1

António Manuel Ferreira de Gouveia

Tumores Mesenquimatosos do Tubo Digestivo

Estudo de parâmetros clínico-patológicos e de prognóstico, com especial ênfase nos Tumores Estromais Gastrointestinais

Dissertação de candidatura ao grau de Doutor

apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Fevereiro de 2011

2

3

Orientador: Prof. Doutor José Manuel Pedrosa Baptista Lopes Co-orientador: Prof. Doutor Silvestre Porfírio Ramos Carneiro

Artº 48, § 3º - A Faculdade não responde pelas doutrinas expandidas na dissertação (Regulamento

da Faculdade de Medicina do Porto, 29 de Janeiro de 1931, Decreto nº 19337)

4

5

JÚRI

Presidente: Reitor da Universidade do Porto

Vogais: Doutor Henrique Manuel Bicha Castelo, Professor Catedrático da Faculdade

de Medicina da Universidade de Lisboa;

Doutor José Manuel Pedrosa Baptista Lopes, Professor Associado da

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, e orientador da tese;

Doutor António Taveira Gomes, Professor Associado Convidado da

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto;

Doutor João António Pinto de Sousa, Professor Associado Convidado

da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto;

Doutor Rui Manuel Vieira Reis, Professor Auxiliar da Escola de Ciências da

Saúde da Universidade do Minho;

Doutora Ana Paula Soares Dias Ferreira, Professora Auxiliar da Faculdade

de Medicina da Universidade do Porto.

6

7

CORPO CATEDRÁTICO DA FACULDADE DE MEDICINA DO PORTO

Professores Catedráticos Jubilados ou Aposentados

Doutor Abel José Sampaio da Costa Tavares

Doutor Abel Vitorino Trigo Cabral

Doutor Alexandre Alberto Guerra de Sousa Pinto

Doutor Amândio Gomes Sampaio Tavares

Doutor António Augusto Lopes Vaz

Doutor António Carvalho Almeida Coimbra

Doutor António Fernandes da Fonseca

Doutor António Fernandes de Oliveira Barbosa Ribeiro Braga

Doutor António Germano Pina da Silva Leal

Doutor António José Pacheco Palha

Doutor António Luís Tomé da Rocha Ribeiro

Doutor António Manuel Sampaio de Araújo Teixeira

Doutor Belmiro dos Santos Patrício

Doutor Cândido Alves Hipólito Reis

Doutor Carlos Rodrigo de Magalhães Ramalhão

Doutor Cassiano Pena de Abreu e Lima

Doutor Daniel dos Santos Pinto Serrão

Doutor Eduardo Jorge da Cunha Rodrigues Pereira

Doutor Fernando de Carvalho Cerqueira Magro Gomes Ferreira

Doutor Fernando Tavarela Veloso

Doutor Francisco Sousa Lé

Doutor Henrique José Ferreira Gonçalves Lecour de Menezes

Doutor José Augusto Fleming Torrinha

Doutor José Carvalho de Oliveira

Doutor José Fernando de Barros Castro Correia

Doutor José Luís Medina Vieira

Doutor José Manuel da Costa Mesquita Guimarães

Doutor Levi Eugénio Ribeiro Guerra

Doutor Luís Alberto Martins Gomes de Almeida

Doutor Manuel Augusto Cardoso de Oliveira

Doutor Manuel Machado Rodrigues Gomes

Doutor Manuel Maria Paula Barbosa

Doutora Maria da Conceição Fernandes Marques e Magalhães

Doutora Maria Isabel Amorim de Azevedo

Doutor Mário José Cerqueira Gomes Braga

Doutor Serafim Correia Pinto Guimarães

Doutor Valdemar Miguel Botelho Santos Cardoso

Doutor Walter Friedrich Alfred Osswald

8

Professores Catedráticos Efectivos

Doutor Alberto Coimbra Sobrinho Simões

Doutor Manuel Mergulhão Castro Tavares

Doutora Maria Amélia Duarte Ferreira

Doutor José Agostinho Marques Lopes

Doutor Patrício Manuel Vieira Araújo Soares Silva

Doutor Daniel Filipe Lima Moura

Doutor Alberto Manuel Barros da Silva

Doutor José Manuel Lopes Teixeira Amarante

Doutor José Henrique Dias Pinto Barros

Doutora Maria Fátima Machado Henriques Carneiro

Doutora Isabel Maria Amorim Pereira Ramos

Doutora Deolinda Maria Valente Alves Lima Teixeira

Doutora Maria Dulce Cordeiro Madeira

Doutor Altamiro Manuel Rodrigues Costa Pereira

Doutor Rui Manuel Almeida Mota Cardoso

Doutor António Carlos Freitas Ribeiro Saraiva

Doutor Álvaro Jerónimo Leal Machado de Aguiar

Doutor José Carlos Neves da Cunha Areias

Doutor Manuel Jesus Falcão Pestana Vasconcelos

Doutor João Francisco Montenegro Andrade Lima Bernardes

Doutora Maria Leonor Martins Soares David

Doutor Rui Manuel Lopes Nunes

Doutor José Eduardo Torres Eckenroth Guimarães

Doutor Francisco Fernando Rocha Gonçalves

Doutor José Manuel Pereira Dias de Castro Lopes

Doutor Manuel António Caldeira Pais Clemente

9

À Graça, ao João, à Luísa e à Carolina

10

11

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Doutor José Manuel Lopes, meu orientador e principal impulsionador deste projecto, pela

amizade e pelo incentivo constantemente demonstrados. Pela transmissão do conhecimento

científico, compreensão e, acima de tudo, pelo elevado grau de exigência, o meu sincero

reconhecimento.

Ao Prof. Doutor Amadeu Pimenta, meu primeiro orientador e anterior Director de Serviço na

Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pela capacidade de transmitir, com generosidade e tolerância,

as aptidões técnicas e humanas ímpares que sempre soube ostentar. Pelo crescimento pessoal e

profissional, o meu profundo e eterno agradecimento.

À Dra. Olga Martinho, à Dra. Ana Gomes e ao Prof. Doutor Rui M. Reis, pela colaboração

empenhada e pela valiosa participação na elaboração dos trabalhos.

Ao Prof. Doutor Valdemar Cardoso e ao Prof. Doutor M. Cardoso de Oliveira, meus anteriores

Directores de Serviço na Cirurgia 4, Cirurgia B e Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pelo apoio

convicto do projecto e por sempre me terem incentivado na procura do conhecimento.

Ao Prof. Doutor Silvestre Carneiro, por ter aceitado incondicionalmente a co-orientação na fase

final dos trabalhos, agradeço a disponibilidade e o encorajamento.

Ao Dr. Costa Maia, meu actual Director de Serviço na Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pelo

estímulo e por me ter facultado as condições necessárias à conclusão deste projecto.

À Prof. Doutora Fátima Carneiro, Directora do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de S.

João, e ao Prof. Doutor Sobrinho Simões, Director do Serviço de Anatomia Patológica da

Faculdade de Medicina do Porto e do IPATIMUP, pelo acolhimento e pela forma como sempre

facilitaram o acesso aos meios necessários ao desenrolar dos trabalhos.

À Dra. Paula Silva, pela amizade e pela inestimável e sempre abnegada colaboração.

À Dra. Ana F. Capelinha, ao Dr. Dionísio de la Cruz e a todos os co-autores, pela valiosa

contribuição e partilha de ideias.

À Prof. Doutora Cristina Santos e ao Prof. Doutor Armando Teixeira-Pinto, pela ajuda preciosa na

análise dos dados.

Ao Dr. Sousa Rodrigues, ao Dr. Aníbal Liberal, ao Dr. Aníbal Justiniano, ao Dr. Bernardo

Bonifácio e ao Prof. Doutor Moutinho Ribeiro, pelo exemplo de competência e pela minha

iniciação em Cirurgia.

12

Aos elementos da Unidade Esófago-Gastro-Duodenal do Serviço de Cirurgia Geral, presentes e

passados, pelo apoio, colaboração e amizade dispensados.

A todos os meus colegas, especialistas e internos, do Serviço de Cirurgia Geral no Hospital de S.

João, pelo interesse e cooperação nas diferentes actividades desenvolvidas.

Às secretárias dos Serviços de Cirurgia B, de Cirurgia Geral e de Anatomia Patológica do Hospital

de S. João, pela dedicação e pelo auxílio sempre solícito.

À Novartis Oncology (Portugal), pelo financiamento de parte dos custos envolvidos na execução do

projecto, e ao Sr. José Seara, por toda a atenção dispensada.

O trabalho só foi possível devido à necessária disponibilização de meios por parte de várias

Instituições, das quais destaco: a Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, o Hospital de S.

João, E.P.E., o IPATIMUP e a Escola de Ciências da Saúde da Universidade do Minho. O meu

voto de gratidão pela hospitalidade e pelas condições de trabalho que sempre souberam

proporcionar.

Aos meus Pais, pelo modelo de trabalho e integridade que me souberam transmitir, e pelo apoio

emocional e dedicação de toda uma vida.

Aos meus irmãos e aos meus familiares pelo incentivo e pelo apoio incondicional recebido ao longo

dos anos.

Aos meus filhos, pela alegria que despertam e pela paciência revelada nos muitos momentos de

ausência do pai.

À minha mulher, que em todos os momentos sinto ao meu lado, pelo estímulo, a compreensão e o

carinho.

13

Ao abrigo do Art. 8º do Decreto-Lei nº 388/70 fazem parte integrante desta dissertação os

seguintes trabalhos publicados:

Gouveia AM, Pimenta AP, Capelinha AF, de la Cruz D, Silva P, Lopes JM. Surgical margin status

and prognosis of gastrointestinal stromal tumor. World J. Surg. 2008 Nov, Vol 32 (11): 2375-82.

Gouveia AM, Pimenta AP, Lopes JM, Capelinha AF, Ferreira SS, Valbuena C, Oliveira MC.

Esophageal GIST: Therapeutic implications of an uncommon presentation of a rare tumor. Dis. Esophagus 2005 Mar, Vol 18 (1): 70-73.

Gomes AL, Gouveia A, Capelinha AF, de la Cruz D, Silva P, Reis RM, Pimenta A, Lopes JM:

Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs: evaluation of a Portuguese series. J. Clin.

Pathol. 2008 Feb, Vol 61 (2): 203-8.

