fcup ao meu orientador, doutor josé antónio rodrigues ......fcup 3 agradecimentos ao meu...

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Agradecimentos

Ao meu orientador, Doutor José António Rodrigues, gostaria de agradecer todo o

apoio, disponibilidade e incentivo ao longo destes anos. Agradeço especialmente a

liberdade e autonomia que me foi dando e que me permitiu evoluir pessoal e

profissionalmente. Agradeço a oportunidade que sempre me deu de poder ser criativa.

Não esquecerei a forma como me orientou e a confiança que depositou em mim.

Ao Doutor Aquiles Araújo Barros gostaria sobretudo de agradecer por me ter

permitido fazer parte do grupo de Química Analítica e Qualidade Alimentar (QuAQuA).

Lembrar-me-ei sempre do seu dinamismo na gestão do grupo, mantendo-se sempre

firme nas suas convicções. Agradeço de forma muito especial o incentivo, a

disponibilidade e apoio em fases mais críticas, e a forma incansável como sempre o

fez.

Ao Doutor Paulo Almeida e ao Doutor Luís Guido agradeço toda a disponibilidade e

auxílio ao longo da minha estadia no QuAQuA e pela forma como me acolheram no

grupo.

A todos os colegas de laboratório no QuAQuA agradeço a ajuda e o bom ambiente

de trabalho proporcionado. Agradeço de forma particular àqueles com quem partilhei

mais tempo ao longo destes últimos anos e com quem trabalhei mais diretamente:

Manuela Moreira, Luís Gonçalves, Daniel Carvalho, Rui Ramos, Christiane Santos,

Eliana Tavares, Ana Sofia Silva, Ana Margarida Carvalho, Manuel Cruz, Patrick Pais,

Paulo Magalhães, João Pacheco, Ana Catarina Oliveira, Carolina Alves. Ao Manuel

Cruz e à Christiane Santos faço um agradecimento especial pela contribuição valiosa

para uma parte deste trabalho.

À Dra. Isabel Rocha agradeço toda a disponibilidade e ajuda no laboratório.

À Dra. Zélia Azevedo agradeço a enorme ajuda nos ensaios de espetrometria de

massa.

A todos os meus amigos, em especial à Manuela, ao Luís e ao Daniel com quem

tenho também o prazer de trabalhar. Agradeço-lhes os bons momentos passados

dentro e, sobretudo, fora do QuAQuA. À Manuela agradeço a amizade incondicional

ao longo destes anos e que também contribuíram de forma significativa para o meu

4 FCUP

Agradecimentos

crescimento pessoal. Qualquer outro agradecimento que lhe possa fazer será sempre

insuficiente. Ao Luís agradeço a amizade e a forma como me incentiva a ser cada vez

melhor. Agradeço as discussões (por vezes inflamadas) sobre assuntos diversos e

que, apesar das divergências, nos têm permitido crescer pessoal e profissionalmente.

À minha família, agradecendo de forma muito especial aos meus pais e irmão pela

enorme paciência, apoio e incentivo durante todos estes anos e, principalmente, nas

fases mais atribuladas.

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PUBLICAÇÕES DO AUTOR CONTENDO TRABALHO RELACIONADO COM ESTA

DISSERTAÇÃO

Manuel P. Cruz, Inês M. Valente, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues and

Aquiles A. Barros, Analytical and Bioanalytical Chemistry (2012) 403 (4), 1031-1037.

Inês M. Valente, Christiane M. Santos, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues and

Aquiles A. Barros, Analytical Methods (2012) 4, 2569-2573.

Inês M. Valente, Christiane M. Santos, Manuela M. Moreira, José A. Rodrigues,

Journal of Chromatography A (2013) 1271 (1), 27-32.

Inês M. Valente, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues, Journal of

Chromatography A (2013) 1308, 58-62.

Christiane M. Santos, Inês M. Valente, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues,

Analyst (2013) 138, 7233-7237.

Apoio financeiro da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) no âmbito do

PIDDAC através da bolsa de doutoramento com a referência SFRH/BD/69719/2010.

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Resumo

A perceção da qualidade das bebidas por parte dos consumidores depende

maioritariamente das suas características organoléticas e da manutenção no tempo

dessas características. Os defeitos organoléticos, designados por off-flavours, são

características sensoriais que não são habituais no aroma e sabor típicos desses

produtos. Os compostos químicos responsáveis por essas perceções sensoriais

podem surgir devido a contaminações durante o processo de fabrico, embalagem e

transporte e, mais habitualmente, por alterações químicas e/ou microbiológicas da

bebida durante o período de armazenamento. Neste último caso, os off-flavours

resultam, normalmente, de reações químicas entre diferentes componentes do

produto, de processos oxidativos, de reações induzidas pela luz ou por via enzimática.

Os off-flavours mais frequentemente identificados nas bebidas devem-se em

grande parte ao aparecimento de compostos que resultam de diversos processos

químicos e enzimáticos, entre os quais a oxidação lipídica, a reação de Maillard, a

degradação de aminoácidos e a atividade microbiológica. A maioria dessas espécies

químicas é volátil e pode ser detetada através da análise sensorial, dado que, em

geral, os seus limites de perceção sensorial são extremamente baixos (da ordem dos

ng L-1). Por outro lado, a determinação analítica desses compostos é também uma

importante ferramenta para a caracterização da qualidade do produto, complementar à

análise sensorial mas com a vantagem de permitir uma avaliação mais objetiva e, em

muitos casos, mais correta. Porém, a análise instrumental dos off-flavours representa

um grande desafio analítico na identificação e quantificação desses compostos, que só

com o recurso a técnicas analíticas de extração e deteção muito eficientes é possível

dar resposta.

A importância que a preparação da amostra tem na análise química e a constante

procura de metodologias de extração mais simples, sensíveis, de baixo custo e com

baixo consumo de solventes de baixa toxicidade motivou a realização deste trabalho.

Neste sentido, o trabalho descrito nesta tese envolve o desenvolvimento de

metodologias analíticas para a determinação de off-flavours em bebidas baseadas em

técnicas de extração cujas principais características se inserem no contexto da

Química Verde.

8 FCUP

Resumo

Neste trabalho foram utilizadas duas técnicas de extração principais para o

desenvolvimento de metodologias analíticas para a determinação de cetonas,

aldeídos, aminas e fenóis em amostras de vinho, cerveja e sumos de fruta. A análise

instrumental dos extratos foi realizada por cromatografia líquida (LC).

Uma das técnicas, a microextração por difusão gasosa (GDME), baseia-se na

extração de compostos voláteis de uma amostra líquida para um pequeno volume de

solução aceitadora líquida por difusão gasosa através de uma membrana porosa. Foi

realizado um estudo de caracterização do processo de extração com base na

avaliação de alguns parâmetros: natureza e características da membrana, modo de

extração, força iónica, temperatura, tempo, agitação da solução dadora, presença do

derivatizante na solução aceitadora e agitação desta solução. Os resultados obtidos

com soluções modelo de cetonas e aldeídos permitiram concluir que a seletividade da

extração depende essencialmente das características da membrana utilizada. A

eficiência da extração é afetada por todos os parâmetros estudados; no entanto está

sobretudo relacionada com a volatilidade dos analitos. Após a realização deste estudo

de caracterização, foram desenvolvidas metodologias para a determinação de alguns

compostos responsáveis por off-flavours (aminas, acetaldeído e compostos α-

dicarbonílicos) em vinhos e cervejas.

A segunda técnica de extração estudada neste trabalho foi a extração líquido-

líquido assistida por salting-out (SALLE). O processo consiste na separação de

solventes orgânicos miscíveis com a água (acetonitrilo, propanol, acetona, etc.) da

água por adição de um sal. A SALLE permite obter extratos diretamente compatíveis

com diversas técnicas instrumentais de análise, nomeadamente a cromatografia

líquida. Além disso, o baixo consumo de solventes e o uso de solventes de elevada

polaridade são duas características desta técnica que a tornam preferível à extração

líquido-líquido clássica. Neste trabalho foram inicialmente estudados alguns

parâmetros da SALLE (natureza e volume de solvente orgânico utilizado, natureza e

concentração do sal) em soluções modelo de compostos α-dicarbonílicos e em

amostras de cerveja. Posteriormente estes compostos foram quantificados em

amostras reais (vinho e cerveja).

A aplicação da SALLE em análise alimentar tem sido sobretudo utilizada na

metodologia QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), criada

para a determinação de pesticidas em amostras sólidas. Esta metodologia envolve

duas etapas: (1) extração dos analitos através de uma SALLE e (2) limpeza do extrato

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Resumo

9

orgânico obtido na etapa anterior por extração em fase sólida dispersiva (d-SPE).

Neste trabalho, foi desenvolvida uma metodologia baseada em QuEChERS para a

determinação de fenóis voláteis em bebidas (vinho, cerveja e sumos de fruta).

Palavras-chave

Bebidas, defeitos organoléticos, extração, extração líquido-líquido assistida por salting-

out (SALLE), microextração por difusão gasosa (GDME), off-flavours

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Abstract

Perception of beverages’ quality by consumers greatly depends on their

organoleptic characteristics and their maintenance over time. Organoleptic defects,

also known as off-flavours, are sensory characteristics that are not common in the

typical aroma and flavour of these products. The chemical compounds responsible for

these sensory perceptions may arise due to contamination during the production

process, packaging and transportation and, more usually, by chemical and/or

microbiological changes of the beverage during storage. In the latter, off-flavours are

normally a result of chemical reactions between different product components,

oxidative processes, light induced reactions or enzymatic reactions.

The more frequently off-flavours identified in beverages are due to the presence of

compounds formed by various chemical and enzymatic processes, including lipid

oxidation, Maillard reaction, amino acids’ degradation and microbial activity. Most of the

chemical species are volatile and can be detected by sensory analysis since that, in

general, their sensory perception limits are extremely low (of the order of ng L-1). On

the other hand, the analytical determination of these compounds is also an important

tool for the characterisation of the product’s quality, complementary to the sensory

analysis, with the advantage of allowing a more objective and, in many cases, more

accurate evaluation. However, off-flavours instrumental analysis is a major analytical

challenge for the identification and quantification of these compounds that is only

possible with the use of very efficient extraction and detection techniques.

The importance that the sample preparation has in analytical chemistry and the

constant search for simpler, more sensitive, low-cost and with low solvent consumption

with low toxicity motivated the realization of this work. In this sense, the work described

in this thesis involves the development of analytical methodologies for the

determination of off-flavours in beverages based on extraction techniques which main

characteristics fit into the Green Chemistry context.

In this work two extraction techniques were used to develop analytical

methodologies for the determination of ketones, aldehydes, amines and phenols in

wine, beer and fruit juice samples. The instrumental analysis of the extracts was

performed by liquid chromatography (LC).

12 FCUP

Abstract

One of the techniques, the gas-diffusion microextraction (GDME), is based on the

extraction of volatile compounds from a liquid sample to a small volume of an acceptor

liquid solution by gas-diffusion through a porous membrane. A study on the

characterization of the extraction process was conducted based on the evaluation of

several parameters: the nature and characteristics of the membrane, method of

extraction, ionic strength, temperature, time, stirring of the donor solution, the presence

of a derivatizing reagent in the acceptor solution and stirring of this solution. The results

obtained with model solutions of ketones and aldehydes showed that the selectivity of

the extraction depends essentially on the characteristics of the membrane. The

extraction efficiency is affected by all the parameters studied; however it is mainly

related to the analytes’ volatility. After this characterization study, methodologies for the

determination of some compounds responsible for off-flavours (amines, acetaldehyde

and α-dicarbonyl compounds) in wines and beers were developed.

The second studied extraction technique in this work was salting-out assisted liquid-

liquid extraction (SALLE). The process consists on the separation of water-miscible

organic solvents (acetonitrile, propanol, acetone, etc.) and water by addition of a salt.

SALLE allows the analyst to obtain extracts directly compatible with different

instrumental analytical techniques, including liquid chromatography. Furthermore, the

low solvent consumption and the use of high polarity solvents are two characteristics of

this technique that make it preferable to classical liquid-liquid extraction. In this work

some parameters of SALLE (type and volume of organic solvent, nature and

concentration of the salt) were initially studied in model solutions of α-dicarbonyl

compounds and beer samples. Subsequently these compounds were quantified in real

samples (wine and beer).

The application of SALLE in food analysis has been mainly used in the QuEChERS

(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) methodology, created for the

determination of pesticides in solid samples. This methodology involves two steps: (1)

extraction of analytes through SALLE and (2) clean-up of the organic extract obtained

in the previous step by dispersive solid-phase extraction (d-SPE). In this work a

methodology based on QuEChERS for the determination of volatile phenols in

beverages (wine, beer and fruit juices) was developed.

FCUP

Abstract

13

Keywords

Beverages, extraction, gas-diffusion microextraction (GDME), off-flavours, organoleptic

defects, salting-out assisted liquid-liquid extraction (SALLE)

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15

Índice

Agradecimentos ............................................................................................................ 3

Resumo ........................................................................................................................ 7

Abstract ...................................................................................................................... 11

Lista de abreviaturas................................................................................................... 29

Parte I - Introdução

1. Off-flavours em bebidas ....................................................................................... 35

1.1. Oxidação lipídica ........................................................................................... 36

1.2. Reação de Maillard ....................................................................................... 38

1.3. Degradação de aminoácidos ......................................................................... 39

1.4. Atividade microbiológica ................................................................................ 40

2. Técnicas de extração de off-flavours de bebidas ................................................. 41

2.1. Técnicas de extração em headspace ............................................................ 42

2.2. Técnicas de extração para fase líquida ......................................................... 44

2.2.1. Extração líquido-líquido clássica ............................................................ 44

2.2.2. Microextração em fase líquida ............................................................... 45

2.3. Técnicas de extração para fase sólida .......................................................... 49

2.3.1. Extração em fase sólida ........................................................................ 49

2.3.2. Microextração em fase sólida ................................................................ 51

2.3.3. Extração sortiva em barra de agitação................................................... 54

2.4. Técnicas de extração assistidas por membranas .......................................... 55

2.4.1. Extração líquido-líquido assistida por membrana ................................... 56

2.4.2. Difusão gasosa ...................................................................................... 58

2.4.3. Pervaporação ........................................................................................ 59

3. Enquadramento do trabalho................................................................................. 63

3.1. Compostos químicos estudados ................................................................... 63

16 FCUP

Índice

3.1.1. Compostos α-dicarbonílicos ................................................................... 63

3.1.2. Acetaldeído ........................................................................................... 64

3.1.3. Aminas biogénicas................................................................................. 67

3.1.4. Fenóis voláteis ....................................................................................... 69

3.2. Técnicas de extração utilizadas neste trabalho ............................................. 71

3.2.1. Microextração por difusão gasosa ......................................................... 71

3.2.2. Extração líquido-líquido assistida por salting-out ................................... 73

Parte II - Microextração por difusão gasosa

4. Introdução ............................................................................................................ 79

5. Execução experimental ........................................................................................ 81

5.1. Materiais e equipamentos ............................................................................. 81

5.2. Preparação de soluções ................................................................................ 83

5.3. Procedimentos experimentais ....................................................................... 84

5.3.1. Caracterização do processo de extração ............................................... 84

5.3.2. Determinação de aminas biogénicas alifáticas ...................................... 85

5.3.3. Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos ............................. 86

5.3.4. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares88

6. Caracterização do processo de extração ............................................................. 91

6.1. Influência da natureza e características da membrana.................................. 91

6.2. Estudo do modo de extração: módulo imerso ou em headspace .................. 96

6.3. Influência da força iónica ............................................................................. 101

6.4. Influência da temperatura de extração ........................................................ 103

6.5. Influência do tempo de extração ................................................................. 104

6.6. Influência da agitação da solução dadora ................................................... 106

6.7. Influência do derivatizante na solução aceitadora ....................................... 107

6.8. Influência da agitação da solução aceitadora .............................................. 108

7. Determinação de aminas biogénicas alifáticas .................................................. 111

7.1. Otimização dos parâmetros da extração ..................................................... 111

FCUP

Índice

17

7.2. Validação da metodologia ........................................................................... 114

7.3. Quantificação das aminas em vinho e cerveja ............................................ 116

8. Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos ......................................... 117

8.1. Otimização das condições de extração ....................................................... 117

8.2. Estudo da influência do SO2 e do etanol ..................................................... 118


8.4. Quantificação do acetaldeído em vinhos ..................................................... 120

8.5. Identificação por HPLC–DAD–MS/MS dos compostos extraídos ................ 121

9. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares ........... 125

9.1. Otimização das condições de extração ....................................................... 125


9.3. Quantificação dos compostos α-dicarbonílicos nas amostras ..................... 126

10. Conclusões ........................................................................................................ 129

Parte III - Extração líquido-líquido assistida por salting-out

11. Introdução .......................................................................................................... 135

12. Execução experimental ...................................................................................... 137

12.1. Materiais e equipamentos ........................................................................... 137

12.2. Preparação de soluções .............................................................................. 138

12.3. Procedimentos experimentais ..................................................................... 140

12.3.1. Determinação de compostos α-dicarbonílicos para o estudo da SALLE

140

12.3.2. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras de bebidas

utilizando a SALLE ............................................................................................ 141

12.3.3. Determinação de fenóis voláteis através da metodologia QuEChERS 143

13. Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas

acetonitrilo-água ....................................................................................................... 145

13.1. Estudo do efeito do solvente orgânico e dos sais na extração .................... 146

13.2. Estudo do efeito da concentração de sal na extração ................................. 147

13.3. Estudo do efeito do volume de acetonitrilo na extração............................... 149

18 FCUP

Índice

13.4. Aplicação do processo de extração à análise de bebidas ........................... 150

14. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE .. 153

14.1. Efeito do reagente derivatizante na extração .............................................. 153

14.2. Efeito da natureza do sal utilizado na extração ........................................... 154

14.3. Efeito do pH da amostra .............................................................................. 156


14.5. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em vinho e cerveja .............. 160

15. Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia

QuEChERS .............................................................................................................. 163

15.1. Seleção do solvente extrator ....................................................................... 163

15.2. Seleção do sal a utilizar na extração dos fenóis voláteis ............................. 164

15.3. Seleção do adsorvente para a limpeza do extrato por d-SPE...................... 165


15.5. Quantificação dos fenóis nas amostras ....................................................... 168

16. Conclusões ........................................................................................................ 171

Parte IV - Propostas de trabalho futuro

Referências bibliográficas ......................................................................................... 181

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19

Índice de tabelas


Tabela 2.1 – Lista de compostos responsáveis por off-flavours em bebidas em que se

utilizou a LLE para a extração. .................................................................................... 45

Tabela 2.2 – Exemplos de aplicações de técnicas de LPME à extração de off-flavours

de bebidas .................................................................................................................. 46

Tabela 2.3 – Lista de aplicações da SPE na extração de off-flavours de bebidas para

análise por LC, GC e eletroforese capilar (CE). .......................................................... 51

Tabela 2.4 – Lista de aplicações de SPME em modo headspace e de imersão na

amostra para a determinação de alguns compostos responsáveis por off-flavours em

bebidas. ...................................................................................................................... 53

Tabela 2.5 – Lista de aplicações da PV para a determinação de off-flavours em

bebidas ....................................................................................................................... 62

Tabela 3.1 – Lista de metodologias analíticas para a determinação de compostos α-

dicarbonílicos em bebidas........................................................................................... 64


Tabela 5.1 - Características principais das membranas utilizadas no módulo de GDME.

................................................................................................................................... 82

Tabela 5.2 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações

dos compostos extraídos por GDME. ......................................................................... 83

Tabela 5.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho e cerveja

analisadas para a determinação de aminas alifáticas. ................................................ 86

Tabela 5.4 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho analisadas para a

determinação de acetaldeído livre e total. ................................................................... 87

Tabela 5.5 – Condições utilizadas no detetor de MS para os estudos de identificação

dos compostos extraídos por GDME. ......................................................................... 88

Tabela 6.1 – Lista dos valores das constantes de Henry (KH) para as cetonas e

aldeídos estudados por ordem crescente de volatilidade. ........................................... 99

20 FCUP

Índice de tabelas

Tabela 7.1 – Limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ), e repetibilidade da

metodologia desenvolvida para a quantificação de aminas alifáticas por GDME. ..... 115

Tabela 7.2 – Valores de concentração obtidos para as aminas biogénicas alifáticas por

GDME nas amostras de vinho e cerveja descritas na Tabela 5.3. ............................ 116

Tabela 8.1 – Compostos identificados por HPLC-DAD-MS/MS em extratos de

amostras de vinho. ................................................................................................... 122


Tabela 12.1 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações

cromatográficas dos compostos extraídos por SALLE. ............................................. 138

Tabela 12.2 – Designações e composições dos tubos comerciais e não comerciais de

d-SPE testados na limpeza do extrato em acetonitrilo. ............................................. 140

Tabela 12.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras analisadas para a

determinação de compostos α-dicarbonílicos após extração por SALLE. ................. 143

Tabela 14.1 – Equações das curvas de calibração, coeficientes de determinação e

limites de deteção e quantificação dos compostos α-dicarbonílicos extraídos de

soluções padrão de acordo com o procedimento descrito na secção 12.3.2. ............ 158

Tabela 14.2 – Valores de repetibilidade e reprodutibilidade para os compostos α-

dicarbonílicos estudados obtidos a partir da análise de extratos de amostras de vinho

branco, vinho tinto e cerveja. .................................................................................... 160

Tabela 15.1 – Limites de deteção e de quantificação, repetibilidade, reprodutibilidade e

taxas de recuperação da metodologia desenvolvida para a determinação de fenóis

voláteis em bebidas. ................................................................................................. 167

Tabela 15.2 – Concentrações (mg L-1) obtidas para os fenóis voláteis quantificados nas

amostras de bebidas analisadas. .............................................................................. 168


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Índice de figuras


Fig. 1.1 - Principais compostos químicos resultantes da oxidação lipídica de (A) ácidos

gordos saturados e (B, C e D) insaturados. ................................................................ 37

Fig. 1.2 – Esquema simplificado da reação de Maillard. Adaptado de Hodge [8]. ....... 39

Fig. 2.1 – Esquema de um módulo de extração por headspace. Adaptado de Pacheco

et al. [16] ..................................................................................................................... 44

Fig. 2.2 – Esquema da extração por DLLME. ............................................................. 47

Fig. 2.3 – Representação esquemática de SDME por imersão (A) e no headspace (B).

................................................................................................................................... 48

Fig. 2.4 – Imagens de microscopia eletrónica de varrimento de uma membrana HF: (a)

secção transversal, (b) superfície interior, (c) superfície exterior, (d) e (e) secções

transversais parciais com diferentes aumentos. Retirado de Sukitpaneenit et al. [46]. 49

Fig. 2.5 – Representação de um dispositivo de extração de SPME. Adaptado de Lord e

Pawliszyn [69]. ............................................................................................................ 52

Fig. 2.6 – Representação esquemática de (a) uma barra de agitação revestida com

PDMS para SBSE e (b) de um dispositivo para HSSE. Adaptada de Bicchi et al. [72].

................................................................................................................................... 55

Fig. 2.7 – Esquema de um sistema em fluxo usando SLME. Adaptado de Wang et al.

[95]. ............................................................................................................................ 57

Fig. 2.8 – Esquema de diferentes configurações de membranas em forma de saco

utilizadas para SLME. Adaptado de Schellin e Popp [94]. ........................................... 57

Fig. 2.9 – Representação esquemática da HF-LPME em sistemas de (A) duas e (B)

três fases. Adaptado de Psillakis e Kalogerakis [97]. .................................................. 58

Fig. 2.10 – Esquema do processo de extração por HF-LGLME. Adaptado de

Farajzadeh e Assadi [107]. ......................................................................................... 59

Fig. 2.11 – Esquema de um módulo de PV convencional. Adaptado de Luque de

Castro e Gámiz-Gracia [113]. ..................................................................................... 60

Fig. 3.1- Esquema representativo da reação química entre a OFDA e os compostos α-

dicarbonílicos. ............................................................................................................. 64

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Índice de figuras

Fig. 3.2 – Equações químicas que representam a formação de adutos entre o HSO3- e

compostos carbonílicos [156]. ..................................................................................... 66

Fig. 3.3 – Equação química que representa a reação do DNPH com aldeídos. .......... 67

Fig. 3.4 – Estruturas químicas de algumas aminas biogénicas. .................................. 67

Fig. 3.5 – Esquema que representa a reação química entre o PITC e as aminas. ...... 69

Fig. 3.6 – Mecanismo da formação enzimática de vinilfenóis e etilfenóis por

Brettanomyces (adaptado de [157]). ........................................................................... 70

Fig. 3.7 – Imagens obtidas por microscopia eletrónica de varrimento de células de

levedura Brettanomyces [178]. ................................................................................... 70

Fig. 3.8 – Representação esquemática do módulo de GDME. .................................... 72

Fig. 3.9 – Esquema do procedimento experimental de GDME e representação do

processo de extração quando na solução aceitadora existe um reagente derivatizante

β a reagir com o analito α, originando γ. ..................................................................... 72


Fig. 5.1 – Esquema do procedimento experimental utilizado para a determinação de

aminas alifáticas. ........................................................................................................ 85

Fig. 6.1 - Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão

com uma concentração de 1 mg L-1 de cada um dos compostos α-dicarbonílicos. As

extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10 min e as condições cromatográficas

foram as descritas na secção 5.3.1. ............................................................................ 92

Fig. 6.2 – Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão

com uma concentração de 2 mg L-1. As extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10

min e as condições cromatográficas foram as descritas na secção 5.3.1. .................. 92

Fig. 6.3 – Soma das áreas dos picos cromatográficos de cetonas e aldeídos extraídos

a partir de misturas aquosas destes compostos utilizando diferentes membranas

hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão

contendo 1 mg L-1 de cada composto dicarbonílico e 5 mg L-1 de cada aldeído e

acetoína, a 55 ºC durante 10 min. ............................................................................... 93

Fig. 6.4 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído, metilglioxal e acetoína

obtidos a partir da extração de soluções aquosas utilizando diferentes membranas

hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão

FCUP

Índice de figuras

23

contendo 1 mg L-1 de metilglioxal e 5 mg L-1 de formaldeído e acetoína, a 55 ºC

durante 10 min. ........................................................................................................... 94

Fig. 6.5 – Áreas dos picos cromatográficos do acetaldeído e diacetilo obtidos a partir

da extração de soluções aquosas utilizando diferentes membranas hidrofóbicas

(Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 5 mg L-1

de acetaldeído e 1 mg L-1 de diacetilo, a 55 ºC durante 10 min. ................................. 94

Fig. 6.6 – Esquema dos modos de extração por GDME estudados: (A) com o módulo

imerso na solução dadora e (B) com o módulo no headspace da solução dadora. ..... 97

Fig. 6.7 – Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração

é superior quando se realiza a extração com o módulo de GDME imerso na solução

dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de

metilglioxal e diacetilo e 2 mg L-1 de acetoína, formaldeído e furfural, a 55 ºC durante

10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1). ......................................... 98

Fig. 6.8 - Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração é

superior quando se realiza a extração com o módulo de GDME no headspace da

solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-

1 de pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona e 2 mg L-1 de cada um dos restantes

compostos, a 55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).

................................................................................................................................... 98

Fig. 6.9 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído e do decanal para a

extração por GDME destes compostos com diferentes concentrações de NaCl na

solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 2 mg L-

1 de formaldeído e decanal, a 55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas

SureVent (Tabela 5.1). .............................................................................................. 102

Fig. 6.10 - Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal para a extração por GDME

com diferentes concentrações de NaCl na solução dadora. As extrações foram

realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 metilglioxal, a 55 ºC durante 10

min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1). ............................................ 102

Fig. 6.11 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-

diona e hexano-2,3-diona realizando a extração por GDME a temperaturas diferentes

(entre 25 e 65 ºC). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg

L-1 de cada analito, durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1)

................................................................................................................................. 103

24 FCUP

Índice de figuras

Fig. 6.12 – Variação das áreas dos picos cromatográficos dos compostos

dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona) com o

tempo de extração. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1

mg L-1 de cada analito, a 55 ºC e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1). . 104

Fig. 6.13 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração

com e sem agitação da solução aceitadora. As extrações foram realizadas com

soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas

Mitex (Tabela 5.1). .................................................................................................... 107


com agitação da solução dadora, a presença e ausência de derivatizante na solução

aceitadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de

diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1). ............................. 108

Fig. 6.15 - Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração

com e sem agitação da solução aceitadora (não contendo o reagente derivatizante).

As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a

25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1). ............................................... 109


com e sem agitação da solução aceitadora (contendo o reagente derivatizante). As

extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25

ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1). .................................................... 109

Fig. 7.1 – Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando

diferentes concentrações de NaOH na solução dadora. As extrações foram realizadas

utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, a 40 ºC, durante 10 min. . 112

Fig. 7.2 - Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando

diferentes temperaturas de extração. As extrações foram realizadas utilizando

soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, durante 15 min. .............................. 113

Fig. 7.3 - Representação gráfica das áreas dos picos cromatográficos das aminas

biogénicas alifáticas utilizando diferentes tempos de extração. As extrações foram

realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, a 40 ºC. ......... 114

Fig. 7.4 – Cromatograma obtido para um extrato de uma amostra de cerveja preta de

acordo com as condições referidas na secção 5.3.2. ................................................ 115

Fig. 8.1 – Variação da área do pico cromatográfico do acetaldeído com (A) o tempo (a

uma temperatura de 50 ºC) e (B) a temperatura de extração (durante 15 min). As

extrações foram realizadas utilizando uma amostra de vinho tinto. ........................... 117

FCUP

Índice de figuras

25

Fig. 8.2 – Variação do sinal analítico do acetaldeído com a concentração de SO2 para

o estudo do efeito da concentração de SO2 no teor de acetaldeído extraído. As

extrações foram realizadas sobre uma amostra de vinho tinto, a 50 ºC durante 15 min.

................................................................................................................................. 119

Fig. 8.3 – Concentração de acetaldeído livre e total (barras) e da percentagem de

acetaldeído ligado (pontos) obtidas nas amostras de vinho descritas na Tabela 5.4. As

extrações foram realizadas de acordo com o procedimento descrito na secção 5.3.3.

................................................................................................................................. 121

Fig. 8.4 - Cromatograma de um extrato de uma amostra de vinho utilizando as

condições descritas na secção 5.3.3; os picos numerados representam os compostos

identificados e que se encontram listados na Tabela 8.1. ......................................... 122

Fig. 9.1 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-

diona obtidos a partir da extração de uma solução padrão (contendo 1 mg L-1 de cada

analito) utilizando as membranas de SureVent e Mitex; as extrações foram realizadas

em triplicado a 55 ºC durante 10 min. ....................................................................... 125

Fig. 9.2 – Concentrações de metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidas nas

amostras analisadas e descritas na secção 5.3.4. .................................................... 127


Fig. 12.1 – Esquema simplificado do procedimento de extração por SALLE para o

estudo da técnica em misturas acetonitrilo-água. ..................................................... 141

Fig. 12.2 – Esquema do procedimento experimental para a determinação de

compostos α-dicarbonílicos utilizando SALLE. .......................................................... 142

Fig. 12.3 – Esquema do procedimento de preparação da amostra para a determinação

de fenóis voláteis por HPLC-UV-FLD. ....................................................................... 144

Fig. 13.1 – Cromatograma obtido a partir da extração de uma solução padrão

contendo 5 mg L-1 de cada um dos compostos analisados utilizando as condições de

extração e de separação cromatográfica descritas na secção 12.3.1. ...................... 145

Fig. 13.2 – Representação gráfica da fração extraída média em função da razão de

fases (R) obtidos para a extração dos derivados dos compostos α-dicarbonílicos de

soluções de acetonitrilo-água (1:1, v/v) usando diferentes sais com concentração na

mistura de 1 mol L-1. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-

1 de cada analito. ...................................................................................................... 147

26 FCUP

Índice de figuras

Fig. 13.3 – Fração extraída dos compostos α-dicarbonílicos em função da

concentração de sal na mistura acetonitrilo-água para os três sais testados (MgSO4, o

Na2CO3 e o NaCl). As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1

de cada analito. ........................................................................................................ 148

Fig. 13.4 – Representações gráficas da variação do volume de fase orgânica recolhida

(A) e da fração extraída do derivado de glioxal (B) em função do volume de acetonitrilo

adicionado para a extração usando os três sais estudados (MgSO4, o Na2CO3 e NaCl).

