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INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
FISIOLOGIA DA MATURAÇÃO DE CANA-DE-
AÇÚCAR (Saccharum spp): SINALIZAÇÃO E
CONTROLE DO METABOLISMO DE PRODUÇÃO E
ARMAZENAMENTO DE SACAROSE
GUILHERME GARCIA ROBERTO
Orientadora: Dra. Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Agricultura Tropical e Subtropical, Área de Concentração em Tecnologia da Produção Agrícola
Campinas, SP 2015
Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico R639f Roberto, Guilherme Garcia Fisiologia da maturação de cana-de-açúcar (Saccharum spp): Sinalização e controle do metabolismo de produção e armazenamento de sacarose/ Guilherme Garcia Roberto. Campinas, 2015. 52 fls. Orientadora: Dra. Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa Tese (Doutorado) Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto Agronômico 1. Cana-de-açúcar 2. Sacarose 3. Maturação 4. Etileno, 5. Déficit hídrico 6. Fitormônios 7.Fotossíntese 8. Carboidratos. 9. Relação fonte/dreno. I. Lagôa, Ana Maria Magalhães Andrade II. Título
CDD. 633.61
ii
iii
À minha família mais antiga:
Avó D. Neuza, pais Wanderley e Sonia e irmão
Gustavo, que me fizeram como sou,
DEDICO.
À minha nova família:
Letícia, que tanta força me deu nesta jornada,
OFEREÇO.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização e conclusão deste
trabalho.
Ao Instituto Agronômico – IAC - por todo o apoio de infraestrutura, financeiro e
logístico. Ao laboratório de fisiologia vegetal “Dr Coaracy M. Franco”, do Centro de P&D em
Ecofisiologia e Biofísica, em cujas dependências foram realizados os experimentos.
À Dra. Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa, pela orientação deste trabalho.
À equipe de pesquisadores e pós-graduandos do IAC que possibilitou a realização deste
trabalho: Dr. Eduardo Caruso Machado e Prof. Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro, coordenadores
do projeto temático de qual a tese faz parte e parceiros intelectuais desde a concepção do
trabalho até a análise dos resultados; Dr. Paulo Eduardo Ribeiro Marchiori e Dra. Norma de
Magalhães Erismann pela contribuição na análise de pré-banca da tese; Dr. José Rodrigues
Magalhães Filho, Dra. Daniela Fávero São Pedro Machado, MsC Cristina Rodrigues Gabriel
Sales, MsC Fernanda Castro Correia Marcos, MsC Neidiquele Maria Silveira, MsC Karina
Iolanda Silva e agrônoma Nathalia Barbosa Lanza, parceiros de trabalho, parceiros de pós-
graduação, de cafés, de conversas, de congresso, de comemorações.
À equipe de apoio técnico e em pesquisa do IAC: Severino Nogueira, pedra fundamental
de todos os trabalhos realizados na sessão, e à Dra. Yolanda Eugenia Alamo Gabrine Boza.
Ao Prof. Marcelo Menossi Teixeira, à MsC Camila Pinto da Cunha e à equipe do
Laboratório de Genoma Funcional do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de
Campinas, parceiros na elaboração, execução e financiamento de parte do projeto.
À banca avaliadora da tese, pela solicitude em dispender um precioso tempo na leitura
e na avaliação deste trabalho.
À Leticia Lidiane Silva, revisora deste trabalho, e amiga e companheira.
Aos amigos, os quais deixo de citar nominalmente por, graças a Deus, serem muitos os
ótimos e bons, mas que tenho certeza que sabem o quanto foram, são e sempre serão importantes
para mim.
v
SUMÁRIO
CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................... 1
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................ 4
2.1 Cultivo da Cana-de-açúcar no Brasil ................................................................................ 4 2.2 Maturação e Acúmulo de Sacarose em Cana-de-açúcar .................................................... 5 2.3 Reguladores Vegetais e o Acúmulo de Sacarose na Cana-de-açúcar ................................. 6 2.4 Fisiologia da Maturação: Metabolismo de Açúcares e Balanço Hormonal ........................ 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 11
CAPÍTULO II: VARIAÇÃO DA FOTOSSÍNTESE E DOS TEORES DE
CARBOIDRATOS INDUZIDOS POR ETEFOM E DÉFICIT HÍDRICO NA FASE DE
MATURAÇÃO DA CANA-DE-AÇÚCAR ....................................................................... 15
RESUMO ........................................................................................................................... 15
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 16
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 17
2.1 Material Vegetal ............................................................................................................. 17 2.2 Desenho Experimental ................................................................................................... 18 2.3 Avaliações Biométricas .................................................................................................. 19 2.4 Trocas Gasosas............................................................................................................... 19 2.5 Concentração de Carboidratos ........................................................................................ 21 2.6 Análise Estatística .......................................................................................................... 21 3. RESULTADOS .............................................................................................................. 21
4. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 25
5. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 26
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 27
CAPÍTULO III: O ETILENO INDUZ A SÍNTESE DE SACAROSE NO COLMO
DURANTE A MATURAÇÃO NA CANA-DE-AÇÚCAR................................................ 30
RESUMO ........................................................................................................................... 30
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 31
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 32
2.1 Material Vegetal ............................................................................................................. 33 2.2 Desenho Experimental ................................................................................................... 33 2.3 Trocas Gasosas............................................................................................................... 34 2.4 Concentração de Carboidratos ........................................................................................ 34 2.5 Extração para Análise Enzimática .................................................................................. 35 2.6 Análises enzimáticas ...................................................................................................... 35 2.7 Quantificação Hormonal ................................................................................................ 36 2.8 Análise Estatística .......................................................................................................... 36 3. RESULTADOS .............................................................................................................. 37
4. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 42
5. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 47
CAPÍTULO IV: CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................. 52
vi
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ABA – Ácido abscísico livre
AIA – Ácido indolacético
AVG – aminoetóxi-vinilglicina
DAA – dias após a aplicação dos tratamentos
DH – déficit hídrico
DH+EN – Tratamento com aplicação conjunta de déficit hídrico e etefom
E – Transpiração foliar
EN – Tratamento com aplicação de etefom
Etefom – ácido 2-cloroetilfosfônico
GA4 - Giberelinas
gs – Condutância estomática
IVA – Invertases Ácidas Solúveis
IVN – Invertases Neutras
Pn – Assimilação de gás carbônico
Pni – Assimilação total de gás carbônico durante o período experimental
RFAtot – Radiação fotossinteticamente ativa total
SPS - Sacarose fosfato sintase
SuSy – Sacarose sintase
Tar – Temperatura do ar
Trans-ZR – Trans-zeatina ribose
URmin – umidade relativa do ar mínima
vii
Fisiologia da maturação de cana-de-açúcar (Saccharum spp): sinalização e controle do
metabolismo de produção e armazenamento de sacarose
RESUMO
Um importante índice para a indústria sucroalcooleira é a produtividade de sacarose em cana-
de-açúcar, que pode ser relacionada à eficiência da planta em acumular sacarose durante a
maturação. Apesar de se conhecer a eficiência de tratamentos como a restrição hídrica e a
aplicação de reguladores para estimular a maturação, é importante para o avanço da tecnologia
de cultivo que se conheça sobre as respostas fisiológicas da planta que conduzem a ela. Durante
a maturação, as relações fonte/dreno são alteradas, ocorrendo aumento do acúmulo de sacarose
nos colmos e a diminuição do crescimento vegetativo. Essas respostas dependem de uma
complexa rede de interações metabólicas, que inclui o metabolismo de sacarose, representado
pela atividade de enzimas como a sacarose fosfato sintase (SPS), a sacarose sintase (SuSy) e as
invertases ácidas e neutras (IVA e IVN); e os hormônios vegetais, como etileno, giberelinas,
ácido abscísico, auxinas e citocininas. Com o objetivo de compreender melhor a fisiologia da
maturação da cana-de-açúcar, foram determinadas como são alteradas as respostas na
assimilação de carbono nas folhas e a produção e armazenamento de sacarose no colmo da
cana-de-açúcar durante a maturação, e qual o papel do etileno na indução e sinalização deste
processo. Foram realizados dois estudos. No primeiro, foram determinadas as principais
alterações fisiológicas que ocorrem durante a maturação, analisando-se respostas na
fotossíntese e no balanço de carboidratos em plantas de duas variedades submetidas a dois
tratamentos indutores de maturação: aplicação de déficit hídrico e de etefom. Concluiu-se que
o efeito do etefom em cana-de-açúcar é genótipo-dependente, estimulando o acúmulo de
sacarose no colmo e o suprimento de fotoassimilados pela fonte na variedade responsiva
(IACSP95-5000). Tais efeitos não são associados à restrição do crescimento. Em relação à
aplicação de etefom em conjunto com a ocorrência de déficit hídrico, o hipotético efeito aditivo
no acúmulo de sacarose no colmo não foi verificado na maturação da cana-de-açúcar. Uma vez
feita esta análise, um segundo estudo analisou o papel do hormônio etileno, princípio ativo do
maturador etefom, na atividade metabólica de síntese de sacarose, na fotossíntese e na
sinalização hormonal da cana-de-açúcar durante a maturação. Concluiu-se que o etileno
aumenta produção e acúmulo de sacarose nos entrenós intermediários dos colmos por estimular
a atividade da SuSy e inibir a atividade de IVA, aumentando assim a concentração de sacarose
nas células parenquimáticas do tecido. Inicialmente, o etileno diminui a assimilação de CO2
fechando os estômatos, mas ao estimular a síntese de sacarose no colmo ele aumenta a força do
viii
dreno, gerando demanda fotossintética que a médio prazo garante o fornecimento de
fotoassimilados para a síntese de sacarose. Em relação às alterações no balanço hormonal,
observou-se que os teores de giberelinas e ácido abscísico aumentam nas folhas e giberelinas e
citocininas aumentam nos colmos em relação ao controle em resposta à aplicação do etefom.
Palavras-chave: etileno; déficit hídrico; fitormônios; fotossíntese; carboidratos; relação
fonte/dreno.
ix
Ripening physiology of sugarcane (Saccharum spp): signaling and control of sucrose
production and storage metabolism
ABSTRACT
An important index for ethanol industry is sucrose productivity in sugarcane, which is related
to plant efficiency to accumulate sucrose during ripening. Despite the efficiency of treatments
such as water restriction and application of regulators to stimulate ripening, it is important for
the advancement of culture technology to understand about physiological responses of the plant
that leads to it. During ripening, the source/sink relations changes, and there is an increase of
sucrose accumulation in culms and reduction in vegetative growth. These responses depend in
a complex network of metabolic interactions including sucrose metabolism, represented by the
activity of enzymes such as sucrose phosphate synthase (SPS), sucrose synthase (SuSy) and
neutral and acidic invertase (IVA and IVN); and plant hormones such as ethylene, gibberellins,
abscisic acid, auxin and cytokinin. In order to better understand the physiology of maturation
of cane sugar, it was determined the responses in carbon assimilation in leaves and the
production and storage of sucrose in culms of sugarcane during ripening, and what is the role
of ethylene in the induction and signaling of this process. Two studies were conducted. In the
first one, were determined the main physiological changes that occur during maturation,
analyzing responses in photosynthesis and plant carbohydrate balance at two varieties
submitted to two ripening induction treatments: water deficit and application of ethephon. It
was concluded that the effect of ethephon in sugarcane is genotype-dependent, stimulating the
sucrose accumulation in the culm and photoassimilates supply by source in the responsive
variety (IACSP95-5000). Such effects are not associated with growth restriction. Regarding the
application of ethephon together with water deficit, the hypothetical additive effect on sucrose
accumulation in the culm was not verified in the ripening of sugarcane. Once made this analysis,
a second study analyzed the role of hormone ethylene, active principle of ethephon, in metabolic
activity of sucrose production, photosynthesis and hormonal signaling during ripening. It was
concluded that ethylene increases sucrose production and accumulation in the intermediate
internodes of the culms by the stimulation of SuSy activity and inhibition of VAI activity,
thereby increasing the concentration of sucrose in parenchyma cells of the tissue. Initially, the
ethylene uptake of CO2 decreases due stomata closure, but the stimulation of sucrose synthesis
in the internodes increases the strength of the sink, generating photosynthetic demands that at
medium term ensures the supply of assimilate to sucrose synthesis. With regard to changes in
hormonal balance, it was observed that the gibberellins and abscisic acid levels increase in the
x
leaves and gibberellins and cytokinins increase in stems compared to the control in response to
the application of etefom.
Keywords: ethylene; water deficit; plant hormones; photosynthesis; carbohydrates; source/sink
relations.
1
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agrícolas brasileiras, tendo um papel
chave na produção de energias renováveis. Além do etanol, utilizado como combustível, a cana-
de-açúcar pode ser fonte de biomassa. Isso sem contar a importância do cultivo para a produção
do açúcar (Waclawosky et al., 2010).