Martinho O, Gouveia A, Viana-Pereira M, Silva P, Pimenta A, Reis RM, Lopes JM. Low frequency

of MAP kinase pathway alterations in KIT and PDGFRA wild-type GISTs. Histopathology 2009 Jul, Vol 55 (1): 53-62.

Martinho O, Gouveia A, Silva P, Pimenta A, Reis RM, Lopes JM. Loss of RKIP expression is

associated with poor survival in GISTs. Virchows Arch. 2009 Sep, Vol 455 (3): 277-84.

Em cumprimento do disposto no referido Decreto-Lei declara que participou activamente na

recolha e estudo do material incluindo em todos os trabalhos, tendo redigido os textos com a activa

colaboração dos outros autores.

14

15

ÍNDICE

Resumo 17

Abstract 21

Abreviaturas 25

INTRODUÇÃO 29

1 - Epidemiologia 32

2 - Características patológicas 33

Macroscopia 33

Microscopia 33

3 - Alterações genéticas KIT e PDGFRA e vias de sinalização intracelular

33

4 - Alterações cromossómicas e do ciclo celular 37

5 - Marcadores imuno-histoquímicos no diagnóstico 38

6 - Diagnóstico diferencial 39

7 - Características clínicas 40

Apresentação clínica 40

GIST e neurofibromatose tipo I 41

GISTs pediátricos 41

GISTs associados com a tríade de Carney e com a díade de Carney (síndrome de Carney-Stratakis)

42

GISTs familiares 42

Procedimentos de diagnóstico e estadiamento 43

8 - Avaliação do risco biológico e estadiamento dos GISTs 44

Factores de prognóstico e avaliação do risco biológico 44

Estadiamento clínico dos GISTs 47

9 - O papel da análise molecular no prognóstico e no tratamento não-cirúrgico dos GISTs

48

10 - Tratamento 50

a) Doença primária localizada 50

Tumor residual microscópico (R1) 52

Cirurgia Laparoscópica 52

GIST primário localmente avançado 54

Tratamento adjuvante 55

Follow-up dos doentes 56

16

b) Doença recidivada e metastática 56

Eficácia e tolerabilidade do imatinib como terapêutica de 1ª linha 57

Resistência e progressão da doença nos doentes submetidos a tratamento de 1ª linha com imatinib

60

Avaliação da resposta ao tratamento 62

Tratamento cirúrgico pós-imatinib em doentes com GIST avançado metastático 63

c) Eficácia da terapêutica de segunda linha dirigida a alvos moleculares nos GISTs

64

Eficácia e tolerabilidade do sunitinib 65

A resposta ao sunitinib e o genótipo dos GISTs 67

Progressão da doença após tratamento com sunitinib 67

d) Opções terapêuticas após falência do tratamento dirigido a alvos moleculares

68

OBJECTIVOS 71

Objectivo geral 73

Objectivos específicos 73

MATERIAL E MÉTODOS 75

1 - Parâmetros clínicos e cirúrgicos 77

2 - Parâmetros anátomo-patológicos e imuno-histoquímicos 77

3 - Extracção de ADN 78

4 - Análise de mutações nos genes KIT e PDGFRA 78

5 - Análise de mutações na região 3’ do exão 11 do KIT e nos genes H-RAS, K-RAS, N-RAS e BRAF

79

6 - Análise da metilação no promotor do gene RKIP 79

7 - Follow-up e análise estatística 80

RESULTADOS 81

Trabalho I 83

Trabalho II 93

Trabalho III 99

Trabalho IV 109

Trabalho V 121

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 131

Perspectivas futuras 151

Referências 153

17

RESUMO

Introdução: Os tumores estromais gastrointestinais (GISTs) são os tumores mesenquimatosos

mais frequentes no tracto gastrointestinal (GI), constituindo ~1-3% das neoplasias malignas nesta

localização. A maioria dos GISTs é esporádica, mas há formas hereditárias, incluindo algumas

famílias com mutações germinativas nos genes KIT e PDGFRA. O diagnóstico deve ser

confirmado pelo estudo imuno-histoquímico dos tumores, integrado no contexto clínico e

morfológico. Os GISTs expressam geralmente CD117 (95%) e CD34 (70%). O comportamento

biológico é incerto e a classificação (incluindo > dimensão, índice mitótico e localização GI) em

categorias de risco é útil para prever o comportamento clínico dos GISTs. Caracterizam-se por

mutações activantes nos genes dos receptores tirosina-cinásicos KIT (até cerca de 85% dos casos)

ou PDGFRA (5-8%) nas células tumorais, sendo que 10-15% não apresentam mutações destes

proto-oncogenes (GISTs wild-type). A ressecção cirúrgica completa, sem linfadenectomia, é

considerada o tratamento padrão dos GISTs primários localizados (sem evidência de disseminação

peritoneal ou metastização à distância). A inibição KIT/PDGFRA com terapêuticas inibidoras

tirosina-cinásicas (imatinib e sunitinib) permite o controlo de GISTs inoperáveis e/ou metastáticos.

A resposta clínica objectiva ao imatinib e sunitinib parece depender da presença e do tipo de

mutações nos genes KIT e PDGFRA.

Objectivos: Estudar parâmetros clínico-patológicos, imuno-histoquímicos e moleculares numa

série de doentes consecutivos (1989-2006) com GIST, diagnosticados no Hospital de São João: (I)

analisar o valor prognóstico da qualidade das margens cirúrgicas no tratamento dos doentes com

GIST primário; (II) avaliar os procedimentos de diagnóstico de GIST no esófago (localização rara)

e rever as opções terapêuticas mais adequadas nesta localização; (III) avaliar o estado mutacional

dos genes KIT e PDGFRA e a sua correlação com as características clinico-patológicas, e com o

prognóstico dos doentes; (IV) identificar alterações moleculares alternativas em GISTs wild-type,

potencialmente úteis para o diagnóstico e preditivas de resposta a terapêuticas dirigidas a novos

alvos moleculares; e (V) avaliar a expressão de RKIP, a sua associação com parâmetros clínico-

patológicos, e esclarecer o papel deste marcador em doentes com GISTs primários.

Material e métodos: Foram reavaliados os registos clínicos e anátomo-patológicos de todos os

casos de GIST identificados (n=114). Foi avaliado todo o material anátomo-patológico disponível

em cortes corados por HE e o diagnóstico de GIST estabelecido de acordo com a classificação

OMS. Realizaram-se estudos imuno-histoquímicos em cortes representativos de cada tumor com o

método do complexo estreptavidina-biotina-peroxídase. Foram utilizados nos diversos trabalhos os

seguintes anticorpos: CD117, actina, desmina, proteína S100, CD34, fosfo-KIT, SCF, fosfo-ERK e

RKIP. As amostras para extracção de ADN foram obtidas por dissecção de áreas seleccionadas. O

estudo molecular incluiu as seguintes técnicas, consoante os trabalhos: amplificação por PCR ou

PCR-SSCP, seguida de sequenciação directa, e análise mutacional dos genes KIT, PDGFRA, H-

RAS, K-RAS, N-RAS, BRAF e RKIP. A análise da sobrevida global (SG), da sobrevida específica

(SE) e da sobrevida livre de recidiva (SLR) dos casos submetidos a cirurgia de ressecção (n=104) foi

realizada pelo método de Kaplan-Meier e com o teste Log rank. A associação entre variáveis clínico-

patológicas, moleculares e a recidiva do tumor foi analisada com o teste Qui-quadrado ou com o

teste exacto de Fisher. Na análise univariada foi utilizado o modelo de regressão de Cox

18

separadamente para cada variável. A análise multivariada foi efectuada com o modelo de riscos

proporcionais de Cox.

Resultados: (I) Obteve-se ressecção completa macroscópica (R0 ou R1) em 92,3% dos GISTs e

margens microscópicas negativas (R0) em 75% dos casos. A ressecção cirúrgica dos GISTs

primários associou-se a SE e SLR aos 5 anos de 87,7% e 89,8%, respectivamente. A taxa de recidiva

foi significativamente (p=0,045) menor nos casos R0. Na análise multivariada, apenas a presença de

tumor residual macroscópico (R2) se associou significativamente (p=0,013) a SE mais curta dos

doentes. (II) Diagnosticou-se um GIST esofágico de alto risco de agressividade, com expressão

CD117 e mutação no exão 11 do KIT (557del558). O caso (achado radiológico incidental, sem

biópsia prévia) foi submetido a esofagectomia transtorácica de tipo Ivor Lewis, que permitiu obter

margens R0. (III) 92% dos GISTs expressaram CD117, sem associação significativa entre essa

expressão e a presença de mutações do KIT. Nos 78 doentes com estudo molecular, observou-se

56,4% com mutações do KIT, 91% das quais no exão 11 e 9% no exão 9. A presença de mutações

do KIT associou-se a pior prognóstico e a sobrevida mais curta dos doentes (p=0,0460). Na análise

do PDGFRA identificou-se mutações em 6% dos casos (15% dos GISTs KIT wild-type), 80% (4/5)

das quais em tumores gástricos. Todos os GISTs com mutações do PDGFRA tinham expressão de

CD117. De todas as mutações resistentes ao imatinib, identificou-se a mutação D842V em 2 GISTs

desta série. (IV) Na reavaliação dos casos wild-type (n=29) identificaram-se 3 casos com duplicação

no exão 11, permitindo ajustar para 33% a percentagem efectiva de GISTs wild-type na nossa série.

Nos GISTs wild-type (n=26), identificou-se co-expressão do ligando (SCF) e do receptor KIT

(CD117) em ~65% dos casos e expressão de fosfo-KIT em ~30% dos casos com expressão de

KIT e SCF. Não se identificaram mutações do H-RAS, K-RAS ou N-RAS (via de sinalização

MAPK) nestes GISTs wild-type; identificou-se mutação activante V600E do gene BRAF num caso

(4%) de GIST wild-type. Não se identificou qualquer mutação do BRAF nos GISTs com mutações

do KIT ou do PDGFRA. A expressão de fosfo-ERK foi identificada em 30% dos casos wild-type e

em 50% dos tumores sem expressão de fosfo-KIT. (V) A ausência de expressão citoplasmática de

RKIP [8,5% (6/70) dos casos] associou-se significativamente com a presença de necrose (p=0,038)

e com SE mais curta (p=0,023) dos doentes. Observou-se uma tendência (não significativa) entre a

presença de expressão RKIP e a ausência de metastização. Não se identificou metilação do

promotor do RKIP nos 6 GISTs sem expressão de RKIP.

