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ÉRICA MARUSA PERGO
GERMINAÇÃO, CRESCIMENTO E
METABOLISMO ENERGÉTICO DE Bidens pilosa
L.: EFEITOS DA CUMARINA E OUTROS
ALELOQUÍMICOS
MARINGÁ
PARANÁ-BRASIL
AGOSTO - 2005
2
Érica Marusa Pergo
GERMINAÇÃO, CRESCIMENTO E
METABOLISMO ENERGÉTICO DE Bidens pilosa
L.: EFEITOS DA CUMARINA E OUTROS
ALELOQUÍMICOS
Orientadora: Dra. Emy Luiza Ishii-Iwamoto
Maringá 2005
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá, área de concentração em Biologia Celular, para obtenção do grau de Mestre.
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Pergo, Érica Marusa P439g Germinação, crescimento e metabolismo en ergético de
Bidens pilosa L.: efeitos da cumarina e outros aleloquímicos / Érica Marusa Pergo. – Maringá, PR : [s.n.], 2005.
51 f. : il. Orientador : Profª Drª Emy Luiza Ishii-I wamoto Dissertação (mestrado) - Universidade Es tadual de
Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2005.
1. Bidens pilosa L. (Planta daninha) - Atividade
respiratória. 2. Bidens pilosa L. (Planta daninha) - Germinação e crescimento. 3. Bidens pilosa L. (Planta daninha) - Atividades de enzimas. 4. Bidens pilosa L. (Planta daninha) - Efeitos da cumarina. 5. Cumarina (Produto natural) - Aleloquímico. 6. Bioquímica - Metabolismo. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. I I. Título.
CDD 21.ed. 572.4 572
ELIANE M. S. JOVANOVICH CRB 9/1250
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APRESENTAÇÃO DO TRABALHO
Em concordância com as normas fixadas pelo Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas, a dissertação foi redigida na forma de dois artigos conforme segue:
1. Érica M. Pergo, Denise Abrahim, Ana Maria Kelmer-Bracht, Patrícia Cristina S.
da Silva, Elemar Voll and Emy L. Ishii-Iwamoto. The energy metabolism of
Bidens pilosa L. during postgerminative growth: The effects of coumarin.
Weed Research, submetido.
2. Érica M. Pergo e Emy Luiza Ishii-Iwamoto. Estudo comparativo da
fitotoxicidade de aleloquímicos de diferentes classes contra a planta invasora
Bidens pilosa L. (Picão-preto). A ser submetido.
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RESUMO
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS O gênero Bidens L., da família Asteraceae
(Compositae) contem muitas espécies de plantas invasoras. ESte gênero abrange
aproximadamente 280 espécies, sendo que mais de dois terços encontra-se na África e
na América, com aproximadamente 100 espécies em cada continente. A Bidens pilosa
L., uma espécie anual nativa da América tropical, está atualmente difundida por todas as
regiões não frígidas do mundo. No Brasil, a espécie é responsável por perdas na
produtividade de diversas culturas, particularmente a soja. Embora muito se saiba sobre
a Bidens pilosa com relação às suas exigências para a germinação e o crescimento,
pouco é conhecido sobre suas características bioquímicas e fisiológicas da espécie
durante os primeiros estágios de crescimento. Em meados de 1993, foi demonstrado que
a Bidens pilosa desenvolveu resistência aos herbicidas conhecidos como inibidores da
acetolactato sintase, e existem estimativas de que espécies resistentes continuam
aumentando em distribuição e prevalência. Aleloquímicos que suprimem ou eliminam
plantas competidoras próximas às plantas que os produzem, têm recebido considerável
atenção em virtude do seu potencial como herbicidas naturais seletivos. A identificação
de produtos naturais bioativos capazes de inibir a germinação das sementes e o
crescimento de plantas invasoras é uma abordagem experimental comum. A finalidade
do presente trabalho foi identificar dentre onze aleloquímicos aqueles que exibem alta
fitotoxidade para a Bidens pilosa. Os seguintes compostos foram testados: ácido
ferúlico, ácido p-cumárico, ácido vanílico, ácido caféico, ácido protocatecuico,
eucaliptol, cânfora, quercetina, flavona, ácido aconítico e cumarina. Foi também
realizado um estudo sistemático dos efeitos do composto mais ativo sobre alguns
aspectos do metabolismo energético de Bidens pilosa durante o crescimento pós-
germinativo. A atividade respiratória e as atividades da álcool desidrogenase e da
lipoxigenase foram medidas nas raízes das plântulas.
MÉTODOS As sementes de Bidens pilosa foram semeadas sobre duas folhas de
papel de germinação, em placas de plástico gerbox, umedecidas com 12 ml de água
destilada ou com soluções dos diferentes aleloquímicos. As placas gerbox foram
acondicionadas em câmara de germinação programada para o seguinte regime: 8 h
claro (fluxo de fótons de 230 µmol m-2 s-1), a 30 °C, e 16 h escuro, a 20 °C. As
sementes que germinaram nos dias 2, 4, 5 ou 6 de incubação foram selecionadas para
iv
testes de crescimento. As sementes foram removidas, secadas em papel de filtro, e as
raízes primárias foram removidas para medidas dos comprimentos e dos pesos fresco. O
consumo de oxigênio das raízes das plântulas foi medido polarograficamente, a 25 °C,
em meio nutritivo, usando um eletrodo do tipo Clark. O cianeto de potássio (KCN) ou
o ácido salicilhidroxâmico (SHAM) foram adicionados no meio de reação para a
estimativa da contribuição da citocromo oxidase (COX), da oxidase alternativa (AOX)
e/ou oxidases extramitocondriais para o consumo total de O2. A atividade da
lipoxigenase em extratos de raízes foi medida pelo monitoramento das velocidades de
consumo de oxigênio na presença do ácido linolênico. A atividade da álcool
desidrogenase foi medida espectrofotometricamente pela avaliação da velocidade inicial
de redução da NAD+, em 340 nm, na presença de n-propanol. O nível de peroxidação
lipídica em extratos de raízes foi medido em termos dos conteúdos de malondialdeído
(MDA) e dienos conjugados. O conteúdo de malondialdeído (MDA) foi medido após
aquecimento dos extratos na presença de ácido tiobarbitúrico (TBA) e sob condições
ácidas. O pigmento vermelho produzido foi medido em 532 nm. Os dienos conjugados
foram medidos, no extrato alcoólico do homogeneizados das raízes, através de medidas
de absorbância a 234 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO O presente trabalho revelou diferentes efeitos e
potências dos aleloquímicos testados na germinação e no crescimento de Bidens pilosa.
O ácido ferúlico e a flavona reduxiram o número de sementes que germinaram, mas não
alteraram crescimento das raízes daquelas que germinaram. O ácido vanílico, por outro
lado, não afetou a germinação, mas inibiu o crescimento. O ácido aconítico estimulou o
crescimento da raiz, mas não alterou a germinação das sementes. A cânfora e a
cumarina inibiram tanto a germinação das sementes quanto o crescimento da raiz. Já o
ácido caféico, o ácido p-cumárico, o ácido protocatecuico, a quercetina e o eucaliptol
foram inativos. A cumarina foi o composto mais fitotóxico dentre todos os
aleloquímicos testados. As sementes de Bidens pilosa exibiram alta atividade
respiratória logo após a emergência das raízes primárias. Depois disso, foi observado
um declínio gradual. A contribuição relativa da respiração KCN-sensível na respiração
total também diminuiu. Ao contrário, a respiração SHAM-sensível foi aumentada. As
atividades da álcool desidrogenase e da lipoxigenase, nos extratos das raízes, foram
relativamente elevadas no 2º dia. Após, foi observado declínio acentuado das atividades
das duas enzimas. Quando as sementes de Bidens pilosa foram incubadas na presença
v
da cumarina na faixa de concentração de 10-100 µM, tanto a germinação das sementes
quanto o crescimento das raízes foram significativamente inibidos. No 2º dia, foi
observada supressão completa da germinação das sementes na concentração de
cumarina 50 µM ou maior. Entretanto, a velocidade de respiração dos ápices
radiculares, bem como as atividades da álcool desidrogenase e da lipoxigenase foram
estimuladas de maneira dose-dependente. Ocorreram similaridades entre os valores de
todos os parâmetros medidos em plântulas crescidas por 4 dias, na presença da cumarina
50 µM, e os obtidos em plântulas crescidas por 2 dias, na ausência da cumarina. Não
foi observada diferença significativa no conteúdo de MDA nos extratos das raízes de
plântulas tratadas e não-tratadas com cumarina. Por outro lado, o conteúdo de dienos
conjugados aumentou significativamente na concentração mais alta de cumarina
(50µM).
CONCLUSÕES Este estudo revelou que após a emergência das raízes primárias a
respiração é a via predominante de geração de ATP em Bidens pilosa, como indicado
pela alta atividade respiratória dos ápices radiculares. A fermentação contribuiu para o
metabolismo energético das raízes somente nas fases iniciais de crescimento. O fato dos
ápices radiculares exibirem alta atividade respiratória na presença de cumarina,
contraria a hipótese de que a ação do composto sobre Bidens pilosa L. se deve ao
comprometimento do metabolismo energético. As plântulas tratadas com cumarina
exibiram características de plântulas em um estágio precoce de crescimento, incluindo
menor percentual de germinação e crescimento, maior atividade respiratória das raízes e
maiores atividades das enzimas álcool desidrogenase e lipoxigenase. No conjunto, os
resultados revelam que a cumarina possui grande potencial fitotóxico contra Bidens
pilosa, agindo provavelmente como agente citostático. A observação que na maior
concentração (50 µM), a cumarina aumenta a atividade da lipoxigenase e o conteúdo de
dienos conjugados sugere que o composto induz uma condição de estresse oxidativo nas
raízes.
