FIGURA 7.1Reação de polimerase em cadeia (PCR). Um fragmento de DNA de seqüência desconheci-da é inserido em um vetor de seqüência conheci-da por metodologias normais de recombinação. O DNA recombinante de interesse não precisa ser purificado. O DNA é aquecido a 90°C para dissociar a dupla fita e resfriado em presença de excesso de dois oligômeros diferentes comple-mentares, que hibridizam com as seqüências conhecidas do DNA do vetor que flanqueiam o DNA estrangeiro inserido. Só espécies de DNA recombinante fita-única podem servir de moldes para replicação do DNA, gerando fragmentos de DNA fita-dupla do DNA estrangeiro ligado pelas seqüências de DNA dos oligômeros. O ciclo aquecimento-replicação é repetido muitas vezes para produzir rapidamente grandes quantidades do DNA estrangeiro original. O fragmento de DNA de interesse pode ser purificado da mistura de reação da polimerase em cadeia por clivagem com a endonuclease de restrição (RE) original, eletroforese da mistura de DNA em gel de agaro-se e eluição do gel das bandas de interesse.

FIGURA 7.2Mapeamento do DNA por endonuclease de restrição. DNA purificado é submetido a digestão por endonuclease de restrição por tempos variáveis, o que gera fragmentos de DNA parcialmente ou totalmente clivado. Os fragmentos de DNA são separados por eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etídio. As bandas de DNA são vistas com uma fonte de luz UV e fotografadas. O tamanho dos fragmentos de DNA é determinado pela migração relativa no gel em comparação com padrões de DNA na mesma eletroforese. A disposição relativa de cada fragmento na molécula de DNA pode ser deduzida a partir do tamanho dos fragmentos incompletamente hidrolisados.

FIGURA 7.4Método de Sanger do didesoxinucleosídeo trifosfato para seqüenciar DNA. A região de interesse do DNA é inserida em molécula de DNA de um bacteriófago. Replicação do bacteriófago produz uma molécula de DNA recombinante fita-única que é facilmente purificada. A seqüência conhecida do DNA do bacteriófago, que fica no lado 3’ (downstream) do DNA inserido serve de ponto de hibridização para um oligômero marcado na extremidade com uma seqüência complementar, um primer universal. Extensão desse primer é catalisada por uma DNA polimerase e todos os quatro dNTPs mais um ddNTP – por exemplo, ddGTP. Síntese pára toda vez que um ddNTP for incorporado à molécula nascente. Note que o ddNTP compete por incorporação com dNTP,. Isso gera fragmentos de DNA marcados na extremidade de todos os comprimentos possíveis, que são separados por eletroforese. A seqüência do DNA pode, então, ser determinada a partir de padrões de eletroforese.

FIGURA 7.5Formação de DNA recombinante a partir de fragmentos ge-rados por endonuclease de restrição contendo extremidades coesivas. Muitas endonucleases de restrição hidrolisam DNA de modo desencontrado, gerando fragmentos com regiões de fita-úni-ca nas suas extremidades 3’ e 5’. Fragmentos de DNA gerados a partir de moléculas diferentes com a mesma endonuclease de restrição têm extremidades fita-única complementa-res, que podem ser “aneladas” e ligadas covalentemente com uma DNA ligase. Todas as diferentes combinações são possíveis numa mistura. Quando dois fragmentos de DNA de diferentes origens se combinam, resulta uma molécula de DNA recombinante.

FIGURA 7.6O plasmídeo pBR322 construído no laboratório para conter características que facilitam clonagem de fragmentos de DNA estrangeiro. Por convenção, a numeração dos nucleotídeos começa com o primeiro T na seqüência única de reconhecimento por EcoR1 (GAATTC), e as posições no mapa referem-se à base 5’ dos vários sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição. Apenas alguns destes, nos genes de resistência a antibiótico, e nenhum dos sítios onde uma enzima corta mais de uma vez são mostrados.