Conclusões: (I) Na nossa série de 104 GISTs submetidos a cirurgia de ressecção, obteve-se

ressecção macroscópica completa (R0 ou R1) do tumor em 92,3% dos casos. A SE e a SLR

observadas enquadram-se com os resultados de outros estudos publicados. A taxa de recidiva foi

significativamente menor nos casos R0, mas na análise multivariada apenas a ressecção R2 se

associou significativamente a sobrevida mais curta dos doentes. De acordo com as recomendações

de consenso actuais, os nossos resultados sublinham o valor prognóstico da ressecção

macroscópica completa dos tumores, com o objectivo de se obterem margens microscópicas

negativas e evitar a ruptura do tumor. (II) A opção terapêutica mais adequada para os GISTs do

esófago depende da confirmação diagnóstica prévia, da localização no esófago, da

dimensão/extensão loco-regional do tumor e do risco cirúrgico do doente. A esofagectomia,

seguindo os princípios oncológicos, e sem prejuízo da opção neoadjuvante, é o procedimento

cirúrgico indicado na maioria dos casos, para uma ressecção R0. (III) Descrevemos pela primeira

vez a frequência de mutações do KIT e do PDGFRA numa série de doentes portugueses com

19

GIST. A frequência global de mutações do KIT e do PDGFRA (63%) é concordante com os

resultados de outros estudos, especialmente em populações ibéricas. Foram identificadas mutações

do KIT em 56% dos casos e mutações do PDGFRA em 6% dos tumores. A presença de mutações

do KIT parece associar-se com sobrevida mais curta dos doentes. A grande maioria (91%) das

mutações activantes do KIT localiza-se no exão 11, indicando a possibilidade de resposta favorável

à terapêutica destes doentes com imatinib. (IV) Este estudo constitui uma análise compreensiva da

desregulação da via MAPK em GISTs wild-type (KIT e PDGFRA). Na ausência de mutações RAS

sugere-se que a via da MAPK pode ser activada através de mecanismos autócrinos/parácrinos de

SCF/KIT e/ou por mutação do BRAF num subgrupo de GISTs wild-type. As mutações activantes

V600E nos GISTs wild-type levantam a possibilidade de terapêutica com inibidores da cínase RAF

neste subgrupo de tumores. (V) Descreve-se pela primeira vez a associação significativa entre os

níveis de expressão tumoral de RKIP e parâmetros clínico-patológicos em doentes com GIST.

Verificou-se que a perda de expressão de RKIP num subgrupo de GISTs parece ser independente

da metilação do promotor, e associa-se significativamente a necrose tumoral e a sobrevida mais

curta dos doentes. A participação de RKIP na progressão tumoral e no desenvolvimento de

metástases sugere que este marcador pode ter potencial prognóstico, e pode permitir novas

abordagens terapêuticas específicas, baseadas na modulação da expressão de RKIP em doentes com

GIST.

Palavras-chave: GIST, tumor estromal gastrointestinal, GIST do esófago, margens cirúrgicas,

sobrevida, imuno-histoquímica, análise mutacional, KIT, PDGFRA, wild-type, MAPK, BRAF, RKIP.

20

21

ABSTRACT

Introduction: Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most common gastrointestinal tract

(GI) mesenchymal tumors, accounting for ~1-3% of all malignant neoplasms in this location. Most

GISTs are sporadic, but there are hereditary forms, including some families with germline KIT and

PDGFRA gene mutations. GIST diagnosis must be confirmed by immunohistochemistry of

tumors, and integrated with other clinical and morphological features. GISTs usually express

CD117 (95%) and CD34 (70%). Biological behavior is uncertain and classification (including largest

size, mitotic rate and GI site) in risk categories is useful for predicting clinical behavior of GISTs.

These tumors are characterized by oncogene mutations in KIT (up to ~85%) or PDGFRA (5-8%)

receptor tyrosine kinases (RTKs) genes; 10-15% does not harbor any of the aforementioned gene

mutations: so called wild-type GISTs. Complete surgical resection, without lymph node dissection,

is considered standard treatment for primary localized GISTs (without peritoneal dissemination or

metastatic disease). KIT/PDGFRA inhibition with tyrosine kinase inhibitors (imatinib and

sunitinib) may control inoperable and/or metastatic disease. The objective clinical response to

imatinib and sunitinib seems to be dependent on the presence and type of KIT and PDGFRA

mutation.

Objectives: Study of clinicopathological, molecular and immunohistochemistry parameters in a

series of consecutive (1989-2006) GIST patients, diagnosed at Hospital de S. João: (I) to analyze the

prognostic value of surgical margins status in the treatment of primary GISTs; (II) to evaluate

diagnostic procedures in esophageal GIST and review major therapeutic options for GISTs

occurring in this rare GI site; (III) to assess the mutational status of KIT and PDGFRA genes and

its correlation with clinicopathological parameters, and patient’s prognosis; (IV) to identify

alternative molecular alterations in wild-type GISTs, which may be useful for diagnosis and as

predictive markers of response with novel molecular targeted therapy; and (V) to evaluate RKIP

expression, its association with clinicopathological parameters, and clarify the role of this marker in

patients with primary GIST.

Material and methods: The clinical and pathological files of all identified GIST cases (n=114)

were reevaluated. All available pathological material was evaluated with H&E stained sections and

the diagnosis of GIST was established according to the WHO classification.

Immunohistochemistry analysis was performed in representative sections of each tumor using the

streptavidin-biotin-peroxidase complex method. The following antibodies were used in the study:

CD117, actin, desmin, S100 protein, CD34, phospho-KIT, SCF, phospho-ERK and RKIP.

Samples for DNA extraction were obtained by dissection of selected areas. The study included also

the following molecular techniques: PCR amplification or PCR-SSCP, followed by direct

sequencing, and mutational analysis of KIT, PDGFRA, H-RAS, K-RAS, N-RAS, BRAF and RKIP

genes. Overall survival (OS), disease-specific survival (DSS) and recurrence-free survival (RFS)

analysis in resection cases (n=104) were analyzed with the Kaplan-Meier method and Log rank test.

Association between clinicopathological, molecular parameters and tumor recurrence was analyzed

with Qui-square test or the Fisher exact test. The Cox regression model was used in the univariate

analysis of each variable. Multivariate analysis was performed with the Cox proportional hazards

model.

22

Results: (I) We obtained complete macroscopic resection (R0 or R1) in 92.3% of GISTs and

microscopic negative margins (R0) in 75% of cases. 5-year DSS and RFS was 87.7% and 89.8%,

respectively, after surgical resection of patient’s primary GIST. The recurrence rate was significantly

(p=0.045) lower in R0 cases. In the multivariate analysis, only the presence of macroscopic residual

tumor (R2) was significantly associated (p=0.013) with shorter DSS. (II) An esophageal high-risk

GIST was diagnosed, expressing CD117 and harboring a KIT mutation in exon 11 (557del558).

This case (a radiological incidental finding, without previous biopsy) underwent an Ivor Lewis

transthoracic esophagectomy, and R0 margins were obtained. (III) 92% of GISTs expressed

CD117, without significant association with KIT mutation status. Molecular analysis of 78 cases

disclosed 56.4% KIT mutations, 91% of which in exon 11 and 9% in exon 9. KIT mutated cases

associated with worst prognosis and shorter survival (p = 0.0460) of patients. PDGFRA analysis

disclosed mutations in 6% of the cases (15% of KIT wild-type GISTs), 80% (4/5) of which were

gastric. All GISTs with PDGFRA mutation displayed CD117 expression. Of all imatinib resistant

mutations, only D842V mutation was identified in 2 GISTs of the series. (IV) The reevaluation of

wild-type cases (n = 29) disclosed 3 cases with duplication in exon 11, allowing the adjustment to

33% of wild-type GISTs in our series. In wild-type GISTs (n = 26), co-expression of ligand (SCF)

and KIT receptor (CD117) was observed in ~65% of the cases, and the expression of phospho-

KIT in ~30% of the cases expressing KIT and SCF. No mutations of H-RAS, K-RAS or N-RAS

(MAPK signaling pathway) were identified in our wild-type GISTs; BRAF V600E mutation was

identified in a wild-type GIST case (4%). No BRAF mutation was observed in any KIT or

PDGFRA mutated GIST. Phospho-ERK expression was observed in 30% wild-type cases and in

50% of GISTs without phospho-KIT expression. (V) The absence of RKIP cytoplasmic

expression [8.5% (6/70) of the cases] was significantly associated with the presence of necrosis (p =

0.038) and shorter DSS (p=0.023) of patients. A trend (not significant) was observed between

RKIP expression and lack of metastases. RKIP promoter methylation was not identified in any of

the 6 GISTs lacking RKIP expression.

Conclusions: (I) In our series of 104 GISTs submitted to resection, complete macroscopic tumor

resection (R0 or R1) was obtained in 92.3% of cases. The DSS and RFS values in our patients fit

with results published in other studies. The recurrence rate was significantly lower in R0 cases, but

in multivariate analysis only R2 resection was significantly associated with shorter survival of

patients. According to the actual consensus recommendations, our results underline the prognostic

importance of complete macroscopic surgical tumor resection, with the aim of achieving negative

microscopic margins, and avoiding tumor rupture. (II) Most appropriate therapeutic option for

esophageal GISTs depends on prior diagnostic confirmation, location in the esophagus, tumor

size/loco-regional extension, and patient's performance status. An esophagectomy following

oncologic principles, considering neoadjuvant option, is the recommended surgical procedure to

achieve R0 resection in most cases. (III) We described for the first time KIT and PDGFRA

mutation frequency in a series of Portuguese GIST patients. The overall frequency of KIT and

PDGFRA mutations (63%) is consistent with results from other studies, namely in Iberian patients.

