germinaÇÃo de sementes e otimizaÇÃo de tÉcnicas … · após 60 dias de cultivo, verificou-se...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
BIOLOGICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
GERMINAÇÃO DE SEMENTES E OTIMIZAÇÃO DE
TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO DE UMBUZEIRO
(Spondias tuberosa, Arr.) - ANACARDIACEAE
SIMONE CASSIANO DE LIMA
Natal/RN
2009
SIMONE CASSIANO DE LIMA
GERMINAÇÃO DE SEMENTES E OTIMIZAÇÃO DE
TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO DE UMBUZEIRO
(Spondias tuberosa, Arr.) - ANACARDIACEAE
Orientador: Prof. Dr. Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa
Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia CB/UFRN
Dissertação de Mestrado apresentado junto ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, do Centro de Biociências, da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
para a obtenção do título de mestre.
Natal/RN
2009
SIMONE CASSIANO DE LIMA
GERMINAÇÃO DE SEMENTES E OTIMIZAÇÃO DE
TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO DE UMBUZEIRO
(Spondias tuberosa, Arr.) - ANACARDIACEAE
Dissertação apresentada pela aluna Simone Cassiano de Lima, ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas, do Centro de Biociências, da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, julgada adequada e aprovada pelos Membros da Banca Examinadora do
Exame de Qualificação do Curso de Mestrado em Ciências Biológicas.
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Osmar Alves Lameira
Laboratório de Biotecnologia/ EMBRAPA Amazônia Oriental
Profa Dr
a Sathyabama Chellappa
DOL/CB/UFRN
Prof. Dr. Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa
DBEZ/CB/UFRN
"O conhecimento exige uma presença curiosa do sujeito
em face do mundo. Requer uma ação transformadora
sobre a realidade. Demanda uma busca constante.
Implica em invenção e em reinvenção". (Paulo Freire)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho primeiramente a Deus, pois sem Ele, não teria determinação, força
e ânimo para a concretização de mais essa etapa em minha vida. Em fim, nada seria possível.
Aos meus pais, Ivan Félix de Lima (in memoriam), que apesar do pouco tempo de
convívio, contribuiu muito com as conquistas que tenho hoje e principalmente a minha mãe,
Miriam Cassiano da Silva, pelo amor incondicional, carinho irrestrito, total dedicação,
educação e empenho para que meus sonhos se realizassem, nunca deixando que as
dificuldades pudessem impedi-los. Serei sempre, imensamente grata.
Ao meu irmão Saulo e minha segunda mãe Maria Euzelina, por direta ou indiretamente,
fazerem parte de todos os momentos importantes da minha vida.
Ao meu namorado Bruno, por me acompanhar e auxiliar em meus experimentos,
principalmente à noite e nos fins-de-semana solitários do laboratório, pelo apoio nos
momentos difíceis, por sempre confiar em meu sucesso e aceitar a minha ausência quando
necessário.
Ao professor Dr. Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa pela oportunidade, orientação, por
transmitir com prazer e dedicação parte do que sei, pela injeção de coragem nos momentos
em que fraquejei, pelo estímulo à vida acadêmica e principalmente, por me ensinar que nunca
se deve desistir.
Ao meu amigo Emerson, por sempre me informar, em primeira mão, todas as
“novidades” sobre a nossa área de pesquisa, por todo entusiasmo, ajuda (mão-de-obra), idéias,
companheirismo, momentos divertidos e pelo ombro amigo nessa minha jornada de estudos.
Muito obrigada!
AGRADECIMENTOS
Aos professores do curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, pela contribuição, dentro
de suas áreas, para a minha formação acadêmica.
À Nilton de Brito Cavalcanti, que me forneceu todo o material vegetal de umbuzeiro
necessário, sem o qual, não poderia realizar os meus experimentos.
À Daisy, por ter dividido comigo, no decorrer do curso de mestrado, todas as expectativas,
alegrias e angústias, tanto no campo profissional quanto no particular, o que acarretou em
uma grande amizade para a toda vida.
À Gabriela, por no meu primeiro ano de pesquisa e seu de graduação, ter confiança e
credibilidade em minha pessoa, contribuindo com a sua grande ajuda e amizade.
À Lony, pela forma ingênua, entusiasmada e contagiante de ultrapassar os obstáculos
impostos para a concretização de um sonho, se tornando assim, um exemplo em minha vida.
A turma que está ou passou pelo Laboratório de Biotecnologia Vegetal: Ana Katarina,
Clarice, Daniel, Emanuel, Érika, Ivanira, Luanna e Yonara, que por seu companheirismo, se
tornou a minha segunda família, nunca tendo me negado auxílio nos momentos em que mais
precisei.
Aos meus tios, Francisco Lourenço e José Cassiano, pelo auxílio e por sempre acreditarem na
conclusão deste trabalho. Sou muito grata.
A Dona Rita e Dona Elione, por lições de perseverança, empenho e determinação, que não
são encontradas em livros.
A todos os familiares, tios, tias, primos, cunhados e amigos que se preocuparam e torceram
pelo meu sucesso.
Por fim, a todos que colaboraram para a conclusão deste projeto.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas ............................................................................................................... i
Lista de Figuras ....................................................................................................................... ii
Lista de tabelas ....................................................................................................................... iv
Resumo Geral .......................................................................................................................... v
General Abstract .................................................................................................................... vi
Capítulo 1
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 18
2.1 TAXONOMIA E DENOMINAÇÕES .............................................................................. 18
2.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA .................................................................................... 18
2.3 ASPECTOS MORFO-ANATÔMICOS ........................................................................... 19
2.4 FENOLOGIA .................................................................................................................... 22
2.5 IMPORTÂNCIA SOCIO-ECONÔMICA E DIFICULDADES ....................................... 23
2.6 PROPAGAÇÃO ................................................................................................................ 25
2.6.1 PROPAGAÇÃO SEXUADA ........................................................................................ 25
2.6.2 PROPAGAÇÃO ASSEXUADA ................................................................................... 26
2.7 A CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS COMO TÉCNICA DE PROPAGAÇÃO EM
GRANDE ESCALA ............................................................................................................... 27
2.7.1 MICROPROPAGAÇÃO ............................................................................................... 27
2.7.1.a ESTABELECIMENTO DO EXPLANTE .................................................................. 29
2.7.1.b MULTIPLICAÇÃO E ALONGAMENTO ................................................................ 30
2.7.1.c ENRAIZAMENTO ..................................................................................................... 31
3. OBJETIVOS E METAS ..................................................................................................... 32
3.1 OBJETIVO GERAL...........................................................................................................32
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 32
Capítulo 2
Artigo 1- A Influência de técnicas de quebra de dormência na germinação de sementes de
umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda) .................................................................................. 34
Artigo 2- Efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de cálcio [Ca(OCl)2] na
desinfestação de explantes de plantas de imbuzeiro (Spondias tuberosa, Arruda) para a
micropropagação in vitro ........................................................................................................ 51
Artigo 3- Efeito de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina sobre a micropropagação
in vitro de umbuzeiro............................................................................................................... 67
Capítulo 3
DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS ........................................................................... 84
CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 87
i
Lista de abreviaturas
AIA - Ácido 3- indolacético
ANA - Ácido naftaleno acético
AIB - Ácido indobutírico
BAP - 6-benzilaminopurina
[Ca(OCl)2] – Hipoclorito de cálcio
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
GA3 – Ácido giberélico
IBGE - Intituto Brasileiro de Geografia e Estatística
MS – Meio nutritivo de Murashige & Skoog (1962)
NaOCl – Hipoclorito de sódio
PVP – Polivinilpirrolidone
pH – Potencial Hidrogeniônico
WPM – Meio nutritivo Woody Plant Médium (Lloyd & McCown, 1980)
Zeatina – 6-(4-(hidroxi-3-trans-metil-2-aminobutenil)
2iP - 6-dimetilamino purina
2,4-D - 2,4- diclorofenoxiacético
µM - micromols
ii
Lista de Figuras
Capítulo 1
Figura 1. Umbuzeiro com copa verde e umbeliforme ........................................................... 19
Figura 2. Raízes de plantas de umbuzeiro com 60 dias de germinadas, apresentando túberas
.................................................................................................................................................. 20
Figura 3. Aspecto da flor do umbuzeiro, com 4 meses de germinação (precoce).................. 21
Figura 4. Aspecto do fruto do umbuzeiro vendido em feiras populares ................................ 21
Figura 5. Umbuzeiro desfolhado no período de estiagem ..................................................... 22
Figura 6. Umbuzeiro em plena produção de frutos ................................................................ 22
Figura 7. Seqüência do desenvolvimento de uma plântula de umbuzeiro desde emergência da
semente, em substrato vermiculita, demonstrando ser do tipo epígea. ................................... 25
Capítulo 2
Artigo 1. .................................................................................................................................. 34
Figura 1A e 1B. Corte em bisel na porção distal da semente de umbuzeiro (Spondias
tuberosa Arr.) utilizando-se bisturi N° 23 (A) e aspecto da mucilagem aberta da semente após
o corte semente após o corte, indicado pela seta (B) .............................................................. 49
Figura 2. Plântulas de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) no substrato vermiculita tratadas
com corte em bisel em casa de vegetação (DBEZ/UFRN) a temperatura média de 33°C, aos
60 dias do início do experimento ............................................................................................ 49
Figura 3. Vista geral das plantas de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) germinadas aos 15
dias de início do cultivo (A) e aos 60 dias de experimento (B) .............................................. 50
Artigo 2. .................................................................................................................................. 51
Figura 1A e1B. Explantes de umbuzeiro: ápice (A) e segmento nodal (B), após 30 dias de
tratamento de desinfestação com hipoclorito de cálcio a 1,0%, apresentando brotações.
.................................................................................................................................................. 57
Figura 2. Percentual de contaminação por bactérias e fungos referente à Média geral de
contaminação e Taxa de oxidação, independente da concentração do hipoclorito de cálcio
Ca(OCl)2, observada nos explantes: ápices, segmento nodal e segmento internodal ............ 58
Artigo 3. .................................................................................................................................. 67
Figura 1. Taxa de indução de brotos em segmentos nodais de Umbuzeiros cultivados em
meio de cultura WPM e suplementados com diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina
(BAP) ...................................................................................................................................... 82
iii
Figura 2A e 2B. Aspecto do segmento nodal (A) e internodal (B) de umbuzeiro, após 30 e
120 dias, respectivamente, inoculados em meio WPM com 0,1 mg.L-1
de BAP .................... 82
iv
Lista de Tabelas
Capítulo 2
Artigo 1. .................................................................................................................................. 34
Tabela 1 – Percentual médio de germinação (% G) e velocidade de germinação (IVG) de
sementes de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) submetidas a diferentes tratamentos de
quebra de dormência aos 30 dias de semeadura....................................................................... 48
Tabela 2 – Percentual médio de germinação (% G) e velocidade de germinação (IVG) de
sementes de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) submetidas a diferentes tratamentos de
quebra de dormência aos 60 dias de semeadura....................................................................... 48
Artigo 2.................................................................................................................................... 51
Tabela 1- Percentagem de contaminação e taxa de sobrevivência de explantes de umbuzeiro:
ápice, segmento nodal e internodal, submetidos à desinfestação em diferentes concentrações
de hipoclorito de cálcio [Ca(OCl)2]......................................................................................... 57
Tabela 2- Percentagem de oxidação de explantes de umbuzeiro: ápice, segmento nodal e
internodal, submetidos à desinfestação em diferentes concentrações de hipoclorito de
cálcio........................................................................................................................................ 59
Artigo 3.................................................................................................................................... 67
Tabela 1. Média de brotos por segmento nodal de umbuzeiro, porcentagem de oxidação e
calogênese em função diferentes concentrações de BAP e taxa de contaminação, após 30 dias
de cultivo in vitro..................................................................................................................... 81
Tabela 2. Média de brotos por segmento internodal de umbuzeiro, porcentagem de oxidação e
calogênese em função diferentes concentrações de BAP e taxa de contaminação, após 30 dias
de cultivo in vitro..................................................................................................................... 81
v
Resumo Geral
O umbuzeiro (Spondias tuberosa, Arr.) é uma árvore frutífera tropical que vem se
consolidando no mercado das agroindústrias de processamento, devido ao seu fruto de sabor
característico. Nesse sentido, estudos para otimizar a propagação de plantas são necessários
para garantir a produção de mudas com qualidade agronômica e garantias fitossanitárias.
Assim, este trabalho teve como finalidade determinar as técnicas eficientes para uniformizar a
germinação, já que as sementes de umbuzeiro apresentam dormência mecânica, e estabelecer
meios de cultura ideais para a multiplicação de brotos, bem como reduzir as contaminações e
oxidações in vitro. Primeiramente, em casa de vegetação da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, foi avaliado a influência de diferentes métodos de quebra de dormência na
emergência de plântulas de umbuzeiro e na velocidade de germinação (IVG) de sementes.
Após 60 dias de cultivo, verificou-se que o corte em bisel na porção distal da semente foi o
melhor tratamento, com índices de 85,33% de germinabilidade e 3,415 de IVG, quando
comparado com o tratamento de embebição em água + húmus por 12h e o grupo controle.
Posteriormente, as novas plântulas obtidas foram fontes de explantes em trabalhos de cultura
de tecidos. No Laboratório de Biotecnologia Vegetal dessa mesma instituição de ensino, se
utilizou ápices caulinares, segmentos nodais e internodais em pesquisas de descontaminação,
com variadas concentrações de hipoclorito de cálcio [Ca(OCl)2] e de micropropagação,
inoculando-os em meio WPM (1980) com variadas concentrações de 6-benzilaminopurina
(BAP). Utilizou-se 10 unidades amostrais com três repetições para as diferente concentrações
de [Ca(OCl)2], de BAP e tipo de explante. Ao fim de trinta dias, se observou que para o
controle da contaminação, durante o estabelecimento in vitro, as concentrações de [Ca(OCl)2]
entre 0,5% e 2,0% foram eficientes no combate das contaminações exógenas do ápice
caulinar. Nos segmentos nodais e internodais, as concentrações de [Ca(OCl)2] entre 1,0% e
2,0% e 1,5% e 2,0% foram respectivamente, suficientes na diminuição do percentual de
perdas por infestações nestes explantes. Para a micropropagação, o meio de cultura
suplementado com 0,1 mg.L-1
BAP favorece o melhor desenvolvimento de brotos múltiplos
por explante a partir de segmento nodal. Entretanto, não se obtêm sucesso de formação de
brotos em segmento internodal.