FIGURA 7.7Clonagem direcional de DNA estrangeiro em vetores com uma orientação específica. Inserção de um fragmento de DNA estrangeiro em um vetor com uma orientação específica requer duas seqüências diferentes de anelamento, uma em cada extremidade do fragmento e da seqüência complementar correspondente das duas extremidades geradas no vetor. Duas seqüências de anelamento diferentes são geradas por endonucleases de restrição específicas que hidrolisam o fragmento de DNA estrangeiro e o vetor. Um polylinker, com vários sítios específicos para endonucleases de restrição no vetor, facilita clonagem direcional. Conhecimento do mapa de restrição do DNA de interesse permite a seleção das endonucleases de restrição apropriadas.

FIGURA 7.10α-Complementação para detecção de bactérias transformadas. Um vetor construído (pUC 18) expressa a seqüência codificadora N-terminal da enzima β-galactosidase do operon lac. Bactérias mutantes que codificam a região C-terminal da β-galactosidase são transformadas com pUC 18. Essas bactérias transformadas, crescidas em presença de um substrato especial para a enzima intacta (X-gal), resultam em colônias azuis, porque contêm a enzima para reagir com o substrato. As seqüências codificadoras funcionais N-terminal e C-terminal do gene complementam-se mutuamente, gerando uma enzima funcional. Se, entretanto, um fragmento de DNA estrangeiro for inserido, interrompe a seqüência codificadora N-terminal da β-galactosidase, bactérias transformadas com essa molécula recombinante não produzirão enzima funcional. Colônias de bactérias que contêm esses vetores recombinantes podem ser detectadas visualmente como colônias brancas.

FIGURA 7.11Nick translation para marcar sondas de DNA. Moléculas purificadas de DNA podem ser marcadas radioati-vamente e usadas para detectar, por hibridização, a presença de RNA ou DNA complementar em amostras experimentais. (1) Etapa de nicking (corte) introduz quebras de fita-única aleatórias no DNA. (2) Etapa de tradução: DNA polimerase de E. coli (pol I) tem ambas: (a) atividade exonucleásica 5’→3’, que remove nucleotídeos da extremidade 5’ do corte (nick); e (b) atividade polimerase, que preenche simultaneamente a falha de fita-única com nucleotídeos marcados radioativamente, usando a extremidade 3’ como primer.

FIGURA 7.12Southern blot para transferir DNA de géis de agarose para nitrocelulose. Transferência de DNA para nitrocelulose, na forma de molécu-las de fita única, permite a detecção de seqüências específicas de DNA numa mistura complexa de DNA. A hibridização com sondas marcadas por nick translation pode demonstrar se uma seqüência de DNA de interesse está presente na mesma região ou em regiões diferentes do genoma.

FIGURA 7.13Ensaio de proteção de nuclease. mRNA celular total pode ser isolado de diferentes tecidos. Sondas de DNA fita-única que são complementares a seqüências conhecidas de diferentes genes transcritos (mRNAx, mRNAy, mRNAz) são hibridizadas com a mistura de RNAs. Digestão com uma ribonuclease hidrolisará as regiões de RNA fita-única de mRNA não-hibridizado com a sonda de DNA e todas as espécies de RNA que não hibridizaram. Só os híbridos DNA-RNA protegidos da nuclease permanecerão para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Expressão diferencial de genes em diferentes tecidos é, então, facilmente observada

FIGURA 7.15Síntese de cDNA a partir de mRNA. A cauda de poli(A) 3´ do mRNA é hibridizada com um oligôme-ro dT [oligo(dT)12-18] que serve de primer para transcriptase reversa, que catalisa a síntese da fita de DNA complementar (cDNA), em presença de todos os quatro desoxinucleotídeos trifosfato. O híbrido cDNA-mRNA resultante é separado em cDNA fita-única por fusão com aquecimento ou hidrólise do mRNA com álcali. A extremidade 3’ da molécula de cDNA forma uma alça em grampo que serve de primer para a síntese da segunda fita de DNA, catalisada pelo fragmento Klenow da DNA polimerase de E. coli. A alça de DNA fita-única não-pare-ada é hidrolisada por nuclease S1, gerando uma molécula de DNA fita-dupla.