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ABSTRACT
INTRODUCTION AND AIMS The genus Bidens L. is in the Asteraceae
(Compositae) family, one which contains many weed species. The genus encompasses
approximately 280 species, over two-thirds of them in Africa and America, with about
100 species in each continent. Bidens pilosa L., an annual native of tropical America, is
now widespread throughout the warm regions of the world. In Brazil the species is
responsible for yield losses of several crops, particularly soybean. Although much is
known about Bidens pilosa in relation to its germination and growth requirements, little
is known about its biochemical and physiological characteristics during the early stage
of growth. It was demonstrated that Bidens pilosa L. first developed resistance to
herbicides known as acetolactase synthase inhibitors in 1993 and there were estimates
that the resistant species continues to increase in distribution and prevalence.
Allelochemicals that suppress or eliminate competing plant near the source plant have
received special attention due to agricultural potential of these compounds as selective
natural herbicides. The identification of naturally occurring bioactive products able to
inhibit the seed germination and seedling growth of weeds is a common approach. The
purpose of the present work was to identify which compounds among eleven
allelochemicals exhibit high phytotoxicity to Bidens pilosa. The following compounds
were tested: ferulic acid, p-coumaric acid, vanilic acid, caffeic acid, protocatechuic acid,
eucaliptol, camphor, quercetin, flavone, aconitic acid and coumarin. A systematic study
of the effects of the most active compound on some aspects of energy metabolism of
Bidens pilosa during postgerminative growth was also performed. The respiratory
activity, the activities of alcohol dehydrogenase and lipoxygenase were measured in
seedling roots.
METHODS Seeds of Bidens pilosa were placed on a double sheet of germination
paper in plastic gerbox plates moistened with 12 ml of distilled water or different
alelochemical solutions. Gerbox plates were placed in a growth chamber programmed
for the following regime: 8 h light (230 µmol m-2 s-1 photon flux) at 30°C and 16 h dark
at 20°C. The seeds that had germinated at 2, 4, 5 or 6 days were selected for growth
tests. The seedlings were removed, dried on filter paper, and the primary roots were
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excised for measurement of their length and fresh weight. The oxygen consumption of
roots from Bidens pilosa seedlings was measured polarographically, at 25°C, in a
nutrient solution using a Clark-type electrode. For estimating the contribution of the
cytochrome oxidase (COX), alternative oxidase (AOX) and/or extramitochondrial
oxidases to the overall O2 uptake, potassium cyanide (KCN) or salicylhydroxamic acid
(SHAM) was added to reaction medium. Lipoxygenase activity in root extracts was
measured by monitoring the oxygen consumption rates in the presence of linolenic acid.
Alcohol dehydrogenase activity was assayed spectrophotometrically by evaluating the
initial rate of NAD+ reduction at 340 nm in the presence of n-propanol. The level of
lipid peroxidation in root extracts was measured in terms of malondialdehyde (MDA)
and conjugated diene contents. The content of malondialdehyde (MDA) was assayed by
heating root extracts with thiobarbituric acid (TBA) under acidic conditions. The red
pigment produced was measured at 532 nm. The conjugated dienes were measured in
alcoholic extract of root homogenate by measuring the absorbance at 234 nm.
RESULTS AND DISCUSSION The present work revealed different effects and
potencies of each tested alleochemical on Bidens pilosa germination and growth. Ferulic
acid and flavone reduced the number of germinated seeds without alteration of root
growth of germinated seeds. Vanilic acid, on the other hand, inhibited root seedling
growth but did not affect seed germination. Aconitic acid caused stimulation of root
growth but did not alter seed germination. Camphor and coumarin inhibited both seed
germination and root seedling growth. Caffeic acid, p-coumaric acid, protocatechuic
acid, quercetin and eucaliptol were inactive. Coumarin was the most phytotoxic
compound among all assayed allelochemicals. Bidens pilosa seedlings exhibited high
respiratory activity shortly after the emergence of primary roots. Thereafter, a gradual
decline was observed. The relative contribution of KCN-sensitive respiration to overall
respiration also decreased. In contrast, the SHAM-sensitive respiration was increased.
The alcohol dehydrogenase and lipoxygenase activities in root extracts were relatively
high at day 2. After this time, an accentuated decline of both enzymes was observed.
When Bidens pilosa seeds were grown in the presence of coumarin in the concentration
range of 10-100 µM, both seed germination and seedling root growth were significantly
inhibited. At day 2, complete suppression of seed germination was observed with
coumarin at 50 µM concentration or higher. However, the overall respiration rates of
seedling root apices as well as the alcohol dehydrogenase and lipoxygenase activities
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were stimulated in a dose-dependent manner. There were several similarities between
the values of all parameters found in seedlings grown in the presence of 50 µM
coumarin for 4 days and those ones of seedlings grown for 2 days in the absence of
coumarin. No significant difference in the MDA content between the untreated and
coumarin-treated seedlings was observed. On the other hand, the conjugated diene
content was significantly increased at the high coumarin concentration (50 µM).
CONCLUSIONS This study reveals that after the emergence of primary roots
respiration is the dominating ATP-generation pathway in Bidens pilosa seedlings, as
indicated by the high respiratory activity of root apices. Fermentation contributes to the
energy metabolism of roots only at the initial phases of growth. The finding that root
apices exhibited high respiratory activity in the presence of coumarin argues against the
hypothesis that the compound acts in Bidens pilosa L. through an impairment of energy
metabolism. Coumarin-treated seedlings exhibited characteristics of seedlings in an
earlier stage of growth, including lower germination and seedling growth, higher root
respiratory activity and higher activities of alcohol dehydrogenase and lipoxygenase.
The whole of the results reveals that coumarin possesses strong phytotoxic potential
against Bidens pilosa, probably acting as a cytostatic agent. The observation that at the
highest concentration (50 µM) coumarin increased the lipoxygenase activity and the
level of conjugated dienes, suggests that the compound induces a condition of oxidative
stress in seedling roots.
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ESTUDO COMPARATIVO DA FITOTOXICIDADE DE
ALELOQUÍMICOS DE DIFERENTES CLASSES CONTRA A
PLANTA INVASORA Bidens pilosa L. (PICÃO-PRETO)
Érica Marusa Pergo e Emy Luiza Ishii-Iwamoto
Laboratório de Oxidações Biológicas, Departamento de Bioquímica da Universidade
Estadual de Maringá
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Resumo
O potencial fitotóxico de onze aleloquímicos de diferentes classes contra a planta
invasora Bidens pilosa L. foi avaliado. Todos os aleloquímicos foram testados na
concentração de 500 µM, com exceção da flavona (250 µM). A Bidens pilosa L. foi
totalmente resistente à ação dos seguintes aleloquímicos: ácido p-cumárico, ácido
caféico, ácido protocatecuico, quercetina e eucaliptol. Por outro lado, a planta foi
susceptível à ação do ácido ferúlico, ácido vanílico, cânfora, flavona, ácido aconítico e
cumarina. A potência e o modo de ação de cada aleloquímico foram diferentes. O ácido
ferúlico e a flavona reduziram o número de sementes germinadas, mas não afetaram o
crescimento das raízes das sementes que germinaram. O contrário ocorreu na presença
de ácido vanílico. A cumarina e a cânfora, por outro lado, inibiram tanto a germinação
quanto o crescimento. O ácido aconítico ao contrário dos outros compostos ativos,
promoveu um estímulo no crescimento das plântulas. A cumarina apresentou maior
atividade, exercendo forte efeito inibitório sobre a germinação e o crescimento na
concentração de 50 µM. Conclui-se que a cumarina possui grande potencial como
agente supressor da planta invasora Bidens pilosa, merecendo estudos adicionais, para
caracterizar o seu modo de ação e especificidade.
Palavras chaves: Bidens pilosa L., germinação, aleloquímicos, compostos fenólicos,
terpenos, ácido aconítico.
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Introdução
As culturas agrícolas do mesmo modo que as demais populações naturais estão
sujeitas a uma série de fatores ambientais que, direta ou indiretamente, influenciam seu
crescimento, desenvolvimento e produtividade econômica. Estes fatores, denominados
ecológicos, podem ser de natureza biótica ou abiótica. A presença das plantas silvestres
que emergem espontaneamente nos ecossistemas agrícolas pode condicionar uma série
de fatores bióticos atenuantes sobre as plantas cultivadas que irão interferir não só na
sua produtividade biológica como na operacionalização do sistema de produção
empregado. Por isso, estas plantas recebem o conceito de plantas daninhas ou plantas
invasoras e, normalmente, são alvos de controle (Pitelli, 1985). Ao mesmo tempo em
que as plantas invasoras indubitavelmente competem por recursos como espaço, luz,
água e nutrientes, sua habilidade de interferir quimicamente com outras plantas pode
também ser importante. Os efeitos negativos observados no crescimento,
desenvolvimento e produtividade de uma cultura, devido à presença das plantas
invasoras são, em última análise, resultante do total de pressões ambientais que são
direta (competição, alelopatia, interferência na colheita e outras) ou indiretamente
(hospedando pragas, moléstias, nematóides e outros) ligadas às suas presenças no
ambiente agrícola (Pitelli, 1985).
A possibilidade do uso da alelopatia com o propósito de beneficiar a agricultura
tem gerado considerável especulação e experimentação nas últimas décadas. A
alelopatia é um fenômeno que ocorre amplamente na natureza, e tem sido postulado
como um dos mecanismos pelos quais algumas plantas podem interferir em suas
vizinhas, alterando o padrão e a densidade da vegetação em uma comunidade de plantas
(Rice, 1974). As substâncias envolvidas nesse processo são geralmente produtos
secundários (compostos secundários ou produtos naturais) e são denominadas de
aleloquímicos (Almeida, 1988). Essas substâncias são liberadas no meio ambiente por
volatilização, exsudação radicular, lixiviação e através da decomposição dos resíduos
das plantas. Acreditava-se que os produtos naturais eram apenas produtos secundários
de vias metabólicas principais, sem alguma função primordial para a planta. Atualmente
se reconhece que a maior parte deles é sintetizada pelas plantas com funções
específicas, como por exemplo, na proteção e defesa das plantas contra ataque de
microorganismos e insetos, na atração de polinizadores e na competição entre plantas
vizinhas (Almeida, 1988). Atualmente, são conhecidos cerca de 10 mil compostos
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secundários. Existem vários tipos de classificação dos compostos secundários,
dependendo de cada autor. Taiz e Zeiger (1991), dividiram os compostos secundários
em apenas três grupos de acordo com o modo de sua biossíntese: Terpenos, compostos
fenólicos e compostos nitrogenados.