O melhoramento da cana-de-açúcar visa aumentar o número de colmos por hectare, sem
se preocupar diretamente com a capacidade de acúmulo de sacarose nos colmos (Jackson,
2005). A produtividade da cana-de-açúcar está diretamente ligada à capacidade dos colmos das
plantas em produzirem e armazenarem a sacarose. Quanto maior a capacidade da variedade em
armazenar sacarose nas condições de cultivo a que ela está submetida, maior a produtividade
do cultivo (Rodrigues, 1995).
O acúmulo de sacarose nos colmos ocorre, durante o desenvolvimento da cana-de-
açúcar, na fase de maturação. Esta fase pode ser definida como o momento em que a planta
reduz significativamente seu crescimento vegetativo e passa a acumular maior quantidade de
sacarose nos colmos. Os mecanismos fisiológicos que ocorrem na planta durante esta fase ainda
não são completamente conhecidos. A determinação de quais são esses mecanismos e como
eles operam para culminar na maior concentração de sacaroses no colmo é de grande interesse
para oferecer ferramentas para a seleção e desenvolvimento de variedades mais produtivas
(Watt et al., 2014).
Estes mecanismos podem envolver alterações nas relações fonte/dreno na planta, isto é,
na capacidade das células dos colmos (poderosos drenos de fotoassimilados) em produzir e
armazenar sacarose, e na capacidade das folhas de assimilar CO2, produzir e transportar
carboidratos (McCormick et al., 2009).
A sinalização que ocorre para que a cana-de-açúcar diminua seu crescimento vegetativo
e passe a acumular sacarose depende de sinais ambientais, notadamente da restrição hídrica ou
de quedas na temperatura. Isso indica que a transdução desses sinais é importante para o
estabelecimento da maturação, logo os hormônios vegetais devem estar envolvidos no processo
(Yao et al., 2002). Um importante hormônio que parece estar envolvido é o etileno. A aplicação
2
de etefom, um regulador químico que é convertido em etileno quando em contato com o tecido
foliar aumentando a biossíntese autocatalítica de etileno nas células, induz à maturação.
Assim, o objetivo deste trabalho foi compreender melhor a fisiologia da maturação da
cana-de-açúcar, determinando como são alteradas as relações de fonte/dreno, ou seja, quais as
respostas na assimilação de carbono nas folhas e a produção e armazenamento de sacarose nas
células do colmo, e qual o papel do etileno durante esse processo.
Primeiramente, foram determinadas as principais alterações fisiológicas que ocorre
durante a maturação, tendo sido feita a análise de respostas fisiológicas na fotossíntese e
balanço de carboidratos em plantas submetidas à aplicação de déficit hídrico e aplicação de
etefom, visando à indução de maturação. Uma vez feita esta análise, foi estudado o papel do
hormônio etileno, princípio ativo do maturador etefom, na atividade metabólica de síntese de
sacarose, bem como na sinalização hormonal da cana-de-açúcar durante a maturação.
Foram testadas as seguintes hipóteses:
(i) o etefom e o déficit hídrico, enquanto indutores da maturação na cana-de-açúcar,
interferem no balanço fonte/dreno da cana-de-açúcar durante a maturação, diminuindo o
crescimento da planta, afetando a fotossíntese e causando o aumento do armazenamento de
sacarose no colmo;
(ii) por afetarem os mesmos processos fisiológicos, i.e., atividade metabólica da fonte e
do dreno, o déficit hídrico e o etefom apresentam efeitos aditivos na indução da maturação;
(iii) para aumentar o acúmulo de sacarose no colmo o etileno induz diretamente a maior
atividade enzimática de sacarose fosfato sintase (SPS) e sacarose sintase (SuSy) e/ou menor
atividade das invertases;
(iv) A maior demanda por carboidratos decorrente da atividade do colmo estimula o
aumento da fotossíntese;
(v) o metabolismo de açúcares e as relações fonte/dreno alteradas durante a maturação
são respostas sinalizadas por diferenças no balanço hormonal, em que o aumento da
concentração de etileno causada pela sua aplicação exógena leva ao aumento de outros
hormônios envolvidos na maturação.
Os dois estudos realizados e apresentados a seguir na forma de artigos científicos1,
compõem os capítulos deste trabalho. O primeiro trata das repostas fisiológicas no crescimento,
fotossíntese e acúmulo de carboidratos em duas variedades de cana-de-açúcar, com o objetivo
de responder às hipóteses i e ii. O segundo estuda o efeito do etefom, o tratamento mais efetivo
1 Artigos científicos e referências bibliográficas formatados conforme normas da Revista Bragantia.
3
na indução da maturação na variedade mais responsiva segundo observações do primeiro
capítulo, analisando as respostas na fotossíntese, metabolismo de carboidratos e sinalização
hormonal nas plantas tratadas com o maturador, verificando assim as hipóteses iii, iv e v.
Desta forma, será defendida a tese de que a maturação é um processo em que a cana-
de-açúcar aumenta a atividade de produção e acúmulo de sacarose nas células dos colmos,
realizando mais fotossíntese para atender à demanda por fotoassimilados (hipótese i). O etileno
é essencial para esta sinalização, induzindo as plantas à maturação mesmo elas estando
submetidas a déficit hídrico (hipótese ii), ao estimular a atividade de enzimas de produção e
inibir as de quebra de sacarose nos colmos (hipótese iii). Apesar da inicial diminuição da
fotossíntese, ela é recuperada com o passar do tempo, suprindo a demanda gerada pela atividade
de síntese de sacarose no colmo (hipótese iv). Ocorrem também alterações nas outras enzimas
ligadas ao metabolismo do açúcar (sacarose fosfato sintase e invertases neutras) e nas
concentrações de hormônios endógenos, como ABA, giberelinas e citocininas (hipótese v).
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cultivo da Cana-de-açúcar no Brasil
A cana-de-açúcar é uma fonte importante de alimento e bioenergia e um componente
significativo da economia de muitos países nos trópicos e subtrópicos (Waclawosky et al.,
2010). Cerca de 100 países produzem cana-de-açúcar em uma área de 25 milhões de hectares –
aproximadamente 0,5% da área total mundial usada para agricultura (FAO, 2014). No Brasil, o
agronegócio da cana-de-açúcar é responsável por mais de US$ 20 bilhões/ano e é um dos
principais setores geradores de empregos diretos e indiretos. O país produz 39% da cana-de-
açúcar mundial, sendo o maior produtor (642 milhões tons/ano). O Estado de São Paulo é o
mais importante produtor de açúcar e etanol a partir da cana-de-açúcar, com cerca de 56%
produção nacional na safra 2014-2015 (CONAB, 2014).
O setor açucareiro nacional é suportado pela disponibilidade de variedades de cana-de-
açúcar adaptadas às diferentes condições de cultivo e pela bem estruturada e altamente
tecnológica indústria de etanol, além de condições ambientais favoráveis (Ortolan, 2006). Um
importante índice para a indústria sucroalcooleira é a produtividade de sacarose, que varia de
acordo com a espécie e a variedade de cana-de-açúcar (Landell, 2004; Landell et al., 2006; Watt
et al., 2014). Desde que foram estabelecidos, os programas de melhoramento da cana-de-açúcar
tinham como objetivo produzir mais açúcar por meio do aumento da produção de plantas por
hectare, com pouca ou nenhuma mudança na concentração de sacarose em cada colmo
(Jackson, 2005). Técnicas que visem o desenvolvimento de variedades com maior concentração
de sacarose nos colmos incrementarão a produtividade industrial, uma vez que será obtida mais
sacarose por massa fresca de colmos transportados e processados (Rodrigues, 1995).
Plantas de cana-de-açúcar passam a acumular sacarose quando cessam seu crescimento
vegetativo, num processo denominado maturação. Este processo ocorre de forma natural, em
reposta a condições climáticas (déficit hídrico e frio) que levam a planta à condição de estresse.
Mas ele também pode ser induzido através do uso de maturadores, que são reguladores vegetais
que retardam o crescimento vegetativo da planta (Rodrigues, 1995). A utilização de
maturadores na cultura da cana-de-açúcar permite o manejo da cultura em seu moderno sistema
de produção, tendo como objetivo aumentar a produtividade e antecipar o corte quando aplicado
no início da safra ou prolongar o período de produção, quando aplicado em final de safra (Viana
et al, 2007).
5
Em geral, os estudos de uso de maturadores são dirigidos para respostas de aplicação
(Donaldson & Van Staden, 1995; Moore & Maretzki, 1996; Robertson & Donaldson, 1998;
Caputo et al., 2008; Leite et al., 2010, 2011), sendo que pouco se sabe sobre as importantes
alterações fisiológicas que ocorrem nas plantas e que levam à maturação na cana-de-açúcar.
(Gronwald, 1991; Inman-Bamber & Smith, 2005; Chong et al., 2010; Wang et al., 2013a,b). A
determinação de quais são esses mecanismos e como eles operam para culminar na maior
concentração de sacaroses no colmo é de grande interesse para oferecer ferramentas, como por
exemplo melhoramento de genes específicos de enzimas e cofatores envolvidos na fisiologia
da maturação, para a seleção e desenvolvimento de variedades mais produtivas por acumularem
mais sacarose no colmo em menor espaço de tempo e com menor comprometimento do
crescimento vegetativo.
2.2 Maturação e Acúmulo de Sacarose em Cana-de-açúcar
O processo de maturação da cana-de-açúcar pode ser definido como o processo
fisiológico que envolve a formação de açúcares nas folhas e seu transporte e armazenamento
no colmo (Watt et al., 2014). O colmo é composto por uma sucessão de internódios em
diferentes estágios fisiológicos, e é nesses internódios que se acumula grande quantidade de
sacarose em condições favoráveis à maturação. Os internódios imaturos, localizados na região
apical do colmo, apresentam folhas verdes, são fibrosos, com alta concentração de hexoses e
baixa concentração de sacarose. Em um colmo maduro, próximo à base da planta, todo o
internódio tem concentração semelhante de sacarose. A taxa de acúmulo de sacarose é maior
durante a última fase do ciclo da cultura, quando os colmos têm pequena taxa de crescimento,
coincidindo com períodos de restrições induzidas pelo clima que levam à maturação (Watt et
al., 2014).
O clima influencia no desenvolvimento da planta e, consequentemente, na produção de
sacarose da cana-de-açúcar. O clima ideal é aquele com duas estações distintas: uma quente e
úmida para proporcionar a germinação, perfilhamento e desenvolvimento vegetativo, seguido
de outra fria e seca, para promover a maturação natural (Caputo et al., 2008). O crescimento
vegetativo ótimo ocorre em temperaturas entre 28 e 34ºC, enquanto a maturação natural exige
temperaturas abaixo de 21ºC e/ou déficit hídrico, fazendo com que o fotoassimilado (sacarose)
necessário para a expansão dos tecidos da planta seja desviado para armazenamento nos colmos,
restringindo o crescimento vegetativo (Moore & Maretzki, 1996; Andrade, 2006). O processo
de maturação da cana-de-açúcar na Região Sudeste do Brasil ocorre naturalmente a partir de
6
abril/maio com clímax em agosto/setembro, período caracterizado pela gradativa queda de
temperatura e diminuição das precipitações pluviais.
Muitos produtores utilizam a limitação de hidratação no período pré-colheita para
aumentar a concentração de sacarose no colmo (Inman-Bamber & Smith, 2005), aumentando
em até 18% o conteúdo de sacarose nos colmos (Robertson & Donaldson, 1998). No entanto,
essa técnica só pode ser utilizada em locais como em regiões da África do Sul, Austrália,
Suazilândia e Sudão, onde há longos períodos de seca, de modo que o cultivo da cana-de-açúcar
depende de irrigação para que haja o crescimento vegetativo das plantas (Inman-Bamber &
Smith, 2005). Na região sudeste do Brasil, a irrigação é utilizada apenas para fornecimento de
água em períodos de seca eventual; para a maturação, ocorrem naturalmente períodos de frio e
seca no inverno, sendo inviável o manejo da safra pelo controle de irrigação. Como a partição
de matéria seca pode ser alterada por reguladores químicos de maneira similar a causada pelo
déficit hídrico e frio (Inman-Bamber & Smith, 2005), uma alternativa para controlar e otimizar
a maturação, e consequentemente a produção e colheita da cana-de-açúcar, é a aplicação
exógena dessas substâncias químicas indutoras de maturação.
2.3 Reguladores Vegetais e o Acúmulo de Sacarose na Cana-de-açúcar
Reguladores vegetais são definidos como substâncias aplicadas exogenamente e que
possuem efeito fisiológico similar aos grupos de hormônios conhecidos. A classe de
reguladores vegetais chamada de maturadores refere-se a compostos químicos capazes de
modificar a morfologia e a fisiologia vegetal, com a propriedade de paralisar e/ou retardar o
desenvolvimento vegetativo da planta, induzindo a translocação e armazenamento dos
açúcares, principalmente sacarose (Leite et al., 2011). O emprego de maturadores químicos
destaca-se como ferramenta importante no cultivo de cana-de-açúcar, promovendo melhorias
na qualidade da matéria-prima, otimizando resultados agroindustriais/econômicos e auxiliando
no planejamento da safra (Caputo et al., 2008). Os maturadores mais utilizados são glifosato,
etil-trinexapac, sulfometuron-metil e etefom (Caputo et al., 2008; Leite et al., 2011).
