fundamentos de biologia molecular - apostila

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

Fundamentos de Biologia Molecular

Autores:

Profa. Dra. Carmen Veríssima Ferreira (UNICAMP) Profa. Dra. Fernanda Ramos Gadelha (UNICAMP) Prof. Dr. Alexandre D. Martins Cavagis (UFSCAR)

Ms. Daisy Machado Dr. Antonio Hernandes Chaves-Neto

- Campinas (SP) - 2010

Fundamentos de Biologia Molecular 2

BIOLOGIA MOLECULAR

Biologia molecular é a área de conhecimento que estuda diversos aspectos

da função do material genético (genoma) e seus produtos de expressão, as

proteínas. Na Disciplina Fundamentos de Biologia Molecular serão abordadas todas

as etapas da informação gênica, além das aplicações da biologia molecular em

diversos aspectos na área de saúde e finalmente, como alterações no fluxo da

informação gênica podem causar patologias como câncer.

O genoma caracteriza-se por toda a informação hereditária de um organismo

que está codificada em seu DNA (ou, em alguns vírus, no RNA). Isto inclui tanto os

genes como as sequências não-codificadoras (Figura 1 ). No ser humano o genoma

é constituído de 23 cromossomos diferentes. O genoma é transmitido, com

variações individuais, de geração em geração e determina a espécie do ser vivo.

Desta forma, as doenças hereditárias também estão definidas no genoma. No caso

específico dos humanos, a metade do genoma que se herda provém do pai e a outra

metade, da mãe. No contexto químico, o genoma é definido pela seqüência de

desoxiribonucleotídeos na molécula do ácido desoxiribonucléico (DNA).

Figura 1. Representação simplificada de um cromosso mo. O cromossomo é constituído de duas cromátides, cada uma contendo uma dupla fita de ácido desoxiribonucléico. No cromossomo existem seqüências codificantes e não codificantes (como por exemplo, os íntrons)


ÁCIDOS NUCLEICOS

A elucidação da estrutura tridimensional de proteínas, de ácidos nucleicos e

outras biomoléculas bem como a elucidação do fluxo de informação do gene à

proteína, o esclarecimento das vias metabólicas centrais e dos mecanismos de

conversão de energia, tem contribuído muito, nos últimos anos, para a nossa

compreensão da base molecular da vida. Nesta disciplina abordaremos como

organismos tão diferentes quanto à bactéria Escherichia coli e os seres humanos

utilizam os mesmos blocos de construção para fabricar macromoléculas.

As proteínas, diferentemente das outras macromoléculas lipídeos e

polissacarídeos, não são sintetizadas através da ligação pura e simples de seus

monômeros constituintes, os aminoácidos. No caso das proteínas, os aminoácidos

são ligados uns aos outros obedecendo a uma ordem, cuja informação está contida

em uma outra classe de macromoléculas denominadas ácidos nucleicos (DNA e

RNA).

A informação genética para sintetizar uma proteína com uma sequência

correta de aminoácidos está contida no DNA, através da sequência correta de seus

monômeros, os desoxirribonucleotídeos. Esta informação genética ou gênica é

passada de uma geração para outra, através de um processo denominado

replicação. Esta informação passa do DNA para o RNA através de um processo

denominado transcrição. Finalmente, a informação contida no RNA, através da

sequência de seus nucleotídeos constituintes é passada para a proteína, em um

processo denominado tradução, que é a própria síntese protéica (Figura 2).


Figura 2. Fluxo da informação gênica . O gene é transcrito dando origem a um

RNA primário, o qual para ter sua função biológica necessita sobre modificações

pós-transcrição se tornando maduro (funcional). Em seguida, o RNAm se translocará

para os ribossomos e será traduzido pela maquinaria responsável pela síntese

protéica. Alguns proteínas após serem sintetizadas já se encontram na forma ativa,

outras necessitam sofrer modificações pós-tradução para poderem exercer a função

biológica.

