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Fototransdução. Modelo de Transmissão do Sinal através de Membranas Celulares 19

Fototransdução. Modelo de Transmissão doSinal através de Membranas Celulares

A. Rocha Sousa

A fototransdução é um exemplo elucidativo do papel das proteínas estruturais demembrana e dos segundos mensageiros celulares na transdução celular do sinalextracelular. Integra os mecanismos de modulação celular, pelo cálcio (Ca2+) e a regulaçãodos níveis de GMPc por proteínas reguladoras. Tais fenómenos são modificados con-forme o meio está ou não iluminado (fotópico, escotópico).No presente artigo, o autor apresenta a fototransdução como um modelo de integraçãodo sinal extracelular, incluindo a descrição dos fenómenos que a complementam, comoa hiperpolarização do fotorreceptor e a sua regulação.

INTRODUÇÃO

A fototransdução é um fenómeno de transmissãodo sinal foto-químico envolvendo proteínas demembrana, sistemas de 2º mensageiros e por fimuma forma diferente de transmissão do potencialeléctrico celular. Ao contrário do esquema clássi-co de transmissão do sinal eléctrico em célulaspolarizadas, estamos aqui perante uma célula per-manentemente despolarizada, ou melhor com umacorrente eléctrica intracelular constante ocorren-do a transmissão do sinal durante a interrupçãodesta mesma corrente.A presença de uma corrente eléctrica conduz àlibertação do neurotransmissor, enquanto a suainterrupção o inibe promovendo a transmissão dosinal luminoso.A fototransdução é um exemplo elucidativo dopapel das proteínas estruturais de membrana e dossegundos mensageiros celulares na transduçãocelular do sinal extracelular. São apresentados osmecanismos de modulação celular, pelo cálcio(Ca2+) e a regulação dos níveis de GMPc por proteí-nas reguladoras, moduladas pelos mesmos. Trata--se de um conjunto de proteínas reguladoras datransmissão do sinal e sua modulação intracelular,com diferentes variações conforme o meio está ounão iluminado (fotópico, escotópico).Tentaremos efectuar a integração destas funçõescelulares durante o decorrer de um fenómeno queestá na base da visão, a transdução celular do si-nal luminoso.

ORGANIZAÇÃO CELULAR DA RETINA

O desenvolvimento da retina

A retina nervosa constitui uma extensão externado diêncefalo, sendo o nervo óptico um feixenervoso que conecta a retina com os outros cen-tros nervosos, não apresentando características denervo periférico. O olho humano desenvolve-se apartir das vesículas prosencefálicas laterais gera-das durante a terceira semana de desenvolvimen-to. Estas vesículas aumentam progressivamente,inicialmente nas suas superfícies dorsais e lateraise formam a tacícula óptica, composta de duasparedes, com orientação latero-ventral. A cavida-de no interior das duas paredes representa a con-tinuação da cavidade do tubo neural, tornando-seno entanto uma cavidade virtual, aquando daobliteração desta comunicação no pedículo ópti-co. Este espaço subretiniano mantêm-se virtualdurante toda a vida, excepto em situações dedescolamento de retina em que se torna real.A retina desenvolve-se a partir do neuroepitéliopseudo-estratificado, cujas células finas e altaspercorrem toda a sua espessura, atingindo a su-perfície interna e externa. Dentro das células des-te epitélio os núcleos migram para a superfícieventricular, dando-se as divisões celulares a estenível. Algumas destas células param o processode divisão e iniciam a diferenciação originandoum dos vários tipos celulares nervosos ou gliaisda retina madura. As primeiras células diferen-ciadas são as células ganglionares, que constitu-em a camada mais próxima da superfície vítrea.No que respeita à formação de sinapses esta ini-cia-se nos fotorreceptores, constatando-se que odesenvolvimento sináptico não se processa nasequência do aparecimento das células diferen-ciadas.

Integrada nas Provas de Aptidão Pedagógica e Capacidade Científica apre-sentadas a 28 de Junho de 2001 à Faculdade de Medicina da Universida-de do PortoCorrespondência: A. Rocha-SousaServiço de Fisiologia • Faculdade de Medicina da Universidade do PortoAl. Prof. Hernâni Monteiro • 4200-319 Porto • PortugalEmail: [email protected]

Acta Oftalmológica 11; 19-30, 2001

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Os fotorreceptores

Na camada de fotorreceptores identificámos qua-tro tipos diferentes de células caracterizadas pelasua forma, distribuição espacial, característicasbioquímicas e capacidade de absorção de luz dediferentes comprimentos de onda. Estes tipos ce-lulares agrupam-se em dois tipos de fotorrecepto-res, os cones e os bastonetes.Os bastonetes são células com uma sensibilidadeespectral maior para a luz azul-verde com um picode sensibilidade localizada nos 500 nm de com-primento de onda de luz. A presença de um sótipo de bastonetes não é universal. Há répteis comdois tipos de bastonetes sensíveis respectivamen-te ao azul e ao verde (Walls, 1934; Liebman eEntire, 1968).Os cones dividem-se, nos primatas, em 3 tiposcelulares diferentes designados por curto, médio elongo comprimento de onda. As sensibilidade demaior absorção de luz situam-se nos 420 nm paraos cones de curto comprimento de onda (conesazuis) (De Monasterio e col., 1981; Szel e col.,1988), 531 nm para os de médio comprimento deonda (cones verde) e 558 nm para os de longocomprimento de onda (cones vermelhos) (Marc eSperling, 1977; Gouras, 1986) (figura 2).