O etefom, comercialmente conhecido como Ethrel® (Bayer Crop Science, Leverkusen,
Alemanha) é aplicado via foliar. É mantido estável através de pH menor ou igual a 3,5, perdendo
essa estabilidade no contato com o tecido vegetal (pH próximo a neutralidade). Isso causa a
liberação de etileno gasoso, o qual se difunde no tecido vegetal. Como consequência da maior
concentração de etileno na planta, ocorre a diminuição do alongamento dos entrenós imaturos
(Stewart & Freebairn, 1969; Yao et al., 2002; Li & Solomon, 2003).
7
O emprego de etefom antecipa a colheita de cana-de-açúcar em pelo menos 21 dias, com
diferentes respostas dependendo do genótipo (Caputo et al., 2008). Ele atua de forma eficiente
ao retardar o processo de crescimento em altura das plantas de cana-de-açúcar, sem ocasionar
alteração no diâmetro dos colmos, levando à melhoria na qualidade tecnológica da matéria-
prima (Leite et al., 2011).
Deste modo, está bem determinada na literatura a importância do controle e otimização
do processo de maturação em cana-de-açúcar, bem como a eficiência do uso de maturadores
químicos como o etefom no controle e acréscimo de produção de sacarose. Porém, pouco se
conhece sobre os processos fisiológicos que levam a cana-de-açúcar a acumular mais sacarose
nos colmos durante este processo. Sabe-se que compostos que estimulam a produção de etileno
induzem plantas jovens de cana-de-açúcar à maior concentração de sacarose nos colmos, bem
como estimulam a fotossíntese nas folhas (Chong et al., 2009). Eles também aumentam a
atividade de enzimas relacionadas à síntese de sacarose nos colmos (Wang et al., 2013).
Existem alguns trabalhos em outras espécies, que relacionam a fotossíntese, o metabolismo de
açúcares (Pinheiro & Chaves, 2011), e o balanço hormonal (Zhang & Tardieu, 1996; Veselova
et al., 2005) que ocorrem na planta em resposta a estímulos naturais da maturação como o déficit
hídrico e frio.
2.4 Fisiologia da Maturação: Metabolismo de Açúcares e Balanço Hormonal
A maturação da cana-de-açúcar envolve um sistema metabólico que se inicia com a
atividade fotossintética nos cloroplastos das células foliares, culminando com o acúmulo de
carboidratos fotossintetizados, principalmente sacarose, nos colmos (Leite et al, 2010). As
células do parênquima e o espaço intercelular dos colmos, onde ocorre o acúmulo de sacarose
durante a maturação, são poderosos drenos regulados pelo metabolismo de produção e alocação
de açúcares e de alta prioridade na alocação de fotoassimilados produzidos nas fontes, as folhas
(McCormick et al., 2006).
As relações fonte/dreno na planta estão relacionadas à produção e alocação do carbono
nos diferentes tecidos vegetais. As fontes são os locais que produzem (tecidos
fotossinteticamente ativos) ou armazenam (tubérculos, colmos) compostos de carbono para
serem distribuídos via sistema vascular para outros tecidos, que são os drenos de compostos de
carbono. Os drenos podem incluir regiões em divisão e expansão celular, tecidos reprodutivos
em formação, ou tecidos de armazenamento em fase de carregamento. A demanda do dreno
pode afetar a atividade da fonte, indicando que o controle do sistema de sinalização é muito
8
importante no processo de translocação de compostos de carbono (Hatch & Glasziou, 1963;
McCormick et al., 2006). Na cana-de-açúcar, um bom entendimento dos mecanismos
fonte/dreno pode levar ao aumento na produtividade de sacarose, ao passo que a compreensão
equivocada de respostas de maturação pode levar a perdas. (Inman-Bamber & Smith, 2005).
Sob estresse, alterações no metabolismo de carbono ocorrem em diferentes órgãos e a
regulação fina desse processo é desconhecida (António et al., 2008; Pinheiro & Chaves, 2011).
Os açúcares solúveis (sacarose e hexoses) e os hormônios vegetais são considerados sinais
metabólicos fundamentais entre o ambiente e as respostas celulares nas plantas, agindo como
substratos e moduladores de atividades enzimáticas e controlando a expressão de diferentes
genes relacionados ao metabolismo de carbono. As relações entre alterações ambientais e as
mudanças fisiológicas são frentes dos atuais esforços em pesquisa (Paul & Pellny, 2003; Couée
et al., 2006; Bolouri-Moghaddam et al., 2010).
Um dos principais fatores limitantes no processo de acúmulo de sacarose é a relação
entre assimilação de carbono (fotossíntese) e síntese e translocação de sacarose (Wang et al.,
2013b; Figura 1). A produtividade de sacarose está diretamente relacionada à produção de
fotoassimilados, processo aumentado pela otimização da interceptação e/ou alta eficiência de
conversão de energia solar (Singels et al., 2005). Enzimas citosólicas como sacarose fosfato
sintase (SPS) e sacarose sintase (SuSy) catalisam a síntese de sacarose e parecem exercer
influência no fluxo de açúcares (Huber & Huber, 1996; Batta et al., 2011). Foi observado,
somente na fonte (folha), que a atividade da SPS é altamente correlacionada com o conteúdo
de sacarose em diversas variedades de cana-de-açúcar (Grof & Campbell, 2001). Por outro lado,
enzimas que catalisam a quebra e remobilização de sacarose, como as invertases ácidas (IVA)
e neutras (IVN) podem comprometer o acúmulo de sacarose nos vacúolos das células
parenquimáticas do colmo (Jain et al., 2013).
Drenos com alta capacidade de armazenamento e ativos por um longo período têm o
potencial de aumentar a atividade fotossintética em plantas de cana-de-açúcar através de
mudanças na atividade de enzimas e na expressão genética (McCornick et al., 2006). O oposto
também é verdade, i.e., drenos menos ativos causam acúmulo de açúcar nas folhas e modificam
o metabolismo da fonte, levando a diminuição na fotossíntese (Paul & Pellny, 2003). Foi
demonstrado que a capacidade de transporte do fotoassimilado não limita a alocação de
açúcares, a não ser em condições extremas de déficit hídrico ou frio (Wardlaw, 1990; Lawlor,
1995). Logo, a força do dreno (tamanho e quantidade de entrenós) é que regula a produtividade
de sacarose, afetando a fotossíntese da cana-de-açúcar. A capacidade de acúmulo dos
9
compostos de carbono produzidos nas folhas é definida geneticamente, sendo um importante
parâmetro discriminatório do potencial produtivo das diferentes variedades (Rodrigues, 1995).
Figura 1. Diagrama de processos para o movimento de sacarose e metabolismo da cana-
de-açúcar desde a síntese nas fontes (folhas) até sua deposição nos colmos (Wang et al.,
2013b). O movimento de sacarose é mostrado com flechas verdes, e seu metabolismo subsequente e compartimentação com flechas negras. Os transportadores são mostrados com círculos azuis, a parede celular designada com o círculo cinza maior, e o vacúolo é mostrado em laranja. A sacarose é sintetizada nas folhas, translocada no floema para as células parenquimáticas do colmo. Dentro da célula ela pode ser movida inalterada para o armazenamento, mas a transferência apoplástica pode envolver a hidrólise da sacarose em hexoses pelas invertases ácidas (IVA) da parede celular. Tanto as hexoses como a sacarose entram nas células do parênquima pelos transportadores. Hexoses podem também ser formadas da sacarose dentro das células pelas invertases neutras (IVN) no citoplasma ou pelas invertases ácidas do vacúolo. A sacarose é armazenada tanto no vacúolo quanto no espaço intercelular. O suplemento interno de sacarose e seu particionamento para drenos concorrentes também envolve o balanço entre UDP-glu (UDP-glicose), um precursor da biossíntese da parede celular. As reações chave incluem as reações reversíveis da SuSy (sacarose sintase) e da SPS (sacarose fosfato sintase), todas tendo papéis centrais no armazenamento de sacarose nas células.
10
Processos enzimáticos relacionados à quebra de sacarose nos tecidos do caule (drenos)
também são essenciais para a determinação da produtividade de sacarose na cana-de-açúcar. A
sacarose é hidrolisada por pelo menos três diferentes isoformas de invertases: uma ativa em pH
neutro no tecido maduro, observada e purificada na cana-de-açúcar; e duas ativas em pH ácido
e caracterizadas em diferentes espécies vegetais: as invertases ácidas localizadas nos vacúolos
e as invertases ácidas localizadas no apoplasto, também conhecidas como invertases de parede
celular (Batta et al., 2011).
O mecanismo de acúmulo de sacarose em tecidos maduros e imaturos do ponto de vista
fisiológico é o mesmo, diferindo nesses tecidos em função de reguladores de crescimento e da
ação das invertases. Nos tecidos imaturos, onde predomina a rápida expansão celular, a sacarose
acumulada é rapidamente hidrolisada pelas invertases ácidas, movendo rapidamente as hexoses
resultantes para o citoplasma, onde são utilizadas no crescimento e desenvolvimento celular.
Nas plantas em fase de maturação ocorre aumento da ação de invertases neutras e a baixa
atividade de invertases ácidas indica que está ocorrendo acúmulo efetivo de sacarose (Jain et
al., 2013).
A produção e a atividade destas enzimas, especialmente das invertases, parecem ser
diretamente reguladas por pelo menos dois hormônios endógenos, auxina (AIA) e ácido
abscísico (ABA) (Alexander, 1973; Pinheiro & Chaves, 2011). Quando submetidas ao déficit
hídrico, as plantas aumentam o conteúdo de ABA sintetizado nas raízes. Esta molécula é um
importante mensageiro na sinalização das plantas, causando fechamento estomático e evitando
a perda de água (Zhang & Tardieu, 1996). Sinalização similar é encontrada em plantas
submetidas a baixas temperaturas (Wan et al., 2004; Veselova et al., 2005). Outras substâncias
de crescimento também estão envolvidas na comunicação raiz-parte aérea como as auxinas e
citocininas (Bano et al., 1993; Vysotskaya et al., 2001; Huang et al., 2008; Jain et al., 2013).
Em menor escala, os açúcares também parecem estar envolvidos na sinalização desses
hormônios (Pinheiro & Chaves, 2011).
Apesar dos impressionantes avanços feitos na última década a respeito da natureza dos
eventos que ocorrem em plantas sujeitas ao estresse, principalmente hídrico, ainda falta uma
visão integrativa da sua regulação metabólica (Rolland et al., 2006; Shinozaki & Yamagushi-
Shinozaki, 2007). Como adequadamente apontado por Hanson & Smeekens (2009), a pesquisa
em sinalização e controle do metabolismo de açúcares apresentará novas oportunidades para a
melhoria nas culturas por atuar nas respostas estratégicas das plantas ao estresse e nas relações
de fonte/dreno, fatores determinantes em cana-de-açúcar para o acúmulo e produtividade de
sacarose nos colmos.
11
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15
CAPÍTULO II
VARIAÇÃO DA FOTOSSÍNTESE E DOS TEORES DE CARBOIDRATOS
INDUZIDOS POR ETEFOM E DÉFICIT HÍDRICO NA FASE DE MATURAÇÃO DA
CANA-DE-AÇÚCAR
RESUMO
Um importante índice para a indústria sucroalcooleira é a produtividade de sacarose em cana-
de-açúcar, que pode ser relacionada à capacidade da planta em acumular sacarose durante a
maturação. Apesar de se conhecer a eficiência de tratamentos como a restrição hídrica e a
aplicação de reguladores para estimular o acúmulo de sacarose nos colmos, pouco se conhece
sobre as respostas fisiológicas da planta que levam à maturação. Nesse contexto, o objetivo
deste estudo foi avaliar as respostas fisiológicas da cana-de-açúcar a diferentes tratamentos
indutores de maturação e, assim, compreender melhor a fisiologia deste processo. Duas
variedades, a IACSP95-5000, de alta produtividade e a IACSP94-2094, de produtividade
moderada, foram submetidas ao déficit hídrico, à aplicação de regulador químico (etefom 480
g ha-1) e aos dois tratamentos associados. Foram medidos o crescimento, a concentração de
carboidratos em folhas e colmos e as trocas gasosas. Concluiu-se que o efeito do etefom em
cana-de-açúcar é genótipo-dependente, estimulando o acúmulo de sacarose no colmo e o
suprimento de fotoassimilados pela fonte na variedade responsiva (IACSP95-5000). Tais
efeitos não são associados à restrição do crescimento. Em relação à aplicação dos tratamentos
de déficit hídrico e etefom associados, a variedade responsiva apresenta aumento no teor de
sacarose no colmo nos mesmos níveis apresentados quando apenas etefom é aplicado, de modo
que os tratamentos não apresentam efeitos aditivos na maturação da cana-de-açúcar.
