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CROMATOGRAFIA GASOSACROMATOGRAFIA GASOSA
Instituto de Química Instituto de Química -- UnicampUnicampCaixa Postal 6154 Caixa Postal 6154 -- 1308413084--971 Campinas SP971 Campinas SP
�� [email protected]@iqm.unicamp.br
Fabio AugustoFabio Augusto
©© Fabio Augusto (IQ Fabio Augusto (IQ -- Unicamp), 2005 Unicamp), 2005 -- 20102010
CROMATOGRAFIA GASOSAAplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por GC ?
Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
(para uma substãncia qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás)
DE FORMA GERAL:GC é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS
DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.© Fabio Augusto (IQ - Unicamp), 2005 - 2010
O Cromatógrafo a Gás
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1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão 4 - Detector2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador)
Observação: em vermelho: temperatura controlada
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INSTRUMENTAÇÃOGás de Arraste
Fase Móvel em GC: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DEGÁS DE ARRASTEARRASTE
Requisitos:
INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
oxida / hidroliza algumas FE
incompatíveis com DCEH2O, O2
hidrocarbonetos ruído no sinal de FID
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CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:
He , H2DCT
FID N2 , H2
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4
CUSTO
PUREZA
A
B
C
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
INSTRUMENTAÇÃOGás de Arraste
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INSTRUMENTAÇÃOAlimentação de Gás de Arraste
Componentes necessários à linha de gás:
controladores de vazão / pressão de gás
dispositivos para purificação de gás (“traps”)
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1 - Cilindro de Gás 2 - Regulador de Pressão Primário3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)
Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre
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INSTRUMENTAÇÃOMicrosseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µµµµL, 5 µµµµL e 10 µµµµL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microseringa
de 10 µµµµ L:
Microseringa de 1 µµµµ L (seção ampliada):
corpo
guia
êmbolo (fio de aço soldado ao guia)
agulha
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INSTRUMENTAÇÃODispositivos de Injeção de Amostra
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
t = 0
t = x
Injeção lenta:
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INSTRUMENTAÇÃOParâmetros de Injeção
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra
COLUNAAmostrasGasosas
AmostrasLíquidas
empacotada∅ = 3,2 mm (1/4”) 0,1 ml ... 50 mL0,2 µL ... 20 µL
capilar∅ = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 µL ... 3 µL
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado einjeta-se a solução
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INSTRUMENTAÇÃOInjetor “on-column” Convencional
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1 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica
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INSTRUMENTAÇÃOInjeção “on-column” de líquidos
1 - Ponta da agulha da microseringa é
introduzida no início da coluna
2 - Amostra injetada e vaporizada
instantâneamente no início da coluna.
3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás
de arraste a fluir pela coluna.
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COLUNAS CAPILARESInjetor com Divisão (Split Injector)
Permite introdução de ~nL de amostras fluidas com microseringas convencionais de 1 - 10 µµµµL
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1 Corpo aquecido do injetor
2 Controle de vazão total de gás de arraste
4 Misturador (liner) de vidro
3 Septo de silicone
5 Válvula solenóide diversora (no modo split)
7 Manômetro (pressão na cabeça da coluna)
6 Controle de vazão da purga do septo
9 Coluna capilar
8 Controle de pressão na cabeça da coluna
COLUNAS CAPILARESInjetor com Divisão (Split Injector)
No modo split, o fluxo total de gás de arraste é dividido
em três componentes:
FtotalVazão total de entrada
FseptoVazão de purga do septo
FpurgaVazão de purga do injetor
FcolVazão da coluna
Ftotal
Fsepto
Fpurga
Fcol
Agulha de microseringa contendo amostra líquida / gasosa
introduzida no injetor através do septo - ponta da agulha deve penetrar no recheio do liner
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COLUNAS CAPILARESInjeção com Divisão (Split Injector)
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Amostra é injetada no recheio do liner, onde se vaporiza
instantaneamente (?) e se dilue homogeneamente (?) no gás de arraste que passa pelo liner
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COLUNAS CAPILARESInjeção com Divisão (Split Injector)
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COLUNAS CAPILARESInjeção com Divisão (Split Injector)
A amostra vaporizada e diluída no gás de arraste emerge do liner
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COLUNAS CAPILARESInjeção com Divisão (Split Injector)
O plugue de vapor de amostra diluído no gás de arraste se divide
entre os dois fluxos de saída: parte do material entra na coluna e parte vai para a purga do injetor,
sendo desprezado
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COLUNAS CAPILARESInjeção com Divisão: Razão de Divisão
A quantidade de amostra introduzida na coluna depende do volume injetado e da razão de divisão (fração da amostra não descartada):
( )
+=
col
colpurga
F
FFSR :1
SR Razão de Divisão
Fpurga Vazão da Purga do Injetor
Fcol Vazão na Coluna
( )
+
=11
111451
.