As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1 de cada analito

com uma concentração constante de sal na mistura de 0,5 mol L-1. ......................... 149

Fig. 13.5 – Fração extraída média de compostos α-dicarbonílicos em soluções padrão

(5 mg L-1) e em amostras de cerveja sem e com álcool dopadas com os cinco

compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1), utilizando diferentes sais para a extração com

acetonitrilo com uma concentração na mistura de 1 mol L-1. ..................................... 151

Fig. 13.6 – Razão de fases (A) e fração extraída média dos compostos α-dicarbonílicos

(B) em função da concentração de NaCl utilizada para a extração de compostos α-

dicarbonílicos de soluções padrão (5 mg L-1) e de amostras de cerveja sem e com

álcool dopadas com os cinco compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1). ....................... 151

Fig. 14.1 – Esquemas dos procedimentos experimentais (A, B e C) realizados para o

estudo do efeito do reagente derivatizante na extração usando uma solução padrão de

α-dicarbonilos (0,5 mg L-1). ....................................................................................... 153

Fig. 14.2 – Áreas dos picos cromatográficos dos quatro compostos estudados

realizando os três procedimentos representados na Fig. 14.1. As extrações foram

realizadas com uma solução padrão contendo 0,5 mg L-1 de cada analito e utilizando

NaCl com uma concentração na mistura de 0,5 mol L-1. ........................................... 154

Fig. 14.3 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE

realizadas com NaCl, Na2CO3 e CH3COONa com concentrações na mistura de 0,5 mol

L-1. Foram utilizadas soluções padrão de compostos α-dicarbonílicos contendo 0,5 mg

L-1 de cada um dos analitos. ..................................................................................... 155

Fig. 14.4 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE

realizadas com NaCl, Na2CO3 e CH3COONa (numa concentração de 0,5 mol L-1 na

mistura) utilizando amostras de vinho branco, vinho tinto e cerveja dopadas com os

compostos α-dicarbonílicos em estudo (0,25 mg L-1). ............................................... 156

Fig. 14.5 – Concentrações dos compostos α-dicarbonílicos obtidas para diferentes

valores de pH da amostra de vinho tinto. .................................................................. 157

FCUP

Índice de figuras

27

Fig. 14.6 – Cromatogramas obtidos a partir da extração de amostras de vinho tinto

(vinho tinto 2, Tabela 12.3) com diferentes adições de soluções padrão de compostos

α-dicarbonílicos, As condições utilizadas para a separação cromatográfica encontram-

se na secção 12.3.2. ................................................................................................. 159

Fig. 14.7 – Valores de concentração do glioxal, metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-

diona obtidos para as amostras de vinho e de cerveja analisadas (Tabela 12.3). (ND,

não detetado; NQ, não quantificado; a, não determinado). ........................................ 161

Fig. 15.1 – Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados

utilizando diferentes sais ou misturas de sais (secção 12.2) para a extração dos

compostos de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (a

etapa de d-SPE foi realizado com o tubo PSA). ........................................................ 164

Fig. 15.2 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados

utilizando NaCl com e sem MgSO4 para a extração dos compostos de uma amostra de

vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (d-SPE foi realizado com o tubo PSA).

................................................................................................................................. 165

Fig. 15.3 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados

utilizando diferentes sorventes (Tabela 12.2) para a etapa de d-SPE em extratos

obtidos da extração de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada

fenol usando 2 g NaCl. ............................................................................................. 166

Fig. 15.4 – Cromatogramas obtidos a partir da análise de uma amostra de vinho tinto

dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (a vermelho) e de um extrato da mesma amostra

utilizando 2 g NaCl para o SALLE e o tubo PSA para o d-SPE (a azul). ................... 166

Fig. 15.5 – Concentrações de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol determinadas nas amostras

de vinho, cerveja, néctares e sumos de fruta ao longo do tempo de armazenamento a

4 ºC. ......................................................................................................................... 170


FCUP

29

Lista de abreviaturas

CE Eletroforese capilar (do inglês, capillary electrophoresis)

DAD Detetor espetrofotométrico com rede de díodos (do inglês, diode-array detector)

DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva (do inglês, dispersive liquid-liquid microextraction)

DNPH Dinitrofenilidrazina

DNS-Cl Cloreto de dansilo

d-SPE Extração em fase sólida dispersiva (do inglês, dispersive solid-phase extraction)

ESI Ionização por electrospray (do inglês, electrospray ionization)

GC Cromatografia gasosa (do inglês, gas chromatography)

GD Difusão gasosa (do inglês, gas-diffusion)

GDME Microextração por difusão gasosa (do inglês, gas-diffusion microextraction)

HF Fibra oca (do inglês, hollow fiber)

FIA Análise por injeção em fluxo (do inglês, flow-injection analysis)

FID Detetor de ionização de chama (do inglês, flame ionization detector)

FLD Detetor de fluorescência (do inglês, fluorescence detector)

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, high performance liquid chromatography)

HSSE Extração sortiva em headspace (do inglês, headspace sorptive extraction)

LC Cromatografia líquida (do inglês, liquid chromatography)

LD Limite de deteção

LGLME Microextração líquido-gás-líquido (do inglês, liquid-gas-liquid microextraction)

LLE Extração líquido-líquido (do inglês, liquid-liquid extraction)

LLME Microextração líquido-líquido (do inglês, liquid-liquid microextraction)

LPME Microextração em fase líquida (do inglês, liquid phase microextraction)

LQ Limite de quantificação

MS Espetrometria de massa (do inglês, mass spectrometry)

NPD Deteção de azoto/fósforo (do inglês, nitrogen phosphorous detector)

30 FCUP

Lista de abreviaturas

OFDA o-fenilenodiamina

OPA o-ftalaldeído (do inglês, o-phthalaldehyde)

PDMS Polidimetilsiloxano

PFBHA o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)hidroxilamina

PFPH Pentafluorofenilidrazina

PITC Isotiocianato de fenilo (do inglês, phenyl isothiocyanate)

PTC Feniltioureia (do inglês, phenylthiourea)

PTFE Politetrafluoroetileno

PV Pervaporação

PVDF Fluoreto de polivinilideno (do inglês, polyvinylidene difluoride)

QuEChERS Acrónimo de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe

SALLE Extração líquido-líquido assistida por salting-out (do inglês, salting-out assisted liquid-liquid

extraction)

SDME Microextração em gota suspensa (do inglês, single drop microextraction)

SBSE Extração sortiva em barra de agitação (do inglês, stir bar sorptive extraction)

SLME Extração líquido-líquido suportada em membrana (do inglês, supported liquid membrane

extraction)

SPE Extração em fase sólida (do inglês, solid-phase extraction)

SPME Microextração em fase sólida (do inglês, solid-phase microextraction)

tR Tempo de retenção

USAEME Microextração por emulsificação assistida por ultrassons (do inglês, ultrasound-assisted

emulsification-microextraction)

Parte I

Introdução

FCUP

35

1. Off-flavours em bebidas

A perceção da falta de qualidade de bebidas e alimentos frescos, processados ou

embalados leva a que todos os anos a indústria alimentar receba inúmeras queixas de

consumidores. Na maioria dos casos estas ocorrências são pontuais mas, por vezes, o

problema pode envolver a perda da produção de um lote ou de várias embalagens de

um produto. Essas características indesejáveis podem ocorrer devido a uma

contaminação de uma fonte externa (por exemplo, ar, água, material de embalagem)

sendo denominada taint, ou pode ser originada pela degradação de alguns

componentes do produto (por oxidação lipídica, escurecimento não enzimático, ação

enzimática, atuação de microrganismos, etc.) sendo, neste caso, denominada off-

flavour. Pode ainda ser considerada uma terceira causa para o aparecimento de

características indesejáveis, cujo diagnóstico é mais difícil, e que corresponde à

alteração do sabor/aroma devido à perda do aroma/sabor característico (por

evaporação ou reação de componentes do alimento ao longo do tempo) [1]. Apesar

dos termos taint e off-flavour serem utilizados diversas vezes indistintamente, no

contexto deste trabalho o termo off-flavour será utilizado para designar um aroma ou

sabor indesejável que resulta da degradação química ou microbiológica de

componentes do produto.

Os compostos químicos responsáveis pelo aparecimento de off-flavours em

bebidas estão, geralmente, presentes em concentrações abaixo dos microgramas por

litro. No entanto, mesmo assim, representam um sério problema de qualidade do

produto devido aos seus baixos limites de perceção sensorial1.

Neste capítulo faz-se uma descrição crítica das principais fontes responsáveis por

off-flavours em bebidas: (1) a oxidação lipídica, (2) a reação de Maillard, (3) a

degradação de aminoácidos e (4) a atividade microbiológica.

1 Concentração mínima do composto à qual é detetado na análise sensorial.

36 FCUP

Off-flavours em bebidas

1.1. Oxidação lipídica

A degradação de lípidos é uma das principias vias de formação de off-flavours e

pode ocorrer por oxidação ou por ação enzimática. Em geral a oxidação lipídica ocorre

por reação do oxigénio com ácidos gordos saturados e insaturados através de reações

com radicais livres, podendo ou não ser iniciada por ação da luz. Dessas reações

resulta uma mistura de compostos voláteis, geralmente aldeídos, cetonas, ácidos

carboxílicos, álcoois, hidrocarbonetos, lactonas e ésteres. Os principais compostos

formados a partir da oxidação de lípidos saturados e insaturados encontram-se na Fig.

1.1. Os aldeídos e as cetonas insaturados são os produtos da oxidação lipídica que

mais contribuem para os off-flavours, essencialmente devido aos seus baixos limites

de perceção olfativa [1]. A oxidação de lípidos pode também ocorrer por ação

enzimática originando compostos semelhantes aos produzidos por via química.

A oxidação lipídica é influenciada por diversos fatores. O número e tipo de ligações

duplas dos ácidos gordos são um dos principais fatores que determinam a velocidade

do processo oxidativo. Por exemplo, na série de ácidos gordos compreendendo os

ácidos araquidónico, linolénico, linoleico e oleico, o primeiro (que tem quatro ligações

duplas) é mais rapidamente oxidado que os restantes (que têm três, duas e uma

ligação dupla, respetivamente). A presença de iões metálicos em quantidades

vestigiais, sobretudo os iões cobre, ferro e cobalto, influenciam de forma significativa o

processo oxidativo. Estes iões metálicos atuam diminuindo o período de indução e na

decomposição dos radicais livres, aumentando a velocidade da reação. Estes iões

metálicos podem existir na forma livre ou fazendo parte da estrutura de enzimas. A

velocidade da oxidação aumenta com o aumento da temperatura; no entanto, quando

a oxidação é catalisada por enzimas, a reação é geralmente mais rápida entre 30 e 45

ºC e diminui quando a enzima é desnaturada. Além disso, essas reações enzimáticas

ocorrem com ácidos gordos específicos e são dependentes do pH [1, 2]. Para além

dos iões metálicos, da temperatura e do pH, a luz também influencia a oxidação

lipídica pelo facto de induzir uma série de reações que caracterizam este processo.

FCUP


37

Fig. 1.1 - Principais compostos químicos resultantes da oxidação lipídica de (A) ácidos gordos saturados e (B, C e D)

insaturados.

A oxidação lipídica é favorecida em alimentos com baixo teor em água e uma

elevada quantidade de ácidos gordos polinsaturados. No entanto, dado que uma

grande parte dos alimentos e bebidas contêm lípidos, em quase todos esses produtos

pode ocorrer este processo.

Os aromas “herbáceos” são atribuídos a álcoois e aldeídos produzidos por

oxidação enzimática de ácidos gordos insaturados. Os principais são o hexanal, o

38 FCUP


trans-octen-2-al e o trans-2-nonenal [3, 4]. O trans-2-nonenal é o aldeído característico

do aroma a “ranço, cartão” resultante do processo de oxidação lipídica durante o

envelhecimento da cerveja [5]. A extensa investigação sobre este aldeído permitiu

caracterizar as suas vias de formação como sendo devidas à oxidação lipídica dos

ácidos linoleico e linolénico [4]. Aliás, uma grande parte dos estudos sobre o

envelhecimento da cerveja centra-se na oxidação de ácidos gordos insaturados [6].

1.2. Reação de Maillard

A reação de Maillard é responsável pela produção de diversos aromas e sabores

característicos de certas bebidas mas também está na origem do aparecimento de off-

flavours, sobretudo durante o período de armazenamento. É definida, genericamente,

como a interação entre aminoácidos, péptidos ou proteínas com açúcares redutores

num complexo processo de reações químicas. A reação de Maillard é responsável

pela formação dos aromas a torrado e a caramelo, bem como pelo aparecimento da

cor castanha em alimentos e bebidas. Por este motivo é também designada por

processo de escurecimento não enzimático.

A reação de Maillard decorre em diversas etapas (Fig. 1.2). Inicialmente um grupo

carbonilo do açúcar redutor (na forma de aldose) reage com o grupo amina do

aminoácido, péptido ou proteína para formar uma base de Schiff. A base de Schiff é

estabilizada através de um rearranjo (rearranjo de Amadori), formando um composto

de Amadori (1-amino-1-desoxicetose). A formação destes compostos é favorecida por

temperaturas elevadas. No entanto, quando as condições de temperatura e pH não

promovem esse rearranjo, os compostos de Amadori podem sofrer reações de

enolização formando 3-desoxidicarbonilos. Estas espécies são bastante reativas e

originam compostos furânicos (tais o furfural e o 5-hidroximetilfurfural) e α-dicarbonilos

(tais como glioxal, metilglioxal e diacetilo). As etapas finais da reação de Maillard é a

formação de aromas e compostos com cor (melanoidinas) [4, 7].

FCUP


39

Fig. 1.2 – Esquema simplificado da reação de Maillard. Adaptado de Hodge [8].

1.3. Degradação de aminoácidos

A degradação de aminoácidos pode ser induzida pela luz e pela presença de

riboflavina, produzindo off-flavours, amónia e dióxido de carbono. Todos os

aminoácidos podem ser degradados desta forma, mas os aminoácidos que contêm

enxofre na sua estrutura (sobretudo a metionina) são considerados os principais

responsáveis pelos off-flavours. Na cerveja, a exposição à luz induz a degradação de

isohumulonas formando radicais livres que reagem com a cisteína, levando à

formação de 3-metil-2-buten-1-tiol. O 3-metiltiopropanal (metional) foi identificado em

leite resultante da oxidação da metionina na presença de luz e riboflavina. A formação

de um composto sulfurado (4-metil-2-isopropiltiazole) foi detetada num sumo de

ananás, a partir dos aminoácidos cisteína, valina e metionina, na presença de

riboflavina [9].

A degradação de aminoácidos pode originar aldeídos através da reação de

Strecker, entre aminoácidos e compostos α-dicarbonílicos. A reação envolve uma

transaminação seguida da descarboxilação do cetoácido formando um aldeído com

menos um átomo de carbono do que o aminoácido que lhe deu origem [6]. O 3-

metilbutanal, responsável por aromas amílicos em vinhos, é um produto da

40 FCUP


degradação de Strecker, formado a partir da reação da leucina com compostos

carbonílicos do vinho [10]. O odor a “queijo” poderá resultar da presença de 2-

metilpropanal se o aminoácido degradado for a valina [10]. O aroma a “vegetais

cozinhados” foi identificado em vinho branco resultante da formação de metional por

oxidação ou degradação de Strecker da metionina [11].

1.4. Atividade microbiológica

Os microrganismos são uma fonte comum de off-flavours em bebidas, sobretudo

quando o produto não é esterilizado por aquecimento ou irradiação ou não é

conservado com agentes antimicrobianos. O aparecimento de off-flavours pode

também resultar de uma fermentação mal controlada, da presença de enzimas ativas

resultantes da lise de microrganismos ou do crescimento dos microrganismos na

bebida resultando na libertação de metabolitos [1]. O diacetilo (butan-2,3-diona) resulta

do processo de fermentação e, acima de determinado nível, é um dos principais off-

flavours em bebidas fermentadas. Nos vinhos os principais compostos α-dicarbonílicos

presentes são o glioxal, o metilglioxal, o diacetilo e a pentano-2,3-diona [12]. A

interação entre a Saccharomyces cerevisae e alguns fungos presentes no mosto pode

originar octen-3-ona responsável pelo odor a “fungo” ou “cogumelo”. Por outro lado, as

bactérias envolvidas na fermentação malolática produzem diacetilo [3]. A

contaminação de vinhos com Brettanomyces é um das principais causas do

aparecimento de off-flavours em vinhos, nomeadamente através da formação de 4-

etilguaiacol e 4-etilfenol [13].

FCUP

41

2. Técnicas de extração de off-flavours de

bebidas

A análise química de compostos responsáveis por off-flavours é um procedimento

de garantia de qualidade de produtos alimentares complementar à análise sensorial e

apresenta uma série de desafios. A presença de um dado off-flavour num alimento ou

bebida é geralmente evidenciada por uma alteração no aroma ou sabor do produto.

Desta forma deteta-se a existência de um problema e surge a necessidade de

identificar a sua origem, nomeadamente saber qual ou quais os compostos

responsáveis pelo off-flavour e determinar o seu teor no produto. A maioria dos

compostos químicos responsáveis pelos off-flavours tem uma elevada atividade

sensorial e são percetíveis em níveis de concentração muito baixos. Este facto

representa um dos maiores desafios da análise química de off-flavours devido à

necessidade de detetar concentrações muito baixas desses compostos, na presença

de outros cuja concentração na amostra é muito mais elevada. Nalgumas situações os

compostos químicos que dão origem a determinados off-flavours são conhecidos e a

análise pode ser orientada e otimizada para esses analitos e para a amostra. No

entanto, existem outros casos em que os compostos não estão identificados sendo

necessário recorrer a uma avaliação mais global combinando as análises sensorial e

instrumental.

As técnicas utilizadas para a extração de off-flavours de bebidas são semelhantes

aos utilizados para a extração de outros compostos orgânicos de forma a obter um

extrato que seja compatível com a técnica analítica. A particularidade da extração de

off-flavours é a necessidade de extrair analitos presentes em concentrações muito

baixas. A maioria dos compostos químicos responsáveis pelos off-flavours é volátil e

as técnicas de extração utilizadas são as mesmas usadas para a determinação de

outros compostos voláteis. A separação, identificação e quantificação desses

compostos é habitualmente realizada por cromatografia líquida (LC) ou por

cromatografia gasosa (GC).

As técnicas de extração para a identificação e quantificação de off-flavours em

alimentos e bebidas têm atraído a atenção de muitos investigadores com o intuito de

desenvolver metodologias simples, de fácil execução, com baixos limites de deteção,

boa capacidade de remoção de interferentes e com baixo consumo de solventes e

42 FCUP

Técnicas de extração de off-flavours de bebidas

reagentes. Essas metodologias baseiam-se principalmente na solubilidade dos

analitos em solventes orgânicos (extrações para fase líquida), na sua volatilidade

(extração por headspace, pervaporação, difusão gasosa), na absorção/adsorção em

fases poliméricas (extração para fase sólida) ou em combinações destas.

A microextração tem vindo a assumir um papel de relevo na análise química.

Caracteriza-se pelo reduzido volume de fase extratora relativamente ao volume da

amostra e por não ser uma extração exaustiva. Este conceito originou o

desenvolvimento de novas metodologias com elevados fatores de concentração dos

analitos nas fases extratoras devido às baixas quantidades de solventes utilizadas

(microextração em fase líquida) ou ao não uso de solventes (microextração em fase

sólida). Para além disso, a utilização de reações de derivatização conjuntamente com

a microextração permite não só aumentar os fatores de recuperação, mas também

melhorar a separação, a deteção dos analitos e a rapidez do processo.

Neste capítulo descrevem-se as principais técnicas de extração utilizadas para a

determinação de off-flavours em bebidas, com especial destaque para os

desenvolvimentos mais recentes nesta área. As técnicas foram agrupadas em quatro

grandes grupos de acordo com as principais características da metodologia: (1)

extração em headspace, (2) extração para fase líquida, (3) extração para fase sólida e

(4) extração assistida por membranas.

2.1. Técnicas de extração em headspace

A maioria dos compostos químicos responsáveis pelos off-flavours em bebidas é

volátil e, por isso, as técnicas de extração dos analitos a partir do headspace permitem

recuperar os compostos químicos de interesse e evitam a interferência de

componentes não voláteis da matriz da amostra. Além disso, estas técnicas não

recorrem ao uso de solventes.

As extrações em headspace podem ser realizadas em modo estático ou dinâmico

e podem ser ou não conjugadas com outros processos, como acontece na

microextração em gota suspensa (SDME), na microextração em fase sólida (SPME)

ou na extração sortiva em barra de agitação (SBSE e HSSE), que serão descritas com

mais detalhe nas secções 2.2.2, 2.3.2 e 2.3.3, respetivamente.

FCUP


43

A extração em modo estático envolve o aquecimento da amostra num recipiente

fechado a uma dada temperatura e durante um determinado intervalo de tempo, para

que os analitos voláteis se equilibrem no headspace. De seguida, uma alíquota gasosa

do headspace é recolhida e injetada diretamente no sistema de GC. Esta metodologia

foi proposta para a determinação de acetoína em cerveja [14]. A temperatura, o

volume de amostra e qualquer modificação à matriz da amostra devem ser bem

controlados. A extração em modo dinâmico é realizada através da recolha contínua do

headspace por arrastamento com um gás inerte. A fase gasosa é removida do

recipiente onde decorre a extração pelo que, em teoria, é possível uma extração

exaustiva dos analitos [15].

Esta técnica de extração é pouco seletiva mas é vantajosa para a análise de perfis

voláteis de bebidas, surgindo sempre associada à GC para permitir a separação dos

analitos extraídos. Uma das principais desvantagens da análise por headspace é a

dificuldade em fazer uma quantificação rigorosa sendo necessário recorrer a padrões

matrix-matched, a padrão interno ou ao método de adição de solução padrão. O

aquecimento da amostra, necessário para promover a volatilização dos analitos

voláteis para o headspace, pode induzir a degradação da amostra e levar à formação

de novos compostos [15].

Atualmente os principais tipos de extração em headspace utilizados na

determinação de off-flavours em bebidas são a SDME, a SPME, a SBSE e a HSSE

(descrição nas secções 2.2.2, 2.3.2 e 2.3.3). A existência de uma fase extratora com

capacidade sortiva aumenta a seletividade e a eficiência do processo de extração.

Além disso, devido ao reduzido volume de fase extratora usado nestas técnicas, é

possível obter elevados fatores de concentração dos analitos. Por essa razão, as

extrações por headspace sem uso de fases sortivas têm sido pouco utilizadas na

determinação de off-flavours em bebidas. Um exemplo de extração por headspace

com uso de uma fase extratora é a metodologia desenvolvida para a determinação de

dicetonas vicinais em cerveja. Nesta metodologia recorre-se à utilização de um módulo

de extração fechado em cujo headspace se encontra suspenso um pequeno módulo

(reator) que contém a fase aceitadora líquida (Fig. 2.1) [16].

44 FCUP


Fig. 2.1 – Esquema de um módulo de extração por headspace. Adaptado de Pacheco et al. [16]

2.2. Técnicas de extração para fase líquida

2.2.1. Extração líquido-líquido clássica

Uma das técnicas de extração mais comuns na análise de amostras líquidas é a

extração líquido-líquido (LLE), particularmente para a extração de compostos

orgânicos de matrizes aquosas. Esta técnica baseia-se na solubilidade relativa dos

analitos em duas fases líquidas imiscíveis. Geralmente a LLE é aplicada em amostras

aquosas utilizando como fase extratora um solvente orgânico de baixa polaridade e

imiscível com a amostra. O procedimento é realizado manualmente recorrendo a

passos repetitivos de separação de fases. Trata-se de um processo moroso e que

produz grandes quantidades de resíduos orgânicos. Além disso, devido à baixa

seletividade da LLE, pode ser necessário realizar um passo adicional de limpeza e/ou

concentração do extrato antes da análise instrumental, sobretudo para a determinação

de compostos presentes em baixas concentrações.

Apesar destas limitações, a LLE é ainda considerada uma das técnicas mais

adequadas para a extração de compostos voláteis do vinho, como demonstrado num

estudo recente que compara esta técnica com a extração em fase sólida (SPE) e a

microextração em fase sólida (SPME) [17]. Aliás, a LLE tem sido muito utilizada na

FCUP


45

análise cromatográfica de diversos compostos voláteis em vinho e cerveja (Tabela

2.1).

Tabela 2.1 – Lista de compostos responsáveis por off-flavours em bebidas em que se utilizou a LLE para a extração.

Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.

Cerveja

Aminas biogénicas HPLC-UV [18, 19]

4-vinilsirinjol GC-MS [20]

Vinho

Compostos voláteis GC-MS [17, 21-24]

4-etilfenol e 4-etilguaiacol GC-MS [25]

Compostos α-dicarbonílicos GC-MS, GC-MS/NPDa [12, 26]

Aminas biogénicas HPLC-UV [27]

Vinho do Porto e sumo de uva Aminas GC-MS [28]

a NPD: deteção de azoto/fósforo

2.2.2. Microextração em fase líquida

As técnicas de microextração em fase líquida (LPME) surgiram como resposta ao

desafio de miniaturizar a LLE de forma a reduzir o consumo de solventes, e de

aumentar a sensibilidade das metodologias baseadas na extração com solvente [29].

As primeiras aplicações desta técnica surgiram na década de 1990 usando sistemas

de análise por injeção em fluxo (FIA) [29-31]. A designação LPME é bastante ampla e

define um conjunto de técnicas de extração baseadas no mesmo princípio, a extração

de analitos de uma fase aquosa para um pequeno volume de solvente orgânico. No

entanto, existem algumas diferenças entre as técnicas referidas e é frequente atribuir-

lhes designações diferentes: (i) microextração líquido-líquido (LLME), (ii)

microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), (iii) microextração em gota

suspensa (SDME), (iv) microextração líquido-líquido por fibra oca (HF-LPME). Alguns

exemplos de aplicações destas técnicas de LPME a bebidas encontram-se referidas

na Tabela 2.2. O uso de abreviaturas para as diferentes abordagens de LPME é

bastante diversificado e é frequente encontrar abreviaturas diferentes para processos

iguais. No entanto, ao longo deste trabalho serão utilizadas as abreviaturas acima

referidas.

46 FCUP


Tabela 2.2 – Exemplos de aplicações de técnicas de LPME à extração de off-flavours de bebidas

Técnica Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.

LLME

Vinho e cerveja Aminas alifáticas FIA-fotometria [30]

Sumos de fruta Derivados de furfural HPLC-UV [32]

Vinho Compostos sulfurados GC-MS [33]

Vinho 4-etilguaiacol, 4-etilfenol, 4-vinilguaiacol

e 4-vinilfenol GC-MS [34]

DLLME

Vinho Fenóis voláteis GC-MS [35]

Vinho Clorofenóis GC-MS [36]

Água e vinho Geosmina e 2-metilisoborneol GC-MS [37]

Vinho Anisóis e fenóis GC-MS [38]

SDME Cerveja Álcoois GC-FIDa, GC-MS [39, 40]

a FID: deteção por ionização de chama

A LLME é a técnica de LPME mais simples e mais semelhante à LLE convencional,

mas em que se utilizam volumes bastante reduzidos de solvente extrator. Este tipo de

procedimento foi proposto pela primeira vez num sistema FIA para a determinação de

aminas alifáticas em amostras de vinho e cerveja [30]. Nesse sistema o solvente

orgânico e a amostra eram misturados e transportados através de uma câmara em

serpentina onde decorria a extração. No final a mistura era conduzida até uma câmara

maior onde a separação de fases ocorria e o extrato orgânico era analisado utilizando

um detetor fotométrico.

Na LLME é necessário promover o máximo contacto entre a amostra e o solvente

orgânico, de forma a aumentar a eficiência da extração. Deste modo têm surgido

alguns trabalhos com aplicação de agitação por vortex [32] ou por ultrassons [33, 34,

41]. Estes processos permitem aumentar a dispersão do solvente extrator na amostra

aquosa, formando uma espécie de emulsão. Dado que a área de contacto entre os

líquidos é grande, as gotículas formadas pela agitação permitem uma extração mais

rápida e eficiente dos analitos. A utilização de ultrassons na LLME tem vindo a ganhar

maior destaque e a técnica adquiriu até uma designação própria: ultrasound-assisted

emulsification-microextraction (USAEME) [33, 34, 41].

FCUP


47

A DLLME também surgiu com o intuito de aumentar o contacto entre a amostra e o

solvente extrator. A técnica consiste na adição à amostra de um pequeno volume (da

ordem dos µL) de um solvente orgânico de elevada densidade (solvente extrator;

geralmente tetracloreto de carbono, tetracloroetileno, 1-dodecanol ou hexadecano)

misturado num solvente orgânico miscível com a água (solvente dispersivo,

habitualmente acetonitrilo, acetona ou metanol). Esta mistura forma pequenas gotas

dispersas na fase aquosa criando uma elevada área de contacto entre as fases

líquidas e desta forma promove-se a transferência de massa dos analitos para o

solvente extrator [42]. No final da extração recorre-se à centrifugação para separar as

fases e a fase orgânica é recolhida para análise. O esquema do procedimento

experimental encontra-se na Fig. 2.2. As grandes vantagens desta técnica para a

determinação de off-flavours são os baixos limites de deteção das metodologias (da

ordem dos ng L-1) e o reduzido tempo de extração (abaixo dos 10 min). Porém, a

presença do solvente dispersivo, necessário para a formação da dispersão, pode

diminuir o coeficiente de partição dos analitos entre a amostra e o solvente extrator.

Por isso, nalguns casos é possível obter maior sensibilidade e reduzir o volume de

solventes utilizando a LLME com agitação por vortex ou a USAEME.

Fig. 2.2 – Esquema da extração por DLLME.

A SDME utiliza uma microgota (1 a 10 µL) de solvente extrator habitualmente

suspensa na ponta da agulha de uma seringa para a extração dos analitos, tendo os

primeiros desenvolvimentos nesta área sido propostos por Liu e Dasgupta [31]. A gota

pode ser imersa na amostra aquosa ou ficar suspensa acima da amostra, no

headspace (Fig. 2.3). Na extração por imersão (Fig. 2.3A) utiliza-se um solvente

orgânico imiscível com a fase aquosa, para extrair compostos de baixa polaridade. A

utilização da SDME em headspace (Fig. 2.3B) permite a utilização de uma fase

extratora orgânica ou aquosa dado que esta não se encontra em contacto direto com a

amostra [43]. A transferência de massa no headspace é um processo rápido devido

48 FCUP


aos elevados coeficientes de difusão na fase gasosa. Com o auxílio de agitação da

amostra, para aumentar a cinética da extração, o equilíbrio termodinâmico entre as

fases aquosa e gasosa pode ser mais rapidamente atingido. Uma vantagem adicional

da extração no headspace é a eliminação da fração não-volátil da amostra que é

geralmente parcialmente extraída quando a extração é realizada por imersão.

Fig. 2.3 – Representação esquemática de SDME por imersão (A) e no headspace (B).

Existe também a possibilidade de utilizar a SDME em modo dinâmico na qual a

extração é realizada no interior da seringa [40]. Durante a extração o êmbolo da

seringa é movido a uma velocidade constante. Em cada movimento a seringa recolhe

um dado volume do headspace da amostra que irá entrar em contacto com o solvente

orgânico contido na seringa. Em cada ciclo de extração é recolhido um novo volume

de headspace o que permite aumentar os fatores de enriquecimento relativamente ao

modo de SDME estático.

