
HC43B* - - - - BIV KM495707
HC43C* - - - - BIV KM495708
* Sequences obtained after molecular cloning.
69
Table S3. Molecular characterization and accession numbers of isolates obtained
from day-care center based on sequencing data from gdh, bg, and tpi genes.
Sample gdh GenBank bg GenBank tpi GenBank
DC01 B JN116478 AII KF923000 BIV KF922938
DC02 - - AII KF923001 BIV KF922939
DC03 B JN116479 AII KF923002 BIV KF922940
DC04 B JN116480 - - BIII KF922941
DC05 B JN116481 AII KF923003 BIV KF922942
DC06 - - - - BIV KF922943
DC07 A JN116482 AII KF923004 - -
DC08 - - AII KF923005 BIV KF922944
DC09 B JN116483 - - BIII KF922945
DC10 - - - - BIII KF922946
DC11 - - AII KF923006 BIII KF922947
DC12 A JN116484 AII KF923007 AII KF922948
DC13 A JN116485 AII KF923008 - -
DC14 - - AII KF923009 BIV KF922949
DC15 A JN116486 AII KF923010 AII KF922950
DC16 B JN116487 - - BIV KF922951
DC17 B JN116488 - - BIV KF922952
DC18 - - - - BIII KF922953
DC19 B JN116489 AII KF923011 BIV KF922954
DC20 B JN116490 AII KF923012 BIV KF922955
DC21 B JN116491 - - BIV KF922956
DC22 B JN116492 AII KF923013 BIV KF922957
DC23 - - AII KF923014 BIII KF922958
DC24 - - - - BIV KF922959
DC25 A JN116493 AII KF923015 AII KF922960
DC26 - - A KF923016 - -
DC27 A JN116494 AII KF923017 AII KF922961
DC28 A JN116495 AII KF923018 AII KF922962
70
Table S4. Molecular characterization and accession numbers of isolates obtained
from veterinary samples based on sequencing data from gdh, bg, and tpi genes.
Sample Host gdh GenBank bg GenBank tpi GenBank
VET01 Dog D JN116498 D KF923019 BIV KF922963
VET02 Dog D JN116499 - - AII KF922964
VET03 Dog C JN116500 - - -
VET04 Cat - - - - AII KF922965
VET05 Cat D JN116497 - - BIV KF922966
VET06 Calf E JN116496 E KF923020 AII KF922967
VET01L Dog - - - - D KF922973
VET02L Dog - - - - C KF922974
VET05L Dog - - - - D KF922975
VET02LA* Dog - - - - AI KM495720
VET02LB* Dog - - - - C KM495721
VET02LC* Dog - - - - C KM495722
VET04A* Cat - - - - BIII KM495697
VET04D* Cat - - - - BIV KM495700
VET04H* Cat - - - - C KM495704
* Sequences obtained after molecular cloning.
Table S5. Molecular characterization and accession numbers of isolates obtained from
environmental samples based on sequencing data from gdh, bg, and tpi genes.
Sample Source gdh GenBank bg GenBank tpi GenBank
ENV01 SWWTP A JN116502 - - - -
ENV02
Water
Abstraction - - - - C KF922968
ENV03 Proença Stream - - - - BIV KF922969
ENV04 Serafim Stream - - - - BIII KF922970
ENV05 Anhumas River D JN116503 - - BIV KF922971
ENV06 Hospital Sewage B JN116504 - - BIII KF922972
71
Table S6. Distribution of each source as a percentage within each genetic
assemblage.
Assemblage A (%) B (%) C (%) D (%) E (%)
HC 52.1 46 62.5 0 0
DC 39.6 42 0 0 0
VET 6.2 4 25 75 100
ENV 2.1 8 12.5 25 0
Each genetic assemblage was examined to identify which source contributed with more
isolates. Bold numbers indicate the highest percentage per column.
Table S7. Samples with double peaks within each loci.
Subtype Nº of samples Isolates
gdh 22 HC11 HC21 HC34 HC35 HC39 HC43 HC50 HC51 DC01
DC09 DC12 DC13 DC16 DC17 DC19 DC20 DC21 VET01
VET03 VET05 ENV01 ENV05
bg 11 HC25 HC29 HC34 HC36 HC39 HC40 HC42 HC45 HC51
DC25 VET06
tpi 21 HC14 HC15 HC20 HC21 HC23 HC24 HC25 HC40 HC42
HC43 HC45 HC50 HC51 DC06 DC25 VET01 VET04
VET05 VET06 ENV04 ENV05
72
Table S8. Correspondence between subtypes and sequences obtained from
isolates from the bg gene.
Subtype Marker Isolates
S01 bg HC44 DC02 DC03 DC05 DC07 DC11 DC12 DC13 DC14
DC15 DC19 DC22 DC23 DC27 DC28
S02 bg HC10 HC11 HC49
S03 bg HC31 HC48 HC50
S04 bg HC46 HC47
S05 bg DC01 DC08
S06 bg HC07
S07 bg HC09
S08 bg HC12
S09 bg HC27
S10 bg HC33
S11 bg DC20
S12 bg DC26
S13 bg VET01
Bold subtype numbers indicate new sequences.
Table S9. Correspondence between subtypes and sequences from isolates from the
gdh gene.
Subtype Marker Isolates
S01 gdh HC01 HC02 HC10 HC12 HC13 HC18 HC22 HC27 HC28
HC31 HC36 HC40 HC42 HC44 HC48 HC49 DC07 DC15
DC25 DC27 DC28
S02 gdh HC15 HC16 HC23 HC25 HC32 HC38 HC46 DC03 DC04
DC05
S03 gdh HC45 DC22 ENV06
S04 gdh HC41 HC47
S05 gdh HC07
S06 gdh HC30
S07 gdh HC33
S08 gdh VET02
S09 gdh VET06
Bold subtype numbers indicate new sequences.
73
Table S10. Correspondence between subtypes and sequences obtained from the tpi
gene.
Subtype Marker Isolates
S01 tpi HC09 HC16 HC32 HC34 HC37 HC41 HC46 HC47 DC03 DC05
DC14 DC16 DC17 DC19 DC21 DC22 DC24
S02 tpi HC06 HC10 HC11 HC22 HC27 HC29 HC31 HC35 HC36 HC49
DC15
S03 tpi HC01 HC12
S04 tpi HC33 DC18
S05 tpi HC44 DC27
S06 tpi DC01 DC08
S07 tpi DC04 DC10
S08 tpi VET01L VET05L
S09 tpi HC02
S10 tpi HC04
S11 tpi HC07
S12 tpi HC08
S13 tpi HC13
S14 tpi HC17
S15 tpi HC19
S16 tpi HC30
S17 tpi HC38
S18 tpi HC39
S19 tpi HC48
S20 tpi DC02
S21 tpi DC09
S22 tpi DC11
S23 tpi DC12
S24 tpi DC20
S25 tpi DC23
S26 tpi DC28
S27 tpi VET02
S28 tpi VET02L
S29 tpi ENV02
S30 tpi ENV03
S31 tpi ENV06
Bold subtype numbers indicate new sequences.
74
Table S11. Correspondence between haplotypes and sequences obtained from isolates from the
gdh gene.
Haplotype Molecular
Marker
Assemblage Isolates
HP01 gdh AII HC01 HC02 HC10 HC11 HC12 HC13 HC18 HC22 HC27
HC28 HC31 HC35 HC36 HC40 HC42 HC44 HC48 HC49
HC51 DC07 DC15 DC25 DC27 DC28 ENV01
HP02 gdh BIV HC15 HC16 HC23 HC25 HC32 HC38 HC46 DC03 DC04
DC05
HP03 gdh BIV HC39 HC45 DC22 ENV06
HP04 gdh BIV HC34 HC41 HC47
HP05 gdh D VET01 VET02
HP06 gdh B HC07
HP07 gdh B HC21
HP08 gdh BIV HC30
HP09 gdh BIII HC33
HP10 gdh BIV HC43
HP11 gdh AII HC50
HP12 gdh B DC01
HP13 gdh BIII DC09
HP14 gdh AII DC12
HP15 gdh AII DC13
HP16 gdh BIV DC16
HP17 gdh BIV DC17
HP18 gdh BIV DC19
HP19 gdh BIV DC20
HP20 gdh BIV DC21
HP21 gdh C VET03
HP22 gdh D VET05
HP23 gdh E VET06
HP24 gdh D ENV05
75
Table S12. Correspondence between haplotypes and sequences obtained from isolates from the
tpi gene.
Haplotype Molecular
Marker
Assemblage Isolates
HP01 tpi BIV HC09 HC14 HC15 HC16 HC20 HC32 HC34 HC37 HC41
HC45 HC46 HC47 HC43D DC03 DC05 DC14 DC16 DC17
DC19 DC21 DC22 DC24 ENV05
HP02 tpi AII HC06 HC10 HC11 HC21 HC22 HC23 HC29 HC31 HC35
HC36 HC42 HC49 HC51 DC15 DC25 VET04
HP03 tpi AII HC01 HC12
HP04 tpi BIII HC33 DC18
HP05 tpi AII HC44 DC27
HP06 tpi BIV DC01 DC08
HP07 tpi BIII DC04 DC10
HP08 tpi D VET01L VET05L
HP09 tpi AII HC48 HC50
HP10 tpi BIV HC43A HC43L
HP11 tpi BIV VET01 VET05
HP12 tpi C HC02
HP13 tpi C HC04
HP14 tpi BIV HC07
HP15 tpi C HC08
HP16 tpi C HC13
HP17 tpi BIV HC17
HP18 tpi C HC19
HP19 tpi BIV HC24
HP20 tpi BIV HC25
HP21 tpi AII HC27
HP22 tpi BIV HC30
HP23 tpi BIV HC38
HP24 tpi BIV HC39
HP25 tpi AII HC40
HP26 tpi BIV HC43
76
HP27 tpi BIV HC43B
HP28 tpi BIV HC43C
HP29 tpi BIV DC02
HP30 tpi BIV DC06
HP31 tpi AII DC12
HP32 tpi BIV DC20
HP33 tpi BIII DC09
HP34 tpi BIII DC11
HP35 tpi BIII DC23
HP36 tpi AII DC28
HP37 tpi AII VET02
HP38 tpi AII VET06
HP39 tpi C VET02L
HP40 tpi AI VET02LA
HP41 tpi C VET02LB
HP42 tpi C VET02LC
HP43 tpi BIII VET04A
HP44 tpi BIV VET04D
HP45 tpi C VET04H
HP46 tpi C ENV02
HP47 tpi BIV ENV03
HP48 tpi BIII ENV04
HP49 tpi BIII ENV06
77
Table S13. Correspondence between haplotypes and sequences obtained from isolates from the
bg gene.
Haplotype Molecular
Marker
Assemblage Isolates
HP01 bg AII DC02 DC03 DC05 DC07 DC11 DC12 DC13 DC14 DC15
DC19 DC22 DC23 DC27
HP02 bg AII HC31 HC36 HC40 HC42 HC48 HC50 HC51
HP03 bg AII HC10 HC11 HC44 HC49 DC25
HP04 bg AII DC01 DC08 DC28
HP05 bg BIV HC46 HC47
HP06 bg BIII HC07
HP07 bg AII HC09
HP08 bg AII HC12
HP09 bg BIV HC25
HP10 bg AII HC27
HP11 bg AII HC29
HP12 bg BIV HC32
HP13 bg BIII HC33
HP14 bg BIV HC34
HP15 bg BIV HC39
HP16 bg BIV HC45
HP17 bg AII DC20
HP18 bg BIV DC26
HP19 bg BIV VET01
HP20 bg E VET06
78
Table S14. Comparison of the main haplotype identified with sequences available at GenBank
database.
bg
haplotypes
n GenBank tpi
haplotypes
n GenBank gdh
haplotypes
n GenBank
HP01 bg 13 - HP01 tpi 23 JN587453
AB618783
HQ179644
HQ179645
HM140708
GU182385
FJ560559
EU518582
JN587453
HP01 gdh 25 JX972184
JX448645
JN616252
KF468661
JN116441
JX266827
HP02 bg 7 HQ179591
FJ971416
FN386484
AY072724
HP02 tpi 16 GU564277
AB516351
FJ560552
JN587406
HQ603777
AB569403
GU182396
HP02 gdh 10 KF468670
JX972186
KC313929
JX839875
JX448642
AB694737
JN204450
JQ700432
79
Table S15. Polymorphic sites in the bg and tpi sequences among G. duodenalis assemblage A isolates.
Genotype bg
40 52 76 165 167 173 251 421 429 549 567 621
REF A C A A A A A C T C C C
BRA1 - - - - - - . . . . T .
BRA2 . . . . . . . T C . T T
BRA3 . . . . . . . T C . T T
BRA4 - - - - - - . T C . T T
BRA5 C A . . . . . T C . T .
BRA6 G A C C C C . . . . G .
BRA7 - - - - - - G . . T - -
Genotype tpi 42 129 349 399 510
REF
T T G C
G
BRA1
. C . T
.
BRA2
. C . T
.
BRA3
. C . T
A
BRA4
C C . T
.
BRA5
. C . T
.
BRA6
. C A T
.
BRA7 - C . T .
The gdh sequences were not inserted as they did not present any polymorphic site among the seven multilocus
genotypes. Dots indicate identity to the reference sequence. Nucleotide substitutions are numbered from the
ATG codon of each gene.
80
Table S16. Polymorphic sites in the bg, tpi and gdh sequences among G. duodenalis assemblage A
isolates.
Genotype bg
40 46 52 79 165 171 189 288 330 399 477 609
Reference
A G C A G T A T C T T A
BRAB1
G C A C . C G C . C . G
BRAB2
. . . . A . . . T . C G
BRAB3
. . . . A . . . T . C G
Genotype tpi
39 91 162 165 168 210 429
Reference A T G T T A G
BRAB1 G C A C C G .
BRAB2 . . . . . . A
BRAB3 . . . . . . A
Genotype gdh
309 354
Reference T G
BRAB1 C .
