genÔmica de intera ÇÕes planta -pat Ógenoarquivo.ufv.br/dbg/genmelhor/index_apresentação...

GENÔMICA DE INTERAGENÔMICA DE INTERAÇÇÕESÕESPLANTAPLANTA--PATPATÓÓGENOGENO

Departamento de FitopatologiaLaboratório de Genômica/

Núcleo de Biotecnologia Aplicada a AgropecuáriaUniversidade Federal de Viçosa

[email protected]

Sérgio H. Brommonschenkel

TiposTipos dede ResistênciaResistência dede PlantasPlantas a Doena Doenççasas

�� 1. Resistência de planta não1. Resistência de planta não--hospedeirahospedeira

�� 2. Resistência de planta hospedeira2. Resistência de planta hospedeira

2.1 Resistência 2.1 Resistência poligênica (Quantitativa)poligênica (Quantitativa)

2.2 Resistência 2.2 Resistência monogênica (Qualitativa)monogênica (Qualitativa)

-- RaRaçças (as (““quebra da resistênciaquebra da resistência””))

-- DurabilidadeDurabilidade

S0 immune S0HR S1 S2 S3

Junghans et al., 2003

r r R R

A Engenharia GenA Engenharia Genéética do Melhoramento Vegetaltica do Melhoramento Vegetal

SS RR

Genes de Genes de patogenicidadepatogenicidade

Gene de Gene de avirulênciaavirulência

ResistênciaResistência

RR

DoenDoenççaaGenes de Genes de patogenicidadepatogenicidade

Gene de Gene de avirulênciaavirulência

DoenDoenççaa DoenDoenççaaGenes de Genes de

patogenicidadepatogenicidadeGenes de Genes de

patogenicidadepatogenicidadeRR rr

AvrAvr RRxx AvrAvr rrxx

avravr RRxx avravr rrxx

TeoriaTeoria genegene--aa--gene (gene (FlorFlor, 1956), 1956)

PatPatóógenogeno avirulentoavirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira PatPatóógenogeno virulentovirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira

PatPatóógenogeno virulentovirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira PatPatóógenogeno virulentovirulento PlantaPlanta hospedeirahospedeira

rr

PatPatóógenogeno

ElicitoresElicitores

Síntese de proteínas PR

Percepção de sinais

transdução

Morte celular:HR

• Fortalecimento da PC• Metabólitos 2os

• Proteínas PR• thioninas

fluxo de íons,ROS, fosforilação

Sinalização

Defesas Primárias(rápidas)

Defesas Locais(rápidas/intermed.)

Defesas Sistêmicas(intermediária)

Ativação altamente específica, resposta de amplo espectro

0

5

10

15

20

25

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35

40

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50

0h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

Genes R

SISTEMA-MODELO

Tomateiro x Tospovírus

Tospovirus

Bunyaviridae

Tomato spotted wilt virus - TSWVChrysanthemum stem necrosis virus - CSNVGroundnut ringspot virus - GRSVTomato chlorotic spot virus- TCSV

Ciclo de Infecção dos Tospovírus

Vira-cabeça do Tomateiro

Santa Clara

sw-5//sw-5

Suscetível

Sw99-1

Sw-5//Sw-5

Resistente

ContenContençção da infecão da infecçção sistêmica ão sistêmica em plantas com o geneem plantas com o gene SwSw--55

Reação de hipersensibilidade - HR

Apoptose

Credit: Nicolle Rager Fuller, National Science Foundation InIníício, meio e fimcio, meio e fim

OO genegene SwSw--55

• Originário da espécie selvagem de tomateiro Lycopersicon peruvianum

• Confere resistência à diferentes espécies de tospovírus(TSWV, CSNV, GRSV, TCSV)

telômerotelômero

Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 9

SwSwSwSwSwSwSwSw--------55555555CT220 CT220

GP39 GP39

TG18 TG18

TG9 TG9

CT143 CT143

TG223A TG223A

CT32 CT32

CP44 CP44 CD32A CD32A

TG568 TG568

CD3, CD3, Tm2aTm2a

TG390 TG390 TG551 TG551 TG404 TG404 TG186 TG186 TG429 TG429 TG348 TG348 TG248 TG248 CT74 CT74 GP129 GP129 CT198 CT198 CT218 CT218

TG421 TG421

TG424 TG424

GP101, (CT96) GP101, (CT96)