.:SR SR = 1 : 133Fcol = 1.1 mL min-1
Fpurga = 145 mL min-1EXEMPLO
Se Vinj = 0.5 µL, o volume de amostra introduzido na coluna é (0.5/133) = 0.0038 µL = 38 nL !!!
VALORES ADMISSÍVEIS TÍPICOS PARA RAZÕES DE DIVISÃO
Colunas convencionais (dc = 0.25 - 0.32 mm): 1:50 ... 1:500
Colunas de diâmetro alto (dc = 0.53 mm) ou filmes espessos de FE: 1:5 ... 1:50
Colunas para Fast GC (dC = 0.10 - 0.05 mm): até 1:1000© Fabio Augusto (IQ - Unicamp), 2005 - 2010
Operação e otimização de parâmetros operacionais relativamente simples.☺☺☺☺Espécies em concentração reduzida na amostra podem não ser detectadas, já que as quantidades efetivamente cromatografadas são reduzidas.
Exatidão e precisão piores que as de outras técnicas de injeção;para análise quantitativa é mandatório o uso de padronização interna.
����
Apesar de suas deficiências, provavelmente ainda é a técnica de injeção mais popular em Cromatografia Gasosa de Alta Eficiência
É quase mandatória quando a maior parte dos constituintes presentes na mistura deve ser detectada (óleos essenciais, materiais
petroquímicos, screening de amostras ambientais, etc.)
COLUNAS CAPILARESInjeção com Divisão: Prós e Contras
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INSTRUMENTAÇÃOColunas: Definições Básicas
EMPACOTADA∅∅∅∅ = 3 a 6 mmL = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas
do recheio)
CAPILAR∅∅∅∅ = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
Paredes internas recober-tas com um filme fino (fra-ção de µµµµm) de FE líquida ou sólida
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INSTRUMENTAÇÃOTemperatura da Coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR
(p0).
p0 = f
Estrutura químicado analito
Temperatura da coluna
Temperaturada
coluna
Pressãode
vapor
Velocidadede
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)
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INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:
- Componentes mais voláteis são separados
- Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis não são separados
- Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
A temperatura do forno pode ser variada
linearmente durante a separação:
Consegue-se boa separação dos
componentes da amostra em menor tempo
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Parâmetros de programação:
TINI Temperatura Inicial
TFIM Temperatura Final
tINI Tempo Isotérmico Inicial
tFIM Tempo Final do Programa
R Velocidade de AquecimentoTEMPO
TE
MP
ER
AT
UR
A
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
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INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE
A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidade vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida
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COLUNAS CAPILARESDefinições Básicas
Tubo fino de material inerte com FE líquida ou sólida depositada sobre as paredes internas
MATERIALDO
TUBO
ø = 0,1 mma 0,5 mm
L = 5 ma 100 m
sílica fundidavidro pirexaço inoxNylon
Silcosteel
Colunas de sílica são revestidas externamente com camada de poliimida para aumentar resistência mecânica e química
Capilaresx
Empacotadas:CAPILARES
���� L = ���� N Colunas mais eficientes
FC = 1 ... 10 mL.min-1 Controle de vazão mais difícil
���� Vi Dispositivos especiais de injeção
Famílias de Colunas Capilares
PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas
SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas com material de recheio similar ao das empacotadas
WCOT (Wall coated open tube) FE liquida depositada (ligada // entrecruzada) sobre as paredes internas.