BRAB2 . .
BRAB3 . A
Dots indicate identity to the reference sequence. Nucleotide substitutions are numbered from the ATG codon of each
gene.
81
Table S17. Multilocus genotypes (MLGs) in G. duodenalis assemblages A isolates.
MLG Samples bg gdh tpi Assemblage
BRA1 HC31/HC48* BG-1 (kc8) gdh-1 tpi-1 (Ad2) AII
BRA2 DC15/DC07 BG-2 gdh-1 - AII
BRA3 DC27/HC44 BG-2 gdh-1 tpi-2 AII
BRA4 DC28 BG-2 gdh-1 tpi-3 AII
BRA5 HC10/HC49* BG-3 gdh-1 tpi-1 (Ad2) AII
BRA6 HC12/HC01 - gdh-1 tpi-4 AII
BRA7 HC27* BG-5 gdh-1 tpi-1 (Ad2) AII
* MLGs where HC22 isolate could be included as data from bg gene was not obtained
Table S18. Multilocus genotypes (MLGs) in G. duodenalis assemblages B isolates.
MLG Sample bg gdh tpi Assemblage
BRAB1 HC33 BGB-1 gdhB-2 tpiB-2 BIV
BRAB2 HC46/HC16
HC41
- gdhB-1
(Ad7)
tpiB-1
(Ad19)
BIV
BRAB3 HC47 BGB-2 gdhB-3 tpiB-1
(Ad19)
BIV
BRAB4 DC04 - gdhB-1
(Ad7)
tpiB-3 BIII
BRAB5 ENV06 - gdhB-4 tpiB-4 BIII
BRAB6 HC38 - gdhB-1
(Ad7)
tpiB-5 BIV
BRAB7 HC30 - gdhB-5 tpiB-6 BIV
82
Table S19. Genetic differences in the genetic assemblages at the gdh locus.
Site number
gdh 1 1 2 3 3 4 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 0 1 1 2 2 3 3 4 5 6 6 6 7 7
1 4 7 6 9 2 1 4 0 3 6 5 8 4 7 0 6 2 8 1 4 6 2 8 4 7 3 9 5 1 3 6 9 2 5
A L40509.1 G T C C T C C G C C C C G C C C C C T C A C C C C C G C C C C C C C T
BIII AF069059.1 . C . . C T . . . . T T . . T T . . C T T G . . . T . T T . . G T . C
BIV L40508 . C T . C T . . . . T T . . T T . . C T T G . . . . . T . . . G T . C
C U60985 A C . T C . . T . . . . C . T . T . C . C . . . . . . . . . . . T . C
D U60986.2 . C T T C T T A T T . . C . T . T T C . C T T T . . A T . T . . T . .
E AY178740 A C . . C . T . . . . . . . T . . . . . G T . . T . . . T T T G T . .
F AY178744 C C . . C . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . T C
G AY178748 . C . . C . . . . . . . . T T . T . C . G A . . . . . . . . . G T . C
All the SNPs in the different genetic assemblages are displayed within gdh loci.
83
Table S20. Genetic differences in the genetic assemblages at the bg locus.
bg
Site numbers
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
1 1 2 5 6 9 0 0 0 2 2 3 3 3 4 5 5 7 7 7 7 8 9 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5
4 0 3 2 5 1 7 3 6 9 4 7 0 3 9 5 1 7 5 6 7 8 1 9 2 5 4 7 0 3 9 0 2 5 4 7 0 3
AI |M36728 C G G C C G C G C G C C C A C G C G G G C C G G G C C C C C C C A G G G C C
AII |AY072723 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AIII DQ648777 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . .
BIII |AY072726 T . A . . . . . T . . . . G . A . A . . . . . . . . T . . . . . G . . . . .
BIV |AY072725 T . A . . . . . T . . . . G T A . A . . . . . . A . T . . . . . G . . . . .
C |JF422719 - - - - - - . . . C . . . T G . . C . . G . . . . . . . . . . . G . . A . .
D |AY545647 T A A T T . T . T C T . . . T . T . A A G . C . . A . T . . T . G . . . T .
E |AY072729 . . . . . A . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . T . T . . . G A A . . .
F |AY647264 . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . .
G |EU769221 - - - - - - T A . . T G . . T . . . . . . G . A . . . . . . . T G . . . . T
2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5
5 6 6 8 8 8 8 9 0 1 1 1 2 4 5 6 6 6 7 7 9 0 0 0 1 1 2 3 4 6 7 7 8 8 9 9 0 1 2
6 2 5 0 3 6 9 8 1 0 3 9 2 6 2 1 4 7 0 9 7 0 6 9 2 5 7 0 5 3 5 8 4 7 3 6 2 7 6
AI |M36728 C T A C T G G C A C T A T T C G T C G C T C G C T C A A C G C C C C C G G C G
AII |AY072723 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AIII DQ648777 . . . . . . . . . . . . C C . . . . . . C . . . C . . G . . . . . . . . A . .
BIII |AY072726 . C . T C C . . G . C G C C . A C . . . C . A . C . C G T A . . . . T C . . .
BIV |AY072725 T C . T . T . . G . C G C C . A C T . . C . A . C . C G T A . . . . T C . . .
C |JF422719 . C G . . C . G C . C . C C . . C . . . C . C . C . C G . . A . . . . C . . .
D |AY545647 A C . . C A . G G . C . C C . A . . . . C T C . C T C G . . A . T T T C . . A
E |AY072729 . . . T C . A . . . . . C C T . C . A . C . . . C . . G T A . T . . . C . T .
F |AY647264 . A C . . A . . . T . . C C . . C . . . C . . . C G . G . . . . . . . C . . .
G |EU769221 . C G . C . . . G . . . C C . . C . . A C . . A . T C G . . . . . . . C . T .
84
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
3 3 3 4 4 5 5 7 7 8 9 0 1 2 2 2 3 4 5 5 7 7 8 9
2 5 8 4 7 0 3 1 7 0 5 7 9 2 5 8 1 3 5 8 0 6 5 1
AI |M36728 T C T G A A G C G G G C C C T C G C C A A C C T
AII |AY072723 . T . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . .
AIII DQ648777 C . . . . G . . . . . . . . C . . . . G G T . .
BIII |AY072726 C . C . . G C . . . . . . . C . . . A G . . . A
BIV |AY072725 C . C . . G C . A . . . . . C . . . A G . . . A
C |JF422719 C . A . C G . T . A A . . . C . . T . G G . T G
D |AY545647 C . A A . G T . . . . T . T C . A . A G . . . C
E |AY072729 C . C . G G C . . . . . T . C T . . . G . . . .
F |AY647264 C . C . . G . . . . . . . . C . . . . G G . . G
G |EU769221 C . C A G G . - - - - - - - - - - - - - - - - -
All the SNPs in the different genetic assemblages are displayed within bg loci.
85
Table S21. Genetic differences in the genetic assemblages at the tpi locus.
tpi
Site number
1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 8
1 4 7 0 3 6 9 1 2 5 8 1 4 7 0 1 2 3 4 6 9 2 3 6 8 1 4 7 0 3 6 9 2 3 5 6 8
AI |L02120.1 C G T C C T T A C T C G C C G G C G G A T T G C T G C T T C G C C G C A T
AII |U57897 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AIII |DQ650648 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . T A . T . T . .
BIII |AY228628 . . C T A G C . . C T . . . A . . . T C C C T . . . . C G . . . T . T G .
BIV |L02116 . A C T A G C . . C T . . . A . . . T C C C T T . . . C G . . . T . T G .
C |AY228641 T . C . G G . . . . . A . T A . . . . C C G T . C . T C C T T T G A . . C
D |DQ246216 T . C . G . . C . . . . T T . T . T . T . . T . C C . C . T . T G A T . .
E |AY655705 T . . . . G . . T . . . . T . . . . . C . . . . . . . C . . A . T . T G .
F |AF069558 T . C . . G C . . . . . T . . . G . . C . . . . C . . . . . . . T . T G C
G |EU781013 T . C . A G C . . C . . . . . . . A . C A . T . C . . C . T . . T . G . .
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
9 9 9 9 9 0 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 6 6 6 7 7 7 7 8 8 8 9
1 4 7 8 9 0 3 6 7 9 2 5 8 1 4 7 0 3 6 9 0 1 2 3 7 8 4 7 0 3 9 0 2 5 8 1 4 7 3
AI |L02120.1 C T C G C C A C C G A A C T G A C G A A C A G T G G A G G T C C A G G C G G T
AII |U57897 . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AIII |DQ650648 . . . T . . . . . A . . . . . G . . . G . . . . . . G . . . . . . . . . . . .
BIII |AY228628 T C . T T T G . . T T . T . . G . C G G T G T C A A . A . C T . G . . . T A C
BIV |L02116 T C . T T T G . . T T . T . . G T T G G T G T C A A . A . C T . G A . . T A C
C |AY228641 . C G T . . G T . . T G . C A G . A G G . . . C A . . . . . . . C . A . C A G
D |DQ246216 T . G T . G G T . A T G T . A C T . . G . . . C A . . . A . . T C A T T C . .
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G |EU781013 . C . . . T G . . . T G . C . . . . G G . . . C A . G . . . . . G . C . C . G
86
1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3
9 9 0 0 0 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 5 5 6 6 6 7 8 8 8 8 9 9 9 0 0 1 1 1
6 9 2 5 8 7 9 0 3 8 9 0 2 3 4 5 6 8 1 5 7 0 3 2 5 8 7 0 3 4 6 2 5 8 0 7 3 6 7
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G |EU781013 . A . C C C T . . . C C . . G C . C . . T . . . . G C . . . . G . G . C . . .
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4
1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 7 7 8 8 8 8 9 9 9 9 0 0 0 0 0 1 1 1
9 2 5 7 8 3 4 7 0 3 6 7 8 9 2 5 8 9 1 4 7 0 9 0 1 2 5 0 1 4 7 0 2 3 6 9 5 8 9
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4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 7 7 7 8 8 9
0 1 4 7 8 0 3 6 7 9 3 4 6 8 2 4 5 6 7 0 1 3 6 9 2 5 8 1 7 0
AI |L02120.1 G C G G C C A G T C A T C C A G G A G T G C T T C G C G C T
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D |DQ246216 A T C . . T . C A . . A . T . . A . C . . T C A T A T . T .
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F |AF069558 . . . . . T . . . G . . . . . . . G A . . T . C . . . - - -
G |EU781013 A A . . . . T . . . G A . . . . A . T C A . . C . A T . . C
All the SNPs in the different genetic assemblages are displayed within tpi loci.
88
89
Capítulo II
Genética de Populações em Giardia duodenalis: Diversidade
Genética e Compartilhamento de Haplótipos em
Amostras Clínicas e Ambientais
90
91
Genética de Populações em Giardia duodenalis: Diversidade Genética e
Compartilhamento de Haplótipos em Amostras Clínicas e Ambientais
Mauricio Durigan1, Maisa B Ciampi
1,2, Ricardo Conde Alves Rodrigues
3, Juliane Araújo
Greinert-Goulart3, Diego Averaldo Guiguet-Leal
3, Taís Rondello Bonatti
3, Maria I Zucchi
4,
Regina M B Franco3
e Anete P Souza1,5§
1Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
2Departamento de Fitopatologia – ESALQ – Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brasil
3Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
4APTA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, Piracicaba, SP, Brasil
5Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil Fone +55 19 35 21 1132; Fax: +55 19 35 21
1089
§Autor de correspondência
Endereço de e-mail: [email protected]
92
Resumo
Giardia duodenalis (sinonímia G. lamblia e G. intestinalis) é um protozoário intestinal
flagelado que parasita humanos além de diversos animais selvagens e domésticos, causando a
doença giardiose que apresenta milhões de novos casos anualmente tanto em países
desenvolvidos como em países em desenvolvimento. Devido a grande variabilidade genética
detectada no parasito, seus isolados foram divididos em oito grupos genéticos (A-H), sendo
que dois (A-B) são responsáveis pela infecção em diversos hospedeiros (entre eles humanos) e
os demais (C-H) são restritos a determinados animais. A genética de populações é o estudo da
variação genética em populações e sua aplicação em populações naturais de parasitas e vetores
pode propiciar acesso a informações essenciais na ecologia e potencial evolutivo desses
organismos. O objetivo do presente estudo foi comparar populações de Giardia duodenalis
originárias de amostras clínicas e ambientais de uma região metropolitana a fim de verificar
compartilhamento de haplótipos e similaridade genética entre as populações. Sequências
geradas após amplificação e sequenciamento de fragmentos dos genes triose fosfato isomerase
(tpi), glutamato desidrogenase (gdh) e beta-giardin (bg) foram obtidas de amostras clínicas
(provenientes de hospital, creche e centro de controle de zoonoses) e amostras ambientais
(provenientes de rios, córregos urbanos e esgoto) da região metropolitana de Campinas. A
comparação entre as populações de G. duodenalis foi realizada através de Análise Molecular
da Variância (AMOVA). A análise da variabilidade haplotípica e das relações genealógicas
entre os haplótipos foi realizada pelo software Arlequin. Um considerável número de
haplótipos foi identificado nos três genes avaliados de forma que o gene tpi apresentou a maior
variabilidade haplotípica. A análise hierárquica de distribuição da diversidade genética mostrou
que as populações HC e DC são muito similares, mesmo resultado obtido ao comparar as
populações clínicas humanas (HC e DC) em comparação com as amostras ambientais (ENV).
A análise das relações genealógicas evidenciou diversos haplótipos compartilhados entre
amostras ambientais e humanas e haplótipos compartilhados entre amostras de animais e
humanas. O elevado grau de compartilhamento de haplótipos associado com os resultados na
análise de variância sugere que os humanos têm sido infectados por haplótipos similares de G.
duodenalis em diferentes regiões. O crescente uso de ferramentas moleculares em estudos
epidemiológicos associados a análises em genética de populações abre novas possibilidades
93
para o entendimento da biologia do organismo, seus meios de veiculação bem como a
identificação de sua fonte de contaminação.