TG328 TG328

CT71, CT71,

8.98.9

5.55.5

3.63.6

4.04.0

6.96.9

10.110.1

4.74.7

1.11.1

5.35.3

3.33.3

5.95.9

4.04.0

2.82.8

1.91.92.02.01.01.03.03.0

1.01.0

1.71.72.22.23.93.93.83.8

5.55.5

5.95.9

4.54.5

2.22.21.61.6

2.72.7

TG254TG254

centrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômerocentrômero

“Linkage-drag”

SwSwSwSwSwSwSwSw--------55555555CT220 CT220

TC34TC34

TC3TC3

TC87TC87

TC168TC168

TC91TC91

TC1TC1

TC2TC2

TC12TC12

TC16TC16

TC134TC134

TC55TC55

SwSw--55

CT220 CT220

**

“Chromosome walking”

S S+TC55 S+TC134

Fenótipo dos Transformantes

Efeito de dosagem e efeito de posição

2 cópias 1 cópia

1 MAENEIEEML EHLRRIKSGG DLDWLDILRI EELEMVLRVF RTFTKYHDVL LPDSLVELTK

61 RAKLTGEILH RVLGRIPHKC KTNLNLERLE SHLLEFFQGN TASLSHNYEL NDFDLSKYMD

121 CLENFLNDVL MMFLQKDRFF HSREQLAKHR SIKELKIVQK KIRFLKYIYA TEINGYVDYE

181 KQECLENRIQ FMTNTVGQYC LAVLDYVTEG KLNEENDNFS KPPYLLSLIV LVELEMKKIF

241 HGEVKASKFT QSKTFKDKKL PKGFSHHLHN LLMYLRNKKL ENFPNNIAAQ NIDVAIEFLL

301 VFLDADVSNH VINGNWLKKV LLKVGAIAGD ILYVIQKLLP RSINKDETSN ISLCSIQILE

361 KTKDLKAQVE TYYKSLKFTP SQFPTFGGLS FLNSLLRKLN EMSTSKSGLG FLMKPLLGNL

421 EKELSSLTSI LEKELSSIFR DVVHHEHNIP KDLQRRTINL SYEAEVAIDS ILAQYNAFLH

481 IFCSLPTIVK EIKQINAEVT EMWSADIPLN PHYVAAPLKH LPDRHSNLVT DEEVVGFENK

541 AEELIDYLIR GTNELDVVPI VGMGGQGKTT IARKLYNNDI IVSRFDVRAW CIISQTYNRR

601 ELLQDIFSQV TGSDDNGATV DVLADMLRRK LMGKRYLIVL DDMWDCMVWD DLRLSFPDDG

661 IRSRIVVTTR LEEVGKQVKY HTDPYSLPFL TTEESCQLLQ KKVFQKEDCP PELQDVSQAV

721 AEKCKGLPLV VVLVAGIIKK RKMEESWWNE VKDALFDYLD SEFEEYSLAT MQLSFDNLPH

781 CLKPCLLYMG MFSEDARIPA STLISLWIAE GFVENTESGR LMEEEAEGYL MDLISSNLVM

841 LSKRTYKGRV KYCQVHDVVH HFCLEKSREA KFMLAVKGQY IHFQPSDWKG TRVSFSFSEE

901 LSKFASLVSK TQKPFHQHLR SLITTNRAKS INDIFSCQIS ELRLLKVLDL SSYIVEFLSL

961 ATFKPLNQLK YLAVQAFEFY FDPGSHLPHI ETFIVMNLPY YDILLPVSFW EMKKLRHAHF

1021 GKAEFDKQGL SEGSSKLENL RILKNIVGFD RVDVLSRRCP NLQQLQITYF GNNEEPFCPK

1081 LENLTQLQQL QLSFARPRTL SGLQLPSNLN KLVLEGIHIE SVIPFIAGLP SLEYLQLQDV

1141 CFPQSEEWCL GDITFHKLKL LKLVKLNISR WDVSEESFPL LETLVIKKCI DLEEIPLSFA

1201 DIPTLEQIKL IGSWKVSLED SAVRMKEEIK DTEGCDRLHL VKQRSD

NN CCNBSNBS LRRLRRCCCC

TIRTIR NBNB

CCCC NBNB

KIN

KIN

CCCC

N, L

Sw-5, Mi

Xa-21

Pto

Cf-9

CC

NBS

LRR

LRR

CC

NBS

LRRNBSCC

HRHRGuardian ModelVan der Biezen & Jones, 1998

Reconhecimento

Mudança de status da capacidadede ligar a nucleotídeos

Ativação

MR S

EcoRI

R S

DraI

R S

EcoRV

R S

BstNI

R S

HaeIII

O gene estO gene estáá presente em plantas R e presente em plantas R e SS

Brommonschenkel et al., 2000

SwSw--55 Resistance Gene Analogs (RGAs)Resistance Gene Analogs (RGAs)

4,4 Kb

R S

Análise de Expressão

O gene O gene éé expresso emexpresso em plantas R e S. plantas R e S. QualQual aa basebase molecular damolecular da

especificidade da resistência ?especificidade da resistência ?