Progressivamente a estrutura histológica da reti-na continua a individualizar-se com a formaçãode 3 camadas de células com os corpos celulares(camada nuclear interna, nuclear externa e dascélulas ganglionares) e camadas intermédias queconstituem as sinapses (plexiforme interna eplexiforme externa).Histologicamente a retina fica finalmente forma-da por 10 camadas, que se estendem desde oepitélio pigmentado até à membrana limitante in-terna, interface com a membrana hioloideia pos-terior do vítreo. (figura 1) (Cohen, 1992).

Fig. 1- Divisão histológica da retina. Corte em microscopia deluz: EP – epitélio pigmentado; SE, segmento externo dosfotrreceptores; SI, segmento internos dos fotorreceptores; MLE,membrana limitante externa; CNE, camada nuclear externa; CPE,camada plexiforme externa; CNI, camada nuclear interna; CPI,camada plexiforme interna; CG camada das células ganglionares;FNO, camada das fibras do nervo óptco; MLI, membrana limitanteinterna. Adaptado de Cohen, 1992.

Fig. 2 – Absorvância média dos quatro pigmentos visuais hu-manos. Circulos fechados - bastonetes (496 nm); quadrados-cones azuis (419 nm); triângulos - cones verdes (531 nm); circulosabertos - cones vermelhos (558 nm); linhas a cheio - curvascalculadas com o uso de um nomograma Adaptado de DartnallHJA et col. Microspectrophotometry of human photoreceptors:in Molon Jd, Sharpe L.T. eds. Color Vision, 1983, copyright byAcademic Press, Inc [London] Ltd.

A existência de três tipos de cones não é universalno reino animal. A maioria dos mamíferos possu-em dois tipos de cones (dicromatas), havendo noentanto alguns peixes que possuem cinco tiposdiferentes de fotopigmentos (Bowmaker e col.,1991; Hisatomi e col. 1997). A sensibilidadeespectral está directamente correlacionada com ofotopigmento presente no segmento externo dofotorreceptor. Trata-se da rodopsina nos bastonetese das opsinas dos cones. O quinto pigmento decomprimento de onda intermédio médio-curto(MS) tem um espectro de absorção de 452 nm eencontra-se distribuído em células com forma debastonete (Hisatomi e col., 1998). Os vários foto-pigmentos têm uma origem comum, derivam dumamolécula ancestral que originou dois grupos depigmentos, um de curto e outro de longo compri-mento de onda e estes posteriormente originaramas moléculas existentes ao longo da filogenia(Takanuga e col., 1999).

Subdivisão celular dos fotorreceptores

Os fotorreceptores dividem-se em 4 porções subce-lulares. O segmento externo, o segmento interno,o corpo e o pedículo celular (Cohen, 1972). O seg-mento externo é constituído por um conjunto dediscos derivados da membrana celular impregna-dos de fotopigmentos responsáveis pela fototrans-dução.Nos meados do século passado Schultze dividiuos fotorreceptores em cones e bastonetes confor-me a forma do segmento externo, sendo seme-lhante a um bastão nos bastonetes e cónica noscones. Apesar destas características, existem es-pécies em que esta distinção não é fácil, podendomesmo, em algumas tornar-se impossível.


Os segmentos externos são compostos por um con-junto de discos membranares resultantes dopregueamento da membrana celular em sucessi-vas camadas. Este processa-se mantendo a comu-nicação entre os espaços membranares e o espaçoextracelular.Há diferenças entre a estrutura dos discos membra-nares dos bastonetes e dos cones (figura 3).

se origina o pedículo ciliar, composto por 9 paresde microtúbulos. Este continua-se excentricamenteno segmento externo. Mais internamente o seg-mento interno possui uma acumulação basal deorganelos celulares, com grande abundância emmitocôndrias (Cohen, 1992).O segmento interno continua-se com o corpo ce-lular (que aloja o núcleo celular) e a terminaçãosináptica. O primeiro situa-se na camada nuclearexterna da retina, enquanto o segundo é constitu-inte da camada plexiforme externa. A terminaçãosináptica é especializada na sua forma conformeconsideramos os cones ou os bastonetes (Dowling,1966; Kolb, 1970). Nos cones a terminação sinápti-ca designa-se por pedículo, é grande, cónica, comuma porção terminal achatada de 8-10 mm, dis-pondo-se paralelamente na camada plexiformeexterna. Em contraste, nos bastonetes, designam-se por esférulas e são pequenas porções alargadasda terminação dos axónios com cerca de 5 mm dediâmetro. As esférulas encontram-se agrupadasentre e acima dos pedículos dos cones (Alnelt ecol., 1990). Em ambos as terminações estão pre-enchidas com pequenas vesículas sinápticas.Na retina os fotorreceptores estabelecem sinapsescom as células bipolares e horizontais, e as pri-meiras, por sua vez, com as células ganglionares,cujos axónios formam o nervo óptico. A formacomo essa sinapse é efectuada varia conforme nosreferimos aos cones ou aos bastonetes (Dowling,1970).