KIT mutations were identified in 56% and PDGFRA mutations in 6% of our GISTs. The presence

of KIT mutation seems to associate with shorter survival of patients. The large majority (91%) of

KIT mutations were in exon 11, indicating a favorable response to imatinib therapy. (IV) Our study

represents a comprehensive analysis of MAPK pathway deregulation in (KIT and PDGFRA) wild-

23

type GISTs. The observed absence of RAS mutations suggests that MAPK pathway may be

activated by SCF/KIT autocrine/paracrine mechanisms and/or by BRAF mutation in a subset of

wild-type GISTs. V600E mutation in wild-type GISTs raises the possibility of RAF kinase inhibitor

therapy in this sub-group of patients. (V) We described for the first time a significant association

between RKIP tumor expression level and clinicopathological parameters in GIST patients. Loss of

RKIP expression in a subgroup of GISTs seems to be independent of promoter methylation, and

associates significantly with tumor necrosis and shorter survival of patients. RKIP role in tumor

progression and metastases development suggests that this marker may hold a potential prognostic

value, and may allow new targeted therapy based on the modulation of RKIP expression in GIST

patients.

Key-words: GIST, gastrointestinal stromal tumor, esophageal GIST, surgical margins, survival,

immunohistochemistry, mutational analysis, KIT, PDGFRA, wild-type, MAPK, BRAF, RKIP.

24

25

LISTA DE ABREVIATURAS

ABL Proto-oncogene Abelson

ACOSOG American College of Surgeons Oncology Group

ADN Ácido desoxirribonucleico

AFIP Armed Forces Institute of Pathology

AGITG Australasian Gastro-Intestinal Trials Group

AIO German Working Group on Medical Oncology

ALK Anaplastic lymphoma kinase

ARG Arginase

ATP Adenosina trifosfato

BCR-ABL Fusion protein, product of Breakpoint cluster region - Abelson oncogene

B-Raf; BRAF Serine/threonine-protein kinase B-raf; proto-oncogene que codifica B-Raf

c-FMS Proto-oncogene que codifica CSF-1R

CGA Campo de grande ampliação

CIC Célula intersticial de Cajal

CpG Cytosine-phosphate-guanine

CSF-1R Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor (product of FMS proto-oncogene)

DAB Diaminobenzidina

DE Doença estável

dNTP Desoxirribonucleotídeo-trifosfato

DOG 1 Discovered on GIST-1; TMEM16A

EC Extracelular

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EMA European Medicines Agency

EORTC European Organization for Research and Treatment of Cancer

ERK Extracellular signal-regulated kinase

ESMO European Society for Medical Oncology

EUA Estados Unidos da América

FDA Federal Drug Administration

FGFR3 Fibroblast growth factor receptor 3

FLT3 FMS-like tyrosine kinase 3 receptor

GFAP Glial fibrillary acid protein

GI Gastrointestinal

GIST Gastrointestinal stromal tumor

HE; H&E Hematoxilina-eosina; hematoxylin-eosin

HR Hazard ratio

HSP-90 Heat shock protein 90

ISG Italian Sarcoma Group

ITC Inibidor tirosina-cinásico

JM Justamembranar

26

KIT; KIT Receptor tirosina-cinásico KIT; proto-oncogene KIT

LMC Leucemia mielóide crónica

MAPK MAP kinase; mitogen-activated protein kinase

MDE Mutation detection enhancement

MEK MAPK/ERK kinase

MSKCC Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

MSP Methylation-specific PCR

mTOR Mammalian target of rapamycin

NCCN National Comprehensive Cancer Network

NF1 Neurofibromatose tipo 1

NFkB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NIH National Institutes of Health

NS Não significativo

OMS Organização Mundial de Saúde

p16INK4A Cyclin-dependent kinase (cdk) 4A inhibitor

p27KIP1 Cyclin / cdk complexes inhibitor

pb pares de bases

PCR Polymerase chain reaction (reacção de polimerização em cadeia)

PDGFA Platelet-derived growth factor A

PDGFRA e -B Platelet-derived growth factor receptor-α and -β

PDGFRA e -B Proto-oncogenes PDGFRA e –B

PERSIST Post-resection Evaluation of Recurrence-free Survival for GastroIntestinal Stromal Tumors

PET Tomografia por emissão de positrões

PET-FDG Tomografia por emissão de positrões com 18-fluordesoxiglicose

PFI Pólipo fibróide inflamatório

PI3K-Akt Phosphatidylinositol 3 kinase - protein kinase B

R0 /R1 /R2 Ressecção R0 /R1 /R2

RAF; RAF Serine/threonine-protein kinase; proto-oncogene RAF

RAS Proto-oncogene RAt Sarcoma

RC Resposta completa

RECIST Response Evaluation Criteria in Solid Tumors

RET Glial cell-line derived neurotrophic factor receptor (rearranged during transfection)

RKIP; RKIP Raf kinase inhibitory protein; proto-oncogene RKIP

RMN Ressonância magnética nuclear

RP Resposta parcial

RTK Receptor tirosina-cinásico

SCF Stem cell factor (factor de crescimento de células estaminais)

SDH; SDH Succinato-desidrogenase; proto-oncogene que codifica SDH

SE Sobrevida específica

SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results

SG Sobrevida global

27

SLP Sobrevida livre de progressão

SLR Sobrevida livre de recidiva

SMA α-smooth muscle actin

SRC Non-receptor tyrosine kinase SRC family

SSCP Single strand conformational polymorphism

SSG Scandinavian Sarcoma Group

STAT Signal transducer and activation of transcription

STBSG Soft Tissue and Bone Sarcoma Group

SWOG Southwest Oncology Group

TC Tomografia computadorizada

TK 1 e 2 Domínios tirosina-cinásicos 1 e 2

TGM Tumor-grade-metastasis (staging system)

TMBNP Tumor maligno da bainha dos nervos periféricos

TNM Classificação TNM de Tumores Malignos

TPT Tempo para progressão do tumor

TSH Hormona tireo-estimulante

UICC Union for International Cancer Control

VEGF Vascular endothelial growth factor

VEGFR Vascular endothelial growth factor receptor

28

29

INTRODUÇÃO

30

31

INTRODUÇÃO

Os tumores estromais gastrointestinais (GISTs) são os tumores mesenquimatosos mais comuns do

tracto gastrointestinal (GI), correspondendo a cerca de 1-3% das neoplasias malignas nesta

localização. Ocorrem preferencialmente no tubo digestivo, embora também possam ser

diagnosticados noutras localizações, como o epíploon ou mesentério. Durante décadas, antes do

final dos anos 90, os tumores mesenquimatosos do tracto GI eram frequentemente classificados

como tumores do músculo liso ou tumores das bainhas nervosas1. Quando apresentavam

características de células de músculo liso na microscopia, eram classificados como leiomiomas ou

leiomiossarcomas2, 3. Mais recentemente, tornou-se evidente que os GISTs são uma entidade

independente, sendo os sarcomas mais comuns do tracto GI4, 5.

A designação “tumor estromal” foi utilizada pela primeira vez em 1983 por Mazur e Clark4. No

entanto, esta designação não foi amplamente aceite até ao início dos anos 90, quando o CD34 foi

identificado como marcador relativamente específico dos tumores estromais GI6.

Em 1998, Hirota et al. descreveram a existência de mutações activantes no gene do receptor

tirosina-cinásico KIT nas células tumorais, bem como a expressão imuno-histoquímica da proteína

KIT em GISTs7. O gene KIT codifica um receptor trans-membranar para o factor de crescimento

de células estaminais — SCF (stem cell factor); o componente intracitoplasmático do receptor tem

funções tirosina-cinásicas8. Em 2003, Heinrich et al.9 descreveram mutações no gene do receptor α

do factor de crescimento derivado de plaquetas — PDGFRA (platelet-derived growth factor receptor-α),

que constituem eventos patogénicos alternativos e mutuamente exclusivos em GISTs sem

mutações KIT. Actualmente, até cerca de 85% dos GISTs têm mutações activantes no gene KIT e

5-8% mutações no PDGFRA, sendo que 10-15% dos casos não apresentam mutações destes proto-

oncogenes (GISTs wild-type), podendo no entanto ter expressão de KIT9-12. A expressão de KIT

(com o anticorpo CD117) nas células tumorais é um método fiável e sensível no diagnóstico dos

GISTs13-15.

Há semelhanças morfológicas entre as células dos GISTs e as células intersticiais de Cajal (CIC),

que são células localizadas designadamente em torno dos plexos mioentéricos do tracto GI,

pacemakers das contracções peristálticas7, 16. As CIC expressam KIT e dependem do SCF para o seu

desenvolvimento17, 18. Aceita-se que os GISTs têm origem em células intersticiais de Cajal ou em

células estaminais precursoras das CIC7, 13, 19, 20.

No passado, os GISTs com comportamento maligno eram reconhecidamente os sarcomas mais

resistentes ao tratamento convencional, com <10% de respostas clínicas após quimioterapia e/ou

radioterapia21, 22. Em 2001, Joensuu et al.23 descreveram que o mesilato de imatinib (Glivec

/Gleevec®; Novartis Pharmaceuticals, Basileia Suíça) era eficaz no tratamento do GIST. O

imatinib, um inibidor dos receptores tirosina-cínase KIT e PDGFRΑ, é o tratamento padrão de 1ª

linha em GISTs irressecáveis e/ou metastáticos KIT-positivos24, 25. Mais de 80% dos doentes

32

beneficiam da terapêutica com este inibidor tirosina-cinásico e a mediana do tempo de sobrevida do

GIST metastático atinge actualmente ~5 anos26, 27.

Os GISTs inoperáveis e/ou metastáticos são doenças controláveis, estando em fase de ensaio

clínico nos últimos anos um número considerável de estudos com novos fármacos alternativos28. O

avanço no conhecimento da biologia do GIST e a excelente resposta alcançada nos GISTs com o

imatinib revelou-se um paradigma na terapêutica molecular dos tumores sólidos, proporcionando

novos desafios para o esclarecimento das vantagens e limitações das designadas terapêuticas

dirigidas contra alvos moleculares.

1 - Epidemiologia

A incidência do GIST nos EUA e na Europa é difícil de determinar, considerando que só

recentemente foram generalizadamente reconhecidos e diagnosticados uniformemente como grupo

individualizado. Os resultados do programa de vigilância epidemiológica SEER (Surveillance,

Epidemiology, and End Results) do National Cancer Institute de 1995 dos Estados Unidos da América

(EUA) indicam 500-600 casos novos de GIST diagnosticados anualmente nos EUA29. Mais

recentemente, estudos de base populacional realizados na Suécia30, Holanda31 e Islândia32,

descrevem incidências de aproximadamente 14,5, 12,7 e 11 casos/milhão/ano, respectivamente.