Palavras chaves: Spondias tuberosa, Cultura de tecidos, Desinfestação, Regulador de
crescimento.
vi
General Abstract
The brazilian-plum (Spondias tuberosa, His) is a tropical fruit tree that has been consolidated
in the market for agribusiness processing, due to its characteristic flavor of fruit. Accordingly,
studies to optimize the propagation of plants are necessary for production of seedlings with
agronomic and quality assurance measures. This study aimed at determining the efficient
techniques for uniform seed germination, as brazilian-plum seed present mechanical
dormancy, and establish optimal culture media for multiplication of shoots from the in vitro
micropropagation. Firstly, in a greenhouse at the Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, was evaluated the influence of different methods of breaking dormancy in the
emergence of seedlings of brazilian-plum and speed of germination (IVG) of seeds. After 60
days of cultivation, it was found that splay in the distal portion of the seed was the best
treatment, with rates of 85.33% in germinability and 3.415 of IVG, compared with the
treatment of seed-soaking in water for 12h + humus and the control group. Subsequently, new
sources of seedling explants were obtained in studies of tissue culture. Laboratory of Plant
Biotechnology that the university, was used stem apex, nodal segments and internodes in
search of decontamination with various concentrations of calcium hypochlorite [Ca(OCl)2]
and micropropagation, inoculating them in half WPM (1980) with various concentrations of
6-benzylaminopurine (BAP). We used 10 sample units with three replications for different
concentrations of [Ca(OCl)2], BAP and explants type. After thirty days, which was observed
for the control of contamination, during the establishment in vitro, concentrations of
[Ca(OCl)2] between 0.5% and 2.0% were effective in combating exogenous contamination of
the apex. In nodal segments and internodes, concentrations of [Ca(OCl)2] between 1.0% and
2.0% and 1.5% and 2.0% were respectively, sufficient to reduce the percentage of losses in
these infestations explants. For micropropagation, the culture medium supplemented with 0.1
mg.L-1
BAP promotes better development of multiple shoots per explants from nodal
segment. However, success does not get to shoot training in internodal segment.
Key words: Spondias tuberosa, Tissue culture, Disinfestations, Growth regulator.
CAPÍTULO 1
16
1. INTRODUÇÃO GERAL
O umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.), é uma espécie frutífera pertencente à Família
Anacardiaceae, endêmica do semi-árido brasileiro (Prado e Gibbgs, 1993) e de grande
importância sócio-ambiental, pois seu fruto saboroso e rico em nutrientes, colhido de forma
extrativista, é utilizado na alimentação humana e animal como também para a geração de
renda, a partir da venda do umbu in natura e/ou processado (Cavalcanti, 1999).
A implantação de pomares de umbuzeiro ainda é considerada elementar e mesmo seu
fruto, é desvalorizado comercialmente. Porém, devido ao crescente interesse dos
consumidores por frutos tropicais, aliado ao número cada vez maior de pequenas indústrias de
processamento e da demanda de frutos com sabores exóticos pelos mercados internacionais,
provavelmente haverá um aumento nas áreas de plantio dessa espécie. Esse fato tem
despertado um maior interesse dos agricultores para a coleta, beneficiamento e
comercialização do fruto do umbuzeiro (Santos & Nascimento, 1998). Segundo a EMBRAPA
Agroindústria Tropical (1999), o potencial agrossocioeconômico do umbuzeiro está se
confirmando a partir do aumento da procura de seu fruto, o que poderá gerar empregos fixos
no cultivo dos pomares e nas agroindústrias de processamento. Com o apoio das entidades
públicas, a implantação de pomares de umbuzeiro seria mais uma alternativa para fixar o
homem no campo.
Quanto aos métodos de propagação do umbuzeiro, que pode ser de forma sexuada e
assexuada, a maioria das mudas são originadas de sementes, apresentando grande
variabilidade nos indivíduos e conseqüentemente nas características dos frutos, além de
demorarem cerca de 10 anos para iniciar a frutificação (Alencar, 1999). A produção de mudas
a partir dos métodos de estaquia e enxertia pode gerar plantas e frutos com maior
uniformidade e produção mais precoce, do que aquelas obtidas naturalmente (Neto et. al.,
1989).
Observando-se estes aspectos, a cultura de tecidos pode ser considerada bastante útil
no processo de propagação, pois em laboratório, a partir da aplicação de suas técnicas, se
obtém mudas com melhor desenvolvimento, provenientes de plantas que apresentem
características agronômicas desejáveis e com garantias fitossanitárias, em menor tempo e
grande quantidade, quando comparados aos métodos naturais (Torres, 1998). A partir das
técnicas de cultura de tecidos, também se podem conservar recursos genéticos (germoplasma)
in vitro, que podem vir a auxiliar nos programas de melhoramento. Essa prática se torna muito
17
eficiente quando se avalia a redução dos riscos de perda de acessos devido a intempéries
ambientais, vandalismo e às pragas e doenças.
Como uma das principais dificuldades da fruticultura do Estado do Rio Grande do
Norte é a baixa quantidade de mudas com características desejáveis, o desenvolvimento de
plântulas que apresentem boa qualidade genética e fitossanitária auxiliaria no aumento da
produtividade e da qualidade dos produtos nas áreas agrícolas, permitindo a implantação de
lavouras com as fruteiras nativas da região.
A possibilidade de se obter sucesso com a micropropagação de Spondias advém dos
resultados observados do uso desta técnica em inúmeras espécies vegetais lenhosas, inclusive
com outras anacardiáceas, como a exemplo do cajueiro (Anacardium occidentale L.) (Lemos,
2008). Entretanto, as pesquisas de propagação desta família vegetal, por cultura de tecidos,
ainda se encontram incipientes, tendo em vista que poucos estudos têm sido publicados em
periódicos científicos e todas, embora gerem expectativas, apresentam resultados
insatisfatórios para popularizar a técnica entre as Spondias (Carvalho et. al., 2002).
Assim, este trabalho teve por objetivo estabelecer uma metodologia apropriada para a
produção em grande escala de mudas de umbuzeiro com genótipos superiores, a partir de
técnicas de micropropagação, como também: contribuir com conhecimentos científicos sobre
esta espécie pouco estudada e de conservar material genético ex vitro (em casa de vegetação),
para dispor, posteriormente, de amostras saudáveis para futuras pesquisas de melhoramento
genético e programas de reflorestamento.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TAXONOMIA E DENOMINAÇÕES
A família Anacardiaceae pertence à ordem Sapindales que compreende cerca de 80
gêneros e 600 espécies predominantemente distribuídas na região Pantropical, sendo também
observada representantes nas áreas temperadas da Europa, Ásia e América do Norte. No
Brasil, são encontrados cerca de 15 gêneros e aproximadamente 68 espécies, pertencentes a
três diferentes tribos: Mangiferae, Spondiaceae e Rhoideae (Ferreira, 2000).
O gênero Spondias foi criado por Linnaeus em 1753, contendo apenas a espécie
Spondias mombim (cajá) (Airy Shaw & Forman, 1967, citado por Carvalho, 2008).
Atualmente, este gênero é composto por 15 espécies, sendo sete delas encontradas no Brasil e
todas apresentando frutos comestíveis: Spondias mombim L. (cajá), Spondias lutea L. (cajá ou
taperebá), Spondias cytherea Sonn. (cajá-manga), Spondias venulosa (cajá-mirim), Spondias
purpurea L. (ciriguela), Spondias tuberosa Arr. (umbu) e Spondias sp (umbu-cajá) (Pires,
1990).
Segundo Mendes (1990), os primeiros relatos da existência do umbuzeiro foram
realizados por Gabriel Soares de Souza em 1587, quando o cita no seu “Tratado Descritivo do
Brasil”, enaltecendo a importância das raízes e das frutas para os índios e habitantes da região.
Posteriormente em 1810, o pesquisador Manuel de Arruda Câmara fez a descrição científica
do umbuzeiro classificando-o como espécie Spondias tuberosa, da família Anacardiaceae.
O termo imbu e a variação umbu têm origem no tupi-guarani “Y-mb-u”, que significa
“árvore que dá de beber”, se referindo à quantidade de água contida em suas raízes, que
formam túberas denominadas de xilopódios. Popularmente, o fruto também é chamada de
ombu, ambu, embu e giqui. No idioma inglês, esta espécie é denominada de brazilian-plum
(Corrêa, 1978, citado por Neves & Carvalho, 2005).
2.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
O umbuzeiro é uma espécie endêmica da região semi-árida brasileira (Prado & Gibbs,
1993), naturalmente encontrada nas Caatingas elevadas da Serra da Borborema, Serras do
Seridó Norte-Rio-Grandense, na região Agreste do Piauí, nas Caatingas de Pernambuco,
Alagoas e Bahia e no norte de Minas Gerais (Mendes, 1990; Lorenzi, 1992). Estas áreas
apresentam, principalmente, as seguintes características: temperaturas entre 13°C a 38°C,
umidade relativa entre 30% a 80%, pluviosidade anual entre 400 a 800mm e 3.000 horas de
insolação/ano (Duque, 1980). A área de crescimento natural do umbuzeiro é limitada pela
19
mata atlântica, cerrado e pela região pré-amazônica (Santos, 1997). De acordo com Lima
Filho (2008), o umbuzeiro pode se desenvolver nos mais variados tipos de solo do Nordeste,
principalmente naqueles encontrados na grande formação da Depressão Sertaneja, onde há
maior ocorrência dos solos Brunos não-cálcicos, Podzólicos Distróficos e Eutróficos.
A área de alta diversidade do umbuzeiro, segundo Giacometti, 1993, citado por Neves
e Carvalho, 2005, compreende as Caatingas dos Estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do
Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas e Chapada Diamantina na Bahia, onde foi observado
um elevado número de plantas ocorrendo naturalmente.
2.3 ASPECTOS MORFO-ANATÔMICOS
O umbuzeiro é uma árvore de pequeno porte, com altura variando entre 4 a 6 metros e
copa umbeliforme (Figura 1), que pode atingir de 10 a 15 metros de diâmetro e longevidade
de mais de 100 anos (Carvalho, 1986).
Figura1. Umbuzeiro com copa verde e umbeliforme.
Esta espécie possui um sistema radicular especializado e adaptado a condição
ambiental de estresse hídrico característico de seu habitat natural, sendo formado por raízes
longas que se alastram horizontalmente próximas a superfície do solo, que podem atingir
profundidade superior a um metro, possuindo também, estruturas denominadas de túberas
(xilopódio) (Figura 2) (Mendes, 1990). As túberas se caracterizam como intumescentes e são
constituídas por tecido lacunoso e celulósico que servem para armazenar água, mucilagem,
glicose, tanino, amido, ácidos, nutrientes, entre outros compostos. São suculentas e de sabor
® Nilton de Brito Cavalcanti
20
agradável, sendo popularmente conhecidos como cafofas ou batatas de umbu, as quais muitas
vezes são utilizadas na alimentação, podendo também delas ser extraido um líquido de sabor
amargo que pode ser usado para saciar a sede (Mendes, 1990 e Lima Filho, 2001).
Figura 2. Raízes de plantas de umbuzeiro
com 60 dias de germinadas, apresentando
túberas.
O caule do umbuzeiro apresenta de 3 a 5 ramificações principais, podendo estas
ocorrer desde a base até 1 metro de altura do solo (Pires, 1990). Possui uma casca que varia
do cinza claro ao negro, áspera e rígida, de espessura média entre 2 a 5 mm, podendo
apresentar ramos novos lisos e ramos velhos com ritidomas (partes do caule que se soltam,
quando o suber é acumulado) (Lima, 1982).
As folhas do umbuzeiro são verdes, alternas, pecioladas, imparipenadas, com 3 a 7
folíolos oblongos-ovalados, com base obtusa ou cordada, ápice agudo ou obtuso, com cerca
de 2 a 4 cm de comprimento, 2 a 3 cm de largura e margens serrilhadas ou inteira lisas,
podendo apresentar pilosidade, glabras quando adultas, tornando-se de coloração avermelhada
no início da estação seca anual, antecedendo a abscisão (Gomes, 1990; Lima, 1994).
As flores são periféricas, brancas, perfumadas, melíferas e actinomorfas (Figura 3). O
cálice possui entre 4 a 5 sépalas e a corola entre 4 a 5 pétalas valvadas. Quando abertas,
medem de 7 a 8 mm de diâmetro. São dispostas em panículas terminais de 10 a 15 cm de
comprimento. Os ramos da inflorescência e o pedicelo são finos e pilosos. As inflorescências
apresentam 50% de flores masculinas e 50% de flores hermafroditas (Lima, 1989). O
Túberas ® EMBRAPA Semi-Árido
21
interstício das flores ocorre entre meia-noite e quatro horas da manhã, ocorrendo picos de
abertura às duas horas (Pires & Oliveira, 1986).
Figura 3. Aspecto da flor do umbuzeiro,
com 4 meses de germinação (precoce).
O fruto, denominado de umbu ou imbu, é uma drupa, normalmente apresentacoloração
amarelo esverdeada quando maduro com diâmetro médio de 3 cm, peso entre 20-30 gramas,
possuindo formas variando entre arredondada, ovóide e oblonga (Figura 4). O umbu é
constituído por um pericarpo coriáceo (casca) (22%), polpa suculenta de sabor agridoce
(68%) e endocarpo (10%). O endocarpo é muito resistente e nele está contida a semente
propriamente dita. É formado por três camadas denso fibrosas, pesando de 1 a 2 gramas e com
1,2 a 1,4 cm de diâmetro após despolpado, podendo apresentar formas entre arredondado a
ovalado (Epstein, 1998).
Figura 4. Aspecto do fruto do umbuzeiro
vendido em feiras populares.
® Simone Cassiano de Lima
® jady.blogspot.com
22
2.4 FENOLOGIA
O umbuzeiro perde totalmente as folhas durante o período de estiagem anual (Figura
5). Dessa forma, a planta reduz a sua superfície transpiratória se prevenindo da desidratação
nos períodos mais secos do ano (Lima Filho, 2008). Normalmente, logo após as primeiras
chuvas, ocorre o florescimento e, posteriormente, o surgimento de novas folhas.
Figura 5. Umbuzeiro desfolhado no período de estiagem.
A frutificação é abundante, se iniciando aproximadamente 25 dias após a floração e a
maturação dos frutos, em torno de 120 dias (Lima Filho, 2008). De uma única planta se pode
extrair aproximadamente 300 kg de umbu por safra (Figura 6) e o período de frutificação é
normalmente de dois meses e meio (Guerra, 1981). Dependendo dos fatores climáticos e
ambientais, a obtenção de frutos pode ocorrer em períodos diferentes.
Figura 6. Umbuzeiro em plena produção de frutos.
® Vinicius Ancetti
® http://2.bp.blogspot.com
23
Segundo Pires (1990), no sertão Pernambucano se observa florescimento nos meses de
outubro a dezembro e, no Agreste, ocorre de janeiro a março, com frutificação entre março e
junho. No sertão de Alagoas, o período de floração do umbuzeiro ocorre entre os meses de
setembro a dezembro (Neves & Carvalho, 2005).