TRANSDUÇÃO MEMBRANAR DO SINAL LUMINOSO

Para explanação dos mecanismos relacionadoscom a transdução do sinal luminoso ao longo damembrana citoplasmática passaremos a descrevê--la nos bastonetes. A razão para esta opção tem aver com o grande conhecimento do processonestefotorreceptor, o conhecimento da estrutura darodopsina, fotopigmento visual, e com a identifi-cação de grande homologia entre este e o desen-volvido nos cones. Há, de facto homologia entreas vias metabólicas da fototransdução dos cones edos bastonetes (Takunaga e col., 1999).Anteriormente referimo-nos à estrutura histológicados bastonetes, descrevendo-os como compostospelo segmento externo, pelo interno, corpo celu-lar e terminação sináptica. A sua função essencialé a transdução do sinal visual (luminoso) em sinaleléctrico que se faz especificamente no segmentoexterno e interno do fotorreceptor.

Potencial de repouso do fotorreceptor

Na maior parte dos neurónios em repouso há ageração de um potencial de membrana hiperpola-

Figura 3 – Constituição e diferenças entre a estrutura do cone edo bastonete. Compostos por segmento externo, interno e ter-minação sináptica. O segmento externo é envolvido por umamembrana interrompida na base no bastonete, enquanto do coneesta membrana mantém a comunicação com o exterior. Adapta-do de Berne e Levi. Ed. Physiology, 2000.

No bastonete os discos membranares estão rodea-dos por uma membrana celular contínua que seinterrompe na base. O perímetro dos bastonetes éinterrompido por uma ou mais incisuras que pe-netram em direcção ao centro do disco membranar.As ansas membranares estão unidas na sua por-ção lateral por uma estrutura designada por anelmembranar (rim), existindo elementos fibrososexternos que unem os anéis membranares à mem-brana celular adjacente (Roof e Henser, 1982;Usukura e Yamada,1981; Fetter e Corless, 1987).As membranas dos discos intercalares encontram--se impregnadas de fotopigmento iniciando-se aío processo de fototransdução. Os fotopigmentossão proteínas estruturais que para serem extraí-dos das membranas celulares requerem o uso dedetergentes. Esses constituem mais de 50% dasproteínas estruturais destas membranas celulares(Papermaster e Dreyer, 1974).O segmento interno separa-se do externo por umestrangulamento. Imediatamente abaixo e numaposição excêntrica situa-se o corpo basal do qual

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rizador e consequente inibição da libertação deneurotransmissor na fenda sináptica. O bastonetetem um mecanismo diferente de transmissão dosinal nervoso na sinapse. Na verdade, o fotorrecep-tor é uma célula que está constantemente despola-r-izada, ou melhor, que é constantemente atra-vessada por uma corrente eléctrica positiva,resultante da abertura constante dos canais desódio (Na+) no segmento externo, da existência deum trocador de Na+ no segmento interno e da exis-tência de uma bomba de Na+/K+,Ca2+ no segmentoexterno do fotorreceptor. Todas estes estruturasmembranares estão situadas ao nível da membra-na celular. A célula está constantementedespolarizada com um potencial de membrana quese aproxima de - 40 mV. Na membrana celular dosegmento interno os canais de K+ voltagem de-pendentes permitem a saída de K+ com consequentecontributo para o estabelecimento da corrente decargas positivas intracelulares. A bomba de Na+

aqui existente está a excretar Na+ do interior dacélula. Durante a estimulação luminosa dá-se ainterrupção desta corrente com descida do poten-cial do fotorreceptor, que se aproxima do potenci-al de equilíbrio do K+ (-75 mV), com consequenteinibição da libertação de glutamato e transmissãodo sinal à célula bipolar (Copenhagen e Jahr,1989)(figura 4).Para que esta transmissão se efectue é fundamen-tal o encerramento dos canais de Na+ que se en-

contram normalmente abertos no segmento ex-terno do fotorreceptor. Estes não se tratam de ca-nais simples de Na+, mas sim de canais de Na+ ouCa2+, ião importante na regulação do processo defototransdução.Os canais de Na+ do segmento externo dofotorreceptor são dependentes do GMPc (Yau eBaylor, 1989; Yau, 1994). A sua diminuição con-duz ao encerramento desses canais.Para a compreensão do processo de que resulta adiminuição do GMPc vamos analisar a processopelo qual a energia luminosa é convertida numavia metabólica conducente à diminuição dos ní-veis de GMPc.