A SDME tem sido, sobretudo, utilizada para análise por GC dado que é possível

utilizar a mesma seringa para a extração e para a injeção no sistema cromatográfico

[39, 44]. A SDME é simples, de baixo custo e tem um consumo de solventes

praticamente nulo. No entanto, no caso em que a gota fica imersa na amostra, pode

ocorrer a formação de emulsões, a dissolução da gota na amostra ou instabilidade da

gota devido à agitação.

O outro modo de LPME, a HF-LPME, foi desenvolvido por Pedersen - Bjergaard e

Rasmussen [45] como forma de contornar os problemas de estabilidade da gota em

SDME quando se executa a extração com a fase extratora imersa. A fase extratora é

imobilizada nos poros de uma fibra oca de diâmetro interno reduzido (hollow fibre, HF,

FCUP


49

Fig. 2.4). Quando se pretende extrair analitos de soluções aquosas a fibra é imersa

num solvente orgânico imiscível com a água e o lúmen2 é preenchido com esse

solvente orgânico (sistema de duas fases) ou com uma solução aquosa (sistema de

três fases) (Fig. 2.4). Para além de ser uma técnica de microextração em fase líquida,

a HF-LPME pode também ser agrupada nas técnicas de extração assistidas por

membranas e, por isso, será discutida mais detalhadamente na secção 2.4.1.

Fig. 2.4 – Imagens de microscopia eletrónica de varrimento de uma membrana HF: (a) secção transversal, (b)

superfície interior, (c) superfície exterior, (d) e (e) secções transversais parciais com diferentes aumentos. Retirado de

Sukitpaneenit et al. [46].

2.3. Técnicas de extração para fase sólida

As técnicas de extração para fase sólida são caracterizadas por processos

sortivos. Os analitos são inicialmente retidos numa fase sólida e, posteriormente, são

removidos dessa fase extratora com um solvente ou por dessorção térmica. O

sorvente deve apresentar uma elevada afinidade para os compostos de interesse de

forma a reter e concentrar esses analitos.

2.3.1. Extração em fase sólida

A extração em fase sólida (SPE) é uma técnica sortiva que envolve uma partição

líquido-sólido, em que a fase extratora é um sorvente sólido contido em cartuchos

2 Cavidade interior da HF.

50 FCUP


descartáveis. Esta técnica tem sido muito utilizada para extrair e/ou concentrar

compostos orgânicos presentes em baixas concentrações em amostras líquidas. A

passagem da amostra pelo sorvente resulta na retenção dos analitos à sua superfície

enquanto os outros componentes da amostra passam sem ficarem retidos. O processo

inverso, isto é, a retenção dos outros componentes da amostra e a passagem dos

analitos sem retenção no sorvente, pode também ser utilizado como forma de limpar a

amostra antes da análise [47, 48].

Genericamente, o procedimento experimental de SPE decorre em quatro passos:

condicionamento da fase extratora, em que os grupos funcionais do

adsorvente são solvatados de forma a poderem interagir com a amostra;

retenção dos analitos, sendo os analitos sorvidos na coluna de SPE;

lavagem seletiva da fase extratora, em que as espécies não retidas são

removidas do sorvente;

eluição, em que os analitos são removidos por eluição do sorvente e

recolhidos para análise.

Existem vários tipos de sorventes disponíveis comercialmente mas os mais

comuns são as fases ligadas com base de sílica e, mais recentemente, com base

polimérica. A escolha do sorvente é influenciada pela matriz da amostra e pelos

analitos [49]. Para o desenvolvimento da metodologia é necessário estudar o pH, força

iónica, polaridade e fluxo do solvente de eluição e conhecer as características do

sorvente utilizado. Uma das principais desvantagens da SPE é a influência da matriz

da amostra no processo de extração, nomeadamente através de processos de

retenção competitivos com a fase extratora entre o(s) analito(s) e outros componentes

da amostra.

Na determinação de off-flavours em bebidas, a SPE é utilizada para extrair os

analitos diretamente da amostra para posterior análise [17, 24, 50-55] ou os produtos

de reações de derivatização dos analitos [56-60]. Os extratos obtidos são adequados

para a análise cromatográfica e por essa razão a maioria das metodologias são para

GC e HPLC. Na Tabela 2.3 encontram-se alguns exemplos da utilização da SPE na

extração de compostos responsáveis por off-flavours presentes em bebidas. O uso de

SPE em sistemas FIA foi também desenvolvido para a determinação de aminas

biogénicas em vinho [61].

FCUP


51

Tabela 2.3 – Lista de aplicações da SPE na extração de off-flavours de bebidas para análise por LC, GC e eletroforese

capilar (CE).

Técnica de

separação Deteção Amostra Analito(s) Ref.

HPLC

FLD

Sumo de laranja 4-vinilguaiacol [50, 62]

Vinho Aminas biogénicas [51, 59, 60, 63]

Cerveja Diacetilo e pentano-2,3-diona [64]

Sumo de laranja Furaneol e 4-vinilguaiacol [52]

Cerveja Aminas [59, 65]

UV

Vinho Aminas biogénicas [57, 66]

Vinho Histamina [56]

Vinho e cerveja Glioxal, metilglioxal e diacetilo [47]

Cerveja Aminas [58, 65]

Vinho Compostos dicarbonílicos [48]

Cerveja Furfural [55]

Água Aldeídos [67]

MS Vinho e cerveja Aminas biogénicas [59]

GC

MS Vinho Compostos voláteis [17, 24, 54, 68]

FID Vinho Fenóis voláteis [53]

CE UV Vinho Aminas biogénicas [61]

2.3.2. Microextração em fase sólida

A microextração em fase sólida (SPME) é uma técnica de extração sem solventes,

que usa uma fibra de sílica fundida revestida com um sorvente inserida num

dispositivo com funcionamento semelhante ao de uma seringa, conforme o esquema

da Fig. 2.5. O processo de extração decorre em dois passos principais: (1) partição

dos analitos entre a amostra e o sorvente que reveste a fibra e (2) dessorção térmica

52 FCUP


ou eluição química dos analitos retidos no sorvente. Geralmente a extração dos

analitos não é exaustiva. A sensibilidade máxima é obtida quando se atingem as

condições de equilíbrio, no entanto não é necessário atingir esse ponto e a extração

pode ser realizada num período de tempo pré-definido (controlo cinético). A

temperatura e o tempo de extração e a agitação da amostra devem ser otimizados

para cada aplicação. A SPME é uma técnica de extração que pode ser facilmente

automatizada, já existindo sistemas que possibilitam o uso de sistemas de SPME em

injetores automáticos para GC. No entanto, a extração é habitualmente realizada de

forma manual conseguindo-se, apesar disso, reprodutibilidade elevada.

Fig. 2.5 – Representação de um dispositivo de extração de SPME. Adaptado de Lord e Pawliszyn [69].

A técnica foi originalmente desenvolvida há mais de 20 anos [70] e é atualmente

uma das técnicas de extração de voláteis mais utilizadas nas várias áreas da química

analítica. No que diz respeito à determinação de off-flavours em bebidas, a utilização

da SPME no vinho é a que mais se destaca nas publicações científicas mais recentes.

A SPME pode ser utiliza por imersão direta da fibra na amostra líquida ou mantendo-a

no headspace; no entanto, devido à complexidade das matrizes alimentares, a SPME

é maioritariamente utilizada em headspace. Algumas das aplicações mais relevantes a

amostras de bebidas são referidas na Tabela 2.4. A imersão da fibra na amostra pode

danificar a fase extratora ou provocar a adsorção irreversível de alguns compostos

químicos da amostra. Uma forma de contornar este problema é a utilização de uma

membrana oca de celulose a proteger a fibra. Porém, este processo requer um tempo

de extração mais longo e pode ocorrer a obstrução da membrana [15].

FCUP


53

Tabela 2.4 – Lista de aplicações de SPME em modo headspace e de imersão na amostra para a determinação de

alguns compostos responsáveis por off-flavours em bebidas.

Modo de

extração Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.

Headspace

Água Compostos carbonílicos GC-ECD [71]

Café Fração volátil GC-MS [72]

Vinho

4-etilguaiacol e 4-etilfenol GC-FID [73, 74]

Off-flavours GC-MS [75]

Compostos voláteis GC-MS [17, 76]

Haloanisóis GC-MS [77]

Fenóis voláteis GC-MS [78]

Cerveja

Aldeídos GC-MS [79]

Compostos voláteis GC-FID [80]

Fração volátil GC-MS [81]

Compostos carbonílicos GC-MS [82]

Fenóis voláteis GC-MS [83]

Whisky Compostos voláteis GC-MS [84]

Cidra Fenóis voláteis GC-MS [85]

Imersão

Água Compostos carbonílicos GC-ECD [71]

Café Fração volátil GC-MS [72]

Whisky Compostos voláteis GC-MS [84]

As principais vantagens da SPME são a eliminação total do uso de solventes, a

combinação da amostragem e da extração num só passo experimental, a possibilidade

de analisar pequenas quantidades de amostra e um elevado fator de concentração

para os componentes mais retidos. A gama de aplicabilidade da SPME é ampla tanto

na polaridade dos analitos como no tipo de amostras e pode ser usada na preparação

de amostras para análise por GC e LC. Contudo, o reduzido volume de sorvente fixado

54 FCUP


na fibra de SPME pode resultar em extrações incompletas e limitar a capacidade de

enriquecimento dos analitos na fibra. Habitualmente a quantificação é feita usando

padrões matrix-matched, padrão interno ou o método de adição de solução padrão de

forma a eliminar o efeito de matriz. Tal como na SPE, a presença de concentrações

elevadas de alguns componentes da amostra pode resultar na ligação competitiva à

fase extratora, diminuindo a eficiência da extração de alguns compostos e dificultando

a quantificação.

2.3.3. Extração sortiva em barra de agitação

As técnicas de extração sortiva caracterizam-se pela partição dos analitos entre

uma fase líquida ou headspace e uma fase extratora imobilizada num suporte. A

técnica sortiva mais comum é a extração sortiva em barra de agitação (SBSE),

desenvolvida em 1999 por Baltussen et al. [86] com o intuito de contornar uma das

maiores limitações da SPME: o volume reduzido de fase extratora. Nesta técnica

utiliza-se uma barra de agitação revestida com uma camada superficial de um material

sorvente (Fig. 2.6a) de forma a obter uma elevada área superficial na fase extratora,

permitindo elevados fatores de enriquecimento e extração. A extração é realizada

após imersão da barra na amostra líquida e a dessorção pode ser realizada por

eluição química ou dessorção térmica, tal como em SPME. Comparando estas duas

técnicas, obtêm-se fatores de recuperação muito superiores em SBSE devido ao maior

volume de fase extratora, mesmo quando se utiliza SPME por imersão na amostra.

Habitualmente, em SPME o volume máximo de revestimento da fibra é 0,6 μL (para

100 μm de sorvente na fibra) enquanto em SBSE os volumes de fase extratora variam

entre 25 e 125 μL [72]. Existe outra técnica semelhante mas menos usada em que a

fase extratora se encontra no headspace e é por isso designada habitualmente por

extração sortiva em headspace (HSSE) [72, 87]. Um dispositivo utlizado em HSSE

encontra-se representado na Fig. 2.6b

Em SBSE os limites de deteção obtidos são baixos, sendo uma técnica bastante

adequada para a análise de off-flavours [72, 76, 84, 87-91]. A SBSE foi aplicada em

vinho para a quantificação de fenóis voláteis, haloanisóis e 2-isobutil-3-metoxipirazina

com limites de deteção inferiores a 1 µg L-1 [91]. Este tipo de extração é utilizado

essencialmente para a análise por GC e, em geral, permite a identificação e

quantificação de uma gama alargada de compostos em bebidas.

FCUP


55

O revestimento mais utilizado é PDMS e, por isso, as técnicas de SBSE e HSSE

são mais adequadas para a extração de analitos de baixa polaridade de amostras

aquosas. No entanto, existem algumas tentativas de aumentar a recuperação de

analitos mais polares através da utilização de barras de agitação revestidas com

PDMS e carvão ativado [92]. As aplicações de SBSE e HSSE na análise alimentar têm

vindo a aumentar mas, devido à utilização quase exclusiva do PDMS nas barras

disponíveis comercialmente, estão limitadas à aplicação em matrizes aquosas e a

analitos de baixa polaridade.

Fig. 2.6 – Representação esquemática de (a) uma barra de agitação revestida com PDMS para SBSE e (b) de um

dispositivo para HSSE. Adaptada de Bicchi et al. [72].

2.4. Técnicas de extração assistidas por membranas

Nas últimas décadas as membranas têm sido cada vez mais utilizadas em

processos industriais de separação tais como a dessalinização, diálise, ultrafiltração,

separação de gases, desumidificação, osmose, osmose inversa e eletrodiálise [93].

Seguindo os mesmos princípios de separação, o uso das membranas com fins de

separação analítica tem sido amplamente estudada para extração, concentração e

limpeza de amostras. Sendo seletiva a uma ou algumas espécies químicas, a

membrana atua como um separador de fases, controlando a transferência de massa

entre elas. A transferência de massa dos analitos pode ser obtida por gradientes

químicos, de pressão ou de potencial elétrico. Têm como principal vantagem a

possibilidade de realizar extrações sem contacto direto entre a amostra e a fase

56 FCUP


aceitadora. Além disso, é possível realizar a extração com membranas em sistemas

automatizados e em fluxo.

2.4.1. Extração líquido-líquido assistida por membrana

A extração líquido-líquido assistida por membrana caracteriza-se pela extração dos

analitos da solução aquosa para uma outra fase líquida (orgânica ou aquosa) através

da difusão das espécies através dos poros de uma membrana microporosa [93]. A

LLME pode ser realizada em sistema de duas ou três fases. Num sistema bifásico, o

transporte dos analitos ocorre por difusão através dos poros da membrana

microporosa impregnada com o solvente orgânico utilizado como fase extratora. As

duas fases líquidas estão separadas pela membrana e o único contacto entre as fases

ocorre nos poros da membrana. O rendimento máximo da extração é determinado

pelo coeficiente de partição e pela cinética para atingir o equilíbrio e depende das

características da membrana e das condições de agitação. O fator de enriquecimento

de compostos orgânicos de baixa polaridade é geralmente superior aos de compostos

polares ou iónicos, dada a elevada solubilidade destes últimos na fase aquosa.

Na extração em sistema de três fases, habitualmente designada por extração

líquido-líquido suportada em membrana (SLME), uma solução é imobilizada nos poros

da membrana por ação da capilaridade. Neste caso, a membrana serve só como

suporte e a imobilização do solvente é obtida por imersão da membrana no solvente.

Ao contrário da LLME, a SLME é apropriada para a extração de espécies polares ou

iónicas tais como ácidos orgânicos e bases. A seletividade da extração pode ser

alterada por modificação da composição química das soluções que compões as fases

líquidas. Por exemplo, o pH das soluções dadora e aceitadora podem ser ajustados de

forma a facilitar o transporte de analitos da amostra para a solução imobilizada nos

poros da membrana, e desta para a solução aceitadora. Além disso, o ajuste de pH na

solução aceitadora de forma a aumentar a solubilidade dos analitos nesta fase evita

que possam ser extraídos de volta para a amostra. Todas estas características do

SLME são uma vantagem relativamente à LLME, sobretudo porque é possível

aumentar a seletividade da extração.

Existem várias configurações propostas para este tipo de extração que estão

relacionadas com os formatos das membranas, tais como as membranas planas, as

membranas em forma de saco [94] ou as fibras ocas (HF). As membranas planas são

FCUP


57

geralmente utilizadas em sistemas de fluxo sendo a junção da unidade extratora ao

instrumento de medição analítica a principal característica desta configuração [95],

conforme esquematizado na Fig. 2.7.

Fig. 2.7 – Esquema de um sistema em fluxo usando SLME. Adaptado de Wang et al. [95].

Nas membranas em forma de saco, o solvente orgânico é inserido na membrana

colocada numa ampola contendo a amostra. No final da extração, o extrato orgânico é

recolhido para análise. Na Fig. 2.8 estão representadas algumas das configurações

possíveis da membrana utilizada neste tipo de extração.

Fig. 2.8 – Esquema de diferentes configurações de membranas em forma de saco utilizadas para SLME. Adaptado de

Schellin e Popp [94].

A utilização de HF permite reduzir a quantidade de solvente orgânico utilizado. A

agitação é feita na amostra enquanto a fase aceitadora permanece estática. No

entanto verifica-se que pode haver perdas do solvente extrator quando se utiliza uma

agitação elevada na solução dadora. No final da extração o solvente que se encontra

no interior da membrana é cuidadosamente recolhido para análise. As HF têm sido

utilizadas para o desenvolvimento de procedimentos de microextração devido aos

elevados fatores de enriquecimento que são obtidos. Saaid et al. [96] extraiu aminas

biogénicas de amostras alimentares utilizando HF-LPME com derivatização em

simultâneo. Os analitos eram derivatizados na amostra e posteriormente extraídos

para a fase orgânica contida nos poros e no lúmen da HF. Tal como referido

58 FCUP


anteriormente (secção 2.2.2) a extração por SLME com HF pode ser realizada em

sistemas de duas ou três fases (Fig. 2.9).

Fig. 2.9 – Representação esquemática da HF-LPME em sistemas de (A) duas e (B) três fases. Adaptado de Psillakis e

Kalogerakis [97].

2.4.2. Difusão gasosa

A técnica de extração por difusão gasosa (GD) baseia-se na transferência de

massa por difusão de espécies voláteis da solução dadora para uma fase aceitadora.

As duas fases líquidas encontram-se fisicamente separadas por uma membrana

impermeável ao solvente mas permeável a gases, evitando que haja contacto direto

entre as duas fases líquidas. O processo de transferência de massa é controlado

essencialmente pela volatilidade dos analitos e pela permeabilidade a gases da

membrana. As espécies voláteis são extraídas da amostra para a fase aceitadora em

três passos: (1) os analitos são transportados do seio da solução dadora até à

vizinhança da membrana; (2) as espécies na forma gasosa difundem-se através da

membrana e (3) os analitos são recolhidos numa fase aceitadora gasosa ou líquida.

Atualmente, a incorporação de módulos de GD em sistemas em fluxo para a

determinação de compostos voláteis encontra-se bem estabelecida [98]. Na literatura

é possível encontrar várias configurações de módulos de GD, sobretudo para

metodologias em sistemas FIA [99-102]. A possibilidade de parar o fluxo da fase

aceitadora durante a extração permite aumentar a sensibilidade da metodologia [103].

A combinação da microextração com a GD levou ao desenvolvimento da

microextração por difusão gasosa (GDME) [104-106] que foi objeto de estudo neste

trabalho (Parte II). A descrição mais detalhada desta técnica de extração será

apresentada na secção 3.2.1.

FCUP


59

A utilização das HF permite aplicar a microextração à GD, sendo este tipo de

procedimento designado por microextração líquido-gás-líquido (HF-LGLME) [107-109].

A HF é imersa na amostra e no seu interior é colocado um pequeno volume (da ordem

das dezenas de µL) de solução aceitadora. O transporte dos analitos ocorre por

difusão gasosa através dos poros da membrana da HF (Fig. 2.10). A aplicação da HF

à GD permite aumentar a sensibilidade da metodologia comparando com as

metodologias de GD anteriormente descritas, sobretudo devido ao aumento da

superfície de contacto entre a amostra e a membrana e à diminuição do volume de

solução aceitadora. No entanto, o uso da HF apresenta algumas desvantagens

experimentais que serão, talvez, a principal razão para o facto de a técnica não estar

ainda muito explorada. O baixo volume de solução aceitadora e as reduzidas

dimensões das fibras utilizadas tornam o manuseamento dos sistemas de extração

difícil.

Fig. 2.10 – Esquema do processo de extração por HF-LGLME. Adaptado de Farajzadeh e Assadi [107].

Apesar das vantagens da GD na determinação de compostos voláteis, a sua

utilização na análise de bebidas é muito reduzida quando comparada com o número

de aplicações da GD a amostras ambientais. No caso dos vinhos, por exemplo, a

utilização da GD evita o uso de procedimentos de pré-tratamento da amostra para

eliminar a coloração do vinho, quando se utiliza a deteção fotométrica [110].

2.4.3. Pervaporação

A pervaporação (PV) é uma técnica de separação por membranas amplamente

utilizada em processos industriais. No entanto, devido à sua simplicidade e à

possibilidade de miniaturização e automatização, a PV pode ser aplicada com fins

60 FCUP


analíticos em diversos tipos de amostras [111]. As primeiras aplicações da PV

analítica surgiram no início da década de 1990 com o objetivo de monitorizar

processos de fermentação em contínuo [112].

A PV combina num único sistema dois processos, a evaporação e a difusão

gasosa de analitos através de uma membrana semipermeável. Os analitos voláteis

são transferidos da amostra sólida ou líquida (fase dadora) sob aquecimento para um

espaço gasoso existente entre a fase dadora e a membrana. De seguida as espécies

são transportadas através da membrana e recolhidas numa fase aceitadora (estática

ou em fluxo) geralmente a uma temperatura mais baixa que a da solução dadora. A

diferença de temperatura existente, que resulta na diferença de pressão nos dois lados

da membrana, é considerada a principal força motriz do processo de separação.

Uma das particularidades da PV é a existência do espaço gasoso entre a amostra

e a membrana prevenindo a obstrução e/ou deterioração da membrana. Na Fig. 2.11

encontra-se representado um esquema de um módulo de PV. A amostra é colocada

na câmara inferior do módulo extrator por injeção ou aspiração contínua no caso de

amostras líquidas, ou pesando diretamente a amostra sólida. Na câmara aceitadora os

analitos são recolhidos numa fase aceitadora líquida ou gasosa. Entre as duas

câmaras a membrana é colocada num suporte que se encontra distanciado da

amostra, mantendo um espaço gasoso entre a fase dadora e a membrana. O volume

de espaço gasoso pode ser alterado usando espaçadores de espessura variável de

forma a colocar o suporte da membrana em diferentes posições.

Fig. 2.11 – Esquema de um módulo de PV convencional. Adaptado de Luque de Castro e Gámiz-Gracia [113].

Dado que os módulos de PV podem ser facilmente adaptáveis a sistemas em fluxo,

esta técnica permite simplificar e miniaturizar alguns sistemas analíticos complexos.

As utilizações mais comuns da PV em determinações analíticas são o controlo de

processos como a fermentação [112] e a análise de amostras sólidas [114]. A

FCUP


61

possibilidade de integrar facilmente os módulos de PV em sistemas FIA tem levado ao

desenvolvimento de inúmeras aplicações utilizando esta técnica de extração. No caso

de amostras líquidas é possível automatizar todo o processo analítico dado que, como

referido anteriormente, a amostra é inserida no módulo de PV por injeção ou

aspiração. Quando se utilizam amostras sólidas em sistemas FIA, a câmara inferior do

módulo de PV permite realizar a lixiviação dos analitos e/ou a sua derivatização [115-

119]. O uso da derivatização é frequente e pode ser aplicada tanto na fase dadora de

forma a aumentar a volatilidade dos analitos, como na fase aceitadora para tornar os

analitos adequados à técnica de deteção. A deteção dos analitos pode ser realizada

fora do módulo de PV ou diretamente no módulo colocando o detetor no interior da

câmara aceitadora [116]. Nesta última situação, se for utilizado um sistema em fluxo, o

fluxo da fase aceitadora pode ser parado durante algum tempo de forma a acumular

os analitos nessa fase aumentando a sensibilidade da metodologia [117, 119, 120].

A PV pode ser uma alternativa à GD para a extração de espécies voláteis com a

vantagem de não haver contacto entre a amostra e a membrana devido à existência

de um espaço gasoso entre elas. Para além de evitar a colmatação dos poros e a

deterioração da membrana, o espaço gasoso permite utilizar temperaturas elevadas

na câmara dadora sem comprometer as características da membrana nem alterar a

fase aceitadora. As altas temperaturas de extração aumentam a volatilidade dos

analitos e, consequentemente, a transferência de massa. No entanto, nalguns casos a

existência desse espaço gasoso pode diminuir a eficiência do transporte de massa,

diminuindo a sensibilidade da metodologia. A utilização da PV em sistemas de

amostragem para GC pode também ser uma alternativa à amostragem em headspace

[121].

A PV tem sido bastante aplicada na determinação de off-flavours usando sistemas

dinâmicos. Este tipo de sistemas permite realizar extrações simples, rápidas e de

baixo custo, indo ao encontro de um dos principais requisitos da indústria de bebidas,

que é o controlo em linha dos processos de produção e de controlo de qualidade. A

PV pode ser facilmente acoplada a sistemas analíticos automatizados, minimizando o

manuseamento e o consumo de amostras de reagentes e aumentando

consideravelmente o número de análises por dia. As principais aplicações da PV na

determinação de off-flavours em bebidas encontram-se descritas na Tabela 2.5.

62 FCUP


Tabela 2.5 – Lista de aplicações da PV para a determinação de off-flavours em bebidas

Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.

Cerveja

Amónia FIA-espetrofotometria [122]

Diacetilo FIA-espetrofotometria [123]

Vinho

Acidez volátil e SO2 livre CE [124]

SO2 FIA-espetrofotometria [125]

Acetaldeído, acetato de etilo,

metanol, etanol GC-FID [126]

Acidez volátil e total Espetrofotometria [127]

Etanol e glicerol Espetrofotometria e fluorimetria [128]

Sumos e iogurte Acetaldeído Espetrofotometria [114]

Sumo de laranja Butanoato de etilo, limoneno,

pineno, geranial, neral, terpineol GC-MS [129]

Iogurte, leite,

sumos de fruta Acetaldeído e acetona GC-FID [130]

Iogurte, sumos de

fruta e misturas de

iogurte e sumos

Acetona, formaldeído, acetaldeído,

hexenal, trans-2-hexenal CE [131]

O primeiro trabalho surgiu em 1990 e nele foi descrito o desenvolvimento de um

sistema de PV com um biossensor para a determinação de diacetilo e etanol durante a

fermentação na produção de cerveja [112]. A formação de diacetilo na cerveja foi

também medida espetrofotometricamente utilizando um sistema de PV no qual a fase

aceitadora continha um reagente derivatizante [123]. A mesma técnica foi utilizada na

determinação de acetaldeído recorrendo a um método espetrofotométrico [114] e para

a determinação de amónia em cerveja [122]. O acetaldeído e outros voláteis de

importância enológica foram extraídos das amostras para análise direta por GC-FID

sem recurso à derivatização [126].

FCUP

63

3. Enquadramento do trabalho

3.1. Compostos químicos estudados

3.1.1. Compostos α-dicarbonílicos

Os compostos α-dicarbonílicos têm uma elevada importância na qualidade

alimentar visto que a sua formação se deve a processos enzimáticos e químicos,

envolvidos na degradação de alimentos nomeadamente através da reação de Maillard

(secção 1.2). Destes compostos, o diacetilo é um dos mais importantes e é um

marcador de qualidade de produtos fermentados, tais como a cerveja [82], o vinho

[132], a manteiga [133], o iogurte [134] e o queijo [135].

Nos vinhos os compostos α-dicarbonílicos presentes em maiores concentrações

são o glioxal, o metilglioxal, o diacetilo e a pentano-2,3-diona e são formados durante

a fermentação malolática [12]. Para além do impacto sensorial nos vinhos e noutras

bebidas fermentadas, os compostos α-dicarbonílicos podem-se ligar a outros

componentes desses produtos [136] e participar em diversos processos biológicos. A

importância destes compostos químicos em processos biológicos tem sido bastante

discutida nos últimos anos, sobretudo no caso do metilglioxal [137, 138].

A determinação de α-dicarbonilos em bebidas é habitualmente realizada através de

análise cromatográfica, líquida ou gasosa (Tabela 3.1). Em ambos os casos é

necessário extrair os analitos das suas matrizes devido às suas baixas concentrações

nas amostras e à elevada complexidade das matrizes. As técnicas de extração mais

frequentemente utilizadas para análise por GC são a SPME [71, 82] e a LLE [12, 26].

No caso da LC é possível analisar diretamente as amostras sem extração, e

recorrendo à derivatização [139-142]. Um dos derivatizantes mais utilizados é a o-

fenilenodiamina (OFDA) cuja reação com os compostos de α-dicarbonílicos se

encontra representada na Fig. 3.1. Este procedimento tem sido utilizado em diversas

matrizes e faz parte do método de referência da Organização Internacional do Vinho e

da Vinha (OIV) [143]. Apesar de ser possível quantificar os compostos α-dicarbonílicos

em concentrações muito baixas em vinho (50 µg L-1 [143]) e cerveja (0,8 µg L-1 [139])

com este procedimento, a realização de um passo de extração preliminar reduz os

interferentes e os efeitos negativos de outros componentes da matriz (tais como

açúcares, lípidos, pigmentos, etc.) nos sistemas cromatográficos, em particular nas

64 FCUP

Enquadramento do trabalho

colunas cromatográficas. Nesse sentido foram desenvolvidas metodologias utilizando

SPE [47, 48, 64] e GD [16] para análise de α-dicarbonilos por LC.

Tabela 3.1 – Lista de metodologias analíticas para a determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas.

Técnica

cromatográfica Deteção Extração Amostra Ref.

GC

MS

LLE Vinho [12, 26]

SPME Cerveja [82]

ECD

SPME Água [71]

GD Cerveja [144]

LC

UV

Sem extração

Vinho [12, 143]

Cerveja [139]

SPE Vinho e cerveja [47, 48]

Extração em headspace Cerveja [16]

FLD SPE Cerveja [64]

Fig. 3.1- Esquema representativo da reação química entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos.

3.1.2. Acetaldeído

Os aldeídos são compostos formados durante o processo de fermentação e têm

um papel importante no sabor e aroma característicos das bebidas. Os aldeídos de

cadeia curta contribuem significativamente para o perfil aromático de bebidas

alcoólicas sendo responsáveis pelos aromas e sabores a noz, maçãs estragadas,

feno/palha, relva cortada, gordura, fruta e picante [145]. Em geral os aldeídos resultam

da fermentação, mas podem também ser formados durante o armazenamento devido

FCUP


65

a diversas reações químicas e bioquímicas. Os níveis de aldeídos nas bebidas podem

ser, em alguns casos, um indicador de deterioração ocasionada pelo processo de

pasteurização, durante o armazenamento ou por contaminação.

O acetaldeído é o aldeído mais abundante em vinhos, sendo um intermediário da

produção bioquímica do etanol. A existência de elevadas concentrações de

acetaldeído em vinhos tintos resulta num aroma/sabor indesejável a maçã, enquanto

que em vinhos brancos é responsável pelo aroma a madeira. Para além das

alterações sensoriais nos vinhos, vários estudos demonstram que a ingestão de

elevadas quantidades de acetaldeído pode induzir uma série de efeitos neurológicos

adversos [146] e pode estar associada aos sintomas de ressaca tais como náuseas,

vómitos, suores, confusão, diminuição da pressão arterial e dores de cabeça [147]. O

acetaldeído tem também importância noutras doenças: está envolvido na fibrose

hepática [148], na dependência do álcool [149] e em alterações no feto durante a

gravidez [146]. Além disso, o acetaldeído é um dos agentes responsáveis pelos

cancros esofágico e gástrico, relacionados com o consumo crónico de álcool [150,

151]. A necessidade de controlar os níveis de acetaldeído nas bebidas alcoólicas é,

por isso, fundamental e a reavaliação da sua segurança tornou-se essencial [152]. No

entanto não existem ainda limites máximos legais para a concentração deste aldeído

nos vinhos.

A concentração de acetaldeído em vinhos depende, entre outros fatores, do tipo de

uva utilizada, da temperatura, do pH do mosto, dos níveis de oxigénio e da quantidade

de sulfito adicionado durante o processo de produção do vinho. A oxidação química do

etanol pode também aumentar a concentração de acetaldeído durante o período de

armazenamento. Dos parâmetros referidos, a presença e concentração de sulfito

adicionado ao vinho é aquele que mais impacto tem no teor de acetaldeído durante os

diferentes passos do processo produtivo. O sulfito atua na atividade da enzima

aldeído-desidrogenase, inibindo a conversão de acetaldeído em etanol; também se

pode ligar ao acetaldeído, diminuindo a quantidade de aldeído passível de ser

convertida em etanol [145].