Palavras-chave: Saccharum spp; relações fonte-dreno; sacarose; reguladores vegetais.
16
1. INTRODUÇÃO
Um importante índice para a indústria sucroalcooleira é a produtividade de sacarose em
cana-de-açúcar, que varia de acordo com a variedade (Watt et al., 2014). Os programas de
melhoramento da cana-de-açúcar promoveram nas últimas décadas aumento significativo na
produção de sacarose através da maior quantidade de colmos por hectare, com pouca ou
nenhuma mudança na concentração do açúcar no colmo (Jackson, 2005). A principal etapa do
desenvolvimento das plantas que está envolvida com o acúmulo de sacarose é a maturação,
processo fisiológico que envolve a formação de açúcares nas folhas e seu deslocamento e
armazenamento no colmo (Watt et al., 2014), quando as plantas praticamente cessam o
crescimento vegetativo. Por sua vez, a produção e o transporte de fotoassimilados nas plantas
são regulados pela atividade fotossintética e pela força do dreno (Wardlaw & Moncur, 1976).
Fatores como o clima e a disponibilidade de água influenciam decisivamente no
desenvolvimento da planta e, consequentemente, na produção de sacarose pela cana-de-açúcar.
O clima ideal é aquele com duas estações distintas: uma quente e úmida para proporcionar a
germinação, perfilhamento e desenvolvimento vegetativo, seguido de outra fria e seca para
promover a maturação natural (Moore & Maretzki, 1996; Caputo et al., 2008). Devido à
necessidade de restrição hídrica para a maturação, a suspensão de rega em cultivos dependentes
de irrigação é realizada na pré-colheita para aumentar a concentração de sacarose no colmo
(Donaldson & Van Staden, 1995; Inman-Bamber & Smith, 2005), técnica que aumenta em até
18% o rendimento de sacarose (Robertson & Donaldson, 1998). O déficit hídrico interfere
negativamente na fotossíntese e no crescimento vegetativo da planta, sendo o crescimento
afetado pela restrição hídrica antes mesmo de alterações significativas na fotossíntese (Inman-
Bamber et al., 2002). Assim, o déficit hídrico moderado beneficia a maturação uma vez que a
competição entre os drenos da planta por fotoassimilados é reduzida pela restrição do
crescimento.
Uma alternativa para controlar e otimizar a maturação, e consequentemente a produção
e a colheita da cana-de-açúcar, é a aplicação exógena de substâncias químicas indutoras de
maturação. Uma destas substâncias é o ácido 2-cloroetilfosfônico (etefom) que ao entrar em
contato com o tecido foliar libera etileno, estimulando a produção desse hormônio pelas plantas
e aumentando assim a sua concentração endógena. O etileno está envolvido na resposta a
diferentes tipos de estresses (Yang & Hoffman, 1987), atuando na maturação de tecidos,
germinação de sementes, na senescência e causando abscisão foliar e variação no grau de
abertura estomática (Pallas & Kays, 1982; Abeles et al., 1992). Na cana-de-açúcar, o etileno
17
está associado também à diminuição do crescimento de entrenós imaturos (Stewart & Freebairn,
1969; Li & Solomon, 2003) e ao acúmulo de sacarose (Chong et al., 2010). O etefom também
estimula o acúmulo de sacarose nos colmos por interferir na atividade de enzimas envolvidas
na síntese de açúcar (Wang et al., 2013), aumentando assim a demanda do dreno por
fotoassimilados.
Donaldson & Van Staden (1995) observaram que a imposição do déficit hídrico
associada à aplicação de maturadores não causou aumento na concentração de sacarose nos
colmos de cana-de-açúcar quando comparado aos tratamentos realizados separadamente. Essa
resposta poderia ser explicada pelo fato de ambos os tratamentos induzirem respostas
fisiológicas semelhantes, já que a diminuição do crescimento induzida pelo etileno e a restrição
hídrica permitiriam o direcionamento do carbono assimilado na fotossíntese para os colmos
(Kaitaniemi & Honkanem, 1996). Alternativamente, as plantas poderiam não acumular mais
sacarose quando tratadas com maturador e submetidas ao déficit hídrico porque o limite
biológico de acúmulo de sacarose teria sido alcançado.
A manutenção da assimilação de carbono tem papel fundamental no processo de
maturação, fornecendo o substrato para a síntese e armazenamento de sacarose nos colmos. Em
geral, os estudos de maturação na cana-de-açúcar se concentram na avaliação do acúmulo de
sacarose nos colmos em função da aplicação de maturadores (Robertson & Donaldson, 1998;
Li & Solomon, 2003; Caputo et al., 2008; Leite et al., 2011), sendo poucas as pesquisas que
avançam na compreensão dos processos fisiológicos afetados (Gronwald, 1991; Chong et al.,
2010; Jain et al., 2013). Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as respostas
fisiológicas da cana-de-açúcar a diferentes tratamentos indutores de maturação e, assim,
compreender melhor a fisiologia deste processo. Para isso, foram testadas as seguintes
hipóteses: (i) o etefom interfere no balanço fonte-dreno da cana-de-açúcar durante a maturação,
diminuindo o crescimento da planta sem alterar a fotossíntese e aumentando assim o
armazenamento de sacarose no colmo; e (ii) por afetarem processos fisiológicos diferentes, o
déficit hídrico e o etefom apresentam efeitos aditivos na indução da maturação.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material Vegetal
Foram utilizadas plantas com dez meses de idade de duas variedades comerciais de
cana-de-açúcar (Saccharum spp.) com diferentes produtividades e resiliências frente a
18
limitações ambientais. Enquanto a IACSP95-5000 apresenta alta produtividade agrícola e é
indicada para ambientes favoráveis (Landell et al., 2007), a IACSP94-2094 apresenta menor
produtividade e é indicada para ambientes restritivos (Ribeiro et al., 2013). As plantas foram
obtidas a partir de mini-toletes das variedades, que foram germinados em bandejas contendo
substrato comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz, RS, Brasil).
2.2 Desenho Experimental
O experimento foi conduzido em casa de vegetação, sendo os tratamentos aplicados no
mês de abril para minimizar o efeito da baixa temperatura do ar como indutor de maturação nas
plantas. A altura da casa-de-vegetação varia de 2,5 a 4 m e as laterais são abertas de tal forma
que há renovação contínua do ar em seu interior. As mudas foram plantadas em 16 tanques de
alvenaria (oito para cada variedade) de 2 m2 de área (4,0 x 0,5 m) e capacidade de 1,54 m3. As
plantas foram conduzidas apenas com o colmo primário, sendo retirados todos os perfilhos
desde o plantio até o fim do experimento. Os tanques continham como substrato terra, analisada
quanto à composição nutricional e adubada seguindo as recomendações de Van Raij et. al.
(1996). Cada tanque continha 15 plantas da mesma variedade, as quais foram submetidas a um
dos tratamentos descritos a seguir: controle (C); déficit hídrico (DH); aplicação de etefom (EN);
e déficit hídrico + aplicação de etefom (DH+EN). Cada tratamento foi induzido em quatro
tanques, dois para cada variedade.
O etefom (Ethrel®, Bayer Crop Science, Leverkusen, Alemanha) foi aplicado no mesmo
dia do início da restrição hídrica, no final da tarde. Utilizou-se um pulverizador costal
automático pressurizado modelo 16L Jett (Sanmaq, São Leopoldo, RS, Brasil) com barra de
três bicos TP8002VK, sendo a pulverização realizada durante 80 s com pressão nominal
máxima de 20 bar e vazão total de 420 mL min-1. A dose aplicada foi equivalente a 480 g ha-1,
concentração recomendada pelo fabricante e aplicada em cultivos comerciais. Para evitar
contaminação entre os tratamentos com e sem o regulador, as plantas foram separadas por lonas
plásticas durante a aplicação e nos dias subsequentes. Os tratamentos que não receberam etefom
foram pulverizados com água e surfactante na concentração 1 mL L-1 (Haiten®, Arysta
Lifescience, Salto de Pirapora, SP, Brasil), utilizados para a preparação da solução de etefom.
O déficit hídrico foi promovido pela diminuição progressiva da rega, sendo a umidade
do substrato monitorada até chegar a 50% da capacidade máxima de armazenamento de água,
o que ocorreu após 23 dias (Figura 1). Nesse momento, a rega foi retomada para a recuperação
das plantas. A umidade do substrato foi monitorada pelo método gravimétrico e o potencial
19
total da água no substrato (Ψ) determinado com um medidor de umidade do solo (WaterMark®
200SS, Irrometer, Riverside, CA, EUA).
Figura 1. Potencial total da água no substrato (Ψ) durante o período experimental. A redução da rega foi iniciada no dia 0. Setas no eixo x indicam os dias em que foram feitas medidas de trocas gasosas. Cada ponto representa a média de 8 repetições ± desvio-padrão.
2.3 Avaliações Biométricas
Após 30 dias de tratamento, a área foliar foi avaliada com um planímetro (LI-3100C,
Li-Cor, Lincoln, NE, EUA), sendo as folhas contadas e pesadas para a determinação da massa
fresca. Nessa mesma ocasião, os colmos foram colhidos e pesados. Sub-amostras de folhas e
colmos foram secas em estufa (60 ºC) até atingirem massa constante e assim foi determinada a
massa seca. Essas sub-amostras foram utilizadas para calcular o índice de umidade dos tecidos
[(MF - MS) x MF-1], usado para estimar a massa seca total das plantas a partir da massa fresca
avaliada.
O acúmulo de massa seca no colmo e nas folhas foi avaliado com medidas realizadas
no início e no fim do período experimental. Essa diferença foi dividida pelo período (30 dias),
obtendo-se a variação diária de massa seca de folhas, colmo e total (folhas+colmo).
2.4 Trocas Gasosas
As trocas gasosas foram avaliadas na folha +3 (terceira folha com a lígula aparente) aos
1, 2, 5, 15, 23 e 30 dias de tratamento. A assimilação de CO2 (Pn) foi avaliada com um
Tempo (dias)
0 5 10 15 20 25 30
m (
kP
a)
-180
-150
-120
-90
-60
-30
0
ControleDéficit hídrico
20
analisador de gases por infravermelho (LI-6400, Li-Cor, Lincoln, NE, EUA). As medidas foram
realizadas sob concentração constante de CO2 no ar (400 µmol mol-1), radiação
fotossinteticamente ativa (RFA) de 2000 µmol m-2 s-1 e variação natural da temperatura e
umidade relativa do ar (Figura 2), entre 13h00 e 15h00. A RFA foi medida com um quantômetro
modelo LI-190 (Li-Cor, Lincoln, NE, EUA) e a temperatura e umidade do ar foram registradas
continuamente durante todo o período experimental com um sistema de aquisição de dados
modelo LI-1400 (Li-Cor, Lincoln, NE, EUA). Posteriormente, os dados de Pn foram integrados
ao longo do período experimental considerando-se a média de 12 h de fotoperíodo para estimar
o total de CO2 assimilado pelas plantas durante os 30 dias (Pni), conforme descrito por Ribeiro
et al. (2013).
Figura 2. Temperatura do ar (Tar) mínima, média e máxima, umidade relativa do ar mínima (URmin) e radiação fotossinteticamente ativa total (RFAt) na casa de vegetação durante o período experimental. Os tratamentos foram iniciados no dia 0. Setas no eixo x indicam os dias em que foram feitas medidas de fotossíntese.
21
2.5 Concentração de Carboidratos
A concentração de carboidratos foi determinada em amostras secas de folhas +2 e de
colmo (entrenós 2, 6 e 10) coletadas após 30 dias de tratamento. Para a determinação dos
açúcares solúveis totais (AST), as amostras foram extraídas em solução
metanol:clorofórmio:água (Bieleski & Turner, 1966) e quantificadas pelo método fenol-
sulfúrico (Dubois et al., 1956), utilizando-se glicose como padrão. A concentração de sacarose
(SAC) foi determinada pelo método descrito por Van Handel (1968) e a dosagem feita pelo
método fenol-sulfúrico, utilizando sacarose como padrão. A concentração de açúcares redutores
(AR) foi estimada como AR=AST–SAC. A quantificação de amido nas folhas foi feita
utilizando-se o método enzimático descrito por Amaral et al. (2007).
2.6 Análise Estatística
O delineamento experimental foi em blocos casualizados, em parcelas subdivididas,
com quatro repetições (plantas) por tratamento para cada variedade. Os fatores de variação
foram as variedades, as condições hídricas e a aplicação de maturador. Os resultados foram
analisados estatisticamente através de análise de variância e quando houve diferença
significativa, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p≤0,05).