2.5 IMPORTÂNCIA SOCIO-ECONÔMICA E DIFICULDADES
O fruto do Umbuzeiro desempenha importante papel social para as famílias que
residem nas regiões secas do Nordeste brasileiro, pois esse fruto é utilizado na alimentação de
muitas famílias rurais, sendo em muitos casos, uma das únicas fontes de vitamina C de que
dispõe a população nas regiões mais secas da zona semi-árida nordestina (Mendes, 2001).
Embora o umbu seja considerado um produto de extração vegetal não cultivado,
coletado em árvores que crescem espontaneamente (IBGE, 1996), ele é uma importante fonte
de renda e de absorção de mão-de-obra para as comunidades rurais nordestinas
(CAVALCANTI, 1999, 2000) que, além da venda do fruto in natura, se beneficiam com os
produtos resultantes de seu processamento, fabricando: doces, geléias, polpas, vinagre, vinho,
licor, sorvetes, sucos, passa e fruta cristalizada. Desta forma, o umbuzeiro é uma fruteira
muito requisitada nos programas de agricultura familiar, por se tratar de uma espécie nativa e
de fácil manejo e que se pode lucrar com os seus derivados.
Cavalcanti et al. (1996), ao realizarem uma pesquisa com as comunidades rurais que
residem na região do médio Rio São Francisco constatou que os pequenos agricultores
obtiveram renda próxima a dois salários mínimos por mês, na época da safra do umbu, que
compreende de janeiro a junho naquela região.
Segundo Maia (2004), a planta de umbuzeiro pode ser considerada de aproveitamento
total, pois a sua madeira é empregada na fabricação de móveis rústicos, telhamento e
sustentação de casa de taipa, lenha, carvão e pasta para papel. Devido a sua beleza e pela
grande copa que oferece sombra a animais e pessoas, é indicada para ser plantada vizinha às
casa rurais como planta ornamental. Na medicina caseira, a água das “batatas" (túberas) é rica
em vitamina C e sais minerais, sendo utilizada para combater diarréias, verminose e escorbuto
(Maia, 2004). O chá feito da casca também é recomendado para combater a diarréia e outras
moléstias. Os índios Kariri-shoko utilizam o decocto da casca como anti-hemorrágico e para
prevenir abortos. Ainda, o chá da casca ou das folhas é utilizado como calmante. Na
forragem, as folhas, os frutos e as túberas servem de alimento para os animais domésticos. O
caroço do umbu é rico em gordura e proteína e o óleo retirado dele pode ser utilizado nas
indústrias para a fabricação de margarina e óleos (Maia, 2004).
24
Em programas de reflorestamento, o umbuzeiro pode ser utilizado na segunda fase de
recomposição da vegetação de áreas degradadas, principalmente devido à grande copa e a boa
penetração das raízes nas camadas superiores do solo, que atuam como protetor prevenindo
erosão. Na alimentação humana, o fruto é rico em vitamina C (entre 14 mg no fruto maduro e
33 mg no fruto verde por 100 ml). Ele pode ser consumido in natura ou processado e
principalmente na tradicional umbuzada. As túberas podem ser ingeridas frescas ou na forma
de picles e da raiz seca, se extrai farinha comestível. As folhas verdes ou refogadas são
utilizadas para compor saladas. A época de colheita do fruto se dá no período de escassez de
alimento nos roçados. No livro Sertões de Euclides da Cunha, o referido autor escreve: ”É a
árvore sagrada do sertão. Sócia fiel das rápidas horas felizes e longos dias amargos dos
vaqueiros” (Maia, 2004).
Apesar de sua importância para as comunidades rurais de baixa renda como fonte de
alimento e absorção de mão-de-obra, o número de umbuzeiros no território brasileiro vem
decaindo com o passar dos anos. Nas últimas décadas, a produção nacional de umbu caiu de
19.859 toneladas em 1990 para 10.206 toneladas em 1999 e em 2007, essa produção reduziu-
se para 8.619 toneladas (IBGE, 2006; 2007). Essa redução é atribuída ao desmatamento da
mata nativa para a formação de pastagens, projetos de irrigação, queimadas e a extração sem
controle da madeira a ser utilizada como fonte de energia em padarias, olarias e calcinadoras
(Queiroz et al., 1993), como também devido à alta palatabilidade de suas plântulas em
desenvolvimento, que passam a servir como fonte alimentar para bovinos, ovinos e roedores,
sendo assim uma das principais causas da inexistência de indivíduos novos na caatinga (Cazé
Filho, 1983). Esse fato pode ser observado por Albuquerque (1999), que após uma pesquisa
de seis anos envolvendo o pastoreio na caatinga com bovinos, em uma área de 400 ha no
município de Petrolina-PE, não encontrou plantas novas de umbuzeiro. Paralelo a isso, o
umbuzeiro vem sofrendo uma seleção negativa de seu genótipo, pois os frutos, que
apresentam melhor crescimento e aspectos saudáveis são coletados enquanto os de qualidade
inferior permanecem nos pés. Futuramente esses fatores, em conjunto, poderão levar a
extinção dessa espécie no meio natural.
Deste modo, percebe-se que são indispensáveis estudos científicos sobre essa espécie
tão importante de nossa caatinga, uma vez que nos levará a ter um melhor conhecimento
sobre ela e da necessidade de sua preservação.
25
2.6 PROPAGAÇÃO
2.6.1 PROPAGAÇÃO SEXUADA
A propagação do umbuzeiro ocorre naturalmente por sementes, que são dispersas após
o consumo in natura do fruto pela população e principalmente por animais. A obtenção das
sementes para o plantio é realizada de forma direta, quando se inicia a queda espontânea do
fruto, onde posteriormente se deve despolpar, lavar e deixar secar a sombra (Maia, 2004).
A sua germinação é do tipo epígea, no qual os cotilédones ficam acima do substrato
(Figura 7). Porém, as sementes de umbuzeiro não brotam de modo uniforme, levando entre 12
a 90 dias para iniciar este processo fisiológico após o semeio, tendo seu ápice aos 40 dias. O
índice de germinação varia entre 30 a 40 % (Neves & Carvalho, 2005). Este fato é atribuído à
composição anatômica desta semente, composta por três camadas densas e fibrosas, sem
perfuração em sua estrutura, dificultando assim a disponibilidade de água para o embrião e
conseqüentemente o processo de germinação, sendo este quadro, denominado de dormência
(Campos, 1986).
Figura 7. Seqüência do desenvolvimento de uma plântula de umbuzeiro desde emergência
da semente, em substrato vermiculita, demonstrando ser do tipo epígea.
Segundo Ferreira & Borghetti (2004), a dormência incide em aproximadamente dois
terços das espécies arbóreas e é caracterizada pelo retardo ou declínio da germinação, mesmo
cotilédones ® Simone Cassiano de Lima
26
que estas se encontrem em condições adequadas (umidade, temperatura, luz e oxigênio) para
o desenvolvimento de novas plântulas. Ela pode ser de dois tipos: primária, que já ocorre
quando a semente completa o seu desenvolvimento ou secundária, que se manifestam quando
as sementes maduras que germinam normalmente (sem dormência) ficam expostas a fatores
ambientais desfavoráveis.
Os procedimentos mais utilizados para a superação de dormência são: escarificação
química, escarificação mecânica, estratificação fria e quente-fria, choque térmico, exposição à
luz intensa, imersão em água quente e embebição em água fria (Kramer & Kozlowski 1972,
Fowler & Binchetti 2000).
2.6.2 PROPAGAÇÃO ASSEXUADA
Os métodos de propagação assexuada ou vegetativos mais utilizados para a obtenção
de plantas de umbuzeiro são a enxertia e a estaquia (Hartmann et al., 2002). Esse tipo de
propagação é aplicado em muitas culturas quando se necessita propagar clones com
características produtivas de interesse, em grande quantidade como também, para a
manutenção do patrimônio genético em pomares comerciais e centro de pesquisas, pois a
multiplicação sexuada traz a desvantagem de desuniformidade do pomar, porte alto das
plantas e entrada tardia em produção (Lederman et al., 1991).
O método de enxertia consiste em propagar plantas fazendo-se a união de duas partes:
uma que fornece a raiz, denominada de porta enxerto ou cavalo e a outra sobre, a qual este é
colocado, denominado de enxerto ou garfo (Araújo, 1999). Este método pode ser classificado
de três tipos de acordo com os procedimentos adotados: borbulhia, garfagem e encostia
(Fachinello et al., 1994).
No caso do umbuzeiro, por se tratar de uma espécie arbórea e de longo período
juvenil, a propagação vegetativa traz o benefício de reduzir de dez para quatro anos o tempo
de frutificação. Nascimento et al. (1993) demonstraram esse fato ao estudar os tipos de
enxertia para a propagação do umbuzeiro, observando 100% de pegamento e com o período
de idade reprodutiva (floração/frutificação) de 4,5 anos de idade.
Entretanto, há uma limitação quanto à época de coleta das estacas de umbuzeiro para
se realizar propagação vegetativa. O momento mais indicado de extração das estacas, que é de
maio a agosto (apenas 4 meses), coincide com o período que antecede o florescimento e a fase
inicial da frutificação, pois é quando a planta encontra-se em estado de repouso vegetativo ou
está na fase final de consumo das reservas armazenadas, podendo este período variar de
região para região (Galvão, 1985).
27
2.7 A CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS COMO TÉCNICA DE PROPAGAÇÃO EM
GRANDE ESCALA
A obtenção de plantas, a partir das técnicas de cultura de tecidos, vem se tornando
uma realidade para a maioria das espécies conhecidas e de importância ecológica, econômica
e medicinal. Nesse tipo de propagação, podem ser controladas as condições físicas, químicas
e biológicas envolvidas no processo de cultivo (Alencar, 1999).
A cultura de tecidos consiste no cultivo de células, tecidos ou órgãos vegetais em um
meio nutritivo e de sua manutenção em um ambiente asséptico e controlado (Paiva & Gomes,
1995), baseando-se na capacidade de totipotência celular de se multiplicar, diferenciar e
originar um novo indivíduo multicelular (Ducan, 1997). Os tipos de explantes que mais se
destacam são: de meristema, ovário, embriões, anteras, segmentos de plantas (folha, caule,
raiz e hipocótilo), células e protoplasto (Siqueira, 1983; citado por Alencar, 1999), que podem
ser aplicados para o desenvolvimento de cultivares superiores ou como alternativa aos
programas de melhoramento (Torres, 1998).
Devido ao extenso progresso no desenvolvimento de plantas resistentes a herbicidas,
insetos, patógenos e a alguns estresses ambientais, a cultura de tecidos pode ser empregada na
preservação de espécies ameaçadas de extinção, principalmente aquelas endêmicas a uma
determinada região.
Dentre as técnicas de cultura de tecidos, a micropropagação é a mais indicada para a
produção massal de mudas. Além disso, a micropropagação possibilita manter genótipos
híbridos, mutações ou variantes selecionados e propagar mudas com altas qualidades
fitossanitárias (Lima, 2000).
2.7.1 MICROPROPAGAÇÃO
A micropropagação consiste em uma técnica de propagação clonal rápida, sendo assim
denominada devido ao tamanho dos propágulos utilizados nos procedimentos de
multiplicação vegetativa (Grattapaglia &Machado, 1998). Com a aplicação de seus métodos,
se pode obter grande quantidade de mudas a partir de pequenas porções de plantas, em menor
espaço de tempo, sendo muito utilizado comercialmente para a produção de plantas
ornamentais e herbáceas.
Segundo Grattapaglia &Machado (1990; citado por Alencar, 1999), o método mais
comum para a propagação vegetativa de plantas in vitro é o cultivo de segmentos nodais, onde
cada uma das gemas encontradas na porção axilar das folhas é idêntica ao do ápice caulinar,
28
podendo ser isolado e inoculado em meio nutritivo, se realizando posteriormente seguidas
repicagens e indução de enraizamento.
As plantas lenhosas apresentam dificuldade para o estabelecimento de protocolos de
micropropagação devido os seus tecidos serem recalcitrantes e grandes produtores de
compostos fenólicos (Jones, 1991). Entretanto, esta técnica vem sendo utilizada
comercialmente para a produção de uma série de espécies comerciais, dentre elas a cerejeira
(Eugenia retusa), o eucalipto (Eucalyptus spp), a sequóia (Sequoia sempervirens) dentre
outras (Boulay, 1987). No caso dessas espécies, os tecidos mais fáceis de serem cultivados in
vitro, são provenientes de plantas matrizes jovens, que ainda não alcançaram a idade
reprodutiva, pois ao atingirem a maturidade, a planta apresenta redução na taxa de
crescimento e enraizamento (Pierik, 1990; citado por Medeiros, 1999).
No que dizem respeito ao umbuzeiro, os trabalhos científicos encontrados na literatura
sobre este tema são muito limitados. Provavelmente pelo pouco interesse ou pela dificuldade
de conseguir resultados satisfatórios. Acredita-se que os primeiros trabalhos apresentados
sobre micropropagação do umbuzeiro foram os de Oliveira et al. (1989), que utilizando como
explante: folhas, segmentos nodais e ápice caulinares, obtiveram melhores resultados de
multiplicação nos três tipos de tecidos, em meio MS ( Murashige e Skoog,1962), acrescido
com 4,6 µM de cinetina.
Posteriormente, Melo et al. (1997) realizando este mesmo tipo de pesquisa com o
umbuzeiro, observaram a formação de 2,2 brotos por segmento nodal inoculados em meio de
cultura MS semi-sólido, com nível de 0,1 mg.L-1
de BAP. Atualmente, Lemos (2008)
conseguiu índices de 1,74 brotos por explante de umbuzeiro em meio WPM suplementado
com 0,5 mg.L-1
de 6-benzilaminopurina (BAP), ao analisar a influência de diferentes
concentrações desse fitorregulador na regeneração de brotos em segmentos nodais de
umbuzeiro.
Diante dos conhecimentos existentes, se percebe a carência de estudos sobre o
umbuzeiro, o que pode dificultar em sua preservação no ambiente natural bem como num
melhor aproveitamento de todas as suas propriedades. Somando-se a isso, a dormência da
semente do umbu e a alta palatabilidade de suas plântulas, acarretam em dificuldades para o
desenvolvimento e produção em grande escala dessa espécie. Outro fato preocupante,
segundo publicação da revista Istoé (Abril/2009), foi que uma entidade internacional sem fins
lucrativos, a Slow Food, catalogou 750 alimentos (pratos típicos e ditos “locais”) ameaçados
no mundo, num compêndio chamado “Arca do Gosto”, dos quais 13 são brasileiros, incluindo
29
o umbu. Dessa forma, se percebe que podemos perder também parte de nossa identidade
cultural.