84SW-5-ORF

84sw-5-ORF

MAENEIEEMLEHLRRIKSGGDLDWLDILRIEELEMVLRVFRTFTKYHDVLLPDSLVELTKRAKLTGEILHRVLGRIPHKCKTNL

MAENEIEEMLEHLRRIKSGGDLDWFDILRIGELEMVLRVFRTFTKYHDVLLPDSLVKLTKMAKLTGEILHRVLGRIPHKCKTNL

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1008SW-5-ORF

1007sw-5-ORF

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1092SW-5-ORF

1091sw-5-ORF

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FWEMKKLRHAHFGKAEFDKQGLSEGSSKLENLRILKNVIQFDRVDVLSRRCPNLQQLQITYFGNNEEPFCPKLENLTQLQQLQL

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1246SW-5-ORF

1245sw-5-ORF

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transdução

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Sinalização




swsw--55


transdução

Morte celular:HR




Sinalização




SwSw--55

Qual a Utilidade da InformaQual a Utilidade da Informaçção Gerada?ão Gerada?

• Transferência do gene para outros gêneros deplantas

• Estudos de conservação das vias de transdução de sinais

• Exploração da variabilidade alélica do gene Sw-5


transdução

Morte celular:HR




Sinalização




SwSw--55

???

Necessidade de conservaNecessidade de conservaçção das vias deão das vias detransdutransduççãoão de sinaisde sinais

Expressão heteróloga do gene Sw-5

Gama de hospedeiros: 82 famílias >800 espécies

NicotianaNicotiana

benthamianabenthamiana

SolanumSolanum

melongenamelongena

Lactuca sativaLactuca sativa ((AsteraceaeAsteraceae))

- ausência de resistência- gene transcrito (RT-PCR)

ConservaConservaçção das vias de ão das vias de transdutransduçção ão de sinaisde sinais

Tomateiro>berinjela>Tomateiro>berinjela>NicotianaNicotiana sppspp.>alface, .>alface, arabidopsisarabidopsis

Explorando a biodiversidade.......

L. esculentum L. hirsutum

L. peruvianumL. chilense

Resistência a tospovírus em acessos de Lycopersicon peruvianum e L. chilense

Espécie Acesso Reação

L. chilense LA 2753 ResistenteL. chilense LA 1969 Suscetível L. chilense LA 130 Resistente

L. peruvianum PI 126928 ResistenteL. peruvianum PI 126444 ResistenteL. peruvianum LA 126944 ResistenteL. peruvianum LA 444/1 ResistenteL. peruvianum LA 371 Resistente

L. peruvianum

Fenótipo da Resistência a Tospovírus em Acessos Selvagens

ObtenObtençção de hão de hííbridos interespecbridos interespecííficosficosatravatravéés do cultivo s do cultivo in in vitrovitro de semente imaturade semente imatura

Introgressão de novos genes de resistência a tospovírus no tomateiro cultivado através de cruzamentos interespecíficos

ACESSOSEMENTES

PLAQUEADASPLANTASOBTIDAS

L. chilense LA 130 1915 5 0

L. chilense LA 2753 1990 4 0

L. peruvianum LA 371 1747 4 2L. peruvianum LA 444/1 969 34 11L. peruvianum PI 126944-6 603 1 1L. peruvianum PI 126944-12 142 1 0

L. peruvianum PI 126444 3600 2 0

ESPÉCIE HÍBRIDOSRESISTENTES

L. esculentum Híbrido L. chilense L. esculentum Híbrido L. peruvianum

L. esculentum Híbrido L. peruvianumL. esculentum Híbrido L. peruvianum

Análise de co-segregação da resistência a tospovírusderivada de LA 371 com o loco Sw-5

Marcador CAPs COS134RF localizado a aproximadamente 12 Kb do loco Sw-5

“O gene que confere resistência a tospovírus em LA 371 é alelo do loco Sw-5 ou de

um loco proximamente ligado”