Fotoquímica da transdução do sinal luminoso

Inicialmente cada fotão atravessa todas as cama-das celulares da retina até atingir o segmentoexterno do fotorreceptor. Este está em intimaligação com o epitélio pigmentado da retina, comfunções nutritivas e de regulação metabólica. Atransdução do sinal está dependente desta ligaçãoe da existência de rodopsina nos discos membra-nosos do bastonetes.A rodopsina resulta da junção de uma proteínaestrutural dos discos membranares, a opsina, quese dispõe assimetricamente na bicamada fosfoli-pídica, e de um cromóforo, o retinaldeído, envol-vido no interior da membrana pela estrutura se-cundária da mesma proteína. A sua estrutura se-cundária consiste em 7 segmentos helicoidais _com três ansas citoplasmáticas e três ansas dis-postas nos discos intramembranares. (figura 5). Assuas ansas citoplasmáticas podem ligar-se à trans-ducina (Blasynski e Ostroy, 1984).A opsina é formada a partir da síntese proteica noribossómico, sendo glicosilada no aparelho deGolgi com adição de 2 cadeias de oligossacarídeos.Posteriormente algumas serinas e treoninas sãofosforiladas pelas cínases da rodopsina, conferin-do-lhe afinidade para a arrestina, proteína impor-tante na interrupção do processo de fototransdução(Cohen, 1992).Nos cones os fotopigmentos são menos abundan-tes e estáveis pelo que a sua identificação se tor-nou mais difícil. Trata-se de 3 cadeias proteicascom grande homologia, entre si e com a rodopsina,e com picos de absorção das radiações correspon-dentes ao verde, ao vermelho e ao azul. As molé-culas com maiores semelhanças estruturais são asopsinas verdes e vermelhas. Estas só diferem em4% dos amino-ácidos na sua estrutura primária(Nathans e col., 1986). O estudo dos fenómenosretinianos desencadeados pela estimulação lumi-nosa iniciou-se no século XIX, com a verificaçãoda perda da cor da retina aquando da suaestimulação (Kuhne, 1879).

Fig. 4 – Fenómenos associados à fototransdução no fotorreceptor.No escuro os canais de Na+ dependentes do GMPc localizadosno segmento externo estão abertos, dando-se a extrusão de Na+

e Ca2+ pelas bombas de Na+/K+ do segmento interno e pelasbombas de Na+/K+,Ca2+ do segmento externo. Durante aestimulação luminosa dá-se o encerramento dos canais de Na+

por diminuição do GMPc intracelular conduzindo háhiperpolarização do bastonete. Adaptado de Cohen 1992.


A rodopsina, responsável pela conversão da ener-gia luminosa em energia química, é activada porum fotão, o que conduz à sua isomerização cis-trans (Alpern, 1971).Ao atingir a cis-rodopsina o fotão conduz à suafotoisomerização e formação do primeiro compo-nente da via metabólica designado de batorro-dopsina. Todos os produtos das reacções seguin-tes encontram-se na forma trans e a estimulaçãoluminosa deixa de ser necessária a partir desteprimeiro passo, já que a conversão da batonodo-psina em luminorrodopsina e metarrodopsina I,II,IIé puramente térmica. As diferenças entre estasmoléculas prendem-se com a sua estrutura secun-dária e terciária (Strier, 1986, 1991; Pugh e Lamb,1993; Liebman, 1987). A duração destas reacçõesé da ordem dos picosegundos. Cerca de 60% daenergia do fotão estimulante foi absorvida namudança de configuração cis-trans (Cooper, 1979;Schick e col., 1987) (figura 6). Nesta altura arodopsina está decomposta em opsina e trans-retinaldeído (Schoenlein e col., 1991). Seguidamen-te o trans-retinaldeido será isomerizado em cis-retinaldeido, no epitélio pigmentado, e integraránovamente a molécula de rodopsina para novafotoisomerização. A este processo designa-se ci-clo visual (Kuhne, 1879; Alpern, 1971).Após a fotoisomerização, a metarrodopsina II (R*)vai activar a transducina, uma proteína G comcapacidades enzimáticas. Esta situa-se na face in-terna da membrana do fotorreceptor e é compostapor três unidades diferentes α, β δ. À sub-unidadeα está ligada uma molécula de GDP. A presençada fracção _ inibe a actividade da transducina. Aoser activada pela metarrodopsina II (R*) atransducina desliga-se do GDP e liga-se a umamolécula de GTP, resultando uma alteração

A B

Fig. 5 – A) Orientação linear da sequência da opsina em relação ao disco membranar. Observam-se-se 7 regiões em hélice a, queatravessam a membrana citoplasmática, resultando 3 ansas citoplasmáticas e 3 ansas no lumen do disco membranoso. B) Disposição darodopsina em relação à membrana celular. As ansas helicoidais estão a rodear o cromoforo, o 11-cis-retinaldeído. Adaptado de Dratz EA,Hargrave PA: Trends Biochem. Sci. 8:128, 1983.