Transcrito primário

RNAm

Proteína inativa

Proteína ativa

TRANSCRIÇÃO

MODIFICAÇÃO PÓS-TRANSCRIÇÃO

MODIFICAÇÃO PÓS-TRADUÇÃO

TRADUÇÃO


Para se entender melhor todos estes processos, devemos conhecer um

pouco sobre os constituintes dos ácidos nucleicos, os desoxirribonucleotídeos e os

ribonucleotídeos, monômeros constituintes de DNA e de RNA, respectivamente.

I. ESTRUTURA E SÍNTESE DO DNA

Os ácidos nucleicos são requeridos para o armazenamento e expressão da

informação genética. Existem dois tipos quimicamente distintos de ácidos nucleicos:

DNA (ácido desoxirribonucléico) e o RNA (ácido ribonucléico).

O DNA está presente não somente nos cromossomos no núcleo dos

organismos eucarióticos, mas também na mitocôndria e nos cloroplastos de

vegetais. As células procarióticas, que não possuem núcleo, possuem um

cromossomo único, mas também podem conter DNA não-cromossômico em forma

de plasmídeo. O DNA é responsável pela codificação das informações, sendo capaz

não somente de replicar-se precisamente cada vez em que a célula se divide, como

também fazer com que a informação que contém seja expressa seletivamente.

O RNA participa na expressão da informação genética armazenada no DNA.

O RNA difere do DNA por apresentar uma molécula polimérica simples de

mononucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster. O DNA é consideravelmente

maior que o RNA e contém o açúcar desoxirribose em vez de ribose e a base

nitrogenada timina em vez de uracil.

O DNA é um polidesoxirribonucleotídeo constituído de

monodesoxirribonucleotídeos covalentemente unidos por ligações 3’,5’-fosfodiéster

(o grupo 5’-hidroxila da desoxipentose de um nucleotídeo liga-se ao grupo 3’-

hidroxila da desoxipentose de outro nucleotídeo através de um grupo fosfato), e as

bases nitrogenadas localizadas junto ao esqueleto de desoxirribose-fosfato, são por

convenção, escrita em sequência do 5’-terminal da cadeia ao 3’-terminal (Figura 3 ).


Ligação de hidrogênio entre as bases nitrogenadas

Figura 3: A Cadeia de DNA dupla fita, com a seqüência de nucleotídeos mostrada

sendo escrita na direção 5’-3’. Uma ligação 3’-5’ fosfodiéster é destacada. As bases

A e T estão ligadas por duas pontes de H, e as bases C e G, por tres pontes de H.

Observar que o terminal 5’ encontra-se fosforilado e o terminal 3’ possui um

grupamento hidroxila (OH) livre.

C 5’

C 3’

C 5’

C 3’

Ligação fosfodiéster

3’

5’

3’

5’


Com exceção de uns poucos vírus que contêm DNA de fita simples, o DNA

existe como uma molécula de fita dupla, formando uma dupla hélice. Na dupla

hélice, as duas cadeias são dobradas em torno de um eixo comum, sendo pareadas

de modo antiparalelo – isto é, o 5’-terminal de uma fita é pareado com o 3’-terminal

de outra fita. As bases de uma fita são pareadas de acordo com as bases da

segunda fita, de modo que uma Adenina (A) é sempre pareada com a Timina (T),

enquanto a Citosina (C) é sempre pareada com a Guanina (G). Assim, uma cadeia

polinucleotídica da dupla hélice de DNA é sempre o complemento da outra (Figura

4).

Figura 4: Dupla Hélice do DNA. A dupla hélice do DNA é mantida por interações fracas tais como: pareamento das bases por ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações iônicas e interações de Van der Waals. Outro ponto que pode ser observado é que as fitas sempre estarão na forma antiparalelas e são complementares (G e C; A eT).


Desnaturação de DNA - Efeito hipercrômico

O DNA pode ser desnaturado pela adição de ácidos, bases, remoção de

Mg2+, ou pelo calor. Na desnaturação do DNA pelo calor, as duas fitas se separam,

no entanto, caso haja resfriamento, as duas fitas podem voltar a se parear (processo

chamado de renaturação) (Figura 5A ).