FIGURA 7.16Modificação do cDNA para clonagem. O procedimento começa com o DNA fita-dupla que contém uma alça em grampo. Um DNA linker, contendo um sítio de endonuclease de restrição (RE1) é adicionado à extremidade livre do cDNA por ligação à extremidade cega. A alça em grampo de fita-única é, a seguir, hidrolisada com nuclease S1. Um segundo linker, com um sítio de endonuclease de restrição diferente em (RE2) é ligado à extremidade cega recém-criada no cDNA livre. O segundo linker possivelmente ligar-se-á às duas extremidades, mas não interferirá com o primeiro sítio de endonuclease de restrição. O DNA modificado é hidrolisado com as duas endonucleases de restrição e pode ser inserido em um plasmídeo ou DNA de um bacteriófago por clonagem direcional.

FIGURA 7.17Geração de cDNA por transcriptase reversa-PCR (RT-PCR). RNA celular total ou mRNA pode ser usado para gerar cDNA por RT-PCR. O mRNA com uma cauda de oligo(rA) é transcrito reversamente com um primer oligo(dT). Uma cauda oligo(dG) é adicionada à extremidade 3’ das fitas de RNA e DNA, e a fita de RNA é subseqüentemente hidrolisada com NaOH. Primers sense e antisense, modificados com seqüências de sítios de restrição são, então, empregados para amplificar o cDNA por PCR. Os produtos podem ser hidrolisados com as endonucleases de restrição específicas (RE1 e RE2) para clonagem e estudos subseqüentes.

FIGURA 7.18Clonando DNA genômico em bacteriófago λ. DNA genômico total é parcialmente digerido com uma endonuclease de restrição (p. ex., EcoRI). Isso resulta em fragmentos de DNA de tamanhos aleatórios, com extremidades coesivas fita-única. Fragmentos de DNA chamados braços cos são gerados com a mesma endonuclease de restrição a partir do DNA do bacteriófago. Os braços cos purificados contêm seqüências sinais necessárias ao empacotamento do DNA em um vírion do bacteriófago. Os fragmentos genômicos são misturados com os braços cos, pareados e ligados, formando seqüências de DNA linear concatenado. O empacotamento in vitro com proteínas do bacteriófago λ ocorre só com fragmentos de DNA de comprimento permitido (15-25 kb) ligado aos braços cos.

FIGURA 7.20Chromosome walking para analisar segmentos contínuos de DNA num genoma. Inicialmente, um fragmento de DNA é marcado por nick translation para examinar uma biblioteca à procura de fago λ recombinante contendo um gene de interesse. O DNA amplificado é mapeado com várias endonucleases de restrição para selecionar uma nova região (1a) dentro do DNA clonado original que possa ser reclonada (subclonada). O DNA subclonado (1a) é usado para identificar outros fragmentos de DNA na biblioteca original, que se sobreponham à região do DNA amplificado. O processo pode ser repetido muitas vezes para identificar regiões contíguas no DNA, antes e depois do DNA de interesse inicial (gene 1).

FIGURA 7.21Construção de um vetor de expressão bacteriano. Um cDNA de uma proteína de interesse é inserido depois (downstream) de seqüências regulatórias bacterianas (promotor, P) do gene lacZ, a seqüência codificadora da seqüência Shine-Dalgarno do mRNA, o códon AUG e alguns poucos códons dos aminoácidos N-terminais da proteína lacZ. O mRNA produzido a partir desse vetor de expressão dirige a síntese na bactéria de uma proteína de fusão com alguns de seus resíduos de aminoácidos N-terminais idênticos aos da lacZ.