Fig. 6 – A) Na ausência de estimulação luminosa os canais deNa+/K+ do segmento externo encontram-se abertos estabelecen-do-se uma corrente de Na+ e Ca2+ entre o segmento externo e ointerno. B) Durante a estimulação luminosa verifica-se activa-ção da rodopsina com formação da metarrodopsina II (R*).C) Nesta fase dá-se a isomerização do 11-cis-retinal em 11 trans-retinal. Adaptado de Palczeweski et. Col; Bioessay 2000: 22, 337-350.

conformacional com desprendimento da porção _das fracções β, δ, Dzeja e col., 1999). Nesta altura,a R* desliga-se da porção _ da transducina (TC)ficando esta livre para nova activação ou para serinactivada pela sua fosforilação mediada pelarodopsinacínase. Agora a porção α da transdu-cina, ligada ao GTP, vai activar uma segunda pro-teína, a fosfodiestérase (PDE) (He e col., 1998;Makino e col., 1999; Gaudet e col., 1999). Esta éconstituída por 4 sub-unidades, uma α, uma β eduas δ, e possui o sítio activo nas suas porções δpermanentemente inibido pelas porções α, β Bahere col., 1979; Deterre e col., 1988). Após a sua ac-tivação pela transducina a fracção α, β separa-seda fracção δ, conduzindo à estimulação da mes-ma enzima (Deterre e col., 1988). Esta separação e

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consequente ligação à molécula do GTP não estáinequivocamente demonstrada. Para a plena acti-vação da fosfodiastérase é necessária a ligação de2 moléculas de transducina α−GTP. Em conclu-são, a via metabólica iniciada pela activação darodopsina conduz então à activação da fosfodies-térase (Funk e col., 1990; Wensel e Stryer, 1990;Yamazaki, 1990).Seguidamente, a fosfodiastérase activadavaiactuar sobre o substracto GMP c e convertê-loem 5-GMP, conduzindo a uma diminuição dos seusníveis intracelulares e ao encerramento dos ca-nais de Na+ da membrana do segmento externodo fotorreceptor. Face aos níveis intracelulares deGMPc só uma pequena fracção de canais de Na+

se encontram abertos durante a fase escura, en-cerrando-se com a estimulação luminosa (Fesenkoe Kolesnikov, 1985) (figura 7).

Nos cones a fototransdução, apesar de não estarcompletamente caracterizada, parece ser conduzidapor uma via metabólica semelhante à dos basto-netes (Li e col., 1990). As opsinas dos cones man-têm regiões com capacidade de fosforilação, exis-tem isoenzimas da transducina e da fosfodies-térase (Takunaga e col., 1999) e foram identificadasrespostas de abertura e encerramento de canaismembranares com a variação dos níveis de GMPc(Hackos e col., 1997).

Hiperpolarização do bastonete e informação visual

A transdução do sinal luminoso iniciou-se assimpela estimulação luminosa do fotopigmento, se-guida dos fenómenos fototérmicos de transmis-são do sinal na membrana, diminuição da con-centração de GMPc encerramento dos canais deNa+ na membrana do segmento externo dos fotor-receptores, interrupção da corrente positiva de Na+

intracelular e diminuição do potencial de mem-brana com consequente hiperpolarização. Todosestes fenómenos conduzem à inibição da liberta-ção de glutamato na fenda sináptica e estimulaçãoda célula bipolar. O glutamato é um neurotrans-missor com capacidades excitatórias existindo re-ceptores para o mesmo ao nível das célulasbipolares, horizontais e mesmo das célulasganglionares (Schoenlein e col., 1991). Na retinaexistem alguns subtipos de receptores para oglutamato (Miller e Slaughter, 1985), comregulação da sinapse conforme os cofactores pre-sentes (como a glicina) e do tipo celular em causa(Ehinger, 1972).De qualquer das formas, o pedículo do fotor-re-ceptor não tem só uma sinapse química com acélula bipolar, também as membranas celularesestão especializadas para a transmissão do sinaleléctrico (Raviola e Gilula, 1975; Nelson, 1985).Em termos histológicos há diferenças signifi-cativasentre a morfologia das terminaçõessinápticas doscones e dos bastonetes. O cone or-ganiza-se em tríadas, com o pedículo a unir-se auma célula bipolar e duas células horizontais(Missotten, 1965; Dowling, 1966; Kolb, 1970;Lasansky, 1971). Em contrapartida os bastonetesorganizam-se de forma a que a duas esférulas es-tão associados dois elementos sinápticos lateraisque estabelecem ligação com as células horizon-tais e elementos centrais que sinaptizam com ascélulas bipolares (Missotten, 1965; Dowling, 1966;Kolb, 1970). Entre os fotorreceptores existem “gap-junctions” com características de sinapse eléctri-ca, tendo sido demonstradas correntes electrogé-nicas entre estes dois tipos celulares (Nelson e col.,1977). Assim os pedículos dos cones tem telodedrosque sinaptizam lateralmente com outros cones oubastonetes.

Fig. 7 – Esquema elucidativo da fototransdução no segmentoexterno do fotorrecetpor. Esta figura subdivide-se em 2 porçõesilustrando respectivamente os fenómenos da fototransdução naausência e presença de luz. Adaptado de Palczeweski et. Col;Bioessay 2000; 22: 337-350.