Estes resultados permitem estimar a incidência anual na Europa em ~8.000-9.000 casos e nos EUA

em ~4.000-5.000 casos /ano. No entanto, como muitos dos doentes sobrevivem períodos longos,

a prevalência do GIST pode ser superior. Por outro lado, estes dados correspondem apenas a

tumores detectados clinicamente, excluindo um número muito provavelmente substancial de

micro-GISTs (< 1 cm), que apenas são detectados na autópsia ou, por exemplo, em gastrectomias

realizadas por outras causas. Um estudo alemão em autópsias consecutivas identificou micro-GISTs

(1-10 mm) em 22,5% de indivíduos com idade > 50 anos33. Os micro-GISTs expressam KIT e têm

geralmente mutação oncogénica no gene KIT ou PDGFRA. Resultados semelhantes têm sido

publicados por outros grupos34-37. Estes estudos sugerem que os micro-GISTs não progridem

habitualmente (ou progridem muito lentamente) para tumores de grandes dimensões, com sintomas

/sinais clínicos12.

Embora os GISTs ocorram em doentes de todas as idades, aquando do diagnóstico a maioria tem

idade compreendida entre os 40-80 anos, com uma mediana de 60 anos27. Têm incidência idêntica

em ambos os géneros38, embora algumas séries descrevam um ligeiro predomínio no género

masculino27. Ocorrem raramente em crianças e adultos jovens. Os GISTs pediátricos são

considerados um grupo clínico-patológico independente, com características distintas, e são

diagnosticados predominantemente na segunda década de vida16, 39, 40.

A maioria dos GISTs é esporádica, mas foram descritas algumas famílias com mutações

germinativas nos genes KIT41-49 e PDGFRA45, 50 e GISTs hereditários. Os doentes com síndromes

hereditários como a neurofibromatose tipo I 51-53, a tríade de Carney (GIST gástrico, paraganglioma

e condroma pulmonar)54 e a díade de Carney (paraganglioma, GIST gástrico)48 podem cursar com

GISTs.

33

2 - Características patológicas

Macroscopia

Os GISTs têm grande variedade morfológica na maioria das localizações, podendo ser

diagnosticados como pequenos tumores incidentais ou tumores com grandes dimensões.

Apresentam-se muitas vezes como nódulos bem circunscritos e muito vascularizados,

particularmente na localização gástrica ou intestinal. Os GISTs de menor dimensão são

habitualmente nódulos subserosos, intramurais ou, com menor frequência, polipóides intraluminais;

os de maior dimensão desenvolvem-se geralmente com crescimento extraparietal e por vezes

pediculado55. Ao corte, têm um aspecto carnudo, róseo ou branco-acastanhado e, nos casos de

maior dimensão, podem ter áreas hemorrágicas, císticas ou necróticas.

Microscopia

As características microscópicas dos GISTs variam com o órgão envolvido55 e classificam-se

geralmente em três subtipos de morfologia celular: fusiforme (70%), epitelióide (20%) ou misto

(fusiforme e epitelióide)1. Nos GISTs de células fusiformes, as células têm citoplasma fibrilar

eosinofílico claro, núcleo ovóide, e limite celular mal definido, muitas vezes com aspecto sincicial.

As células tumorais dispõem-se em feixes, que se entrecruzam, ou em novelos. As células

fusiformes podem ter núcleos em paliçada ou vacuolização paranuclear proeminente que, apesar de

sugestiva de fenótipo muscular liso, é muito comum nos GISTs. Os GISTs epitelióides são

compostos por células arredondadas com citoplasma eosinofílico ou claro, organizadas em toalhas e

ninhos. Cerca de 10% dos GISTs são mistos. Os GISTs têm geralmente estroma escasso e

morfologia celular uniforme, com núcleos de cromatina fina e nucléolos aparentes56. A celularidade

é variável e a matriz extracelular pode ser esclerótica, colagenosa ou mixóide. Ocasionalmente

podem ser pleomórficos55 ou desdiferenciados57.

Após tratamento com inibidores tirosina-cinásicos, podem ter diminuição substancial da

celularidade tumoral e esclerose acentuada ou transformação mixóide do estroma. Na maioria dos

casos, a morfologia celular mantém-se idêntica à do tumor original. No entanto, após tratamento

com estes agentes, têm sido descritos casos de modificação da morfologia celular fusiforme para

epitelióide, padrão epitelióide pseudopapilar58 e, muito raramente, diferenciação

rabdomiossarcomatosa59. Estas alterações podem dificultar o diagnóstico, especialmente quando o

tumor também perde expressão de KIT. Nestes casos, a análise mutacional pode esclarecer o

diagnóstico porque os tumores podem manter a mutação do KIT ou do PDGFRA58, 59.

3 - Alterações genéticas KIT e PDGFRA e vias de sinalização intracelular

Os genes KIT e PDGFRA localizam-se no braço longo do cromossoma 4 (4q11-q12)60. Codificam

receptores tirosina-cinásicos (RTK) de tipo III que partilham características estruturais idênticas.

34

São compostos por uma região extracelular (EC) para interacção com o ligando, uma região

transmembranar, um domínio justamembranar (JM) e dois domínios cinásicos citoplasmáticos

(TK1: bolsa de ligação ao ATP; e TK2: ansa de activação cinásica) (Fig. 1)61, 62.

Fig. 1: Representação esquemática dos receptores tirosina-cinásicos KIT e PDGFRA e distribuição das mutações mais frequentes nos GISTs9-12.

Os receptores KIT e PDGFRA são normalmente activados pela ligação dos respectivos ligandos —

o ligando KIT (SCF/stem cell factor; mast cell growth factor; Steel factor) e o ligando PDGFA. A ligação de

SCF na região EC resulta na homodimerização do receptor e na sua activação cinásica. A

consequente auto-fosforilação do receptor (KIT/PDGFRA) ocorre nos vários resíduos de tirosina

JM e citoplasmáticos. Estes resíduos fosforilados servem de pontos de ligação a diversas moléculas

de sinalização secundária, activando cascatas de fosforilação e activação de substratos com funções

de regulação da proliferação, diferenciação, adesão e sobrevivência ou apoptose celular63-67 (Fig. 2).

A actividade tirosina-cinásica do receptor é regulada pelo domínio JM, que, na ausência de activação

pelo ligando, tem função inibidora68. A activação do KIT pode regular funções celulares

fundamentais para o desenvolvimento e manutenção de vários tipos celulares, designadamente

células germinativas e hematopoiéticas, mastócitos, melanócitos e células intersticiais de Cajal65, 69.

Uma mutação com ganho-de-função no gene KIT ou PDGFRA desencadeia sinalização oncogénica

constitucional, ou seja, sem necessidade da acção dos respectivos ligandos. A desregulação da

actividade tirosina-cinásica do receptor resulta na activação de vias de sinalização PI3K-Akt

(phosphatidylinositol 3 kinase - protein kinase B), MAPK (mitogen-activated protein kinase; RAS/RAF/MEK)

e, num nível relativamente mais baixo de activação, da via STAT (signal transducer and activation of

transcription; STAT1, STAT3)63, 67, 70-73. A activação destas vias de sinalização intracelular condiciona

alterações no ciclo celular, na translação de proteínas, no metabolismo e na apoptose celular (Fig.

35

2). Estudos efectuados em extractos tecidulares de GISTs descreveram grande variação no grau de

activação das diferentes vias de sinalização KIT. O melhor esclarecimento das vias de sinalização

Fig. 2: Vias de sinalização intracelular dependentes da activação dos receptores KIT e PDGFRA10, 63, 64.

envolvidas na patogénese dos GISTs poderá ser útil no estabelecimento de novas estratégias para o

tratamento dos doentes com GIST avançado10, 71, 74-76.

As mutações activantes do KIT ocorrem noutras neoplasias: mastocitose77, tumores de células

germinativas78, leucemia mielóide aguda79 e neuroblastoma80. Foram descritas mutações activantes

do KIT, semelhantes às descritas em GISTs, num subgrupo de melanomas malignos das

extremidades (pele) e das mucosas81.

A maioria dos GISTs tem mutações activantes dos receptores tirosina-cinásicos KIT (~75-85%) ou

PDGFRA (~5-8%). Contudo, uma proporção de GISTs (10-15%) não tem quaisquer mutações do

KIT ou do PDGFR (GISTs wild-type)9-12, 82.

As mutações nos genes KIT e PDGFRA são mutuamente exclusivas83. As mutações alteram duas

regiões principais: os domínios reguladores EC (domínio de dimerização) e JM, e os domínios

enzimáticos tirosina-cinásicos intracitoplasmáticos (TK1 e TK2). As mutações no domínio JM

alteram a função auto-inibitória e causam activação cinásica84, 85 e as mutações na região EC causam

dimerização do receptor independente do ligando9.

36

A maioria das mutações do gene KIT ocorre no exão 11 (domínio JM) — 57-70%, e no exão 9

(domínio EC) — 5-18%9, 11, 86-91. As mutações KIT primárias também podem ocorrer no exão 13

(TK1: bolsa de ligação do ATP) e no exão 17 (TK2: ansa de activação cinásica), mas são raras

(<2%) e os dados disponíveis limitados9, 11, 70, 87, 88, 90, 92. As mutações descritas no gene PDGFR

envolvem os exões 12, 14 e 18, e correspondem às mutações homólogas nos exões 11, 13 e 17 do

gene KIT, respectivamente. Em > 90% dos casos, as mutações do PDGFRA ocorrem nos codões

842-849 do exão 18, sendo a substituição D842V a mutação mais frequente (62,6%)11, 83.

Mais de uma década de estudos sobre as mutações do KIT e do PDGFRA nos GISTs indica que

algumas das mutações podem associar-se a características histopatológicas bem definidas, e que há

grande variação de mutações em GISTs de localizações gastrointestinais diferentes, “benignos” e

“malignos”75, 90, 93.