No pH típico dos vinhos (entre 3 e 4) o sulfito está maioritariamente presente na

forma de ião bissulfito (HSO3-); o restante encontra-se na forma de SO2. O ião HSO3

-

apresenta uma elevada capacidade de se ligar a diversos compostos do vinho

(formando adutos), tais como o acetaldeído, ácido pirúvico, ácido 2-cetoglutárico,

antocianinas, glucose e compostos fenólicos [153]. As reações químicas de formação

66 FCUP


de adutos entre o HSO3- e compostos carbonílicos encontram-se na Fig. 3.2. Assim,

podem definir-se duas frações de sulfito presente em vinhos: a fração livre e a fração

ligada (ou combinada) [154, 155]. Mais de 95% do sulfito adicionado ao vinho está na

forma ligada, enquanto o restante permanece na forma livre. A formação de adutos

estabelece um equilíbrio químico e, portanto, quando a quantidade de SO2 livre

diminui, parte da forma ligada dissocia-se para restabelecer o equilíbrio.

Fig. 3.2 – Equações químicas que representam a formação de adutos entre o HSO3- e compostos carbonílicos [156].

O acetaldeído reage rapidamente com o HSO3- formando adutos não voláteis e,

deste modo, reduzindo a perceção olfativa deste aldeído. Esta é uma das razões pela

qual se adicionam sulfitos ao vinho [157]. Assim como acontece com os sulfitos, as

designações de “forma livre” e “forma ligada” também podem ser atribuídas ao

acetaldeído.

A determinação do acetaldeído em vinhos é habitualmente realizada recorrendo a

GC ou a HPLC, após derivatização. Para a análise por GC a derivatização é

normalmente realizada com o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)hidroxilamina (PFBHA) ou

pentafluorofenilidrazina (PFPH) [158] seguida de deteção por captura eletrónica ou

MS. A extração dos aldeídos das amostras para análise por GC é realizada por SPME

com derivatização na fibra ou por LLE após derivatização dos aldeídos na amostra

[145]. Para a análise por HPLC o reagente de derivatização mais utilizado é a 2,4-

dinitrofenilidrazina (DNPH, Fig. 3.3) que permite aumentar a sensibilidade da deteção

espetrofotométrica e melhorar a separação por HPLC em fase reversa [159]. Ao

contrário das metodologias baseadas em GC, normalmente não se recorre a nenhum

procedimento de extração para análise por HPLC; a derivatização dos analitos é

realizada na amostra, que é de seguida injetada diretamente no sistema

cromatográfico [160-162]. No entanto, tal como referido anteriormente, a realização de

FCUP


67

extração antes da análise cromatográfica permite reduzir a complexidade da matriz

evitando a degradação dos sistemas cromatográficos.

Fig. 3.3 – Equação química que representa a reação do DNPH com aldeídos.

3.1.3. Aminas biogénicas

As aminas estão normalmente presentes em alimentos e bebidas e são formadas,

principalmente, por descarboxilação de aminoácidos ou por aminação (ou

transaminação) de aldeídos e cetonas. São genericamente designadas por aminas

biogénicas e podem ser classificadas em três grupos de acordo com a sua estrutura

química (Fig. 3.4): alifáticas (metilamina, dimetilamina, etilamina, putrescina,

cadaverina, espermidina), aromáticas (tiramina, feniletilamina) e heterocíclicas

(histamina, triptamina) [163].

Fig. 3.4 – Estruturas químicas de algumas aminas biogénicas.

As aminas biogénicas podem surgir em todos os alimentos e bebidas que

contenham proteínas ou aminoácidos livres, e que estejam sujeitos a condições

68 FCUP


propícias à atividade bioquímica ou microbiológica. Por esta razão as aminas

biogénicas são consideradas marcadores da qualidade alimentar.

O teor total de aminas formadas depende do tipo de alimento ou bebida e do tipo

de microrganismos presentes. A presença de níveis elevados destes compostos pode

provocar diversos problemas de saúde tais como dores de cabeça, hipo ou

hipertensão, náuseas, palpitações cardíacas, intoxicação renal, entre outros [163].

Além disso, verifica-se que a presença de acetaldeído e etanol nos vinhos potenciam o

efeito tóxico das aminas [51].

Nos vinhos as aminas estão geralmente presentes na forma ionizada e são

inodoras. No entanto, ao pH da boca as aminas passam à forma não ionizada e o seu

sabor/odor pode tornar-se percetível [51]. A origem destes compostos nos vinhos pode

ser devida à presença de aminas no mosto, por formação durante a fermentação

alcoólica pelas leveduras, ou por ação de bactérias envolvidas na fermentação

malolática [61, 164]. A sua formação depende da presença de certos microrganismos

bem como do teor dos aminoácidos percursores, duração da fase inicial da

fermentação, do período de contacto do mosto com a casca das uvas, dos níveis de

SO2, do pH e da duração do contacto do vinho com as borras de leveduras. Na cerveja

o aparecimento de aminas biogénicas está relacionado com a atividade das leveduras,

com contaminações microbiológicas ou com a qualidade das matérias-primas [165].

De uma forma geral, a dificuldade na determinação de aminas biogénicas reside no

facto de estarem presentes em muito baixas concentrações em amostras complexas

tais como os vinhos e cerveja. Existem algumas metodologias analíticas para a

determinação de aminas biogénicas em bebidas baseadas em CE [61, 166-169] e GC

[28]. Porém a LC é a técnica mais utilizada.

Para a análise por LC é geralmente necessário recorrer à derivatização dos

analitos de forma a aumentar a seletividade e sensibilidade das metodologias. Os

reagentes de derivatização mais comuns são o o-ftalaldeído (OPA) [63, 170, 171], o

cloreto de dansilo (DNS-Cl) [18, 57] e o cloreto de dabsilo [172]. Neste trabalho foi

utilizado o isotiocianato de fenilo (PITC) para a derivatização das aminas estudadas.

Este reagente, designado também por reagente de Edman, é habitualmente utilizado

para a determinação de aminoácidos, mas reage igualmente bem com aminas

primárias e secundárias formando feniltioureias (PTC) (Fig. 3.5). Apesar de ser menos

FCUP


69

utilizado do que os derivatizantes acima referidos, o PITC foi aplicado à determinação

de aminas em vinhos [56] e águas [173].

Fig. 3.5 – Esquema que representa a reação química entre o PITC e as aminas.

Independentemente do reagente utilizado para a derivatização das aminas, é

necessário realizar uma etapa de limpeza e/ou concentração da amostra quando se

pretende determinar aminas em níveis de concentração muito baixos sem a

interferência de outros componentes da amostra. A determinação de aminas de baixo

peso molecular em soluções aquosas é particularmente desafiante devido à elevada

polaridade desses compostos que os tornam muito solúveis em água. A abordagem

mais simples é análise cromatográfica da amostra após a realização de derivatização

das aminas na amostra sem recurso a limpeza ou extração dos analitos [174-176].

Porém, devido aos problemas associados à determinação de aminas acima descritos,

foram desenvolvidas metodologias em que se realiza uma etapa de extração. A LLE

clássica (antes ou depois da derivatização das aminas) [18, 27] e a SPE têm sido

utilizadas para o isolamento das aminas (ou dos seus produtos da derivatização) antes

da análise dos extratos por LC. A SPE tem sido mais usada devido às suas vantagens

relativamente à LLE [51, 56, 57, 63, 65]. Loukou e Zoutou descreveram uma

metodologia em três passos que inclui o pré-tratamento da amostra de vinho com

polivinilpirrolidona para a remoção de interferentes, seguido da derivatização das

aminas e finalmente a utilização da SPE para a limpeza do extrato [59].

3.1.4. Fenóis voláteis

Os fenóis voláteis são compostos com elevada importância no aroma e sabor de

bebidas e são responsáveis por determinadas características sensoriais próprias

desses produtos. Por vezes, quando estes compostos excedem determinados níveis

de concentração podem tornar a bebida inaceitável para consumo. Nalguns tipos de

cerveja, dois dos mais importantes fenóis, o 4-vinilfenol e o 4-vinilguaicol, são

considerados essenciais para o aroma e sabor característicos dessas bebidas [177]

enquanto noutras cervejas os seus níveis têm de ser controlados. Os fenóis voláteis 4-

70 FCUP


vinilfenol e 4-vinilguaiacol podem ser produzidos pela descarboxilação térmica ou

enzimática dos ácidos p-cumárico e ferúlico, respetivamente (Fig. 3.6) [177]. Durante a

produção da cerveja, por exemplo, as elevadas temperaturas utilizadas durante a

ebulição do mosto e a pasteurização, podem degradar os ácidos fenólicos formando

os fenóis voláteis correspondentes.

Fig. 3.6 – Mecanismo da formação enzimática de vinilfenóis e etilfenóis por Brettanomyces (adaptado de [157]).

Nos vinhos os fenóis voláteis estão presentes numa gama de concentrações muito

variável, sendo os mais abundantes o 4-vinilfenol, o 4-vinilguaiacol, o 4-etilfenol e o 4-

etilguaicol. As suas concentrações variam de acordo com o tipo e variedade do vinho.

Apesar de estarem descritos vários mecanismos para a formação destes fenóis nos

vinhos, a descarboxilação enzimática causada pela contaminação com a levedura

Brettanomyces (Fig. 3.7) é considerada a mais significativa [13]. O mecanismo da

formação enzimática dos quatro principais fenóis produzidos no vinho por esta via

encontra-se representado na Fig.

3.6. Esta levedura tem sido referida

como uma das maiores

preocupações na vinificação pois é

responsável pelo aparecimento do

conhecido aroma/sabor fenólico.

Esta característica nos vinhos é

sobretudo devida à presença de 4-

etilfenol e 4-etilguaiacol, e torna-se

especialmente significativa quando

a concentração total destes dois

compostos excede 600 µg L-1 [13].

Fig. 3.7 – Imagens obtidas por microscopia eletrónica de

varrimento de células de levedura Brettanomyces [178].

FCUP


71

Os fenóis voláteis em bebidas podem ser determinados por LC ou GC.

Habitualmente é necessário recorrer à extração e/ou concentração destes compostos

devido à elevada complexidade das matrizes e às baixas concentrações dos analitos.

As técnicas de extração geralmente utilizadas nas metodologias por GC são a LLE, a

SPE [179], a SPME [73, 74, 83, 85] e a SBSE [88]. Mais recentemente têm vindo a ser

exploradas as técnicas de extração dispersivas para a extração de fenóis voláteis em

bebidas. A DLLME é uma técnica promissora tirando partido do contacto direto entre o

solvente orgânico e a amostra. Além disso, ultrapassa as principais desvantagens da

LLE convencional, reduzindo os volumes de solvente e amostra necessários, o tempo

de extração e a manipulação da amostra [35, 38]. A USAEME foi também aplicada

recentemente à determinação de fenóis voláteis em vinhos [34].

Geralmente, nas metodologias publicadas para a análise de fenóis voláteis por LC,

não é utilizado nenhum procedimento de extração; as amostras são simplesmente

filtradas e injetadas diretamente no sistema cromatográfico com ou sem diluição prévia

[13, 177, 180-183]. Os trabalhos encontrados na literatura que recorrem extração (por

SPE) para análise por HPLC só determinam o 4-vinilguaiacol em sumos de laranja [50,

52, 62, 184, 185]. Este fenol é um dos principais responsáveis pelo aroma e sabor a

fruta podre em sumos de citrinos, daí o interesse da sua determinação [184, 186].

Apesar de ser possível detetar a maioria dos fenóis voláteis presentes em baixas

concentrações nas bebidas (para níveis superiores a 1 µg L-1) por HPLC usando

metodologias que não recorrem a extração prévia [180, 183], a utilização de um passo

de “limpeza” da amostra será benéfico para evitar os efeitos prejudiciais de alguns

componentes da matriz da amostra (açúcares, lípidos, pigmentos, etc.) na análise

rotineira de bebidas, ou seja para aumentar a robustez das metodologias e

separações cromatográficas e prevenir a degradação a longo prazo dos sistemas

cromatográficos, em particular do desempenho das colunas cromatográficas.

3.2. Técnicas de extração utilizadas neste trabalho

3.2.1. Microextração por difusão gasosa

A microextração por difusão gasosa, abreviada para GDME (do inglês, gas-

diffusion microextraction) é uma técnica de extração de espécies voláteis e semi-

voláteis desenvolvida em 2010 por Pacheco et al. [104] e patenteada em 2013 [187]. O

72 FCUP


processo de extração consiste na difusão gasosa das espécies através de uma

membrana, e a recolha dos compostos extraídos numa solução aceitadora contida no

interior do módulo extrator. Na Fig. 3.8 encontra-se representado o módulo de GDME.

O módulo extrator é constituído por um corpo e uma cabeça perfurados, fabricados

em PTFE, entre os quais se coloca uma membrana porosa impermeável às soluções

dadora e aceitadora criando-se, assim, um espaço gasoso nos poros da membrana

através dos quais se podem difundir as

espécies gasosas. As configurações e

medidas do módulo e as membranas

utilizadas podem ser facilmente

alteradas de forma a ajustar a

sensibilidade da metodologia para a

utilização com diversas matrizes,

analitos e técnicas analíticas. As

membranas são obtidas por corte de

membranas comerciais de maiores

diâmetros.

Fig. 3.8 – Representação esquemática do módulo de

GDME.

O procedimento experimental (Fig. 3.9) consiste na imersão parcial do módulo de

GDME com a membrana numa solução dadora (amostra) termostatizada e em

agitação. No interior do módulo é colocado um pequeno volume (inferior a 1 mL) de

uma solução aceitadora (Fig. 3.9A). Após um determinado período de tempo, definido

de acordo com a sensibilidade pretendida, a solução aceitadora é recolhida e

analisada por uma técnica analítica adequada.

Fig. 3.9 – Esquema do procedimento experimental de GDME e representação do processo de extração quando na

solução aceitadora existe um reagente derivatizante β a reagir com o analito α, originando γ.

FCUP


73

A seletividade e sensibilidade desta técnica dependem em grande parte da

composição da solução aceitadora e é na modificação da sua composição que se

podem tirar grandes vantagens da GDME. A abordagem mais frequente tem sido a

utilização de um agente derivatizante na solução aceitadora. Em muitos casos é a

derivatização dos analitos que permite a sua deteção. A utilização de derivatizantes

específicos para determinadas espécies químicas permite aumentar a seletividade da

extração. Além disso, a presença do reagente derivatizante na solução aceitadora faz

com que, no decorrer do processo, a quantidade de analito que vai chegando a essa

solução vá diminuindo (por reação com o derivatizante), aumentando a eficiência da

extração (princípio de Le Chatelier, Fig. 3.9).

Um dos problemas associados à difusão gasosa (GD) é a necessidade da troca

frequente das membranas devido à colmatação dos poros por partículas presentes na

amostra. Nos processos tradicionais por GD que operam em fluxo é frequente a

necessidade de interromper o processo para substituir a membrana. Este aspeto é um

dos principais inconvenientes dos processos por GD. O módulo de GDME representa

uma alternativa simples aos módulos de GD convencionais, visto que é possível trocar

a membrana rapidamente desapertando a parte inferior do módulo. Além disso, as

membranas utilizadas em GDME têm um tamanho mais reduzido que as

habitualmente usadas em GD.

3.2.2. Extração líquido-líquido assistida por salting-out

O processo de salting-out consiste na adição de um eletrólito a uma solução

aquosa de forma a modificar o coeficiente de distribuição de um dado soluto entre

duas fases [188] e tem sido utilizado com diferentes fins. De forma genérica a adição

de um eletrólito (ou mistura de eletrólitos) a uma solução permite alterar as forças de

solvatação entre os solutos e a água.

O salting-out tem sido bastante aplicado em técnicas de preparação de amostra,

nomeadamente em extrações baseadas na formação de um headspace [43, 189] nas

quais, geralmente, a extração de analitos para o headspace pode ser favorecida pela

adição de um sal à amostra. Porém, existem outras aplicações interessantes do

salting-out que incluem a adição de um sal para separar água de solventes orgânicos

que, sem isso, seriam miscíveis com a água (acetonitrilo, acetona, metanol, etanol,

etc.) formando um sistema líquido bifásico. Uma das primeiras demonstrações deste

74 FCUP


efeito foi publicada em 1914 por Frankforter e Cohen [190] que estudaram vários sais

inorgânicos para separar água e acetona. Mais tarde, em 1973, Matkovich e Christian

[191] utilizaram o cloreto de cálcio para separar a mesma mistura de solventes. Para a

escolha do sal para o processo de separação de dois líquidos miscíveis por salting-out

deve ter em conta três premissas: (1) que a solubilidade do sal no solvente orgânico

deve ser considerada desprezável, (2) que a solubilidade do sal na água deve ser a

mais elevada possível para maximizar a interação entre os iões e a água e (3) que a

capacidade de salting-out dos sais segue a série liotrópica (ou série de Hofmeister)

[192]. O processo de separação de líquidos miscíveis ocorre porque um dos solventes

solvata preferencialmente o eletrólito, tornando-o indisponível para solvatar o outro

solvente e, portanto, ocorrer a miscibilidade.

A possibilidade de separar líquidos miscíveis através do processo de salting-out

levou ao desenvolvimento de técnicas de extração baseadas neste princípio e que têm

assumido várias designações: separação induzida por sal, extração líquido-líquido

assistida por salting-out (SALLE), extração líquido-líquido homogénea por salting-out

(SHLLE). Ao longo deste trabalho será adotada a designação SALLE.

Após a publicação, em 1973, da aplicação de SALLE para a extração de quelatos

metálicos de água utilizando acetona [191] o interesse por este processo de extração

não parou de crescer. Ainda na década de 1970, Nagaosa [193-195] iniciou a

expansão desta técnica a outros solventes orgânicos miscíveis com a água,

nomeadamente ao acetonitrilo, e aplicou-o à extração de catiões metálicos presentes

em soluções aquosas. Ao longo dos anos têm sido testados outros solventes [196-

198], no entanto o acetonitrilo é um dos solventes extratores mais promissores em

múltiplas aplicações. O acetonitrilo é miscível com a água em todas as proporções e a

sua polaridade é favorável à extração de uma vasta de gama de compostos; para além

disso é adequado à análise por LC e GC. Como o acetonitrilo é um solvente orgânico

menos tóxico que a maior parte dos solventes orgânicos utilizados na LLE clássica, é

mais adequado no contexto da Química Verde. Tendo em conta que os solventes

utilizados em SALLE são miscíveis com a água, os extratos orgânicos obtidos são

compatíveis com diversas técnicas analíticas: voltametria [191, 193-195, 199], LC

[196, 200-205], CE [206, 207], espectrofotometria de emissão atómica com plasma

acoplado indutivamente [208], espetrofotometria de absorção atómica [209], entre

outros.

FCUP


75

No campo das biomoléculas, a SALLE tem provado ser um processo de extração

vantajoso relativamente às técnicas convencionais de LLE, fazendo com que esta

técnica tenha adquirido um grande impulso. Para além das vantagens mais óbvias

(baixo consumo de solventes, possibilidade de automação, baixo custo), a utilização

de solventes orgânicos de alta polaridade permite expandir as vantagens da extração

líquido-líquido a uma maior gama de compostos, de baixa até elevada polaridade

[210]. Além disso, a utilização do salting-out é reconhecidamente útil na precipitação

de proteínas em matrizes biológicas. Apesar da SALLE já ter sido descrita na década

de 1980 para a extração de fármacos de amostras biológicas [204], só recentemente é

que lhe tem sido dada maior atenção para aplicações analíticas [203, 211, 212].

A utilização do SALLE para realizar extrações em matrizes complexas tais como

plantas [213], amostras ambientais [214] e alimentos [215-217] tem sido crescente nos

últimos anos. A metodologia QuEChERS revigorou o salting-out aplicado à análise

química extração sobretudo na área do controlo alimentar de pesticidas em alimentos

[215, 216, 218].

Parte II

Microextração por difusão gasosa

FCUP

79

4. Introdução

Como referido anteriormente a técnica de GDME surgiu da combinação das

técnicas de PV, LLME e GD, tirando partido das principais vantagens de cada uma

delas. A caracterização da técnica de GDME começou por ser realizada com o intuito

de otimizar procedimentos de extração de aldeídos e dicetonas presentes em bebidas.

Neste trabalho pretendeu-se realizar uma caracterização mais profunda desta técnica

avaliando alguns dos principais parâmetros experimentais: natureza e características

da membrana, modo de extração, força iónica, temperatura, tempo, agitação da

solução dadora, presença do derivatizante na solução aceitadora e agitação desta

solução (Capítulo 6).

Além dos estudos de caracterização da GDME, foram desenvolvidas metodologias

analíticas para a extração e determinação de alguns compostos responsáveis por off-

flavours em bebidas: aminas (Capítulo 7), acetaldeído (Capítulo 8) e compostos α-

dicarbonílicos (Capítulo 9).

FCUP

81

5. Execução experimental

5.1. Materiais e equipamentos

Os materiais e equipamentos utilizados para a realização do trabalho experimental

foram os seguintes:

Balança de precisão Mettler, modelo PE2000, para pesagem de reagentes.

Balança analítica Mettler, modelo AE50, para pesagem rigorosa de reagentes.

Banho de ultrassons Bandelin Sonorex, modelo TK100, para a homogeneização e

desgaseificação de soluções e amostras.

Medidor de pH Metrohm, modelo 605, equipado com elétrodo combinado de vidro

calibrado com soluções tampão de referência de pH 4 e 7.

Micropipetas Brand Transferpette (2 – 20 μL; 20 – 100 μL), Gilson Pipetman (P100 -

capacidade máxima de 100 µL; P200 – capacidade máxima de 200 µL; P1000 -

capacidade máxima de 1000 µL), Brand e Selecta (capacidade máxima de 5 mL)

para medição rigorosa de pequenos volumes. A medição de volumes superiores a 5

mL foi realizada com pipetas volumétricas de vidro.

Sistemas de purificação de água Millipore Simplicity e Direct-Q3 UV, para

purificação de água (água ultrapura com resistividade superior a 18 MΩ cm)

utilizada para a preparação de soluções e dos eluentes para HPLC.

Módulo de extração por difusão gasosa (GDME) fabricado em PTFE (Fig. 3.8).

Membranas porosas com as características indicadas na Tabela 5.1.

82 FCUP

Execução experimental

Tabela 5.1 - Características principais das membranas utilizadas no módulo de GDME.

Designação Material Tamanho do

poro (µm)

Espessura

(µm) Marca Morfologia

SureVent PVDF modificado 0,22 125 Millipore Porosas

simples Mitex PTFE 5 170 Millipore

Fluoropore 0,22 PTFE com

suporte de HDPE 0,22 150 Millipore

Porosas

suportadas Fluoropore 0,45 PTFE com

suporte de HDPE 0,45 150 Millipore

Zefluor PTFE suportado 2 152 Pall Corporation

Sistema de HPLC com deteção espetrofotométrica utilizado para a determinação de

acetaldeído (secção 8) constituído por:

Bomba com unidade de gradiente quaternário Jasco, modelo PU-2089 Plus;

Unidade de desgaseificação Jasco, modelo DG-1580-54;

Detetor espetrofotométrico Jasco, modelo UV-2070 Plus;

Injetor manual Rheodyne, modelo 7725i, com loop de injeção de 20 µL.

Interface Jasco, modelo LC-Net II/ADC.

Programa Jasco ChromPass Chromatography Data (versão 1.7.403.1) para

o controlo de sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.


aldeídos, compostos α-dicarbonílicos (secções 6 e 9) e aminas alifáticas (secção 7)

constituído por:

Bomba de gradiente quaternário PerkinElmer, modelo S200;

Detetor espetrofotométrico PerkinElmer, modelo S200

Amostrador automático PerkinElmer, Flexar com loop de injeção de 100 μL.

FCUP


83

Programa TotalChrom Navigator (PerkinElmer, versão 6.3.2) para o controlo

do sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.

Sistema de HPLC-DAD-MS/MS para a identificação de compostos obtidos nos

extratos de GDME (secção 8.5) constituído por:

Bomba com unidade de gradiente quaternário Thermo Electron Corporation;

Injetor automático Thermo Electron Corporation;

Detetor espetrofotométrico com rede de díodos;

Detetor MS ion-trap quadrupolo com fonte de ionização por electrospray

(ESI) Finnigan LCQ Deca XP Plus;

Programa XCalibur (versão 1.4) da Thermo Electron Corporation para o

controlo do sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.

Colunas cromatográficas com as características indicadas na Tabela 5.2.

Tabela 5.2 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações dos compostos extraídos por

GDME.

Coluna Comprimento Diâmetro

interno

Tamanho da

partícula

Dimensões da

pré-coluna Marca

Gemini C18 250 mm 4,6 mm 5 µm 4 x 3,0 mm Phenomenex

Eurospher C18 250 mm 4,0 mm 5 µm 5 x 4 mm Knauer

Hypersil GOLD 150 mm 4,6 mm 3 µm 10 x 4 mm Thermo

Scientific

5.2. Preparação de soluções

As soluções padrão stock (1 g L-1) dos compostos carbonílicos (Sigma-Aldrich) em

estudo foram preparadas em acetonitrilo e armazenadas a -20 ºC à exceção das

soluções padrão de glioxal, metilglioxal e formaldeído que foram preparadas em água

ultrapura e armazenadas a 4 ºC. As soluções diluídas destes compostos foram

preparadas diariamente em água ultrapura a partir das soluções stock.

84 FCUP


A solução de 0,01% (m/v) de o-fenilenodiamina (OFDA, 98% pureza, Sigma-

Aldrich) foi preparada diariamente por dissolução do reagente em solução tampão

fosfato 0,1 mol L-1, pH 7 e armazenada ao abrigo da luz. A solução tampão foi

preparada com hidrogenofosfato de sódio (VWR) e o pH foi ajustado com HCl (1 mol L-

1, Panreac).

As soluções de DNPH (0,25% ou 0,6%, m/v) para a derivatização dos aldeídos

foram preparadas por dissolução do reagente comercial (grau de pureza 97%, Sigma-

Aldrich) numa mistura (50:50, v/v) de acetonitrilo e HCl (40 mmol L-1).

As soluções padrão stock (1 g L-1) de metilamina, dimetilamina e etilamina (Sigma-

Aldrich) foram preparadas em HCl (0,1 mol L-1, VWR) e armazenadas a 4 ºC. As

soluções diluídas das aminas foram preparadas diariamente em água ultrapura a partir

das soluções stock. A solução de fenilisotiocianato (PITC, 98% pureza, Sigma-Aldrich)

para derivatização das aminas foi preparada por diluição do reagente em acetonitrilo

(para HPLC, Fisher).

Para as separações cromatográficas utilizou-se acetonitrilo (Panreac, qualidade

para HPLC), solução tampão acetato (20 mmol L-1), preparada a partir da mistura

equimolar de acetato de sódio e ácido acético (Merck) e solução aquosa (0,1%, v/v) de

ácido fórmico (Sigma-Aldrich). Os eluentes para HPLC foram filtrados por filtro de

Nylon (0,45 µm, Whatman) e desgaseificados antes da sua utilização.

5.3. Procedimentos experimentais

5.3.1. Caracterização do processo de extração

As extrações de compostos carbonílicos foram realizadas utilizando 25 mL de

solução padrão num copo termostatizado. No interior do módulo de GDME eram

colocados 0,5 mL de solução aceitadora. Foram testados diferentes parâmetros da

extração: (1) tipo de membrana utilizada (ver Tabela 5.1), (2) modo de extração, (3)

força iónica, (4) temperatura, (5) tempo, (6) agitação da solução dadora, (7) presença

do derivatizante na solução aceitadora e (8) agitação da solução aceitadora.

A análise cromatográfica dos extratos obtidos a partir da extração de soluções

padrão de glioxal, metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona era

realizada utilizando uma coluna Gemini C18 (ver Tabela 5.2) à temperatura ambiente

utilizando uma fase móvel em modo isocrático com uma mistura 50:50 (v/v)

FCUP


85

acetonitrilo-solução tampão acetato (20 mmol L-1) durante 15 min e um caudal de 0,8

mL min-1. A deteção era realizada a 315 nm e eram injetados 20 µL de amostra.

Os restantes compostos eram separados por LC numa coluna Gemini C18 (ver

Tabela 5.2) à temperatura ambiente, com um caudal de eluente de 1 mL min-1. O

eluente era composto por acetonitrilo e solução tampão acetato (10 mmol L-1) e foi

utilizado em modo gradiente: (1) de 0 a 25 min a composição de acetonitrilo aumentou

linearmente de 50% a 100%; (2) nos 5 min seguintes a composição da fase móvel

regressou às condições iniciais mantendo-se por mais 10 min. A deteção era realizada

a 360 nm.

5.3.2. Determinação de aminas biogénicas alifáticas

O esquema do procedimento de preparação da amostra encontra-se

esquematizado na Fig. 5.1. No copo termostatizado eram colocados 15 mL de amostra

e no interior do módulo GDME eram colocados 500 µL da solução aceitadora (10

mmol L-1 de NaH2PO4, VWR). As membranas utilizadas, com 10 mm de diâmetro, são

obtidas a partir de corte das membranas Mitex com 47 mm de diâmetro (Tabela 5.1).

Para iniciar a extração, eram adicionados 500 µL de uma solução de NaOH (1 mol L-1,

VWR) e a extração prosseguia a 40 ºC durante 10 min com agitação da amostra e da

solução aceitadora. No final da extração, o extrato era recolhido na totalidade e

transferido para uma ampola de 2 mL para proceder à derivatização das aminas. Para

a reação eram adicionados ao extrato 100 µL de Na3PO4 (0,1 mol L-1, VWR) e 1 mL da

solução de PITC (0,5%, v/v). A reação decorria à temperatura ambiente durante 10

min. Por fim, para parar a reação adicionavam-se 100 µL de HCl (0,1 mol L-1) antes da

análise por HPLC-UV.

Fig. 5.1 – Esquema do procedimento experimental utilizado para a determinação de aminas alifáticas.

86 FCUP


A análise dos extratos foi efetuada de acordo com o procedimento descrito por

Sahasrabuddhey et al. [173] com pequenas modificações. A separação cromatográfica

era realizada à temperatura ambiente numa coluna Eurospher C18 (Tabela 5.2). O

caudal de eluente utilizado era de 0,8 mL min-1 utilizando um gradiente binário de uma

fase móvel constituída por acetonitrilo e 0,1% de ácido fórmico em água do seguinte

modo: (1) 0 – 8 min a 45% de acetonitrilo; (2) aumento linear até 100% de acetonitrilo

em 7 min; (3) regresso às condições iniciais em 5 min, (4) seguidos de mais 5 min

para estabilização antes da injeção anterior. Eram injetados 20 µL de amostra e a

deteção era feita a 254 nm.

As amostras de vinho analisadas foram adquiridas comercialmente e as amostras

de cerveja foram gentilmente cedidas pela UNICER-Bebidas de Portugal (S. Mamede

de Infesta). A designação, o teor alcoólico e o pH das amostras analisadas encontram-

se referidas na Tabela 5.3.

Tabela 5.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho e cerveja analisadas para a determinação de

aminas alifáticas.

Designação da amostra Teor alcoólico (%, v/v) pH

Vinho branco 1 10,5 3,1



Vinho tinto 1 10,0 3,3


Vinho rosé 11,5 3,4

Cerveja preta 5,0 4,2

Cerveja Pilsner 5,1 3,9

Cerveja sem álcool < 0,5 4,1

5.3.3. Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos

O procedimento experimental seguido para a extração foi baseado no trabalho de

Gonçalves et al. [219] com algumas modificações. No copo termostatizado eram

FCUP


87

colocados 20 mL de amostra. No módulo de GDME, utilizado com as membranas

Mitex (Tabela 5.1) e imerso na amostra, era colocado 1 mL da solução de DNPH

(0,6%, m/v). As extrações eram efetuadas a 50 ºC durante 15 minutos. Os extratos

eram filtrados num filtro de Nylon (VWR, 0,5 µm poro) antes da análise por HPLC-UV.