Apesar de hoje o GMPc ser universalmente aceitecomo o 2º mensageiro nesta via metabólica, estepapel foi muitas vezes posto em causa pela veri-ficação de que os seus níveis intracelulares, duran-te a fase escura e após com o estabelecimento dacorrente de Na+ na fase luminosa, não serem osesperados para o efeito mediador (Fesenko eKolesnikov, 1985). A sua justificação está no fac-to do GMPc estar em dois compartimentos dife-rentes no interior da célula. Para além do GMPclivre no citoplasma, a célula possui um segundo”pool” de GMPc ligado a sítios não catalíticos damolécula da fosfodiestérase. A libertação deste“pool” resulta num grande aumento (cerca de 6vezes) da sua concentração e consequente verifi-cação da grande diferença entre a fase escura e afase luminosa da via metabólica. Também na con-centração do ião Ca2+ se verificam oscilações im-portantes entre a fase escura e luminosa do fenó-meno, pelo que lhe foi atribuído o papel de 2ºmen-sageiro. Sabe-se hoje que o seu papel é de regula-ção do fenómeno e não de mensageiro do mesmo.


Regulação da fototransdução

Quando nos referimos à regulação da fototrans-dução teremos que localizar dois processos deregulação opostos embora complementares. O pri-meiro de amplificação do fenómeno e o segundode auto-limitação (“feedback-negativo”) do mes-mo.

Amplificação

A amplificação é o fenómeno pelo qual uma mo-lécula de um fotorreceptor conduz à activação devárias moléculas de fosfodiestérase com conse-quente diminuição acentuada dos níveis de GMPc.Uma molécula de rodopsina é capaz de activarcerca de 500 moléculas de transducina até perdero seu poder catalítico (Fung e col., 1981). Arodopsina parece ser uma enzima responsável pelaregulação da actividade eléctrica do fotorreceptor.Por sua vez a transducina activada vai exercer asua acção metabólica sobre 800 moléculas dife-rentes de fosfodiestérase (Baher e col., 1979; Yee eLiebmann, 1978). Assim o efeito de um só fotão éamplificado resultando numa grande diminuiçãodas moléculas de GMPc, na ordem das 105 vezes.

Auto-limitação

Por outro lado, este fenómeno tem também umasegunda via metabólica conducente à reposiçãodos níveis de GMPc e limitação da transdução dosinal. Aqui o Ca2+ tem um papel extremamenteimportante. Como anteriormente referenciamos oCa2+ entra na célula a partir dos canais de Na+ dosegmento externo. Esta entrada é cerca de 15% dototal de iões entrados, verificando-se concentra-ções durante a adaptação ao escuro de 700 nM,enquanto durante a fase luminosa de 30 nM(Koutalos e Yau, 1996). Com o encerramento doscanais de Ca2+, os seus níveis intracelulares bai-xam, face ao contínuo bombeamento de Ca2+ pelotrocador de Na+/K+, Ca2+ da membrana do segmentoexterno (Cook e col., 1988). Nesta fase, a guanil-cíclase condiciona a transformação GTP-GMPccom reposição dos níveis intracelulares de GMPce reabertura dos canais de Na+, logo que a estimu-lação luminosa cesse.Com níveis de Ca2+ demasiado baixos o trocadorNa+/K+, Ca2+, deixa de actuar, sendo esta prova-velmente regulada por proteínas cínase (Schne-tkamp e col., 1995).A regulação da guanil-cíclase pelo Ca2+ não é umaregulação directa. Acontece por intermédio dasproteínas activadoras da guanil-cíclase (GCAP), de23 KD, com 3 isoformas ( Palczewski e col., 1994;Dizhoor e col., 1995; Gorczyca e col., 1995),estimuladoras da guanidilcíclase e dependente do

Ca2+. A localização no fotorreceptor não está com-pletamente definida. (Philipov, 2000). A diminui-ção dos níveis de Ca2+ citoplasmático, conduz auma activação da guanil-cíclase (figura 8). A ac-tivação da guanidilcíclase potencia a sua acção 5a 10 vezes.

Fig. 8 – Papel do Cálcio na fototransdução. Activação darodopsina cínase (RK), com consequente fosforilação da rodopsina(Rho). Activação das proteínas activadoras da guanidilcíclase(GCAP) e recuperação dos níveis de GMP. Regulação do canaliónico de Na+/Ca2+. Adaptado de Philipov 2000.

O Ca2+ é também importante na regulação da adap-tação dos fotorreceptores a ambientes de muita epouca luminosidade (figura 9). Os seus níveisintracelulares variam conforme o bastonete estejaadaptado à luz ou não. No escuro o Ca2+

i tem con-centrações mais altas do que adaptado à luz, mo-dulando-se assim o limiar de estimulação lumi-nosa. Esta modulação é feita pela activação peloCa2+ da recoverina/modulina-S. No escuro verifi-ca-se uma activação maior da modulina-S poraumento dos níveis de Ca2+, com inibição darodopsina-cínase e manutenção da rodopsina ac-tivada. Durante a adaptação á luz o fenómeno écontrário (Kawamura, 1994).

Figura 9 – Efeito do ambiente luminoso no limiar de estimulaçãodo bastonete. Em ambientes com escotópicos o limiar é maisbaixo devido aos níveis altos de Ca2+ intracelulares (circulos). OLimiar aumenta em ambiente fotópico.(linha a cheio) Adaptadode Palczeweski et. Col, Bioessay 2000; 22: 337-350.