Introdução
Giardia duodenalis (sinonímia G. lamblia e G. intestinalis) é um protozoário intestinal
flagelado que parasita humanos além de diversos animais selvagens e domésticos, causando a
doença giardiose. Essa doença afeta tanto países desenvolvidos como países em
desenvolvimento, sendo mais frequentemente encontrada em áreas precárias de
desenvolvimento com sistemas de tratamento de água inadequado e precárias práticas de
higiene [1,2].
G. duodenalis apresenta considerável variabilidade genética e seus isolados foram
divididos em oito grupos genéticos (A-H). Os grupos genéticos A e B são os únicos geralmente
associados a infecções humanas, embora esses grupos também sejam isolados de diversos
animais domésticos, selvagens e marinhos [3]. Os demais grupos genéticos (C-H) são
comumente associados a animais e considerados hospedeiro-específico, embora alguns desses
genótipos já tenham sido descritos em humanos [4]. A transmissão zoonótica de genótipos de
Giardia duodenalis foi demonstrada experimentalmente, mas poucas informações existem
sobre sua ocorrência no ambiente em condições naturais [5]. A importância das transmissões
zoonóticas em G. duodenalis ainda necessita ser determinada [6].
A genética de populações é o estudo de como os princípios da genética se aplicam a
populações inteiras através da utilização de métodos que buscam quantificar a variação dos
indivíduos nessas populações. [7]. O estudo da variação genética em populações naturais de
parasitas e vetores pode propiciar acesso a informações essenciais na ecologia e potencial
evolutivo desses organismos. A maioria das populações naturais é subdividida em
subpopulações com tamanho limitado e a estrutura de uma população tem muita influência na
distribuição da informação genética [8].
A fragmentação de populações de parasitas pode ser observada no nível espacial, no
nível da espécie hospedeira e no nível dos indivíduos hospedeiros [9]. A estrutura populacional
de um parasita é correlacionada com mobilidade do hospedeiro, modo de reprodução do
parasita, complexidade de seu ciclo de vida, tamanho populacional e especificidade ao
94
hospedeiro [10). Um estudo de genética de populações de Giardia duodenalis através da
análise de genes conservados em uma área altamente endêmica no Perú apresentou evidências
de recombinação e indicou possível reprodução sexual no organismo [11].
No presente estudo, diferentes populações de Giardia duodenalis de origem clínica e
ambiental foram comparadas através de análises de variância e diversidade. Os haplótipos de
cada população foram comparados a fim de verificar o possível compartilhamento de genótipos
entre os diferentes ambientes onde as amostras foram obtidas.
Material e Métodos
Área de estudo e desenho experimental
A região metropolitana de Campinas possui 20 cidades e aproximadamente três milhões
de habitantes. Os isolados avaliados do presente estudo são provenientes de diferentes
ambientes e hospedeiros, de forma a amostrar a diversidade genética de G. duodenalis em uma
região metropolitana. As amostras, cujas sequências foram utilizadas na presente pesquisa,
foram obtidas em importantes locais da cidade de Campinas e adjacências tanto do ponto de
vista das amostras clínicas quanto ambientais. As amostras clínicas são provenientes de um
hospital, de uma creche urbana, de uma clínica veterinária e do centro de controle de zoonoses
da cidade de Campinas. As amostras ambientais são originárias de rios, córregos urbanos,
efluente de esgoto e esgoto hospitalar. Muitas parcerias foram estabelecidas para o
desenvolvimento do presente estudo e os dados de prevalência nos locais de coleta estão
presentes nos estudos anteriores, cujas sequências foram utilizadas na presente pesquisa.
Nenhuma informação clínica foi obtida dos isolados.
Amostras Clínicas
Os isolados obtidos de amostras clínicas são originários de cistos de Giardia
duodenalis de fezes de humanos, cães, gatos e um boi. Os cistos de amostras humanas são
provenientes do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e
também de uma creche urbana da região central da cidade de Campinas. As amostras de cães e
gatos são provenientes de centro de controle de zoonoses e também de uma clínica veterinária
da região central de Campinas. A amostra bovina tem sua origem na fazenda São Francisco,
em Amparo, localizada a 37 quilômetros a noroeste da cidade de Campinas. Os isolados foram
95
denominados com siglas de acordo com sua localização. As amostras hospitalares receberam a
sigla HC, as amostras da creche receberam a sigla DC e as amostras clínicas não humanas
receberam a sigla VET. Foram obtidas sequências de 51 isolados provenientes do grupo HC,
28 isolados do grupo DC e sequências de 48 isolados obtidos de amostras veterinárias.
Amostras ambientais
Os isolados obtidos de amostras ambientais são provenientes do esgoto hospitalar da
UNICAMP, do efluente da Estação de Tratamento de Esgoto Samambaia da cidade de
Campinas, do esgoto da Estação de Tratamento de Esgoto Piçarrão, nos córregos urbanos
Serafim e Proença, no rio Anhumas após a junção dos córregos e no rio Atibaia, próximo ao
ponto de captação de água da cidade de Campinas. As amostras ambientais foram denominadas
como parte do grupo ENV. Foram obtidas sequências de 39 isolados provenientes de esgoto e
sequências de 51 isolados de rios e córregos urbanos da cidade de Campinas.
Caracterização da distribuição da diversidade genética através de análise
hierárquica e relações genealógicas entre as sequências
Sequências de fragmentos de 530 pb do gene triose fosfato isomerase (tpi), 753 pb do
gene beta-giardin (bg) e 218 pb do gene glutamato desidrogenase (gdh) foram obtidos de cada
um dos isolados. Esses marcadores apresentam apenas uma cópia e não são ligados no genoma
de G. duodenalis [12]. Sequências de referência dos genes tpi, bg, gdh correspondentes aos
grupos genéticos de G. duodenalis foram obtidos através do GenBank (Tabela Suplementar
S1). As sequências da presente pesquisa foram alinhadas com as sequências de referência
através do software ClustalX [13].
Os grupos genéticos das sequências obtidas foram confirmados através de análises
filogenéticas. Análises de Neighbor-joining (NJ) e máxima verossimilhança (ML) foram
realizadas com a utilização do software MEGA, v5.05 [14]. O modelo de substituição foi
selecionado após análise com o software jModelTest [15]. O teste de filogenia foi realizado
com 10.000 repetições bootstrap.
96
Todas as sequências obtidas foram alinhadas e o arquivo foi formatado para o formato
NEXUS. As relações genealógicas entre as sequências foram estimadas pelo software TCS
[16] que unifica sequências idênticas em haplótipos únicos e gera um cladograma estimado
através do método “Statistical Parsimony”. Baseado no tamanho das sequências presentes no
arquivo de entrada, o software calcula o máximo de passos mutacionais para unir dois grupos
através de cálculos par a par entre as sequências até que a probabilidade exceda 95%. Os
grupos que recebem mais de um haplótipo apresentam proporcional aumento de tamanho ao
passo que o arquivo de saída indica o número de haplótipos encontrados além de informações
sobre cada amostra.
Após identificação da variabilidade haplotípica entre as populações de G. duodenalis,
as sequências foram convertidas no formato .ARP no software DNAsp [17]. Foi utilizado o
software Arlequin [18] que permitiu a avaliação da diversidade genética das populações bem
como o teste de AMOVA (Análise Molecular da Variância) para avaliar a estruturação da
variabilidade genética nas diferentes populações.
A diversidade genética e o grau de similaridade entre as populações foram avaliados de
maneira hierárquica através de comparações entre as populações clínicas (amostras humanas
do hospital, humanas da creche e amostras veterinárias) e amostras ambientais. Devido à
grande divergência genética entre os grupos genéticos A e B, estes foram considerados como
populações distintas de forma que as análises hierárquicas foram realizadas individualmente
para cada um desses grupos. No presente trabalho, uma população foi considerada como um
conjunto de amostras do mesmo grupo genético que possuem a mesma origem ou local de
coleta. Não foram consideradas populações que apresentam um número inferior a 10
indivíduos em apenas um determinado gene. O gene bg não foi considerado nas análises
hierárquicas populacionais devido ao viés de amostragem que impossibilitou a comparação
com as demais populações. Os grupos RIV (amostras hídricas de rios e córregos urbanos) e
SEW (amostras provenientes de esgoto) foram analisados independentemente quanto a seus
haplótipos e foram analisadas em conjunto com as amostras ambientais nas análises
hierárquicas da distribuição da diversidade genética entre as populações (Grupo ENV).
97
Resultados
Estimação da variabilidade haplotípica das diferentes populações
Um considerável número de haplótipos foi identificado em todos os grupos genéticos
nas populações com os genes bg, tpi e gdh. A porcentagem relativa de sucesso (etapas de
amplificação até sequenciamento) de cada marcador foi 49%, 70% e 33%, resultando em 106,
151 e 71 haplótipos diferentes para os marcadores bg, tpi e gdh, respectivamente. O gene tpi
foi o que apresentou maior diversidade de haplótipos, sendo seguido pelo gene bg. Os dados
são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Haplótipos diferentes identificados nos três genes nas diferentes populações.
bg tpi gdh
HC 16 24 10
DC 5 14 12
VET 12 31 6
RIV (ENV) 22 4 1
SEW (ENV) 6 21 6
Análise hierárquica da distribuição da diversidade genética nas diferentes
populações
As populações foram comparadas através de AMOVA de forma a verificar a
variabilidade entre e dentro dos grupos determinados. Na hierarquia estabelecida, decidiu-se
comparar inicialmente os grupos de amostras clínicas HC, de amostras humanas de um hospital
com o grupo DC, proveniente de crianças de uma creche urbana. Foram comparadas as
populações dos grupos genéticos A e B. Os dados descritivos das análises de AMOVA podem
ser visualizados na Tabela 2.
Os resultados da comparação entre as populações HC e DC mostram que, em relação ao
grupo genético A, essas populações não apresentam variação genética significativa podendo
ser consideradas similares. Em relação ao grupo genético B, foram encontrados resultados
contrastantes entre os dois marcadores utilizados. De acordo com o marcador tpi, não existe
variação significativa entre as populações, porém de acordo com o gene gdh a variação,
98
embora notavelmente concentrada no nível intrapopulacional, apresentou variação significativa
entre as duas populações.
No segundo nível hierárquico de análises, decidiu-se comparar as populações de G.
duodenalis obtidas de amostras clínicas humanas (HC e DC) com as amostras ambientais
(ENV) de forma a verificar a similaridade dessas populações através de um possível
compartilhamento de haplótipos. Os resultados da comparação entre as populações clínicas e
ambientais mostram que, para os dois grupos genéticos (A e B), não foi detectada variação
genética significativa de forma que essas populações podem ser consideradas similares para os
dois grupos genéticos ao se comparar as amostras clínicas e ambientais do presente projeto. Os
resultados são apresentados na Tabela 3.
De maneira geral, os resultados mostram que essas populações são bastante similares,
não existindo variação genética significativa entre elas. As amostras do grupo VET, por serem
majoritariamente pertencentes aos grupos genéticos C e D, não foram consideradas na análise
hierárquica uma vez que, de acordo com o conceito utilizado na presente pesquisa, pertencem a
populações já caracterizadas como diferentes.
99
Tabela 2. Análises de variância molecular (AMOVA) hierárquicas entre populações clínicas humanas de G. duodenalis.
Grupo Soma dos Componentes Porcentagem
Índice
de
Gene genético G.L. Quadrados de variância de variação P-valor fixação
HC x DC
Entre populações tpi A 1 0,93 0,04587 7,53
Dentro das populações tpi A 23 12,95 0,56304 92,47
Total
24 13,88 0,60891 100 0,2569 0,07533
HC x DC
Entre populações tpi B 1 1,504 0 0
Dentro das populações tpi B 42 71,542 1,70337 100
Total
43 73,046 1,70337 100 0,42005 0
HC x DC
Entre populações gdh A 1 0,774 0 0
Dentro das populações gdh A 26 22,333 0,85897 100
Total
27 23,107 0,85897 100 0,32729 0
HC x DC
Entre populações gdh B 1 4,751 0,2539 15,75
Dentro das populações gdh B 26 35,321 1,3584 84,25
Total 27 40,072 1,6123 100 0,0005 0,1575
100
Tabela 3. Análises de variância molecular (AMOVA) hierárquicas entre populações clínicas e ambientais de G. duodenalis.
Grupo Soma dos Componentes Porcentagem
Índice
de
Gene genético G.L. Quadrados de variância de variação P-valor fixação
(HC + DC) X ENV
Entre populações tpi A 1 1,386 0,01236 1,1
Dentro das populações tpi A 43 47,77 1,11093 98,9
Total
44 49,156 1,12329 100 0,17513 0,011
(HC + DC) X ENV
Entre populações tpi B 1 3,684 0,11558 5,58
Dentro das populações tpi B 51 99,788 1,95663 94,42
Total 52 103,472 2,07221 100 0,10187 0,05578
101
Análise da diversidade genética
As populações do presente estudo foram analisadas quanto à diversidade haplotípica em
cada um dos grupos genéticos. É possível avaliar que todas as populações apresentam alta taxa de
diversidade genética o que reflete a variação haplotípica apresentada na Tabela 1. De maneira
geral, todas as populações apresentam indivíduos com considerável variação. As exceções são
verificadas na população HC, do grupo genético A, a qual apresentou pequena diversidade
haplotípica para o gene gdh (0,1857). Os resultados são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Diversidade haplotípica para as diferentes populações para os grupos genéticos A e B.