3. RESULTADOS
Durante o período experimental a restrição hídrica causou progressiva diminuição no
potencial matricial da terra, chegando ao mínimo observado de -159,3 kPa no 23º dia (Figura
1). A temperatura média diária variou entre 18,3 e 24,7 ºC, com mínima de 12,5 ºC no 12o dia
de experimento e máxima de 32,7 ºC no 30º dia (Figura 2a). A umidade relativa mínima
observada no período variou de 34% a 87%, com tendência de queda a partir do 11º dia após o
início do experimento (Figura 2b). Neste mesmo dia a RFA total apresentou tendência de
aumento, chegando a 20,4 mol m-2 d-1 no 25º dia (Figura 2c).
22
Em relação ao controle, o tratamento EN aumentou o crescimento de IACSP95-5000,
sendo determinado pelo aumento da massa seca na parte aérea (Figura 3a). Já o tratamento
DH+EN causou diminuição do acúmulo de massa, principalmente em função de uma
significativa diminuição da massa seca foliar total (Figura 3a,b). Em IACSP94-2094, o
tratamento DH causou diminuição do acúmulo de massa seca devido ao menor acúmulo de
massa seca nas folhas (Figura 3a,c) e o tratamento DH+EN causou diminuição do crescimento
em relação ao controle (Figura 3a) motivado pelo menor acúmulo de massa nos colmos e
diminuição significativa da massa seca foliar (Figura 3a,c).
Figura 3. Variação da massa seca da parte aérea (ΔMSPA, em a) e do colmo (ΔMSC, em b,c) e folha (ΔMSF, em b,c) de IACSP95-5000 (b) e IACSP94-2094 (c) submetidas aos seguintes tratamentos: controle; déficit hídrico (DH); etileno (EN, aplicação de etefom 480 g ha -1); DH+EN = combinação dos tratamentos DH e EN. Valores médios de três repetições. Em a, as letras diferentes indicam efeito significativo dos tratamentos dentro de cada variedade. Em b e c, letras maiúsculas diferentes indicam efeito significativo dos tratamentos nos colmos e letras minúsculas nas folhas, pelo teste de Tukey (p<0,05).
23
Houve aumento na assimilação total de CO2 de IACSP95-5000 no tratamento EN, sendo
reduzida no tratamento DH (Figura 4a). Quando as plantas foram submetidas ao tratamento
DH+EN, não houve diminuição de Pni em relação ao controle (Figura 4a). Em IACSP94-2094,
Pni foi reduzida nos tratamentos DH e DH+EN quando comparados ao controle e o tratamento
EN não afetou Pni i (Figura 4b). Os tratamentos DH e DH+EN causaram redução da área foliar
total ao final do experimento nas duas variedades (Figura 4c,d).
Figura 4. Assimilação total de CO2 (Pni) durante o período experimental (a,b) e área foliar total média (AF) de cada planta (c,d) em IACSP95-5000 e IACSP94-2094 submetidas aos seguintes tratamentos: Controle; DH = déficit hídrico; EN = etileno, com aplicação de etefom (480 g ha-
1); DH+EN= combinação dos tratamentos DH e EN. Cada coluna representa a média de quatro repetições ± desvio-padrão. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
A concentração de carboidratos nos colmos e folhas também foi afetado pelos
tratamentos (Figura 5). No colmo de IACSP95-5000, os tratamentos EN e DH+EN causaram
maior teor de sacarose, sem alterar a concentração de açúcares redutores nas plantas. Quando
comparado ao controle, o tratamento DH causou redução tanto do teor de sacarose como de
24
açúcares redutores nos colmos (Figura 5a). Os tratamentos DH e DH+EN causaram diminuição
nas concentrações foliares de amido em IACSP95-5000, sem afetar os teores de sacarose e
açúcares redutores (Figura 5b). Nos colmos da IACSP94-2094, os tratamentos DH e DH+EN
reduziram a concentração de sacarose se comparados ao controle, com os teores de açúcares
redutores permanecendo estáveis (Figura 5c). Nas folhas da IACSP94-2094, o teor de sacarose
foi reduzido no tratamento EN, sendo ainda mais afetado nos tratamentos DH e DH+EN (Figura
5d). O teor de amido na folha em IACSP94-2094 foi reduzido pelos tratamentos DH e DH+EN,
com o teor de açúcares redutores diminuindo apenas nas plantas do tratamento DH (Figura 5d).
Antes da aplicação dos tratamentos, a concentração de sacarose nos colmos das variedades
IACSP95-5000 e IACSP94-2094 era de 216,7±4,8 e 228,0±9,3 mg (g MF)-1, respectivamente.
Como esses valores eram similares, as diferenças nas concentrações de sacarose observadas
após 30 dias de tratamento refletem o acúmulo de sacarose durante o período estudado.
Figura 5. Concentração de sacarose, açúcares redutores e amido em colmos (a,c) e folhas (b,d) de IACSP95-5000 (a,b) e IACSP94-2094 (c,d) submetidas a diferentes tratamentos indutores de maturação: controle; déficit hídrico (DH); etileno (EN, com aplicação de etefom 480 g ha -
1); DH+EN = combinação dos tratamentos DH e EN. Cada coluna representa a média de quatro repetições ± desvio-padrão. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05).
25
4. DISCUSSÃO
Sob o efeito do etefom, houve acúmulo de massa seca nos colmos de IACSP95-5000
(Figura 3b) e aumento da assimilação total de carbono (Figura 4a). A maior fotossíntese pode
estar associada à maior demanda por carbono pelos colmos. De fato, o colmo é um dreno de
alta prioridade na alocação de fotoassimilados (Pammenter & Allison, 2002) e a atividade dos
drenos na cana-de-açúcar regula a atividade da fonte (Inman-Bamber et al., 2011). Deste modo,
o etefom parece ter estimulado o crescimento do colmo (Figura 3b), que passou a acumular
mais sacarose (Figura 5a). Esse aumento da demanda por fotoassimilados teria induzido o
aumento da fotossíntese em IACSP95-5000 (Figura 4a). O efeito do etefom na força do dreno
foi marcante ao se considerar que mesmo com maior acúmulo de sacarose no colmo da
IACSP95-5000, o teor de sacarose nas folhas permaneceu inalterado (Figura 5b).
A resposta à aplicação de etefom foi dependente da variedade estudada, sendo
IACSP95-5000 mais responsiva. Na IACSP94-2094 o crescimento e o acúmulo de sacarose nos
colmos não foram alterados pelo tratamento EN (Figuras 3b e 5c). De fato, a resposta diferencial
das variedades de cana-de-açúcar aos indutores de maturação é conhecida (Caputo et al., 2008;
Li & Solomon, 2002; Donaldson & Van Staden, 1995), assim como a suscetibilidade diferencial
a estresses ambientais (Ribeiro et al., 2013; Sales et al., 2013).
Em cana-de-açúcar, a supressão de crescimento favorece a partição de fotoassimilados
para o armazenamento (Chong et al., 2010), aumentando a concentração de sacarose nos colmos
devido ao sombreamento, desfolha parcial, déficit hídrico ou frio (Robertson & Donaldson,
1998; Pammenter & Allison, 2002; Li & Solomon, 2003; Huang et al., 2015). No presente
trabalho, a imposição do déficit hídrico não alterou o acúmulo de massa seca nos colmos (Figura
3b,c) e diminuiu a concentração de sacarose nos colmos das duas variedades (Figura 5a,c).
Como houve diminuição significativa na área foliar das plantas submetidas ao déficit hídrico
(Figura 4c,d), o acúmulo de sacarose poderia aumentar nesta condição se as plantas
apresentassem aumento de Pni. Tal condição não foi atendida neste estudo (Figura 4a,b) e assim
houve redução do teor de sacarose no colmo das plantas sob déficit hídrico (Figura 4c,d).
Levando-se em consideração que o CO2 assimilado pelo dossel das plantas diminuiu
sensivelmente devido à redução da área foliar, poder-se-ia sugerir que o suprimento de
fotoassimilados foi reduzido pelo déficit hídrico em IACSP95-5000.
A baixa disponibilidade hídrica observada entre 15 e 23 dias após a indução dos
tratamentos (Figura 2) foi suficiente para reduzir Pni (Figura 4a) e se sabe que mesmo períodos
curtos de restrição hídrica podem comprometer o acúmulo de sacarose no colmo (Inman-
26
Bamber, 2004). O déficit hídrico causou redução da fotossíntese nas duas variedades (Figura
4a,b) e esta resposta foi associada ao fechamento estomático (resultado não apresentado).
Assim, a redução no teor foliar de amido nas duas variedades sob déficit hídrico (Figura 5b,d)
indica que as plantas utilizaram os reservas foliares disponíveis para suprir a demanda do dreno
e/ou arcar com os custos metabólicos da manutenção da homeostase sob condição estressante.
Concentrações similares de sacarose foram observadas nos colmos de IACSP95-5000
submetida aos tratamentos DH+EN e EN, a despeito do primeiro reduzir a assimilação de CO2
(Figuras 4a e 5a). Este fato sugere que o etileno também atuou na maturação, estimulando a
atividade do dreno e possibilitando que o colmo continuasse a armazenar sacarose, mesmo sem
aumento na assimilação de CO2. Assim, os nossos resultados indicam que o estresse hídrico foi
menos restritivo para a produtividade da cana-de-açúcar quando ocorreu a aplicação de etefom.
Poderia o acúmulo de sacarose nos colmos ser aumentado pela aplicação de etefom antes da
ocorrência do déficit hídrico? Wu et al. (2004) reportaram que o etefom aplicado na fase inicial
do desenvolvimento das plantas aumenta a resistência à seca durante o desenvolvimento da
cana-de-açúcar. Todavia, o seu efeito no acúmulo de sacarose no colmo em condições
ambientais não limitantes deve ser avaliado em pesquisas futuras.
5. CONCLUSÕES
O efeito do etefom em cana-de-açúcar é genótipo-dependente, estimulando o acúmulo
de sacarose no colmo e o suprimento de fotoassimilados pela fonte na variedade responsiva
(IACSP95-5000). Tais efeitos não são associados à restrição do crescimento. Em relação à
aplicação de etefom em conjunto com a ocorrência de déficit hídrico, o hipotético efeito aditivo
no acúmulo de sacarose no colmo não foi verificado na maturação da cana-de-açúcar.
27
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CAPÍTULO III
O ETILENO INDUZ A SÍNTESE DE SACAROSE NO COLMO DURANTE A
MATURAÇÃO NA CANA-DE-AÇÚCAR
RESUMO
O etefom é um regulador vegetal utilizado no cultivo da cana-de-açúcar que estimula produção
do hormônio etileno na planta, alterando as relações fonte/dreno. Essas respostas fisiológicas
dependem de uma complexa rede de interações metabólicas, ainda não bem estabelecidas. Desta
rede podem constar: i) o metabolismo de sacarose, representado pela atividade de enzimas que
catalisam sua síntese (SPS e SuSy) ou sua quebra (SuSy, IVA e IVN); ii) a assimilação de
carbono na fotossíntese; e iii) a sinalização hormonal do processo. O objetivo deste trabalho
foi determinar quais as alterações no metabolismo, nas relações fonte/dreno e na sinalização
que são alteradas pelo etileno durante a maturação da cana-de-açúcar. As hipóteses testadas
foram: i) para aumentar o acúmulo de sacarose no colmo o etileno induz a maior atividade
enzimática de SPS e SuSy e/ou menor atividade das invertases; ii) A maior demanda por
carboidratos decorrente da atividade do colmo estimula o aumento da fotossíntese,
independentemente do efeito inibidor do etileno na abertura estomática; iii) o metabolismo de
açúcares e as relações fonte/dreno alteradas durante a maturação são respostas sinalizadas por
diferenças no balanço hormonal, em que o aumento da concentração de etileno causada pela
sua aplicação exógena leva à mudança na concentração de outros hormônios, induzindo à
maturação. Para testar as hipóteses, plantas da variedade IACSP95-5000 foram tratadas com o
etefom e com AVG, um composto que inibe a síntese de etileno na planta, além do controle.
Foram medidas concentração de sacarose nos tecidos, fotossíntese, atividade das enzimas do
metabolismo de sacarose e concentração hormonal. Conclui-se que o efeito indutor do etileno
na maturação é determinado pelo seu estímulo ao aumento da atividade da SuSy e diminuição
de IVA nos colmos em maturação. Inicialmente o etileno diminui a assimilação de CO2
fechando os estômatos, mas ao estimular a síntese de sacarose no colmo ele aumenta a força do
dreno, gerando demanda fotossintética que garante o fornecimento de fotoassimilados para a
síntese de sacarose. Não foi possível correlacionar as alterações no balanço hormonal às
respostas observadas na fisiologia da maturação.