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Por fim a baixa dos níveis de cálcio sensibilizamos canais iónicos do segmento externo para oGMPc, podendo esta sensibilização aumentar 6vezes a sua permeabilidade (Hsu e Molday, 1993;Weitz e col., 1998).A transducina α tem capacidade GTPásica e auto-limita a sua actividade, convertendo o GTP emGDP e ligando-se novamente à sub-unidade β e δ.A libertação das sub-unidades da transducina con-duz a nova agregação da fosfodiestérase (Yee eLiebmann, 1978; Pober e Bitensky, 1979).Em relação à rodopsina activada esta terá de serinactivada para evitar a perpetuação de toda a viametabólica. Ela é fosforilada, na dependência doATP, pela rodopsina-cínase (Thomson e Findley,1984), na porção C terminal. Este fenómeno con-fere-lhe afinidade para uma outra proteína, a arres-tina (Hisatomi e col., 1997b), cuja ligação inacti-vará a rodopsina, libertando a opsina e o trans-retinaldeído (Bennet e Sytaramaya, 1988). Noscones e nos bastonetes as moléculas de arrestinasão denominadas de S e X arrestina sendo diferen-te em termos de composição molecular (Hisatomie col., 1997b).A variação dos níveis de Ca2+ afecta concomitan-temente a concentração de R*. Estes níveis estãocorrelacionados com a presença ou ausência deluz. A fosforilação da R* com consequente inibi-ção é modulada pela modulina-S. Esta proteínainibe a fosforilação da R* e prolonga a sua semi-vida o que implica níveis elevados de cálcio intra-celular. Em ambiente escotópico (escuro) os níveisde Ca2+ intracelular são mais altos conduzindo auma activação da modulina-S e inibição dafosforilação da R*. Nesta circunstância a semi-vidada R* está aumentada. O aumento da semi-vidada R* conduz uma maior hidrólise do GMPc e onível de resposta ao estímulo luminoso aumenta.Por um mecanismo contrário, a semi-vida da R*está diminuída em ambiente fotópico comconsequente diminuição da amplitude de respostaao estímulo luminoso (Kawamura, 1993, 1994;Chen e col., 1995).

IMPLICAÇÕES FISIOPATOLÓGICAS

A desregulação dos mecanismos de fototransduçãoestá na base de numerosas patologias retinianasde etiologia hereditária. Assim, e percorrendo asvárias etapas da fototransdução, as alteraçõesmoleculares subjacentes às doenças heredodegene-rativas da retina estendem-se desde a rodopsinaaté à guanidil-cíclase e às proteínas reguladorasdependentes pelo Ca2+.A rodopsina pode ser afectada por um elevadonú-mero de mutações, as quais estão na base deváriaspatologia como a retinopatia pigmentada autossó-

mica dominante (RPAD) (Dryja e col, 1990; Berson,1993) e recessiva (RPAR) (Rosenfeld, e col. 1992)e a cegueira nocturna congénita estacionária(CNCE) (Dryja e col, 1993; Sieving e col, 1995).As alterações na molécula de transducina condicio-nam CNCE (Dryja e col, 1996), enquanto as dafosfodiestérase originaram a RPAD (McLaughlin ecol, 1993; Huang e col, 1995) e CNCE (Gal e col,1996).Durante a fase de inactivação da rodopsina é fun-damental a actuação da rodopsina cínase e daarrestina. Ambas, quando alteradas, originam va-riantes da CNCE (Fuchs e col, 1995; Yamamoto ecol, 1997).No final destes fenómenos os níveis de GMPc en-contram-se reduzidos e condicionam o encerra-mento dos canais de Ca2+/Na+ da membranacelulardo fotorreceptor. As anomalias molecularesdestescanais condicionam o desenvolvimento de RPAR(Dryja e col, 1995).Os níveis de GMPc serão posteriormente restabe-lecidos pela activação da guanil-cíclase, reguladapor proteínas dependentes do Ca2+. As alteraçõesmoleculares destas proteínas condicionam respec-tivamente distrofia cone-bastonete (DCB) (Perraulte col, 1996; Perrault e col, 1998) e distrofia cone(McLaughlin e col, 1993).Por fim, a doença de Stargart, a RPAD e DCB po-dem estar relacionadas com alterações no gene daproteína ABCR/Rim, uma proteína tranportadorade ATP (Allikmets e col, 1997, Nassonkin e col,1998). Estes genes podem ainda condicionar RPAR(Martinez-Mir, e col, 1998) e DCB (Cremers e col,1998). Enquanto a distrofia macular (Wells e col,1993, Gorin e col, 1995, Jacobson e col, 1996), aRPAD (Farrar e col, 1991; Kaijawra e col, 1991,Gruning e col, 1994) e a distrofia padronizada(Nicols e col, 1993; Weleber e col, 1993) podemestar relacionadas com alterações no gene daperiferina RDS, outra proteína estrutural na mem-brana dos discos dos fotorreceptores.Destes parágrafos podemos inferir que a relaçãoentre o quadro fisiopatológico e as manifestaçõesclínicas nem sempre pode ser estabelecida. A fisio-patologia destas alterações condicionam uma au-sência de transmissão do sinal luminoso, no casoda rodopsina, transducina e fosfodiestérase, comconsequente ausência da estimulação do fotorre-ceptor. Consequentemente, a nictalopia é um dosprimeiros sintomas apresentados por estes paci-entes.Algumas patologias condicionam lesão do fotorre-ceptor, mediada imunologicamente. Na retinopatiaassociada a carcinomas estes secreta, recoverina,uma proteína de ligação ao Ca2+ reguladora dafototransdução. A recoverina circulante despertauma resposta imunológica pois não faz parte dosantigéneos reconhecidos como próprios. Secun-