Os GISTs com mutação no exão 11 do gene KIT podem ocorrer em todo o tracto GI. Vários tipos

de mutações podem ser observadas neste exão, mas as delecções são as alterações mais

frequentemente descritas. As delecções, delecções-inserções e substituições de nucleotídeo no exão

11 foram descritas em GISTs do esófago ao ânus38, 94-98. O impacto prognóstico das mutações de

genes de RTKs foi avaliado em diversos estudos retrospectivos, mas persiste controvérsia

relativamente ao significado prognóstico das mutações do KIT no exão 11 dos GISTs. Alguns

estudos descreveram que as mutações neste exão eram mais comuns nos tumores de maior

dimensão, com índice mitótico mais elevado, sem nenhuma relação entre os diferentes tipos de

mutações KIT neste exão e a morfologia celular, e que se associavam a evolução clínica “maligna”99,

100. Outros autores sugeriram que as mutações podiam ser detectadas tanto em tumores “malignos”

como “benignos” e clinicamente indolentes36, 70. Estudos mais recentes sugeriram que os diferentes

tipos de mutações no exão 11 podem correlacionar-se com a evolução clínica dos tumores75. Os

GISTs gástricos com delecções neste exão parecem ter tendência para cursar, na ausência de

tratamento com imatinib, com um comportamento clínico mais agressivo do que os tumores com

substituições de um nucleotídeo38. No entanto, a associação a comportamento biológico mais

agressivo das delecções nos codões 557-558 do exão 11 descrita por diversos autores não foi

confirmada em estudos recentes 10, 101-103.

Os GISTs com mutação no exão 9 ocorrem mais frequentemente no intestino delgado. Na maioria

dos casos, as mutações caracterizam-se pela inserção de seis pares de bases, a duplicação de alanina

e tirosina, e ocorrem quer em tumores primários quer em GISTs recidivados e/ou avançados89, 103.

Os tumores com duplicações no exão 9 têm sido associados a evolução “maligna”86, 96, 104, 105. No

entanto, um estudo de GISTs do intestino delgado com mutações no exão 9 não descreveu

diferenças significativas na evolução clínica quando comparada com a de tumores com mutações no

exão 1196.

Os GISTs com mutações nos exões 13 e 17 do KIT são ligeiramente mais prevalentes em

localização intestinal. Estas mutações não parecem ter impacto nas características clínico-

patológicas dos tumores, quando comparadas com os restantes tipos de GIST nesta localização.

GISTs com mutação no exão 13 localizados no estômago tendem a ser algo maiores e mais

agressivos do que os GISTs gástricos sem esta mutação104.

37

As mutações no gene PDGFRA ocorrem principalmente (∼6-7%) no exão 18 (TK2: ansa de

activação cinásica) e no exão 14 (TK1: bolsa de ligação ATP), sendo raramente identificadas no

exão 12 justamembranar (~1%)11, 12, 72, 83, 106-108. As mutações nos exões 14 e 18 do PDGFRA são

sobretudo mutações missense. Os GISTs com mutações do PDGFRA predominam no estômago,

têm morfologia epitelióide, estroma mixóide e pleomorfismo nuclear11, 106-109. Este subgrupo

associa-se a comportamento clínico geralmente “benigno” e ausência de expressão KIT106, 107, 110-112.

Os GISTs com a mutação D842V no exão 18 do PDGFRA são resistentes ao tratamento com

imatinib e sunitinib9, 83, 87, 113.

Mais recentemente, foram também descritas mutações no exão 15 de BRAF (gene que codifica

serine/threonine-protein kinase B-raf) em 5-13% dos GISTs wild-type de adultos114-116.

Os GISTs têm diferentes tipos de mutações nos genes KIT e PDGFRA e diferenças nas

“assinaturas moleculares” da expressão génica que podem explicar a complexidade biológica e a

variabilidade da resposta ao tratamento com inibidores tirosina-cinásicos dos doentes com estes

tumores117.

4 - Alterações cromossómicas e do ciclo celular

As mutações do KIT ou do PDGFRA são eventos precoces no desenvolvimento dos GISTs. A

ocorrência de mutação é independente da dimensão do tumor. Observam-se em tumores

incidentais microscópicos, múltiplos e "silenciosos", detectados em gastrectomias realizadas por

outras causas, e em 10-20% dos indivíduos com idade > 60 anos, sem diagnóstico clínico de

GIST34, 35. Estas evidências sugerem que as mutações estão envolvidas na oncogénese e na

proliferação dos tumores, mas que não parecem ser decisivas para a transformação “maligna” dos

GISTs36. A progressão clínica dos GISTs depende de eventos genéticos adicionais.

Nos estudos citogenéticos foram descritos desarranjos dos cromossomas 14 e 22. Cerca de dois

terços dos GISTs mutantes KIT e PDGFRA têm monossomia no cromossoma 14 ou perda parcial

de 14q72, 118, 119. Duas regiões de 14q, 14q11.2–q12 e 14q23–q24, parecem incluir genes de supressão

tumoral importantes para o desenvolvimento precoce dos GISTs118-120. A perda do braço longo do

cromossoma 22 (22q) foi descrita em ~50% dos casos. Esta alteração associa-se a progressão para

comportamento biológico intermédio /”borderline” ou” maligno” dos GISTs 118, 121-123.

Os doentes pediátricos ou adultos com GISTs sem mutações KIT ou PDGFRA têm progressão

citogenética insignificante quando comparados com a dos doentes com GISTs com mutações16, 124,

sublinhando o facto de que os mecanismos que levam à progressão tumoral são diferentes em

GISTs com mutação e em GISTs wild-type.

O gene supressor tumoral CDKN2A (p16INK4A) localizado no cromossoma 9p é inactivado através

de vários mecanismos numa percentagem significativa de GISTs “malignos”125-129. A delecção, a

38

mutação e a metilação do promotor contribuem para a diminuição da expressão de p16, que é um

inibidor do ciclo celular. Os resultados de estudos imuno-histoquímicos descrevem uma correlação

significativa com o comportamento agressivo, mesmo em tumores de baixo risco127-129.

Outro inibidor do ciclo celular, o p27KIP1, é frequentemente activado nos GISTs “malignos”, mas a

associação com a progressão tumoral não foi confirmada consistentemente128, 130, 131. Embora a

expressão destes marcadores indique uma tendência para a associação com comportamento

biológico de alto risco ou “maligno”, nenhum deles parece ser factor de risco independente em

análise multivariada.

5 - Marcadores imuno-histoquímicos no diagnóstico

O diagnóstico anátomo-patológico de GIST resulta da integração de dados morfológicos com os

do estudo imuno-histoquímico, num contexto clínico adequado. Os GISTs expressam CD117/KIT

(95%) e frequentemente CD34 (70%).

A expressão do KIT tem elevada especificidade e sensibilidade no diagnóstico diferencial dos

GISTs com os tumores mesenquimatosos do tracto GI7, 13, 15, 20. Podem ser observados padrões

diferentes de expressão KIT15. A maioria dos GISTs tem expressão citoplasmática forte e difusa do

KIT (Fig. 3A), que muitas vezes se associa a padrão paranuclear (tipo dot). A extensão e o padrão da

expressão KIT não se correlacionam com o tipo de mutação do KIT nem são preditivos da resposta

aos inibidores tirosina-cinásicos.

Fig. 3: Expressão imuno-histoquímica de CD117/KIT (A) e de DOG1 (B) em GISTs de células fusiformes.

Estudos recentes descrevem a existência de um subgrupo de aproximadamente 4-5% de GISTs que

não expressam CD117 — designados como GISTs KIT-negativos106, 107. Os GISTs com expressão

KIT fraca ou focal, bem como os GISTs sem expressão do KIT, podem corresponder a tumores

KIT wild-type (sem mutações KIT/PDGFRA) ou com mutações do PDGFRA106, 107. Ocorrem

preferencialmente no estômago e epíploon e com morfologia epitelióide ou mista.

39

Nos últimos anos surgiram novos anticorpos usados no diagnóstico do GIST. Estes marcadores

foram identificados sobretudo através de estudos moleculares e têm despertado interesse no estudo

do subgrupo de GISTs KIT-negativos.

O marcador mais relevante deste grupo é o DOG 1 (discovered on GIST-1) (Fig. 3B), também

conhecido como TMEM16A, uma proteína trans-membranar de função desconhecida, descoberta

através de análise de expressão génica132. Vários estudos publicados descreveram que os anticorpos

anti-DOG 1 têm maior sensibilidade e especificidade do que o CD117 e o CD34, e que este

anticorpo pode ser um marcador imuno-histoquímico específico de GIST, independentemente da

existência de mutações KIT/PDGFRA ou da expressão KIT132-135. Os diferentes anticorpos

monoclonais recentemente desenvolvidos para DOG 1 (ex: DOG 1.1; K9)133, 135 podem ser

marcadores válidos na prática, particularmente no diagnóstico diferencial entre GISTs KIT-

negativos e outros sarcomas24, 136-138.

Cerca de 1/3 dos GISTs KIT-negativos expressa DOG 1, sendo que os restantes 2/3, apesar de

morfologia típica, continuam a ser difíceis de classificar no estudo imuno-histoquímico134.

Dependendo da morfologia histológica, o diagnóstico de GIST KIT-negativo pode ser

problemático. A análise das mutações nos genes KIT e PDGFRA pode confirmar em definitivo o

diagnóstico de GIST, não só em casos que apresentem morfologia equívoca, mas também nos

GISTs sem expressão de CD117 e DOG1,24, 138 porque alguns destes tumores podem ter mutações

num dos proto-oncogenes107, 110.

Neste contexto, importa salientar que a ausência de expressão KIT não justifica excluir doentes do

tratamento com inibidor tirosina-cinásico (ITK). Algumas das mutações detectadas nos GISTs

KIT-negativos (incluindo mutações do PDGFRA) são sensíveis ao tratamento com ITKs. Alguns

GISTs wild-type respondem ao tratamento com ITKs. A análise mutacional deve ser considerada

indispensável para a confirmação do diagnóstico e é boa prática na decisão terapêutica,

designadamente com ITKs 11.

Outros marcadores frequentemente expressos no GIST, embora menos sensíveis e específicos, são

o CD34, o h-caldesmon e a SMA (α-smooth muscle actin). O CD34 é uma glicoproteína trans-

membranar presente nos precursores das células hematopoiéticas humanas e no endotélio vascular.