Palavras-chave: sacarose sintase; invertases ácidas; fotossíntese; sacarose; fitormônio.
31
1. INTRODUÇÃO
Nas plantas, o aumento na demanda de carbono nos drenos resulta no aumento das taxas
de fotossíntese e exportação de sacarose nos tecidos fonte (McCormick et al., 2006). Na cana-
de-açúcar, as folhas são fontes de novos fotoassimilados, produzindo trioses e hexoses e os
colmos funcionam como poderosos drenos de sacarose, concorrendo com outros processos,
como crescimento vegetativo, perfilhamento, respiração e florescimento (Verma et al., 2011).
Durante a fase de maturação, a cana-de-açúcar diminui seu crescimento vegetativo e
aumenta a concentração de sacarose nos tecidos dos colmos, que passam a ser o principal dreno
de fotoassimilados na planta. O aumento da produção de sacarose pelas células parenquimáticas
do colmo faz com que o açúcar seja armazenado em seus vacúolos e mesmo nos espaços
intercelulares do tecido (Glasziou & Gayler, 1972; Rae et al., 2005).
O maior acúmulo de sacarose nas células dos colmos durante a maturação pode estar
ligado à atividade de algumas enzimas relacionadas à produção e/ou à quebra de sacarose (Zhu
et al., 1997). Nessas enzimas inclui-se a Sacarose Fosfato Sintase (SPS, EC 2.4.1.14),
responsável pela síntese de sacarose a partir de hexoses, a Sacarose Sintase (SuSy, EC 2.4.1.13),
que atua tanto na síntese quanto na quebra de sacarose e as Invertases Neutras (IVN, EC
3.2.1.26) e Ácidas (IVA, EC 3.2.1.25), que atuam na quebra de sacarose. Tem sido observado
que a SPS e SuSy aumentam sua atividade durante a maturação, ao passo que as atividades das
invertases, principalmente as ácidas, diminuem (Grof &Campbell, 2001).
A sinalização hormonal é essencial para que ocorra a transdução dos sinais ambientais
que levam uma planta a mudar seu estágio fenológico (Ghanem et al., 2011; Sachs, 2005), como
é o caso da transição da fase de crescimento vegetativo para a maturação na cana-de-açúcar em
resposta a déficit hídrico e frio (Moore & Maretzki, 1996). Durante a fase de maturação natural
da cana-de-açúcar aumentam as concentrações de etileno, ABA e de auxinas (Yao et al., 2002).
Em outras espécies, as invertases têm sido caracterizadas por serem reguladas por estes
hormônios vegetais (Roitsch & Ehness, 2000). Outro grupo de hormônios, as giberelinas estão
positivamente relacionadas ao estímulo da atividade da SPS em espinafre e soja (Cheikh et al.,
1992).
Já foi observado que a aplicação de reguladores vegetais que induzem a produção de
etileno na cana-de-açúcar faz com que algumas variedades entrem em maturação
independentemente das condições naturais (Solomon & Li, 2002; Chong et al., 2010; Wang et
al., 2013a). O principal desses reguladores é o etefom (ácido 2-cloroetilfosfônico). Como
consequência da maior concentração de etileno na planta decorrente da aplicação de etefom, os
32
colmos apresentam maior concentração de sacarose (Chong et al., 2010; Wang et al., 2013a) e
ocorre diminuição do alongamento dos entrenós imaturos em cana-de-açúcar (Li & Solomon,
2003).
Como o etefom consegue induzir a um maior acúmulo de sacarose nas células do colmo,
há aumento da demanda por fotoassimilados, o que exige que a atividade fotossintética também
aumente (Inman-Bamber, 2011). No entanto, o etileno compromete a fotossíntese, ao induzir o
fechamento estomático (Vysotskaya, 2001). No processo de maturação da cana-de-açúcar,
ainda não é compreendido completamente quais os mecanismos de sinalização, nem como as
folhas, fontes de carbono, respondem à sinalização para continuar assimilando açúcar, mesmo
com a sacarose estando em grande concentração nos tecidos da planta (Watt et al., 2014).
Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avançar na compreensão de mecanismos
metabólicos relacionados à produção e armazenamento de carboidratos durante a maturação,
através do estudo de como esses mecanismos respondem à aplicação de etefom. As hipóteses
testadas foram: i) para aumentar o acúmulo de sacarose no colmo o etileno induz a maior
atividade enzimática de SPS e SuSy e/ou menor atividade das invertases; ii) A maior demanda
por carboidratos decorrente da atividade do colmo estimula o aumento da fotossíntese,
independentemente do efeito inibidor do etileno na abertura estomática; iii) o metabolismo de
açúcares e as relações fonte / dreno alteradas durante a maturação são respostas sinalizadas por
diferenças no balanço hormonal, em que o aumento da concentração de etileno causado pela
sua aplicação exógena leva ao aumento de outros hormônios envolvidos positivamente na
maturação, como as giberelinas, ácido abscísico, auxinas e citocininas.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Para avaliar o efeito do etileno na maturação da cana-de-açúcar foi realizado
experimento em casa de vegetação, com aplicação de tratamento com etefom, para proporcionar
maior concentração endógena do hormônio, e aminoetóxi-vinilglicina (AVG), composto que
inibe a atividade das enzimas responsáveis pela síntese de etileno nos tecidos vegetais, além do
controle sem aplicação de tratamentos. Para avaliar o efeito dos tratamentos no acúmulo de
sacarose nas plantas, foram realizadas medidas de trocas gasosas, quantificação de carboidratos,
análise da atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de sacarose e a quantificação dos
hormônios em colmos e folhas das plantas tratadas.
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2.1 Material Vegetal
Foram utilizadas plantas de cana-de-açúcar com 10 meses de idade da variedade
comercial IACSP95-5000, que apresenta alta produtividade agrícola e é indicada para
ambientes com disponibilidade hídrica e nutricional favoráveis (Landell et al., 2007). As
plantas foram obtidas a partir de mini toletes das variedades que foram germinados em bandejas
contendo substrato comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz, RS, Brasil).
2.2 Desenho Experimental
O experimento foi conduzido em casa de vegetação e as mudas foram plantadas em 6
tanques de alvenaria de 2 m2 de área (4 m comprimento x 0,5 m de largura) e capacidade de
1,54 m3. Cada tanque continha 15 plantas. Foi conduzido apenas o colmo primário de cada
planta, sendo excisados todos os perfilhos desde o plantio até o fim do experimento. O substrato
nos tanques era terra, analisada para composição nutricional e adubada seguindo as
recomendações de Van Raij et al. (1996).
Os reguladores foram aplicados com um pulverizador costal pressurizado automático
modelo 16L Jett (Sanmaq, São Leopoldo, RS, Brasil) com barra de 3 bicos TP8002VK, durante
80s com pressão nominal máxima de 20 bar e vazão total de 420 mL min-1. Para evitar
contaminação entre os tratamentos, as plantas nos tanques foram separadas por lonas plásticas
durante a aplicação e nos dias subsequentes. As doses utilizadas foram testadas previamente
em plantas da mesma variedade no campo. A dose de etefom foi testada para conformação do
efeito maturador e a de AVG foi testada de modo a se utilizar a maior dose possível que não
apresentasse fitotoxicidade severa aparente. Cada tratamento foi aplicado em dois tanques,
perfazendo um total de 30 plantas por tratamento. Os tratamentos foram:
- Controle: aspersão de água e tensor utilizado para as caldas dos reguladores (Haiten®
1 mL L-1, Arysta Lifescience, Salto de Pirapora, SP, Brasil);
- AVG: aplicação de aminoetóxi-vinilglicina 155 g ha-1 (Retain®, Valent Bioscience
Corporation, Libertyville, IL, EUA).
- Etileno: aplicação de etefom 480 g ha-1 (Ethrel®, Bayer Crop Science, Leverkusen,
Alemanha).
34
2.3 Trocas Gasosas
As determinações de trocas gasosas foram realizadas na folha+3 (terceira folha com a
lígula aparente) aos 1, 2, 5, 15, 23 e 30 dias de tratamento. Foram avaliadas a assimilação de
CO2 (Pn), a condutância estomática (gs) e a transpiração (E) utilizando-se um analisador de
gases por infravermelho (LI-6400, Li-Cor, Lincoln, NE, EUA). As medidas foram realizadas
sob concentração constante de CO2 no ar (400 µmol mol-1), radiação fotossinteticamente ativa
(RFA) de 2000 µmol m-2 s-1 e variação natural de temperatura e umidade relativa do ar (Figura
1. As avaliações foram realizadas entre 13:00 e 15:00h. A RFA foi medida com o quantômetro
modelo LI-190 (Li-Cor, Lincoln, NE, EUA) e a temperatura e umidade do ar foram registradas
continuamente durante todo período experimental com um sistema de aquisição de dados
modelo LI-1400 (Li-Cor, Lincoln, NE, EUA).
Tabela 1. Condições do ambiente na casa de vegetação durante o período experimental, medidas nos dias das medidas de trocas gasosas. Temperatura máxima (Tmax), mínima (Tmin) e média (Tar); Umidade relativa média diária (UR) e Radiação fotossinteticamente ativa total (RFAtot).
2.4 Concentração de Carboidratos
Amostras de folhas+2 e das diferentes porções do colmo (inferior, mediana e superior)
foram secas e a concentração de carboidratos foi determinada nas plantas aos 0, 5 e 30 dias de
tratamentos. Para a determinação dos açúcares solúveis totais (AST) as amostras foram
extraídas em solução metanol:clorofórmio:água (Bieleski & Turner, 1966) e quantificadas pelo
método fenol-sulfúrico (Dubois et al., 1956), utilizando-se glicose como padrão. A
DAA Tmax Tmin Tar UR RFAmax °C °C °C % mmol m-2 s-1
0 30,0 19,2 23,7 79,7 442,4 2 26,4 20,1 22,4 93,1 487,0 5 30,5 18,9 23,7 73,9 478,4
15 29,3 14,7 20,5 70,8 660,4 23 29,2 15,8 21,5 62,3 932,0 30 32,7 16,2 23,5 68,0 846,0
35
concentração de sacarose (SAC) foi determinada pelo método descrito por Van Handel (1968)
e a dosagem feita pelo método fenol-sulfúrico, utilizando sacarose como padrão. A
concentração de açúcares redutores foi estimada pela subtração de AST–SAC. A determinação
da concentração de carboidratos total nos colmos foi obtida pela média das medidas nas
diferentes porções da mesma planta.
Como os entrenós do terço mediano foram os que apresentaram maior relação entre o
efeito do etileno e a concentração de sacarose, a atividade de enzimas do metabolismo de
açúcares e a quantificação hormonal foram realizadas nesta porção do colmo, além das folhas.
2.5 Extração para Análise Enzimática
Após 5 dias do início dos tratamentos, período o qual foi testado como o mais indicado
para a observação de alterações induzidas pelos tratamentos nas atividades enzimáticas, tecidos
(folhas+1 e entrenós) foram coletados e congelados em nitrogênio líquido e posteriormente
processados. Os procedimentos realizados para as extrações das enzimas nos colmos e nas
folhas foram iguais, seguindo como base o método de Grof et al. (2007). Foi utilizado cerca de
500 mg de massa do tecido, que foram maceradas com 5% de polivinilpolipirrolidona (PVPP)
e 3,0 mL de tampão Hepes-NaOH 50mM (pH 7,5), contendo MgCl2 10 mM e EDTA 1mM.
Em seguida o extrato foi centrifugado a 14000 g, 4 °C por 30 minutos. Após a centrifugação
2,5 mL do sobrenadante foram dessalinizados em coluna Sephadex G25 modelo Disposable
PD-10 Desalting (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ, EUA), previamente
saturada com o tampão de extração. O extrato coletado da coluna após eluição com 3,5 mL do
tampão da extração foi utilizado para análise enzimática.
2.6 Análises enzimáticas
Após a dessalinização e purificação, foram determinadas as atividades da sacarose
fosfato sintase (SPS, EC 2.4.1.14) e da sacarose sintase (SuSy, EC 2.4.1.13) no sentido da
síntese de sacarose. Foram adicionados na proporção 1:1 (v/v) o extrato dessalinizado e o
tampão de reação contendo tampão Tris-HCl 200 mM (pH 7,5) com MgCl2 10 mM, EDTA 2
mM, frutose 25 mM e de uridina difosfato glicose (UDPG) 50 mM para o ensaio da SPS e
tampão Tris-HCl 200mM (pH 7,5) com MgCl2 10 mM, EDTA 2 mM, frutose-6-fosfato 8 mM,
glicose 6-fosfato 40 mM e UDPG 50 mM (Zhu et al., 1997, modificado). As misturas foram
incubadas a 37ºC (SPS) e 30ºC (SuSy) por 30 minutos e a reação parada adicionando-se 100µL
36
de KOH 30% e fervura por 3 min. A sacarose produzida por essas reações foi quantificada
utilizando-se o método da antrona (Van Handell, 1968) adaptado por Zhu et al., 1997.