Grupo Diversidade
População genético Gene genética
HC A tpi 0,6368 +- 0,1151
DC A tpi 0,9 +- 0,161
HC B tpi 0,7572 +- 0,0941
DC B tpi 0,8 +- 0,0886
HC A gdh 0,1857 +- 0,1102
DC A gdh 0,5238 +- 0,2086
HC B gdh 0,8162 +- 0,0815
DC B gdh 0,9455 +- 0,0659
102
Relações genealógicas entre populações
Gene tpi
As análises genealógicas realizadas com o software TCS para o gene tpi evidenciaram a
presença de 83 haplótipos diferentes entre todas as populações. Dentre esses haplótipos, alguns
foram encontrados em maior frequência e em diferentes populações. Os haplótipos HP01tpi,
HP02tpi, HP03tpi, HP04tpi, HP05tpi e HP06tpi foram detectados em importantes populações
clínicas e ambientais. Destacam-se os haplótipos HP01tpi e HP02tpi presentes em amostras do
hospital, creche e amostras de esgoto da cidade de Campinas, sendo que o primeiro haplótipo
ainda foi encontrado em uma amostra de cão da cidade.
Gene gdh
As análises dos haplótipos do gene gdh evidenciaram a presença de 26 haplótipos
distintos entre todas as populações. Os haplótipos HP01gdh, HP02gdh, HP03gdh estão presentes
em maior frequência e compartilham haplótipos entre as principais populações clínicas e
ambientais. O haplótipo HP04gdh, correspondente ao grupo genético D, está presente em
diversos cães assim como o haplótipo Hp05gdh, correspondente ao grupo genético C.
Gene bg
As análises dos haplótipos do gene bg evidenciaram a presença de 54 haplótipos distintos
entre todas as populações. Dentre todos, os haplótipos HP01bg, HP02bg, HP03bg, HP04bg,
HP05bg e HP06bg apresentaram-se em maior frequência na população. Destacam-se os
haplótipos HP01bg no qual amostras clínicas humanas são compartilhadas com amostras
ambientais do Rio Atibaia, haplótipo HP04bg no qual amostras de cães são compartilhadas com
uma amostra ambientais provenientes de esgoto. O número de haplótipos apresentados para os
três genes na presente seção é menor que o total apresentado na Tabela 1 uma vez que aqui foram
unificados os mesmos haplótipos encontrados em diferentes populações. A Figura 1 apresenta os
haplótipos mais frequentes das populações para os genes tpi, gdh e bg.
103
Figura 1. Haplótipos mais frequentes de G. duodenalis nos genes tpi, gdh e bg. O tamanho do
haplótipos é proporcional à sua frequência relativa.
104
Discussão
A contaminação de rios e córregos urbanos por protozoários patogênicos na região
metropolitana de Campinas tem sido amplamente descritas em diversos estudos [19, 20, 21, 22].
Um estudo recente, publicado por nosso grupo de pesquisa, evidenciou a contaminação por
Giardia duodenalis na região metropolitana de Campinas e encontrou elevada diversidade
haplotípica tanto em amostras clínicas quanto ambientais [23]. No presente estudo, foi verificada
a relação entre diferentes populações de G. duodenalis de amostras clínicas e ambientais através
de uma análise hierárquica de AMOVA entre as diferentes populações e também através de
comparação do perfil dos haplótipos encontrados nessas populações.
O conhecimento da diversidade genética de G. duodenalis é um componente essencial
para aumentar a compreensão do conhecimento sobre a taxonomia, epidemiologia e dinâmica
populacional do parasito[24]. Devido à grande variação genética existente entre os diferentes
grupos genéticos de G. duodenalis [25], decidiu-se considerar cada grupo genético como uma
população distinta e compara-los com as populações do mesmo grupo genético de outras
localidades e hospedeiros. Dessa forma, os resultados encontrados não sofrem viés de
amostragem, fato este muito frequente ao se comparar populações de grupos genéticos distintos.
Uma limitação dos estudos populacionais em microrganismos refere-se ao fato de que a
comparação entre populações é algo bastante complexo. Existe grande dificuldade em possuir um
número amostral similar entre diferentes populações, algumas populações não apresentam
determinados grupos genéticos o que impedem posterior comparação e, por fim, existe uma taxa
diferente de sucesso na amplificação e sequenciamento com os diferentes marcadores utilizados.
Os dados obtidos no presente estudo sugerem que existe mais de uma população nos
determinados locais de coleta, sendo estes considerados a partir de grupos genéticos distintos. A
estrutura de uma população tem grande influência na distribuição da informação genética [8]. Os
resultados observados em diferentes populações podem ser interpretados globalmente, indicando
uma mesma situação. Tanto as populações do grupo genético A quanto do grupo B apresentaram-
se geneticamente similares na comparação estabelecida entre as populações clínicas humanas e as
populações ambientais. Dessa forma, existem duas comparações distintas indicando uma possível
relação entre essas populações.
Ao comparar os genes tpi, bg e gdh, em relação ao número de haplótipos obtidos e o
número de sequências inicialmente trabalhadas, pode-se concluir que o gene tpi apresenta uma
105
maior variabilidade de haplótipos. O número inferior de haplótipos em sequências do gene gdh
possui relação com a baixa taxa de sucesso na amplificação seguida por sequenciamento do
mesmo nas populações VET, AT e SEW. Tal fato já havia sido identificado em estudo anterior
[23] cujas amostras correspondem parcialmente às utilizadas no atual estudo. As novas
populações mantiveram o mesmo padrão de sucesso de amplificação dos genes e variabilidade de
haplótipos descritas anteriormente.
As análises populacionais realizadas mostraram que a maior parte da variação em G.
duodenalis está presente dentro das populações, de maneira que as diferentes populações
apresentam altas taxas de diversidade genética. O teste AMOVA, utilizado para testar a
distribuição da variabilidade genética entre as populações, mostrou que, com exceção das
amostras veterinárias, que apresentam majoritariamente grupos genéticos específicos de cães, as
populações de G. duodenalis são bastante similares, o que pode indicar compartilhamento de
linhagens do parasito entre esses diversos ambientes.
Os resultados indicaram alta similaridade entre as populações de G. duodenalis presentes
no hospital e na creche. Crianças fazem parte do grupo com alta susceptibilidade para infecção
por Giardia duodenalis, particularmente as que frequentam creches, escolas primárias e orfanatos
[26,27,28,29]. A grande variabilidade haplotípica detectada nas amostras da creche muito
provavelmente reflete as múltiplas fontes de contaminação observadas nesse local em associação
com a vulnerabilidade socioeconômica das crianças que frequentam a creche. O elevado número
de haplótipos encontrados nas amostras do hospital pode ser explicado pelo grande número de
pacientes oriundos de diferentes regiões da cidade.
A similaridade entre as populações amostradas tanto do grupo genético A, quanto do
grupo genético B sugere que os humanos infectados estão sendo contaminados por haplótipos
similares de G. duodenalis em diferentes regiões. Embora exista grande diversidade de
haplótipos, a maioria dos isolados corresponde à apenas poucos haplótipos. A identificação de um
haplótipo particular em diferentes populações sugere uma potencial relação entre esses grupos o
que foi demonstrado com as redes de haplótipos apresentadas.
O gene gdh apresentou resultado contrastante em relação ao gene tpi no grupo genético B.
Embora este gene tenha apresentado um valor de FST significativo entre as populações (0,1575) a
menor parte da variabilidade está estruturada entre as populações. Como os indivíduos da
população amostrada pelos marcadores gdh e tpi não são exatamente iguais, uma vez que alguns
106
indivíduos amplificaram em um marcador e não no outro, é possível que tal resultado seja um
viés de amostragem já que a população amostrada pelo gene gdh é menor que a população
amostrada pelo gene tpi.
As análises populacionais entre as amostras clínicas e as amostras ambientais dos grupos
genéticos A e B também apresentaram alta similaridade genética entre as populações. Grande
parte das amostras ambientais apresentam genótipos dos grupos genéticos comumente
encontrados em humanos. Embora a contaminação por Giardia sp nessa região seja descrita há
bastante tempo, só recentemente trabalhos evidenciaram a contaminação por genótipos de grupos
genéticos associados a contaminações humanas no Brasil [21, 23]. A identificação de haplótipos
comuns entre amostras clínicas e ambientais sugere que existe uma relação entre a contaminação
ambiental de Giardia duodenalis e a infecção clínica em humanos. Futuros estudos moleculares
de monitoramento poderão ajudar a elucidar a origem da diversidade genética das populações de
G. duodenalis na região metropolitana de Campinas.
Embora o grupo das amostras veterinárias seja bastante distinto dos demais grupos pela
presença generalizada de genótipos específicos de cães, alguns genótipos dos grupos genéticos A
e B também estão presentes nesse grupo de forma que existe o compartilhamento de haplótipos
desse grupo com as demais populações humanas e ambientais. Assim, existe um risco de
contaminação humana por G. duodenalis proveniente de cães que apresentem genótipos com
potencial zoonótico, embora estes genótipos correspondam à absoluta minoria na população.
Outro importante resultado que reforça essa constatação é que cinco amostras humanas do grupo
HC foram descritas como pertencentes ao grupo genético C [23]. A comparação dessas amostras
com o grupo das amostras caninas do centro de controle de zoonoses mostrou que dois haplótipos
são compartilhados entre esses grupos. Embora amostras do grupo genético C não sejam comuns
em humanos, o presente trabalho demonstra haplótipos compartilhados entre amostras do grupo
genético C de humanos e cães. Tal fato, que já foi demonstrado em trabalhos anteriores [23,30], é
considerado incomum, porém não deve ser ignorado uma vez que indicam novos genótipos com
potencial zoonótico [4].
Conclusões
107
No presente artigo, realizamos análises populacionais capazes de avaliar a variabilidade
genética em diferentes populações de Giardia duodenalis e comparar o grau de similaridade entre
essas populações. Os resultados mostram que, na região metropolitana de Campinas, existe alta
diversidade de haplótipos e que as populações clínicas e ambientais de G. duodenalis possuem
alto grau de similaridade do ponto de vista genético.
Além disso, foi possível demonstrar a existência de haplótipos comuns a diferentes
populações, o que reforça a correlação entre as amostras clínicas e ambientais na região de
estudo. A população de G. duodenalis obtida de cães, com alta prevalência de genótipos dos
grupos genéticos C e D, também apresentou haplótipos compartilhados com amostras dos grupos
humanos, o que demonstra o potencial zoonótico de amostras do grupo.
O crescente uso de ferramentas moleculares em estudos epidemiológicos abre novas
possibilidades para o entendimento da biologia do organismo e sua contaminação ambiental.
Estudos de monitoramento em importantes sítios ambientais como águas superficiais, pontos de
captação de água, estações de tratamento de esgoto e água tratada, atrelados a técnicas
moleculares e análises em genética de populações, podem fornecer importantes respostas sobre
seus meios de veiculação bem como a identificação de sua fonte de contaminação.
108
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Informações Suplementares
Tabela S1. Números de acesso das sequências obtidas no NCBI.
gdh bg tpi
AI L40509 M36728.1 L02120.1
AII L40510 AY072723.1 U57897.1
AIII - DQ648777.1 DQ650648.1
BIII AF069059.1 AY072726.1 AY228628.1
BIV L40508.1 AY072725.1 L02116.1
C U60985.1 JF422719.1 AY228641.1
D U60986.2 AY545647.1 DQ246216.1
E AY178740 AY072729.1 AY655705.1
F AY178744 AY647264.1 AF069558.1
G AY178748.1 EU769221.1 EU781013.1
G. muris - EF455599.1 AF069565.1
G. ardeae AF069060.2 - AF069564.1
G. microti - - AY228649.1
112
113
Capítulo III
Microssatélites em Giardia duodenalis: Identificação e
caracterização de novos marcadores para identificação de
grupos genéticos específicos, estudos populacionais e de
diversidade
114
115
Microssatélites em Giardia duodenalis: Identificação e caracterização de
novos marcadores para identificação de grupos genéticos específicos,
estudos populacionais e de diversidade
Mauricio Durigan1, Claudio Benício Cardoso-Silva
1, Maísa Ciampi-Guillardi
1,2, Regina M B
Franco3
e Anete P Souza1,4§
1Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
2Departamento de Fitopatologia – ESALQ – Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brasil
3Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
4Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas, SP, Brasil Fone +55 19 35 21 1132; Fax: +55 19 35 21 1089
§Autor de correspondência
Endereço de e-mail: [email protected]
116
Resumo
Giardia duodenalis é um protozoário entérico que parasita humanos e diversos outros mamíferos
domésticos e selvagens causando a doença giardiose. G. duodenalis é considerado um organismo
primitivo no ramo dos eucariotos e uma considerável variabilidade genética foi detectada, de
forma que seus isolados foram divididos em oito grupos genéticos (A-H) distintos. Marcadores
microssatélites são altamente polimórficos e podem ser utilizados para discriminar isolados com
um nível maior de sensibilidade. O objetivo do presente estudo foi identificar microssatélites nos
diferentes genomas publicados de G. duodenalis e desenvolver novos marcadores para serem
utilizados em estudos populacionais e de diversidade. Microssatélites foram identificados nos
diferentes genomas publicados com o auxílio dos softwares MISA e SciRoKo. Foi definida uma
região adjacente de estudo onde iniciadores específicos puderam ser desenhados e locos
microssatélites definidos foram comparados entre todos os genomas em estudo de forma a
verificar locos específicos e compartilhados. A especificidade dos locos selecionados foi avaliada
através de reações de amplificação com amostras de G. duodenalis de diferentes grupos genéticos
e os locos promissores foram caracterizados através da avaliação da frequência alélica. Foram
desenvolvidos 28 marcadores específicos do grupo genético A, 11 específicos do grupo genético
B e 17 específicos do grupo genético E. Também foram desenvolvidos quatro marcadores
compartilhados entre todos os genomas avaliados. Os locos pertencentes ao grupo genético B
apresentaram maior polimorfismo alélico em relação ao grupo A. Os marcadores desenvolvidos
podem ser utilizados para identificação da espécie ou de seus principais grupos genéticos. Os
marcadores polimórficos podem contribuir para os estudos populacionais e de diversidade, uma
vez que são ferramentas com grande poder de discriminação. Os iniciadores desenvolvidos
podem representar um método de diagnóstico acessível para empresas de saneamento, instituições
de diagnóstico e instituições de pesquisa e podem ser utilizados em estudos baseados em PCR
convencional, sequenciamento genético ou PCR em tempo real.