É expresso em ~80% dos GISTs gástricos, 50% do intestino delgado e 95% do esófago e recto 96,

139, enquanto o h-caldesmon é expresso em > 2/3 dos GISTs140, 141 e a SMA em ~30%142. Os

GISTs raramente expressam desmina, que é geralmente focal. No entanto, tem sido descrita

positividade em ~30% de GISTs KIT-negativos, especialmente no estômago e com morfologia

epitelióide134. A proteína S-100 (5%) e as citoqueratinas são raramente expressas nos GISTs.

6 - Diagnóstico diferencial

Os principais diagnósticos diferenciais do GIST de células fusiformes são os tumores do músculo

liso (leiomiomas e leiomiossarcomas), a fibromatose (desmóide), o schwanoma, o tumor

miofibroblástico inflamatório, o pólipo fibróide inflamatório e o tumor fibroso solitário.

40

Os leiomiomas ocorrem mais frequentemente no esófago, mas também no cólon e recto. São

menos celulares e têm citoplasma mais eosinofílico, com limites celulares bem definidos. Embora a

SMA e o h-caldesmon sejam expressos em ambos os tipos de tumor, a expressão de desmina é mais

extensa nos tumores do músculo liso1. Os leiomiossarcomas do tracto GI são raros e têm marcado

pleomorfismo nuclear e elevada actividade mitótica.

Os schwanomas ocorrem raramente no tracto GI, sobretudo no estômago, habitualmente com um

bordalete linfóide periférico e expressam proteína S-100 e GFAP (glial fibrillary acid protein)143.

A fibromatose (desmóide) intra-abdominal é um tumor raro com potencial de crescimento e

agressividade local, mas que não metastiza. As células expressam beta-catenina nuclear em ~75%

dos casos144, 145 e a expressão de KIT é pouco frequente146.

Os tumores miofibroblásticos inflamatórios, também designados como “pseudo-tumores

inflamatórios”, ocorrem sobretudo em crianças e adultos jovens. As células expressam desmina e

SMA na ausência de expressão de CD34 e CD117. A expressão de ALK (anaplastic lymphoma kinase)

em até 50% dos casos facilita o diagnóstico destas lesões147.

O pólipo fibróide inflamatório (PFI) é uma lesão pseudo-tumoral que ocorre no adulto e sobretudo

no estômago e intestino delgado. As células (fibroblastos) expressam habitualmente CD34. Foi

descrita expressão PDGFRA e mutações de PDGFRA nos PFIs148, 149. No entanto, contrastando

com os GISTs, os PFIs não expressam KIT nem DOG1135, 150.

O diagnóstico diferencial dos GISTs epitelióides inclui o tumor neuroendócrino, o tumor glómico,

o melanoma maligno/metastático, o leiomiossarcoma epitelióide, o tumor maligno da bainha dos

nervos periféricos (TMBNPs) epitelióide, o sarcoma de células claras e o angiossarcoma.

Os tumores neuroendócrinos caracterizam-se pela expressão de citoqueratina, sinaptofisina e

cromogranina. Os tumores glómicos ocorrem raramente no tracto GI e são morfológica e imuno-

histoquimicamente idênticos aos tumores glómicos noutras localizações. O melanoma, o sarcoma

de células claras e o TMBNP epitelióide expressam proteína S-100; os dois primeiros também

podem ter expressão de outros marcadores de melanoma, que não são expressos no TMBNP. O

sarcoma de células claras caracteriza-se por genes de fusão EWSR1–CREB1 ou EWSR1−ATF1151,

152. O angiossarcoma epitelióide expressa KIT/CD117 e marcadores vasculares (CD31 e CD34).

7 - Características clínicas

Apresentação clínica

Os GISTs ocorrem ao longo de todo o tracto GI e são mais frequentemente identificados no

estômago (60%), jejuno e íleo (30%), duodeno (5%), recto (4%) e menos no esófago e apêndice27, 38,

40, 96, 153. Podem também desenvolver-se raramente fora do tracto gastrointestinal (EGISTs), em

locais como o mesentério, epíploon e estruturas retroperitoneais141, 154, 155.

41

Apesar de ~70% dos doentes apresentar alguma forma de sintomatologia, o diagnóstico de GIST é

muitas vezes realizado na sequência de uma laparotomia efectuada por outro motivo. Devido à

baixa incidência, o diagnóstico pré-operatório requer um alto grau de suspeição, podendo alguns

achados radiológicos fornecer informações úteis156. Os GISTs são tumores de crescimento

expansivo e muitas vezes rápido, que ultrapassam facilmente o seu suporte sanguíneo,

desenvolvendo áreas centrais de necrose detectáveis na imagiologia; podem fistulizar para o lúmen

visceral e causar hemorragia GI.

Os GISTs têm tendência para comprimir, mais do que invadir, os órgãos adjacentes e podem

atingir grandes dimensões antes de causar sintomas, geralmente inespecíficos: náuseas, vómitos,

saciedade precoce, distensão abdominal ou tumefacção palpável. No entanto, os sintomas clínicos

mais comuns são a dor abdominal e a hemorragia digestiva157. Os doentes podem ter hemorragia

GI crónica, associada a anemia, ou perdas agudas causadas pela erosão/ulceração da mucosa

gástrica ou intestinal. Raramente, pode ocorrer ruptura tumoral para a cavidade abdominal com

hemoperitoneu potencialmente fatal. Tal como outros tumores, os GISTs podem causar disfagia

quando localizados no esófago ou na junção esófago-gástrica, icterícia obstrutiva quando

periampolares, ou invaginação/oclusão intestinal quando localizados no intestino delgado156, 158.

Um estudo de base populacional descreveu que ~70% dos GISTs apresentava sintomatologia

clínica, 20% eram assintomáticos e 10% eram detectados apenas na autópsia. A dimensão média do

tumor em cada uma destas categorias foi, respectivamente, de 8,9 cm, 2,7 cm e 3,4 cm 30. Os GISTs

de menores dimensões são habitualmente assintomáticos e muitas vezes são detectados durante

uma endoscopia, intervenção cirúrgica ou estudo radiológico, efectuados por outras razões. Os

GIST “malignos” são frequentemente diagnosticados como doença disseminada. As metástases

desenvolvem-se principalmente na cavidade celómica e/ou fígado e, raramente, nos tecidos moles e

pele, em gânglios linfáticos ou no pulmão27. Clinicamente, é essencial diferenciar GIST metastático

de GIST multifocal, em doentes com mutações KIT ou PDGFRA germinativas (GISTs familiares)

e em doentes com neurofibromatose 1, e de GISTs múltiplos esporádicos, que ocorrem sobretudo

no estômago proximal159. A patogénese dos GISTs múltiplos esporádicos está pouco esclarecida;

no entanto, estes GISTs têm mutações de KIT distintas nas diferentes lesões tumorais do doente159.

GIST e neurofibromatose tipo I

Existe uma associação entre GIST e neurofibromatose tipo I (NF1)43, 51-53, 160, 161. A ocorrência de

GISTs múltiplos e pequenos no intestino delgado, fora do contexto de GIST esporádico

disseminado, associa-se significativamente à síndrome NF1. Estes GISTs têm habitualmente

morfologia fusiforme, baixo índice mitótico e expressam KIT, geralmente na ausência de mutações

de KIT ou PDGFRA51-53. Habitualmente, têm comportamento clínico benigno, embora tenham

sido descritos alguns casos clinicamente malignos co-existindo com tumores síncronos

“benignos”96.

GISTs pediátricos

Aproximadamente 1-3% dos GISTs ocorre na população pediátrica, especialmente na segunda

década de vida. Predominam no género feminino (F:M = 9:1), localizam-se preferencialmente no

42

estômago e apresentam sobretudo morfologia epitelióide16, 39, 40, 162. Embora expressem

consistentemente KIT, a maioria não tem mutações de KIT ou PDGFRA (GISTs wild-type)16, 39, 40,

162. Nas crianças é mais frequente a ocorrência de tumores gástricos multifocais e, divergindo dos

GISTs no adulto, frequentemente com metástases nos gânglios linfáticos. Em adultos jovens, os

GISTs podem apresentar-se como tumores de tipo pediátrico ou de tipo adulto. O perfil de

expressão génica dos GISTs na população pediátrica e nos adultos jovens é uma área de grande

interesse e investigação.

Os GISTs pediátricos sem mutações (wild-type) não apresentam as alterações genéticas observadas

tipicamente em GISTs do adulto com mutações de KIT, sendo provável que estes tumores

correspondam a uma entidade clínico-patológica independente16, 39.

GISTs associados com a tríade de Carney e com a díade de Carney (síndrome de Carney-Stratakis)

Os GISTs gástricos pediátricos associam-se por vezes a paragangliomas e condromas pulmonares,

integrando a tríade de Carney54, 163, ou apenas a paragangliomas, na denominada díade de Carney48,

163. Tal como na maioria dos tumores estromais esporádicos do grupo etário pediátrico, são GISTs

sem mutações de KIT/PDGFRA (wild-type). A patogénese da tríade de Carney ainda não é

conhecida e admite-se que é uma situação esporádica. A díade de Carney é transmitida de forma

autossómica dominante. Pasini et al. descreveram recentemente no subgrupo de GISTs da díade de

Carney mutações germinativas dos genes que codificam as subunidades B, C ou D da succinato-

desidrogenase (SDH), evidenciando assim mecanismos patogénicos moleculares distintos (das

mutações do KIT/PDGFRA) neste subgrupo de GISTs48. A existência de vários GISTs gástricos é

comum na tríade e na díade de Carney.

Zhang et al. publicaram uma série de 104 GISTs da tríade de Carney, descrevendo as diferenças

relativamente aos GISTs esporádicos comuns164. As características clínicas da tríade incluem: a

ocorrência predominante no género feminino e em idades jovens, o crescimento indolente e a

multifocalidade dos tumores, a metastização frequente (muitas vezes para os gânglios linfáticos), a

ausência de resposta ao imatinib e, por vezes, evolução fatal. Este subgrupo de GISTs ocorre

principalmente no antro gástrico, tem morfologia geralmente epitelióide e não tem mutações de

KIT, PDGFRA ou SDH. Não há correlação clara entre as classificações convencionais de risco

biológico e o comportamento clínico destes tumores, que é imprevisível, mesmo na doença

metastática164.