A atividade da invertase ácida solúvel (IVA, EC 2.4.1.25) foi determinada pela adição
do extrato dessalinizado em 250µL de tampão citrato 1M (pH 4,5) e 250µL de solução de
sacarose 0,24 M, na proporção 1:1:2 (v/v/v) e posteriormente incubadas a 37ºC por 30min. A
reação foi paralisada pela adição de 0,2µL de tris-base 3M e fervura da mistura por 3min. Os
açúcares redutores foram determinados pelo método de Somogy-Nelson (Nelson, 1944;
Somogy, 1945; 1952). A determinação da atividade das invertases neutras (IVN, EC 2.4.1.26)
foi similar, exceto pelo pH do tampão citrato, que foi de 7,5 (Zhu et al., 1997).
As atividades das enzimas foram calculadas e expressas como micromoles de produto
formado por grama de massa fresca por minuto.
2.7 Quantificação Hormonal
Aos 1 e 5 DAA, amostras de folhas e das porções intermediárias e superiores do colmo
foram coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. No laboratório elas foram
liofilizadas, pesadas e enviadas para quantificação do perfil hormonal no Laboratório
Proteomics and Mass Spectrometry Facility do Donald Danforth Plant Science Center, St
Louis, MO, EUA. Os hormônios foram quantificados pela metodologia descrita em Pan et al.
(2010). O sistema LC–MS/MS utilizado foi composto por um LC (Shimadzu, Kyoto, KYT,
Japão) acoplado a um espectrômetro de massas modelo 4000 QTRAP (AB Sciex, Framingham,
MA, EUA) equipado com fonte de íons eletrospray TurboIonSpray (TIS). Foram quantificados
os teores de ácido abscísico livre (ABA), ácido indolacético (AIA), giberelinas (GA1, GA3 e
GA4) e trans-zeatina ribose (trans-ZR), trans-zeatina, ácido salicílico e jasmonatos.
2.8 Análise Estatística
O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com delineamento
experimental inteiramente casualizado, com quatro repetições (plantas) por tratamento para
cada variedade. Os fatores de variação foram as aplicações dos reguladores etefom e AVG. Os
resultados foram analisados estatisticamente através de análise de variância (P≤0,01 e P≤0,05)
e quando houve diferença significativa, as médias foram comparadas pelo teste Tukey (P≤0,05).
37
3. RESULTADOS
O etileno causou aumento na concentração de sacarose nos colmos tratados (Figura 1).
Inicialmente, aos 5 DAA diminuiu a concentração de açúcares redutores (Figura 1a) e de
sacarose (Figura 1c) nas folhas das plantas tratadas com AVG e etileno em relação ao controle.
Nos colmos a concentração de sacarose (Figura 1b) e açúcares redutores (Figura 1d) foi maior
nos tratamentos em relação ao controle. Aos 30 DAA as concentrações de sacarose e açúcares
redutores foram respectivamente 46% e 20% maiores nos colmos de plantas tratadas com
etefom em relação ao controle (Figura 1b,d), enquanto a concentração de sacarose no
tratamento com AVG foi 20% menor. A concentração de carboidratos nas folhas dos
tratamentos não diferiu do controle ao final do experimento (Figura 1a,c).
Figura 1. Concentrações de sacarose (a,b) e açúcares redutores (c,d) iniciais, aos 5 e aos 30 dias após a aplicação de diferentes reguladores vegetais na folha+2 (a.c) e no colmo (b,d) de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. Controle = sem aplicação; AVG = aplicação de aminoetóxi-vinilglicina (195 g ha-1); Etileno = aplicação de etefom (480 g ha-1). Cada ponto representa a média de 4 repetições. Asteriscos representam diferenças estatísticas em relação ao controle, determinadas pelo teste Tukey (p<0,05).
38
A concentração de sacarose (Figura 2a) e açúcares redutores (Figura 2b) foram
respectivamente 35% e 23% maiores nas plantas tratadas com etileno em relação ao controle
nos entrenós da porção mediana do colmo e o tratamento com AVG diminuiu em 21% a
concentração de sacarose. Na porção superior do colmo a concentração de sacarose foi 17%
maior no tratamento com etileno (Figura 2a), porém não houve diferença no teor de açúcares
redutores em relação ao controle (Figura 2b). Na porção inferior, o acréscimo do teor de
sacarose no tratamento EN foi de 14%. O tratamento com AVG não induziu diminuição na
sacarose nas porções inferior e superior (Figura 2a). O tratamento com AVG também não
causou alterações nos teores de açúcares redutores em relação ao controle em nenhuma das
partes do colmo (Figura 2b).
Figura 2. Concentração de sacarose (a) e açúcares redutores (b) nos entrenós de diferentes porções do colmo (inferior, mediana e superior) de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000 submetidas a diferentes tratamentos com reguladores. Controle = sem aplicação; AVG = aplicação de aminoetóxi-vinilglicina (195 g ha-1); Etileno = aplicação de etefom (480 g ha-1). Cada coluna representa a média de 4 repetições e cada barra o desvio-padrão. Letras diferentes representam diferenças estatísticas pelo teste Tukey (p<0,05).
A atividade da SuSy (Figura 3a) foi aumentada em relação ao controle no tratamento
com etileno, mas diminuiu com a aplicação de AVG. IVN também foi mais ativa nas plantas
tratadas com etileno em relação ao controle, que não diferiu do tratamento com AVG (Figura
3d). As atividades da SPS (Figura 3b) e da IVA (Figura 3c) diminuíram em relação ao controle
nos tratamentos com etileno, sem diferir nos tratamentos com AVG. Nas folhas, os tratamentos
foram menos efetivos na alteração das atividades das enzimas do metabolismo de açúcar
(Figura 4). Apenas o tratamento com etileno induziu menor atividade das IVA (Figura 4c), sem
diferenças nas outras enzimas e nos outros tratamentos em relação ao controle.
39
Figura 3. Atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos: sacarose sintase (SuSy, a), sacarose fosfato sintase (SPS, b), invertases ácidas solúveis (IVA, c) e invertases neutras (IVN, d) nos entrenós centrais do terço mediano do colmo de plantas de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, 5 dias após tratamento com reguladores vegetais. Controle = sem aplicação; AVG = aplicação de aminoetóxi-vinilglicina (195 g ha-1); Etileno = aplicação de etefom (480 g ha-1). Cada coluna representa a média de 4 repetições e cada barra o desvio-padrão. Letras diferentes representam diferenças estatísticas pelo teste Tukey (p<0,05).
Figura 4. Atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos: sacarose sintase (SuSy, a), sacarose fosfato sintase (SPS, b), invertases ácidas solúveis (IVA, c) e invertases neutras (IVN, d) nos entrenós centrais do terço mediano da folha+1 de plantas de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, 5 dias após tratamento com reguladores vegetais. Controle = sem aplicação; AVG = aplicação de aminoetóxi-vinilglicina (195 g ha-1); Etileno = aplicação de etefom (480 g ha-1). Cada coluna representa a média de 4 repetições e cada barra o desvio-padrão. Letras diferentes representam diferenças estatísticas pelo teste Tukey (p<0,05).
Entrenós centrais do terço mediano
Folha
40
Inicialmente (2 e 5 DAA) houve diminuição de Pn (Figura 5a), gs (Figura 5b) e E (Figura
5c) nas plantas tratadas com etileno. No entanto, a partir do 15º dia os valores de todos os
parâmetros superaram os observados no controle, igualando-se a ele na última medida, aos 30
DAA. Aos 15 DAA também o tratamento com AVG causou diminuição Pn em relação ao
controle (Figura 5a). Em 23 DAA o AVG causou maior Pn maior do que o controle, se igualando
ao tratamento com etileno. Ainda, as plantas tratadas com AVG apresentaram maior gs e E no
último dia de medidas em relação ao controle e ao etileno (Figuras 5b,c).
Figura 5. Acompanhamento da assimilação de CO2 (Pn, a), da abertura estomática (gs; b) e da transpiração (E; c) em folhas+3 de plantas de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000 submetidas à aplicação de reguladores vegetais. Controle = sem aplicação; AVG = aplicação de aminoetóxi-vinilglicina (195 g ha-1); Etileno = aplicação de etefom (480 g ha-1). Cada ponto representa a média de 4 repetições; Asteriscos representam diferenças estatísticas em relação ao controle pelo teste Tukey (p<0,05). Setas representam o dia em que foram feitas as análises enzimáticas (Figuras 3 e 4).
41
A análise do efeito dos tratamentos no balanço hormonal (Figura 6) mostra alterações
nas concentrações de giberelinas (folhas e colmos), ABA (folhas) e trans-ZR (colmos). Essas
respostas foram observadas com maior intensidade aos 5 DAA. O tratamento com etileno
induziu menor concentração de GA4 nas folhas (Figura 6a) e maior concentração nos colmos
(Figura 6b) em relação ao controle. O etileno também induziu menor concentração de ABA nas
folhas (Figura 6c) e aumento da concentração de trans-ZR no colmo (Figura 6h). O tratamento
com AVG causou aumento dos teores de ABA (Figura 6d) e trans-ZR (Figura 6h) na porção
intermediária dos colmos em relação ao controle. O AIA (Figura 6e,f) apresentou aumento no
tratamento com AVG no colmo, aos 5DAA. As concentrações de GA1, GA3, trans-zeatina,
ácido salicílico e jasmonatos não diferiram em nenhum tecido e em nenhum dos tratamentos
(dados não mostrados).
Figura 6. Hormônios ácido giberélico (GA4; a,b), ácido abscísico (ABA; c,d), ácido indolacético (AIA; e,f) e trans-zeatina ribose (trans-ZR; g,h) em folhas (a,c,e,g) e nos entrenós da porção mediana do colmo (b,d,f,h) de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, 1 e 5 dias após tratamento com reguladores vegetais Controle = sem aplicação; AVG = aplicação de aminoetóxi-vinilglicina (195 g ha-1); Etileno = aplicação de etefom (480 g ha-1). Cada coluna representa a média de 3 repetições e cada barra o desvio-padrão. Letras diferentes representam diferenças estatísticas pelo teste Tukey (p<0,05).
42
4. DISCUSSÃO
O efeito indutor do etileno na maturação parece estar relacionado a seu estímulo à
atividade de produção e acúmulo de sacarose nos colmos. O etileno estimula a atividade da
SuSy principalmente nos entrenós intermediários das plantas, o que aumentaria a concentração
de sacarose nas células parenquimáticas dos entrenós. Além do metabolismo de acúmulo de
carboidratos, a aplicação de etefom parece interferir também no metabolismo de produção de
trioses. Inicialmente, o tratamento com etefom diminui a assimilação de CO2 fechando os
estômatos, mas ao estimular a síntese de sacarose no colmo ele aumenta a força do dreno, o que
estimula maior fotossíntese a médio prazo, garantindo o fornecimento de substrato para a
síntese de sacarose que culmina na maior concentração do açúcar observada nos colmos ao final
do experimento. Em relação a como se dá a sinalização desses processos, não foi possível
correlacionar conclusivamente as alterações no balanço hormonal às respostas observadas na
fisiologia da maturação, doravante tenha sido observado aos 5DAA aumento nos teores de
giberelinas e trans-ZR nos colmos e diminuição de ABA e giberelinas nas folhas das plantas
tratadas com etefom.
Em um primeiro momento, aos 2 e 5 DAA o etileno altera a partição de fotoassimilados
na planta ao diminuir a concentração de sacarose e açúcares redutores nas folhas, porém sem
alterar a concentração de carboidratos nos colmos (Figura 1). Como observado por Rajala &
Peltonen-Sainio (2001), Desikan et al. (2006), e Vysotskaya et al., (2001), o etileno estimula o
fechamento estomático. A diminuição de gs observada no tratamento com etileno acarreta em
menor Pn (Figura 5) e com menor fotossíntese diminui a concentração de açúcares redutores e
de sacarose nas folhas. No entanto, a concentração de sacarose nos colmos nesse período inicial
do tratamento com etileno não foi comprometida. O que é explicado por dois fatores: (i) o fato
de a cana-de-açúcar apresentar mecanismos fisiológicos que otimizam a assimilação de CO2,
como metabolismo C4 e anatomia krans; e (ii) o etileno ter alterado a atividade das enzimas do
metabolismo de carboidratos, especialmente a maior atividade da SuSy e menor atividade da
IVA que estão relacionadas a maior acúmulo de sacarose nas células do colmo (Wang et al.,
2013a).