FASES ESTACIONÁRIASConceitos Gerais
LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: sólidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)
SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar)
Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:
Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente
ligadas entre si
Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas são “presas” ao suporte por
ligações químicas
SUPORTESólido inerte poroso
Tubo capilar de material inerte
FElíquida
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FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principais: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, AT-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)
CH2 CH2OH OH
n
Estrutura Química:
ACETATOS (© Alltech)Coluna: AT-Wax (30 m x 0,32 mm x 1,00 µµµµm)TCOL: 5 min a 40
oC→→→→ 10oC. min-1 →→→→ 180oCGás de Arraste: He @ 1,6 mL.min-1
Detector: FID Amostra: 0,5 µµµµL sol. CS2 / SR = 1:50
1 - C2 2 - t-C4 3 - C3 2 - s-C45 - C2 acril. 6 - i-C4 5 - C4 8 - i-C5
9 - C5 10 - 2-etoxietil
PIRIDINAS E ANILINAS (© Alltech)Coluna: AT-Wax (30 m x 0,53 mm x 1,20 µµµµm)
TCOL: 40oC→→→→ 10oC. min-1 →→→→ 200oC
Gás de Arraste: He @ 20 mL.min-1
Detector: FID
1 - Py 2 - 2-MePy 3 - 4-MePy 4 - DMBA5 - NNDMA 6 - anilina 7 - o-MeAn 8 - 2,6DMA
9 - 2,4DMA 10 - 3,5DMA
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FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
SILICONES (polisiloxanas) As FE mais empregadas em GC. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades químicas diversas.
Si
CH3
H3C
CH3
O Si
R1
R2
O Si
CH3
CH3
CH3n
R1, R2 = qualquerradical orgânico
- Ligação Si-O extremamente estável = elevada estabilidade térmica e química das FE.
- Silicones são fabricados em larga escala para diversas aplicações = minimização de custo do produto + tecnologia de produção e purificação largamente estudada e conhecida.
- Praticamente qualquer radical orgânico ou inorgânico pode ser ligado à cadeia polimérica = FE “ajustáveis” a separações específicas
- Facilidade de imobilização por entrecruzamento e ligação química a suportes© Fabio Augusto (IQ - Unicamp), 2005 - 2010
COLUNAS CAPILARESDiâmetro Interno
dC = 0,10 mm
dC = 0,25 mm
Aumento no diâmetro da coluna causa alargamento de pico e diminuição da retenção
= MENOR EFICIÊNCIA
= MENOR RESOLUÇÃO
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COLUNAS CAPILARESEspessura do filme de FE
���� df = ���� Eficiência
mas também
���� df = ���� Retenção
���� df = ���� Seletividade
df = 0,25 µµµµm
df = 0,50 µµµµm
df = 1,00 µµµµm
© SGE Australia © Fabio Augusto (IQ - Unicamp), 2005 - 2010
COLUNAS CAPILARESComprimento da Coluna
© SGE Australia
L = 15 m
L = 30 m
L = 60 m
���� L = ���� Tempo de Análise
porém
���� L = ���� Seletividade
���� L = ���� Resolução
���� L = ���� Número de pratos
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COLUNAS CAPILARESFast GC: Colunas Capilares Finas
Necessário controle acurado de vazão (controle eletrônico de pressão) e altas velocidades de aquecimento da coluna
Óleo Essencial de Limão
Separação Convencional: Coluna DB-5 (60 m x 0,25 mm x 0,25 µµµµm); Gás de Arraste: He @ 25 cm/s;
Forno: 8 min @ 75°C →→→→ 4°C/min →→→→5 min @ 200°C; Vinj = 1 µµµµL (SR =
1/150)
Separação Rápida: Coluna DB-5 (20 m x 0,10 mm x 0,10 µµµµm); Gás de Arraste: H2 @ 60 cm/s; Forno: 3
min @ 40°C →→→→ 30°C/min →→→→ 3 min @ 185°C; Vinj = 1 µµµµL (SR = 1/275)
© Agilent
DETECTORESDefinições Gerais
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluida de um analito
FID FIDDetector porIonização em
Chama
EM MSDetector Es-
pectrométrico de Massas
DCT TCDDetector porCondutividade
Térmica
DCE ECDDetector porCaptura deEletrons
~ 60 detectores já usados em GC
~ 15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
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DETECTORESClassificação
UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquersubstância eluida.
SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química.
ESPECÍFICOS: Detectam substâncias quepossuam determinado elemento ou grupo estrutural
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INSTRUMENTAÇÃODetectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD) Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (FID OU FID) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
REGISTRODE
SINAL
ANALÓGICORegistradores XY
DIGITALIntegradoresComputadores
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DETECTORESDetector por Ionização em Chama
PRINCÍPIO Formação de íons quando um analito é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio
O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 +
O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica.
Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima
são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica
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DETECTORESCaracterísticas Operacionais do FID
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD típicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg)
SELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura.(como virtualmente todas as substâncias analizáveis por GC são orgânicas, na prática o FID é UNIVERSAL)
Compostos que NÃO geram resposta no FID:
Gases nobres
H2, O2, N2
CO, CO2, CS2
CCl4, peralogenados
NH3, NxOy
SiX4 (X = halogênio)
H2O
HCOOH, HCHO *
FID
TCD
N2
CH4
CO2
O2
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DETECTORESCaracterísticas Operacionais do FID
FATORES DE RESPOSTA O fator de resposta de um composto é aproximadamente proporcional ao número átomos de carbono. Presença de heteroelementos diminui o fator de resposta.
Número Efetivo de Carbonos (NEC)Prevê com ~20% de aproximação o fator
de resposta de um composto.
Átomo X
C alifático +1,00C aromático +1,00C olefiníco +0,95C carbonila +0,00
O álcool prim. -0,60Cl alifático -0,12
(X = Contribuição de cada átomo ao NEC)
C2H6 →→→→ NEC = 2,00
C2H5OH →→→→ NEC = 1,40
CH3CHO →→→→ NEC = 1,00
Mistura com quantidades equimolares de:
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DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho
QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído
SINAL (S)
RUÍDO (N)
= 3S
NRUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra
Fontesde
Ruído
Contaminantes nos gases
Impurezas acumuladas no detector
Aterramento elétrico deficiente
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DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho
LIMITE DE DETEÇÃO Quantidade de analito que gera um pico com S/N = 3 e wb = 1 unidade de tempo
Mesmo detector, nível de ruído e massa de analito MAS
diferentes larguras de base:
wb
QMD = fDetector (sinal gerado, ruído)
Largura do pico cromatográfico
Definindo limite de detecção como:
LD é independente da eficiência do sistema cromatográfico !
[QMD] =massa
(ng, pg ...)
[LD] = massa / tempo(ng.s-1, pg.s-1 ...)
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DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho
SENSIBILIDADE Relação entre o incremento de área do pico e o incremento de massa do analito
Na ausência de erros determinados:
A = área do pico cromatográfico
m = massa do analito
MASSA
ÁREA Fator de Resposta, S:
inclinação da reta Área do pico x Massa do
analito
o mesmo incremento de massa causa um maior incremento de área
Sensibilidade
S
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ANÁLISE QUALITATIVAConceitos Gerais
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Fontes de Informações Qualitativas
RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação
DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas
Identificação individual das espécies contidas na amostra
Determinação da identidade da amostra propriamente dita
Aplicações Qualitativas
de GC
Para análise qualitativa confiável por GC é recomendável combinação de dados provenientes de pelo menos duas fontes
ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção
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t’R = fInterações analito / FE
Pressão de vapor do analito
Condições operacionais (TCOL, FC ...)
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado doanalito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito
ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção
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Identificação por t’R é muito pouco confiável:
Dependência com FC e TCOL Variações nestas condições afetam os t’R
VARIAÇÃO DE ±±±±
1% NO t’R
∆∆∆∆TCOL = ±±±± 0,1%
∆∆∆∆FC = ±±±± 1%
Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa eluida deforma o pico e altera o seu t’R
MASSA
Saturação da coluna cromatográfica com aumento de massa
eluida provoca “cauda frontal” no pico
ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção
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Comparação de t’R usando dopagem (“spiking”) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificação.
Amostra complexa: incerteza nos t’Rmedidos pode levar a identificação
errônea
Comparação com cromatograma da amostra dopada permite identificação
mais confiável do desconhecido
ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts
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O índice de retenção de Kovàts I para um analito é definido por:
t’R (A) Tempo de retenção ajustado do analito A
t’R (N) Tempo de retenção ajustado do n-alcano com N carbonos
t’R (n) Tempo de retenção ajustado do n-alcano com n carbonos (n = N + 1)
Ex.: um analito com I = 874 teria um tempo de retenção ajustado equivalente ao de um n-alcano hipotético com cadeia de 8,74 átomos de carbono
Interpolação
logarítmica dos t’R