Segundo Alencar (1999), as etapas para o cultivo in vitro de espécies lenhosas a partir
de meristema pré-existente são: estabelecimento do explante, multiplicação das gemas
axilares, alongamento da haste caulinar, enraizamento e aclimatação. Torres (1998) afirma
que estas etapas permitem alterações de acordo com a espécie a ser pesquisada, além de se
manter o genótipo da planta matriz.
2.7.1.a ESTABELECIMENTO DO EXPLANTE
Plantas que apresentam características agronômicas superiores são mais utilizadas
como fonte de explante em trabalhos de cultura de tecido. Na maioria das vezes, estas, já se
encontram em fase reprodutiva e o estabelecimento de explantes provenientes de plantas
adultas é mais dificultoso devido às altas taxas de contaminação in vitro e de oxidação (Bonga
& Durzan, 1987; citado por Alencar, 1999). Para contornar esta situação, se deve selecionar
explantes com maior grau de juvenilidade em indivíduos adultos.
Uma das dificuldades para a elaboração de protocolos de micropropagação de plantas
lenhosas é o alto grau de contaminação dos explantes, principalmente daqueles oriundos do
campo. A maior incidência de contaminação é de origem bacteriana, embora ácaros e fungos
possam ocorrer com maior intensidade (Barros & Pasqual, 1991; citado por Alencar, 1999).
Segundo Gonçalves (1983), a contaminação pode gerar sérios problemas como perda
de material vegetal de interesse, além do risco de proliferação de contaminantes para outros
meios sadios. Entretanto, várias são as substâncias de ação germicida que podem ser
empregados nos procedimentos de desinfestação do material vegetal para posterior
inoculação, como: etanol, compostos a base de cloro (hipoclorito de sódio e de cálcio), cloreto
de mercúrio, cloreto de benzalcônio e peróxido de hidrogênio (Grattapaglia &Machado,
1998). Contudo, se deve elaborar uma metodologia para o uso destes produtos durante os
procedimentos de desinfestação, já que diferentes tecidos de uma mesma espécie podem ter
respostas variadas quanto à concentração e ao tempo de exposição nesses compostos
químicos.
Outro problema durante a fase do estabelecimento e do cultivo in vitro é o
metabolismo de compostos fenólicos e o escurecimento do explante devido à oxidação.
Plantas lenhosas são consideradas ricas em polifénois e essas substâncias, são derivadas do
metabolismo secundário das mesmas. Alguns gêneros de plantas são mais suscetíveis a
30
oxidação fenólica que outros, dependendo do tecido utilizado. Material juvenil de plantas
apresenta menores índices de oxidação do que os explantes adultos (Teixeira, 2006).
A oxidação fenólica ocorre devido à presença da enzima polifenol oxidase nos
plastídeos da célula vegetal, que atua oxidando substâncias precursoras da síntese de lignina,
acarretando na liberação de substâncias tóxicas no meio de cultura que inibem o
desenvolvimento do explante, (Grattapaglia &Machado, 1998). Vários tratamentos ou pré-
tratamentos podem ser utilizados com a finalidade de atenuar o problema de oxidação
fenólica. Dentre eles, os compostos anti-oxidantes mais comuns adicionados ao meio de
cultura são: cisteína, ácido ascórbico, glutatione, polivinilpirrolidone (PVP) ou substâncias
como carvão ativado, que adsorve os fenóis e seus produtos de oxidação, evitando que os
mesmos afetem o crescimento do explante (Melo, 1998; citado por Alencar, 1999).
Por outro lado, apesar das plantas originadas por sementes terem uma grande
variabilidade genética, elas fornecem tecidos jovens, os quais podem ser utilizados nos
experimentos de estabelecimento de protocolo de micropropagação para diversas espécies.
Além da grande disponibilidade durante todo o ano, fácil manejo e controle de vetores, as
plantas juvenis disponibilizam explantes que respondem rápido a aplicação de
fitorreguladores, permitindo-se assim a condução de inúmeros testes em meio nutritivo e
condições ambientais de cultura (Grattapaglia &Machado, 1998).
Diversas formulações de meios nutritivos são utilizadas em trabalhos de cultura de
tecido. Geralmente, o meio de cultura mais aplicado é o MS (1962), do qual suas
modificações e diluições apresentaram resultados satisfatórios para diversas espécies.
Entretanto, em espécies lenhosas, o meio MS não se mostrou muito eficiente devido às altas
taxas de oxidação dos explantes na presença elevadas dos sais que compõem este meio.
Assim, já foram descritas outras formulações de meios nutritivos para serem usados como
alternativa ao MS, dentre elas o meio WPM (Lloyd & McCown, 1980) (Anderson, 1984;
citado por Alencar, 1999), que é muito utilizado em trabalhos de micropropagação de espécies
lenhosas.
2.7.1.b MULTIPLICAÇÃO E ALONGAMENTO
Para se obter sucesso na propagação da cultura in vitro é indispensável o uso de
reguladores de crescimento (Schwenger et al., 1999). Essa fase é a mais longa da
micropropagação e têm como objetivo produzir um grande número de brotos. Os
fitorreguladores do grupo das citocininas, comumente são necessários nessa fase, e o seu tipo
e concentração, são os fatores que mais influenciam no êxito dos experimentos. Este grupo de
31
fitorreguladores é essencial para a quebra de dominância apical e indução da proliferação de
gemas. O 6-benzilaminopurina (BAP) tem sido muito utilizado por diversos autores para
promover a multiplicação da parte aérea e surgimento de gemas adventícias, em diversas
espécies. Isso fez com que o BAP fosse considerado um fitorregulador de excelência a ser
utilizado em trabalhos de micropropagação (Grattapaglia &Machado, 1998). Outras
citocininas utilizadas são: Zeatina (natural) e 2iP (6-dimetilamino purina).
Outro fitorregulador utilizado na cultura de tecidos é a giberelina, que atua no
crescimento modificando a plasticidade da parede celular. A aplicação exógena desse
fitorregulador no meio de cultura pode promover o alongamento de brotos que não
conseguiram atingir tamanho adequado para participarem da fase de enraizamento,
estimulando o aumento do comprimento dos entrenós das plantas, sem alterar o seu aspecto
normal (Vieira & Monteiro, 2002; citado por FICK, 2007).
2.7.1.c ENRAIZAMENTO
A indução de raízes em brotos micropropagados, permite a composição de uma planta
completa e de sua posterior transferência para o ambiente ex-vitro. Segundo Alencar,(1999), o
processo de enraizamento consiste em duas fases distintas, porém continua: a indução e o
alongamento. Na fase de indução, comumente se utiliza meio nutritivo contendo uma maior
concentração de auxinas enquanto que na segunda fase, este fitorregulador deve estar presente
em baixas concentrações ou ausente. Entretanto, o processo de enraizamento em plantas
lenhosas é mais complexoo do que em herbáceas (Grattapaglia &Machado, 1998),
principalmente quando se utiliza explantes oriundos de plantas adultas, pois os seus tecidos
estão bastante especializados.
As auxinas são substâncias fitorreguladoras, relacionadas quimicamente com o AIA.
Em trabalhos de cultura de tecidos, o tratamento de brotos com auxinas sintéticas como AIB e
ANA, estimula a formação de raízes (Gaspar & Coumans, 1987; citado por Alencar, 1999).
Segundo (Grattapaglia &Machado, 1998), a diluição dos sais do meio de cultura pode
aumentar a eficiência do processo de enraizamento, já que a sua alta concentração tendem a
inibir a formação dessas estruturas. Porém, o broto pode ter o seu desenvolvimento
interrompido e conseqüente morte em meios de cultura que apresentem baixa concentração de
macronutrientes (Grattapaglia &Machado, 1998).
32
3. OBJETIVOS E METAS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estabelecer protocolos de micropropagação de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.)
via cultura de tecidos, com a finalidade de, posteriormente, produzir mudas com
características superiores dessa espécie.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estabelecer protocolos apropriados de germinação de sementes de umbuzeiro ex-vitro
em casa de vegetação.
Definir protocolos de desinfestação de explantes de umbuzeiro crescidos em casa de
vegetação.
Determinar o efeito da citocinina BAP e do tipo de explante na taxa de multiplicação
de brotos de umbuzeiro.
CAPÍTULO 2
34
Artigo 1
TÍTULO
A Influência de Técnicas de Quebra de Dormência na Germinação de Sementes de
Umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda)
AUTORES
Simone Cassiano de Lima, Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa, Emerson de Medeiros Sousa e
Bruno Sousa Da Silva
REVISTA
Revista Brasileira de Botânica
SITUAÇÃO
Submetido
35
The influence of Dormanct breaking techniques on Umbuzeiro plants (Spondias tuberosa
Arruda) germination
Abstract - The objective of this work was to evaluate the influence of several techniques to
break the dormancy during the process of emergence and germination velocity of seeds .This
study have been realized in Green house in Centro de Biociências, Rio Grande do Norte
University and the experiment has been constituted of two different types of treatments:
beveled treatments 1 (T1) water imbibition + Humus for 12 hours (T2). Posterially, the seeds
of all the treatments have been sown in germination plate containing vermiculite as substrates
and maintained in environmental temperature and daily regime of irrigation. After 30 and 60
days of sowing, germination índex, germination velocity have been evaluated in both the
treatments besides the control. The Best treatment was the beveled cut which has been
resulted in 85.53 % of germinability índex and 3.45 of velocity germination rate germination
after 60 days.
Keys words: Beveled cut, imbibition, germinability (%G) and velocity index (IVG).
A influência de técnicas de quebra de dormência na germinação de sementes de umbuzeiro
(Spondias tuberosa Arruda)
Resumo- O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de técnicas de quebra de
dormência na emergência de plântulas de umbuzeiro e na velocidade de germinação de
sementes. Esta pesquisa foi realizada em casa de vegetação do Centro de Biociências da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte e o experimento consistiu em aplicar dois tipos
de tratamentos: T1- corte em bisel e T2- embebição em água + húmus por 12h.
Posteriormente, as sementes de todos os tratamentos foram semeadas em placas de
36
germinação contendo vermiculita e mantidas a temperatura ambiente e a regimes diários de
irrigação. Avaliaram-se aos 30 e 60 dias após a semeadura, a partir do teste de Tukey a 5% de
significância, os índices de germinação e velocidade de germinação das plântulas de
umbuzeiro entre os tratamentos com corte em bisel e embebição em água e o grupo controle.
O tratamento mais eficiente observado foi o de corte em bisel, que resultou em índices de
germinabilidade de 85,33% e 3,415 de velocidade de germinação após 60 dias do início do
experimento.
Palavras chave: Corte em bisel, embebição, germinabilidade (%G) e índice de velocidade de
germinação (IVG).
Introdução
O desmatamento bem como a exploração econômica extrativista não sustentada vem
colocando em risco as espécies nativas da vegetação do Nordeste Brasileiro. Dentre eles o
umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda), uma fruteira endêmica da região semi-árida,
pertencente à família anacardiaceae, xerófila e de porte arbóreo, podendo atingir até 7 m de
altura e 12 metros de diâmetro de copa (Mendes 2001). O fruto do umbuzeiro é uma drupa
que apresenta entre 10 a 14 cm de comprimento, nos formato ovóide ou oblongo, nas cores
variando entre o amarelo-esverdeado, que pode chegar a pesar entre 5 e 22 g (Lima 1996,
Mendes 1990). Embora seja considerado um produto de extração vegetal não cultivado (IBGE
1996), é uma importante fonte de renda e de absorção de mão-de-obra para as famílias rurais
nordestinas (Cavalcanti 1999, 2000), do qual se beneficiam com a venda do fruto in natura e
processado na forma de doces, geléias, polpas, sorvetes e sucos.
Nos últimos anos, as crescentes exportações de frutos tropicais e o aumento das
pequenas agroindústrias de processamento de produtos derivados do umbuzeiro (Cavalcanti &
37
Resende, 2005), vêm confirmando o grande potencial de exploração dessa fruteira na região
semi-árida.
A propagação do umbuzeiro ocorre normalmente de forma sexuada, porém as
sementes apresentam dormência, caracterizando-se em uma germinação lenta e desuniforme,
que impõem barreiras na produção de mudas em larga escala para o estabelecimento de
pomares comerciais e recuperação de áreas degradadas. Este fato, segundo Campos (1986),
esta relacionada à anatomia desta semente que apresenta três camadas densas fibrosa, sendo
que a mais interna se liga à camada externa por toda a sua extremidade proximal, não
apresentando nenhuma perfuração, dificultando assim a disponibilidade de água para o
embrião e conseqüentemente o processo de germinação.
A dormência que ocorre nas sementes é caracterizada pelo retardo ou declínio da
germinação, mesmo que estas se encontrem em condições adequadas (umidade, temperatura,
luz e oxigênio) para o desenvolvimento de novas plântulas (Ferreira & Borghetti 2004). O
processo de dormência em sementes, que incide aproximadamente em dois terços das espécies
arbóreas, pode ser de dois tipos: primária, que já ocorre quando a semente completa o seu
desenvolvimento ou secundária, que se manifestam quando as sementes maduras que
germinam normalmente (sem dormência) ficam expostas a fatores ambientais desfavoráveis,
sendo assim induzidas ao estado de dormência (Ferreira & Borghetti 2004).
Kramer & Kozlowski (1972), determinam que a dormência de sementes pode ser
tegumentar ou exógena, no qual o tegumento ou a cobertura protetora é muito resistente,
impedindo o crescimento e expansão do embrião, caracterizada por sementes que apresentam
embrião fisiologicamente imaturo e que requerem algumas exigências para germinarem. Os
métodos mais usuais para a superação de dormência são: escarificação química, escarificação
mecânica, estratificação fria e quente-fria, choque térmico, exposição à luz intensa, imersão
38
em água quente e embebição em água fria (Kramer & Kozlowski 1972, Fowler & Binchetti
2000).
Estudos conduzidos por Campos (1986), constataram que a dormência da semente de
umbuzeiro é do tipo exógeno e que o seu tegumento atua como fator limitante, promovendo
resistência mecânica à expansão do embrião, como também a entrada de água e oxigênio.
Nesse sentido, a partir de experimentos de quebra de dormência: este pesquisador afirmou que
um corte em forma de bisel na parte distal da semente seria suficiente na quebra de dormência
promovendo uma maior uniformização de emergência. Segundo Almeida (1987), a dormência
da semente do umbuzeiro é tida como superável durante o tempo de armazenagem. Adriance
& Brison (1980), salientaram que a germinação de sementes pode ser acelerada por
tratamentos de pré-embebição em água.
Deste modo, a presente pesquisa teve como objetivo analisar a influência dos
tratamentos de quebra de dormência: corte em bisel e embebição em água, no percentual de
germinação e no índice de velocidade de germinação em sementes de umbuzeiro oriundas de
plantas nativas do município Petrolina/PE.