A desnaturação de uma molécula de DNA pela temperatura pode ser

acompanhada por um parâmetro denominado por temperatura de fusão (Tm), que

corresponde a ponto de equivalência na curva de fusão do DNA (gráfico de A260 em

função da temperatura), a absorbância a 260 nm (A260) também aumenta, mostrando

um perfil semelhante ao de uma curva de titulação ácido-base. Este comportamento

consiste no chamado efeito hipercrômico, onde a A260 do DNA dupla fita nativo é

menor que a soma das A260 dos nucleotídeos constituintes, devido às interações

(van der Waals e hidrofóbicas) entre as bases empilhadas no DNA desnaturado,

promovendo nuvens eletrônicas distintas das existentes no DNA nativo (Figura 5B ).

Devido aos diferentes conteúdos dos DNAs temos diferentes valores de

temperaturas de fusão. Assim, por exemplo, a Tm de um DNA viral pode ser maior

que a Tm de um DNA de bactérias. Como a desnaturação do DNA consiste na

abertura das duas fitas, que são mantidas pareadas por pontes de hidrogênio, e

sabendo-se que o pareamento A-T envolve duas pontes e G-C, três pontes, um DNA

com maior conteúdo de G e C, terá uma temperatura de fusão maior. A

determinação da Tm de um DNA pode fornecer uma estimativa de sua composição

de bases. Com aumento controlado da temperatura é possível abrir uma região rica

em A-T, sem comprometer a abertura de trechos ricos em G-C. A Figura 5C mostra

diferentes perfis de desnaturação do DNA da E. coli e do M. phlei. De acordo com as

curvas, podemos supor que o conteúdo de C e G do M. phlei é maior que o da E.

coli, pois a temperatura necessária para que o DNA deste último seja desnaturado, é

maior.


Figura 5. Desnaturação do DNA. (a) Desnaturação e renaturação do DNA; (B)

Efeito hipercrômico; (C) DNAs de fontes diferentes podem requerer temperaturas

diferentes para causar desnaturação dos mesmos. As curvas mostras em (C)

sugerem que o conteúdo de C e G do M. phlei é maior que na E. coli, por isto é

necessária uma temperatura maior, para observamos aumento da absorbância a

260 nm.

Calor

Resfriamentolento

DNA nativo (dupla fita) DNA desnaturado

A

B C

Calor

Resfriamentolento

DNA nativo (dupla fita) DNA desnaturado

A

B C


REPLICAÇÃO DO DNA

Os mecanismos que regulam a replicação do DNA e a divisão celular estão

relacionados. A replicação e o ciclo celular devem ser conectados de tal forma que a

frequência dos ciclos de replicação se ajuste à velocidade do crescimento da célula

e o término da replicação seja relacionado à divisão celular. Devem existir, portanto,

sinais celulares para o crescimento da célula, tais como velocidade de síntese

protéica, resposta à falta de aminoácidos ou fontes de carbono, que induzem os

ciclos de eventos da divisão celular.

Em células eucarióticas, o processo de replicação do DNA ocorre durante a

fase do ciclo celular denominada período de síntese (S). A replicação apresenta

algumas características típicas: a) a replicação ocorre de forma semiconservativa; b)

requer um grande consumo de energia, na forma de nucleotídeos trifosfatados (ATP,

GTP, CTP e TTP); c) a reação catalisada pela DNA polimerase (enzima responsável

para unir um nucleotídeo ao outro) se dá no sentido 5’ para 3’.

Replicação é semiconservativa

A hipótese Watson-Crick propõe que cada fita de dupla hélice do DNA seja

usada como um molde para a replicação das fitas-filhas complementares. Desta

forma, duas moléculas de fitas duplas de DNA, idênticas ao DNA parental, serão

formadas, cada uma contendo uma fita intacta do DNA parental (Figura 6 ).