FIGURA 7.22Expressão de genes estrangeiros em células eucarióticas COS. CV1, uma linhagem celular estabelecida em cultura de tecidos, de origem símia, pode ser infectada e suporta a replicação lítica do vírus símio de DNA SV40. Células são infectadas com um mutante de SV40 defectivo na origem (ori), cujo DNA in-tegra-se permanentemente ao genoma da célula CV1 hospe-deira. O DNA viral defectivo codifica continuamente proteínas que podem se associar com ori de SV40 normal, para regular a replicação. Devido a seu ori defectivo, o DNA viral integrado não produz vírus. As proteínas de SV40 sintetizadas na linha-gem celular CV1 permanentemente alterada, COS-1, podem, entretanto, induzir a replicação de plasmídeos recombinantes carregando SV40 com ori tipo selvagem, até um grande núme-ro de cópias (até 105 moléculas por célula). A proteína estran-geira sintetizada nas células transfectadas pode ser detectada imunológica ou enzimaticamente.

FIGURA 7.23Uso de vetores de expressão para estudar seqüências regula-tórias do DNA. O gene de interesse, com regiões flanqueadoras upstream e downstream do DNA, é inserido e clonado em um vetor de expressão, e a expressão basal do gene é determinada em uma célula apropriada. Regiões definidas de seqüências regulatórias em potencial podem ser removidas por clivagem com endonu-cleases de restrição, e o vetor do DNA recombinante trunca-do pode ser circularizado novamente, ligado e transfectado em uma célula hospedeira apropriada. O nível de expressão gênica em ausência do regulador em potencial é determinado e comparado a controles para verificar o papel regulatório da seqüência flanqueadora deletada da seqüência de DNA.

FIGURA 7.24Modificação enzimática de seqüências regulatórias de DNA em potencial. Uma molécula de DNA recombinante purificada, contendo um suposto elemento regulatório de um gene em regiões flanque-adoras do DNA, é clivado com uma endonuclease de restrição (RE2). O DNA recombinante linearizado é digerido por perío-dos variados com a exonuclease Bal31, reduzindo o tamanho do DNA que flanqueia o elemento potencialmente regulatório. As moléculas de DNA recombinante resultantes, de tama-nhos variavelmente reduzidos, têm pequenos oligômeros de DNA (linkers) contendo uma seqüência de restrição para RE2, ligados às suas extremidades. O DNA modificado por linker é hidrolisado com RE2 para criar extremidades coesivas de fita única complementares, que permitem a recircularização dos vetores recombinantes. O elemento regulatório em potencial, ligado a várias seqüências flanqueadoras de DNA de tamanhos variavelmente reduzidos, pode ser amplificado, purificado, seqüenciado e inserido upstream de um gene competente, em um vetor de expressão. Modificação da expressão do gene em uma célula transfectada apropriada pode ser monitorada para avaliar o papel do elemento regulatório em potencial colocado a distâncias variáveis do gene.

FIGURA 7.26Mutagênese por PCR inverso. Uma única base pode ser mutada em plasmídeos de DNA re-combinante por PCR inverso. Dois primers são sintetizados com suas extremidades 5’ antiparalelas complementares a bases adjacentes nas duas fitas de DNA. Um dos dois primers contém uma base específica errada, que é fielmente copiada durante as etapas de amplificação por PCR, gerando finalmente um plasmídeo recombinante contendo uma única base mutada.

FIGURA 7.27Produção de RNA antisense. Um gene, ou uma parte dele, é inserido em um vetor depois (downstream) de um promotor por clonagem direcional e em orientação inversa à que é normalmente encontrado. Transfecção desse DNA recombinante na célula parental que carrega o gene normal resulta na transcrição do RNA (RNA antisense) do DNA clonado com polaridade invertida, juntamente com o mRNA celular normal (RNA sense) transcrito. Os dois RNAs antiparalelos complementares hibridizam dentro da célula, resultando em expressão bloqueada (tradução) do mRNA normal transcrito.