117
Introdução
Giardia duodenalis (sinonímia G. lamblia e G. intestinalis) é um protozoário entérico que
parasita uma ampla gama de hospedeiros mamíferos incluindo o homem e diversos animais
domésticos e selvagens. [1,2]. Este parasito causa a doença giardiose que é uma das mais
prevalentes doenças parasitárias de veiculação hídrica do mundo, responsável por
aproximadamente 280 milhões de casos anualmente [3]. Em uma recente revisão, ao avaliar 199
surtos reportados entre 2004 e 2010, foi demonstrado que 35% destes foram causados por
Giardia duodenalis [4].
Existe uma considerável variabilidade genética em G. duodenalis de maneira que seus
isolados foram divididos em oito grupos genéticos (A-H), dois dos quais (A e B) apresentam
subestruturação (AI, AII, AII, BIII e BIV) e são encontrados tanto em humanos quanto em
animais. Os demais grupos parasitam outros animais e são considerados hospedeiro-específico
raramente parasitando humanos [5, 6].
G. duodenalis faz parte do clado Fornicata, um grupo de eucariotos que se caracterizam
por diversas características peculiares, notadamente a ausência de mitocôndrias. Apresenta dois
núcleos idênticos e transcricionalmente ativos bem como ausência de mitocôndria (embora
apresente mitossomos) e complexo de golgi. [7, 8]. O genoma de G. duodenalis é pequeno
(~11MB) quando comparado aos demais eucariotos e não passou por uma expansão massiva de
duplicações, possivelmente por pressões evolutivas que atuam sobre o genoma ou devido à
ausência de uma proliferação em larga escala de elementos móveis [9]. Quatro isolados de
diferentes grupos genéticos (AI, AII, B e E) foram completamente sequenciados [9, 10, 11, 12] O
genoma WB_AI apresenta alta densidade gênica e níveis extremamente baixos de
heterozigosidade (<0,01%). O genoma DH_AII é o menor dentre os publicados (~10,7 MB), com
baixa heterozigosidade, embora superior ao genoma WB. O genoma P15_E apresenta um
tamanho intermediário (~11,5MB) e grande número de arranjos cromossômicos em comparação
aos demais. O genoma GS_B é o maior (~12MB) e possui a maior taxa de heterozigosidade
(0,425%) entre todos os sequenciados [9, 12].
G. duodenalis foi historicamente considerada como uma única espécie baseada na
similaridade morfológica entre os isolados. Entretanto, baseado na ampla variação genética entre
os diferentes isolados, Giardia duodenalis pode ser considerado um complexo de espécies
118
[13,14]. Um recente estudo analisou variação genética entre um grande número de isolados dos
grupos genéticos A e B e detectou grande variação entre esses isolados [15].
Marcadores moleculares microssatélites (single sequence repeats - SSRs) são sequências
simples repetidas, de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem. Como as regiões que
flanqueiam os microssatélites são geralmente conservadas entre os indivíduos, é possível a
seleção de iniciadores específicos que amplificam, via reação em cadeia da polimerase
(polymerase chain reaction - PCR) fragmentos contendo o DNA repetitivo [16[. Os
microssatélites são marcadores altamente polimórficos, multialélicos, apresentam herança
mendeliana codominante e são considerados marcadores ideais para estudos populacionais e
estudos de diversidade [17].
As altas taxas de mutação de locos microssatélites fornecem marcadores altamente
polimórficos que podem ser utilizados para discriminar isolados com um elevado nível de
sensibilidade [18]. A sensibilidade depende da estruturação populacional do parasito, o nível de
trocas genéticas do parasito e o número de marcadores utilizados [19].
Microssatélites já foram verificados em diversos animais como humanos [20], Drosophila
mediopunctata [21], camundongos, bovinos [22], plantas como cana-de-açúcar [23] trigo [24] e
café [25] e também em fungos [26]. Em protozoários, a presença de SSRs também foi descrita.
De 224 microssatélites avaliados em Plasmodium falciparum, 188 apresentaram polimorfismos
entre as diferentes linhagens do parasita [27]. Repetições (CA)n foram encontradas no genoma de
Trypanosoma cruzi que se mostraram polimórficas e possibilitaram análise da estruturação
populacional desse parasita [28]. A análise de repetições de di e trinucleotídeos em
Cryptosporidium parvum permitiu a caracterização dos isolados de maneira que estes foram
agrupados em subgrupos mais próximos do ponto de vista geográfico [29]. Esses estudos
demonstraram êxito na caracterização da diversidade desses organismos, mas ainda nenhum
trabalho foi relatado sobre de marcadores moleculares microssatélites em Giardia spp.
A importância de se utilizar marcadores de alta resolução refere-se ao fato de que eles
permitem que sejam identificados variações de genótipos não detectados pelos marcadores
conservados convencionais. Essa identificação permite, além de genotipar o parasito em subtipos
pré-existentes, caracterizar os indivíduos coletados em um nível maior de discriminação o que
pode ser explorado para investigar a epidemiologia da doença, o papel de portadores
assintomáticos e para rastreamento da doença através de água e alimentos contaminados [30].
119
Em G. duodenalis, o déficit de heterozigotos tem sido considerado como um indicador da
evolução clonal do parasito através de seleção purificadora e conversão gênica ao mesmo tempo
em que um excesso de heterozigotos é uma evidência de hibridização ou recente evento sexual
[31]. Além disso, a grande variação encontrada entre os diferentes grupos genéticos sugere que
estes possam ser espécies diferentes [9], o que reforça a necessidade pelo desenvolvimento de
novos marcadores polimórficos. O desenvolvimento desses marcadores em um organismo
importante do ponto de vista epidemiológico pode fornecer novas ferramentas para estudos
genéticos em G. duodenalis além de contribuir para a identificação da espécie e de seus grupos
genéticos.
O presente estudo foi realizado para identificar microssatélites genômicos presentes nos
diferentes grupos genéticos de Giardia duodenalis e desenvolver novos marcadores que possam
servir como ferramenta para a caracterização da diversidade genética do parasito, bem como para
a identificação dos principais grupos genéticos.
Material e Métodos
Busca e identificação de microssatélites nos genomas WB (AI), DH (AII) GS (BIV) e P15
(E).
Sequências correspondentes aos cinco genomas publicados de G. duodenalis foram
obtidas junto ao GiardiaDB (32) em sua versão 5.0 publicado em setembro de 2014 [9, 10, 11,
12] (http://www.giardiadb.org). Também foram utilizadas sequências do genoma do organismo
Spironucleus salmonicida como controle negativo [33]. As sequências utilizadas correspondem à
versão 5.0 do banco de dados.
A identificação dos microssatélites em cada um dos genomas foi realizada através dos
softwares MISA – Microsatellite Identification Tool [34] e SciRoKo [35]. Os critérios acerca dos
padrões mínimos de repetição para identificar os microssatélites nos diferentes genomas de G.
duodenalis são dinucleotídeos com cinco, trinucleotídeos com quatro, tetranucleotídeos com três,
pentanucleotídeos com três e hexanucleotídeos com três repetições.
Após a identificação dos microssatélites, foi selecionada a região adjacente de 300 pb a
jusante e 300 pb a montante de cada SSR. Dessa forma, foram geradas sequências que continham
120
aproximadamente 600 pb sem contar o tamanho de cada SSR selecionado. Uma visão geral da
metodologia desenvolvida é apresentada através de fluxograma na Figura 1.
Análise in silico de transferibilidade entre os locos SSRs obtidos dos genomas disponíveis.
Foi realizada uma busca para avaliar se os microssatélites encontrados estavam presentes
apenas em um determinado genoma ou se eram compartilhados pelos demais genomas de Giardia
duodenalis. O critério para avaliar se os microssatélites estão presentes nos demais genomas é a
conservação da região adjacente aos SSRs, local onde os iniciadores se anelam. Não foram
descartados locos que apresentaram deleções ou inserções apenas na região do SSR uma vez que,
em termos de amplificação, o que importa é a região adjacente ao SSR, onde os iniciadores se
anelam. Dessa forma, ficou definido que um loco SSR é representado pela região de 600 pb na
qual o SSR está inserido na região central.
Cada SSR e sua região adjacente foram cortados do seu genoma de origem através de um
script customizado desenvolvido especialmente para esta finalidade. Cada loco SSR gerado foi
comparado com os demais genomas por meio do software Blastall modificado para análises em
larga escala e instalado em um servidor local. O software foi configurado para reconhecer
regiões de alta similaridade (e-value ≤ 1e-100
). Os locos analisados foram classificados como:
específicos para um determinado genoma; compartilhados entre dois genomas e compartilhados
entre todos os genomas.
Desenho de iniciadores específicos e compartilhados para amplificação e caracterização de
microssatélites presentes nos genomas dos grupos genéticos A, B e E.
Iniciadores foram desenhados de forma a amplificar a região adjacente ao SSR
selecionado. Foi utilizado o software Primer 3 Plus [36] para os SSRs específicos e o software
PriFi [37] para os SSRs compartilhados. Após os desenhos dos iniciadores, a qualidade dos
mesmos foi verificada pelo software Primer Select (DNASTAR, Madison, WI) em relação à
formação de dímeros. Foram desenhados 40 pares de iniciadores específicos para o grupo
genético A (que geram produto de amplificação tanto no genoma AI quanto no genoma AII), 20
pares de iniciadores específicos para o grupo genético B, 20 pares de iniciadores específicos para
o grupo genético E e 36 pares de iniciadores compartilhados entre todos os genomas. Os
iniciadores desenhados foram submetidos à amplificação in silico contra os genomas disponíveis
121
através do software FastPCR [38], para garantir a especificidade determinada previamente pela
análise dos locos.
Amplificação e caracterização de marcadores microssatélites presentes nos genomas dos
grupos genéticos A, B e E.
A caracterização de cada loco SSR foi realizada de forma a confirmar os resultados
previamente obtidos com as análises in silico. Cada reação de amplificação foi realizada em
amostras disponíveis no laboratório de quatro indivíduos dos grupos genéticos A, B, C, D
(totalizando 16 indivíduos) e em um indivíduo do grupo genético E. Essas amostras já foram
utilizadas previamente e todas já foram devidamente genotipadas com os genes triose fosfato
isomerase, beta-giardin e glutamato desidrogenase [39]. O DNA da cepa Portland 1 (grupo
genético AI) foi cedido pela pesquisadora Camila Henriques Coelho da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG).
Os fragmentos contendo os microssatélites foram amplificados através da reação em
cadeia da polimerase realizada em um volume total de 25µl contendo 1x Tampão PCR
(Invitrigen), 0,5µM de cada iniciador, 0,2mM de dNTP, 2,5mM de MgCl2, 1,25 unidades de Taq
Polymerase (Invitrogen) e 1µl de cada amostra. As reações foram realizadas em um
termociclador C1000 Thermal Cycler (BioRad) e o programa utilizado foi o TouchDown PCR
[40] que consiste em 94oC (2 min), seguido por 20 ciclos de 94
oC (1 min), 65
oC (1 min) e 72
oC (2
min). A cada dois ciclos a temperatura de anelamento diminui 1oC de forma que inicia em 65
oC e
termina em 55oC. Em seguida, o ultimo ciclo foi repetido 18 vezes e foi realizada a extensão
final, a 72oC (7 min). Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados através de
eletroforese em gel de agarose 3% seguida de coloração por brometo de etídeo e visualização sob
luz UV (Gene Genious Bio Imaging System – Syngene).
A reação de amplificação de um determinado loco foi considerada satisfatória quando
apenas o grupo genético (no caso dos marcadores específicos) ou todos os grupos genéticos (no
caso dos marcadores compartilhados) foram amplificados. Os iniciadores que não cumpriram
esses pré-requisitos foram descartados.
Após a seleção dos marcadores, 24 indivíduos de cada um dos grupos genéticos de estudo
foram amplificados com os iniciadores selecionados. Após amplificação e visualização em gel de
122
agarose, os indivíduos foram genotipados através de eletroforese vertical com a utilização de gel
de poliacrilamida denaturado 6% seguido por coloração em prata [41]. A Tabela Suplementar S1
e Tabela Suplementar S2 mostram a lista completa dos indivíduos utilizados para amplificação
dos grupos genéticos A e B, respectivamente.
Análise genético-estatística dos marcadores microssatélites selecionados
O conteúdo de informação de polimorfismo alélico de cada loco (polymorphic
information content – PIC) foi calculado utilizando-se a seguinte equação PIC =
2
1
2
11
2 21 j
n
ij
i
n
i
n
i
i ppp
[42] na qual n é o número de diferentes alelos do marcador
encontrados na população e pi e pj correspondem às frequências dos alelos i e j. As
heterozigosidades esperada e observada foram calculadas com o software TFPGA [43].
123
Figura 1. Fluxograma evidenciando todas as etapas da busca e caracterização dos
microssatélites em Giardia duodenalis.
124
Resultados
Busca e identificação de microssatélites nos genomas WB_AI, DH_AII, GS_B e P15_E.
Após análise pelos softwares MISA e SciRoKo, foram encontrados 506 SSRs no genoma
WB_AI, 438 SSRs no genoma DH_AII, 402 SSRs no genoma GS_B e 507 SSRs no genoma
P15_E. A Tabela 1 evidencia os resultados e separa os microssatélites encontrados pelos
diferentes números de repetições.
Tabela 1. Microssatélites encontrados nos diferentes genomas pelo número de repetições.
Repetição/Genoma AI AII B E
Di-5 78 77 131 84
Tri-4 206 156 123 207
Tetra-3 163 150 120 158
Penta-4 21 21 18 32
Hexa-3 38 34 10 26
Total 506 438 402 507
O grupo genético B apresenta um número pouco menor de SSRs quando comparada às
demais. As repetições de motivos trinucleotídeos são as mais frequentes entre todos, mas
apresenta um percentual reduzido no genoma B em relação aos demais. Motivos de repetição
trinucleotídeos e tetranucleotídeos correspondem a aproximadamente 70% de todas as repetições.