Ao final do experimento, aos 30 DAA, o etileno apresentou efeito maturador ao
aumentar a concentração de sacarose nos colmos (Figuras 1b, 2a). Esse aumento foi
determinado principalmente pela porção intermediária do colmo, que apresentou maior
concentração de sacarose e também de açúcares redutores (Figura 2). Wang et al, 2013a
observaram que o etileno age com mais intensidade no que os autores chamaram de colmos
43
“em maturação”, os entrenós da porção intermediária do colmo. O presente trabalho reforça o
papel do etileno nesta região do colmo, ao observar que o tratamento com AVG, que inibe a
produção do hormônio, diminuiu a concentração de sacarose nos colmos desta região em
relação ao controle (Figura 2a). Os resultados também indicam que o etileno, cuja produção é
estimulada pelo etefom nas folhas aonde é absorvido e metabolizado, é translocado para outros
tecidos, notadamente as diferentes regiões do colmo aonde ele estimula a produção de sacarose.
Na cana-de-açúcar, o etileno atua no processo de maturação de duas formas: ao diminuir
o crescimento vegetativo e ao aumentar a atividade de acúmulo de sacarose nos colmos (Chong
et al., 2010; Wang et al., 2013a). Com maior atividade de produção de sacarose no colmo,
ocorre aumento da demanda por fotoassimilados e a atividade da fonte também tende a
aumentar (Inman-Bamber, 2011). Por isso, o maior Pn durante a metade final do experimento
nas plantas tratadas com etefom (Figura 5a) pode ser resultado da maior atividade dos colmos,
importantes drenos de carbono na cana-de-açúcar. Vale lembrar que inicialmente (2 e 5 DAA)
o etefom comprometeu a atividade fotossintética ao promover o fechamento estomático (Figura
5a,b). Mas como ao final do experimento a concentração de açúcares redutores nos colmos é
maior nas plantas do tratamento com etileno em relação ao controle (Figuras 1d, 2b), podemos
concluir que a assimilação de CO2 e o transporte de carboidratos para o acúmulo no colmo não
foram comprometidos, uma vez que o tratamento com etefom propiciou maior concentração de
sacarose nos tecidos.
O carbono assimilado na fotossíntese foi rapidamente translocado, o que pode ser
concluído quando se observa que aos 30 DAA nos colmos a concentração de sacarose e
açúcares redutores foram maiores em relação ao controle (Figura 1b,d), mas nas folhas as
concentrações de carboidratos não diferiram (Figura 1a,c). A capacidade de translocar
rapidamente o açúcar produzido é essencial para que variedades mais produtivas possam manter
a atividade fotossintética (Grof & Campbell, 2001), uma vez que se a concentração de sacarose
na folha aumentar muito esta pode inibir enzimas responsáveis pela assimilação de CO2 (Stitt
et al., 1988). Como houve pouca diferença na fotossíntese entre o tratamento com AVG e o
controle (Figura 5) sugere-se que a maior taxa fotossintética nos tratamentos com etefom se dá
pelo estímulo causado pela maior atividade nos colmos, e não pela influência direta do etileno
no metabolismo fotossintético. A maturação é, portanto, controlada pelo aumento da atividade
do dreno, i.e., o acúmulo de sacarose no colmo, e devido a isto a planta aumenta a assimilação
de carbono para suprir a maior demanda.
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A maior atividade de acúmulo de sacarose no colmo está relacionada à alteração na
atividade de enzimas do metabolismo de açúcares (Figuras 3 e 4), em especial nos colmos. No
colmo, o etileno influenciou determinantemente a atividade da SuSy, pois foi observado que
ela foi quase 4 vezes maior no tratamento com etefom em relação ao controle. E além disso, o
tratamento com AVG também inibiu a atividade da enzima. Nas folhas, apenas a atividade de
IVA foi influenciada pelo tratamento com etileno diminuindo em relação ao controle. Isso
reforça o que já havia sido concluído: o etileno atua na maturação ao alterar principalmente a
atividade das células do colmo, e não das folhas.
O aumento na atividade da SuSy (Figura 3a) e a diminuição da atividade de IVA nos
colmos (Figura 3c) estão associados com o maior acúmulo de sacarose. Enquanto a SuSy no
sentido de síntese possibilita maior produção de sacarose (Jain et al., 2013), a menor atividade
de IVA diminui a remobilização de sacarose para outros drenos, como o crescimento e a
respiração (Verma et al., 2011). Tratamentos indutores de maturação na cana-de-açúcar alteram
geneticamente a atividade somente dessas enzimas, promovendo a da SuSy e reprimindo a das
IVA (Jain et al., 2013).
A SuSy tem a particularidade de atuar tanto na síntese quanto na quebra de sacarose,
sendo que normalmente ela atua mais no sentido de quebra do que de síntese em tecidos
maduros (Zhu et el., 1994) e no sentido de síntese em tecido em maturação (Schäfer et al.,
2005). No presente trabalho, a maior concentração de sacarose nos colmos em que também há
maior atividade da enzima sugere que a enzima está atuando no sentido da síntese de sacarose.
Como a SPS, que também atua no sentido da síntese de sacarose, apresentou menor atividade
nos colmos do tratamento com etileno em relação ao controle (Figura 3b), a SuSy é a principal
enzima que está produzindo sacarose a partir dos açúcares redutores presentes no colmo.
A SuSy está envolvida em outros processos além do acúmulo de sacarose, como o
fornecimento de carbono para a síntese de parede celular (Guerriero et al., 2010) e para a
respiração (Wang et al., 2013b). Durante o crescimento vegetativo, o engrossamento e
alongamento da parede celular dependem de um complexo sistema em que a SuSy fornece
UDPG para a síntese de celulose (Guerriero et al., 2010). Com o fim do ciclo vegetativo, durante
a maturação, sua atividade praticamente triplica (Batta et al., 2011) e ela passa a atuar mais no
sentido da síntese de sacarose devido à mudança na produção e ativação das diferentes
isoformas da enzima, que diferem entre si na afinidade pela sacarose, levando à maior atividade
de síntese de sacarose (Schäfer et al., 2005).
As invertases, especialmente as ácidas, têm sido relatadas como peças-chave na
atividade metabólica da cana-de-açúcar em maturação (Slack, 1965), sendo muitas vezes as
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enzimas que apresentam maior correlação com o aumento de sacarose no colmo (Batta et al.,
2011). A atividade das invertases ácidas é maior em tecidos em desenvolvimento, onde tem
papel no controle do turgor (Zhu et al., 2000) e na remobilização de açúcares armazenados para
o tecido em crescimento (Verma et al., 2011). A menor atividade de IVA induzida pelo etileno
é, então, fundamental para inibir o crescimento da planta e possibilitar o acúmulo de sacarose
no colmo durante a maturação. O processo que controla o efluxo de sacarose do colmo
permanece não muito claro, mas acredita-se que as invertases ácidas devem estar presentes para
hidrolisar a sacarose em hexoses que, posteriormente, serão carregadas via transportadores
simporta, sendo então a diminuição de IVA um fator chave limitante para o carregamento do
floema (Watt et al., 2014). Estresses bióticos ou abióticos e sinalização hormonal também
induzem menor atividade de IVA na folha, bem como a atividade de dreno dos colmos (Lara et
al., 2004; Roitch & Gonzales, 2004).
Também foi observado aumento na atividade de IVN nos colmos (Figuras 3d). A maior
atividade de IVN está relacionada à maior quantidade de sacarose presente no citoplasma, que
estimula a realização do chamado ciclo fútil da sacarose, onde esta é continuamente hidrolisada
e ressintetizada dentro do compartimento celular (Rossouw et al., 2007). As invertases neutras
têm sido sugeridas como chave no controle da concentração de hexoses no citosol das células
do colmo, afetando a expressão de genes responsivos a açúcares (Vorster & Botha, 1998).
Tanto a atividade das enzimas do metabolismo de sacarose como a fotossíntese, podem
ser influenciadas por alterações no balanço hormonal induzidas pela aplicação de etefom. Nas
folhas (Figura 6a), as plantas tratadas com etileno apresentaram menor concentração de GA4
aos 5 DAA em relação ao controle. Nos colmos (Figura 6b), foi observado o contrário, i.e., a
concentração de GA4 foi maior que a do controle, indicando que está ocorrendo remobilização
do hormônio entre os tecidos da planta. O acúmulo de açúcares redutores no colmo, que já é
significativamente maior aos 5 DAA (Figura 1d), é relacionado à atividade das giberelinas
(Simko, 1994). Também é interessante ressaltar que foi observada a presença da giberelina ativa
GA4 nesta variedade de cana, sendo que normalmente as giberelinas ativas encontradas na cana-
de-açúcar são GA1 e GA3 (Kuhnle et al., 1983). Durante a maturação natural da cana-de-açúcar
a concentração de etileno, ABA e AIA atingem seus picos no período inicial do processo (Yao
et al., 2002). No presente trabalho, a aplicação de etileno diminuiu a concentração de ABA nas
folhas (Figura 6c) e não altera os teores de AIA (Figura 6e,f).
O etileno e o ABA apresentam comprovada interdependência. Ambos são necessários
para estimular respostas a estresses (Albacete et al., 2008) e atuam sinergicamente na inibição
do crescimento vegetativo de algumas espécies (Ghanem et al., 2011). O etileno é conhecido
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por prevenir o acúmulo de ABA, e vice-versa (Spollen et al., 2000). Foi observado que a menor
concentração de ABA nas folhas aos 5 DAA não preveniu o fechamento estomático (Figura
5b), ao contrário do que poderia se esperar. Isso ocorreu devido ao etileno também estimular o
fechamento estomático (Vysotskaya et al., 2001).
Nos entrenós da região mediana do colmo, onde ocorreu a maior diferença na
concentração de sacarose, foi observado aumento significativo nos teores de trans-ZR no
tratamento com etileno quando comparadas ao controle (Figura 6h). Apesar de ser uma forma
inativa de trans-zeatina associada a moléculas de ribose, a trans-ZR pode ser facilmente
convertida na forma ativa da citocinina (Yamada, et al., 2001). Na cana-de-açúcar, as
citocininas estão diretamente relacionadas ao aumento da força do dreno (Ha et al., 2012). Isso
também foi observado em outras espécies, onde as citocininas aumentam a atividade de genes
envolvidos no ciclo celular e facilitam o descarregamento de carboidratos do floema para as
células dos tecidos (Mohapatra et al., 2011).
5. CONCLUSÃO
O etileno aumenta produção e acúmulo de sacarose nos entrenós intermediários dos
colmos por estimular a atividade da SuSy e inibir a atividade de IVA, aumentando assim a
concentração de sacarose nas células parenquimáticas do tecido. Inicialmente, o etileno diminui
a assimilação de CO2 fechando os estômatos, mas ao estimular a síntese de sacarose no colmo
ele aumenta a força do dreno, gerando demanda fotossintética que a médio prazo garante o
fornecimento de fotoassimilados para a síntese de sacarose. Em relação às alterações no balanço
hormonal, observou-se que os teores de giberelinas e ácido abscísico aumentam nas folhas e
giberelinas e citocininas aumentam nos colmos em relação ao controle em resposta à aplicação
do etefom.
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CAPÍTULO IV
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho traz importante contribuição para o estudo da fisiologia da maturação na
cana-de-açúcar e sua reposta à aplicação de etefom ao destacar como a atividade de síntese de
sacarose nos colmos (drenos) leva à planta a acumular o açúcar e estimula a atividade
fotossintética das folhas (fontes), mesmo em condições adversas que, a priori, causam
supressão fotossintética, como o déficit hídrico e a presença de etileno nas folhas.
Em relação às hipóteses apresentadas no Capítulo I, os dados apresentados permitem
concluir que:
(i) O etefom estimula a maturação por causar aumento no armazenamento de sacarose
no colmo;
(ii) Nas variedades testadas, o déficit hídrico não é capaz de induzir à maturação,
comprometendo o armazenamento de sacarose nos colmos, mas o tratamento com etefom
permite à cana-de-açúcar armazenar sacarose nos colmos na mesma proporção estando ou não
em estresse por déficit hídrico;
(iii) O estímulo ao aumento na concentração de sacarose nos colmos mediados pelo
etileno é resultado do efeito positivo que o etileno tem na atividade da SuSy e IVN, e negativo
em IVA;
(iv) Após inibição inicial da fotossíntese devido ao fechamento estomático, a
assimilação de CO2 é estimulada pelo etileno devido à demanda criada nos colmos em alta
atividade de síntese de sacarose;
(v) As giberelinas e ABA são inibidas nas folhas e as citocininas e giberelinas são
promovidas no colmo nos tratamentos com etileno, mas não é possível correlacionar essas
alterações com a produção e o acúmulo de sacarose durante a maturação.
Trabalhos futuros podem elucidar melhor como se dá o sistema de sinalização
fonte/dreno na planta, relacionando o balanço hormonal aos processos fisiológicos destacados
neste trabalho. Pontos de interesse neste tema seriam a relação entre os diferentes tipos de
açúcares e a sinalização da atividade do colmo e das folhas, e as relações metabólicas e
genéticas do etileno e dos outros hormônios com as enzimas afetadas, especialmente a SuSy e
as invertases.