Genômica funcional de fungos de importância médica, ambiental e

biotecnológica

Nalu T. A. PeresLaboratório de Genética e Biologia Molecular de Fungos

Profa. Dra. Nilce M. Martinez RossiDepartamento de Genética – FMRP-USP

FungosFungos

• Organismos eucariotos, uni ou pluricelulares,

apresentam parede celular (quitina);

• Morfologicamente diversos (macro e microscópicos);

• Cogumelos, leveduras e filamentosos (bolores);

• Heterotróficos - nutrição por absorção -

secreção de uma ampla variedade de enzimas

digestivas que clivam macromoléculas;

• Saprófitos - absorvem os nutrientes da matéria morta;

• Mutualistas - associação benéfica com outros organismos;

• Patógenos - absorvem os nutrientes do tecido hospedeiro (infecções em

plantas e animais).

Fungos – importância biológicaFungos – importância biológica

CogumelosAlimentação:

LevedurasFilamentosos:

Penicillium roqueforti

Saúde pública: aumento na incidência de infecções fúngicas, devido ao elevado número de individuos imunocomprometidos.

Economia: fitopatógenos

Ambiental: decomposição de matéria orgânica.

Interesse biotecnológicoInteresse biotecnológicoDescoberta da penicilina (Alexander Flemim, 1928)

LevedurasLeveduras• Produção de antibióticos, enzimas, biocombustíveis; • Excelentes hospedeiros para expressão heteróloga de proteínas (interesse farmacêutico, industrial, ambiental);• Organismos modelo para estudo de biologia celular, regulação de expressão gênica, etc.

Saccharomyces cerevisiaePichia pastoris

Candida albicans

• Patógenos humanos, em pacientes imunocomprometidos e saudáveis – infecções de cutâneas, subcutâneas, disseminadas e invasivas (candidíases, meningite criptococócica). Cryptococcus

neoformans

Fungos filamentososFungos filamentosos

Aspergillus Penicillium

Paracoccidioides brasiliensis Histoplasma capsulatum

Fungos Dimórficos

Morfologia dos fungos filamentososMorfologia dos fungos filamentosos

• Micélio – composto por filamentos

tubulares individuais, denominados hifas.

• Hifas septadas ou cenocíticas. A presença

de poros nos septos permite a circulação

de organelas citosólicas e moléculas entre

as células.

•Algumas espécies produzem esporos sexuais, e

o micélio é então organizado em uma estrutura

denominada corpo de frutificação.

Fungos – estruturas e formas de reproduçãoFungos – estruturas e formas de reproduçãoEsporangióforo

Conidióforo

Asco

Reprodução – fungo modelo Aspergillus nidulansReprodução – fungo modelo Aspergillus nidulans

Experimentos de genética clássica em A. nidulansExperimentos de genética clássica em A. nidulans

Cruzamento de linhagens complementares

Grupos de ligação: linhagem Master apresenta marcadores genéticos cromossomo-específicos (auxotrofias e resistência a drogas).

Identificação de genes de resistência em A. nidulansIdentificação de genes de resistência em A. nidulans

O fungo patogênico Trichophyton rubrumO fungo patogênico Trichophyton rubrum

Fungo imperfeito (deuteromiceto): ciclo sexual não descrito.

• Genes envolvidos na patogenicidade,• Resistência e resposta a agentes antifúngicos,• Adaptação ao ambiente – mudanças no pH.

Genômica funcional – Knock out gênicoGenômica funcional – Knock out gênicoPapel do gene TruMDR2 (transportador ABC) na suscetibilidade a drogas (Fachin et. al., 2006, J. Med. Microbiol. 55:1093) e na patogenicidade de T. rubrum (Maranhão et. al., 2009, J. Med. Microbiol. 58:163).

WT TruMDR2

WT

Genômica funcional – Knock out gênicoGenômica funcional – Knock out gênico

WT WTPacC PacC

PacC

SGA + HigromicinaSGA

Ensaio de patogenicidade in vitro: Infecção ex vivo de unha

Ligação de adaptadores

ao cDNA teste

Hibridação

PCR com oligos específicos

para os adaptadores

Genômica funcional – análise da expressão gênicaGenômica funcional – análise da expressão gênica

Bibliotecas de subtração

Genômica funcional – análise da expressão gênicaGenômica funcional – análise da expressão gênica

Modulação do pH ambiente

Genes expressos em pH ácido

Genômica funcional – análise da expressão gênicaGenômica funcional – análise da expressão gênica

Genes expressos em pH alcalino

Genômica funcional – análise da expressão gênicaGenômica funcional – análise da expressão gênica

Genômica funcional – análise da expressão gênicaGenômica funcional – análise da expressão gênica

BMC Microbiology (in press)

Genômica funcional – análise da expressão gênicaGenômica funcional – análise da expressão gênica

Identificação de genes envolvidos na infecção ex vivo de pele humana

Subtilisina protease 5

Laboratório de Genética e Biologia Molecular de Fungos (FMRP):

Profa. Dra. Nilce M. Martinez RossiJeny Cursino SantosFernando SegatoFernanda MaranhãoFernanda Paião Henrique SilveiraJuliana Falcão Luciene CoelhoRodrigo CazzanigaTiagoGabriela FelixMendelson MazucatoRoseli de A. FerreiraPablo R. SanchesMarcos

Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Fungos (FMRP):

Prof. Dr. Antonio Rossi FilhoDiana GrasEmiliana SilvaErnna Oliveira Janaina F. SilvaJuliana LealVivian CiprianoNiegeGlauce

Nosso grupo!Nosso grupo!

Obrigada!Obrigada!