Os motivos microssatélites mais frequentes encontrados são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Motivos microssatélites mais frequentes encontrados nos diferentes genomas pelo
número de repetições.
Repetição/Genom
a AI AII B E
Di-5 AC/GT AC/GT AC/GT AC/GT
Tri-4 AAC/GTT AAC/GTT AGC/CTG ACG/CGT
Tetra-3 AAGC/CTTG AAGC/CTTG AAAG/CTTT AAAG/CTTT
Penta-4 AGAGC/CTCTG AGAGC/CTCTG ACCCT/AGGGT ACCCT/AGGGT
Hexa-3 ACTATC/AGTGA
T
ACTATC/AGTGA
T
AATTGC/AATTG
C
AACAGC/CTGTT
G
125
Análise in silico de transferibilidade entre os SSRs identificados em relação aos 3 genomas
disponíveis.
A análise dos microssatélites presentes nos genomas A, B e E permitiu a identificação de
SSRs específicos de cada genoma, compartilhados entre A e E, A e B, B e E e também
compartilhados entre os 3 grupos genéticos.
A análise dos SSRs nos diferentes grupos genéticos mostrou que a maior parte dos
marcadores é específica de um determinado grupo genético, com destaque para o grupo B, no
qual 90% dos SSRs identificados são específicos. Um porcentual baixo dos SSRs encontrados é
compartilhado entre os três grupos genéticos e uma parte considerável é compartilhada entre os
grupos A e E. O número de SSRs analisados é um pouco menor que o número real encontrado
porque alguns SSRs estão na ponta de contigs das sequências disponíveis e, portanto, não
puderam ser aproveitados uma vez que não possuem a região adjacente para desenho de
iniciadores. Os resultados completos da análise de cada um dos grupos genéticos podem ser
visualizados na Figura 2.
Após realizar a busca de SSRs compartilhados entre os três genomas, 56 locos SSRs
foram identificados no total, sendo 22 identificados inicialmente nos genomas A (e regiões
homólogas nos demais genomas), 16 identificados inicialmente no genoma B e 18 inicialmente
no genoma E. Após caracterização de cada SSR (identificação do motivo, região adjacente e
número de repetições) foi possível verificar que alguns deles se tratavam de regiões homólogas,
presentes nos três genomas. Assim, portanto, o número de 56 foi reduzido para o total de 36 SSRs
distintos compartilhados entre os três genomas.
Os locos SSRs foram investigados de forma a verificar quais seriam os mais promissores
para síntese de iniciadores. Um percentual considerável de SSRs apresentou alta similaridade em
mais de uma região de um determinado genoma, o que pode representar amplificações
inespecíficas. Dessa forma, esses locos SSR foram descartados. A Figura 3 evidencia o
percentual de SSRs (região adjacente) com similaridade em múltiplos locos (ML) entre os locos
genoma-específicos. A Figura 4 evidencia o percentual de SSRs (região adjacente) com
similaridade em múltiplos locos (ML) entre os SSRs presentes nos três genomas. Para o
desenvolvimento do presente projeto, foram utilizados os SSRs específicos que não estavam
presentes em múltiplos locos, para garantir a especificidade desejada.
126
Figura 2. Transferibilidade in silico das regiões adjacentes dos SSRs presentes no grupo
genético A em comparação com os genomas A, B e E.
127
Figura 3. Comparação entre locos SSRs específicos de cada genoma que foram detectados em
mais de uma região do mesmo genoma (ML) em relação aos presentes em apenas uma região.
Figura 4. Comparação entre locos SSRs compartilhados entre os três genomas que foram
detectados em mais de uma região do mesmo genoma (ML) em relação aos presentes em apenas
uma região.
128
Amplificação e caracterização dos microssatélites específicos
No total, 80 pares de iniciadores específicos foram desenhados. Um total de 57 iniciadores
geraram produtos de amplificação satisfatórios e amplificaram apenas os fragmentos esperados.
Os iniciadores que amplificaram fragmentos inespecíficos, fragmentos de outros grupos genéticos
ou não amplificaram o fragmento do grupo genético esperado, foram excluídos. Do grupo
genético A, 28 pares de iniciadores amplificaram apenas amostras desse grupo. Do grupo
genético B, 11 pares de iniciadores amplificaram apenas amostras do grupo B. Do grupo genético
E, 17 pares de iniciadores amplificaram apenas amostras do grupo E. Os resultados de
amplificação podem ser visualizados na Tabela Suplementar S3 e S4.
Amplificação e caracterização dos microssatélites compartilhados
No total, 36 pares de iniciadores foram desenhados. Um total de 4 pares de iniciadores
geraram os produtos de amplificação esperados em todos os grupos genéticos testados (AI, AII,
BIII, BIV, C, D e E). Uma vez que esses iniciadores foram desenhados sobre os genomas A, B e
E, não existiam garantias que gerasse produtos de amplificação nos demais cujos genomas ainda
não foram sequenciados. Dessa forma, os quatro marcadores desenvolvidos e amplificados
satisfatoriamente em todos os indivíduos testados podem representar novos marcadores
indicadores da presença de Giardia duodenalis em uma amostra. A análise in silico desses
marcadores não apresentou amplificação em outros genomas de microrganismos e outros
parasitas. Os resultados de amplificação podem ser visualizados na Tabela Suplementar S5.
Genotipagem das populações e análise de polimorfismo
Dentre os 28 locos SSRs do grupo genético A que haviam sido satisfatoriamente
amplificados nos ensaios prévios, polimorfismo alélico foi detectado em 12 locos sendo que os 16
locos restantes podem ser considerados monomórficos para as populações estudadas. Dentre os
12 locos polimórficos, a presença de indivíduos heterozigotos foi verificada em quatro locos
diferentes sendo que nos oito locos restantes diferentes alelos homozigotos foram genotipados. O
loco GduA24 foi o que apresentou maior número de alelos (4) e máximo valor de PIC (0,5388).
A Tabela 3 apresenta os resultados completos para o grupo genético A.
129
Tabela 3. Caracterização dos marcadores SSRs do grupo genético A.
Loco NA Variação He Ho PIC
Alélica
(Pb)
GduA01 2 228-224 0,1765 0 0,1574
GduA02 2 234-232 0,1287 0 0,1167
GduA03 1 244 0 0 0
GduA04 1 247 0 0 0
GduA05 1 179 0 0 0
GduA06 1 240 0 0 0
GduA07 1 189 0 0 0
GduA08 2 141-139 0,085 0,087 0,0797
GduA09 1 231 0 0 0
GduA10 2 170-168 0,5077 0 0,3724
GduA11 1 195 0 0 0
GduA12 1 195 0 0 0
GduA13 1 187 0 0 0
GduA14 1 231 0 0 0
GduA15 1 248 0 0 0
GduA16 2 170-168 0,4965 0,0833 0,3679
GduA17 2 249-246 0,0888 0 0,083
GduA18 1 205 0 0 0
GduA19 2 251-242 0,085 0 0,0797
GduA20 2 220-217 0,1765 0,0952 0,1574
GduA21 3 242-218 0,2718 0 0,2468
GduA22 1 194 0 0 0
GduA23 1 194 0 0 0
GduA24 4 187-175 0,63 0,1818 0,5388
GduA25 2 198-189 0,0929 0 0,0865
GduA26 2 251-248 0,1594 0 0,141
GduA27 1 176 0 0 0
GduA28 1 166 0 0 0
NA – Número de alelos, He – Heterozigosidade esperada, Ho – Heterozigosidade observada,
PIC – Conteúdo de Informação de polimorfismo.
Dentre os 11 locos SSRs do grupo genético B satisfatoriamente amplificados nos ensaios
prévios, polimorfismo alélico foi detectado em sete locos, sendo que os quatro restantes podem
ser considerados monomórficos para as populações estudadas. Dentre os sete locos polimórficos,
a presença de indivíduos heterozigotos foi verificada em quatro locos, sendo que nos três locos
restantes, diferentes alelos homozigotos foram genotipados. Os locos GduB01 e GduB06 foram
130
os que apresentaram o maior número de alelos (5) e o loco GduB02 foi o que apresentou o
máximo valor de PIC (0,5108). A tabela 4 apresenta os resultados completos para o grupo
genético B. Os locos específicos do grupo genético E não puderam ser genotipados pela ausência
de uma população de indivíduos desse grupo genético. Um exemplo de loco polimórfico
(GduB02) é apresentado na Figura 5 e um exemplo de loco monomórfico (GduB07) é
apresentado na Figura 6.
Tabela 4. Caracterização dos marcadores SSRs do grupo genético B.
Loco NA Variação He Ho PIC
Alélica
(Pb)
GduB01 5 230-209 0,4508 0,1111 0,3962
GduB02 3 165-153 0,591 0,1 0,5108
GduB03 3 185-173 0,2079 0,1111 0,1899
GduB04 1 224 0 0 0
GduB05 3 234-216 0,3763 0 0,3257
GduB06 5 224-188 0,4705 0,0435 0,4342
GduB07 1 236 0 0 0
GduB08 1 247 0 0 0
GduB09 2 253-250 0,241 0 0,2078
GduB10 2 250-244 0,2319 0 0,201
GduB11 1 202 0 0 0
NA – Número de alelos, He – Heterozigosidade esperada, Ho – Heterozigosidade observada, PIC
– Conteúdo de Informação de polimorfismo.
Figura 5. Gel de poliacrilamida 6% corado em solução de prata evidenciando polimorfismo do
marcador GduB02. Indivíduos HC07, HC15, HC25, HC30, HC32, HC33, HC34, HC39, HC43,
HC45, HC46, DC04, DC10, DC17, DC18, DC21, DC24, VET01, VET05, VET07, ENV03,
ENV04, ENV05, ENV06. Setas indicam indivíduos heterozigotos. Números (1, 2 e 3) indicam
1
2
3
131
alelos diferentes. Bandas fortes abaixo da banda principal são consideradas bandas fantasmas
(stutters) e correspondem à artefatos da reação de amplificação.
Figura 6. Gel de poliacrilamida 6% corado em solução de prata evidenciando marcador
monomórfico GduB07. Indivíduos HC07, HC15, HC25, HC30, HC32, HC33, HC34, HC39,
HC43, HC45, HC46, DC04, DC10, DC17, DC18, DC21, DC24, VET01, VET05, VET07,
ENV03, ENV04, ENV05, ENV06. Número1indica alelo detectado.
Dentre os quatro locos compartilhados por todos os grupos genéticos, apenas um
(GduABE01) apresentou polimorfismo alélico e com valor extremamente baixo de PIC (0,0415).
Todos os demais marcadores foram considerados monomórficos. A Tabela 5 apresenta os
resultados completos para os locos compartilhados.
Tabela 5. Caracterização dos marcadores SSRs compartilhados entre os genomas.
Loco NA Variação He Ho PIC
Alélica
(Pb)
GduABE01 2 333-330 0,043 0 0,0415
GduABE02 1 290 0 0 0
GduABE03 1 349 0 0 0
GduABE04 1 182 0 0 0
NA – Número de alelos, He – Heterozigosidade esperada, Ho – Heterozigosidade observada, PIC
– Conteúdo de Informação de polimorfismo.
1
132
Discussão
Existem duas limitações básicas para o grau de resolução de um determinado marcador
molecular: a taxa global de mutação dos locos utilizados e o nível de recombinação do organismo
alvo. Nesse contexto, microssatélites possuem uma taxa de mutação maior que polimorfismos
nucleotídicos de genes conservados [30]. A variação na taxa de mutação dos genes amplamente
utilizados em estudos de genotipagem de microrganismos depende se este gene está atrelado a
funções basais da célula (housekeeping genes), que costumam ser altamente conservados ou se
está presente em regiões mais variáveis como regiões antigênicas (variant-specific surface protein
- VSP). Além disso, regiões intergênicas e íntros costumam apresentar maior taxa de mutação em
relação a exons [44].
Os dados do presente artigo mostram um padrão bastante distinto de variação entre os
marcadores desenvolvidos para o genoma A e genoma B, tanto no número de alelos encontrados,
quanto no conteúdo de informação de polimorfismo dos locos. A diferença na frequência de
heterozigosidade nesses grupos descrita previamente em diversos trabalhos [11,39] foi verificada
com os locos microssatélites desenvolvidos e corroboram a hipótese de complexo de espécies do
organismo.
O presente estudo mostrou que, em G. duodenalis, repetições microssatélites do tipo
trinucleotídeos são mais comuns sendo seguida pelas repetições tetranucleotídeos. O genoma de
G. duodenalis é altamente expresso [10] e a maioria absoluta das repetições de tetranucleotídeos
verificadas no presente estudo é baseada em três repetições. Assim, é possível determinar que, ao
longo da evolução, foram favorecidas as repetições baseadas em microssatélites que não
representam quebra no frame de leitura para a tradução de proteínas em G. duodenalis. Em
plantas, motivos dinucleotídeos têm sido reportados como os mais comuns [45]. Ao avaliar
apenas as sequências expressas (ESTs) em diversas plantas como cana [23], cevada [46] e uva
[47], motivos trinucleotídeos foram revelados como sendo os mais comuns. Em animais, motivos
dinucleotídeos foram revelados como mais frequentes tanto em Drosophila quanto em humanos.
Já em C. elegans, motivos dinucleotídeos e trinucleotídeos apresentaram frequências
semelhantes. Em leveduras, motivos trinucleotídeos foram descritos como os mais frequentes
[20].
133
É notável que apenas uma pequena parte dos locos microssatélites encontrados sejam
compartilhados entre todos os genomas publicados. Uma vez que para estar presente em
diferentes genomas, uma determinada região gênica necessita ser mais conservada, é
perfeitamente plausível a pouca ocorrência de marcadores microssatélites compartilhados entre os
genomas de G. duodenalis. Além disso, dentre os microssatélites compartilhados que foram
identificados, os valores de PIC apresentaram-se como zero ou extremamente baixos, o que
também está de acordo com a menor variabilidade desses locos.