FIGURA 7.28Produção de animais transgênicos. Genes funcionais clonados, amplificados e purificados são micro-injetados em vários pró-núcleos de óvulos fecundados de camundongos in vitro. Os ovos são implantados numa mãe adotiva. DNA é isolado de um pequeno fragmento da cauda de cada um dos filhotes e hibridizado com uma sonda marcada, para identificar animais que carregam o gene estrangeiro (camundongo transgênico). Os camundongos transgênicos podem ser cruzados entre si para estabelecer uma nova linhagem de camundongos. Linhagens celulares também podem ser estabelecidas a partir de tecidos de camundongos transgênicos para estudar regulação gênica e estrutura/função do produto do gene estrangeiro.

FIGURA 7.29Geração de um camundongo knockout. Células embrionárias em cultura podem ser manipuladas por tecnologia de recombinação para conterem um gene defectivo ou “deletado”. As células alteradas podem ser introduzidas em um blastocisto que é, então, implantado numa mãe adotiva. Filhotes que têm o gene “deletado” não-funcional em todas as suas células podem, então, ser selecionados – os animais knockout.

FIGURA 7.30Análise de microarray de DNA. A superfície de um suporte impermeável, tipicamente vidro ou polipropileno, é preparada para aplicar múltiplas amos-tras de DNA ou oligonucleotídeos. Lâmina com oligonu-cleotídeos ou ácidos nucléicos representando centenas de milhares de genes é incubada em uma câmara em condições apropriadas para hibridização, seguida de lavagens adequa-das para remover cDNA não-hibridizado. Manchas fluo-rescentes verdes indicariam genes expressos em células de fígado, manchas fluorescentes vermelhas indicariam genes expressos em células de pulmão, e manchas fluorescentes amarelas indicariam genes expressos em ambos os tecidos.

FIGURA 6.21Estrutura do colágeno, ilustrando (de cima para baixo) a regularidade da seqüência primária em uma hélice tipo II de poliprolina que gira para a esquerda; a tripla hélice que gira para a direita; a molécula de 300 nm; e a organização das moléculas em uma fibrila típica, dentro da qual moléculas de colágeno são unidas por ligações cruzadas

FIGURA 7.31Análise por microarray de expressão gênica em camundongos infectados com um parasita de malária de roedor. DNA, RNA ou oligonucleotídeos, representando parte ou todo o genoma ou as proteínas celulares – ou anticorpos, representando parte do proteoma celular – são fixados sobre um suporte impermeável. As sondas fixas reagem com componentes celulares apropria-dos marcados, que formarão um complexo estável por hibridização ou interações proteína-proteína. Identificação de ácidos nucléi-cos/proteínas que se associam com as amostras fixas no microarray permite a análise da expressão gênica celular em células mantidas em uma variedade de condições.Microarrays de DNA de camundongo foram produzidas para o genoma de camundongo, que contém 13.443 oligonucleotídeos sinté-ticos representando genes bem caracterizados de camundongos. Cada oligonucleotídeo tem 70 bases de comprimento, derivado da extremidade 3´ de cada gene, otimizado para minimizar hibridização cruzada com todos os genes de camundongos conhecidos. A ma-triz inclui um conjunto abrangente de genes relacionados ao sistema imune codificando um subconjunto de linfócitos e marcadores de ativação, citocinas, quimiocinas, seus receptores, moléculas de adesão, moléculas co-estimulatórias, fatores imuno-regulatórios, fatores de transcrição e proteínas de transdução de sinal e outras.Amostras: RNA de esplenócito de camundongo não-infectado foi usado para sintetizar cDNA com marcador fluorescente Cy3 (verde). RNA de esplenócito de camundongo no dia 8 de infecção com um parasita de malária de roedor foi usado para sintetizar cDNA com marcador fluorescente Cy5 (vermelho). As sondas de DNA marcadas para fluorescência misturadas foram hibridizadas com a matriz de oligonucleotídeos alvos. Genes que estão super-expressos em camundongos infectados com malária são vermelhos, e os que são sub-expressos nesses animais são verdes. Genes que não são afetados pelo parasita da malária são amarelos.Dados são de trabalho não-publicado do laboratório do Dr. James Burns, Departamento de Microbiologia, Drexel University College of Medicine.