O acetaldeído livre era determinado a partir da extração direta das amostras de

vinho. Para a determinação do acetaldeído total as amostras de vinho eram diluídas

em solução tampão fosfato (0,1 mol L-1, pH 12,5) antes da extração para permitir a

dissociação dos adutos acetaldeído-HSO3-.

As separações cromatográficas eram realizadas à temperatura ambiente numa

coluna Gemini C18 (Tabela 5.2). A fase móvel era composta por acetonitrilo e tampão

acetato (20 mmol L-1, pH 4) e era utilizada a 1 mL min-1 em modo gradiente do

seguinte modo: (1) nos primeiros 15 min ocorria um aumento linear de 50% a 60% de

acetonitrilo, (2) nos 5 min seguintes a composição da fase móvel voltava às condições

iniciais e estas condições e (3) eram mantidas durante mais 10 minutos para

estabilização antes da injeção seguinte. A deteção do derivado do acetaldeído era

feita a 365 nm e foram injetados 20 µL de amostra.

As amostras analisadas foram adquiridas comercialmente. A designação, o teor

alcoólico e o pH das amostras encontram-se referidas na Tabela 5.4.

Tabela 5.4 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho analisadas para a determinação de acetaldeído

livre e total.

Designação da amostra Teor alcoólico (%, v/v) pH




Vinho rosé 11,5 3,4





88 FCUP


Para os ensaios por HPLC-DAD-MS/MS as separações cromatográficas eram

efetuadas na coluna cromatográfica Hypersil GOLD (Tabela 5.2). As separações

cromatográficas eram realizadas nas mesmas condições utilizadas para as análises

por HPLC-UV mas a um fluxo de 0,4 mL min-1 e usando um volume de injeção de 25

µL. O detetor de MS foi utilizado em modo negativo nas condições descritas na Tabela

5.5.

Tabela 5.5 – Condições utilizadas no detetor de MS para os estudos de identificação dos compostos extraídos por

GDME.

Temperatura do capilar 325 ºC

Corrente da fonte 5,0 kV

Corrente do capilar 4,0 V

Fluxo do sheat gas (N2) 80 unidades arbitrárias

Fluxo do gás auxiliar (N2) 30 unidades arbitrárias

Intervalo de deteção 120–2000 m/z

5.3.4. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares

Num copo termostatizado a 55 ºC eram colocados 25 mL de amostra e, no módulo

de GDME imerso na amostra, eram colocados 500 µL de solução de OFDA (0,01%,

m/v). A membrana utilizada era a SureVent (Tabela 5.1). A extração dos compostos α-

dicarbonílicos da amostra para a solução aceitadora decorria durante 10 min, a 55 ºC

e com agitação contínua da amostra.

A separação cromatográfica dos extratos era realizada numa coluna Phenomenex

Gemini C18 (Tabela 5.2), à temperatura ambiente, com um caudal de eluente de 0,8

mL min-1. A fase móvel era usada em modo isocrático com uma mistura 50:50 (v/v)

acetonitrilo-solução tampão acetato (20 mmol L-1) durante 15 min. A deteção era feita

a 315 nm e eram injetados 20 µL de amostra.

As amostras analisadas (vinho do Porto, chá preto e molho de soja) foram

adquiridas comercialmente. As amostras de vinho e molho de soja eram utilizadas

diretamente no procedimento de extração. A amostra de chá era preparada por

FCUP


89

infusão, de acordo com as indicações da embalagem (um saco de chá para 200 mL de

água quente). A infusão resultante era utilizada para o procedimento de extração.

FCUP

91

6. Caracterização do processo de extração

O desenvolvimento da GDME surgiu na sequência de modificações de outras

técnicas de extração que recorrem a membranas tais como a PV, a LLME e a GD

(secção 2.4). Pretendia-se conjugar numa única técnica as vantagens de cada uma

das referidas anteriormente, tentando simplificar o mais possível o procedimento

experimental. Uma das principais características desta técnica e que a torna diferente

da PV, da GD e da LLME é a realização de extrações baseadas na difusão gasosa

dos analitos através dos poros de uma membrana microporosa que separa duas

soluções líquidas (fases dadora e aceitadora). No início do desenvolvimento da GDME

foram realizados estudos para avaliar a influência de alguns parâmetros na extração

de dicetonas vicinais presentes em cerveja, tais como a temperatura, tempo, força

iónica, agitação, pH e volume de solução aceitadora [104]. Com o desenvolvimento de

novas aplicações para a GDME a outros analitos, nomeadamente para a determinação

de aldeídos em amostras de cerveja [105] e de diacetilo em vinho [106], foi necessário

voltar a estudar e otimizar alguns destes parâmetros para essas metodologias. No

entanto, não tinha ainda sido realizada nenhuma caracterização de caráter

fundamental sobre a técnica de extração, o que motivou a realização de estudos mais

detalhados sobre vários parâmetros experimentais que serão discutidos nas secções

seguintes.

6.1. Influência da natureza e características da membrana

As características das membranas utilizadas em processos de difusão gasosa

influenciam a eficiência e a seletividade da extração. No caso de membranas

microporosas, a eficiência e seletividade da extração pode estar relacionada com o

tamanho dos poros. De forma a estudar a influência da natureza e das características

da membrana no processo de extração por GDME, foram realizadas extrações de

soluções aquosas de cetonas e aldeídos utilizando as membranas hidrofóbicas

descritas na Tabela 5.1, mantendo constantes a temperatura e o tempo de extração

(55 ºC e 10 min, respetivamente). Os cromatogramas obtidos nas separações

cromatográficas dos compostos analisados encontram-se representados na Fig. 6.1 e

na Fig. 6.2. As membranas estudadas podem ser agrupadas em dois grandes grupos

de acordo com a sua morfologia: membranas porosas simples e membranas porosas

suportadas. Estas diferenças morfológicas associadas ao tamanho dos poros e à

92 FCUP

Caracterização do processo de extração

espessura da membrana influenciam o mecanismo de transporte das espécies através

das membranas, afetando a seletividade e eficiência da extração [220, 221].

Fig. 6.1 - Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão com uma concentração de 1 mg

L-1 de cada um dos compostos α-dicarbonílicos. As extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10 min e as condições

cromatográficas foram as descritas na secção 5.3.1.

Fig. 6.2 – Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão com uma concentração de 2 mg

L-1. As extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10 min e as condições cromatográficas foram as descritas na

secção 5.3.1.

Os resultados apresentados na Fig. 6.3 correspondem à soma das áreas dos picos

cromatográficos dos compostos analisados. De forma geral verificou-se que a extração

foi mais eficiente quando se utilizaram membranas de poros maiores (membranas

Mitex e Zefluor), quer para as membranas porosas simples quer para as suportadas.

Ou seja, verificou-se que quanto maior o tamanho do poro, maior é o fluxo de espécies

através da membrana.

FCUP


93

Fig. 6.3 – Soma das áreas dos picos cromatográficos de cetonas e aldeídos extraídos a partir de misturas aquosas

destes compostos utilizando diferentes membranas hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com

soluções padrão contendo 1 mg L-1 de cada composto dicarbonílico e 5 mg L-1 de cada aldeído e acetoína, a 55 ºC

durante 10 min.

No entanto, analisando as respostas individuais dos compostos analisados,

verificou-se que para alguns analitos a extração foi mais eficiente quando se utilizaram

membranas de poros menores (Fig. 6.4). Estes resultados mostraram que o tamanho

dos poros da membrana afeta não só a eficiência mas também a seletividade do

processo. Para além disso verificou-se que a eficiência da extração para membranas

com poros do mesmo tamanho (SureVent e Fluoropore 0,22) não foi igual, como se

verifica pela análise dos resultados da Fig. 6.4. Assim, concluiu-se que a eficiência

depende também da porosidade (volume de espaço gasoso contido na membrana), da

distribuição dos poros, da natureza e morfologia da membrana. No caso das

membranas suportadas, a seletividade é também determinada pela composição da

superfície da membrana [220]. Este facto poderá explicar as diferenças na eficiência

da extração de alguns compostos utilizando duas membranas com o mesmo tamanho

de poro mas morfologicamente diferentes.

94 FCUP


Fig. 6.4 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído, metilglioxal e acetoína obtidos a partir da extração de

soluções aquosas utilizando diferentes membranas hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com

soluções padrão contendo 1 mg L-1 de metilglioxal e 5 mg L-1 de formaldeído e acetoína, a 55 ºC durante 10 min.

Se a dependência da eficiência global da extração com o tamanho dos poros da

membrana corresponde ao esperado, isto é, que poros de maiores dimensões

permitem uma mais fácil passagem de analitos, a seletividade verificada é mais difícil

de explicar. Por exemplo para o acetaldeído e o diacetilo (Fig. 6.5), a seletividade do

processo de separação não está exclusivamente dependente do tamanho dos poros

da membrana e, por isso, poderá estar também relacionada com as características e

propriedades das espécies a separar e da morfologia da membrana.

Fig. 6.5 – Áreas dos picos cromatográficos do acetaldeído e diacetilo obtidos a partir da extração de soluções aquosas

utilizando diferentes membranas hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão

contendo 5 mg L-1 de acetaldeído e 1 mg L-1 de diacetilo, a 55 ºC durante 10 min.

FCUP


95

Como foi referido anteriormente, é difícil estimar a seletividade do processo de

extração com membranas. No entanto, é possível tentar prever quais as propriedades

dos compostos a separar que poderão influenciar os resultados obtidos, tendo por

base a teoria simplificada do transporte de espécies gasosas através de membranas

[221]. O transporte de gases por difusão através de membranas pode ser descrito pela

primeira lei de Fick

Equação 6.1

em que F é o fluxo do gás através da membrana, D é o coeficiente de difusão e dC/dx

é o gradiente de concentração na membrana. Sabendo que no estado estacionário o

fluxo é constante e se assumirmos que D é constante, a Equação 6.1 pode ser

integrada, obtendo-se

Equação 6.2

em que C0 e Cl são as concentrações do analito nas extremidades da membrana e l é

a espessura da membrana. Para pressões baixas, a concentração do analito na forma

gasosa no interior da membrana pode ser expressa através da lei de Henry e a

Equação 6.2 passa a ser expressa por

Equação 6.3

em que KH é a constante de solubilidade de Henry (definida por C/p) e p0 e pl

correspondem à pressão da espécie gasosa nas extremidades da membrana.

A partir da análise da Equação 6.2 e da Equação 6.3 verifica-se que a difusão de

espécies gasosas através da membrana será tanto maior quanto menor a espessura

da membrana, maior o gradiente de concentração entre as soluções dadora e

aceitadora e maiores forem os valores de D e KH do analito. A seletividade (αA/B) do

processo será dada por

96 FCUP


Equação 6.4

em que A e B são os analitos. Assim, a seletividade da extração será influenciada

pelas diferenças nos coeficientes de difusão e nas constantes de Henry das duas

espécies.

Em suma, a escolha da membrana para a extração por GDME deverá levar em

conta os seguintes aspetos:

o tamanho do poro pode afetar a eficiência global da extração;

a morfologia da membrana (porosa simples ou suportada) pode afetar a

seletividade da extração;

as propriedades dos compostos a separar afetam a eficiência e seletividade

do processo de extração, nomeadamente através dos coeficientes de

difusão e das constantes de Henry.

6.2. Estudo do modo de extração: módulo imerso ou em

headspace

A GDME baseou-se desde o seu início na extração de analitos de uma solução

aquosa dadora para outra aceitadora também aquosa, separadas por uma membrana

hidrofóbica que cria um espaço gasoso entre as duas fases. Como se pode verificar

pelos resultados apresentados na secção 6.1, com esta técnica de extração é possível

determinar uma vasta gama de compostos com diferentes características e

propriedades. Sendo a GDME uma técnica de extração de espécies voláteis, é

interessante avaliar qual o efeito que a imersão da membrana na solução aquosa tem

na eficiência da extração dessas espécies. Assim, efetuaram-se estudos acerca da

extração de cetonas e aldeídos de soluções aquosas, em dois modos distintos (Fig.

6.6):

A. extração com o módulo imerso na solução dadora – em que o transporte

dos analitos ocorre por difusão gasosa através da membrana;

FCUP


97

B. extração com o módulo colocado no headspace da solução – em que o

transporte dos analitos ocorre por pervaporação.

Fig. 6.6 – Esquema dos modos de extração por GDME estudados: (A) com o módulo imerso na solução dadora e (B)

com o módulo no headspace da solução dadora.

No modo de extração A (Fig. 6.6), o transporte de analitos da fase dadora para a

solução aceitadora ocorre em três passos: (1) passagem dos analitos da solução

dadora para a fase gasosa (nos poros da membrana), (2) difusão dos analitos na fase

gasosa através da membrana, e (3) passagem dos analitos para a fase aquosa da

solução aceitadora. Por seu lado, no caso em que o módulo se encontra no

headspace da solução dadora (modo de extração B na Fig. 6.6), existe um passo extra

inicial que consiste na passagem dos analitos para a fase gasosa no headspace, antes

da sua difusão através da membrana.

Para estudar a eficiência do processo de extração nestes dois modos de extração

na eficiência do processo, foram realizadas extrações de soluções aquosas de

cetonas e aldeídos utilizando as membranas SureVent, mantendo constantes a

temperatura e o tempo de extração (55 ºC e 10 min, respetivamente). A membrana

SureVent foi escolhida por se ter verificado que a seletividade da extração não se

encontra limitada pelas características da superfície da membrana, como é o caso das

membranas suportadas (discutido na secção 6.1). Além disso, verificou-se que foi

mais eficiente na extração de compostos de baixa volatilidade, tal como o metilglioxal

(Fig. 6.4).

98 FCUP


Os resultados obtidos (Fig. 6.7) mostraram que existem compostos (metilglioxal,

diacetilo, acetoína, formaldeído e furfural) cuja extração é mais eficiente quando o

módulo se encontra imerso na solução dadora (Fig. 6.6A). Para os restantes

compostos estudados a eficiência da extração foi superior para a situação em que o

módulo de GDME se encontrava em headspace (Fig. 6.8).

Fig. 6.7 – Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração é superior quando se realiza a

extração com o módulo de GDME imerso na solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão

contendo 1 mg L-1 de metilglioxal e diacetilo e 2 mg L-1 de acetoína, formaldeído e furfural, a 55 ºC durante 10 min e

utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).

Fig. 6.8 - Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração é superior quando se realiza a

extração com o módulo de GDME no headspace da solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções

padrão contendo 1 mg L-1 de pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona e 2 mg L-1 de cada um dos restantes compostos, a

55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).

De acordo com a Equação 6.2 e a Equação 6.3 referidas na secção anterior, o

transporte através da membrana está relacionado com o coeficiente de difusão da

espécie através da membrana (D), da constante de Henry (KH) e da diferença de

FCUP


99

pressão (ou concentração) entre os dois lados da membrana. Relacionando os

resultados obtidos (Fig. 6.7 e Fig. 6.8) com os valores de KH dos compostos

analisados (Tabela 6.1) verifica-se que para os compostos menos voláteis (compostos

da Fig. 6.7) a extração com o módulo imerso é mais eficiente do que com o módulo em

headspace, com exceção da pentano-2,3-diona e da hexano-2,3-diona. Estas

interpretações com base no valor de KH podem dar uma indicação acerca do

comportamento dos compostos nos dois modos de extração estudados. Estas

conclusões devem, porém, ser aplicadas de forma cautelosa devido à dependência de

KH com a temperatura, força iónica, solvente, entre outros.

Tabela 6.1 – Lista dos valores das constantes de Henry (KH) para as cetonas e aldeídos estudados por ordem

crescente de volatilidade.

KH /mol m-3 atm-1 Ref.

Diacetilo 5,08 x 106 a [222]

Pentano-2,3-diona 3,82 x 106 a [222]

Metilglioxal 3,70 x 106 a [222]

Formaldeído 2,97 x 106 b [223]

Hexano-2,3-diona 2,87 x 106 a [222]

Acetoína 9,71 x 104 a [222]

Furfural 7,46 x 104 a [222]

Benzaldeído 3,75 x 104 b [223]

trans-2-hexenal 2,04 x 104 b [224]

Acetaldeído 1,50 x 104 b [225]

2-octenal 1,36 x 104 b [224]

Propanal 1,36 x 104 b [224]

trans-2-pentenal 1,34 x 104 a [222]

Butanal 8,70 x 103 b [224]

Acroleína 8,20 x 103 b [225]

trans-2-heptenal 7,63 x 103 a [222]

Pentanal 6,80 x 103 b [224]

100 FCUP


Hexanal 4,69 x 103 b [224]

trans-2-nonenal 4,33 x 103 a [222]

Heptanal 3,70 x 103 b [224]

trans-2-decenal 3,26 x 103 a [222]

Octanal 1,95 x 103 b [224]

Nonanal 1,36 x 103 b [224]

Decanal 5,56 x 102 b [226]

a Valor estimado.

b Valor obtido experimentalmente.

Por outro lado, o transporte através da membrana depende também do coeficiente

de difusão (D) (ver Equação 6.3). Em membranas porosas com poros de dimensões

superiores a 0,05 μm assume-se que o processo de transporte através dos poros pode

ser descrito através do modelo de difusão de Knudsen3 [221]. Neste modelo a

constante de difusão da espécie A (DA) pode ser definida por4:

Equação 6.5

Assim, para o fenómeno de transporte de massa através de membranas porosas

contribuem, para além da volatilidade do analito (representada pelo valor de KH),

também o diâmetro do poro (dporo), a temperatura (T) e a massa molecular (MA) do

analito. Assim, para o mesmo tamanho de poro e temperatura constante, DA varia com

a raiz quadrada do inverso da massa molecular do analito. O parâmetro DKH da

equação (3) será o resultado dos diversos fatores acima descritos e todos eles

deverão ser considerados para prever o comportamento de cada espécie química

durante a extração.

3 A difusão de Knudsen ocorre quando o percurso médio livre das moléculas de gás é maior do que o tamanho de poro.

Neste caso, as colisões das moléculas com a parede do poro são mais frequentes do que as colisões entre moléculas

(Javaid, Chem. Eng. J. (2005), 112, 219-226).

4 kB é a constante de Boltzmann.

FCUP


101

Relativamente ao modo de extração B (Fig. 6.6), no qual o módulo de GDME se

encontra no headspace da solução dadora, será a primeira etapa da extração (a

passagem dos analitos para a fase gasosa no headspace) a condicionar de modo

mais significativo o transporte de analitos através da membrana. Se só for considerada

a volatilidade do analito, quanto menor for o valor de KH (maior volatilidade) maior será

a concentração da espécie no headspace da solução. Desta forma, o gradiente de

pressão (ou concentração) nos dois lados da membrana será maior e o transporte

dessas moléculas é favorecido. Assim se podem explicar os resultados obtidos com os

analitos mais voláteis (Fig. 6.8).

Com estes estudos conclui-se que é possível realizar a extração por GDME de

uma vasta gama de compostos com características e propriedades distintas em dois

modos de extração diferentes: por imersão do módulo na solução dadora ou com o

módulo colocado no headspace da solução. A utilização do módulo imerso na solução

é especialmente vantajosa para a extração de compostos de baixa volatilidade em

soluções aquosas.

6.3. Influência da força iónica

A adição de um sal à amostra num processo de extração é um procedimento de

reconhecida utilidade para aumentar a eficiência através do efeito de salting-out. Para

avaliar o efeito do aumento da força iónica da amostra na extração de compostos por

GDME, foram realizados ensaios com adições de diferentes quantidades de NaCl

(entre 0 e 2 mol L-1) à solução dadora. Os ensaios foram realizados com o módulo

imerso na solução dadora utilizando as membranas SureVent.

Para os compostos analisados (à exceção do metilglioxal) verificou-se um aumento

do sinal analítico com o aumento da concentração de NaCl na solução dadora, mais

significativo nos compostos mais voláteis e com baixa solubilidade em água (com

menor valor de KH). Na Fig. 6.9 estão representados os resultados obtidos para dois

compostos com valores de KH diferentes (ver Tabela 6.1). Como se verifica na Fig. 6.9,

a variação do sinal analítico com o aumento da força iónica é muito maior para o

decanal (KH = 5,56 x 102 mol m-3 atm-1) do que para o formaldeído (KH = 2,97 x 106 mol

m-3 atm-1), na gama de concentrações de NaCl estudadas.

102 FCUP


Fig. 6.9 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído e do decanal para a extração por GDME destes compostos

com diferentes concentrações de NaCl na solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão

contendo 2 mg L-1 de formaldeído e decanal, a 55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).

O metilglioxal foi o único composto para o qual não se verificou aumento da

eficiência da extração com o aumento da força iónica (resultados apresentados na Fig.

6.10).

Fig. 6.10 - Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal para a extração por GDME com diferentes concentrações de

NaCl na solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 metilglioxal, a 55 ºC

durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).

Os resultados obtidos neste estudo permitiram mostrar que a força iónica da

solução dadora em GDME tem maior influência na extração de compostos com baixa

solubilidade em água e elevada volatilidade, isto é, com valores de KH mais baixos. O

facto de não se terem observado diferenças mais significativas nos compostos com

valores de KH superiores, como por exemplo o formaldeído (Fig. 6.9), poderá estar

relacionado com a gama de concentrações de NaCl estudada. A concentração de sal

necessária para produzir um efeito mais significativo na volatilização dos analitos

FCUP


103

depende de KH e quanto maior for o valor desta constante (maior solubilidade em água

e menor volatilidade) maior será a quantidade de sal necessária para produzir um

efeito de salting-out [227]. Assim, seria provavelmente necessária uma maior

quantidade de sal na solução dadora para aumentar a eficiência da extração de

compostos como o formaldeído (Fig. 6.9) e o metilglioxal (Fig. 6.10).

6.4. Influência da temperatura de extração

A influência da temperatura na extração por GDME foi estudada em soluções

aquosas de compostos dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e

hexano-2,3-diona) entre 25 e 65 ºC, durante 10 min. Não foram testadas temperaturas

superiores para evitar perdas de solução aceitadora por evaporação. Os resultados

obtidos (Fig. 6.11) mostram que o aumento de temperatura aumenta a extração dos

compostos para a solução aceitadora. Verificou-se que o aumento do sinal analítico

variou de forma quase linear com a temperatura para o diacetilo, a pentano-2,3-diona

e a hexano-2,3-diona. Por seu lado, o comportamento do metilglioxal seguiu uma

tendência exponencial com a temperatura. Ou seja, o efeito da temperatura na

extração não foi a mesma para todos os compostos testados.

Fig. 6.11 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona realizando

a extração por GDME a temperaturas diferentes (entre 25 e 65 ºC). As extrações foram realizadas com soluções

padrão contendo 1 mg L-1 de cada analito, durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1)

Como discutido nas secções anteriores, o transporte de massa em GDME depende

do coeficiente de difusão (D) da espécie química e do seu KH. Por sua vez estas duas

variáveis dependem da temperatura, e por isso o efeito que este parâmetro terá na

104 FCUP


eficiência da extração depende do analito. Assim, a temperatura será um importante

parâmetro a estudar quando se pretende desenvolver um novo processo de extração.

A otimização da temperatura deverá ter em conta, sobretudo, a sensibilidade desejada

para os analitos.

6.5. Influência do tempo de extração

A influência do tempo da extração por GDME foi avaliada na extração de soluções

aquosas de compostos dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e

hexano-2,3-diona) a 55 ºC. Pela análise dos resultados (Fig. 6.12) verifica-se um

aumento do sinal analítico de todos os compostos analisados com o aumento do

tempo de extração.

Fig. 6.12 – Variação das áreas dos picos cromatográficos dos compostos dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo,

pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona) com o tempo de extração. As extrações foram realizadas com soluções padrão

contendo 1 mg L-1 de cada analito, a 55 ºC e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).

A criação de um modelo para interpretar os mecanismos de transferência de

massa em GDME é bastante complexa devido à existência de diversas variáveis que

influenciam o transporte dos analitos da solução dadora (amostra) para a fase

aceitadora. Para a extração por SPME já existem modelos matemáticos simplificados

para descrever a cinética da extração [228]. O mesmo tipo de tratamento matemático

foi igualmente desenvolvido para a extração por HF-LPME [229]. Nesses casos, a

interpretação teórica da extração baseia-se nos seguintes pressupostos:

existência de duas interfaces: amostra/membrana e membrana/solução

aceitadora;

FCUP


105

consideram que no interior da membrana não existe gradiente de

concentração, admitindo que na fase gasosa os coeficientes de difusão são

muito superiores aos coeficientes de difusão na fase líquida;

consideram que no estado estacionário, o fluxo de massa na interface

amostra/membrana é igual ao da interface membrana/solução aceitadora.

Nestas condições o processo de extração pode ser descrito por5:

Equação 6.6

em que: n é a quantidade de analito extraída; A é a área da interface; maceit é o

coeficiente de transferência de massa do analito na solução aceitadora; k é a

constante da velocidade de evaporação; VAM, Vm e Vaceit são os volumes da amostra,

dos poros da membrana e da solução aceitadora, respetivamente; K1 e K2 são os

coeficientes de equilíbrio de partição nas interfaces amostra/membrana e membrana

/solução aceitadora, respetivamente; t é o tempo; e C0 é a concentração inicial do

analito na amostra.

Assim, atendendo à Equação 6.6, conclui-se que a quantidade de analito extraída

(n) varia de forma assintótica com o tempo de extração (t) e que, para tempos de

extração constantes, a quantidade extraída varia linearmente com a concentração de

analito na amostra (C0). É, aliás, esta dependência linear de n com C0 que possibilita a

aplicação destas técnicas de extração em metodologias de quantificação.

Transpondo estas previsões teóricas para os resultados apresentados na Fig. 6.12

verifica-se que o sinal analítico do diacetilo, da pentano-2,3-diona e da hexano-2,3-

diona varia de forma assintótica com o tempo de extração de acordo com o previsto

pela Equação 6.6. Porém, para o metilglioxal, a quantidade extraída ao longo do

tempo varia de forma linear para tempos superiores a 20 min (r2 = 0,996). Para este

composto, atendendo à elevada solubilidade em água e à sua baixa volatilidade, a

velocidade de passagem ao estado gasoso é pequena; assim, para os tempos de

5 Adaptação da equação que descreve o processo de extração por SPME em headspace (J. Ai, Anal. Chem. 69 (1997)

3260-3266).

106 FCUP


extração estudados, verifica-se que n varia linearmente com t, de acordo com a

seguinte equação [228]:

Equação 6.7

Os estudos descritos nas secções seguintes para avaliar as influências da agitação

da solução dadora, da presença do derivatizante na solução aceitadora e a agitação

dessa solução estão de acordo com esta interpretação teórica.

6.6. Influência da agitação da solução dadora

A agitação da solução dadora tem como principal função o aumento da difusão dos

analitos do seio desta solução para a superfície da membrana permitindo aumentar a

eficiência da extração. A influência da agitação foi estudada em soluções aquosas de

compostos dicarbonílicos a 25 ºC variando o tempo de extração entre 10 e 240 min.

Ao contrário dos ensaios descritos nas secções anteriores que foram realizados a 55

ºC, neste estudo decidiu-se realizar as extrações a temperaturas mais baixas para

garantir que a passagem dos analitos para a fase gasosa fosse o passo limitante do

processo de extração e, assim, conseguir verificar se a presença da agitação

influenciava a eficiência da extração. O metilglioxal não foi utilizado neste estudo dado

que, nestas condições experimentais, não foi possível detetar o seu sinal analítico. Os

resultados obtidos para os compostos estudados (diacetilo, pentano-2,3-diona e

hexano-2,3-diona) foram todos no mesmo sentido e, por isso, só serão apresentados

os resultados obtidos para o diacetilo.

Os resultados obtidos no estudo da agitação da solução dadora são apresentados

na Fig. 6.13. Observa-se que com e sem agitação o sinal analítico varia linearmente

com o tempo de extração. Esta relação é distinta da observada nos resultados

representados na Fig. 6.12 (em que o comportamento era assintótico). No entanto,

neste caso a temperatura de extração utilizada neste estudo, 25 ºC, foi inferior à do

estudo anterior, 55 ºC, e, por isso, o processo de extração está a ser controlado pela

passagem do analito para a fase gasosa. Neste caso, será a Equação 6.7 que

representará o processo de extração nas condições estudadas.

FCUP


107

Fig. 6.13 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com e sem agitação da solução

aceitadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as

membranas Mitex (Tabela 5.1).

O aumento da eficiência da extração do diacetilo quando a solução dadora se

encontrava em agitação (Fig. 6.13) foi significativo para os tempos de extração mais

longos (acima dos 60 min). Conclui-se, assim, que no caso em que a passagem dos

analitos para a fase gasosa é o passo limitante do processo, a agitação da solução

dadora só tem maior efeito no aumento da eficiência da extração para tempos de

extração longos.

6.7. Influência do derivatizante na solução aceitadora

De forma a estudar a influência da presença do derivatizante na solução aceitadora

na quantidade de analito extraída e na velocidade da extração, efetuaram-se ensaios

em que a solução aceitadora continha o derivatizante (como nos ensaios

anteriormente descritos) e ensaios em que os analitos eram inicialmente recolhidos em

água e, só após essa recolha, eram derivatizados. Os resultados obtidos para

extrações de diacetilo são apresentados na Fig. 6.14.

A presença do derivatizante na solução aceitadora permite aumentar o gradiente

de concentração do analito entre as duas superfícies da membrana. Isto é, como o

analito que vai chegando à solução aceitadora vai sendo convertido no

correspondente derivado, vai-se mantendo a diferença de concentração de analito nas

108 FCUP


Fig. 6.14 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com agitação da solução dadora,

a presença e ausência de derivatizante na solução aceitadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão

contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1).

duas faces da membrana, permitindo aumentar a velocidade com que a extração

decorre (como representado na Fig. 3.9). Pelo contrário, quando o derivatizante não

está presente na solução aceitadora, a velocidade de extração vai depender da

velocidade com que o analito se difunde nessa solução. Ou seja, esta etapa passa a

ser o passo limitante do processo e por isso a dependência da quantidade extraída

com o tempo é assintótica de acordo com a Equação 6.8 [228].

Equação 6.8

6.8. Influência da agitação da solução aceitadora

O efeito da agitação da solução aceitadora foi estudado na ausência e na presença

do reagente derivatizante. Quando a extração foi realizada sem derivatizante, a

agitação da solução aceitadora permitiu aumentar a eficiência da extração (Fig. 6.15)

dado que a agitação aumenta a difusão das espécies na solução aceitadora. A

dependência da quantidade extraída com o tempo foi, porém, a mesma verificada nos

resultados apresentados na Fig. 6.14 (extração sem derivatizante) mas em que os

níveis de analito extraído são superiores para cada tempo de extração estudado,

relativamente ao processo de extração sem agitação da solução aceitadora.

FCUP


109

Fig. 6.15 - Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com e sem agitação da solução

aceitadora (não contendo o reagente derivatizante). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1

mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1).

Quando a extração foi realizada com o derivatizante contido na solução aceitadora,

a agitação desta solução não provocou variações significativas na quantidade de

analito extraída (Fig. 6.16). Estes resultados confirmam o efeito preponderante que a

presença do derivatizante na solução aceitadora tem na eficiência da extração.

Fig. 6.16 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com e sem agitação da solução

aceitadora (contendo o reagente derivatizante). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1

de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1).

FCUP

111

7. Determinação de aminas biogénicas

alifáticas

Neste capítulo descreve-se o desenvolvimento de uma metodologia por HPLC-UV

para a determinação de aminas biogénicas alifáticas (metilamina, dimetilamina e

etilamina) presentes em bebidas. O procedimento de extração baseia-se na GDME

utilizando uma membrana hidrofóbica de PTFE e recolha dos analitos voláteis numa

solução aceitadora aquosa. Os analitos são posteriormente derivatizados com uma

solução de PITC e depois é feita a análise por HPLC-UV. A metodologia foi otimizada

e aplicada à determinação das três aminas em vinhos e cervejas.