Aleloquímicos que suprimem ou eliminam plantas competidoras têm recebido
considerável atenção devido ao potential desses compostos como herbicidas naturais
seletivos. Existe a expectativa de que os aleloquímicos, algumas vezes referidos como
“herbicidas naturais”, possam auxiliar no aumento da produção agrícola e na redução
dos custos e da degradação do ambiente. Segundo Dayan et al. (1999), muitos
aleloquímicos operam por mecanismos diferentes dos herbicidas sintéticos, fazendo
desses produtos naturais uma fonte promissora para a fabricação de novos herbicidas, já
que as plantas invasoras apresentam resistência a vários herbicidas sintéticos usados.
Alguns compostos já estão sendo testados. A partenina, por exemplo, é usada para o
controle seletivo de Ageratum conyzoides L. (Batish et al., 1997) e os óleos voláteis de
Eucalyptus para o controle de Parthenium hysterophorus (Kohli et al., 1998).
Monoterpenos de um número de plantas aromáticas como a Lantana câmara,
Eucalyptus spp., Artemísia, etc., também podem ser usadas com esta finalidade (Singh
et al., 1999), assim como outros produtos naturais como a artemisinina e ailantona
(Duke e Lydon, 1987; Heisey, 1996). Aleloquímicos que estimulam a germinação e o
crescimento de outras plantas são também de interesse. As plantas invasoras das
famílias Striga, Orobanche e Alectra, por exemplo, podem ser controladas pela
aplicação prévia de um agente estimulante, exsudado de outras plantas. Entre os
aleloquímicos estimuladores identificados estão o estrigol, sorgoleone e o alectrol
(Vyvyan, 2002).
Uma das primeiras etapas na busca de um aleloquímico com potente atividade
biológica consiste em verificar a sua atividade sobre a germinação e o crescimento de
diferentes espécies. Idealmente um herbicida natural deve inibir completamente a
germinação e o crescimento de uma espécie invasora enquanto exerce pouco efeito
sobre uma cultura de interesse econômico. Uma vez identificada a atividade biológica
promissora, o composto pode ser sintetizado em larga escala, ou manipulações
estruturais podem levar a derivados com maior atividade, seletividade e menor
toxicidade para o meio ambiente. O herbicida pré-emergente cinmetilina, por exemplo,
é um derivado benzil éter do monoterpeno 1,4-eucaliptol. Essa modificação estrutural
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diminuiu sua volatilidade. A cinmetilina é um herbicida seletivo que controla gramíneas
anuais em muitas culturas (May et al., 1985).
Embora existam relatos das ações de aleloquímicos sobre plantas invasoras
(Duke, 1987; Singh et al., 2002a; 2002b; Batish et al., 2002; 2004; Barney et al., 2005),
não há praticamente estudos realizados com a Bidens pilosa L. Esta planta, também
conhecida pelos nomes vulgares: picão, picão-preto, picão-do-campo, erva-picão,
macela-do-campo, etc., pertence à família Asteraceae (nova denominação de
Compositae). O nome Bidens sugere “dois dentes”, uma vez que dos aquênios
sobressaem duas cristas farpadas, e geralmente pode haver uma terceira, pouco
desenvolvida. Essa planta distribui-se por todas as regiões não frígidas do mundo, sendo
sua maior disseminação na costa oeste do continente africano e na América Latina. É
uma invasora de culturas em mais de 40 países. No Brasil, esta espécie encontra-se
amplamente distribuída, principalmente nas regiões centro-sul e sul, onde é considerada
uma espécie altamente nociva e séria, infestante de culturas anuais e perenes. A espécie
ocorre em lavouras de soja, milho, cana, café, citrus, e outras (BASF, 1978).
Segundo Tamashiro e Leitão Filho (1978), esta espécie reúne quase todas as
características morfológicas e biológicas de uma planta invasora típica: alta produção de
sementes por planta, alta viabilidade das sementes, rápido desenvolvimento vegetativo,
eficiente mecanismo de dispersão dos frutos, ocorrência de várias gerações durante o
ano, porte herbáceo e tolerância a variados ambientes ecológicos. No Brasil há relatos
de que a Bidens pilosa desenvolveu resistência aos herbicidas inibidores da acetolactato
sintase (ALS), em meados de 1993. Existem estimativas de que existem de 100 a 10000
acres infestados com a espécie resistente, aumentando progressivamente as áreas
infestadas (Christoffoleti e Foloni, 1999).
Em face da importância dessa planta invasora no Brasil, no presente estudo foi
realizada uma avaliação prévia do potencial fitotóxico de alguns aleloquímicos de
diferentes classes na germinação e no crescimento de Bidens pilosa L. O objetivo foi
identificar aqueles biologicamente ativos com vistas à exploração futura de seus
potenciais herbicidas.
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Material e Métodos
1. Material biológico e reagentes. Os produtos naturais (aleloquímicos) utilizados neste
trabalho foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, U.S.A.). Os demais
reagentes utilizados foram os de melhor pureza disponível. As sementes de picão
(Bidens pilosa L.) foram colhidas em março de 2002 nos campos experimentais da
Embrapa-Soja de Londrina, PR. As sementes foram armazenadas em dessecador, a
temperatura ambiente.
2. Método geral de germinação. As sementes foram lavadas inicialmente em álcool
comercial por um minuto e depois em água e, em seguida, submetidas à esterilização
superficial com solução de hipoclorito de sódio 1%. Então, as sementes foram levadas
para a câmara de fluxo laminar, para serem semeadas. As sementes foram lavadas em
água destilada e dispostas em caixas gerbox 11 x 11 cm. Cinqüenta sementes foram
colocadas em cada caixa, contendo 2 folhas de papel Germitest, previamente
autoclavadas e umedecidas com 12 ml de água destilada (controle) ou com a solução do
aleloquímico. Os seguintes aleloquímicos foram testados: ácidos p-cumárico, ferúlico,
caféico, vanílico e protocatecuico, quercetina, flavona, cumarina, eucaliptol, cânfora e
ácido aconítico. Todos foram testados na concentração de 500 µM, com exceção da
flavona que foi utilizada na concentração de 250 µM, devido à sua baixa solubilidade.
Na tabela 01, estão mostradas as estruturas químicas e os pesos moleculares dos
compostos utilizados. Controles foram feitos para excluir a interferência do
dimetilsulfóxido (DMSO) utilizado para facilitar a dissolução de alguns compostos. As
caixas foram acondicionadas em câmara de germinação, com fotoperíodo de 8 horas
claro, a 30 ºC, e 16 horas escuro, a 20 ºC.
3. Determinação da germinação e do crescimento das plântulas. Após 2, 4, 5 ou 6
dias de embebição, as sementes germinadas foram contadas e avaliado o crescimento
das plântulas resultantes. Foram consideradas germinadas, aquelas sementes com
radícula de 2 mm. O crescimento das plântulas foi avaliado em termos do comprimento
das raízes primárias e dos seus pesos de matéria fresca. A cada período experimental, as
raízes primárias foram removidas, seus comprimentos medidos e imediatamente pesadas
em balança analítica, para obtenção dos pesos de matéria fresca.
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TABELA 01 – Estrutura química, nomenclatura usual e oficial e peso molecular dos compostos investigados no presente trabalho.
Composto Estrutura química Nome químico Peso molecular
Compostos fenólicos da classe dos derivados do ácido cinâmico
Ácido
p-cumárico
COOH
HO
Ácido 3-(4-
hidroxifenil)-2-
propenóico
164,16
Ácido
ferúlico
COOH
OCH3
HO
Ácido 3-(4-hidróxi-3-
metoxifenil)-2-
propenóico
194,19
Ácido
caféico
OH
HOCOOH
Ácido 3-(3,4-
dihidroxifenil)-2-
propenóico
180,16
Ácido
vanílico
OCH3
COOH
OH
Ácido 4-hidróxi-3-
metoxibenzóico
168,15
Ácido
protocate-
chuico
COOH
OH
OH
Ácido 3,4-
dihidroxibenzóico
154,12
Compostos fenólicos da classe dos flavonóides
Quercetina OH
OH
OH
O
HO O
OH
2-(3,4-dihidroxifenil)-
3,5,7-trihidroxi-4H-1-
benzopiran-4-ona
302,24
Flavona
O
O
2-fenil-4H-1-
benzopiran-4-ona
222,24-
16
Composto fenólico da classe das cumarinas
Cumarina OO
2H-1-benzopiranona-2 146,15
Terpenos
Eucaliptol
H3C CH3
O
CH3
1,3,3-trimetil-2-
oxabiciclo[2.2.2]-octano
154,25
Cânfora
O
H3C
CH3
CH3
1-metil-4-(1-
metiletenil)ciclohexeno
136,24
Ácido Orgânico
Ácido
aconítico
COOH
COOHHOOC
H
Ácido 1-propeno-1,2,3-
tricarboxílico
174,11
4. Solubilização dos compostos secundários. Os compostos fenólicos da classe dos
derivados do ácido cinâmico (p-cumárico, ferúlico, caféico, vanílico e protocatecuico),
bem como ácido aconítico, foram solubilizados em solução alcalina de hidróxido de
potássio, sob agitação constante e monitoramento do pH. Após a solubilização
completa, o pH foi reajustado para cerca de 7,0 com HCl.
Os dois compostos da classe dos flavonóides foram dissolvidos em diferentes
solventes: A quercetina foi solubilizada em solução alcalina de hidróxido de potássio,
conforme descrito acima, mas o seu pH final foi reajustado para pH 7,6. Já a flavona foi
solubilizada inicialmente em uma solução concentrada de dimetilsulfóxido e a seguir foi
adicionada água destilada para atingir uma concentração final de dimetilsulfóxido
(DMSO) 0,1%.
O representante da classe das cumarinas (cumarina), bem como os terpenos
eucaliptol e cânfora foram solubilizados inicialmente em uma solução concentrada de
DMSO e a seguir foi adicionada água destilada, sob agitação constante, para atingir uma
concentração final do solvente de 0,1%.