Figura 6 : Replicação Semiconservativa do DNA. Após a replicação, a dupla hélice

formada conterá uma fita parental pareada com a fita recém-sintetizada (fita nova)


Etapas na Síntese do DNA

1) Início da Replicação

A. Separação das duas fitas de DNA complementares:

Para que as duas fitas da dupla hélice parental de DNA sejam replicadas,

elas devem ser primeiramente separadas, pois as polimerases usam somente DNA

fita simples como molde. Nos procarióticos, a replicação do DNA inicia em uma

sequência de nucleotídeos específica que representa a origem única de replicação.

Nos eucarióticos, a replicação inicia em múltiplos sítios (origens de replicação) ao

longo da hélice de DNA. Estes sítios incluem sequência curtas de pares de bases

AT.

B. Formação da zona de replicação

A medida que as duas fitas se desenrolam e se separam, formam uma

região parecida com um “V” designada forquilha de replicação, onde as proteínas

que participarão da síntese da fita nova, incluindo a DNA polimerase, irão se ligar. A

partir da origem, a replicação prossegue ao longo da fita de DNA. A replicação do

DNA de dupla fita é bidirecional e a forquilha de replicação se move em ambas as

direções a partir da origem.

Algumas proteínas são requeridas para o reconhecimento da origem de

replicação e/ forquilha de replicação, formando um Complexo. Proteínas estas que

são responsáveis por manter a separação das fitas parentais (fitas que serão

utilizadas como molde) e por desenrolar a dupla hélice. Estas proteínas incluem

(Figura 7 ):

- Proteína DNA: é responsável pela separação das fitas, formando regiões

localizadas de DNA de fita simples.

- DNA Helicases: Enzimas que tem como função a quebra das pontes de

hidrogênio entre as bases, separando as duas fitas de DNA. As helicases requerem

energia, fornecida pelo ATP.

- Proteínas SSB ou proteínas que se ligam à DNA fita simples: Também

denominadas de proteínas desestabilizadoras da hélice, ligam-se somente em DNA


fita simples impedindo o “repareamento” da dupla fita. A presença de proteínas SSB,

durante a replicação, é extremamente importante, pois evitam que regiões

despareadas sofram torções. Desta forma, as SSBs garantem uma conformação do

DNA ideal para a replicação e pareamento da fita recém sintetizada, além de

proteger as fitas simples de degradação por nucleases.

- Topoisomerases: são enzimas que promovem quebras transitórias nas

ligações fosfodiésteres, gerando uma forma intermediária, onde a proteína

permanece ligada covalentemente ao DNA, permitindo que as fitas do DNA passem

umas sobre as outras, alterando, assim, o superenrolamento da molécula.

Figura 7: Proteínas responsáveis por manter separação das fitas parentais e

desenrolar da hélice dupla adiante da zona de replicação avançada.

5'

5'

3'

3'

DNA Girase

Helicase

Direção do movimento da

forquilha de replicação

Proteínas que se ligam ao

DNA simples fita (SSB)

SSB

Fita líder (contínua)Fita seguidora

(descontínua)


2) Adição do primer

As DNA polimerases (enzimas responsáveis pela síntese da nova fita do

DNA) não podem iniciar a síntese de uma fita complementar através de um molde

totalmente composto de fita simples. Elas requerem um primer ou iniciador que são

regiões curtas de RNA sintetizadas pela DNA primase ou iniciase (uma RNA

polimerase), estes primers são complementares e antiparalelos ao molde de DNA. A

fita contínua necessita somente de um primer inicial enquanto a fita descontínua

utiliza vários primers (Figura 7 ).

3) Elongação

DNA polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA,

possuindo a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH,

possibilitando o crescimento da cadeia no sentido 5’-3’. São constituídas de três

tipos: DNA polimerase I, DNA polimerase II e DNA polimerase III.

- DNA poli I: possui atividades de síntese (DNA polimerase) e atividade de

degradação 5’-3’ exonuclease, sendo capaz de remover hidroliticamente o primer de

RNA e atividade 3’-5’ exonuclease, importante para que a replicação ocorra livre de

erro (Figura 6).

- DNA poli II: sua principal função em extratos celulares está relacionado aos

processos de reparo do DNA.