7.1. Otimização dos parâmetros da extração

Os procedimentos desenvolvidos descritos nos capítulos anteriores que recorrem à

GDME foram realizados incluindo a derivatização dos analitos durante a extração [104,

105, 230]. No entanto, no caso das aminas tal não foi possível. Para que a reação

ocorra num período de tempo aceitável (10-20 min) é necessário que a concentração

de PITC seja superior a 0,5%. Sendo este reagente muito pouco solúvel em água, tem

que ser preparado num solvente orgânico, como por exemplo o acetonitrilo. Porém, a

utilização de acetonitrilo como solvente da solução derivatizante inviabiliza o seu uso

em conjunto com as membranas Mitex (Tabela 5.1) no GDME dado que o solvente

atravessa a membrana durante a extração. Assim, optou-se por realizar os

procedimentos de extração e de derivatização em separado.

Para a extração das aminas o controlo do pH tanto da amostra como da solução

aceitadora é um fator chave. Relativamente à extração, dado que esta é baseada na

volatilidade dos compostos, o pH da amostra deverá ser bastante superior ao valor de

pKa dos analitos para que estes estejam na sua forma não ionizada e, portanto, na sua

forma volátil. A adição de NaOH à amostra foi suficiente para aumentar o pH de forma

a extrair as aminas de amostras como o vinho e cerveja (Fig. 7.1).

112 FCUP

Determinação de aminas biogénicas alifáticas

Fig. 7.1 – Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando diferentes concentrações de

NaOH na solução dadora. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, a 40

ºC, durante 10 min.

Na solução aceitadora as condições do meio serão as opostas às necessárias na

solução dadora. Ou seja, as aminas alifáticas são extraídas da amostra, passam

através dos poros da membrana e são recolhidas numa solução aceitadora com

características ligeiramente ácidas (NaH2PO4 10 mmol L-1) para que a ionização dos

grupos amina ocorra e os analitos fiquem “retidos“ nessa solução. Pode-se considerar,

assim, que a utilização de uma solução com a capacidade de atuar desta forma nos

grupos funcionais dos analitos exerce um efeito semelhante ao uso de um

derivatizante na solução aceitadora.

Após extrair os compostos é necessário proceder à derivatização dos analitos para

a deteção por UV em HPLC. A reação das aminas com o PITC é favorecida a pH

alcalino obrigando à alteração do pH do extrato obtido no GDME. Foram testados

alguns pares ácido-base conjugados utilizados como solução tampão de forma a

selecionar as melhores condições para o procedimento. O uso de NaOH ou de sais de

carbonato propostos por Sahasrabuddhey et al. [173] foi excluído dado que as

soluções resultantes eram muito instáveis ao contrário dos sais de fosfato que

resultaram na melhor opção. Assim, ao extrato obtido em NaH2PO4 (10 mmol L-1) foi

adicionado Na3PO4 (0,1 mol L-1) de forma a obter um pH alcalino favorável à reação

das aminas com o PITC. No final do tempo definido para a reação de derivatização, a

reação pode ser parada através de uma nova alteração de pH para valores abaixo do

pKa das aminas.

FCUP


113

Para além do pH, a temperatura e o tempo de extração são parâmetros

experimentais importantes e têm um impacto direto na extração dos compostos. Os

resultados obtidos (Fig. 7.2) mostram que tempos mais longos e temperaturas mais

altas permitem uma maior eficiência de extração. A temperatura de extração foi

estudada no intervalo 25 a 60 ºC (utilizando um tempo de extração de 10 min) e os

resultados mostram que é possível extrair as aminas, mesmo à temperatura ambiente,

ou seja, a volatilização dos compostos é possível através de uma simples alteração do

pH da amostra. No entanto verificou-se que a repetibilidade da extração é superior

para temperaturas mais altas. Assim, foi selecionada a temperatura de 40 ºC para os

ensaios subsequentes porque permitiu uma boa sensibilidade e não é uma

temperatura suficientemente elevada para ocorrer a perda por evaporação dos

analitos na solução aceitadora.

Fig. 7.2 - Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando diferentes temperaturas de

extração. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, durante 15 min.

No caso do tempo de extração (testado entre 2 e 20 min) verificou-se que mesmo

utilizando intervalos de tempo curtos (2 minutos) é possível determinar as aminas (Fig.

7.3). Assim como foi concluído a partir dos ensaios da influência da temperatura,

também no caso do tempo de extração se verifica que o pH da amostra é o principal

fator a contribuir para a extração dado que os analitos são muito voláteis. Não

obstante, a escolha de tempos de extração superiores será recomendável de forma a

aumentar a repetibilidade da metodologia.

114 FCUP


Fig. 7.3 - Representação gráfica das áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando

diferentes tempos de extração. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito,

a 40 ºC.

A agitação da solução dadora desempenha nesta situação dois efeitos positivos.

Por um lado, permite aumentar a difusão dos analitos para a solução aceitadora e, por

outro lado, garante a homogeneização da solução após a adição de NaOH para

aumento do pH da amostra. Neste caso particular, a agitação da solução aceitadora foi

também utilizada dado que se verifica que a quantidade de aminas extraídas é

superior quando se utiliza agitação, e a repetibilidade é também melhorada. Este efeito

estará relacionado com o aumento da difusão das espécies na solução aceitadora,

que aumenta a eficiência da extração.

Em suma, a temperatura e o tempo de extração devem ser otimizados de forma a

obter uma melhor repetibilidade. Temperaturas ligeiramente acima da temperatura

ambiente e tempos de extração superiores a 10 min são recomendáveis. A amostra

(solução dadora) deverá ser ajustada a valores de pH acima do pKa das aminas e a

solução aceitadora deverá ser ligeiramente ácida para permitir a “retenção” dos

analitos.

7.2. Validação da metodologia

As curvas de calibração para as aminas estudadas (entre 80 e 500 µg L-1 para

metilamina e dimetilamina e entre 80 µg L-1 e 5 mg L-1 para etilamina) foram

comparadas com as curvas de adição de padrão destes compostos às amostras. Na

Fig. 7.4 encontram-se representados os cromatogramas da adição de soluções padrão

das aminas a uma amostra. Por aplicação do teste t-Student (com 99% de intervalo de

FCUP


115

confiança) aos declives das curvas verificou-se que existiam diferenças

estatisticamente significativas entre eles e, portanto, a quantificação dos analitos nas

amostras foi realizada pelo método das adições de padrão.

Fig. 7.4 – Cromatograma obtido para um extrato de uma amostra de cerveja preta de acordo com as condições

referidas na secção 5.3.2.

O desempenho da metodologia foi avaliado usando amostras de vinho branco

fortificadas com adições de metilamina, dimetilamina e etilamina (n = 5). Os limites de

deteção e de quantificação foram calculados a partir de 3 e 10 vezes o desvio-padrão

da regressão linear [231]. A precisão intra-dia (repetibilidade) foi avaliada pela análise

de 5 réplicas da amostra no mesmo dia (Tabela 7.1).

Tabela 7.1 – Limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ), e repetibilidade da metodologia desenvolvida para a

quantificação de aminas alifáticas por GDME.

Amina LD (µg L-1) LQ (µg L-1) Repetibilidade

Metilamina 12 39 8%

Dimetilamina 34 112 4%

Etilamina 46 153 5%

116 FCUP


7.3. Quantificação das aminas em vinho e cerveja

A aplicabilidade da metodologia foi testada através da determinação de metilamina,

dimetilamina e etilamina em seis amostras de vinhos e três amostras de cerveja.

Algumas características das amostras analisadas encontram-se na Tabela 5.3.

Um tratamento preliminar às amostras só foi necessário para as cervejas e

consistiu na desgaseificação por ultrassons durante 5 min. Todas as extrações foram

executadas de acordo com o procedimento descrito na secção 5.3.2. Os resultados da

quantificação das aminas encontram-se na Tabela 7.2. Nas amostras analisadas

foram determinados níveis variáveis das aminas alifáticas em estudo. Nos vinhos a

etilamina estava presente em maior quantidade enquanto que nas cervejas era a

dimetilamina a mais abundante.

Tabela 7.2 – Valores de concentração obtidos para as aminas biogénicas alifáticas por GDME nas amostras de vinho e

cerveja descritas na Tabela 5.3.

Sample

Concentração (desvio padrão) /mg L-1

Metilamina Dimetilamina Etilamina

Vinho branco 1 0,232 (0,002) < LQ 2,09 (0,01)

Vinho branco 2 0,242 (0,003) 0,117 (0,006) 0,87 (0,03)

Vinho branco 3 0,026 (0,007) < LQ 0,67 (0,09)

Vinho tinto 1 0,202 (0,005) 0,093 (0,003) 3,70 (0,08)

Vinho tinto 2 0,087 (0,009) < LQ 2,08 (0,05)

Vinho rosé 0,098 (0,001) 0,133 (0,003) 0,144 (0,002)

Cerveja preta 0,350 (0,001) 0,420 (0,005) 0,317 (0,004)

Cerveja Pilsner 0,140 (0,005) 0,491 (0,003) 0,127 (0,006)

Cerveja sem álcool 0,252 (0,006) 0,677 (0,003) 0,133 (0,002)

FCUP

117

8. Determinação de acetaldeído livre e total

em vinhos

Nos vinhos, a presença de acetaldeído em níveis elevados é responsável não só

por odores e sabores indesejáveis mas também pode provocar diversos efeitos

adversos à saúde humana. A atividade sensorial do acetaldeído pode ser reduzida por

adição de sulfitos durante a produção do vinho devido à formação de adutos entre o

acetaldeído e os sulfitos. No entanto, o acetaldeído ligado pode ser libertado durante o

período de armazenamento sendo, por isso, importante conhecer o seu teor total de

forma a prever a evolução da qualidade do vinho a longo prazo.

A metodologia desenvolvida baseia-se na extração do acetaldeído do vinho

utilizando a GDME e na análise dos extratos por HPLC-UV. A quantidade de

acetaldeído ligado aos sulfitos foi determinada realizando um passo de hidrólise

alcalina antes da extração de forma a dissociar os adutos. A metodologia foi aplicada à

análise de diferentes amostras de vinho. Para além do acetaldeído, foram identificados

outros aldeídos nos extratos por HPLC-MS/MS.

8.1. Otimização das condições de extração

Os resultados obtidos para o estudo da influência do tempo e da temperatura na

extração do acetaldeído encontram-se na Fig. 8.1.

Fig. 8.1 – Variação da área do pico cromatográfico do acetaldeído com (A) o tempo (a uma temperatura de 50 ºC) e (B)

a temperatura de extração (durante 15 min). As extrações foram realizadas utilizando uma amostra de vinho tinto.

A quantidade de acetaldeído extraída aumenta linearmente com o aumento do

tempo de extração e exponencialmente com o aumento de temperatura. Resultados

semelhantes já tinham sido obtidos num trabalho anterior para a extração de

118 FCUP

Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos

acetaldeído de amostras de cerveja [219]. Para os estudos seguintes foi utilizado um

tempo de extração de 15 minutos e uma temperatura de 50 ºC. 15 min é um tempo

não muito excessivo e fornece uma boa sensibilidade, e 50 ºC é uma temperatura

relativamente alta para não sofrer alterações com a variação da temperatura ambiente,

não dando lugar a fenómenos de evaporação significativos.

8.2. Estudo da influência do SO2 e do etanol

A formação de adutos entre o HSO3- e compostos carbonílicos é uma reação

reversível e depende do pH da amostra. Como referido anteriormente, ao pH do vinho

o sulfito está na forma de HSO3- e formam adutos com diversas espécies, incluindo o

acetaldeído. No entanto, quando o valor de pH é inferior a 1 (pKa1 = 1,85) ou superior a

8 (pKa2 = 7,2) [232] o sulfito passa a estar presente maioritariamente nas formas SO2 e

SO32-, respetivamente. Nestas condições as ligações dos adutos tendem a quebrar e

as espécies passam a estar preferencialmente na sua forma livre (ver secção 3.1.2).

Por esta razão é possível determinar o teor total de acetaldeído ligado aos sulfitos

realizando uma hidrólise [159, 160]. Apesar de a pH 10 apenas uma pequena

percentagem de HSO3- estar presente, recomenda-se o uso de valores de pH

superiores a 10 para garantir a dissociação total dos adutos [106].

Equação 8.1

Equação 8.2

A influência do SO2 na extração do acetaldeído foi estudada pela adição de

quantidades conhecidas de Na2SO3 (como fonte de SO2) a uma amostra de vinho

antes da extração. Nestes ensaios as extrações foram realizadas a 50 º C durante 15

min. Verificou-se que a adição de SO2 ao vinho provoca a diminuição de acetaldeído

extraído (Fig. 8.2) confirmando que ocorre a formação de adutos entre os dois

compostos.

FCUP


119

Fig. 8.2 – Variação do sinal analítico do acetaldeído com a concentração de SO2 para o estudo do efeito da

concentração de SO2 no teor de acetaldeído extraído. As extrações foram realizadas sobre uma amostra de vinho tinto,

a 50 ºC durante 15 min.

Assim, realizando a extração a um valor de pH típico dos vinhos (entre 3 e 4) só

será possível extrair o acetaldeído que não se encontra ligado ao SO2, isto é, o

acetaldeído livre. Ajustando o pH da amostra a um valor superior (pH 12.5) foi possível

quebrar esses adutos e consequentemente a quantidade de acetaldeído extraída

aumentou, correspondendo ao acetaldeído total (Fig. 8.2). De notar que se verifica que

a quantidade de acetaldeído extraída a pH 12.5 para as diferentes adições de SO2 se

mantem constante, ou seja, é independente da concentração de SO2 adicionada.

Estes resultados demonstram a importância do SO2 na “disponibilidade” do

acetaldeído nos vinhos e a forma como a extração deste aldeído é afetada pela sua

presença. Além disso, confirmam que a alcalinização do vinho permite a quantificação

do acetaldeído total ligado aos sulfitos nas amostras, já que nessas condições ocorre

a dissociação dos adutos.

A influência do etanol na extração também foi avaliada. Na extração de soluções

padrão de acetaldeído (20 mg L-1) verificou-se uma diminuição de 1,5 vezes no sinal

analítico do acetaldeído para um teor de etanol de 15% (v/v). Foram realizados

ensaios idênticos numa amostra de vinho, no entanto a diminuição do sinal não foi tão

significativa como no caso da solução padrão. Na amostra de vinho a diminuição

máxima de acetaldeído extraído (1,3 vezes) verificou-se para incrementos de 25 %

(v/v) de etanol (resultando em cerca de 36,5% de teor total de etanol no vinho). Estes

ensaios mostram que o etanol dificulta a extração do acetaldeído e que esse efeito é

mais significativo em soluções padrão. O efeito de diminuição menos pronunciado nos

120 FCUP


vinhos poderá estar relacionado com a composição da matriz que pode atenuar este

efeito.


Foram construídas duas curvas de calibração para o acetaldeído, uma utilizando

soluções padrão do analito preparadas em água contendo 12% (v/v) de etanol, e outra

com soluções padrão de acetaldeído preparadas em solução tampão fosfato (0,1 mol

L-1, pH 12,5) contendo 12% (v/v) de etanol. Não se verificaram diferenças

estatisticamente significativas (teste t-Student com intervalo de confiança de 99%)

entre os declives das duas curvas de calibração concluindo-se que o processo de

extração não é afetado pela alteração de pH da amostra.

Foram realizadas adições de padrão a amostras de vinho e amostras de vinho

alcalinizadas e verificou-se, por aplicação do teste t-Student (com 99% de intervalo de

confiança), que existiam diferenças estatisticamente significativas entre os declives

das curvas de adição de padrão e os declives das curvas de calibração. Além disso,

ao contrário do verificado para as soluções padrão, nas amostras a alteração do pH

influenciou o processo de extração. Por estas razões a determinação do acetaldeído

livre e total nas amostras foi realizada pelo método da adição de padrão. As adições

de acetaldeído foram feitas no intervalo de concentração 10 a 250 mg L-1, dependendo

da concentração do aldeído na amostra. As figuras de mérito foram avaliadas

utilizando uma amostra de vinho branco. Os limites de deteção (LD) e de quantificação

(LQ) foram obtidos a partir de 3 e 10 vezes o desvio-padrão da regressão linear,

respetivamente [231]. Para a determinação do acetaldeído livre os valores de LD e LQ

foram 1,1 mg L-1 e 3,5 mg L-1, respetivamente; para a determinação do acetaldeído

total foram 0,8 mg L-1 e 2,5 mg L-1. A repetibilidade foi avaliada pela análise de extratos

de cinco réplicas de uma amostra, realizados no mesmo dia. A reprodutibilidade foi

calculada a partir dos resultados obtidos de três réplicas em quatro dias diferentes. Os

resultados obtidos para a repetibilidade e a reprodutibilidade foram 4,4% e 4,9%,

respetivamente.

8.4. Quantificação do acetaldeído em vinhos

A metodologia desenvolvida foi aplicada à quantificação do acetaldeído livre e total

em oito amostras de vinho descritas na Tabela 5.4. Os resultados (Fig. 8.3) para o

acetaldeído livre variaram entre 5,04 e 25,9 mg L-1 e para o total entre 154,1 e 906,1

FCUP


121

mg L-1. Nos vinhos tintos analisados a quantidade de acetaldeído livre foi praticamente

idêntica entre amostras (concentração média de 13 ± 2 mg L-1) mas nos vinhos

brancos a sua concentração é muito variável. A quantidade de acetaldeído total é em

geral superior nos vinhos brancos assim como o teor de acetaldeído ligado (cerca de

98%). Estes resultados podem ser explicados pelos maiores níveis de SO2

encontrados nos vinhos brancos. No entanto, para todos os vinhos verifica-se que

mais de 90% do acetaldeído presente se encontra na forma ligada.

Fig. 8.3 – Concentração de acetaldeído livre e total (barras) e da percentagem de acetaldeído ligado (pontos) obtidas

nas amostras de vinho descritas na Tabela 5.4. As extrações foram realizadas de acordo com o procedimento descrito

na secção 5.3.3.

8.5. Identificação por HPLC–DAD–MS/MS dos compostos

extraídos

Para além do acetaldeído, verificou-se que foi possível extrair outros compostos

carbonílicos das amostras de vinho. A identificação desses compostos foi realizada

através de análises por HPLC-MS/MS de extratos de amostras de vinho, comparando

os espetros de massa obtidos com os de soluções padrão e com a informação

recolhida na literatura [233-235]. Um cromatograma típico de um extrato de vinho tinto

encontra-se na Fig. 8.4 e a lista dos compostos identificados em amostras de vinho e

os seus principais fragmentos encontram-se na Tabela 8.1.

122 FCUP


Fig. 8.4 - Cromatograma de um extrato de uma amostra de vinho utilizando as condições descritas na secção 5.3.3; os

picos numerados representam os compostos identificados e que se encontram listados na Tabela 8.1.

Tabela 8.1 – Compostos identificados por HPLC-DAD-MS/MS em extratos de amostras de vinho.

Pico Compostoa tR /min λmáx/nm [M-H]- Fragmentos típicos (intensidade)

1 Acetoínab (isómero Z) 10,4 364 267 152 (100), 179 (72), 177 (62), 120 (13), 153 (10)

2 Formaldeído 11,8 355 209 163 (100), 151 (72), 120 (57), 179 (57), 123 (20)

3 Acetoína (isómero E) 12,9 370 267 152 (100), 179 (75), 177 (28), 122 (20), 151 (15)

4 Acetaldeído 14,3 364 223 163 (100), 179 (92), 151 (63), 152 (39), 120 (37),

163 (27), 151 (27)

5 Furfural 17,7 394 275 228 (100), 163 (44), 179 (43), 151 (16), 120 (15),

111 (14)

6 Propanal 19,0 364 237 163 (100), 179 (69), 151 (41), 152 (34), 191 (30),

192 (24), 120 (22), 207 (14), 153 (12)

7 Acroleínac 20,6 376 433 235 (100), 223 (62), 179 (47), 167 (10)

8 Butanal 23,1 360 251 163 (100), 221 (91), 152 (68), 179 (52), 151 (50),

120 (35), 153 (31), 205 (24), 176 (19), 191 (11)

9 iso-butanal 24,0 363 251 163 (100), 179 (66), 205 (34), 152 (27), 151 (27),

120 (24), 153 (24), 221 (18)

a Compostos identificados como derivados de DNPH.

b 3-Hidroxi-2-butanona

c Propen-2-al

Nos extratos analisados foram identificados sete aldeídos e uma cetona. Todos

estes compostos são derivados de DNPH com fragmentos característicos deste tipo

FCUP


123

de compostos (m/z 120 e 179). Foram também encontrados alguns outros fragmentos

típicos (m/z 152 e 122) resultantes de múltiplas fragmentações MS/MS dos

compostos, tal como [M-H]-→[M-H-30]-→m/z 152→m/z 122 [233].

Os aldeídos e as cetonas podem ser distinguidos pela presença de um fragmento

intenso com m/z 163 nos derivados de aldeídos e que é residual nos derivados de

cetonas. Nestes últimos compostos, o fragmento com m/z 179 é mais intenso do que o

de m/z 163. O derivado do furfural é caracterizado por dois iões resultantes de

fragmentação: [M-H-47]- (m/z 228) e [M-H-164]- (m/z 111). Verificou-se também que o

máximo de absorção na região UV é superior aos valores observados nos aldeídos

acíclicos.

A acroleína (propen-2-al) foi o único aldeído insaturado detetado no vinho. O

fragmento mais intenso, com m/z 433, corresponde a uma molécula de acroleína que

reagiu com duas moléculas de DNPH [234]. O fragmento mais representativo deste ião

é o m/z 235, que corresponde à perda de uma molécula de DNPH.

A distinção entre o butanal e o iso-butanal não é simples dado que a semelhança

das suas estruturas químicas resulta numa fraca separação cromatográfica e o

máximo de absorção no UV é praticamente o mesmo. Para além disso, os seus

espetros de massa são idênticos e os padrões de fragmentação também. As tentativas

de identificação utilizando soluções padrão podem ser infrutíferas dado que, em

muitos casos, ambos os compostos estão presentes nos padrões. No entanto existe

uma pequena diferença nos padrões de fragmentação dos dois aldeídos. A

fragmentação do ião com m/z 251 nos aldeídos não ramificados origina um ião

característico de m/z 191 com cerca de 10% de abundância (relativamente a m/z 163),

e que não é visível nos aldeídos ramificados [233]. Assim, os compostos com tempo

de retenção 23,1 e 24 minutos foram identificados como butanal-DNPH e iso-butanal-

DNPH, respetivamente.

A única cetona identificada, a acetoína, originou dois picos cromatográficos,

atribuídos aos isómeros Z e E do composto acetoína-DNPH. Este tipo de resultado é

comum em derivados de DNPH e caracteriza-se pela observação de ligeiras

diferenças nos máximos de absorção no UV e que permitem a distinção isomérica

[235].

FCUP

125

9. Determinação de compostos α-

dicarbonílicos em amostras alimentares

9.1. Otimização das condições de extração

Nos resultados apresentados e discutidos na secção 6.2 verificou-se que a

extração de compostos com elevada solubilidade em água e baixa volatilidade, como é

o caso do metilglioxal, era favorecida quando o módulo de GDME se encontrava

imerso na solução dadora. O sinal analítico do metilglioxal aumentou cerca de 4 vezes

quando o módulo de GDME se encontra imerso em solução (Fig. 6.7), quando

comparado com a situação em que o módulo foi colocado no headspace da solução

dadora. Por isso, realizaram-se os ensaios seguintes com o módulo imerso na

amostra.

A partir do estudo da natureza e características da membrana descrito na secção

6.1 verificou-se que a eficiência da extração foi superior para as membranas SureVent

(Fig. 6.4). A comparação dos sinais analíticos do metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-

diona obtidos por extração com as membranas Mitex e com as membranas SureVent

encontra-se na Fig. 9.1. Neste estudo utilizou-se uma solução padrão contendo 1 mg

L-1 dos três analitos e realizou-se a extração a 55 ºC durante 10 min. Para os três

compostos analisados verificou-se um aumento na eficiência da extração com a

membrana SureVent, sendo a maior diferença obtida para o metilglioxal, para o qual

se registou um aumento de 2,5 vezes. Por esta razão, os ensaios seguintes foram

realizados com a membrana SureVent.

Fig. 9.1 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidos a partir da extração de

uma solução padrão (contendo 1 mg L-1 de cada analito) utilizando as membranas de SureVent e Mitex; as extrações

foram realizadas em triplicado a 55 ºC durante 10 min.

126 FCUP

Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares

Os resultados obtidos no estudo da temperatura e tempo de extração são

apresentados na Fig. 6.11 e na Fig. 6.12, respetivamente. Verificou-se que os sinais

analíticos aumentaram com o aumento da temperatura e do tempo de extração. No

entanto, de forma a obter o melhor compromisso entre a sensibilidade e o tempo de

extração optou-se por realizar o procedimento a 55 ºC durante 10 min.


A quantificação dos compostos α-dicarbonílicos nas amostras foi realizada pelo

método das adições de padrão, dado que se verificaram diferenças estatisticamente

significativas entre os declives das curvas de calibração e das curvas da adição de

padrão (teste t-Student com 99% de intervalo de confiança). Foram feitas adições de

soluções padrão contendo os compostos α-dicarbonílicos em quatro níveis de

concentração (ensaios realizados em triplicado). As adições foram feitas nas seguintes

gamas de concentração, dependendo da concentração dos analitos nas amostras:

metilglioxal entre 0,2 e 4 mg L-1; diacetilo entre 0,1 e 4 mg L-1 e pentano-2,3-diona

entre 0,05 e 0,8 mg L-1.

A linearidade foi avaliada pela análise de extratos obtidos a partir de solução

padrão dos compostos α-dicarbonílicos nas gamas de concentrações habitualmente

encontradas nas amostras. Os coeficientes de determinação (r2) obtidos foram todos

superiores a 0,994. A repetibilidade (precisão intra-dia) foi obtida a partir da análise de

três réplicas de extratos de uma amostra de vinho do Porto Tawny no mesmo dia. A

reprodutibilidade (precisão inter-dia) foi avaliada pela análise de três réplicas da

mesma amostra em três dias diferentes. Os valores obtidos para a precisão intra-dia

foram de 4,1%, 3,5% e 4,5% para o metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona,

respetivamente. A precisão inter-dia foi de 6%, 8% e 9% para o metilglioxal, diacetilo e

pentano-2,3-diona, respetivamente.

9.3. Quantificação dos compostos α-dicarbonílicos nas

amostras

A metodologia desenvolvida foi aplicada à quantificação de metilglioxal, diacetilo e

pentano-2,3-diona em amostras de vinho do Porto, molho de soja e chá preto. Os

resultados obtidos são apresentados na Fig. 9.2. O metilglioxal foi determinado nas

amostras em concentrações entre 0,24 e 1,7 mg L-1. A concentração mais alta foi

obtida para uma das amostras de vinho do Porto Tawny. Esta amostra foi aquela em

FCUP

Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares

127

que os níveis de diacetilo e pentano-2,3-diona foram mais baixos (0,6 ± 0,1 mg L-1 e

0,06 ± 0,01 mg L-1, respetivamente) de entre as amostras de vinho do Porto

analisadas. Na amostra de molho de soja o metilglioxal foi o composto α-dicarbonílico

presente em maior quantidade (0,6 ± 0,1 mg L-1) seguido do diacetilo (0,10 ± 0,02 mg

L-1) e da pentano-2,3-diona (0,023 ± 0,008 mg L-1). Na amostra de chá preto só foi

determinado o metilglioxal (0,25 ± 0,02 mg L-1).

Fig. 9.2 – Concentrações de metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidas nas amostras analisadas e descritas na

secção 5.3.4.

FCUP

129

10. Conclusões

A técnica de extração GDME, estudada neste capítulo, é uma técnica de aplicação

simples que permite a extração de compostos voláteis de matrizes complexas. O

reduzido tamanho das membranas utilizadas e a facilidade com que estas podem ser

trocadas são duas das principais vantagens desta técnica. A eficiência e a seletividade

do processo de extração dependem de vários fatores, tais como as características da

membrana, a força iónica, a temperatura, o tempo, a composição da fase aceitadora e

a agitação. A influência destes fatores na eficiência e seletividade foram estudados em

soluções aquosas modelo de cetonas e aldeídos.

O estudo de diferentes membranas permitiu verificar que o tamanho dos poros

afeta sobretudo a eficiência da extração. No conjunto dos compostos estudados, em

que a gama de dimensões moleculares era bastante diversa, observou-se que a

eficiência da extração foi superior nas membranas com poros maiores (2 e 5 μm). Por

outro lado, a seletividade do processo de extração parece estar também estar

relacionada com a morfologia da membrana (porosa simples ou porosa suportada) e

com as propriedades físico-químicas dos analitos, nomeadamente com os coeficientes

de difusão nos poros da membrana e com a volatilidade da espécie (relacionada com

a constante de Henry). Foi a partir deste estudo que foi possível verificar que a

eficiência da extração de compostos pouco voláteis e de elevada solubilidade em água

(como o metilglioxal) pode ser melhorada utilizando membranas de poros de

dimensões menores.

Um outro aspeto importante na técnica de GDME é a realização da extração por

imersão do módulo na amostra. A comparação da eficiência da extração nestas

condições com a situação em que o módulo foi colocado no headspace da amostra

permitiu verificar que a imersão do módulo na amostra aumenta a eficiência da

extração dos compostos menos voláteis.

De forma geral verificou-se que a eficiência da extração aumenta com o aumento

do tempo e da temperatura utilizados. A força iónica apresentou um efeito mais

significativo na extração dos compostos mais voláteis.

A influência da agitação da solução dadora e da solução aceitadora e a presença

do derivatizante na solução aceitadora foram avaliadas. Verificou-se que a agitação da

solução dadora tem um efeito de aumento da eficiência da extração para tempos de

130 FCUP

Conclusões

extração longos (acima de 60 min). A presença do derivatizante na solução aceitadora

aumenta a eficiência da extração visto que, ao converter os analitos noutra espécie

química na solução aceitadora, mantém elevado o gradiente de concentração nas

duas superfícies da membrana. A agitação da solução aceitadora, quando na

presença do derivatizante, não teve efeito significativo na eficiência da extração. Por

outro lado, na ausência do derivatizante na solução aceitadora, a agitação dessa

solução permite aumentar a quantidade de analitos extraída visto que é promovida a

difusão dos analitos na solução. A importância da agitação da solução aceitadora

quando não está presente o derivatizante foi igualmente verificada no processo de

extração de aminas biogénicas alifáticas.

Para além do estudo de caracterização da técnica, a GDME foi utilizada para o

desenvolvimento de metodologias analíticas para a determinação de aminas

biogénicas alifáticas, acetaldeído e outros aldeídos, e compostos α-dicarbonílicos em

bebidas.

Os estudos apresentados neste capítulo contribuíram para uma mais adequada

compreensão desta técnica de extração para aplicação à análise de amostras

aquosas, e principalmente a analitos que não tinham ainda sido extraídos por GDME.

Os estudos de caracterização da técnica permitiram compreender melhor os

fenómenos de transferência de massa no processo de extração e a influência que

diferentes parâmetros experimentais têm na eficiência e seletividade da extração.

Parte III

Extração líquido-líquido assistida por

salting-out

FCUP

135

11. Introdução

Apesar de ser uma técnica conhecida há várias décadas, a extração líquido-líquido

assistida por salting-out (SALLE) é um instrumento para preparação de amostras que

só recentemente passou a ser mais utilizado pela Química Analítica. Este facto explica

a razão para o uso desta técnica na preparação de amostras para análise por LC ser

ainda reduzida, e existirem oportunidades para expandir a sua aplicação a

metodologias de análise química.