17
Experimentos realizados na ausência ou presença de DMSO revelaram que, na
concentração em que foi utilizado (0,1%), o solvente não alterou significativamente
nenhum dos parâmetros avaliados.
5. Apresentação dos dados. Os dados são apresentados como resultados médios de
experimentos independentes e estão apresentados como média ± erro padrão da média
(EPM). As barras representam o erro padrão da média.
6. Métodos numéricos e estatísticos. Os dados foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) com as diferenças significativas entre as médias identificadas pelo teste de
Duncan. P < 0,05 foi adotado como critério de significância. Essas análises foram feitas
pelo programa STATISTICA.
Resultados
A germinação das sementes de Bidens pilosa iniciou no segundo dia após a
embebição e atingiu o valor máximo de cerca de 84%, após cinco dias, conforme pode
ser visualizado na Figura 1, através dos valores dos controles. Neste mesmo período as
plântulas cresceram gradativamente. O comprimento das raízes aumentou cerca de 1,17
vezes e o peso de matéria fresca das raízes aumentou em cerca de 1,77 vezes. Dentre os
compostos fenólicos da classe dos derivados do ácido cinâmico testados somente o
ácido ferúlico interferiu sobre a germinação de Bidens pilosa. Houve uma inibição de
56,3% em relação ao controle no 2º dia de tratamento. Após 4 e 5 dias, entretanto, o
número de sementes germinadas não foi diferente daquele do controle. Deve-se
destacar, que embora em número menor, as sementes que germinaram no segundo dia
não apresentaram crescimento alterado. Por outro lado, houve uma redução de 31,5% no
peso de matéria fresca das raízes no quarto dia de crescimento. Um efeito distinto foi
exercido pelo ácido vanílico. A germinação não foi alterada, mas foi observada uma
redução no crescimento das plântulas no quarto dia de incubação. Ocorreu uma inibição
de 38% e 28% no comprimento e no peso de matéria fresca das raízes, respectivamente.
Entretanto, as plântulas recuperaram o crescimento no quinto dia.
18
A Figura 2 mostra os efeitos dos terpenos eucaliptol e cânfora. O eucaliptol na
concentração de 500 µM não exerceu qualquer efeito na germinação ou no crescimento
de Bidens pilosa. Na presença de cânfora, por outro lado, tanto a germinação quanto o
crescimento foram reduzidos. O número de sementes germinadas foi reduzido em
84,8%, 39,6% a 15,2% no segundo, quarto e quinto dia, respectivamente. O
comprimento e o peso das raízes foram 40% e 51% menores, respectivamente, quando
comparados com os respectivos controles, no segundo dia. A inibição no crescimento
foi relativamente menor no quarto dia e não houve diferença significativa no quinto dia,
quando comparados com os respectivos controles.
A Figura 3 mostra os resultados dos experimentos realizados na presença dos
flavonóides quercetina e flavona. As séries controles foram diferentes para cada
composto, pois a quercetina foi dissolvida em meio aquoso e a flavona em meio de
DMSO 0,1%. Nenhum dos flavonóides alterou de maneira significativa os parâmetros
avaliados. Ocorreu somente pequena redução no número de sementes germinadas na
presença de flavona 250 µM, no quarto dia de tratamento (13,2% de inibição).
O ácido aconítico não apresentou efeitos inibitórios sobre a Bidens pilosa (Figura 4).
Ao contrário, observou-se estímulo no crescimento das plântulas, revelado pelo
aumento de 23,1% no tamanho das raízes, no quinto dia, e de 40,5% no peso de matéria
fresca das raízes, no quarto dia.
Quando as sementes de Bidens pilosa foram semeadas na presença de cumarina
na concentração de 500 µM, ocorreu supressão completa da germinação. Assim, uma
série adicional foi realizada na presença de cumarina em uma concentração 10 vezes
menor (50 µM). Os resultados estão mostrados na Figura 5. No segundo dia após o
início da embebição as sementes de Bidens pilosa não germinaram. No quarto dia
ocorreu uma redução de 56,2% no número de sementes germinadas, em relação ao
controle. As raízes das plântulas apresentaram crescimento e peso de matéria fresca
reduzidos. A redução foi de 51,2% e 25,4%, respectivamente. Aos seis dias, o número
de sementes germinadas atingiu 85% do valor do controle. O comprimento e o peso de
matéria fresca das raízes foram reduzidos em 64,9% e 25,4%, respectivamente, quando
comparados com os respectivos controles.
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Controle
Ácido ferúlico
Ácido vanílico
Ácido cumárico
Ácido caféico
Ácido protocatecuicoN
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Dois dias Quatro dias Cinco dias
Tempo após o início da embebição
A
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B C
E F
G H I
Figura 01. Efeitos de compostos fenólicos da classe dos derivados do ácido
cinâmico sobre a germinação e o crescimento de Bidens pilosa L. O número de
sementes que germinaram (A, B, C) o comprimento das raízes (D, E, F) e o peso de
matéria fresca das raízes (G, H, I) foram avaliados após 2 (A, D, G), 4 (B, E, H) ou 5
(C, F, I) dias após o início da embebição. Os valores são médias ± EPM de 4-19
repetições. As diferenças significativas entre os valores médios dos testes em relação ao
valor médio do controle foram identificadas através da análise de variância com o teste
de Duncan. (*): P< 0,05.
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Controle Eucaliptol Cânfora
Tempo após o início da embebição
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Dois dias Quatro dias Cinco dias
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Figura 02. Efeitos do eucaliptol e da cânfora sobre a germinação e o crescimento de
Bidens pilosa L. O número de sementes que germinaram (A, B, C) o comprimento das
raízes (D, E, F) e o peso de matéria fresca das raízes (G, H, I) foram avaliados após 2
(A, D, G), 4 (B, E, H) ou 5 (C, F, I) dias após o início da embebição. Os valores são
médias ± EPM de 5-8 repetições. As diferenças significativas entre os valores médios
dos testes em relação ao valor médio do controle foram identificadas através da análise
de variância com o teste de Duncan. (*): P< 0,05.
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Control Ácido aconítico
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to d
ara
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cm)
Pes
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mat
éria
fres
ca d
a ra
íz (
mg)
Dois dias Quatro dias Cinco dias
Tempo após o início da embebição
G H I
D E F
A B C
Figura 4. Efeitos do ácido aconítico sobre a germinação e o crescimento de Bidens
pilosa L. O número de sementes que germinaram (A, B, C) o comprimento das raízes
(D, E, F) e o peso de matéria fresca das raízes (G, H, I) foram avaliados após 2 (A, D,
G), 4 (B, E, H) ou 5 (C, F, I) dias após o início da embebição. Os valores são médias ±
EPM de 2-19 repetições. As diferenças significativas entre os valores médios dos testes
em relação ao valor médio do controle foram identificadas através da análise de
variância com o teste de Duncan. (*): P< 0,05.
23
24
Discussão
Os resultados desse estudo revelaram que a germinação e o crescimento inicial de
Bidens pilosa L foram susceptíveis à ação de alguns aleloquímicos de diferentes classes,
entre eles o ácido ferúlico, o ácido vanílico, a cânfora, a flavona, o ácido aconítico e a
cumarina. Por outro lado, o ácido p-cumárico, o ácido caféico, o ácido protocatecuico, o
eucaliptol e a quercetina foram inócuos na concentração de 500 µM. Todos os derivados
do ácido cinâmico (p-cumárico, ferúlico, caféico, vanílico e protocatecuico) possuem
em suas estruturas o grupo fenil, mas apresentam substituintes diferentes. Os dois
compostos que apresentaram efeitos sobre a germinação e/ou crescimento de Bidens
pilosa o ácido ferúlico e o ácido vanílico possuem o grupo metoxil, ausente nas
outras estruturas. Este grupo parece ser, portanto, essencial para a atividade biológica
em Bidens pilosa. Deve-se ressaltar, entretanto, que o modo de ação de cada composto
foi diferente. O ácido ferúlico retardou a germinação, sem contudo alterar o
comprimento das raízes. O ácido vanílico não reduziu o número de sementes
germinadas, mas afetou o crescimento das plântulas, revelado pela redução no
comprimento e no peso de matéria fresca das raízes.
Os efeitos dos representantes dos terpenos, eucaliptol (1,8-cineol) e cânfora foram
diferentes. O eucaliptol revelou-se inócuo, enquanto que a cânfora exerceu forte efeito
inibidor sobre a germinação e o crescimento das raízes. É difícil precisar as razões
estruturais que podem ter influenciado na maior atividade da cânfora se comparada com
o eucaliptol. Ambos os terpenos possuem estrutura cíclica hidrocarbonada e um radical
oxigenado, sendo função éter no eucaliptol e função cetona na cânfora. Além do grupo
químico funcional distinto, a maior solubilidade da cânfora em meio aquoso pode ter
exercido alguma influência. De acordo com Fisher et al. (1994) a solubilidade da
cânfora é de 550 ppm e do eucaliptol de 332 ppm.
O flavonóide quercetina não foi ativo na concentração de 500 µM e a flavona, na
concentração de 250 µM, exerceu fraco efeito inibidor na germinação das sementes. A
cumarina, por sua vez, inibiu fortemente a germinação e o crescimento das raízes de
Bidens pilosa em concentração 10 vezes menor (50 µM). A comparação das estruturas
desses três compostos permite visualizar que o grupo benzopiranona da cumarina é
parte integrante das estruturas da quercetina e da flavona, embora esses últimos
possuam ainda um grupo fenil e diferentes substituintes nas estruturas cíclicas. Assim,
25
pode-se concluir que o grupo potencialmente ativo benzopiranona foi totalmente
anulado nos flavonóides. De fato, Richard et al. (1950) demonstraram a importância do
anel benzopirona no potencial da cumarina e seus derivados sobre o crescimento da raiz
de Avena. O autor demonstrou que a introdução de substituintes na posição 3 e 4 causa
uma redução no potencial de inibição dos derivados sobre o crescimento, quando
comparado com a forma não substituída.