Herança da resistência a tospovírus encontrada no acesso LA 371 de L. peruvianum

“A resistência encontrada em LA 371 é de amplo espectro,

monogênica e dominante”

ISOLADONO DE PLANTAS

R S

VALORP

77 25 3:1 0,013 0,90

54 13 3:1 1,119 0,29

50 17 3:1 0,004 0,94

89 31 3:1 0,044 0,82

AL (GRSV)

V1-3 (TCSV)

CUBIO (GRSV)

BR01 (TSWV)

χχχχ2PROPORÇÃOESPERADA (%)

270 86 3:1 0,13 0,71TOTAL

Amplificação de seqüências homólogas a Sw-5 por meio de PCR

Kb

Acessos de L. peruvianum

resistentes a tospovírus

1958B 19Sma

Homólogos Sw-5

ORFATG5’

Região 3’não traduzida

TGAPromotor

3’

4,1 Kb

LA

371

LA

444

/1

1269

444-

6PCR

Amplificação de duas sequências homólogas

Kb A B B B A B A B B A B B B A B

vetor

Confirmação da clonagem mediante digestão enzimática com EcoRI

LA 371

SW99-1

Moneymaker

LA 444/1

LA 2753

1269444-6

126944

126444

Kb

Pro

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to d

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1100 pb

Pro

du

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m R

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AnAnáálise da lise da cosegregacosegregaççãoão dos homdos homóólogos logos clonadosclonados com a resistência conferida por LA371com a resistência conferida por LA371

Kb371 RR rr rr rr Rr Rr RR RR RrMM

Homólogo 1

Homólogo 2

Homólogo 2PI 125944-6 14344

Homólogo 1LA 444/1 24024

Homólogo 2LA 444/1

02424

Homólogo 1LA 371

808

Homólogo 2LA 371

022

SuscetívelResistenteTotal de

Plantas R0 Inoculadas

Planta Inoculada

Análise funcional em tabaco das seqüências homólogas ao gene Sw-5 clonadas por meio de PCR

Loco 2 Loco 1

Alelo 2 Alelo 1

Algumas ConsideraAlgumas Consideraçções....ões....

•• Melhoramento visando resistência a doenMelhoramento visando resistência a doençças=as=melhoramento da capacidade de reconhecimento melhoramento da capacidade de reconhecimento de molde molééculas produzidas pelo patculas produzidas pelo patóógeno durante o geno durante o processo infeccioso;processo infeccioso;

•• Expressão heterExpressão heteróóloga de genes R possloga de genes R possíível, porvel, poréémmde amplitude limitada;de amplitude limitada;

•• Possibiblidade de explorar a diversidade alPossibiblidade de explorar a diversidade aléélica.lica.

Buchanan et al. Biochemistry and Molecular Biology of Plants

DIATCHENKO, L., LAU, Y.F.C., CAMPBELL, A.P., et al.. PNAS, v.93, p.6025-6030, 1996.

Driver

SUPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION

abcd

e

Tester adap.1 Tester adap.2R

1ª Hibridização

2ª Hibridização

Adição de driverabcd

Amplificação por PCR Clonagem Seq.

Lesões com anéis concêntricos em folíolos de tomate.

Podridão do fruto na região peduncular e anéis concêntricos na

lesão.

Cancro da haste. Podridão basal.

Pinta preta – Alternaria solani

Tomateiro x Alternaria solani

- resistência do tipo quantitativa

- dificuldade no melhoramento

- resistência afetada pela idade

fisiológica dos tecidos

GRUPO CLONE POSSÍVEL GENE VALOR e

- Proteínas PRs D09-07 Gluthathione S-transferase (PR-1) 6e-53 E06-07 Beta-1,3 glucanase (PR-2) 9e-34

C10-11 Quitinase (PR-3) 2e-52 B04-11 Osmotina (PR-5) 3e-23

F08-06 PR-6 1e-39

B06-06 STH-2 3e-51

F11-07 STH-21 7e-14

- Fatores de A09-07 ERF1 (resposta a etileno) 0.0 Transcrição F10-07 PTI5 (ativação de proteínas PR) 6e-15