As comparações estabelecidas entre os locos microssatélites desenvolvidos no presente
estudo evidenciam um maior compartilhamento de SSRs entre os grupos genéticos A e E ao
mesmo tempo em que ambos os grupos mostram-se muito diferentes do grupo B. Esse resultado
corrobora resultados já obtidos através de genes conservados que evidenciam uma maior
proximidade genética entre os grupos A e E em relação ao grupo B [48].
Dentre os locos SSRs encontrados, uma parte significativa mostrou-se presente em mais
de uma região do mesmo genoma e não pode, portanto, ser utilizada para desenho de iniciadores.
Microssatélites não raramente podem estar associados a regiões repetitivas do genoma, tais como
elementos de transposição ou proteínas de variação antigênica. A associação entre microssatélites
e elementos repetitivos tem sido documentada previamente em vertebrados e plantas de forma
que motivos dinucleotídeos, especialmente CA/GT, são geralmente associados com elementos
repetitivos [49]. Dessa forma, não é um fato inesperado esses locos possuírem repetições ao longo
de um mesmo genoma.
Giardia duodenalis tem sido descrito como um organismo central no debate sobre a
predominante clonalidade reprodutiva de protozoários patogênicos. Baixas taxas de recombinação
são descritas ao se comparar os genomas A, B e E [50] ao mesmo tempo em que evidências de
trocas genéticas entre isolados têm sido descritas por diversos autores [15,51]. Nesse contexto,
duas abordagens são consideradas chave para detectar trocas genéticas em locais onde os isolados
apresentam suposta similaridade. A primeira é focar o estudo em zonas híbridas, onde diferentes
subpopulações podem estar em contato e a segunda é aumentar o poder discriminatório dos
marcadores moleculares utilizados [52].
No presente trabalho, em locos considerados polimórficos, alguns indivíduos foram
genotipados como heterozigotos, no qual dois ou mais alelos foram detectados em um único
indivíduo. Embora tal detecção seja comum em outros organismos [45,46,47], peculiaridades do
134
genoma de Giardia duodenalis acirram a discussão sobre diferentes aspectos sobre a origem de
tal variação. O sequenciamento de alguns genomas de G. duodenalis evidenciou uma baixa taxa
de heterozigosidade alélica, bastante evidente no genoma WB_A. Embora superior no genoma
GS_B, essa taxa ainda pode ser considerada baixa o que diminui a expectativa sobre a
identificação de indivíduos heterozigotos[33-36].
Uma primeira hipótese é que os indivíduos heterozigotos apresentem variabilidade dentro
de seu núcleo e tal variação seja expressa através de alelos distintos. A informação relativa à
maior variabilidade do genoma B pode ser confirmada no presente estudo de forma que um
número maior de locos polimórficos e indivíduos heterozigotos foram identificados nesse grupo
genético. Também não se pode descartar a possibilidade de variação entre diferentes núcleos,
através de trocas genéticas ou transferência lateral de genes [9]. Tais fatos poderiam explicar a
variação encontrada e continuariam sendo no nível de indivíduos. Uma terceira hipótese se refere
à possibilidade de contaminações mistas em isolados de G. duodenalis. A variação detectada
pode representar alelos diferentes de indivíduos homozigotos. Um método importante para
definitivamente identificar se a variação detectada refere-se a um cisto ou a infecção mista é o
método de isolamento de uma única célula (cisto ou trofozoítos), sendo sucedido pela análise da
variação nessa célula. Embora infecções mistas sejam comuns e possivelmente tenham papel
protagonista nos dados de heterozigosidade publicados até o presente momento [15], a variação
alélica no nível de célula foi demonstrada em G. duodenalis [53]. Além disso, importantes
métodos como clonagem e sequenciamento desses indivíduos heterozigotos podem gerar
evidências de infecções mistas pois podem amostrar ainda outros genótipos não amostrados
previamente [39]. O sequenciamento do fragmento também seria importante para comprovar que
não se trata de amplificação inespecífica em um dos alelos.
Os marcadores específicos desenvolvidos que apresentaram diversidade de alelos e valor
considerável de PIC demonstram grande possibilidade de utilização em futuros estudos que
busquem identificar diversidade genética em amostras de Giardia duodenalis. A genotipagem
multilocos com esses marcadores possibilitará um nível de resolução maior que o verificado com
a utilização de genes conservados. Tal fato pode ajudar a fornecer mais informações sobre trocas
genéticas em G. duodenalis e ampliar o debate sobre a clonalidade reprodutiva do organismo.
Além disso, esses marcadores, em conjunto com os marcadores específicos monomórficos,
135
podem ser utilizados para identificação dos grupos genéticos A, B ou E através de PCR, uma vez
que comprovadamente não amplificam os demais grupos genéticos testados.
No presente estudo, apenas um marcador compartilhado pelos grupos genéticos testados
apresentou polimorfismo e com valor baixo de PIC. Esse resultado era esperado uma vez que o
loco deve ser bastante conservado para estar presente em diferentes grupos genéticos de G.
duodenalis, o que reduz significativamente a chance de ocorrer polimorfismos nesses locos. Estes
locos conservados entre grupos genéticos diferentes possuem grande valor para a identificação de
G. duodenalis e podem somar-se aos genes clássicos utilizados na literatura. O loco GduABE01
mostra-se promissor para futuros estudos que possam avaliar mais profundamente seu grau de
polimorfismo por meio de genotipagem em mais indivíduos ou sequenciamento do fragmento
amplificado.
Conclusões
No presente artigo, reportamos o desenvolvimento de novos marcadores microssatélites
para Giardia duodenalis que representam um robusto recurso para estudos de diversidade
genética do parasito. Os locos mais polimórficos podem servir para futuros estudos populacionais
em um nível maior de discriminação que possam identificar a fonte de contaminação e promover
o rastreamento da doença. Futuros estudos devem buscar a origem da variação genética em
indivíduos heterozigotos, seja através do isolamento de cistos individuais ou através de métodos
de clonagem e sequenciamento genético.
Além disso, os marcadores desenvolvidos podem ser utilizados para identificação de G.
duodenalis em amostras clínicas e ambientais bem como para a identificação dos principais
grupos genéticos da espécie. Por serem baseados em PCR e não necessitarem de sequenciamento,
os iniciadores desenvolvidos podem representar um método de diagnóstico acessível para
empresas de saneamento, instituições de diagnóstico (como centros de controle de zoonoses,
clínicas veterinárias e laboratórios de diagnóstico) instituições de pesquisa.
Existe uma crescente demanda pela caracterização do patógeno em um nível maior de
discriminação, seja pelo acirramento de leis de potabilidade de água ou pela necessidade de obter
novas ferramentas que possam rastrear a origem desses organismos. Essa demanda vai definir se
os locos informativos disponibilizados nessa pesquisa, e em futuros estudos, serão utilizados
136
através da avaliação do polimorfismo alélico, sequenciamento genético ou genotipagem através
de PCR em tempo real.
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142
Informações Suplementares
Tabela S1. Indivíduos utilizados para genotipagem do grupo genético A.
Amostra Origem Grupo
Genético
1 HC01 Humana AII
2 HC10 Humana AII
3 HC11 Humana AII
4 HC12 Humana AII
5 HC27 Humana AII
6 HC36 Humana AII
7 HC40 Humana AII
8 HC42 Humana AII
9 HC44 Humana AII
10 HC48 Humana AII
11 HC49 Humana AII
12 HC49 Humana AII
13 HC50 Humana AII
14 HC51 Humana AII
15 VET02 Animal AII
16 VET04 Animal AII
17 VET06 Animal AII
18 DC12 Humana AII
19 DC15 Humana AII
20 DC25 Humana AII
21 DC27 Humana AII
22 DC28 Humana AII
23 ENV01 Ambiental AII
24 PORTLAND I Cultura AI
143
Tabela S2. Indivíduos utilizados para genotipagem do grupo genético B.
Amostra Origem Grupo
Genético
1 HC07 Humana BIII
2 HC15 Humana BIV
3 HC25 Humana BIV
4 HC30 Humana BIV
5 HC32 Humana BIV
6 HC33 Humana BIII
7 HC34 Humana BIV
8 HC39 Humana BIV
9 HC43 Humana BIV
10 HC45 Humana BIV
11 HC46 Humana BIV
12 DC04 Humana BIII
13 DC10 Humana BIII
14 DC17 Humana BIV
15 DC18 Humana BIII
16 DC21 Humana BIV
17 DC24 Humana BIV
18 VET01 Animal BIV
19 VET05 Animal BIV
20 VET07 Animal BIV
21 ENV03 Ambiental BIV
22 ENV04 Ambiental BIII
23 ENV05 Ambiental BIV
24 ENV06 Ambiental BIII
144
Tabela Suplementar S3. Resultados de amplificação dos SSRs específicos do grupo A
Loco Amplificação Amplificação Genotipagem Resultado
específica inespecífica acrilamida final
GduA01 sim não satisfatório aprovado
GED2 não não - não aprovado
GED3 sim sim - não aprovado
GduA02 sim não satisfatório aprovado
GduA03 sim não satisfatório aprovado
GduA04 sim não satisfatório aprovado
GduA05 sim não satisfatório aprovado
GduA06 sim não satisfatório aprovado
GED9 não não - não aprovado
GED10 sim sim - não aprovado
GduA07 sim não satisfatório aprovado
GduA08 sim não satisfatório aprovado
GduA09 sim não satisfatório aprovado
GduA10 sim não satisfatório aprovado
GduA11 sim não satisfatório aprovado
GduA12 sim não satisfatório aprovado
GduA13 sim não satisfatório aprovado
GGD8 sim sim - não aprovado
GduA14 sim não satisfatório aprovado
GduA15 sim não satisfatório aprovado
GduA16 sim não satisfatório aprovado
GduA17 sim não satisfatório aprovado
GduA18 sim não satisfatório aprovado
GduA19 sim não satisfatório aprovado
GET5 não não - não aprovado
GET6 não não - não aprovado
GduA20 sim não satisfatório aprovado
GET8 não não - não aprovado
GduA21 sim não satisfatório aprovado
GduA22 sim não satisfatório aprovado
GduA23 sim não satisfatório aprovado
GduA24 sim não satisfatório aprovado
GduA25 sim não satisfatório aprovado
GGT4 não não - não aprovado
GduA26 sim não satisfatório aprovado
GGT6 sim não insatisfatório não aprovado
GGT7 sim não insatisfatório não aprovado
GGT8 sim não insatisfatório não aprovado
GduA27 sim não satisfatório aprovado
GduA28 sim não satisfatório aprovado
145
Tabela Suplementar S4. Resultados de amplificação dos SSRs específicos do grupo B
Loco Amplificação Amplificação Genotipagem Resultado
específica inespecífica acrilamida final
B01 sim não insatisfatório não aprovado
B02 sim sim - não aprovado
B03 não não insatisfatório não aprovado
B04 sim sim satisfatório não aprovado
GduB01 sim não satisfatório aprovado
GduB02 sim não satisfatório aprovado
B07 sim sim - não aprovado
GduB03 sim não satisfatório aprovado
GduB04 sim não satisfatório aprovado
GduB05 sim não satisfatório aprovado
GduB06 sim não satisfatório aprovado
B12 sim não insatisfatório não aprovado
GduB07 sim não satisfatório aprovado
GduB08 sim não satisfatório aprovado
B15 sim não insatisfatório não aprovado
GduB09 sim não satisfatório aprovado
B17 sim não insatisfatório não aprovado
GduB10 sim não satisfatório aprovado
B19 não não - não aprovado
GduB11 sim não satisfatório aprovado
146
Tabela Suplementar S5. Resultados de amplificação dos SSRs compartilhados entre grupos
Loco Amplificação Genotipagem Resultado
todos grupos acrilamida final
ABE01 não - não aprovado
ABE02 não - não aprovado
ABE03 não - não aprovado
ABE04 não - não aprovado
GduABE01 sim satisfatório aprovado
ABE06 não - não aprovado
ABE07 não - não aprovado
ABE08 não - não aprovado
ABE09 não - não aprovado
ABE10 não - não aprovado
ABE11 não - não aprovado
ABE12 não - não aprovado
ABE13 não - não aprovado
ABE14 não - não aprovado
ABE15 não - não aprovado
GduABE02 sim satisfatório aprovado
ABE17 não - não aprovado
ABE18 não - não aprovado
ABE19 não - não aprovado
ABE20 não - não aprovado
ABE21 não - não aprovado
ABE22 não - não aprovado
ABE23 não - não aprovado
ABE24 não - não aprovado
GduABE03 sim satisfatório aprovado
ABE26 não - não aprovado
ABE27 não - não aprovado
ABE28 não - não aprovado
ABE29 não - não aprovado
ABE30 não - não aprovado
GduABE04 sim satisfatório aprovado
ABE32 não - não aprovado
ABE33 não - não aprovado
ABE34 não - não aprovado
ABE35 não - não aprovado
ABE36 não - não aprovado
147
Considerações Finais
148
149
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A principal motivação para a realização do presente trabalho foi a necessidade de
aprofundar os conhecimentos sobre a diversidade genética de Giardia duodenalis bem como
como estabelecer comparações entre diferentes populações do organismo, além de contribuir com
a publicação de novos marcadores moleculares, úteis a futuros trabalhos de identificação do
organismo e caracterização da diversidade. A literatura científica a respeito de G. duodenalis
possui poucos estudos no âmbito populacional e tal fato limita uma real inferência sobre o
potencial zoonótico de isolados bem como a contribuição de cada população na vulnerabilidade
de outra em relação à possíveis rotas de contaminação. Além disso, o conhecimento acerca da
epidemiologia molecular de Giardia tem sido construído, ao longo de toda sua história, com base
em poucos marcadores moleculares conservados. Poucos estudos têm se proposto a pesquisar
novos marcadores que apresentem maior poder de discriminação. Acreditamos que os
conhecimentos obtidos e divulgados no presente trabalho possam contribuir para o entendimento
da biologia do organismo, sua epidemiologia e os mecanismos que possam explicar a origem da
diversidade encontrada.