Nesta parte do trabalho foi estudada a utilização da SALLE como técnica de

extração de compostos de amostras líquidas para análise por HPLC. No capítulo 13

apresenta-se um estudo fundamental do processo SALLE com particular ênfase nas

misturas água-acetonitrilo, fazendo uma avaliação do efeito de alguns parâmetros

experimentais considerados como os mais influentes neste tipo de extração. Os efeitos

de cada parâmetro foram avaliados com base na separação dos dois líquidos (água e

acetonitrilo) em duas fases induzida pela adição de sal e na eficiência da extração de

compostos α-dicarbonílicos de soluções padrão aquosas e de amostras. Com base

nestes estudos, desenvolveu-se uma metodologia para a determinação desses

compostos em amostras de vinho e cerveja (capítulo 14).

No capítulo 15 apresenta-se uma aplicação da extração SALLE com base num

procedimento desenvolvido recentemente que tem sido bastante utilizado na análise

de pesticidas em amostras sólidas, a metodologia QuEChERS (acrónimo de Quick,

Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Este procedimento envolve dois passos na

preparação da amostra, (1) uma extração líquido-líquido do tipo SALLE e (2) uma

limpeza do extrato orgânico obtido através de uma extração em fase sólida dispersiva

(d-SPE). Apresenta-se, assim, no capítulo 15 uma aplicação da metodologia

QuEChERS para a análise de fenóis voláteis por LC. O objetivo foi desenvolver uma

metodologia simples para a determinação de fenóis voláteis em bebidas por LC. Dado

que a maioria das metodologias existentes que recorrem à LC não envolve nenhuma

preparação da amostra, pretendia-se que a metodologia proposta pudesse ser uma

solução eficiente para a limpeza da amostra sem complicar demasiado o processo

analítico. A necessidade de realizar uma limpeza da amostra tem particular

importância na prevenção dos sistemas analíticos, sobretudo das colunas

cromatográficas. Além disso, pretendeu-se que a metodologia correspondesse a uma

aplicação inovadora para o procedimento QuEChERS, isto é, que pudesse representar

136 FCUP

Introdução

o alargamento desse procedimento a outros analitos e matrizes, mantendo o modo

original como o procedimento foi criado.

FCUP

137

12. Execução experimental

12.1. Materiais e equipamentos

Os materiais e equipamentos utilizados para a realização deste trabalho foram os

seguintes:

Balança de precisão Mettler, modelo PE2000, para pesagem de reagentes.

Balança analítica Mettler, modelo AE50, para pesagem rigorosa de reagentes.

Banho de ultrassons Bandelin Sonorex, modelo TK100, para a homogeneização e

desgaseificação de soluções e amostras.

Medidor de pH Metrohm, modelo 605, equipado com elétrodo combinado de vidro

calibrado com soluções tampão de referência de pH 4 e 7.

Micropipetas Brand Transferpette (2 – 20 μL; 20 – 100 μL), Gilson Pipetman (P100 -

capacidade máxima de 100 µL; P200 – capacidade máxima de 200 µL; P1000 -

capacidade máxima de 1000 µL), Brand e Selecta (capacidade máxima de 5 mL)

para medição rigorosa de pequenos volumes. A medição de volumes superiores a 5

mL foi realizada com pipetas volumétricas de vidro.

Sistemas de purificação de água Millipore Simplicity e Direct-Q3 UV, para

purificação de água (água ultrapura com resistividade superior a 18 MΩ cm)

utilizada para a preparação de soluções e eluentes para HPLC.


fenóis (secção 15) constituído por:

Bomba com unidade de gradiente quaternário Jasco, modelo PU-2089 Plus;

Unidade de desgaseificação Jasco, modelo DG-1580-54;

Detetor espetrofotométrico Jasco, modelo UV-2070 Plus;

Injetor manual Rheodyne, modelo 7725i, com loop de injeção de 20 µL.

Interface Jasco, modelo LC-Net II/ADC.

138 FCUP


Programa Jasco ChromPass Chromatography Data (versão 1.7.403.1) para

o controlo de sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.


aldeídos, compostos α-dicarbonílicos (secções 13 e 14) constituído por:

Bomba de gradiente quaternário PerkinElmer, modelo S200;

Detetor espetrofotométrico PerkinElmer, modelo S200;

Amostrador automático PerkinElmer, Flexar com loop de injeção de 100 μL.

Programa TotalChrom Navigator (PerkinElmer, versão 6.3.2) para o controlo

de sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.

Colunas cromatográficas com as características referidas na Tabela 12.1:

Tabela 12.1 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações cromatográficas dos compostos

extraídos por SALLE.

Coluna Comprimento Diâmetro

interno

Tamanho da

partícula

Dimensões da

pré-coluna Marca

Gemini C18 250 mm 4,6 mm 5 µm 4 x 3,0 mm Phenomenex

Eurospher C18 250 mm 4,0 mm 5 µm 5 x 4 mm Knauer

12.2. Preparação de soluções

As soluções padrão stock (1 g L-1) dos compostos α-dicarbonílicos foram

preparadas por diluição da quantidade apropriada do reagente comercial (Sigma-

Aldrich) no solvente apropriado. As soluções de glioxal e metilglioxal foram preparadas

a partir dos reagentes comerciais (40% v/v em água) em água ultrapura e

armazenados a 4 ºC. As soluções dos restantes α-dicarbonilos foram preparadas a

partir de diacetilo (97%), a pentano-2,3-diona (97%) e a hexano-2,3-diona (90%) em

acetonitrilo e armazenados a -20 ºC. As soluções de trabalho foram preparadas por

diluição das soluções de 1 g L-1 em solução tampão fosfato (0,1 mol L-1, pH 7). A

solução tampão foi preparada com dihidrogenofosfato de sódio (Merck) e o pH foi

ajustado com ácido clorídrico (Merck).

FCUP


139

A solução de extração/derivatização contendo OFDA (0,5%, m/v) foi preparada

diariamente a partir da dissolução do reagente comercial (98%, Sigma-Aldrich) em

acetonitrilo (Fisher) e armazenada ao abrigo da luz.

As soluções padrão individuais (1 g L-1) dos fenóis voláteis (fenol, cresol, 4-

vinilfenol, 4-vinilguaiacol, 4-etilfenol, 4-etilguaiacol e eugenol) foram preparadas em

acetonitrilo a partir de padrões com um grau de pureza superior a 98% (exceto o 4-

vinilfenol, que era uma solução 10% em propilenoglicol) e armazenadas a -20 ºC. As

soluções de trabalho foram preparadas diariamente a partir das soluções de 1 g L-1 por

diluição em água ultrapura.

Os sais utilizados eram de grau analítico (Sigma-Aldrich): carbonato de potássio

(K2CO3), sulfato de magnésio (MgSO4), acetato de sódio (CH3COONa), acetato de

amónio (CH3COONH4), sulfato de amónio [(NH4)2SO4], cloreto de sódio (NaCl), cloreto

de amónio (NH4Cl), sulfato de sódio (Na2SO4), nitrato de sódio (NaNO3), cloreto de

cálcio (CaCl2), brometo de sódio (NaBr), carbonato de sódio (Na2CO3) e tiocianato de

amónio (NH4SCN).

Os ensaios com mistura de sais de citrato foram realizados utilizando os tubos de

extração comercias (Sigma-Aldrich), constituídos por 1 g NaCl, 0,5 g de

dihidrogenocitrato de sódio sesquidratado, 1 g de citrato de trissódio dihidratado e 4 g

de MgSO4. As restantes misturas de sais foram preparadas com a seguinte

composição: (A) 2 g NaCl, (B) 2 g NaCl + 2 g MgSO4 e (C) 2 g acetato de sódio + 2 g

MgSO4.

Para o passo de limpeza do extrato na metodologia QuEChERS foram testados

três tubos d-SPE comerciais (Sigma-Aldrich) e dois não comerciais (preparados no

laboratório a partir de sorventes fornecidos pela Sigma-Aldrich). A composição de

cada tubo testado encontra-se descrita na Tabela 12.2.

140 FCUP


Tabela 12.2 – Designações e composições dos tubos comerciais e não comerciais de d-SPE testados na limpeza do

extrato em acetonitrilo.

Designação Composição do tubo

Comerciais

Tubo PSA 150 mg PSA6 + 900 mg MgSO4

Tubo PSA/C18 150 mg PSA + 150 mg C18 + 900 mg MgSO4

Tubo PSA/GCB 150 mg PSA + 15 mg GCB7 + 900 mg MgSO4

Não comerciais

Tubo GCB 15 mg GCB + 900 mg MgSO4

Tubo C18 150 mg C18 + 900 mg MgSO4

A solução tampão acetato (10 mmol L-1) utilizada na fase móvel de HPLC-UV foi

preparada a partir de acetato de sódio e ácido acético (Merck) em água ultrapura. Os

eluentes para HPLC foram filtrados com um filtro de Nylon (0,45 μm, Whatman) e

desgaseificados antes da sua utilização.

12.3. Procedimentos experimentais

12.3.1. Determinação de compostos α-dicarbonílicos para o estudo da

SALLE

A derivatização dos analitos era realizada por adição de o-fenilenodiamina (OFDA,

98%, Sigma-Aldrich) à solução padrão de trabalho de forma a obter uma concentração

final de OFDA de 0,2% (m/v). A reação decorria ao abrigo da luz durante 1 hora. À

solução padrão dos compostos α-dicarbonílicos derivatizados (5 mg L-1) era

adicionado o solvente a testar na proporção 1:1 (v/v). Para induzir a separação dos

solventes era adicionada a quantidade necessária de sal de forma a obter uma

concentração final de 1 mol L-1 no volume total da mistura. A mistura era agitada e

centrifugada a 6000 rpm durante 5 min. Nos casos em que ocorria formação de duas

fases líquidas, recolhia-se a fase superior para posterior análise por HPLC-UV. O

esquema simplificado do procedimento encontra-se na Fig. 12.1. A razão de volume

6 PSA: adsorvente contendo N-propiletilenodiamina de base polimérica

7 Carbono preto grafitizado não poroso

FCUP


141

das fases foi calculada e definida como R = Vsup./Vinf., em que Vsup. e Vinf. são os

volumes de fase superior e inferior, respetivamente, obtidos após a centrifugação das

soluções. Foi igualmente calculada a fração extraída definida por (mA/mA’) x 100, em

que mA e mA’ correspondem à massa de analito extraída para a fase superior e a

massa total de analito presente no início da extração, respetivamente.

Fig. 12.1 – Esquema simplificado do procedimento de extração por SALLE para o estudo da técnica em misturas

acetonitrilo-água.

Os extratos obtidos por SALLE foram analisados por HPLC-UV de acordo com o

procedimento descrito por Pacheco et al. [104]. A separação cromatográfica era

realizada à temperatura ambiente numa coluna Gemini C18 (Tabela 12.1). A fase

móvel, constituída por uma mistura 50:50 (v/v) de acetonitrilo e solução tampão

acetato (10 mmol L-1, pH 4,8), era utilizada em modo isocrático a 0,8 mL min-1. O

volume de amostra injetado era de 20 µL e o comprimento de onda de deteção era

315 nm.

As amostras de cerveja analisadas (cerveja sem álcool e cerveja com 5,6% de

álcool) foram gentilmente cedidas pela UNICER-Bebidas de Portugal (S. Mamede de

Infesta, Portugal).

12.3.2. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras de

bebidas utilizando a SALLE

As amostras de bebidas eram diluídas (2:5, v/v) com solução tampão acetato (0,2

mol L-1, pH 4) e era adicionado o padrão interno (hexano-2,3-diona) para uma

concentração final de 0,25 mg L-1. Num tubo de 10 mL misturava-se 2 mL da amostra

diluída, 2 mL de solução de OFDA (0,5%, m/v) e 0,13 g NaCl. Depois de agitar

vigorosamente a mistura até à dissolução quase completa do sal, a solução era

mantida ao abrigo da luz durante 1 hora à temperatura ambiente para ocorrer a

extração e derivatização simultânea dos analitos. No final, os tubos eram

142 FCUP


centrifugados a 6000 rpm durante 2 minutos para facilitar a separação das fases e era

recolhida uma alíquota para análise por HPLC-UV. O esquema simplificado do

procedimento experimental encontra-se na Fig. 12.2.

Fig. 12.2 – Esquema do procedimento experimental para a determinação de compostos α-dicarbonílicos utilizando

SALLE.

Os derivados dos compostos α-dicarbonílicos (quinoxalinas) eram determinados

por HPLC-UV usando uma coluna Gemini C18 (características na Tabela 12.1) à

temperatura ambiente. A fase móvel era composta por (A) acetonitrilo e (B) tampão

acetato (10 mmol L-1) utilizada a um fluxo de 0,8 mL min-1 em modo gradiente: (1) nos

primeiros 5 min era mantida a composição em 30% de A; (2) até aos 15 min

aumentava-se A linearmente até 50%; (3) nos 5 minutos seguintes a composição da

fase móvel regressava às condições iniciais e (4) mantinha-se por mais 15 min antes

da injeção seguinte. O volume de amostra injetado era de 20 µL e a deteção realizava-

se a 315 nm.

As amostras de vinho e cerveja de origem portuguesa analisadas foram adquiridas

em supermercados. Algumas das suas características encontram-se descritas na

Tabela 12.3.

FCUP


143

Tabela 12.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras analisadas para a determinação de compostos α-

dicarbonílicos após extração por SALLE.

Amostra Teor alcoólico (%, v/v) pH








Vinho rosé 9,0 3,3

Cerveja Pilsner 5,0 4,1

Cerveja preta 5,0 4,2

12.3.3. Determinação de fenóis voláteis através da metodologia QuEChERS

Em tubos de 10 mL eram colocados 5 mL de amostra aos quais eram adicionados

2,5 mL de acetonitrilo. A mistura era agitada durante 1 min. Para permitir a separação

da mistura em duas fases, eram adicionados 2 g de NaCl aos tubos, que

posteriormente eram agitados por mais 1 min e centrifugados a 6000 rpm. Da fase

superior era recolhido 1 mL que se transferia para um tubo PSA. O tubo era agitado

durante 1 min, seguido de centrifugação a 6000 g durante 10 min. Por fim, o extrato

era recolhido e analisado por HPLC-UV-FLD. O esquema do procedimento de

preparação da amostra encontra-se na Fig. 12.3. As fotografias junto aos esquemas

dos tubos ilustram o aspeto da amostra ao longo do procedimento.

144 FCUP


Fig. 12.3 – Esquema do procedimento de preparação da amostra para a determinação de fenóis voláteis por HPLC-UV-

FLD.

As separações cromatográficas eram realizadas à temperatura ambiente numa

coluna Eurospher C18 (Tabela 12.1). A fase móvel era composta por acetonitrilo (para

HPLC, Fisher) e tampão acetato (10 mmol L-1, pH 4,7) e era utilizado um fluxo de 0,7

mL min-1 em modo gradiente: (1) nos primeiros 25 min o acetonitrilo aumentava

linearmente de 30 a 35%; (2) nos 5 min seguintes o teor de acetonitrilo aumentava

para 50%; (3) a composição da fase móvel regressava às condições iniciais nos 5 min

seguintes e (4) essas condições eram mantidas durante mais 5 min para estabilização

antes da injeção seguinte. Os comprimentos de onda utilizados para a deteção dos

fenóis voláteis foram escolhidos de forma a obter a máxima sensibilidade para cada

analito. O detetor UV fixado a 280 nm foi utilizado para a deteção de 4-etilfenol, 4-

etilguaiacol e eugenol; os restantes fenóis foram detetados por fluorimetria a λexcitação =

260 nm e a λemissão = 305 nm, para o fenol e cresol, e a λexcitação = 259 nm e a λemissão =

341 nm, para 4-vinilfenol e 4-vinilguaiacol.

As amostras de cerveja foram gentilmente cedidas pela UNICER-Bebidas de

Portugal (S. Mamede de Infesta, Portugal). As amostras de vinho, de sumos e de

néctares foram adquiridas em supermercados locais.

FCUP

145

13. Estudo da extração líquido-líquido

assistida por salting-out em misturas

acetonitrilo-água

Neste capítulo discute-se o fenómeno de salting-out aplicado a misturas líquido-

líquido homogéneas de acetonitrilo-água, para posterior aplicação na extração de

compostos responsáveis por off-flavours em bebidas. Como analitos para testar o

processo de extração foram utilizados alguns compostos α-dicarbonílicos e os extratos

foram analisados por HPLC-UV. O cromatograma de um extrato de solução padrão

encontra-se representado na Fig. 13.1. O estudo focou-se no efeito de alguns

parâmetros experimentais considerados mais relevantes em SALLE. O processo de

extração foi caracterizado através da análise da fração extraída dos compostos de α-

dicarbonílicos e da separação da mistura líquida água-acetonitrilo.

Fig. 13.1 – Cromatograma obtido a partir da extração de uma solução padrão contendo 5 mg L-1 de cada um dos

compostos analisados utilizando as condições de extração e de separação cromatográfica descritas na secção 12.3.1.

146 FCUP

Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água

13.1. Estudo do efeito do solvente orgânico e dos sais na

extração

O iso-propanol, o etanol e o acetonitrilo são três dos solventes mais utilizados em

SALLE devido à sua miscibilidade com a água em todas as proporções. Inicialmente

foram testados vários sais orgânicos e inorgânicos (concentração na mistura de 1 mol

L-1) para a separação de misturas água-solvente 1:1 (v/v). Os resultados obtidos com o

iso-propanol e o etanol foram muito semelhantes. Dos sais estudados só com o

K2CO3, o (NH4)2SO4, o Na2SO4 e o Na2CO3 foi possível obter separação de fases.

Apesar disso, na maioria dos casos em que houve separação, o volume obtido na fase

superior era maior que o da fase inferior (R superior a 1). Este facto demonstrava que

o extrato obtido na fase superior continha uma elevada quantidade de água.

Nas misturas acetonitrilo-água só não se verificou separação dos dois solventes da

mistura quando se utilizou NaNO3, NaBr ou NH4SCN. Com os restantes sais

estudados foi possível separar o acetonitrilo da água (Fig. 13.2), sendo possível

distinguir três grupos de sais de acordo com a razão de fases (R) e a fração extraída:

(1) acetatos e cloretos, (2) carbonatos e sulfatos8 e (3) MgSO4. Verificou-se que o

anião do eletrólito será o principal responsável pelas diferenças na eficiência da

separação dos solventes e da extração dos analitos, seguindo a ordem SO42- ≈ CO3

2- >

CH3COO- ≈ Cl-, como na série de Hofmeister [236]. Na extração com MgSO4, apesar

de se ter obtido um sistema líquido bifásico, o volume de fase inferior obtido no final da

extração era muito reduzido. Portanto, a fase superior continuava a ser uma mistura

de água e acetonitrilo. O comportamento observado com o MgSO4 foi idêntico ao

referido por Tabata et al. [197].

Dado que os resultados das misturas acetonitrilo-água foram mais promissores do

que as outras misturas testadas e também porque o uso de acetonitrilo é mais

favorável à separação cromatográfica dos compostos analisados por HPLC em fase

reversa, os ensaios seguintes foram realizados usando o acetonitrilo como solvente

extrator.

8 A única exceção é o MgSO4.

FCUP


147

Fig. 13.2 – Representação gráfica da fração extraída média em função da razão de fases (R) obtidos para a extração

dos derivados dos compostos α-dicarbonílicos de soluções de acetonitrilo-água (1:1, v/v) usando diferentes sais com

concentração na mistura de 1 mol L-1. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1 de cada

analito.

13.2. Estudo do efeito da concentração de sal na extração

O efeito da concentração de sal na separação dos dois solventes da mistura

acetonitrilo-água e na extração dos analitos foi avaliado utilizando sais pertencentes

aos três grupos representados na Fig. 13.2 na gama de concentrações na mistura

entre 0,2 e 2,5 mol L-1. Os eletrólitos escolhidos foram o MgSO4, o Na2CO3 e o NaCl e

as suas concentrações na mistura acetonitrilo-água mostraram ter influência distinta

no processo de extração dos compostos α-dicarbonílicos.

A alteração das concentrações de NaCl ou Na2CO3 em solução não afetaram a

separação dos dois solventes (R igual a 0,6 e 1, respetivamente) na gama de

concentrações de sais estudada. Por outro lado, o volume de fase superior recolhida

nos ensaios com MgSO4 variou com o aumento da concentração do sal. Para as

concentrações testadas mais baixas (0,25 e 0,5 mol L-1) o valor de R foi mais elevado

(R = 3) e diminuiu com o aumento da concentração de MgSO4. Estes resultados estão

de acordo com os reportados por outros autores [237].

Relativamente à fração extraída foram igualmente encontradas diferenças para os

três sais testados (Fig. 13.3). A quantidade de compostos α-dicarbonílicos extraídos

148 FCUP


para a fase superior utilizando diferentes concentrações de MgSO4 seguiu uma

tendência similar ao verificado para a razão de fases; o aumento da concentração de

sal resultou numa diminuição pouco acentuada da quantidade de analitos extraídos.

Fig. 13.3 – Fração extraída dos compostos α-dicarbonílicos em função da concentração de sal na mistura acetonitrilo-

água para os três sais testados (MgSO4, o Na2CO3 e o NaCl). As extrações foram realizadas utilizando soluções

padrão 5 mg L-1 de cada analito.

O aumento da concentração de Na2CO3 não provocou alterações significativas na

fração extraída dos compostos. Nos ensaios realizados com o NaCl a quantidade de

analitos extraída foi maior para as concentrações de sal mais elevadas. Resultados

idênticos aos obtidos neste trabalho têm sido também reportados por outros autores

em diversos estudos sobre a capacidade do NaCl em separar misturas acetonitrilo-

água [237-240]. Analisando mais detalhadamente os resultados obtidos para a

extração utilizando este sal, verificou-se que o valor de fração extraída é diferente para

cada composto analisado. Quanto menos polar é o analito, maior será a quantidade

extraída para a fase orgânica. Tal seria de esperar tendo em conta as diferenças de

polaridade dos dois solventes da mistura. Ou seja, o derivado do glioxal foi aquele em

que os valores de fração extraída foram mais baixos, por oposição à hexano-2,3-diona

cujas quantidades extraídas foram as mais elevadas. Analogamente, a concentração

mínima de sal necessária para obter o máximo valor de fração extraída foi diferente

para os compostos analisados. Para o derivado da hexano-2,3-diona só foi necessária

uma concentração de sal de 0,4 mol L-1 para que se atingisse a eficiência máxima de

extração para este analito (cerca de 95%). Essa quantidade de sal aumentou quando

a polaridade do derivado do composto α-dicarbonílico é maior, verificando-se que para

o derivado do glioxal já é necessária uma concentração de 1,3 mol L-1 para que se

consiga extrair a maior quantidade possível (fração extraída de 81%).

FCUP


149

13.3. Estudo do efeito do volume de acetonitrilo na extração

Com o objetivo de verificar de que forma a razão de volumes água-acetonitrilo

influencia o processo de SALLE foram realizados ensaios em que, mantendo-se o

volume de solução aquosa em 2 mL, se variava o volume de acetonitrilo adicionado

(entre 1 e 4 mL). Os ensaios foram realizados utilizando o MgSO4, o Na2CO3 ou o

NaCl e mantendo a concentração de sal constante (concentração na mistura de 0,5

mol L-1) em todos os ensaios.

Da análise dos resultados obtidos verifica-se que o volume de fase superior

recolhida aumenta proporcionalmente com o aumento do volume de acetonitrilo

adicionado no início da extração (Fig. 13.4A). No entanto, verifica-se que a

proporcionalidade entre as duas variáveis (volume recolhido e volume de acetonitrilo

inicial) é diferente para os três sais estudados, de acordo com os resultados obtidos

anteriormente e discutidos nas secções 13.1 e 13.2. No caso do MgSO4 o volume

recolhido é superior ao volume de acetonitrilo inicial, para o Na2CO3 o volume

recolhido é praticamente idêntico ao volume adicionado inicialmente e, quando se

utilizou o NaCl, o volume recolhido é inferior à quantidade inicial de solvente orgânico

adicionado.

Fig. 13.4 – Representações gráficas da variação do volume de fase orgânica recolhida (A) e da fração extraída do

derivado de glioxal (B) em função do volume de acetonitrilo adicionado para a extração usando os três sais estudados

(MgSO4, o Na2CO3 e NaCl). As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1 de cada analito com

uma concentração constante de sal na mistura de 0,5 mol L-1.

Na Fig. 13.4B estão representados os resultados da fração extraída do derivado de

glioxal para diferentes volumes de acetonitrilo utilizado. Os resultados obtidos para os

outros compostos α-dicarbonílicos em estudo foram similares aos obtidos para o

glioxal. O aumento do volume de solvente extrator (acetonitrilo) adicionado conduziu a

150 FCUP


uma variação mínima da quantidade de analito extraída nos ensaios com MgSO4 e

Na2CO3 (entre 89 e 104% para o MgSO4 e entre 67 e 76% para o Na2CO3). À

semelhança dos resultados obtidos nos estudos anteriores sobre o efeito da

concentração de sal na extração (secção 13.2), o NaCl originou resultados diferentes

dos outros dois sais. Verificou-se que a quantidade de analito extraída aumenta com o

aumento do volume de acetonitrilo adicionado até um volume de 3 mL. Acima desse

volume a eficiência de extração dos analitos manteve-se praticamente constante.

13.4. Aplicação do processo de extração à análise de bebidas

De forma a verificar se as conclusões obtidas nos estudos realizados com soluções

padrão de compostos α-dicarbonílicos eram válidas para amostras reais foram

realizados ensaios em amostras de cerveja fortificadas com os compostos α-

dicarbonílicos (5 mg L-1). As condições de extração utilizadas foram as mesmas dos

estudos com soluções modelo.

Na Fig. 13.5 estão representados os valores de fração extraída do derivado de

glioxal em soluções modelo e em amostras utilizando os diferentes sais testados nos

casos em que ocorreu a separação da mistura em duas fases líquidas. Os resultados

obtidos com as amostras foram semelhantes aos obtidos para as soluções modelo,

para a maioria dos sais testados. No entanto observaram-se diferenças significativas

nas extrações com MgSO4, Na2CO3 e CH3COONa. Nos dois primeiros casos verificou-

se que a quantidade de analito extraída para a fase orgânica foi superior, no caso da

cerveja com álcool, à registada para as soluções modelo e para a amostra de cerveja

sem álcool. Relativamente aos resultados das extrações utilizando o CH3COONa,

apesar de não ter havido diferenças nos volumes de fase superior recolhidos, a

eficiência da extração nas amostras foi superior à obtida para a solução padrão. Para

os restantes compostos analisados os resultados que se obtiveram foram semelhantes

para as três situações.

FCUP


151

Fig. 13.5 – Fração extraída média9 de compostos α-dicarbonílicos em soluções padrão (5 mg L-1) e em amostras de

cerveja sem e com álcool dopadas com os cinco compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1), utilizando diferentes sais para a

extração com acetonitrilo com uma concentração na mistura de 1 mol L-1.

Relativamente aos ensaios sobre o efeito da concentração de sal no SALLE

verificou-se que o volume de fase superior recolhida na solução padrão e nas

amostras era diferente, para diferentes concentrações de sal. No entanto, as

quantidades de analitos extraídos nas soluções modelo e nas amostras mantinham-se

idênticas. Para o caso do NaCl, os volumes de extrato recolhidos nas amostras são

diferentes dos recolhidos nas soluções padrão para concentrações de NaCl inferiores

a 1,3 mol L-1 (Fig. 13.6A). Por outro lado não se verificaram diferenças nas

quantidades de analitos extraídas para a fase superior (Fig. 13.6B).

Fig. 13.6 – Razão de fases (A) e fração extraída média dos compostos α-dicarbonílicos (B) em função da concentração

de NaCl utilizada para a extração de compostos α-dicarbonílicos de soluções padrão (5 mg L-1) e de amostras de

cerveja sem e com álcool dopadas com os cinco compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1).

9 Média dos valores de fração extraída obtidos para os cinco compostos analisados.

FCUP

153

14. Determinação de compostos α-

dicarbonílicos em bebidas utilizando a

SALLE

14.1. Efeito do reagente derivatizante na extração

No capítulo anterior (secção 13.4) demonstrou-se ser possível extrair compostos α-

dicarbonílicos de amostras de cerveja utilizando a SALLE. Os analitos eram

inicialmente derivatizados com OFDA

na amostra e posteriormente as

quinoxalinas eram extraídas com

acetonitrilo por salting-out

(procedimento A na Fig. 14.1). Contudo

este procedimento podia ser

simplificado executando a extração e

derivatização em simultâneo

(procedimento C na Fig. 14.1),

permitindo minimizar os riscos de

variabilidade nos resultados e

simplificando o processo. Foi

igualmente testado um procedimento

em que inicialmente era realizada a

extração dos α-dicarbonilos seguida da

derivatização com OFDA para avaliar o

efeito que a presença ou ausência da

OFDA na solução extratora

(procedimento B na Fig. 14.1) tinha na

recuperação dos compostos na fase

orgânica.

Fig. 14.1 – Esquemas dos procedimentos

experimentais (A, B e C) realizados para o estudo do

efeito do reagente derivatizante na extração usando

uma solução padrão de α-dicarbonilos (0,5 mg L-1).

Os resultados dos procedimentos testados (Fig. 14.2) permitem concluir que o uso

do agente derivatizante durante a extração (procedimento C da Fig. 14.1) aumenta a

recuperação dos analitos por comparação com o procedimento B. Dado que a OFDA é

mais solúvel em acetonitrilo do que em água, a sua presença na fase extratora permite

154 FCUP

Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE

deslocar o equilíbrio químico no sentido do solvente orgânico devido à reação de

derivatização favorecendo o processo de extração dos analitos. Como se pode

verificar, as diferenças nos sinais analíticos obtidos com os procedimentos B e C são

maiores para os compostos mais polares, o glioxal e o metilglioxal. Os resultados

obtidos para o procedimento C foram semelhantes aos obtidos usando o procedimento

A, no qual se realiza primeiro a derivatização da amostra e posteriormente a extração

das quinoxalinas. Assim, atingido o objetivo da simplificação do procedimento

experimental, foi adotado o procedimento C (extração e derivatização simultâneas)

para os estudos subsequentes. Todas estas conclusões foram igualmente verificadas

em amostras de vinho dopadas com os analitos (0,5 mg L-1).

Fig. 14.2 – Áreas dos picos cromatográficos dos quatro compostos estudados realizando os três procedimentos

representados na Fig. 14.1. As extrações foram realizadas com uma solução padrão contendo 0,5 mg L-1 de cada

analito e utilizando NaCl com uma concentração na mistura de 0,5 mol L-1.

14.2. Efeito da natureza do sal utilizado na extração

Do estudo da influência do sal utilizado na SALLE discutido na secção 13.1

conclui-se que diferentes sais têm efeito na eficiência da obtenção da separação da

mistura acetonitrilo-água em duas fases e na extração dos analitos para a fase

orgânica. Dado que o procedimento experimental foi modificado relativamente ao do

capítulo anterior, realizando-se, neste caso, a extração e a derivatização em

simultâneo, este estudo foi novamente realizado utilizando três sais (NaCl, Na2CO3 e

CH3COONa). Os ensaios foram realizados com uma solução padrão (0,5 mg L-1)

contendo os compostos α-dicarbonílicos em estudo e os resultados mostraram que o

sal utilizado como agente de salting-out praticamente não afeta a resposta analítica.

FCUP


155

Fig. 14.3 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE realizadas com NaCl, Na2CO3 e

CH3COONa com concentrações na mistura de 0,5 mol L-1. Foram utilizadas soluções padrão de compostos α-

dicarbonílicos contendo 0,5 mg L-1 de cada um dos analitos.