G12-09 Proteína de ligação a CREB 5e-07

D03-08 WRKY11 1e-11 E03-09 WRKY38 5e-05

- Sinalização G11-09 Adenilato cinase 2e-23

B09-08 Calmodulina dependente de cálcio 1e-18

B07-11 Diacilglicerol 4e-04

C09-10 Ras-GTP e-177 D06-08 Serina/treonina cinase 0.0

- Metabolismo D10-11 Ascorbato peroxidase 0.0

Oxidativo B03-06 Catalase 2e-28

D11-10 Malato desidrogenase 4e-80

- Tolerância a C11-07 ARG2(choque térmico) 4e-15

Estresses C01-07 NT-SA1 (tolerância a salinidade) e-153

D03-06 Win2(feimento) 3e-31

Alguns genes identificados, NCEBR-2, Biblioteca 36 hai

0

10

20

30

40

50

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

2

4

6

8

10

12

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

20

40

60

80

100

120

140

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

4

8

12

16

20

24

28

32

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

2

4

6

8

10

12

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0h 6h 12h 24h 36h 48h 60h

Controle

Inoculado

Substrato(?)

MAPKKK(S)

Interação gene-a-gene

Elicitores raça não-específicos

Estressesabióticos

Receptores Sensores

Substrato P

WRKYW-Box Genes de Defesa

MEK2

SIPK

Ativação dos genes WRKY

Outros sinais

R

Tomateiro x Meloidogyne incognita

Células gigantes

Classe e-value Similaridade

Ciclo celular 3,E-63 cell cycle control crn (crooked neck) protein-like [Arabidopsis thaliana] 2,E-45 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein [A. thaliana]

Citoesqueleto 3,E-66 MFP1 attachment factor 1 [Lycopersicon esculentum]

Fator de transcrição e-108 D13F(MYBST1) protein - potato

Fisiologia/Água 4,E-74 aquaporin 1 [Nicotiana tabacum]

1,E-61 acid invertase [Citrus unshiu]

Metabolismo geral 3,E-73 peptide transport protein homolog 3,E-45 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase [L. esculentum]

2,E-32 acid phosphatase [A. thaliana]

Nodulina 7,E-45 putative MtN19 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]

Outros 2,E-50 feebly-like protein [A. thaliana]

7,E-24 tuber-induction protein [Solanum tuberosum]

4,E-72 caffeoyl-CoA O-methyltransferase - common tobacco Parece celular 2,E-09 cellulose synthase-2 [Zea mays]

2,E-62 pectin methylesterase isoform alpha [Vigna radiata]

Resposta a ABA 7,E-26 ABA-responsive protein [A. thaliana]

Resposta a auxinas 1,E-26 auxin-resistance protein AXR1 [A. thaliana] ubiquitin-activating enzyme E1

7,E-67 chitinase class II; pathogenesis-related protein, PR-3 type [Sambucus nigra] Resposta de defesa 2,E-63 Peroxidase

1,E-20 phenylalanine ammonia-lyase [A. thaliana]

Stress 5,E-48 potassium transporter HAK3p [Mesembryanthemum crystallinum]

Stress/Metabolismo geral 1,E-49 heat shock protein 90 [L. esculentum] Stress/Transdução de sinais 2,E-95 calcium dependent protein kinase

Tráfico de membranas 2,E-46 27k vesicle-associated membrane protein-associated protein [N. plumbaginifolia] 3,E-45 secretory carrier membrane protein [O. sativa] Transdução de sinais 8,E-58 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase [A. thaliana]

4,E-66 receptor protein kinase [A. thaliana]

Opperman et. al. (1994) Science 263:221-223

Elene Yamazaki Lau (DS, CAPES)Klaus K. Scheuermann (DS, FAPEMIG)Cynthia de Melo Rocha (MS, CAPES)Dagoberto B. Oliveira (DS, CNPq)Bruno Lima Soares (ITI, CNPq)Gustavo A. Guimarães (IC, MS, CNPq)Janaína de Oliveira Melo (ITI, CNPq)J. Thadeu R. Castro Silva (SIF)Lúcio Mauro Guimarães (MS, DS, CNPq)

Prof. Eduardo S. Mizubuti (DFP, UFV)Prof. F. Murilo Zerbini Júnior (DFP,UFV)Prof. Leandro G. De Freitas (DFP, UFV)Prof. Ivan Maia (UNESP-Botucatu)Prof. Wagner Campos Otoni (UFV, DBV)

EMBRAPA/PRODETAB (PROJETO DEFESOMA)

AGRADECIMENTOS

OBRIGADO PELA ATENÇÃO!

genÔmica de intera ÇÕes planta -pat Ógenoarquivo.ufv.br/dbg/genmelhor/index_apresentação...

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