Os estudos nesse âmbito realizados no Brasil são recentes e, em sua maioria, utilizam
poucos marcadores moleculares para atribuição dos grupos genéticos. Os estudos ambientais com
a utilização de ferramentas moleculares são escassos e, em sua maioria, apenas atestam a
presença de Giardia sp em sítios ambientais. Estudos internacionais, embora muito desenvolvidos
na questão de genotipagem multilocos, detecção de potencial zoonótico e possíveis infecções
mistas, raramente demonstram preocupação em tentar relacionar os genótipos obtidos de amostras
clínicas e amostras ambientais. Nesse sentido, a identificação seguida pela comparação de grupos
genéticos de amostras clínicas e ambientais (Capítulo I) pode ser considerada como uma
contribuição direta tanto para grupos que estudam amostras clínicas, quanto para os que estudam
amostras ambientais. Além disso, o trabalho desenvolvido é um incentivo para que comparações
de haplótipos possam ser estabelecidas entre ambos (clínico e ambiental) a fim de entender o real
impacto de amostras com potencial zoonótico.
Através da caracterização multilocos de amostras clínicas e ambientais, foi verificada uma
elevada prevalência de cistos com potencial zoonótico em amostras provenientes de animais e
amostras ambientais. Dessa forma, já fica demonstrado o potencial impacto e risco que cistos de
Giardia presentes em animais e em amostras ambientais representam às pessoas. Do ponto de
150
vista genético, foi detectada grande diversidade genética em Giardia duodenalis, principalmente
nos isolados pertencentes ao grupo genético B, resultado este coerente com o genoma publicado
(Franzen et al, 2009) no qual grande variação foi encontrada, ao contrário do genoma do grupo
AI (Morrison et al, 2007).
Em relação ao Capítulo II, destaca-se a comparação entre populações de Giardia
duodenalis através de análises de genética de populações. Existe grande dificuldade em definir
uma população de micro-organismos pois muitos dos princípios básicos estabelecidos pela
genética de populações não são seguidos por esses organismos. Ainda assim, informações da
literatura sobre a grande diversidade entre isolados de diferentes grupos genéticos (Jerlström-
Hultqvist et al, 2010) e dados obtidos em testes na presente pesquisa evidenciaram a necessidade
de se tratar os diferentes grupos genéticos como populações distintas. Assim como não faz
sentido, em termos de genética de populações, comparar dados de sequência de espécies
diferentes, os dados obtidos no Capítulo II evidenciaram que grupos genéticos distintos são muito
diferentes para serem comparados, o que pode gerar resultados com grande viés.
As parcerias estabelecidas no trabalho desenvolvidos no Capítulo II permitiram que novas
populações fossem adicionadas às já existentes, apresentadas no Capítulo I. As novas análises
realizadas evidenciaram que, com exceção da população canina, os demais grupos são muito
próximos geneticamente. A detecção de haplótipos compartilhados entre esses grupos é mais uma
evidência da possível contaminação de uma população com isolados de outra. A informação
obtida com os haplótipos também evidenciou o compartilhamento de haplótipos entre a
população canina com a população humana. Assim, mesmo que de maneira geral a população
canina apresente genótipos específicos de cães, existe também a possibilidade de contaminação
em humanos, o que foi demonstrado tanto com cistos dos grupos genéticos comumente
encontrados em humanos (A e B) quanto por cistos do grupo genético C, raramente encontrados
em humanos mas que foram detectados no presentes estudo.
O Capítulo III apresentou a identificação e caracterização de novos marcadores
moleculares para Giardia duodenalis. Nos últimos anos, quatro diferentes genomas de G.
duodenalis foram publicados (Morrison et al, 2007, Franzén et al, 2009, Jerlström-Hultqvist et al,
2010 e Adam et al, 2013) sendo, portanto, importante que as informações neles presentes sejam
utilizadas para o contínuo entendimento da biologia do organismo. Muitas informações sobre
variação genética, introgressão gênica e da origem evolutiva do organismo podem ser inferidas a
151
partir da comparação dos genomas. No presente estudo, foram identificados locos específicos dos
genomas A, B e E e também compartilhados entre todos, para que novos marcadores fossem
desenvolvidos. Os genes comumente utilizados pelos pesquisadores para caracterizar os grupos
genéticos de Giardia duodenalis (tpi, bg, gdh entre outros) apresentam polimorfismo ao se
realizar o sequenciamento. Mas como estão presentes em todos os grupos, são necessariamente
conservados em Giardia o que impede maior variação. Nesse contexto, novos artigos têm
sugerido o desenvolvimento de marcadores hipervariáveis (Caccio e Ryan, 2008) e marcadores
especificos dos grupos genéticos (Vanni et al, 2012). O que ambos têm em comum, é a ampla
possibilidade de possuírem maior poder de discriminação em relação aos marcadores mais
utilizados. A junção dessa necessidade com as informações disponibilizadas nos genomas
publicados foi o que motivou o presente capítulo, no qual marcadores específicos foram
desenvolvidos e polimorfismo foi encontrado. Os marcadores monomórficos também podem ser
utilizados para identificação dos grupos genéticos. Os marcadores polimórficos poderão ser
utilizados para caracterização da diversidade em um nível maior de resolução. Mais importante
que os iniciadores desenhados são os locos investigados pois, estes podem ser avaliados através
de PCR comum, PCR quantitativa ou mesmo sequenciamento.
Dessa forma, na presente tese, buscou-se contribuir para o conhecimento associado à
Giardia duodenalis através de diferentes abordagens, que podem ser consideradas
complementares. Foram identificados os principais grupos presentes em um região metropolitana,
diferentes populações foram comparadas e novos marcadores moleculares foram desenvolvidos.
152
153
Resumo dos Resultados
154
155
RESUMO DOS RESULTADOS
No presente trabalho, concluímos que os objetivos dos três diferentes capítulos foram
alcançados e os principais resultados são resumidos a seguir:
Capítulo I:
- Foi detectada elevada prevalência de cistos com potencial zoonótico em amostras clínicas e
amostras ambientais na Região Metropolitana de Campinas;
- Genótipos mistos foram detectados em 25% do total de amostras;
- Foi detectada grande diversidade genética dos isolados da Região Metropolitana de Campinas, o
que levou a elevado número de haplótipos distintos identificados.
Capítulo II:
- Muitos haplótipos foram identificados nas diferentes populações; alguns desses haplótipos
foram amostrados em grande frequência em diferentes populações;
- As populações de Giardia duodenalis, tanto de hospital quanto da creche, são bastante similares
e apresentam diversos haplótipos compartilhados;
- As populações de Giardia duodenalis obtidas de amostras clínicas (hospital e creche) são
bastante similares às populações ambientais provenientes de rios e de esgoto, apresentando
diversos haplótipos compartilhados;
- As populações caninas de Giardia duodenalis apresentam, em sua maioria, haplótipos
específicos de infecções caninas e são geneticamente muito diferentes das demais populações
amostradas (populações clínicas humanas e ambiental).
156
Capítulo III:
- Identificação de 506 SSRs no genoma WB_AI, 438 SSRs no genoma DH_AII, 402 SSRs no
genoma GS_B e 507 SSRs no genoma P15_E;
- Nos genomas dos grupos genéticos de Giardia duodenalis até o presente momento publicados,
repetições baseadas em trinucleotídeos e em tetranucleotídeos são as mais frequentes;
- Foram desenvolvidos 28 marcadores SSRs específicos do grupo A, 11 marcadores específicos
do grupo B e 17 específicos do grupo E;
- Foram desenvolvidos quatro marcadores compartilhados entre os grupos genéticos A, B e E de
Giardia duodenalis;
- Houve identificação de polimorfismo em 12 locos SSRs do grupo A e em sete locos SSRs do
grupo B, além de polimorfismo em um loco SSR compartilhado entre todos os grupos.
157
Conclusões
158
159
CONCLUSÕES
A análise de diferentes populações de Giardia duodenalis em uma importante região
metropolitana brasileira permitiu determinar que a variabilidade genética do protozoário é
elevada nessa região e que há diversos haplótipos compartilhados entre populações clínicas e
ambientais, o que salienta a importância da discussão sobre o potencial zoonótico dos isolados
identificados.
O genoma dos diferentes grupos genéticos de Giardia duodenalis publicados apresenta
repetições do tipo microssatélites. Há polimorfismo entre diferentes amostras de G. duodenalis
para vários locos analisados, onde tais repetições microssatélites estão presentes, o que demonstra
grande potencial de utilização desses marcadores (com maior potencial de discriminação) para
estudos populacionais e de diversidade e de identificação dos diferentes grupos genéticos de G.
duodenalis.
160
161
Perspectivas
162
163
PERSPECTIVAS
O conhecimento de aspectos relevantes da epidemiologia molecular de Giardia
duodenalis bem como o desenvolvimento de marcadores moleculares com maior potencial
discriminatório permitem o estabelecimento de novas perspectivas de curto, médio e longo prazo.
Em relação ao Capítulo I, no qual foi realizada uma amostragem da diversidade genética
presente na Região Metropolitana de Campinas, a médio prazo, são necessários muitos estudos de
monitoramento nas regiões amostradas (bem como de outras também de interesse) para que se
tenha uma real dimensão da variabilidade do organismo. Do ponto de vista clínico, essa região
possui diversos hospitais, creches, clínicas veterinárias, centros de controle de zoonoses,
pastagens além de parques públicos com animais errantes. Do ponto de vista ambiental, a Região
Metropolitana está sobre três importantes bacias hidrográficas brasileiras (Bacia do Rio Atibaia,
Bacia do Ribeirão Quilombo e Bacia do Rio Capivari) que convergem suas águas para o Rio
Tietê e, em seguida, para o Rio Paraná. Além disso, o Rio Atibaia é pertencente à Bacia PCJ
(Rios Piracicaba, Capivari e Jundiaí), que forma os reservatórios do Sistema Cantareira. Todos
esses locais citados são de alta relevância para estudos epidemiológicos moleculares que possam
atestar a vulnerabilidade da população em relação à possibilidade de infecção por Giardia.
A caracterização molecular dos cistos de Giardia presentes nessas regiões é de suma
importância para: I. Verificar a extensão da contaminação humana na região; II. Identificar
haplótipos comuns entre as regiões e III. Estabelecer o perfil genético multilocos dessas amostras
para que os perfis genéticos mais frequentes dessas regiões sejam identificados. Dessa forma, a
curto prazo, novos estudos ambientais devem buscar a implementação de métodos moleculares
para que se possa conhecer os grupos genéticos presentes nas diversas regiões. As ferramentas
moleculares têm estado cada vez mais presentes em instituições de pesquisa e mesmo as
instituições de fomento têm estimulado a construção de laboratório multidisciplinares.
Em um segundo momento, com o acúmulo de dados moleculares dos diferentes locais de
interesse, poderá ser estabelecido o perfil genético de Giardia de cada local, através da
caracterização multilocos dos principais haplótipos encontrados. Essa é uma perspectiva de longo
prazo pois são necessários anos para que esses dados sejam obtidos e possam ser comparados.
Futuros estudos moleculares de monitoramento são necessários em: águas superficiais, efluentes
de esgoto, estações de tratamento de esgoto, estações de tratamento de água, hospitais, creches e
164
canis públicos. Todas as ferramentas utilizadas no artigo recém publicado oriundo da presente
tese (Capítulo I) podem ser implementadas nesses locais.
Em relação ao Capítulo II, as perspectivas são muito semelhantes às anteriores.
Entretanto, em complementação ao Capítulo I, o trabalho apresentado neste capítulo mostrou as
comparações entre as diferentes populações. É notável a ausência de estudos que busquem
estabelecer comparações entre amostras clínicas e ambientais. Muitos são os desafios e dúvidas
(por exemplo, dificuldade na atribuição de infecções mistas ou eventos de recombinação
genética) mas os resultados que podem ser obtidos com estudos populacionais fornecem
importantes informações epidemiológicas que mostram a dinâmica do protozoário sob diversos
aspectos.
Os marcadores moleculares desenvolvidos no Capítulo III podem servir como base para
comparação com os atuais marcadores comumente utilizados em Giardia duodenalis. São
necessários mais estudos que possam comparar o poder de discriminação desses marcadores, de
forma que novos resultados, com maior poder discriminatório possível, possam ser obtidos.
Assim, duas amostras que se mostrem idênticas para os marcadores atuais, poderão revelar-se
diferentes quando comparadas após análise realizada com marcadores cujo polimorfimso é maior
entre as amostras de G. duodenalis. A natureza repetitiva dos marcadores microssatélites e suas
altas taxas de mutação geram grandes perspectivas acerca de seu uso em tais estudos. Já os
marcadores considerados monomórficos no presente trabalho, em conjunto com os marcadores
polimórficos, podem servir, a curto prazo, para estudos de identificação de Giardia duodealis, be
como de seus principais grupos genéticos. A vantagem deste fato está na facilidade com que os
marcadores publicados nesse capítulo podem ser utilizados, por serem baseados em PCR e não
necessitarem de posterior sequenciamento. Dessa forma, existe uma boa perspectiva de que a
identificação dos principais grupos genéticos de Giardia duodenalis se torne mais acessível e
possam representar um método de diagnóstico a baixo custo e bastante rápido, facilitando seu
emprego para as empresas de saneamento, instituições de diagnóstico (como centros de controle
de zoonoses, clínicas veterinárias e laboratórios de diagnóstico) além de instituições de pesquisa.
165
Literatura Citada
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Anexos
I. Evaluation of tropical water sources and mollusks in
southern Brazil using microbiological, biochemical, and
chemical parameters
II. Sanitary quality of edible bivalve mollusks in
Southeastern Brazil using an UV based depuration system
III. Infectivity of Giardia duodenalis Cysts from UV
Light-Disinfected Wastewater Effluent Using a Nude
BALB/c Mouse Model
IV. Declaração Bioética
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