- DNA poli III: é a principal enzima responsável pelo elongamento da cadeia

do DNA em procariotos, possuindo atividade de síntese e degradação.

As DNA polimerases responsáveis por copiar o molde de DNA somente são

capazes de ler as seqüências de nucleotídeos no sentido 3’-5’, polimerizando a fita

em direção oposta ao sentido da zona de replicação 5’-3’(continua). Esta fita que

está sendo copiada na direção da zona de replicação é denominada Fita Líder e a

outra fita que está sendo sintetizada na direção oposta (5’- 3’) de modo descontínuo,

é Fita secundária. A fita secundária é sintetizada descontinuamente, em fragmentos

curtos de DNA, denominados de Fragmentos de Okazaki (Figura 8 ).

O alongamento da cadeia de DNA é catalisada pela DNA polimerase III,

utilizando o grupo 3’-hidroxila do primer de RNA como aceptor do primeiro

desoxirribonucleotídeo. A DNA polimerase III começa a adicionar os nucleotídeos ao


longo do molde de fita única, que especifica a sequência de bases da cadeia recém-

sintetizada (Figura 9 ). À medida que o nucleotídeo está sendo adicionado, a DNA

polimerase III faz correção (atividade 3’-5’ exonuclease). É importante para a

sobrevivência dos organismos que a sequência de nucleotídeos seja replicada com

mínimo de erros, para evitar mutações.

A DNA polimerase III continua a sintetizar o DNA até ser bloqueada pela

proximidade ao primer de RNA. Quando isso ocorre, o RNA é excisado e a lacuna

preenchida pela DNA polimerase I que remove os nucleotídeos de RNA. A ligação

fosfodiéster final entre o grupo 5’-hidroxila na cadeia de DNA sintetizada pela DNA

polimerase III e o grupo 3’-hidroxila da cadeia feita pela DNA polimerase I é

catalizada pela DNA-ligase. A junção destas duas fitas de DNA requer energia, a

qual, em seres humanos, é fornecida pela clivagem de ATP em AMP+2Pi.

Figura 8: Alongamento das fitas líder e secundária.

5'

5'

3'

3'

3'5'

DNA Girase

Helicase

Direção do movimento da

forquilha de replicação

Proteínas que se ligam ao

DNA simples fita (SSB)

SSBDNA primase

RNA iniciador

RNA iniciador

DNA polimer.III

DNA Polimer. I

DNA ligase

Fita líder (contínua)Fita seguidora

(descontínua)

Figura 9: Formação da ligação fosfodiéster catalisada pela DNA polimerase.

Fundamentos de Biologia Molecular

Formação da ligação fosfodiéster catalisada pela DNA polimerase.

O grupo hidroxila livre, no C 3’, do primeiro nucleotídeo, através de seu par de elétrons, ataca o grupamento fosfato (substituição nucleofílica) donucleotídeo, no C 5’, que se encontra com carga parcialmente positiva, devido ao deslocamento de elétrons para o oxigênio, mais eletronegativo

Liberação do grupamento pirofosfato

Formação da ligação fosfodiéentre o oxigênio do C3’ do primeiro nucleotídeo, e o oxigênio do C5’ do segundo nucleotídeo.

O dinucleotídeo formado possui uma

hidroxila livre no C 3’, necessário

para a formação da próxima ligação

fosfodiester.


Formação da ligação fosfodiéster catalisada pela DNA polimerase.

O grupo hidroxila livre, no C 3’, do primeiro nucleotídeo, através de seu par de elétrons, ataca o grupamento fosfato (substituição nucleofílica) do segundo nucleotídeo, no C 5’, que se encontra com carga parcialmente positiva, devido ao deslocamento de elétrons para o oxigênio, mais eletronegativo.

Liberação do grupamento

Formação da ligação fosfodiéster, entre o oxigênio do C3’ do primeiro nucleotídeo, e o oxigênio do C5’ do segundo nucleotídeo.

O dinucleotídeo formado possui uma

hidroxila livre no C 3’, necessário

para a formação da próxima ligação

fundamentos de biologia molecular - apostila

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