O ácido aconítico é um ácido tricarboxílico que ao contrário dos outros compostos
testados não apresenta estrutura cíclica. Diferentemente dos outros compostos ativos, o
ácido aconítico exerceu um efeito estimulador no crescimento de Bidens pilosa, sem
contudo modificar o percentual de germinação.
O conjunto dos resultados revela que dentre os compostos testados, a cumarina foi o
composto mais ativo na Bidens pilosa, seguido pela cânfora, ácido ferúlico e ácido
aconítico. Não houve, portanto, alguma correlação com a classe química, já que são
representantes de classes diferentes. Aparentemente, não há correlação direta com a
solubilidade em água, pois a cumarina é pouco solúvel, a cânfora é fracamente solúvel e
os ácidos ferúlico e aconítico possuem boa solubilidade em água. É também provável
que o mecanismo de ação de cada composto seja distinto, possivelmente afetando
processos que influenciam a germinação, em certos casos de processos que afetam o
crescimento em outros, ou ainda ambos os processos sejam influenciados. O ácido
ferúlico, por exemplo, inibiu a germinação de Bidens pilosa no segundo dia, mas as
sementes germinadas apresentaram raízes com crescimento normal. Já a cumarina e a
cânfora inibiram a germinação e o crescimento das raízes. O ácido aconítico estimulou
somente o crescimento das raízes. Obviamente, diversos fatores contribuíram para as
diferentes atividades de cada aleloquímico em Bidens pilosa. Entre eles podemos
relacionar, a velocidade de captação pelos tecidos, a velocidade de metabolização e o
acesso às diferentes estruturas celulares.
Existem consideráveis relatos da ação de aleloquímicos sobre a germinação e o
crescimento de plantas de diferentes espécies (Putnam, 1983; Duke, 1987; Vyvyan,
2002). Por outro lado, são poucos os aleloquímicos cujos mecanismos de ação foram
completamente elucidados. Há relatos de que os aleloquímicos são capazes de interferir
em diversos processos celulares, incluindo divisão celular, permeabilidade de
membranas, atividade de enzimas, produção e ação de hormônios, absorção de íons e
em processos fisiológicos como a respiração, a transpiração e a fotossíntese (Rodrigues
et al., 1992; Einhellig et al.,1995). Mesmo a cinmetilina, um análogo estrutural do
27
Referências Bibliográficas
ALMEIDA, F. S. A alelopatia e as plantas. Circular n. 53. IAPAR, 1988, 60p.
BASF. Divisão Agroquímica. Invasoras na cultura de soja. v.1, 1978, 90 p.
BATISH, D. R.; KOHLI, R. K.; SAXENA, D. B.; SINGH, H. P. Growth regulatory
response of pathenin and its derivatives. Plant Growth Regul., v. 21, p.189-194,
1997.
BATISH, D. R.; SETIA, N.; SINGH, H. P.; KOHLI, R. K.; Phytotoxicity of lemon-
scented eucalyptol and its potential use as a bioherbicide. Crop Protection, v. 23,
p. 1209-1214, 2004.
BATISH, D.R.; SINGH, H. P.; KOHLI, R. K.; SAXENA, D.B.; SHALINDER, K.
Allelopathic effects of parthenin against two weed species, Avena fatua and Bidens
pilosa. Environmental and Experimental Botany, v. 47, p. 149-155, 2002.
BARNEY, J. N.; HAY, A. G.; WESTON, L. A. Isolation and characterization of
allelopathic volatiles from mugwort (Artemisia vulgaris). J Chem Ecol., v. 31, p.
247-265, 2005.
CHRISTOFFOLETI, P. J.; FOLONI, L. Dose-response curves of resistant and
susceptible Bidens pilosa to ALS inhibitor herbicide. Brighton Crop Protection
Conference: weeds. Proceedings of an International Conference, v.1, p. 159-162,
Brighton, UK, November, 1999.
DAYAN, F.; ROMAGNI, J.; TELLEZ, M.; RIMANDO, A.; DUKE, S., Pest.
Outlook, p. 185-188, 1999.
DUKE, S.O.; LYDON, J. Herbicides from natural compounds. Weed Tech., v.1, p.
122-128, 1987.
28
EINHELLIG, F. A. Mechanism of action of allelochemicals in allelopathy. In:
INDERJIT; DAKSHINI, K. M. M. and EINHELLIG, F. A. (eds), Allelopathy:
Organisms, Processes and Applications. Washington: ACS Symposium Series
583, American Chemical Society, p. 96-116, 1995.
EL-DEEK, M. H.; HESS, F. D. Inhibited mitotic entry is the cause of growth
inhibition by cinmethylin. Weed Sci., v. 34, p. 684-688, 1986.
FISCHER, N. H.; WILLIAMSON, G. B.; WEIDENHAMER, J. F.;
RICHARDSON, D. R. In search of allelopathy in the Florida scrub: the role of
terpenoids. J. Chem. Ecol., v. 20, p. 1355-1379, 1994.
HEISEY, R. M. Identification of an allelopathic compound from Ailanthus altissima
(Simaroubaceae) and characterization of its herbicidal activity. Am. J. Bot., v. 83, p.
192-200, 1996.
KOHLI, R. V.; BATISH, D. R.; SINGH, H. P. Eucalypt oils for the control of
parthenium (Patrhenium hysterophorus L.). Crop Protection, v. 17, p. 119-122,
1998.
MAY, J. W.; GOSS, J. R.; MONCORGE, J. M.; MURPHY, M. W. SD 95481 A
versatile new herbicide with wide spectrum crop use. Proceedings of the British
Crop Protection Conference Weeds, v.12, p. 265-270, 1985.
PITELLI, R. A. Interferência de plantas invasoras em culturas agrícolas. Informe
Agropecuário. Belo horizonte, v.11, n. 129, p. 16-27, setembro de 1985.
PUTNAM, A. R. Allelopathic chemicals. Chem. Eng. News., v. 6, p. 34-45, 1983.
RICE, E.L. Allelopathy. Academic Press, Orlando, 353 p., 1974.
RICHARD, H.; GOODWIN, A.E.; TAVES, C. The effect of coumarin derivatives
on the growth of Avena roots. Amer. J. Bot., v. 37, p. 224-231, 1950.
29
RODRIGUES , L. R. A.; RODRIGUES, T. J.D.; RETS, R.A. Alelopatia em plantas
forrageiras. Jaboticabal: FCAVJ-UNESP/FUNEP, 1992.
SINGH, H. P.; BATISH, D. R.; KOLHI, R. V. Autotoxicity: Concept, Organisms,
and Ecological Significance. Crit. Rev. Plant Sci., v. 18, p. 757-772, 1999.
SINGH, H. P.; BATISH, D. R.; KOHLI, R. K.; SAXENA, D. B.; ARORA, V.
Effect of parthenin – a sesquiterpene lactone from Parthenium hysterophorus – on
early growth and physiology of Ageratum conyzoides. J. Chem. Ecol., v. 28, p.
2169-2179, 2002a.
SINGH, H. P.; BATISH, D. R.; KOHLI, R. K.; KAUER, S.; RAMEZANI, H.;
KOHLI, R. K. Comparative phytotoxicity of four monoterpenes against Cassia
occidentalis. Ann. Appl. Biol., v. 141, p. 111-116, 2002b.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Surface protection and secondary defense compounds. In:
Plant Physiology. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Redwood city,
p. 320-345, 1991.
TAMASHIRO, J. Y.; LEITÃO FILHO, H. F. Observações sobre o ciclo de vida de
Bidens pilosa L. (Compositae-Heliantheae). Hoehnea, v. 7, p. 17-40, 1978.
VAUGHN, S. F.; SPENCER, G. F. Volatile monoterpenes as potential parent
structures for new herbicides. Weed Sci., v. 41, p. 114-119, 1993.
VYVYAN, J. R. Allelochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals.
Tetrahedron, v. 58, p. 1631-1646, 2002.
30
THE ENERGY METABOLISM OF Bidens pilosa L. DURING
POSTGERMINATIVE GROWTH: THE EFFECTS OF COUMARIN
Érica Marusa Pergoa, Denise Abrahima, Patrícia Cristina Soares da Silvaa, Ana Maria
Kelmer-Brachta, Elemar Vollb and Emy Luiza Ishii-Iwamotoa*
a Laboratory of Biological Oxidations, Department of Biochemistry, University of
Maringá, 87020900 Maringá, Brazil.
Brazilian Agricultural Research Corporation - EMBRAPA, Londrina, Brazil
* To whom correspondence should be sent:
Emy L. Ishii-Iwamoto
Department of Biochemistry
University of Maringá
E-mail: [email protected]
Fax:55-44-32614896
87.020.900 Maringá, Brazil
Short title: The energy metabolism of Bidens pilosa L
31
ABSTRACT
Some aspects of energy metabolism of Bidens pilosa during postgerminative
growth were studied, including root apices respiration, alcohol dehydrogenase and
lipoxygenase activities. The effects of the allelochemical coumarin were also
investigated. Shortly after the emergence of primary roots, respiration was the
dominating ATP-generating pathway. Fermentation contributed to the energy
metabolism of roots only at the initial phases of growth. There was a decline in the
overall respiration and cytochrome oxidase activity during the entire experimental
growth period (4 days) although the relative contribution of the alternative oxidase
activity increased. Lipoxygenase activity was detected in Bidens pilosa at the early
stage of growth. Seedlings grown in the presence of coumarin for 4 days exhibited
characteristics of seedlings in an earlier stage of growth, including lower germination
and seedling growth, higher root respiratory activity and higher activities of alcohol
dehydrogenase and lipoxygenase. The present findings suggest that coumarin possesses
strong phytotoxic potential against Bidens pilosa, probably acting as a cytostatic agent.
Coumarin at a high concentration (50 µM) increased the lipoxygenase activity and the
level of conjugated dienes, suggesting that the compound induces a condition of
oxidative stress in seedling roots.
Key words: Allelopathy, Bidens pilosa, energy metabolism, coumarin, respiration.