dariamente o sistema imunológico condicionará adestruição do fotorreceptor (Palczewski e col,2000). O papel da imunidade celular e humoralneste processo é desconhecido, observando-se, noentanto, a presença de anticorpos anti-recoverina(Adamus e col, 1998).As distrofias cone estão associadas a umamutaçãono gene da proteína activadora da guaníl-cíclase.Esta mutação condiciona uma diminuição da suasensibilidade ao Ca2+ com consequente manuten-ção da activação da guanil-cíclase e aumento daconcentração de GMPc. Estes limitam a inactivaçãoda guanil-cíclase na ausência de estimulação lu-minosa.As mutações ao nível da fosfodiestérase condicio-nam também um aumento da quantidade citosólicade GMPc. (Ulshafer e col, 1980). Os níveis eleva-dos deste 2º mensageiro mantêm abertos oscanaisde Ca2+ do segmento externo do fotorreceptor, ele-vando a concentração citosólica deste ião. Quan-do os níveis de Ca2+ são mantidos constantementeacima dos 200 mM desencadeia-se a falência dosmecanismos de regulação pelas mitocôndrias epelos sistemas de membrana importantes para amanutenção da sua homeostasia.Tais níveis condicionam o desenvolvimento defenómenos apoptóticos (McConkey, 1998). No seg-mento externo do fotorreceptor, apesar desses ní-veis de Ca2+ serem ultrapassados, não se estabele-cem fenómenos apoptóticos devido ao isolamentodo citoplasma do segmento externo. Convém, noentanto, sublinhar que, apesar destas particulari-dades fisiológicas, a manutenção, em condiçõespatológicas, de níveis elevados de Ca2+ no segmentoexterno podem desencadear os tais fenó-menosapoptóticos que conduzem à morte celular (Frassone col, 1999).

CONCLUSÃO

A fototransdução é um processo desenvolvido nosdiscos membranares do segmento externo dosfotorreceptores e que transforma o sinal luminosoem impulso nervoso conduzido pela via óptica aocórtex visual.O processo pelo qual o sinal luminoso é transfor-mado em sinal químico resulta de uma série dereacções químicas que envolvem o cromóforo dofotorreceptor (a rodopsina), o sistema celular deproteínas G (a transducina) e por fim a transmis-são do sinal intracelular, a qual condiciona umaredução dos níveis de GMPc e o encerramento docanais de Na+ do segmento externo do foto-rreceptor.Ao contrário do que ocorre nas outras células ner-vosas, no fotorreceptor a hiperpolarização con-duz à condução nervosa do sinal luminoso com

inibição da libertação de glutamato na fendasináptica e excitação das células bipolares.Na fototransdução, tal como noutros processoscelulares de transdução do sinal através das mem-branas biológicas, há fenómenos de regulação dosmesmos. Esta auto-regulação condiciona meca-nismos de amplificação, um fotão é capaz de am-plificar a sua resposta na via metabólica numarazão logarítmica de 5 vezes, e mecanismos deauto-limitação do sinal. A auto-limitação proces-sa-se anulando a actividade das moléculas acti-vadas, como a rodopsina, a transducina e a fosfo-diastérase.Em alguns casos, processa-se sem intervenção dequalquer via metabólica, sendo esta necessárianoutros como no caso da rodopsina. Por fim, parao processo cessar é necessário eliminar os siste-mas de segundo mensageiro gerado, neste caso oGMPc. Este fenómeno bem como o mecanismo deadaptação celular ao escuro ou a ambientes ilu-minados é regulado pelo ião Ca2+, importante aquital qual noutros fenómenos de regulação dahomeostasia celular.

SUMMARY

Phototransdution is an example of the structuralproteins and second messenger’s role in the tran-sudation of the extracellular signal. It integratesthe cellular modulation mediated by Calcium andthe cGMP levels by regulatory proteins.Multiple proteins involved in signal transmissionand intracellular modulation regulate photo-transdution. This is modified as the background isor not illuminated (photopic and scotopic). In thisarticle phototransduction is presented as a modelof extracellular signal transduction. Also we do areview of the other different phenomena that takeplace in the photoreceptor after phototransduction,its hyperpolarization and the related regulationmechanisms.

Key wordsFototransdução, proteínas G, segundos mensageiroscelulares, bastonetes

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fototransdução. modelo de transmissão do sinal através de ... · corte em microscopia de luz:...

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