Material e métodos
A pesquisa foi conduzida em casa de vegetação da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, no período entre Junho a Agosto de 2008, utilizando-se sementes de
umbuzeiro coletadas de plantas nativas em Fevereiro/2008, que foram doadas pela Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária-Embrapa Semi-Árido (Petrolina/PE), sendo estas
armazenadas em caixa de papelão à temperatura ambiente até o momento do experimento.
Em ambiente de laboratório, as sementes foram selecionadas ao acaso e submetidas a
diferentes tratamentos para a quebra da dormência: corte em bisel na parte distal da semente,
Embebição em água + húmus por 12h e sem tratamento caracterizado como grupo controle. A
semente do umbuzeiro apresentava tamanho variado com a extremidade proximal, em relação
39
ao pedúnculo, mais afunilada do que distal. Deste modo, o tratamento com corte consistiu em
um corte em forma de bisel na região distal da semente se utilizando bisturi n° 23, a fim de se
atingir a mucilagem e poder expor o embrião ao contato direto com a água (Figura 1 A, B). Já
o segundo tratamento, consistiu em embeber sementes de umbuzeiro sem algum tratamento
prévio de quebra de dormência, em água destilada + húmus de minhoca por 12h, com a
finalidade de aumentar a umidade no interior das mesmas. No tratamento controle, devido às
sementes não serem submetidas a algum tratamento, estas foram classificadas como
testemunha.
Após a aplicação dos tratamentos, as mesmas foram semeadas em placas de
germinação (68 cm x 6 cm x 34,5 cm), a uma profundidade de 3 cm, utilizando-se como
substrato vermiculita, sendo então mantidas em casa de vegetação a temperatura ambiente
(média de 33°C) e a regimes diários de irrigação, com 10 ml de água, por placa. Diariamente
foi realizada a contagem das plântulas emergidas considerando-se os critérios de germinação
agronômica de emergência da planta do substrato (Brasil, 1992). O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado. Para cada tratamento se utilizou um grupo
amostral com 100 sementes intactas (com endocarpo) e três repetições.
Analisou-se a germinabilidade (%G) e o índice de velocidade de germinação (IVG)
das plântulas de umbuzeiro aos 30 e 60 dias após a semeadura. Os dados obtidos foram
submetidos à análise de variância e a comparação de médias entre os tratamentos pelo teste de
Tukey ao nível 5% de probabilidade, utilizando-se o programa Statistica 7 (Copyright
StatSoft 2005).
Resultados / Discussão
Com base na análise de variância, pode-se observar na Tabela 1 que aos 30 dias do
início do experimento houve maior emergência das sementes submetidas ao tratamento de
40
corte em bisel, onde emergiram 50,66% das plântulas com o índice de velocidade de
germinação de 2,602 seguido pelo tratamento de imersão em água + húmus por 12 horas,
onde foi verificada a emergência de 25,33% e IVG de 1,082. A menor taxa de germinação e
índice de velocidade de germinação foi verificada no grupo controle, com 21,33% das
plântulas emergidas e IVG de 0,848. Neste período de análise, o tratamento com corte foi o
mais responsivo e diferente significativamente em relação aos demais tratamentos. Entretanto,
estes dois últimos não demonstraram diferenças significativas entre si.
O resultado no tratamento em corte foi em média 100% superior em relação aos
obitidos nos outros tratamentos no que diz respeito à germinabilidade e velocidade de
germinação. Porém, os resultados observados nos demais tratamentos foram inferiores aos
obtidos por Cavalcanti & Resende (2005), que testando a influência de seis diferentes
substratos na emergência de plântulas de umbuzeiro, obtiveram índices entre 27% a 46% de
germinação aos 30 dias de cultivo, utilizando-se sementes com três anos de armazenagem a
temperatura ambiente e sem algum tipo de tratamento de quebra de dormência. Além disso, o
melhor resultado de germinabilidade obtido por este mesmo autor aos 30 dias, no substrato
latossolo (46%), se equipara aos observados por Souza (1998), que estudou alguns métodos
de propagação de Spondias com potencial agroindustrial e por Nascimento et al. (2000), que
obtiveram plântulas de umbuzeiro com xilopódios de 1 a 2 cm de diâmetro aos 60 dias de
crescimento utilizando areia lavada durante o cultivo.
Costa et al. (2001), ao analisarem os diferentes tempos de pré-embebição em água (0,
48, 96 e 144 horas) na germinação de sementes de umbuzeiro, constataram que não houve
diferença significativa entre os tratamentos, independente do tipo da fruteira (genótipo azedo
e doce). Já Gonzaga Neto et al. (1988), descreveram que se obtêm resultados satisfatórios
com a imersão destas sementes por 48 horas em água antes do plantio. Na presente pesquisa,
41
não foi observada diferenças significativas na G% e no IVG entre o grupo controle e o
tratamento de imersão em água + húmus por 12horas aos 30 dias de cultivo.
As sementes tratadas com corte em bisel iniciaram a emergência no 9° dia de cultivo,
sendo mais breve do que as observadas nos outros tratamentos, que foram no 17° dia e 16° dia
após a semeadura, respectivamente, controle e imersão em água. Costa et al. (2001) relataram
o início da emergência após o 16° dia de semeio e Souza et al. (2005), realizando
experimentos com sementes de umbuzeiro em quatro períodos de desenvolvimento (verde, de
vez, maduro e maturação avançada) e quatro períodos de armazenagem (dois, quatro, seis e
oito meses), verificaram a emergência de plântulas de umbuzeiro ao 10° dia de cultivo, em
sementes oriundas de frutos maduros e com oito meses de armazenamento. Resultados
semelhantes também foram obtidos por Cavalcanti (2005), que pesquisando a influência de
diferentes tempos de armazenagem de sementes de umbuzeiro à temperatura ambiente até o
início do experimento (seis, 12, 24, 36, 48 e 60 meses pós-coleta), verificou início da
emergência a partir do 10° de cultivo em sementes com 24, 36 e 48 meses de armazenamento.
Com base na Tabela 2, aos 60 dias do início do experimento, ocorreu aumento nos
índices de emergência e na velocidade de germinação de plântulas de umbuzeiro
independente do tratamento, destacando-se os tratamentos controle e imersão em água, que
apresentaram esses percentuais triplicados. Nestes referidos tratamentos, obtive-se 69% de
emergência e IVG de 1,986 no grupo controle e 68,66 % de emergência e 2,132 de IVG nas
sementes tratadas com embebição de água +húmus por 12h. No tratamento de corte em bisel
constataram-se 85,33% (Figura 2) de plântulas emergidas e 3,415 de velocidade de
germinação, sendo este considerado o melhor tratamento de quebra de dormência neste estudo
por ter alcançado os maiores índices de %G e IVG e ser significativamente diferente em
relação aos demais tratamentos, mas que não demonstraram diferenças significativas a nível
de 5% de probabilidade.
42
Os dados constatados ao termino deste estudo no tratamento de corte em bisel se
assemelham aos de Cavalcanti (2005), que aos 60 dias do início do experimento obteve
índices de germinação de 80,25% de sementes de umbuzeiro com 36 meses de coleta e
divergem dos impetrados por Souza et al. (2005), que apesar de verificarem germinação de
87% e 90% em sementes de umbuzeiro extraídas de frutos maduros e de frutos muito
maduros, respectivamente, alcançaram esses resultados após 150 dias de cultivo. Os
resultados do presente estudo também foram superiores aos de Costa et al. (2001), que após
150 dias obtiveram os melhores índices de germinação em frutos de vez, com 41% para o
umbu da fruteira tipo azedo e 56% para as sementes de origem da fruteira doce.
Os índices de germinação e velocidade de emergência de plântulas de umbuzeiro
analisados aos 60 dias após a semeadura nos tratamentos controle e embebição em água são
semelhantes aos resultados de Araújo et al. (2001), que ao testarem escarificação em sementes
de umbuzeiro recém-colhidas, com 12 e 24 meses de armazenagem, obtiveram percentual de
73,6 % de germinação no grupo de 24 meses aos 45 dias de cultivo. Contudo, os dados
verificados na presente pesquisa, independente do tratamento, são muito superiores quando
comparados aos outros experimentos realizados pelo autor citado anteriormente, já que este
obteve índices de germinação de 27,7% e 22,8% em sementes com 12 meses de armazenagem
e recém-colhidas, respectivamente, em igual período de observação.
Os dados do controle e da imersão em água também se assemelham com os
verificados por Cavalcanti &Resende (2005), que obtiverem percentuais de 72% de
emergência e IVG de 2,822 após 120 dias de cultivo com sementes de umbuzeiro no substrato
latossolo. No entanto, aos 60 dias do início do experimento, estes mesmos autores
descreveram o maior percentual de germinação obtido de 56% substrato latossolo, sendo este
resultado ainda similar aos de Araújo et al. (2000), que plantaram sementes de umbu em
substrato de areia para formação de porta enxertos e obtiveram plantas para repicagem aos 75
43
dias após o plantio e de Nascimento et al. (2000), que utilizaram sementes de umbu
desprovidas de dormência em substrato com areia lavada.
As taxas encontradas nos três tratamentos ainda são superiores aos de Lederman et al.
(1989), que constataram germinação de sementes de umbuzeiro abaixo de 12% em seus
experimentos. Além disso, os trabalhos de Gonzaga Neto et al. (1988) relatam que os
métodos de quebra de dormência: escarificação química e mecânica, foram insatisfatórios na
indução de emergência de plântulas em seus experimentos.
De modo geral, apenas 4% das plântulas obtidas, independente do tratamento
aplicado, desenvolveram-se apresentando escurecimento ou rompimento dos cotilédones e
sistema radicular incompleto, desfavorecendo um bom desenvolvimento e em alguns casos,
levando a morte da planta.
Contudo, após 60 dias, a emergência e a velocidade de germinação diminuíram
drasticamente, impossibilitando a análises de dados após 90 dias do experimento.
As sementes germinadas originaram plantas que se desenvolveram com vigor,
tornando-se fontes de explantes em pesquisas de cultura de tecidos (Figura 3 A, B).
Conclusão
Baseados nos resultados obtidos podemos concluir que:
1- A dormência das sementes de umbuzeiro é superável a partir do uso da técnica de
corte em bisel na porção distal da mesma;
2- Melhores taxas de germinação e IVG, após 60 dias, foram observados com o
tratamento em corte;
3- A imersão em água + húmus por 12 horas não foi eficaz para o incremento nos
índices de germinação e velocidade de germinação de sementes da espécie em estudo;
44
4- A técnica de corte em bisel antecipa o início da germinação em sementes de
umbuzeiro; e
5- Sementes dessa espécie com 4 meses de coleta e armazenagem a temperatura
ambiente, independente de tratamento, apresentam bons índices de germinação.
Agradecimentos
À EMBRAPA Semi-Árido (Petrolina) na pessoa de Nilton de Brito Cavalcanti,
pesquisador dessa mesma instituição, pela atenção e orientação no manejo da cultura do
umbuzeiro e disponibilização de sementes dessa fruteira para a realização desse estudo e ao
Banco do Nordeste e ao CNPq, pelo apoio financeiro.
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48
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TABELA 1 – Percentual médio de germinação (% G) e velocidade de germinação (IVG) de
sementes de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) submetidas a diferentes tratamentos de
quebra de dormência aos 30 dias de semeadura.
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey
ao nível de 5%.
TABELA 2 – Percentual médio de germinação (% G) e velocidade de germinação (IVG) de
sementes de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) submetidas a diferentes tratamentos de
quebra de dormência aos 60 dias de semeadura.
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey
ao nível de 5%.
Tratamentos % G IVG
Controle 21,33 b 0,848 b
Corte em bisel 50,66 a 2,602 a
Embebição H2O + húmus 12h 25,33 b 1,082 b
Média 32,44 1,510
C.V. (%) 49,01 62,78
Tratamentos % G IVG
T0- Controle 69 b 1,986 b
T1- Corte em bisel 85,33 a 3,415 a
T2- Embebição H2O + húmus 12h 68,66 b 2,132 b
Média 74,33 2,511
C.V. (%) 12,8 31,30
49
FIGURA 1A e 1B – Corte em bisel na porção distal da semente de umbuzeiro (Spondias
tuberosa Arr.) utilizando-se bisturi N° 23 (A) e aspecto da mucilagem aberta da semente após
o corte semente após o corte, indicado pela seta (B).
FIGURA 2 – Plântulas de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) no substrato vermiculita
tratadas com corte em bisel em casa de vegetação (DBEZ/UFRN) a temperatura média de
33°C, aos 60 dias do início do experimento.
1 cm
1 cm 1 cm
A B
50
FIGURA 3 – Vista geral das plantas de umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) germinadas aos
15 dias de início do cultivo (A) e aos 60 dias de experimento (B).
A B
51
Artigo 2
TÍTULO
Efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de cálcio [Ca(OCl)2] na desinfestação de
explantes de plantas de imbuzeiro (Spondias tuberosa, Arruda) para a micropropagação in
vitro
AUTORES
Simone Cassiano de Lima, Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa; Emerson de Medeiros Sousa,
Bruno Sousa da Silva e Gabriela do Nascimento Oliveira.
REVISTA
Plant Cell Culture & Micropropagation
SITUAÇÃO
Submetido
52
Efeito de diferentes concentrações de hipoclorito de cálcio [Ca(OCl)2] na desinfestação
de explantes de plantas de imbuzeiro (Spondias tuberosa, Arruda) para a
micropropagação in vitro
Effect of calcium chloride in the desinfetation process of Umbuzeiro explants Spodia
tuberosa arruda for in vitro micrpropagation
Resumo - Com o objetivo de definir uma metodologia para o controle da contaminação no
estabelecimento de técnicas de cultura in vitro de tecidos de umbuzeiro (Spondias tuberosa
Arruda), se realizou em Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, testes de esterilização com hipoclorito de cálcio [Ca(OCl)2] em variadas
concentrações: 0,5%; 1,0%; 1,5 % e 2,0%. Deste modo, explantes retirados de plântulas
crescidas em casa de vegetação desta mesma instituição de ensino, tais como: ápices
caulinares, segmentos nodais e internodais, após os procedimentos de desinfestação, foram
inoculados em meio WPM (1980) não modificado e suplementado com 3% sacarose e 0,5%
de carvão ativo. Para cada tipo de explante e as diferentes concentrações de Ca(OCl)2, foram
utilizadas 10 unidades amostrais com três repetições cada. Após 30 dias, os dados obtidos
foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey a 5% de significância. Assim, as
concentrações do hipoclorito entre 0,5% e 2,0% foram eficientes no controle as
contaminações exógenas do ápice. Já para os segmentos nodais e internodais, as
concentrações de [Ca(OCl)2] entre 1,0% e 2,0% e 1,5% e 2,0% foram respectivamente,
suficientes na diminuição do percentual de perdas por contaminação nestes explantes.