32
INTRODUCTION
Bidens pilosa L., an annual native of tropical America, is a dicot weed of the
Asteraceae family. The species is a troublesome weed in field and plantation crops in
more than 40 countries (Holm et al., 1977). In Brazil the species is responsible for yield
losses of several crops, particularly soybean. Although much is known about Bidens
pilosa L. in relation to its germination and growth requirements (Valio et al., 1972;
Amaral-Baroli & Takaki, 1998, 2001), little is known about the biochemical
characteristics of the species during the early stage of growth. It was demonstrated that
Bidens pilosa L. first developed resistance to herbicides known as acetolactase synthase
inhibitors in 1993 and there were estimates that the resistant species continues to
increase in distribution and prevalence. Allelopathy has been considered as an
alternative in integrated weed management (Putnam & Duke, 1974; Wu et al., 1999;
Vyvyan, 2002). The identification of naturally occurring bioactive products able to
suppress growth of weeds is a common approach (Duke et al., 2000). The coumarins
constitute a large class of allelochemicals widely distributed in the plant kingdom.
Coumarin (1,2 benzopyrone), the simplest representative of its class, is considered a
natural plant growth regulator (Jansson & Svensson, 1980; Abenavoli et al., 2003). It
has been demonstrated that coumarin inhibits seed germination and growth of many
plant species, including maize, wheat, soybean, cucumber, carrot and pea (Svensson,
1972; Jansson & Svensson, 1980; Kupidlowska et al., 1994; Abenavoli et al., 2003).
The effects of coumarin have been demonstrated to be species-specific and
concentration-dependent. Kupidlowska et al. (1994), for example, demonstrated that
coumarin at 680 µM inhibits completely root growth of cucumber and maize seedlings,
but causes only slight inhibition of pea root growth. On the other hand, at
concentrations between 30 to 100 µM coumarin increases the fresh weight of soybean
hypocotyl explants (Jansson & Svensson, 1980). The effects of coumarin on weed
species, have not yet been exploited. An action on energy metabolism can be a possible
mode of action of growth regulators. Thus, the aim of the present study was to
investigate the energy metabolism of roots of Bidens pilosa L. during postgerminative
growth and the influence of coumarin. With this purpose in mind the respiratory
activity, the activities of alcohol dehydrogenase and lipoxygenase were measured in
seedling roots.
33
MATERIALS AND METHODS
Reagents
Coumarin, NAD+, SHAM, linolenic acid and TBA were from Sigma Chemical
Co. (St. Louis, USA). The other reagents were of the purest grade available.
Seed germination and growth tests
Seeds of Bidens pilosa L. were obtained from the Brazilian Agricultural
Research Corporation (EMBRAPA) of Londrina, Paraná State. The seeds were surface-
sterilized in a 1.0% sodium hypochlorite solution. After washing in distilled water, the
seeds were placed on a double sheet of germination paper in plastic germination boxes
(gerbox) (110 mm x 110 mm), moistened with 12 mL of distilled water or coumarin
solution (concentration range 10-100 µM) dissolved in 0.1% dimethylsulfoxide.
Controls were performed to exclude the interference of the solvent, but no significant
changes in seedling growth were found. Each treatment was applied to three plates
(replicates) and each replicate consisted of fifty seeds distributed over gerbox.
Experiments were repeated 5-6 times. The boxes were placed in a growth chamber
programmed for the following regime: 8 h light (230 µmol m-2 s-1 photon flux) at 30°C
and 16 h dark at 20°C. A seed was considered as germinated when the radicle was 2.0
mm or longer. The seeds that had germinated at 2, 4 or 6 days were selected for growth
tests. The seedlings were removed, dried on filter paper, and the primary roots were
excised for measurement of their length and fresh weight. Data were expressed as cm or
milligrams per root. The mean germination time was calculated according to the
following formula:
∑∑= iii ntnt
t = Mean germination time
in = Number of germinated seeds between the times 1−it and it
Respiration of excised root apices
The oxygen consumption of roots from Bidens pilosa seedlings was measured
polarographically, at 25°C, using a Clark-type electrode positioned in a closed plexi-
34
glass chamber. Root samples were removed from the seedlings and rinsed in distilled
water. Six roots were excised, weighed and immediately placed in the oxygen electrode
vessel containing 2 mL of nutrient solution (pH 5.8) containing 2 mM Ca(NO3)2, 2 mM
KNO3, 0.43 mM NH4Cl, 0.75 mM MgSO4 and 20 µM NaH2PO4 (Larkin, 1987). For
estimating the contribution of the cytochrome oxidase (COX; KCN-sensitive
respiration), alternative oxidase (AOX; SHAM-sensitive respiration) and/or
extramitochondrial oxidases (KCN-insensitive respiration) to the overall O2 uptake, 270
µM KCN or 5 mM salicylhydroxamic acid (dissolved in 2-methoxyethanol) was added
to reaction medium. Oxygen uptake was monitored for 12-15 min. Oxygen uptake rates
were calculated from the polarographic records considering a concentration of dissolved
oxygen of 240 µM at 25°C (Estabrook, 1967), and referred to the fresh weight of the
roots.
Lipoxygenase activity measurement
Lipoxygenase activity was assayed in the root extracts from seedlings grown in
the absence of coumarin for 2, 3 or 4 days or in the presence of coumarin (10-50 µM)
for 4 days. The roots (approximately 0.2 g fresh weight) were weighed and transferred
to a mortar and thoroughly mixed with 1.5 mL of a cold 50 mM K-phosphate (pH 7.0)
solution containing 0.1% Triton X-100 (v/v). Extracts were then centrifuged for 10 min
at 12000g and 5°C. The supernatant was decanted and used as the enzyme source.
Lipoxygenase was measured polarographically with a Clark-type oxygen electrode
according to Siedow and Girvin (1980). The reaction medium contained 200 mM K-
phosphate (pH 7.0) and 200 µl of enzyme extract. The reaction was initiated by the
addition of linolenic acid (3.0 mM final concentration), dissolved in Tween 20. Oxygen
uptake was monitored for 12-15 min and the enzyme activity was expressed as nmol O2
min-1 (g root fresh weight)-1. Controls were run to exclude solvent effects.
Alcohol dehydrogenase activity measurement
Alcohol dehydrogenase activity was assayed in root extracts from seedlings
grown in the absence of coumarin for 2, 3 or 4 days or in the presence of coumarin (10-
50 µM) for 4 days. Roots (approximately 0.2 g fresh weight) were excised from the
seedlings, weighed and transferred to a mortar, thoroughly mixed with 3.0 mL of a
medium containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1.0 mM EDTA and 2.0 mM DTT.
35
Extracts were then centrifuged for 20 min at 20000g and 5°C. The supernatant was
decanted and used as the enzyme source. The alcohol dehydrogenase activity was
measured according to Lee (1982). The reaction medium contained 50 mM Tris-HCl
(pH 7.4), 1.0 mM NAD+ and 200 µl of enzyme extract. The reaction was initiated by the
addition of 120 µM n-propanol. The enzyme activity was evaluated as the initial rate of
NAD+ reduction, which was calculated from the increase in absorbance at 340 nm.
Enzyme activity was expressed as µmol min-1 (g fresh weight)-1.
Lipid peroxidation products
The level of lipid peroxidation in root extracts was measured in terms of
malondialdehyde (MDA) and conjugated diene contents. Approximately 200 mg of
excised roots were homogenized in 4.0 mL of 96% (v/v) ethanol. The content of
malondialdehyde (MDA) was assayed in 3.0 mL of the homogenate. An equal volume
of 10% TCA containing 0.5% TBA was added to the homogenate. The mixture was
heated at 95°C for 30 min and quickly cooled in an ice-bath. After centrifuging at
10000g for 10 min the absorbance of the supernatant at 532 nm was read. The value for
non-specific absorbance at 600 nm was subtracted. The concentration of MDA was
calculated using its extinction coefficient of 155 mM-1 cm-1 (Heath & Packer, 1968) and
expressed as µmol (g root fresh weight)-1.
For the conjugated dienes measurement, 1.0 mL aliquot of homogenate was
mixed to an equal volume of 96% ethanol and centrifuged at 12000g for 10 min. The
absorbance of the supernatant was read at 234 nm and the non-specific absorbance at
500 nm was subtracted. The concentration of the conjugated dienes was calculated
using the extinction coefficient of 2.65 × 104 M-1 cm-1 (Boveris et al., 1980) and
expressed as µmol (g root fresh weight)-1.
Statistical analysis
The data shown in the graphs and tables were expressed as means ± standard errors of
the mean (SEM) of independent preparations. The data were analyzed using Student's t-
test or variance analysis (ANOVA), significant differences between means being
identified by Duncan’s test. The comparisons are given in the text as probability values
(P). P ≤ 0.05 being adopted as the minimum criterion of significance. Statistical
analyses were performed using the Statistica software package.
36
RESULTS
Germination and growth of Bidens pilosa L.
Within 0 to 6 days of incubation, the Bidens pilosa seeds germinated almost
linearly, achieving 88.4% at the terminus of the experimental period (Table 1). The
calculated mean germination time was 88.41±4.5 hr. Over the entire incubation period,
root length increased 1.59-fold and fresh weight increased 1.40 fold. From day 2 to 4
the relative increment in root fresh weight was 44.5% and from day 4 to 6 was 33%.
After 4 days of incubation, the first eophylls were visible indicating that photosynthesis
started to contribute to seedling energy metabolism. Thus, in order to exclude any
interference of photosynthesis, the subsequent experiments were performed with
seedlings grown for a maximum of 4 days after starting imbibition.
Respiratory activity of root apices and the activities of alcohol dehydrogenase and
lipoxygenase in root extracts
Figure 1A shows the course of the development of the respiratory activity of the
Bidens pilosa root apices. A relatively high respiratory activity was detected shortly
after the emergence of primary roots. Thereafter a decline was observed. From the 2th
to the 4th day, the overall O2 consumption rates reduced 40% on a fresh-mass basis. The
relative contribution of KCN-sensitive respiration to overall respiration decreased from
73.9% at day 2 to 68.9% at day 4. In contrast, the SHAM-sensitive respiration increased
from 7.26% to 29.0%. As a consequence, the AOX activity was 9.8% relative to COX
activity at day 2 while at day 4, it was increased by nearly 42.6%.