Os mesmos estudos foram realizados em amostras de vinho (branco e tinto) e de

cerveja dopadas (0,25 mg L-1). Os resultados encontram-se apresentados na Fig. 14.4

e mostram que nas amostras o sal utilizado influenciava muito a quantidade de

analitos presentes no extrato, ao contrário do que se havia observado para as

soluções padrão. Verificou-se que, inclusivamente, a extração/derivatização do mesmo

composto em amostras diferentes era afetada de forma distinta, consoante o sal

utilizado. Por exemplo, na amostra de vinho branco a área de pico máxima é obtida

com o NaCl, enquanto na amostra de vinho tinto foi obtida com o Na2CO3. Estes

resultados indicam a existência de uma interação do sal com a matriz da amostra que

afeta a quantidade de analitos extraídos. A primeira e mais óbvia hipótese de

justificação destes resultados é a da existência de uma alteração de pH da amostra

provocada pela adição de sal, o que pode ocorrer com a adição de CH3COONa e

Na2CO3. Os resultados obtidos com as soluções padrão (Fig. 14.3) permitiram concluir

que essa alteração de pH não afeta nem a extração nem a derivatização dos

compostos dado que o sinal analítico obtido foi semelhante para os três sais. Assim,

será a capacidade dos compostos α-dicarbonílicos se ligarem ou reagirem com

constituintes do vinho, como por exemplo os sulfitos [106] ou aminoácidos [10], que

poderá justificar estes resultados. Como a maioria destas reações é dependente do

pH, a alteração desta propriedade pode levar à formação ou quebra daquelas ligações

e por isso a quantidade de α-dicarbonilos extraída poderá ser afetada. Assim, tornou-

se necessário fazer um estudo sobre a influência do pH da amostra na quantidade de

analitos extraídos.

156 FCUP


Fig. 14.4 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE realizadas com NaCl, Na2CO3 e

CH3COONa (numa concentração de 0,5 mol L-1 na mistura) utilizando amostras de vinho branco, vinho tinto e cerveja

dopadas com os compostos α-dicarbonílicos em estudo (0,25 mg L-1).

14.3. Efeito do pH da amostra

O efeito do pH da amostra na quantidade de analitos extraída foi inicialmente

estudado na gama entre 1 a 10 utilizando soluções padrão dos analitos (0,25 mg L-1)

preparadas em soluções tampão com valores de pH correspondentes. O NaCl foi

utilizado para induzir o salting-out dado que não interfere com o pH da solução. Os

resultados mostram que as áreas dos picos cromatográficos do glioxal e do

metilglioxal aumentam com o aumento do pH. Por outro lado, para os compostos

diacetilo e pentano-2,3-diona a influência do pH na extração era menos acentuada. No

entanto, para pH 1 e superior a 9 a quantidade extraída de diacetilo era menor. Com

FCUP


157

base nestes resultados, selecionou-se a gama de pH entre 2 e 8 para ser estudada

nas amostras.

De forma a estudar o efeito do pH em amostras, diluíram-se amostras de vinho

(2:5, v/v) com as soluções tampão correspondentes aos valores de pH a testar. A

quantificação dos compostos nas amostras era realizada através do método da adição

de padrão. Na Fig. 14.5 estão representadas as concentrações de α-dicarbonilos

determinadas numa amostra de vinho tinto pelo método da adição de padrão para

diferentes valores de pH. Os resultados obtidos para uma amostra de vinho branco

seguiram o mesmo comportamento. Verificou-se que a quantidade de glioxal extraída

diminuiu muito com o aumento do pH na gama testada (pH entre 2 e 8), ao contrário

do verificado com as soluções padrão. Para a pentano-2,3-diona também se

observaram variações nas amostras analisadas.

Fig. 14.5 – Concentrações dos compostos α-dicarbonílicos obtidas para diferentes valores de pH da amostra de vinho

tinto.

O efeito do pH na extração de α-dicarbonilos e outros compostos carbonílicos de

amostras com matrizes complexas, tais como o vinho, é ainda uma questão a ser

clarificada. Existem muitos estudos acerca da influência do pH na interação entre

carbonilos e outros componentes do vinho e o seu impacto na determinação analítica

daqueles compostos [10]. No entanto, são necessários estudos mais detalhados das

reações dependentes do pH e das suas implicações no procedimento de extração.

Existem alguns trabalhos sobre o estudo do efeito do pH na extração de α-dicarbonilos

considerando a sua interação com os sulfitos [106, 160, 241]. Porém, considerando os

resultados deste trabalho será certamente necessário averiguar a existência de outro

158 FCUP


tipo de interações na amostra e estudar de que forma a alteração de pH afeta essas

interações. Por esta razão, o controlo do pH da amostra para a realização da extração

é essencial. Dado que os resultados do estudo do pH não foram ainda clarificados e

que o objetivo deste trabalho era a aplicação da técnica SALLE à determinação de α-

dicarbonilos, foi selecionado um valor de pH próximo das amostras em estudo de

modo a evitar uma grande alteração das condições na matriz. Assim, a determinação

dos analitos realizou-se após o ajuste do pH da amostra para 4 por diluição com

solução tampão acetato (0,2 mol L-1, pH 4).


A linearidade da metodologia foi avaliada através da construção de curvas de

calibração utilizando extratos de soluções padrão preparadas em solução tampão pH 4

nas gamas de concentração em que geralmente os compostos α-dicarbonílicos se

encontram nas bebidas analisadas. A extração foi realizada de acordo com o

procedimento descrito na secção 12.3.2 e cada solução foi analisada em triplicado. O

padrão interno (hexano-2,3-diona) foi utilizado para compensar qualquer variação do

processo de extração. A partir da aplicação da regressão linear aos pontos

experimentais obtiveram-se coeficientes de determinação elevados (r2 superiores a

0,993, Tabela 14.1). Os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) foram obtidos

a partir de 3 e 10 vezes o desvio-padrão da regressão linear da curva de calibração,

respetivamente [231] (Tabela 14.1).

Tabela 14.1 – Equações das curvas de calibração, coeficientes de determinação e limites de deteção e quantificação

dos compostos α-dicarbonílicos extraídos de soluções padrão de acordo com o procedimento descrito na secção

12.3.2.

Analito Equação da curva de calibração a r2 b LD /mg L-1 LQ /mg L-1

Glioxal y = (0,73 ± 0,03)x + (0,2 ± 0,2) 0,996 0,019 0,063

Metilglioxal y = (2,85 ± 0,03)x + (0,12 ± 0,08) 0,999 0,008 0,028

Diacetilo y = (3,96 ± 0,08)x + (0,22 ± 0,09) 0,999 0,007 0,023

Pentano-2,3-diona y = (1,69 ± 0,08)x - (0,02 ± 0,02) 0,993 0,011 0,036

a y = ax + b; a: declive ± desvio padrão (n = 5) em L mg-1; b: ordenada na origem ± desvio padrão (n = 5)

b Coeficiente de determinação

FCUP


159

A influência da matriz da amostra na quantificação dos compostos α-dicarbonílicos

foi avaliada através da análise de três amostras diferentes (vinho branco, vinho tinto e

cerveja). Cada amostra foi fortificada em quatro níveis de concentração e cada

solução foi analisada em triplicado. As concentrações para a fortificação foram

escolhidas de acordo com o teor dos analitos nas amostras e de forma a obter

incrementos de sinal entre 50% e 200%. Os declives das curvas da adição de solução

padrão foram comparados com os declives das curvas de calibração utilizando o teste

t-Student (99% de intervalo de confiança) verificando-se diferenças estatisticamente

significativas entre eles. Assim, utilizou-se o método da adição de solução padrão para

quantificar os analitos nas amostras. Os cromatogramas obtidos para os extratos da

adição de solução padrão a uma amostra de vinho tinto encontra-se representados na

Fig. 14.6.

Fig. 14.6 – Cromatogramas obtidos a partir da extração de amostras de vinho tinto (vinho tinto 2, Tabela 12.3) com

diferentes adições de soluções padrão de compostos α-dicarbonílicos, As condições utilizadas para a separação

cromatográfica encontram-se na secção 12.3.2.

A repetibilidade foi avaliada pela análise, no mesmo dia, de cinco réplicas de

extratos de amostras fortificadas. A reprodutibilidade foi calculada a partir dos

resultados obtidos de três réplicas em quatro dias diferentes. Os resultados obtidos

para a repetibilidade e a reprodutibilidade em três amostras encontram-se na Tabela

14.2.

160 FCUP


Tabela 14.2 – Valores de repetibilidade e reprodutibilidade para os compostos α-dicarbonílicos estudados obtidos a

partir da análise de extratos de amostras de vinho branco, vinho tinto e cerveja.

Repetibilidade (%) Reprodutibilidade (%)

Vinho

branco

Vinho

tinto

Cerveja

Pilsner

Vinho

branco

Vinho

tinto

Cerveja

Pilsner

Glioxal 8,8 6,2 3,9 11,7 9,3 6,6

Metilglioxal 4,9 2,6 4,3 5,0 4,6 9,8

Diacetilo 7,6 2,6 5,1 9,5 3,3 6,9

Pentano-2,3-diona 4,6 5,5 5,9 4,7 8,1 9,1

14.5. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em vinho e

cerveja

A metodologia desenvolvida foi aplicada na quantificação dos compostos α-

dicarbonílicos em amostras de vinho e de cerveja descritas na Tabela 12.3. Os

resultados são apresentados na Fig. 14.7. Todos os compostos foram quantificados

nas amostras analisadas à exceção do metilglioxal na cerveja branca (valor de

concentração abaixo do LQ) e a pentano-2,3-diona na amostra de cerveja preta (valor

de concentração abaixo do LD). O diacetilo não foi determinado na cerveja preta

porque se verificou a existência de uma interferência no sinal cromatográfico,

correspondente a um composto que co-eluía com o derivado do diacetilo.

A concentração mais elevada de glioxal foi determinada numa amostra de vinho

branco (vinho branco 4; 12,1 ± 0,5 mg L-1). Todos os valores de concentração obtidos

para este analito em vinhos brancos encontram-se na gama de concentração descrita

por outros autores em vinhos portugueses [48]. O teor de glioxal nos vinhos tintos e

rosé foram determinados numa gama de concentrações entre 0,95 ± 0,05 e 8,8 ± 0,6

mg L-1. Nas cervejas os valores de glioxal quantificados foram mais baixos (0,29 ± 0,04

e 0,53 ± 0,04 mg L-1).

O valor médio do teor de metilglioxal nos vinhos foi de 0,7 mg L-1, exceto para uma

das amostras cuja concentração determinada foi bastante superior (3,2 ± 0,2 mg L-1).

O teor de diacetilo determinado nos vinhos brancos (valor médio de 1,4 mg L-1) foi

bastante inferior aos obtidos nos vinhos tintos (cerca de 5,6 mg L-1).

FCUP


161

De forma geral, a pentano-2,3-diona foi o composto α-dicarbonílico presente em

menor quantidade nas amostras analisadas (entre 0,12 ± 0,03 e 0,62 ± 0,07 mg L-1).

Fig. 14.7 – Valores de concentração do glioxal, metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidos para as amostras de

vinho e de cerveja analisadas (Tabela 12.3). (ND, não detetado; NQ, não quantificado; a, não determinado).

FCUP

163

15. Determinação de fenóis voláteis em

bebidas através da aplicação da

metodologia QuEChERS

Neste capítulo é apresentado o desenvolvimento de uma metodologia

desenvolvida para a análise de fenóis voláteis em bebidas baseada no procedimento

QuEChERS. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para a

extração destes compostos presentes em bebidas para análise por LC. O

procedimento desenvolvido é simples, não tem requisitos especiais em termos de

equipamento de laboratório e tem um consumo reduzido de solventes. Além disso,

permite a “limpeza” do extrato antes da análise cromatográfica, prevenindo a longo

prazo a degradação das colunas cromatográficas, especialmente em análises de

rotina. Resumidamente o procedimento de preparação da amostra divide-se em duas

etapas: (1) a amostra é submetida a uma extração líquido-líquido assistida por salting-

out (SALLE) com um solvente orgânico miscível com a água e (2) o extrato orgânico é

sujeito a um procedimento de lavagem utilizando uma extração em fase sólida

dispersiva (d-SPE).

15.1. Seleção do solvente extrator

O principal fator para a escolha do solvente extrator foi a sua miscibilidade com o

solvente das amostras, isto é, com a água. O acetonitrilo e o metanol foram testados

na extração dos fenóis utilizando uma mistura de 2 g NaCl com 2 g MgSO4 para

induzir a separação de fases. Estes solventes foram os escolhidos para o estudo por

se adaptarem à posterior separação cromatográfica dos fenóis. O acetonitrilo acabou

por ser o solvente selecionado, dado que não foi possível induzir a separação das

fases da mistura água-metanol.

De modo a estudar a influência do volume de solvente extrator na sensibilidade da

metodologia e nas taxas de recuperação dos analitos foram realizados alguns ensaios

utilizando diferentes razões de volumes amostra/acetonitrilo (entre 1:1 e 5:1). Estes

estudos foram realizados usando uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1

de cada um dos fenóis estudados. A razão 2:1 (amostra/acetonitrilo) foi a que resultou

em melhores valores de recuperação dos analitos e que permitiu uma melhor

separação entre as fases aquosa e orgânica.

164 FCUP

Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS

15.2. Seleção do sal a utilizar na extração dos fenóis voláteis

Após a mistura da amostra com o acetonitrilo é necessário induzir a separação em

duas fases e que o equilíbrio de distribuição seja deslocado no sentido do solvente

orgânico. Para isso é adicionado um sal ou mistura de sais à solução para que, após

centrifugação, ocorra a separação da água e do acetonitrilo [242]. Foram estudadas

vários sais (ou misturas de sais) geralmente utilizadas nos procedimentos QuEChERS

contendo MgSO4, NaCl, tampão citrato ou acetato de sódio. Os resultados encontram-

se apresentados na Fig. 15.1.

Fig. 15.1 – Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados utilizando diferentes sais ou misturas

de sais (secção 12.2) para a extração dos compostos de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada

fenol (a etapa de d-SPE foi realizado com o tubo PSA).

Analisando os resultados obtidos (Fig. 15.1) verificou-se que não houve diferenças

significativas nas quantidades extraídas de fenóis quando se utilizavam diferentes

composições de sais. As únicas exceções foram o 4-etilguaiacol e o eugenol para os

quais a eficiência da extração com tampão citrato+MgSO4 foi a menor.

De seguida decidiu-se comparar a necessidade da utilização do MgSO4 neste

processo. Geralmente este sal é utilizado na metodologia QuEChERS de forma a

remover a água residual existente no extrato orgânico, de forma a eliminar os efeitos

adversos que esta possa ter na segunda etapa da metodologia, o d-SPE [243]. De

forma a verificar a influência do MgSO4 na extração dos fenóis foram realizados

ensaios em que só era utilizado NaCl. Os resultados (Fig. 15.2) mostram que a

resposta analítica para todos os fenóis é superior quando é utilizado NaCl sem MgSO4.

Assim, para os ensaios subsequentes foi utilizado somente o NaCl para o processo de

salting-out. A quantidade mínima de NaCl necessária para que ocorresse a separação

FCUP


165

da mistura amostra/acetonitrilo foi de 2 g para a separação de 5 mL de amostra e 2,5

mL de acetonitrilo.

Fig. 15.2 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados utilizando NaCl com e sem MgSO4

para a extração dos compostos de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (d-SPE foi

realizado com o tubo PSA).

15.3. Seleção do adsorvente para a limpeza do extrato por d-

SPE

Nesta etapa do procedimento de preparação da amostra estudaram-se as

condições de limpeza do extrato para remover alguns compostos químicos da amostra

extraídos pelo acetonitrilo e que devem ser evitados na análise cromatográfica, tais

como ácidos orgânicos, açúcares e pigmentos. Os ensaios para a escolha do melhor

adsorvente a utilizar na extração dos fenóis foram efetuados utilizando uma amostra

de vinho tinto fortificada com 0,5 mg L-1 em cada fenol em estudo. As condições

experimentais utilizadas para a primeira etapa da preparação da amostra foram as

selecionadas nos estudos anteriores (secções 15.1 e 15.2, usando 5 mL de amostra,

2,5 mL de acetonitrilo e 2 g NaCl). Os tubos de d-SPE testados encontram-se

descritos na Tabela 12.2.

De uma forma geral, os resultados obtidos (Fig. 15.3) foram semelhantes para

todos os adsorventes testados. Desta forma verifica-se que o impacto que esta etapa

do procedimento tem na extração é reduzido. A escolha do adsorvente foi feita com

base no volume recolhido após o passo de limpeza do extrato, na limpidez do extrato,

e nas diferenças observadas nos cromatogramas resultantes da injeção direta da

amostra (sem extração) e da análise do extrato obtido através da metodologia em

estudo.

166 FCUP


Fig. 15.3 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados utilizando diferentes sorventes (Tabela

12.2) para a etapa de d-SPE em extratos obtidos da extração de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de

cada fenol usando 2 g NaCl.

Visualmente os extratos obtidos recorrendo aos tubos PSA e PSA/GCB eram os

mais límpidos, ao contrário dos extratos obtidos com o tubo C18, em que nenhuma

limpeza pareceu ter ocorrido. Assim, o tubo PSA foi o escolhido dado que o extrato da

amostra obtido era o mais límpido e as diferenças observadas nos cromatogramas

obtidos antes e após a realização do procedimento de preparação da amostra eram as

mais significativas (Fig. 15.4).

Fig. 15.4 – Cromatogramas obtidos a partir da análise de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada

fenol (a vermelho) e de um extrato da mesma amostra utilizando 2 g NaCl para o SALLE e o tubo PSA para o d-SPE (a

azul).

FCUP


167


Para cada composto fenólico estudado foram obtidas curvas de calibração a partir

da análise de duas réplicas para cinco níveis de concentração (entre 0,02 e 2,2 mg L-

1). As curvas de calibração e de adição de padrão forma comparadas através do teste

t-Student (com 99% de intervalo de confiança) verificando-se que não existiam

diferenças estatisticamente significativas nos seus declives. Assim, a quantificação

dos fenóis foi realizada a partir da curva de calibração.

Os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados a partir 3 e 10

vezes o desvio-padrão da regressão linear das curvas de calibração, respetivamente

[231]. A repetibilidade da metodologia foi avaliada através da análise no mesmo dia de

três réplicas de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol. Para

o cálculo da reprodutibilidade forma analisadas três réplicas da mesma amostra

durante três dias diferentes. Os resultados encontram-se na Tabela 15.1.

Tabela 15.1 – Limites de deteção e de quantificação, repetibilidade, reprodutibilidade e taxas de recuperação da

metodologia desenvolvida para a determinação de fenóis voláteis em bebidas.

Analito LD (mg L-1)a LQ (mg L-1)a Repetibilidade

(%)b

Reprodutibilidade

(%)

Recuperação

± DPc (%)

Fenol 0,055 0,101 2,8 5,4 100 ± 7

Cresol 0,025 0,115 2,0 8,8 100 ± 5

4-vinilfenol 0,018 0,083 0,2 3,9 105 ± 4

4-vinilguaiacol 0,001 0,055 0,3 2,2 96 ± 3

4-etilfenol 0,001 0,048 6,2 6,9 92 ± 6

4-etilguaiacol 0,003 0,092 4,3 3,6 108 ± 9

Eugenol 0,001 0,012 3,5 10,0 94 ± 3

a Valores calculados para a concentração na amostra.

b Calculada através do desvio padrão relativo.

c Desvio padrão relativo.

A existência de efeito de matriz foi estudada através da análise de uma amostra de

vinho tinto dopada com concentrações conhecidas dos fenóis (0,25 a 1 mg L-1). Os

valores de recuperação dos fenóis analisados variam entre 92% e 108% (Tabela 15.1).

168 FCUP


15.5. Quantificação dos fenóis nas amostras

A aplicabilidade da metodologia desenvolvida foi avaliada fazendo a análise (em

triplicado) dos fenóis voláteis em diferentes bebidas (vinho, cerveja, sumos de fruta e

néctares de fruta). O fenol e o cresol não foram detetados em nenhuma das amostras.

O 4-vinilfenol só foi detetado nas amostras de cerveja e no vinho tinto 1, mas o valor

obtido encontrava-se abaixo do LQ. O mesmo aconteceu com o 4-vinilguaiacol,

detetado na amostra de cerveja mas igualmente abaixo do LQ. Os resultados obtidos

para as amostras de cerveja corroboram os resultados obtidos por Vanbeneden et al.

[244] em que foram determinados níveis baixos dos fenóis vinílicos e concentrações

elevadas de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol. Os resultados obtidos para a concentração dos

fenóis voláteis presentes em maior concentração nas amostras encontram-se na

Tabela 15.2.

Tabela 15.2 – Concentrações (mg L-1) obtidas para os fenóis voláteis quantificados nas amostras de bebidas

analisadas.

4-etilfenol 4-etilguaiacol Eugenol

Cerveja Pilsner <LD 1,14 ± 0,01 <LD

Cerveja preta <LD 0,28 ± 0,01 0,032 ± 0,002

Vinho branco 1 0,19 ± 0,01 1,14 ± 0,01 <LD

Vinho branco 2 0,15 ± 0,01 0,46 ± 0,01 <LD

Vinho tinto 1 1,11 ± 0,01 1,23 ± 0,01 0,052 ± 0,002

Vinho tinto 2 0,83 ± 0,01 0,90 ± 0,01 0,052 ± 0,002

Néctar de pêra <LQ 0,10 ± 0,01 <LQ

Néctar de manga 0,12 ± 0,01 0,13 ± 0,01 0,032 ± 0,002

Sumo natural de laranja e maçã <LQ 0,13 ± 0,01 <LD

Sumo natural de maçã e cenoura <LQ 0,15 ± 0,01 <LQ

Refrigerante de ananás <LD 0,19 ± 0,01 <LD

Nas cervejas Pilsner e preta o 4-etilguaiacol foi determinado em concentrações de

1,14 e 0,28 mg L-1, respetivamente. Nas amostras de vinho analisadas, o teor de 4-

FCUP


169

etilguaicol encontrado foi superior aos de 4-etilfenol. As concentrações de 4-

etilguaiacol determinadas variaram entre 0,46 e 1,23 mg L-1 e as de 4-etilfenol entre

0,19 e 1,11 mg L-1. A grande variabilidade no teor destes compostos em vinhos está

relacionada com a origem das uvas e o processo de produção utilizado, mas

geralmente os vinhos tintos possuem concentrações mais elevadas de 4-etilfenol e 4-

etilguaiacol do que os vinhos brancos [157].

Nos sumos e néctares de fruta as concentrações de 4-etilguaiacol determinadas

foram muito semelhantes entre as amostras. Por outro lado, o 4-etilfenol só foi

quantificado no néctar de manga. Nas amostras de bebidas não alcoólicas, a maior

concentração de 4-etilguaiacol foi obtida na amostra de refrigerante (0,19 mg L-1).

O eugenol foi quantificado em poucas amostras e em níveis de concentração muito

baixos (entre 0,032 e 0,052 mg L-1). Nas amostras analisadas a maior quantidade de

eugenol foi determinado nas duas amostras de vinho tinto. Os valores obtidos estão de

acordo com os valores típicos deste fenol em vinhos tintos [54].

A metodologia desenvolvida para a determinação de fenóis voláteis foi também

aplicada ao estudo da evolução do teor desses compostos ao longo do tempo de

armazenamento a 4 ºC. Para esse estudo foram recolhidas alíquotas das amostras em

estudo semanalmente, durante oito semanas.

As concentrações de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol, os fenóis presentes em maior

quantidade nas amostras, foram determinados ao longo das oito semanas de ensaio e

os resultados encontram-se na Fig. 15.5. Nas amostras de vinho analisadas o teor de

4-etilfenol manteve-se praticamente constante ao longo do tempo de armazenamento

enquanto para o 4-etilguaiacol se verificou um aumento, mais significativo nas

amostras de vinho tinto.

Nas cervejas analisadas verificou-se um grande aumento de 4-etilfenol nas duas

primeiras semanas de ensaio, seguido de um decréscimo da sua concentração até às

8 semanas. No caso do 4-etilguaiacol, o comportamento observado para as cervejas

Pilsner e preta foi distinto. Na cerveja Pilsner a concentração deste fenol diminuiu logo

durante a primeira semana até atingir valores muito semelhantes ao longo das

restantes semanas em que o ensaio decorreu. Na cerveja preta na primeira semana

houve um pequeno aumento da concentração de 4-etilguaiacol, seguido de uma

diminuição para valores de concentração próximos dos obtidos para a cerveja Pilsner.

170 FCUP


No néctar de pera não se registou praticamente nenhuma variação das

concentrações de 4-etilfenol, 4-etilguaiacol e eugenol mas curiosamente registou-se

um decréscimo na concentração de 4-etilfenol no néctar de manga nas duas primeiras

semanas. Por outro lado, nas duas amostras de sumo natural as concentrações de 4-

etilguaiacol aumentaram ao longo do tempo de armazenamento, especialmente a

partir da quarta semana. Os teores de 4-etilfenol variaram de forma diferente nestas

duas amostras analisadas. No sumo de laranja e maçã verificou-se um aumento de

concentração e para o sumo de maçã e cenoura registou-se um máximo na quarta

semana seguido de um decréscimo.

Fig. 15.5 – Concentrações de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol determinadas nas amostras de vinho, cerveja, néctares e

sumos de fruta ao longo do tempo de armazenamento a 4 ºC.

FCUP

171

16. Conclusões

A SALLE tem sido bastante utilizada para desenvolver metodologias analíticas

para aplicação em amostras biológicas, ambientais, plantas e alimentos como

alternativa à LLE clássica, devido ao baixo consumo de solventes e à utilização de

solventes orgânicos de elevada polaridade. Além disso, a metodologia de extração é

de fácil execução, não tem requisitos especiais em termos de equipamento e material

de laboratório e permite obter extratos diretamente compatíveis com diversas técnicas

analíticas, nomeadamente a LC em fase reversa. A utilização desta técnica tem vindo

a ser revigorada através da implementação da metodologia QuEChERS.

Neste trabalho o processo de SALLE foi estudado em misturas homogéneas de

acetonitrilo-água com o objetivo de aplicar esta técnica à extração de compostos

responsáveis por off-flavours em bebidas. Foram utilizadas soluções aquosas modelo

de compostos α-dicarbonílicos para estudar o efeito do tipo e concentração de sal e do

volume de fase extratora (acetonitrilo) na eficiência da extração. A fração de analitos

extraídos para a fase orgânica foi superior nos casos em que a separação em duas

fases líquidas foi mais eficiente. De acordo com estes resultados foi possível identificar

três grupos de sais com diferentes capacidades de salting-out e que estão

relacionados com o anião do sal: (1) cloretos e acetatos, (2) carbonatos e sulfatos

(exceto MgSO4) e (3) MgSO4. O aumento da concentração de sal foi testado para um

sal de cada um destes grupos (MgSO4, Na2CO3 e NaCl) verificando-se que o NaCl foi

o sal cuja variação de concentração mais afetou a quantidade de analitos extraída.

A aplicabilidade da SALLE foi testada através do desenvolvimento de uma

metodologia analítica para a determinação de compostos α-dicarbonílicos em

amostras de vinho e cerveja. A particularidade desta metodologia é a utilização de um

reagente derivatizante na solução extratora, que permitiu aumentar a eficiência da

extração dos analitos, para além de simplificar o procedimento experimental (evitando

que a derivatização seja realizada num passo experimental diferente). Nesta

metodologia verificou-se que a extração dos compostos α-dicarbonílicos foi afetada

pelo pH da amostra e que, por isso, é importante controlar este parâmetro na extração.

Foi também desenvolvida uma metodologia para a determinação de fenóis voláteis

em diversas bebidas, baseada no procedimento QuEChERS. O procedimento de

preparação da amostra divide-se em duas etapas: (1) a amostra é submetida a um

procedimento SALLE com acetonitrilo e (2) realiza-se uma limpeza do extrato orgânico

172 FCUP

Conclusões

obtido na primeira etapa por d-SPE. Dada a quase inexistência de metodologias de

extração de fenóis voláteis de bebidas para análise por LC, a metodologia

desenvolvida neste trabalho constitui uma proposta inovadora na preparação de

amostra com esse objetivo. A segunda etapa do procedimento de preparação de

amostra (a d-SPE) permite remover alguns compostos da matriz (pigmentos,

açúcares, lípidos, etc.) o que se revela útil para análises de rotina, de forma a prevenir

a degradação a longo prazo das colunas cromatográficas.

Parte IV

Propostas de trabalho futuro

FCUP

177

As metodologias analíticas desenvolvidas neste trabalho basearam-se em duas

técnicas de extração, a GDME e a SALLE, e tiveram como objetivo a determinação de

compostos voláteis responsáveis por off-flavours em bebidas. As metodologias

desenvolvidas permitiram expandir a aplicabilidade de ambas as técnicas a diferentes

amostras e analitos. Destaca-se a possibilidade de aplicar a GDME a analitos pouco

voláteis e de elevada solubilidade em água e a uma gama alargada de analitos com

diferentes propriedades físico-químicas. O estudo da SALLE permitiu explorar esta

técnica para a utilização em Química Analítica, nomeadamente para a extração de

analitos de amostras aquosas. Com este propósito, foi desenvolvida uma metodologia

baseada no procedimento QuEChERS. Este trabalho foi pioneiro dado que este

procedimento não tinha ainda sido aplicado na quantificação de compostos, para além

de pesticidas em amostras líquidas.

Tendo em conta as principais conclusões deste trabalho, sugere-se o seguinte:

Seria interessante explorar a técnica de GDME para a extração de analitos com

características semelhantes às do metilglioxal, ou seja, alguma volatilidade e

elevada solubilidade em água. Nalguns casos a determinação de compostos com

essas características pode ser também dificultada pela presença de outros

compostos da matriz. Por isso, a extração por GDME poderá permitir realizar uma

extração seletiva e evitar a extração de compostos interferentes não voláteis.

A GDME tem estado ainda limitada a um pequeno grupo de compostos (aldeídos,

cetonas e aminas). Será importante expandir a técnica a outros compostos, quer

de baixa quer de elevada volatilidade, usando outros agentes derivatizantes.

O desenvolvimento de metodologias para análise por GC seria um passo

importante para a técnica de GDME. O problema da transferência das aplicações

de LC para GC reside na necessidade de utilizar solventes orgânicos na solução

aceitadora para análise por GC. Assim, terá que se garantir que a membrana

utilizada seja impermeável a esses solventes para que os poros da membrana

estejam preenchidos só com ar. Só assim se garante que o processo de

transferência de massa ocorrerá por difusão gasosa. A existência cada vez maior

de membranas comerciais com diferentes características poderá facilitar o

desenvolvimento de aplicações com solventes orgânicos na fase aceitadora.

178 FCUP

Propostas de trabalho futuro

A aplicação da SALLE a amostras líquidas poderá ser explorada para muitos

outros analitos e a outras matrizes aquosas. A utilidade da SALLE na preparação

de amostras para a análise por LC ficou comprovada neste trabalho e, por isso,

poderá ser aplicada a muitos outros analitos com vantagens relativamente à LLE

clássica. Além disso, dadas as capacidades e características da técnica de SALLE,

designadamente a utilização de solventes orgânicos de elevada polaridade, poderá

ser interessante avaliar mais detalhadamente as vantagens da utilização destes

solventes na extração de compostos de diferentes polaridades.

Seria igualmente interessante explorar a aplicação da técnica para a preparação

de amostras para a análise por GC, nomeadamente por modificação do

procedimento QuEChERS, tal como foi feito para a determinação de fenóis

voláteis.

A aplicação do procedimento QuEChERS tem estado um pouco limitado ao

objetivo da sua criação, a extração de pesticidas de amostras sólidas. No entanto,

sendo a base do procedimento a SALLE, as possibilidades de extração de outros

compostos para além de pesticidas são muito grandes. Seria, por isso, importante

caracterizar melhor a técnica SALLE e o procedimento QuEChERS para o

desenvolvimento de novas aplicações para a determinação de diversos compostos

em matrizes sólidas.

FCUP

181

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fcup ao meu orientador, doutor josé antónio rodrigues ......fcup 3 agradecimentos ao meu...

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