Contudo, se observou altas taxas de oxidação nos três tipos de explantes de umbuzeiro
testados.
53
Palavras chaves: Ápice caulinar, segmento nodal, segmento internodal, contaminação.
Abstract - For the purpose of determining a methodology for contamination control in
order to establish a technique of tissue culture of brazilian-plum (Spondias tuberosa Arr.) in
vitro , testes of sterilization have been realized in laboratory using different concentration of
calcium chloride ( 0.5 % ; 1 %; 1.5 %; 2% ). In this mode, explantes have been removed from
plantlets developed in green house at Universidade Federal do Rio Grande do Norte. In this
mode , the following explants : Stem apex , nodal and internode have been inoculated on
WPM médium not modificated supplemented with sucrose 3 % , activated charcoal ,0,5%
after the desinfestation process. 10 experimental units and three repetition have been used for
every type of explant . After30 days, the data obtained have been submitted to variation
analysis and Tukey test with 5% of probability. According to our results , we found that the
following concentration of calcium chloride ( 0.5 % ; 2 % ) were efficient to eliminate the
exogenous contamination of stem apex explant , in the other side for the nodal and
internodal segments the following concentration ( 1% - 2%; 1.5 % - 2%) have been
respectively sufficient for contaminatio reduction . However, we have observed high level
oxidation using all the different type of brazilian-plum’s explants.
Index terms: Stem apex, Nodal segments, Internodal segments, Contamination.
Introdução
O umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr.) é uma espécie nativa do semi-árido brasileiro
que apresenta grande potencial comercial nas agroindústrias de processamento (Cavalcanti,
2000). Esta fruteira pode ser propagada por sementes, de forma vegetativa (estaquia e
enxertia) e a partir das técnicas de cultura de tecidos in vitro, sendo esta última considerada a
mais eficaz para inúmeras espécies, principalmente aquelas que apresentam: dormência em
54
suas sementes, desuniformidade de germinação e recalcitrância; pois a partir da aplicação de
suas técnicas, pode-se obter grande quantidade de mudas com características genéticas
desejadas e com alta garantia fitossanitária.
As espécies lenhosas, incluindo as Spondias, apresentam dificuldades para o
estabelecimento in vitro, principalmente se for utilizado material vegetal proveniente de
plantas adultas, uma vez que é mais freqüente apresentarem infestações por microrganismos
(Lemos, 2008).
Um elevado grau de assepsia é um fator limitante para o sucesso das pesquisas de
cultura de tecidos, já que fungos e bactérias, que podem ocorrer naturalmente em plantas
crescidas em campo, encontram no meio nutritivo utilizado, ambiente propício para um rápido
desenvolvimento, acarretando em morte das culturas por competição de nutrientes, liberação
de toxinas e modificação do meio de cultura (Texeira & Torres, 1998).
O uso de diferentes agentes germicidas nos tratamentos de desinfestação é
fundamental para reduzir patógenos dos tecidos que serão utilizados como explantes durante
os experimentos in vitro, a fim de se obter bons resultados no final dos processos de
estabelecimento (Gamborg & Phillips, 1995; Rocha, 1999 e Silva et al., 2003).
Os agentes germicidas mais difundidos para tratamentos de descontaminação dos
explantes são o etanol e os compostos à base de cloro, tais como o hipoclorito de sódio,
encontrado em formulações comerciais de água sanitária e o hipoclorito de cálcio, encontrado
na forma de pó em lojas de material para piscina (Grattapaglia & Machado, 1998).
No entanto, a continua exposição do tecido vegetal aos agentes esterilizantes como
também a sua alta concentração, comumente danifica o explante levando à morte celular. Para
contornar essa situação, é fundamental que se determine um protocolo adequado de
desinfestação para a espécie que se deseja estudar, a fim de que as pesquisas in vitro iniciem
com explantes saudáveis e o cultivo desenvolva-se com sucesso (Smith, 2000). No que se
55
referem ao umbuzeiro, as pesquisas sobre este assunto ainda se encontram incipientes, sendo
este fato comprovado com as insuficientes publicações em periódicos e eventos científicos.
Desta forma, este trabalho teve como objetivo identificar uma metodologia eficiente
para desinfestação de tecidos de plantas de umbuzeiro, tais como: ápices, segmento nodal e
segmento internodal, extraídos de exemplares crescidos em casa de vegetação a partir de
sementes, visando à obtenção de uma elevada taxa de sobrevivência dos explantes com o
mínimo de perdas por contaminação, durante o estabelecimento de culturas in vitro.
Metodologia
Material
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal do
Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia (DBEZ) da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte utilizando-se como explantes: ápices caulinares e segmentos nodais e
internodais de plantas de umbuzeiro com aproximadamente cinco meses de idade e crescidas
em casa de vegetação desta mesma instituição e diferentes concentrações de hipoclorito de
cálcio Ca(OCl)2 em testes de desinfestação.
Métodos
No laboratório de Biotecnologia Vegetal, em ambiente asséptico na câmara de fluxo
laminar, ápices caulinares, segmentos nodais e segmentos internodais oriundos de plantas de
umbuzeiro cultivadas em casa de vegetação foram desinfestados em seguidos banhos de:
álcool 70% durante 1 minuto, em hipoclorito de cálcio nas variadas concentrações: 0,5%,
1,0%, 1,5% e 2,0% por 10 minutos e três banhos em água destilada e autoclavada por 10
minutos cada.
56
Em seguida, os explantes foram inoculados em frascos (80 mm x 50 mm) contendo 20
ml de meio de cultura WPM não modificado, com pH ajustado a 5,6 e suplementado com 3%
de sacarose, 0,5% de carvão ativo e 0,9% de Agar, produzido pela empresa VETEC, sendo
então mantidos em sala de crescimento com temperaturas de 26 ± 2°C, fotoperíodo de 16
horas e umidade relativa próxima a 76 %. Para cada tratamento de desinfestação com as
variadas concentrações de hipoclorito de cálcio e os três tipos de explante, utilizou-se 10
unidades amostrais com três repetições.
Após 30 dias, os índices de contaminação e taxa de sobrevivência observada foram
submetidos à análise de variância e ao teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Para
obtenção de tais índices, no que se refere à contaminação, realizou-se identificação visual para
o tipo de patógeno: bactéria e/ou fungo. Já para o cálculo da taxa de sobrevivência, realizou-
se a subtração da quantidade de material contaminado e oxidado do total de explantes
utilizados, em cada concentração de hipoclorito e do tipo de tecido. As taxas de oxidação
foram calculadas se atribuindo notas inteiras de 1 a 10 conforme o grau de deterioração do
explante ao termino do experimento.
Resultados e Discussão
Em relação ao ápice, foram observadas contaminações no meio de cultura a partir do
oitavo dia de cultivo. Após o trigésimo dia de cultivo (Figura 1A), a taxa de contaminação e
oxidação (Tabela 1) confirmou-se estatisticamente igual, independente da concentração do
hipoclorito de cálcio utilizada neste estudo, com médias de contaminação de 3,33% em cada
tratamento e índice total de perdas por oxidação de 21% (Tabela 2). Contudo, foi notado um
aumento de morte tecidual do ápice a partir do acréscimo da concentração deste hipoclorito.
Referente ao tipo de contaminação neste mesmo tecido, tomando-se como base à média geral,
75% das contaminações foi de origem bacteriana enquanto que 25% foram de origem fúngica
57
(Figura 2). O índice total de sobrevivência ao termino do experimento foi de 79% neste tipo
de explante (Tabela 1).
Figura 1A e 1B: Explantes de umbuzeiro - ápice (A) e segmento nodal (B) - após 30 dias de
tratamento de desinfestação com hipoclorito de cálcio a 1,0%, apresentando brotações.
Tabela 1- Percentagem de contaminação e taxa de sobrevivência de explantes de
umbuzeiro: ápice, segmento nodal e internodal, submetidos à desinfestação em diferentes
concentrações de hipoclorito de cálcio Ca(OCl)2.
Concentração Ca(OCl)2 Ápice Segmento nodal Segmento internodal
T1- 0,5% 3,33% a 13,3% b 20% b
T2- 1,0% 3,33% a 3,33% ab 16,6% ab
T3- 1,5% 3,33% a 0% a 0% a
T4- 2,0%
Média geral de
contaminação
3,33% a
3,33%
0% a
4,16%
0% a
9,2%
CV (%) 56,9
Taxa de sobrevivência 79% 74% 72%
Médias seguidas da mesma letra na coluna, para os diferentes tipos de explante, não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
A B
58
Figura2: Percentual total de contaminações por bactérias e fungos, independente da
concentração do Ca(OCl)2, observado nos explantes: ápices, segmento nodal e segmento
internodal.
75%
25%
60%
40%
72,72%
27,27%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
Ápice Segmento Nodal Segmento Internodal
Bactéria
Fungo
Colunas
3D 3
No segmento nodal, foram verificadas contaminações a partir do décimo primeiro dia
de início do experimento. No decorrer de 30 dias (Figura 1B), os tratamentos com 1,5% e
2,0% de Ca(OCl)2 apresentaram as menores taxas de infestação, sendo observado percentuais
de 0% em ambas concentrações (Tabela 1), seguido pelo tratamento contendo 1,0%, com
índices de 3,33% e pelo tratamento utilizando 0,5%, com 13,3%. Do total de infestações,
independente do tratamento, 60% foi de origem bacteriana e 40 % de origem fúngica (Figura
2). Entre as concentrações testadas, o tratamento com 1,0% foi significativamente semelhante
a todos os tratamentos utilizados neste estudo. Porém, com 1,5% e 2,0% foram
estatisticamente iguais entre si e diferentes da concentração com 0,5%.
Ao termino das avaliações, a média total de sobrevivência dos segmentos nodais
envolvidos foi de 74% (Tabela 1). Em relação à oxidação fenólica deste explante, os índices
observados nos diferentes tratamentos de hipoclorito de cálcio foram estatisticamente iguais,
se obtendo uma média geral de perdas de 26% (Tabela 2).
59
Tabela 2- Percentagem de oxidação de explantes de umbuzeiro: ápice, segmento nodal e
internodal, submetidos à desinfestação em diferentes concentrações de hipoclorito de cálcio.
Concentração Ca(OCl)2. Ápice Segmento nodal Segmento internodal
0,5% 13,3% a 30% a 26,6% a
1,0% 20% a 23,3% a 30% a
1,5% 20% a 26,6% a 26,6% a
2,0% 30% a 26,6% a 30% a
Média geral 21% 26% 28%
CV (%) 14,4
Médias seguidas da mesma letra na coluna, para os diferentes tipos de explante, não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%.
No segmento internodal, foram observadas contaminações a partir do sétimo dia de
cultivo. Neste explante, ao termino das observações, foram verificados índices de
contaminação de 0% nos tratamentos 1,5% e 2,0% (Tabela 1). O tratamento com 0,5%
apresentou o maior percentual de perdas por patógenos com 20% dos explantes infestados,
seguido pela concentração contendo 1,0%, com 16,6%. Deste modo, o tratamento com 1,0%
foi significativamente semelhante a todos os tratamentos utilizados neste estudo. Enquanto
que, com 1,5% e 2,0%, os dados obtidosforam estatisticamente iguais entre si e diferentes de
0,5%.
Do total de segmentos internodais utilizados, independente da concentração do
hipoclorito, ocorreram 9,2 % de perdas por contaminação, sendo que 72,72 % de origem
bacteriana e 27,27% de origem fúngica (Figura 2). Independentemente da concentração do
hipoclorito, a taxa de sobrevivência observada foi de 72% (Tabela 1) e com relação à
oxidação, os índices analisados se mostraram estatisticamente iguais, apresentando um total
de perdas de 28% (Tabela 2).
60
Com base na Figura 2, as maiores taxas de contaminação foram de origem bacteriana.
Explica-se esse fato devido à presença endógena desses microorganismos no tecido vegetal,
os quais as substâncias desinfetantes não têm a capacidade de agir diretamente sobre estes
patôgenos, como ocorre com outros que estão presentes de forma exógena. Para se contornar
esta situação, em futuras pesquisas, se pode fazer uso de antibióticos no meio de cultura como
complemento do procedimento de esterilização.
Costa et al. (2007), obtiveram uma redução significativa da contaminação bacteriana
em segmentos nodais de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), utilizando variadas
concentrações do antibiótico cefotaxima sódica (55,23%, no tratamento testemunha para
9,99%, na concentração de 200 mg L-1
) durante o estabelecimento in vitro.
Entretanto, independente da concentração do hipoclorito de cálcio testado, se observou
que o ápice e o segmento nodal de umbuzeiro foram significativamente semelhantes entre si e
distintos do segmento internodal, em relação aos índices de contaminação, demonstrando que
nesses explantes se obtêm melhores resultados de desinfestação quando se utiliza as
concentrações testadas neste ensaio. Enquanto isso, as taxas de sobrevivência nestes três tipos
de explante foram semelhantes. Contudo, independente do tipo de tecido utilizado, todos os
explantes contaminados também apresentaram alta taxa de oxidação, culminando na necrose
dos mesmos.
A oxidação polifenólica é um processo metabólico natural da planta que inibe o
estabelecimento inicial do cultivo in vitro, principalmente em explantes de espécies lenhosas,
cujos tecidos são mais ricos em compostos fenólicos (Grattapaglia & Machado, 1998). A taxa
de oxidação observada neste trabalho pode ser atenuada alterando a concentração do
antioxidante carvão ativado empregado neste experimento ou utilizando-se outros compostos
antioxidantes, bem como incubar os explantes no escuro por um determinado período de
tempo, a fim de se retardar a ativação da enzima responsável por este processo metabólico, a
61
polifenil-oxidase. Paiva (2007), observou redução satisfatória na taxa de oxidação em
segmentos nodais de aroeira-da-praia (Schinus terebinthifolius Raddi.), inoculados em meio
MS suplementado com 200 mg.L-1
de ácido ascórbico ou 10 g.L
-1 de carvão ativado.
De acordo com o presente estudo, o uso de hipoclorito de cálcio nas concentrações
entre 0,5% a 2,0% se mostrou apropriado para a desinfestação de explantes de umbuzeiro, já
que foi verificado menos de 10% de perdas por contaminação. Este fato pode ser explicado
devido à condição fitossanitária das plantas doadoras de explante (desenvolvidas em casa de
vegetação), pois segundo Grattapaglia & Machado (1998), o estado fitossanitária da planta
matriz é importante para definir a facilidade em descontaminar o explante durante os
procedimentos de inoculação in vitro.