The alcohol dehydrogenase activity was measured in root extracts to estimate the
contribution of the fermentative pathway to energy metabolism during postgerminative
growth. Figure 1B shows that the activity of alcohol dehydrogenase was relatively high
at day 2. After this time, an accentuated decline was observed. At days 3 and 4 the
enzyme activity was 33.2% and 8.6% of that one found at day 2, respectively.
A similar trend was seen in the lipoxygenase activity. A relatively high activity
was detected in roots from seedlings grown for 2 days (Figure 1C). Thereafter, the
enzyme activity declined reaching at days 3 and 4, respectively, 28.4% and 14.3% of the
value found at day 2.
37
Effects of coumarin on germination and seedling growth
When Bidens pilosa seeds were placed to germinate in the presence of coumarin
in the concentration range of 10-100 µM, both seed germination and seedling root
growth were significantly inhibited (Figure 2). At day 2, complete suppression of seed
germination was observed with coumarin at 50 µM concentration or higher (Figure 2A).
The calculated ID50 was 10.61±2.129 µM, 23.81±4.52 µM and 21.32±4.37 µM for
germination, root length and root fresh weight, respectively. At the subsequent
experimental periods (days 4 and 6) germination and root growth were also reduced
though to lesser degrees. The ID50 for germination was increased to 46.45±2.66 and
89.87±2.05 µM at the 4th and 6th days of incubation, respectively. The mean
germination time was increased from 88.41±4.5 hr in the control condition to
94.0±2.69, 105.8±2.56, 122.8±1.14 and 129.1±2.81 hr in the presence of 10, 25, 50 and
100 µM coumarin, respectively. Further, the root fresh weight was reduced by coumarin
to a lesser extent compared to the reduction of the root length. At day 6, for example,
coumarin up to 50 µM had not affected root fresh weight while an inhibitory action on
root length was observed at that time with 10 µM coumarin.
The effects of coumarin on root respiration
The overall respiration rates of seedling root apices were stimulated in a dose-
dependent manner by coumarin up to 50 µM as illustrated by Figure 3A. No further
stimulation was observed with 100 µM coumarin. KCN-sensitive respiration was
similarly stimulated, so that its relative contribution to the overall respiration was not
modified. It constituted 68.9% of the overall respiration in the control condition and
67.8, 68.3, 70.8 and 66.4% in the presence of 10, 25, 50 and 100 µM coumarin,
respectively. The SHAM-sensitive respiration was not significantly changed by
coumarin.
The effects of coumarin on alcohol dehydrogenase and lipoxygenase activities
The alcohol dehydrogenase and lipoxygenase activities were measured in root
extracts from seedlings grown for 4 days in the presence of coumarin (10-50 µM). No
enough material was available to measure enzyme activities at 100 µM coumarin-
treated seedlings. As shown in Figure 3B and 3C the activities of both enzymes were
38
significantly increased by coumarin. The alcohol dehydrogenase activity increased 4.6
and 9.3-fold, with 25 and 50 µM coumarin, respectively. Under the same conditions, the
lipoxygenase activity increased 5.7 and 14.7-fold, when compared with untreated
seedlings.
The effects of coumarin on malondialdehyde and conjugated dienes content
The high activity of lipoxygenase in roots of seedlings grown during four days in
the presence of 25 and 50 µM coumarin (Figure 3C) suggested an increase in the level
of lipid peroxidation. In order to examine this possibility we measured the content of
MDA and conjugated dienes in root extracts. No significant difference in the MDA
content between the untreated and coumarin-treated seedlings was observed. On the
other hand, the conjugated diene content was significantly increased in 50 µM-treated
seedlings (nearly 4-fold higher) (Table 2).
39
DISCUSSION
40
(Podbiekowska et al., 1994). The finding that root apices from coumarin-treated cells
exhibit high respiratory activity argues against the hypothesis that coumarin acts in
Bidens pilosa L. through an impairment of energy metabolism. An inhibition of root
respiration, instead of activation, would be an expected effect, as was observed with the
allelochemical α-pinene (Abrahim et al., 2005). The inhibition caused by α-pinene on
maize seedling growth has been shown to be associated with a decrease in root apices
respiration (Abrahim et al., 2005). It had been previously demonstrated that α-pinene
inhibits ATP production in isolated mitochondria by acting as an uncoupler and an
inhibitor of electron transport (Abrahim et al., 2003).
A possible explanation for the apparent inhibition of seedling growth associated
with increased mean germination time and increased root respiration is that coumarin
causes a retard in germination and growth of Bidens pilosa L. As a consequence, the
seedlings grown for 4 days in the presence of coumarin were probably in a different
physiological age, i.e., in an earlier stage of growth. It should be remembered that the
effects of coumarin on respiration were examined at 4 days of growth, i.e., at a time
period in which the respiratory activity of control series was found to be lower than that
in the early stage of growth (see figure 1A). The hypothesis receives further support
from the effects of coumarin on alcohol dehydrogenase and lipoxygenase activities.
Both enzymes were also stimulated by coumarin, tending to reach values similar to
those of younger seedlings grown in the absence of coumarin. Actually, there were
several similarities between the values of all parameters found in seedlings grown in the
presence of 50 µM coumarin for 4 days and those ones of seedlings grown for 2 days in
the absence of coumarin, as can be seen in Table 3. Only the lipoxygenase activity
presented a higher value in the first experimental condition.
It seems thus reasonable to suggest that coumarin acts as a cytostatic agent in
Bidens pilosa. This effect may be related to its capacity to alter cell division and cell
elongation as observed by Svensson (1972) in corn and wheat at a concentration range
comparable to that found in the present work, or to mitosis blockade as found in onion
(Allium cepa L.) by Podbiekowska et al. (1994). We cannot, however, discard the
possibility that coumarin exerts additional phytotoxic actions as suggested by the
unexpected high activity of lipoxygenase in 50 µM coumarin-treated seedlings.
Activation of lipoxygenase is believed to be one of the immediate responses to changes
in cell membrane structure induced by different agents including oxygen reactive
species that can be generated in response to a variety of stress conditions, such as
41
wounding, pathogen attack and oxygen deprivation, and in cell death processes
(Siedow, 1991; Thaler, 1999; Porta & Rocha-Sosa, 2002; Blokhina et al., 2003). That
coumarin can indeed induce a condition of oxidative stress is supported by the high
content of conjugated dienes in the root extracts. No increase was found in the MDA
content, presumably because the products of lipid peroxidation were further oxidized or
metabolized (Beuge & Aust, 1978; Muscari et al., 1990). In accordance with our
suggestion, Abenavoli et al. (2003) reported that coumarin activates antioxidant enzyme
activities in durum wheat seedlings and also the activity of G6PDH and the pentose
phosphate pathway in carrot cell suspension cultures. All these enzymes are generally
stimulated under oxidative stress condition (Tian et al., 1999).
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by grants from the Fundação Araucária do Estado do
Paraná and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Érica Marusa Pergo fellowship holder from the Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico. We are indebted to Dr. Adelar Bracht for his suggestions in
the revision of the present manuscript.
42
REFERENCES
ABRAHIM D, FRANCISCHINI AC, PERGO E M, KELMER-BRACHT AM & ISHII-IWAMOTO
EL (2003) Effects of α-pinene on the mitochondrial respiration of maize seedlings.
Plant Physiology and Biochemistry 41, 985-991.
ABRAHIM D, SERT MA, BONATO CM, KELMER-BRACHT AM, BRACHT A & ISHII-
IWAMOTO EL (2005) Mitochondria as a site of allelochemical action. In:
Allelopathy: A Physiological Process with Ecological Implications. (eds MV
Reigosa & N Pedrol, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, (in press).
ABENAVOLI MR, SORGONÃ A, SIDARI M, BADIANI M & FUGGI A (2003) Coumarin
inhibits the growth of carrot (Daucus carota L. cv. Saint Valery) cells in suspension
culture. Journal of Plant Physiology 160, 227-237.
AMARAL A & TAKAKI M (1998) Achene dimorphism in Bidens pilosa L. (Asteraceae)
as determined by germination tests. Brazilian Archives of Biology and Technology
41, 11-16.
AMARAL A & TAKAKI M (2001) Phytochrome controls achene germination in Bidens
pilosa L. (Asteraceae) by very low fluorescence response. Brazilian Archives of
Biology and Technology 44, 121-124.
ANDREWS DL, COBB BG, JOHNSON JR & DREW MC (1993) Hypoxic and anoxic
induction of alcohol dehydrogenase in roots and shoots of seedlings of Zea mays.
Plant Physiology 101, 407-414.
ATKIN OK, ZHANG Q & WISKICH JT (2002) Effect of temperature on rates of alternative
and cytochrome pathway respiration and their relationship with the redox poise of
the quinone pool. Plant Physiology 128, 212-222.
BEUGE JA & AUST SD (1978) Microsomal lipid peroxidation. Methods of Enzymology
52, 302-310.
44
KNYPL JS (1964) Coumarin-induced respiration of sunflower. Physiologia Plantarum
17, 771-778.
KUPIDLOWSKA E, KOWALEC M, SULKOWSKI G & ZOBEL AM (1994) The effects of
coumarin on root elongation and ultrastructure of meristematic cell protoplast.
Annals of Botany 73, 525-530.
LARKIN PJ (1987) Calmodulin levels are not responsible for aluminum tolerance in
wheat. Australian Journal of Plant Physiology 14, 377-387.
LEE CY (1982) Alcohol dehydrogenase from Drosophila melanogaster. Methods of
Enzymology 89, 445-450.
LENNON AM, PRATT J, LEACH G & MOORE AL (1995) Developmental regulation of
respiratory activity in pea leaves. Plant Physiology 107, 925-932.
MATSUI K, HIJIMA K, TABUCHI Y & KAJIWARA T (1999) Cucumber cotyledons
lipoxygenase during postgerminative growth. Its expression and action on lipids
bodies. Plant Physiology 119, 1279-1287.
MILLAR AH, ATKIN OK, MENZ RI, HENRY B, FARQUHAR G & DAY DA (1998) Analysis
of respiratory chain regulation in roots of soybean seedlings. Plant Physiology 117,
1083-1093.
MORELAND ED & NOVITZKY WP (1987) Effects of phenolic acids, coumarins and
flavonoids on isolated chloroplast and mitochondria. In: Allelochemicals: Role in
Agriculture and Forestry. (ed GR Waller), 247-261. ACS Symposium Series,
Washington DC.
MUSCARI CL, FRASCARO M, GUARNIERI C & CALDARERA CIM (1990) Mitochondrial
function and superoxide generation from submitochondrial particles of aged rat
hearts. Biochimica and Biophysical Acta 1015, 200-204.
45
PODBIEKOWSKA M, KUPIDLOWSKA E, WALEZA M, DOBRZYNSKA K, LOUIS SA,
KEIGHTLEY A & ZOBEL AM (1994) Coumarin as antimitotics. International Journal
of Pharmacognosy 32, 262-273.
PORTA H & ROCHA-SOSA M (2002) Plant lipoxygenases. Physiological and Molecular
Features. Plant Physiology 130, 15-21.
PUTNAM AR & DUKE WB (1974) Biological suppression of weeds: evidence for
allelopathy in accessions of cucumber. Science 185, 370-372.
RAYMOND P, AL-ANI A & PRADET A (1985) ATP production by respiration and
fermentation, and energy charge during aerobiosis ans anaerobiosis in twelve fatty
and starchy germinating seeds. Plant Physiology 79, 879-884.
ROSHAL S (1996) Lipoxygenase in plants: their role in development and stress response.
Zeitschrift für naturforschung 51, 123-138.
SIEDOW JN (1991) Plant lipoxygenase: structure and function. Annual Review of Plant
Physiology and Plant Molecular Biology 42, 145-188.
SIEDOW JN & GIRVIN ME (1980) Alternative respiratory pathway. Plant Physiology 65,
669-674.
SOLOMOS T, SPENCER M, PRASAD S & MALHOTRA SK (1972) Biochemical and
structural changes in mitochondria and other cellular components of pea cotyledons
during germination. Canadian Journal of Biochemistry 50, 725-737.
SVENSSON SB (1972) The effect of coumarin on growth, production of dry matter,
protein and nucleic acids in roots of maize and wheat and the interactions of
coumarin with metabolic inhibitors. Physiologia Plantarum 27, 13-24.
THALER J (1999) Jasmonate-inducible plant defenses cause increased parasitism of
herbivores. Nature 399, 686-688.
46
TIAN WN, BRAUNSTEIN LD, APSE K, PANG J, ROSE M, IAN X & STANTON RC (1999)
Importance of glucose 6-phosphate dehydrogenase activity in cell death. American
Journal of Physiology 276, C1121-C1131.
VALIO IFM, KIRSZENZAFT SL & ROCHA RF (1972) Germination of achenes of Bidens
pilosa L. I. Effects of light of different wavelengths. New Phytologist 71, 677-682.
VYVYAN JR (2002) Allelochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals.
Tetrahedron 58, 1631-1646.
WAGNER AM & MOORE AL (1997) Structure and function of the plant alternative
oxidase: its putative role in the oxygen defense mechanism. Bioscience Reports 17,
319-333.
WU H, PRATLEY J, LEMERLE D & HAIG T (1999) Crop cultivars with allelopathic
capability. Weed Research 39, 171-180.
47
Table 1. Seed germination and root growth of Bidens pilosa L. Each value is the
mean ±standard error of the mean obtained in four to five independent experiments.
Pairs of the same letters indicated that the differences between the mean values were
statistically significant, as determined by ANOVA with Duncan’s testing (P< 0.05).
Days of growth Germination (%) Root length (cm) Root fresh weight (mg)
2 29.40±2.73a,b 0.691±0.037 a,b 1.355±0.058 a,b
4 73.20±3.00a,c 1.074±0.067 a,c 2.204±0.188 a,c
6 88.40±2.32b,c 1.789±0.147 b,c 3.250±0.269 b,c
Table 2. Effects of coumarin (25 and 50 µM) on the content of MDA and
conjugated dienes in roots from seedlings grown for 4 days. Each value represents
the mean±standard error of the mean. Pairs of the same letters indicate that the
differences between the mean values were statistically significant as determined by
ANOVA with Duncan’s testing (P< 0.05).
Coumarin
concentration
(µM)
MDA
[µmol (g root fresh weight)-1 ]
(n=3)
Conjugated dienes
[µmol (g root fresh weight)-1 ]
(n=6)
0 0.0143±0.0024 3.18±0.21 a
25 0.00885±0.0008 3.78±0.49b
50 0.0123±0.0014 15.68±2.06 a,b
48
Table 3. Comparison of the several parameters measured in Bidens pilosa L.
seedlings at 2 days of growth in the absence of coumarin and at 4 days in the
presence of 50 µM coumarin. The data were obtained from experiments shown in
Figures 1, 2 and 3. Each value represents the mean±standard error of the mean.
Statistical significance of the differences between parameters was evaluated by means
of Student’s t-test and is mentioned as the P values.
Parameters Coumarin untreated
(2 days)
Coumarin-treated
(4 days)
P
Germination (%) 29.4±2.72 (n = 5) 32.0±1.366 (n = 6) 0.390
Root length (cm) 0.69±0.0366 (n = 4) 0.523±0.0302 (n = 6) 0.671
Root fresh weigh (mg) 1.355±0.0581 (n = 4) 1.61±0.09115 (n = 6) 0.072
Total respiration [nmol O2
min-1 (g fresh weight)-1]
426.8±31.73 (n = 4) 471.50±51.37 (n = 4) 0.487
KCN-sensitive respiration
[nmol O2 min-1 (g fresh
weight)-1]
315.74±25.93 (n = 4) 338.68±53.46 (n = 4) 0.713
SHAM-sensitive
respiration [nmol O2 min-1
(g fresh weight)-1]
30.95±9.049 (n = 4) 52.15±33.10 (n = 4) 0.559
Alcohol dehydrogenase
activity [µmol min-1 (g
fresh weight)-1]
0.2212±0.02586 (n = 3) 0.2007±0.05396 (n = 3) 0.749
Lipoxygenase activity
[µmol O2 min-1 (g fresh
weight)-1]
9.088±0.896 (n = 3) 20.470±0.954 (n = 3) 0.001
49
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Time course of respiration rates (A), alcohol dehydrogenase (B) and
lipoxygenase (C) activities in roots of Bidens pilosa L. seedlings. In A, root tip
samples were removed from seedlings and added without delay to the oxygen electrode
vessel, containing 2.0 mL of nutrient medium in the absence or presence of 270 µM
KCN or 5.0 mM SHAM. Oxygen consumption was followed polarographically over
approximately 12-15 min. Alcohol dehydrogenase activity (B) was measured in reaction
medium containing 1.0 mM NAD+ and 120 µM n-propanol. Lipoxygenase activity (C)
was measured polarographically in the presence of 3.0 mM linolenic acid. Each data
point is the mean value of four (A), three (B) or three (C) independent experiments.
Vertical bars are SEM. Pairs of the same letters indicate that the differences between the
mean values are statistically significant, as determined by ANOVA with Duncan’s
testing (P< 0.05).
Figure 2. The effects of coumarin on germination (A), root length (B) and root
fresh weight (C) of Bidens pilosa L . The seeds were germinated and grown on the
following regime: 8 hr light, at 30°: 16 hr dark, at 20°C, photon flux density of
approximately 230 µmol m-2 s-1. Coumarin (10-100 µM) was added to the nutrient
solution and at each experimental interval (2, 4 or 6 days) roots were excised and their
length and fresh weight were measured. All values are the means of three-five
independent experiments. Error bars are SEM. Significant differences between
coumarin-treated and untreated seedlings were identified by ANOVA with Duncan’s
testing (*P< 0.05).
Figure 3. Effects of coumarin on respiration (A), alcohol dehydrogenase (B) and
lipoxygenase (C) activities in roots of Bidens pilosa L. seedlings. The seedlings were
grown for 4 days in the absence or presence of coumarin (concentration range 10-100
µM). The respiration rates and the activities of lipoxygenase and alcohol dehydrogenase
were measured as described in legend of Figure 1. All values are the means of four
(A), three-four (B) or three (C) independent experi
50
2.0 3.0 4.00
200
400
600
Total respirationKCN sensitive respirationSHAM sensitive respiration
c,dc
ba
a
b
d
Oxy
gen
cons
umpt
ion
(nm
ol m
in-1
g-1
)
2.0 3.0 4.00.0
0.1
0.2
0.3
a,b
a,c
b,cAlc
ool d
ehyd
roge
nase
activ
ity (µ m
ol m
in-1
g-1
)
2.0 3.0 4.00
5
10
15
20
25
30
a,b
abLi
poxy
gena
se a
ctiv
ity
(µm
ol O
2 m
in-1
g-1
)
Time of growth (days)
A
B
C
FIGURE 01
51
0 10 25 50 1000
25
50
75
100
% g
erm
inat
ion
*
*
*
*
*
*
*
0 10 25 50 1000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Roo
t le
ngth
(cm
)
*
*
*
*
*
**
**
0 10 25 50 1000
1
2
3
4
5
Roo
t fre
sh w
eigh
t (m
g)
*
* **
*
2 days 4 days 6 days
Coumarin concentration ( µM)
A
B
C
FIGURE 02
52
0 10 25 50 1000
200
400
600
Total respirationKCN sensitive respirationSHAM sensitive respiration
* *
**
Oxy
gen
cons
umpt
ion
(nm
ol m
in-1
g-1
)
0 10 25 500.0
0.1
0.2
0.3
*
*
Alc
ool d
ehyd
roge
nase
activ
ity (µ m
ol m
in-1
g-1
)
0 10 25 500
5
10
15
20
25
30
*
*
Lipo
xyge
nase
act
ivity
(µm
ol O
2 m
in-1
g-1
)
Coumarin concentration ( µM)
A
B
C
FIGURE 03