Contudo, estes resultados contrariam dos observados por Lemos (2008), que utilizando
variadas concentrações de hipoclorito de sódio a (0,5%; 1,0%; 1,5% e 2,0%) na desinfestação
de explantes nodais e apicais de umbuzeiro, verificou índices de contaminação entre 38% a
67% aos 30 dias de inoculação, respectivamente, nas concentrações de 1,5% e 0,5%, sendo
estes dados diferentes significativamente. Os resultados do presente ensaio também são
distintos dos verificados por Melo et al. (1997), que também trabalhando com explantes
nodais e apicais de umbuzeiro para micropropagação, observaram perdas de 49% de suas
inoculações, por contaminação, na primeira semana de experimento, utilizando solução de
ácool etílico (70% v/v) por 1 min e posterior imersão em solução de cloreto de mercúrio
(0,02% p/v) por 10 minutos.
No caso de outras Spondias, Silva et al. (2002), conseguiram cerca de 55% de
explantes caulinares de umbu-cajazeira, com 2 anos de idade e mantidas em viveiro, livres de
contaminações, tratando os mesmos com hipoclorito de sódio a 1% por até 20 min. Medeiros
(1999), obteve índices de 80% de contaminação trabalhando com segmentos nodais de cajá
62
(Spondias mombin L.) ,oriundos de plantas com 12 e 24 meses de idade, utilizando o
protocolo de desinfestação de álcool 70% por 1 min. + NaOCl 1% por 10 min.
Em relação a outras fruteiras, os resultados obtidos neste experimento, são
semelhantes aos observados por Chaves et al. (2004), que pesquisando sobre a desinfestação
de segmento nodal de pessegueiro (Prunus CV. Mr. S. 2/5), em variadas concentrações de
hipoclorito de cálcio e sódio (0,5%; 1,0%; 1,5% e 2,0%), verificaram contaminação em 3,75%
do total de explantes submetidos as variadas concentrações de NaOCl. Entretanto, em relação
à oxidação, os índices divergem deste mesmo autor, já que este observou taxas de 38,75%,
enquanto que no presente trabalho, as maiores taxas de oxidação foram de 28% utilizando
segmento internodal.
Soares et al. (2008),trabalhando com indução de calos em folhas e segmentos
caulinares de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), oriundos de casa de vegetação,
avaliou índices de contaminação inferiores a 10% para ambos explantes, submetidos a
desinfestação em hipoclorito de sódio nas concentrações entre 1,0% e 2,0% de cloro ativo por
15 minutos. No que se refere à taxa de sobrevivência, Chaves et al. (2004) observaram índices
de 61,25% de explantes de pessegueiro submetidos a diferentes concentrações de hipoclorito
de cálcio e de 96,25% em hipoclorito de sódio, sendo este ultimo resultado mais elevado do
que aos obtidos no presente ensaio. Contudo, Grattapaglia & Machado (1998) afirmam que o
hipoclorito de cálcio é menos tóxico aos tecidos vegetais do que o hipoclorito de sódio.
As taxas de sobrevivência obtidas no presente estudo ainda se assemelham aos de
Ribeiro et al. (2004), que obtiveram índices de 72,9% de sobrevivência de segmentos nodais
de cerejeira-do-rio-grande (Eugenia involucrata DC), cultivadas em casa de vegetação,
tratando-as com diferentes concentrações de hipoclorito de cálcio (2,5% e 5,0%). Entretanto,
estes autores observaram taxa de sobrevivência de 87,3% tratando os mesmos explantes com
hipoclorito de sódio.
63
Conclusões
De acordo com resultados expostos, pode-se concluir o seguinte:
- As concentrações entre 0,5% e 2,0% de hipoclorito de cálcio foram eficazes para
reduzir a contaminação por patógenos exógenos em ápices caulinares de umbuzeiro
cultivados in vitro.
- Em segmentos caulinares nodais e internodais, as concentrações de 1,5% e 2,0% de
hipoclorito de cálcio foram eficientes em controlar o percentual de perdas por contaminação
nestes explantes.
- Não houve significância entre as concentrações de hipoclorito de cálcio sobre a
oxidação dos explantes de umbuzeiro cultivados in vitro.
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67
Artigo 3
TÍTULO
A micropropagação in vitro do umbuzeiro em diferentes concentrações de 6-
benzilaminopurina
AUTORES
Simone Cassiano de Lima, Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa, Emerson de Medeiros Sousa,
Bruno Sousa da Silva e Gabriela do Nascimento Oliveira.
REVISTA
Pesquisa Agropecuária Brasileira
SITUAÇÃO
Submetido
68
Efeito de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina sobre a micropropagação in
vitro de umbuzeiro
Resumo - O umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda), pertencente ao gênero Spondias da
família Anacardiaceae, é uma árvore frutífera tropical da região Nordeste brasileira que vem
se consolidando no mercado da agroindústria de processamento. A micropropagação do
umbuzeiro a partir de técnicas de cultura de tecidos in vitro é bastante promissora, pois em
laboratório, pode-se obter em larga escala plantas sadias e geneticamente uniformes em menor
tempo e espaço quando comparados com métodos de propagação convencionais. Desta forma,
a presente pesquisa teve como objetivo estabelecer protocolos de propagação in vitro de
plantas de umbuzeiro a partir de segmentos nodais e internodais. Assim, estes tipos de
explantes, oriundos de mudas com dois meses de idade e crescidas em casa de vegetação da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, após desinfestação, foram inoculados em meio
nutritivo WPM suplementado com variadas concentrações de BAP 0,0 mg.L-1
; 0,1 mg.L-1
; 0,5
mg.L-1
e 1,0 mg.L-1
. Para cada tratamento, utilizou-se 10 unidades amostrais com três
repetições. Após 30 dias foi observado que o meio de cultura suplementado com 0,1 mg.L-1
de BAP favoreceu o melhor desenvolvimento de brotos múltiplos por explante. Entretanto
não se obteve sucesso com a formação de brotos a partir do segmento internodal, do qual 76%
destes explantes originaram calos.
Termos para indexação: Regulador de crescimento, Spondias tuberosa, Brotos múltiplos,
Segmento caulinar nodal, Segmento caulinar internodal.
69
The micropropagation in vitro of brazilian-plum on diferents concentrations of 6-
Benzylaminopurine
Abstract - The brazilian-plum (Spondias tuberosa Arr.) is belonging to Spondias genus,
Anacardeaceae family, it is a very required specie for familial agriculture program for being
easily handled native species, where besides its fruit selling in nature, we can take advantage
of its processed products. The micropropagation of this specie using tissue culture techiniques
is promising process, since in laboratory, we can get in large scale healthy plants, genetically
uniform in less time, comparing with others conventional methods of propagation. In this
way, this study had the objective to establish protocols for in vitro propagation of brazilian-
plum plants using nodals and internodals segments removed from plants of two months age
developed in Green house condition. The disinfecting explants have been inoculatedon WPM
medium supplemented with different concentration of BAP 0.0 mg.L-1
, 0.1 mg.L-1
, 0.5 mg.L-1
e 1.0 mg.L-1
. We have used 10 experimental units for every treatments and three repetitions.
According whit our results, we have observe that thirty days after experiments initial, that 0.1
mg.L-1
of Benzylaminopurine has favored the best development of multiple shoots per
explant. However, we don’t get success regarding shoots formation when using internodal
segments as explants, from which 76% have originated callus.
Index terms: Growth regulator, Spondias tuberosa, Multiple shots, Nodal segments,
Internodal segments.
Introdução
O umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda), pertencente ao gênero Spondias da família
Anacardiaceae, é uma árvore frutífera endêmica do Nordeste brasileiro (Mendes, 2001).
Apresentando uma alta resistência a seca (xerofita), de um único indivíduo pode-se extrair
70
aproximadamente 300 kg de umbu por ano (Guerra, 1981) do qual esse fruto, saboroso e rico
em nutrientes, é utilizado na alimentação de muitas famílias rurais e de animais (Mendes,
2001).
O umbuzeiro também é muito requisitado nos programas de agricultura familiar por se
tratar de uma espécie nativa e de fácil manejo, onde além da venda do fruto in natura pode-se
lucrar com os produtos resultantes de seu processamento (Cavalcanti, 1999, 2000). Deste
modo, a produção de mudas de umbuzeiro, para a implantação de pomares comerciais, seria
uma alternativa para o desenvolvimento de comunidades rurais, além de se disponibilizar
espécies para trabalhos de recuperação de áreas degradadas.
A propagação do umbuzeiro ocorre naturalmente por sementes, porém estas
apresentam desuniformidade na germinação e dormência (Neves & Carvalho, 2005). Por
outro lado, a propagação de forma vegetativa possibilita a produção de mudas com
características desejáveis, uniformizando-se assim a produção (Lederman et. al., 1991).
Assim, a cultura de tecidos se apresenta como um método alternativo e promissor na
propagação de umbuzeiro, pois em laboratório, a partir da aplicação de eficientes protocolos,
se podem obter elevadas taxas de multiplicação de plantas em menor tempo e espaço físico
com garantias fitossanitárias, durante o cultivo in vitro (Higashi et al., 2002), quando
comparados com métodos de propagação convencionais. Segundo Lima et al. (2000), a
micropropagação do umbuzeiro, ainda em fase preliminar de estudos, pode ser uma opção a
propagação.
Grande parte das espécies vegetais micropropagadas é obtida a partir da regeneração
de brotos axilares, do qual brotos múltiplos podem se desenvolver de um único explante, a
partir da interação entre as substâncias de crescimento que ocorrem naturalmente na planta e
os análogos sintéticos (reguladores de crescimento), os quais são adicionados ao meio de
cultura mais adequado para cada tipo de planta (George, 1996).
71
Contudo, as plantas lenhosas apresentam maiores dificuldades para o estabelecimento
devido à alta produção de etileno pelos explantes e seu acúmulo nos recipientes de cultura,
levando a oxidação fenólica e conseqüente morte do tecido (Pasqual, 2001). Buscando-se
contornar esta situação, o meio de cultura WPM foi desenvolvido como opção ao meio mais
usual o MS (Pasqual, 2001).
Apesar da pouca informação a respeito do uso de técnica de cultura de tecidos para
espécies tropicais, a multiplicação de brotos é um método seguro que pode ser usado quando a
produção de clones de plantas lenhosas for necessária (Einset, 1986) como, por exemplo, para
programas de reflorestamento e plantação comercial. A partir destas técnicas também se
podem conservar recursos genéticos (germoplasma) in vitro além de se reduzir os riscos de
perdas de acessos devido a intempéries ambientais, vandalismo e praga e doenças.
Estudos sobre a micropropagação do umbuzeiro são recentes e incipientes para a
definição de um protocolo ideal de obtenção de inúmeros brotos. Provavelmente, Oliveira et
al. (1989) foram os primeiros a tentarem o cultivo in vitro de umbuzeiro no Brasil, que
utilizando gemas apical, axilar e folhas para cultivo em meio MS, conseguiram os melhores
resultados de brotações com segmento nodal e ápice caulinar em meio MS suplementado com
4,6µM de cinetina. Atualmente, a publicação de artigos científicos sobre cultura de tecidos de
umbuzeiro é quase inexistente, como também ocorre com outras espécies do gênero Spondias.
Deste modo, visando contribuir com conhecimentos científicos sobre a produção de
plantas de umbuzeiro, a partir dos métodos de micropropagação, esta pesquisa teve como
objetivo avaliar o desempenho de dois tipos de explantes: segmento nodal e internodal,
cultivados em meio WPM suplementado com diferentes concentrações de BAP na taxa de
multiplicação de brotos.
72
Material e Métodos
Este ensaio foi conduzido no laboratório de Biotecnologia Vegetal do Departamento
de Botânica, Ecologia e Zoologia (DBEZ) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
utilizando-se como explantes segmentos nodais e internodais de mudas de umbuzeiro com
dois meses de desenvolvimento, cultivados em casa de vegetação a partir de sementes, dessa
mesma instituição.
A fim de se obter brotos múltiplos, segmentos nodais e internodais de mudas de
umbuzeiro, cultivadas em casa de vegetação a temperatura ambiente entre 30° a 35° C e sob
regime diário de irrigação (100 ml de água corrente), passaram inicialmente por tratamento
superficial de desinfestação em câmara de fluxo laminar, seguindo-se o protocolo: 1 minuto
de imersão em álcool 70%, 10 minutos em Ca(OCl2) na concentração de 1,5% e três banhos
em água destilada e autoclavada por 10 minutos cada. Posteriormente, os explantes foram
inoculados em frascos (125 mm x 60 mm) contendo 30 ml de meio de cultura WPM não
modificado, pH ajustado a 5,6 e suplementado com 30 g de sacarose, 9 g de agar produzido
pela empresa VETEC, 150 mg de PVP e diferentes concentrações de BAP (0,0 mg.L-1
; 0,1
mg.L-1
; 0,5 mg.L-1
e 1,0 mg.L-1
. Os frascos de cultura, contendo explante de 1 cm de
comprimento, foram mantidos em sala de cultura com condições controladas de temperatura
(26 ± 2 °C), fotoperíodo (16 horas) e umidade relativa próxima a 76%. Para cada tratamento e
tipo de explante foram utilizadas 10 unidades amostrais com três repetições.
As taxas de brotações obtidas após 30 dias do início do experimento bem como,
percentagem de oxidação, calos e contaminação, foram submetidas à análise de variância e a
comparação de médias, entre os tratamentos, foi realizada pelo teste de Tukey ao nível de
probabilidade de 5%.
73
Resultados e Discussões
Com relação ao segmento nodal, a partir do oitavo dia de cultivo foi observado o
escurecimento nas extremidades deste tipo de tecido. Ao fim do trigésimo dia, verificou-se
oxidação fenólica em 17,32% do total de explantes utilizados neste experimento independente
da concentração de BAP. Segundo Modgil et al. (1999), a oxidação fenólica é um dos fatores
que podem comprometer inicialmente o estabelecimento do explante no cultivo in vitro,
afetando principalmente espécies lenhosas, pois seus tecidos possuem maior quantidade de
compostos fenólicos.
Observou-se a formação de brotos em segmentos nodais a partir do décimo quarto dia
do início do cultivo. Com base na análise de variância, no que se refere à indução de respostas
morfogenéticas nos segmentos nodais em diferentes concentrações de BAP, foi verificado que
o tratamento contendo0,1 mg.L-1
de BAP foi significativamente diferente e o mais eficaz
comparando-o aos tratamentos 0,0 mg.L-1
e 1,0 mg.L-1
de BAP (Tabela 1). O tratamento com
0,5 mg.L-1
de BAP se confirmou estatisticamente igual a todos os tratamentos utilizados neste
experimento (Tabela 1).
Em relação à taxa de indução de brotos nos segmentos nodais de umbuzeiro, não
houve diferenças estatísticas entre os tratamentos com as variadas concentrações de BAP
(Figura 1). No entanto, verificou-se redução no percentual de regeneração de brotos nos
explantes submetidos à maior concentração do fitorregulador no meio de cultura.
Constatou-se o desenvolvimento de calos friáveis na base dos segmentos nodais
superior a 60% do total de explantes utilizados em cada tratamento. A influência das
diferentes concentrações de BAP na indução da calogênese foi considerada estatisticamente
igual pelo teste de Tukey (Tabela 1). Boggetti et al. (1999), pesquisando sobre a
morfogênense de caju (Anacardium occidentaale L.), observaram a formação de calos em
explantes cultivados em meio nutritivo com 20 µM de BAP. Entretanto, Soares et al. (2008),
74
não observaram a presença de calos em explantes caulinares de mangabeira cultivados em
meio WPM e suplementado com variadas concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0 e 3,0 mg.L-1
).
Os brotos obtidos no decorrer de quatro semanas, independente do tratamento,
apresentaram comprimento médio inferior a 3 cm (Figura 2A), sendo necessário o posterior
subcultivo dos mesmos em meios de cultura que favorecessem o alongamento. Porém, aos 50
dias de cultivo, os segmentos nodais apresentaram altos índices de oxidação fenólica, sendo
observado o escurecimento destes explantes e abscisão foliar das brotações em 72% do total
de explantes utilizados, independente da concentração do fitorregulador, o que impediu a
continuidade dos experimentos.
Nos segmentos internodais, quanto à indução de respostas morfogenéticas, os resultados da
Tabela 2, demonstram que não se obteve sucesso utilizando-se este explante, pois não houve o
desenvolvimento de um único broto, sendo este fato explicado pela ausência de gemas neste
tipo de tecido (Grattapaglia & Machado, 1998). No caso deste explante, a taxa média de
oxidação fenólica foi de 14,12%, se observando o menor índice no tratamento com 0,5 mg.L-1
de BAP (Tabela 2).
Observou-se também diferença significativa entre os tratamentos na indução de calos
(Tabela 2). Na concentração com 0,1 mg.L-1
de BAP, ocorreu à formação de calos em 90% do
total de segmentos internodais (Figura 2B), sendo superior a testemunha. Deste modo, o
segmento internodal de umbuzeiro não é recomendado em pesquisas de micropropagação,
porém ele é uma importante fonte de tecido em trabalhos que envolvam indução de calos e de
variabilidade genética, visando a seleção de alguma característica de interesse, sendo este tipo
de explante inoculados em meio WPM preferencialmente suplementados com 0,1 mg.L-1
de
BAP.
O protocolo de desinfestação utilizado pode ser considerado satisfatório, pois a taxa de
contaminação observada em ambos os explantes, segmentos nodal e internodal, foi inferior a
75
10% do total de explantes inoculados, independente do tratamento com as diferentes
concentrações do fitorregulador. Melo et al. (1997), realizando este mesmo tipo de pesquisa
com o umbuzeiro, observou 49% de perdas por contaminação aos 15 dias do início do cultivo
de ápices e segmentos nodais em meio MS, utilizando em seus procedimentos de
esterilização solução de álcool etílico (70% v/v) por 1 min e cloreto de mercúrio (0,02% p/v)
por 10 minutos.
Os resultados obtidos nesta pesquisa de indução de brotos adventícios, a partir de
segmentos nodais de umbuzeiro, foram semelhantes aos verificados por Lemos (2008), que
analisando a influência de diferentes concentrações de BAP na regeneração de brotos em
segmentos nodais de umbuzeiro, extraídos de plantas com 12 anos de idade, conseguiu
índices de 1,32 e 1,74 brotos por explante em meio WPM suplementados com BAP, nas
concentrações de 0,1 mg.L-1
e 0,5 mg.L-1
respectivamente. Já Melo et al. (1997), trabalhando
com esta mesma espécie vegetal, conseguiram índices de 2,2 brotos por segmento nodal
inoculados em meio de cultura MS semi-sólido, com nível de 0,1 mg.L-1
de BAP. Acredita-se
que a diferença na quantidade de brotações obtidas por este autor em relação ao presente
trabalho, seja justificada pelo genótipo das plantas utilizadas como fonte de explante.
Avanços em pesquisas nesta área com outras anacardiáceas vêm demonstrando um
aumento no interesse sobre estas espécies nativas de crescente valor comercial, como no caso
da cajazeira (Spondias mombin L.), no qual Carvalho et al., (2002), realizando experimentos
de micropropagação com segmento nodal, obtiveram índices de 5 a 6 brotos por explante
inoculado em meio WPM, suplementado com variadas combinações de BAP (0.0; 0.22; 0.44;
2.22 e 4.44 µM) e ANA (0.0; 0.27 e 2.70 µM). Em explantes de caju inoculados em meio de
cultura para a indução de brotações Das et al. (1996), verificaram a formação de 10-12 brotos
por explante em meio MS com 4,4 µM de BAP, 2,32 µM de cinetina e 9,12 µM de zeatina.
Mneney & Mantell (2002), também verificaram que o fitorregulador BAP promoveu a melhor
76
proliferação de brotos axilares em explantes de caju com aproximadamente 70% de brotos
sendo multiplicados. O resultado destes últimos autores em relação à taxa de indução de
brotações em explantes de cajueiro é semelhante ao obtido neste presente ensaio, já que foi
constatado um percentual de indução de brotação em segmento nodal de umbuzeiro de
76,66% submetido a 0,1 mg.L-1
de BAP.
Entretanto, em algumas espécies dessa mesma família, como exemplo do umbuzeiro,
ainda é necessário maiores pesquisas para o desenvolvimento de um protocolo ideal de
obtenção de brotos múltiplos in vitro, como nos casos observados por Andrade et al. (2000),
que trabalhando com Aroeira do Sertão (Myracrodruon urundeuva), constataram a
regeneração de apenas um broto por segmento nodal, utilizando o meio MS suplementado
com 2,3µM e 4,5µM de BAP e por Paiva (2007), que obteve 2 brotos por segmento nodal de
aroeira da praia (Schinus terebinthifolius Raddi.) em meio MS suplementado com 2,25 µM e
4,5 µM de BAP.
Conclusões
A partir dos resultados expostos, podemos concluir que:
1- Segmentos nodais de umbuzeiros apresentam potencial organogenético em meio WPM
suplementado com BAP;
2- As concentrações de 0,1 e 0,5 mg.L-1
de BAP induzem uma boa formação de brotações
adventícias em segmentos nodais de umbuzeiro;
3- Segmentos internodais de umbuzeiro não apresentam resposta para micropropagação por
organogênese;
4- Uma taxa de 90% de indução de calos em segmentos internodais de umbuzeiro é obtida em
meio WPM suplementado com 0,1 mg.L-1
de BAP.
77
Agradecimentos
À EMBRAPA Semi-Árido (Petrolina) na pessoa de Nilton de Brito Cavalcanti, pesquisador
dessa mesma instituição, pela atenção e orientação no manejo da cultura do umbuzeiro e
disponibilização de sementes dessa fruteira para a realização desse estudo e ao Banco do
Nordeste, pelo apoio financeiro.
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81
Tabela 1. Média de brotos por segmento nodal de umbuzeiro, porcentagem de oxidação e
calogênese em função diferentes concentrações de BAP e taxa de contaminação, após 30 dias
de cultivo in vitro.
BAP mg.L-1
Número de
brotos por
explante
Oxidação (%) Calos (%) Contaminação
(%)
0,0
0,7 a(*)
16 a
(*) 66 a
(*) 13,3 a
(*)
0,1
1,6 b
13,3 a 63 a 3,33 a
0,5
1,1ab
20 a 72 a 10 a
1,0 0,6 a 20 a 66 a 6,66 a
Média 1 17,32 66,75 8,32
CV (%) 45 18,93 5,65 51,56
(*) Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Tabela 2. Média de brotos por segmento internodal de umbuzeiro, porcentagem de oxidação e
calogênese em função diferentes concentrações de BAP e taxa de contaminação, após 30 dias
de cultivo in vitro.
BAP mg.L-1
Número de
brotos por
explante
Oxidação (%) Calos (%) Contaminação
(%)
0,0
0 a(*)
23,3 b (*)
63,3 a(*)
6,66 a(*)
0,1
0 a 13,3 ab 90 b 10 a
0,5
0 a 3,3 a 76,6 ab 6,66 a
1,0 0 a 16,6 ab 76,6 ab 13,3 a
Média 0 14,12 76,62 9,15
CV (%) 0 59 14,22 34,75
(*) Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
82
Figura 1. Taxa de indução de brotos em segmentos nodais de Umbuzeiros cultivados em
meio de cultura WPM e suplementados com diferentes concentrações de BAP.
Médias seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste
de Tukey ao nível de 5%.
Figura 2A e 2B. Aspecto do segmento nodal (A) e internodal (B) de umbuzeiro, após 30 e 90
dias, respectivamente, inoculados em meio WPM com 0,1 mg.L-1
de BAP.
Foto: Simone Cassiano de Lima. Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia (DBEZ)
/UFRN.
Broto Calo
B A
CAPÍTULO 3
84
DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS FUTURAS
A cultura de tecidos permite a produção de novas plantas a partir da manipulação de
células, órgão e tecidos vegetais em laboratório, devido à competência morfogenética desse
material (Mantovani & Franco, 1998), originando plantas com grande potencial agronômico,
livres de patógenos e em grandes quantidades (Grattapaglia &Machado, 1998). Assim, essas
técnicas se configuram como uma alternativa a propagação convencional de mudas,
principalmente daquelas espécies que apresentam dormência em suas sementes e/ou
limitações durante a multiplicação vegetativa.
O umbuzeiro (Spondias tuberosa, ARR.), apesar de sua importância ecológica e
social, pouco se tem pesquisado sobre a aplicação das técnicas de cultura de tecidos para a
propagação desta espécie, se considerando as escassas publicações científicas a respeito desse
tema. Nesse trabalho, foi verificado que as sementes de umbuzeiro apresentam germinação
precoce e uniforme, quando se aplica a técnica de corte em bisel como método de quebra de
dormência, comparando-as com as testemunhas. Esse fato foi relatado por Campos (1986),
que constatou que o tegumento da semente de umbuzeiro atua como fator limitante,
promovendo resistência mecânica à expansão do embrião e que um corte em bisel, na porção
distal da semente, seria suficiente para reverter essa situação. Também se observou que
sementes de umbuzeiro com quatro meses de armazenagem estavam aptas a germinar,
contrariando com as pesquisas de Souza et al. (2005), do qual obtiveram melhores índices de
germinação com sementes de umbuzeiro com 8 meses de armazenamento.
Em testes preliminares de desinfestação de explantes de umbuzeiro, se constatou que
as concentrações de hipoclorito de cálcio entre 0,5% e 2,0% foram suficientes para combater
a contaminação em trabalhos de cultura de tecidos in vitro que envolvam a utilização de
ápices. Já para o segmento nodal e segmento internodal, as concentrações de hipoclorito de
cálcio ideais foram, respectivamente entre, 1,0% e 2,0% e 1,5% e 2,0%. Neste tipo de
pesquisa, é importante que se adote um protocolo eficiente de desinfestasção para se evitar
perdas por contaminação na fase inicial de estabelecimento, bem como se escolha plantas
matrizes com qualidade fitossanitária a serem doadoras de explantes sadios (Grattapaglia
&Machado, 1998).
Neste estudo, também se obteve resultados satisfatórios de micropropagação de
umbuzeiro a partir da inoculação de segmentos nodais, preferencialmente em meio de cultura
WPM (1980) suplementado com 0,1 mg.L-1
e 0,5 mg.L-1
de BAP. Entretanto, este protocolo
pode ser aprimorado em futuras pesquisas testando-se diferentes concentrações deste
85
fitorregulador, outros tipos de citocininas e combinações com outras auxinas a fim de se obter
um maior número possível de brotações, como os observados por Carvalho et al., (2002), que
obtiveram de 5 a 6 brotos por segmento nodal de cajá utilizando meio WPM suplementado
com variadas combinações de BAP e ANA, em trabalhos de micropropagação.
Entretanto, diversas pesquisas podem ser realizadas para o aprimoramento das técnicas
de cultura de tecidos em relação ao umbuzeiro, otimizando assim a sua propagação, como a
utilização de diferentes antioxidantes (PVP, ácido ascórbico, carvão ativo, cisteína entre
outros) em distintas concentrações, a fim de diminuir as perdas de explantes por oxidações
fenólicas durante o período de incubação.
Outras técnicas importantes para o futuro sucesso da propagação massal de brotos,
desta espécie, são os estabelecimentos de protocolos de enraizamento e aclimatação. Para o
primeiro estudo, pode se reduzir as concentrações de sais do meio de cultura e também,
utilizar variadas concentrações de fitorreguladores do grupo das auxinas, como o AIB e ANA,
em associação com bactérias estimuladoras de enraizamento do gênero Rhizobium.
Para o segundo estudo, pode-se reduzir gradativamente de modo controlado, com o auxílio de
aspersores, a umidade relativa do ar, até que a plântula obtida em laboratório se torne
adaptada do ambiente in vitro para o ex vitro, com desenvolvimento pleno de seu
metabolismo e estruturas anatômicas.
Pesquisas relacionadas à embriogênese, variabilidade e transformações genéticas
podem ser realizadas a partir da indução de calos em explantes de umbuzeiro, sendo estes
preferencialmente mantidos em meio de cultura acrescidos de diferentes concentrações de
ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) e combinações entre ANA e BAP.
Atualmente, experimentos para promover enraizamento de brotos formados em etapas
anteriores neste trabalho e para redução de oxidação dos explantes de umbuzeiro no meio de
cultura, estão sendo conduzidos no Laboratório de Biotecnologia Vegetal.
86
CONCLUSÕES
1- A germinação de sementes de umbuzeiro pode ocorrer de modo uniforme e antecipado a
partir do uso da técnica de corte em bisel, por superar a dormência da mesma. O tratamento de
imersão das sementes em água + húmus por 12 horas não foi eficiente para incrementar as
taxas de germinação bem como a velocidade de germinação.
2- O estabelecimento asséptico de explante apical de umbuzeiro pode ser obtido com a
utilização de solução de hipoclorito de cálcio entre 0,5% e 2%. Já para os explantes
caulinares, segmento nodal e internodal, as concentrações de hipoclorito de cálcio entre 1,0%
e 2,0% e 1,5% e 2,0% foram respectivamente, eficientes para se combater a contaminação por
patógenos exógenos.
3- O cultivo de segmentos nodais de umbuzeiro em meio de cultura WPM suplementado com
as concentrações de 0,1 e 0,5 mg.L-1
de BAP induzem a formação de brotações adventícias
em trabalhos de micropropagação.
4- Não é possível regenerar brotos de segmentos internodais de umbuzeiro por
micropropagação, pois estes não apresentam competência de se desenvolverem por
organogênese direta.
5- Os segmentos internodais são tecidos apropriados para a obtenção de calos, principalmente
quando os mesmos são inoculados em meio WPM suplementado com 0,1 mg.L-1
de BAP.
87
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