GISTs familiares

Já foram identificadas cerca de duas dúzias de famílias com mutações hereditárias de KIT e

PDGFRA41-50. A penetrância nestas famílias é elevada e os membros mais afectados desenvolverão

durante a sua vida um ou mais GISTs. A idade média (44 anos) aquando do diagnóstico é inferior à

dos GISTs esporádicos comuns, e não foram descritas diferenças significativas na distribuição por

género. A maioria destes GISTs tem curso clínico “benigno” e não difere morfologicamente dos

tumores esporádicos.

43

Procedimentos de diagnóstico e estadiamento

Os GISTs são diagnosticados com frequência durante a avaliação efectuada para outras patologias.

Dependendo da sua localização, os tumores podem ser identificados na endoscopia gastro-

duodenal, colonoscopia, tomografia computorizada ou na ressonância magnética.

A endoscopia pode indicar o diagnóstico de GIST gástrico ou colo-rectal. Na avaliação

endoscópica, o GIST identifica-se tipicamente como uma tumefacção submucosa. A

ultrassonografia endoscópica pode ser útil para solucionar a dificuldade diagnóstica e confirmar que

o tumor tem origem (na parede) sub-epitelial e não na mucosa gastrointestinal165-168. Uma massa

circunscrita hipoecóica contígua com a muscular própria do estômago é característica de GIST165,

169. Uma lesão heterogénea com diâmetro > 4 cm e com limites irregulares indica um elevado grau

de suspeição de malignidade170, 171.

Embora as biópsias endoscópicas continuem a ser realizadas na prática clínica, fornecem raramente

resultados conclusivos165, 169. A biópsia com agulha fina realizada com ultrassonografia endoscópica

permite identificar células fusiformes/epitelióides que expressam marcadores imuno-histoquímicos

característicos de GIST.

A biópsia percutânea (com agulha fina ou microbiópsia/com agulha grossa) guiada por ecografia ou

TC para confirmar o diagnóstico de GIST ressecável deve ser usada com alguma ponderação,

atendendo à possibilidade de ruptura tumoral, disseminação de células tumorais ou hemorragia138.

O diagnóstico de GIST numa biópsia percutânea, mesmo na microbiópsia, pode ser extremamente

difícil ou impossível, quando apenas se obtém material necrótico ou hemorrágico. As biópsias,

preferencialmente microbiópsias e, se possível, obtidas com ultrassonografia endoscópica, estão

indicadas nos doentes em que o diagnóstico diferencial pode alterar a decisão terapêutica24, 172,

incluindo linfoma, fibromatose mesentérica ou tumor de células germinativas. A biópsia pode

também ser útil nos casos em que a massa é volumosa e ressecável marginalmente ou implica uma

ressecção multi-visceral, indicando a necessidade de tratamento neoadjuvante. O risco de

disseminação peritoneal tem sido considerado desprezível quando são seguidas todas as precauções

na realização do procedimento. A excisão laparoscópica/laparotómica imediata é uma alternativa

válida a considerar, especialmente nos casos indicados para ressecção local limitada24. Na doença

metastática a biópsia de uma das lesões pode ser útil para planear o tratamento, evitando a

necessidade de laparoscopia ou laparotomia.

A tomografia computorizada (TC) é considerada o estudo radiológico mais útil para o diagnóstico

dos GISTs. A TC com contraste endovenoso (e.v.) pode permitir avaliar o tumor primário, o fígado

e o peritoneu, que são os locais mais comuns da doença metastática138, 173. O tumor primário

consiste habitualmente numa massa bem circunscrita e muitas vezes muito vascularizada, em

relação íntima com o estômago ou com o intestino delgado. Na TC, são geralmente tumores

hiperdensos, que contrastam bem, podendo apresentar áreas heterogéneas ou císticas, necrose

central ou hemorragia intratumoral.

As metástases ganglionares são muito raras e a metastização extra-abdominal ocorre especialmente

em fases muito avançadas dos GISTs. O exame radiológico indicado para estadiamento dos GISTs

é a TC do abdómen e da pelve, com contraste e.v., podendo a Ressonância Magnética Nuclear

44

(RMN) e a ultrassonografia com contraste e.v. constituir alternativas válidas24, 138. A RMN permite

maior acuidade na avaliação pré-operatória dos GISTs rectais.

A radiografia simples do tórax pode ser considerada suficiente para avaliar o tórax num doente

assintomático, porque o GIST raramente metastiza inicialmente para o tórax. O cintilograma ósseo

deve ser realizado apenas no esclarecimento de sintomas específicos24, 174.

A tomografia por emissão de positrões com 18-fluordesoxiglicose (PET-FDG) tem elevada

sensibilidade na identificação de actividade metabólica destes tumores, ajudando a distinguir tumor

activo de tecido necrótico ou fibrosado175, mas não permite o diagnóstico de GIST. A PET-FDG

pode ser considerada nos doentes em que os resultados da TC são inconclusivos ou discordantes

dos achados clínicos138, 173. É um meio auxiliar de diagnóstico importante nos casos em que é

necessária a avaliação precoce da resposta do tratamento molecular dirigido a alvos moleculares24,

156, 176. A integração da PET-FDG e da TC (ou RMN) nos sistemas combinados PET/TC

disponíveis permite optimizar a avaliação dos doentes submetidos a terapêutica dirigida a alvos

moleculares177.

8 - Avaliação do risco biológico e estadiamento dos GISTs

Factores de prognóstico e avaliação do risco biológico

O comportamento dos GISTs baseado na avaliação de parâmetros anátomo-patológicos é

classificado de forma distinta da maioria tumores malignos (carcinomas) do tracto GI. O melhor

indicador de malignidade é a confirmação de doença metastática. Nalgumas séries, 10-45% dos

doentes apresentam doença metastática aquando do diagnóstico30, 178, 179.

Os GISTs podem-se manifestar com um espectro vasto de comportamento biológico, sendo

muitas vezes difícil prever a recidiva tumoral após ressecção cirúrgica macroscopicamente

completa. Vários parâmetros podem ser úteis na previsão do comportamento clínico dos GISTs.

Os três mais importantes são: dimensão maior, índice mitótico e localização do tumor153, 180, 181.

Numa análise multivariada recente do MSKCC (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)180, cada um

destes parâmetros permitiu prever de forma independente a sobrevida livre de recidiva após exérese

numa série retrospectiva de GISTs primários e localizados. O impacto do índice mitótico foi o mais

significativo em doentes com ≥5 mitoses/50 campos de grande ampliação (CGA). Os doentes com

tumores localizados no intestino delgado e tumores com diâmetro ≥10 cm apresentaram maior

probabilidade de recidiva. Os doentes com tumores <5 cm de dimensão ou tumores localizados no

estômago apresentaram comportamentos mais favoráveis.

Embora a grande maioria dos GISTs <2 cm seja considerada como tendo comportamento

clinicamente benigno, há doentes ocasionais que desenvolvem metástases 5 ou mais anos após a

excisão do tumor primário. Por isso, as classificações dicotómicas "benigno" ou "maligno" foram

substituídas por classificações de estratificação do risco biológico para a prever o comportamento

clínico dos GISTs.

45

A primeira classificação de risco de comportamento clínico no GIST foi publicada em 2002 por

Fletcher e et al., na sequência de uma reunião de consenso do National Institute of Health (NIH)1, 182. A

avaliação de risco proposta baseou-se na maior dimensão e na actividade mitótica (mitoses/50

CGA) do tumor, sendo a dimensão de 5 cm e o índice de 5 mitoses/50 CGA os valores limite

usados na estratificação do comportamento clínico. De acordo com esta classificação, todos os

GISTs podem ter potencial maligno. É muito usada por médicos e patologistas, dado o pequeno

número de grupos de risco e a simplicidade de aplicação. No entanto, parece ter limitações nos

GISTs de “risco intermédio” exclusivamente baseado na dimensão do tumor. Na maior parte das

séries de base populacional, o grupo de "risco intermédio" não discrimina satisfatoriamente os

doentes com prognóstico desfavorável24. A principal limitação desta classificação resulta da não

valorização da localização anatómica do tumor nem da ruptura tumoral. Não obstante ter sido

validada em diversos estudos a utilidade e a sensibilidade da classificação de risco NIH, alguns

autores descreveram um valor superior ao de classificações alternativas para estratificação do

risco180, 183.

Em 2005 e 2006, Miettinen e et al. do Armed Forces Institute of Pathology (AFIP), publicaram dois

estudos de grandes séries de GISTs gástricos e jejunais/ileais com follow-up prolongado38, 96. Estes

estudos descreveram que, para dimensões e índices mitóticos idênticos, os GISTs localizados no

estômago têm comportamento menos agressivo do que os jejunais e ileais. A localização anatómica

do tumor passou a ser incluída como parâmetro adicional na avaliação de risco dos GISTs, de

acordo com as orientações do consenso National Comprehensive Network (NCCN) de 2007,

recentemente actualizadas21 (Tabela 1, adaptada de Miettinen et al.184).

Miettinen et al. definiram 8 subgrupos, com base na maior dimensão e no índice mitótico, usando

também a localização anatómica, para distinguir quatro grupos de risco: "muito baixo", "baixo",

"moderado" e "alto", idênticos aos 4 grupos de risco do sistema NIH, e incluíram um grupo de

“tumores benignos” (≤2 cm e ≤5 mitoses/50 CGA)184. O sistema de classificação AFIP pretende

estimar o risco de recidiva e/ou progressão do tumor, expresso numericamente185. Para alguns

autores, o inconveniente principal resulta da complexidade do sistema AFIP, com 8 subgrupos,

sendo que a excessiva subdivisão pode reduzir a sensibilidade e especificidade prognóstica183.

Comparando as classificações NIH e AFIP, constata-se que o sistema NIH sobrevaloriza o risco

dos tumores gástricos em relação aos GISTs não-gástricos. A European Society of Medical Oncology

(ESMO) considera que a classificação de risco AFIP pode estratificar melhor os grupos de risco dos

GISTs24.

A previsão do comportamento do GIST num doente concreto permanece um desafio clínico.

Actualmente, aceita-se que todos os GISTs podem ter potencial maligno e nenhum caso, com a

possível excepção de tumores <1 cm, deve ser classificado como benigno156. A história natural dos

GISTs microscópicos permanece desconhecida. Dois estudos descreveram a presença de GISTs

microscópicos, respectivamente, em 22,5% e 35% dos estômagos em autópsias consecutivas e

removidos por carcinoma gástrico33, 35. Estes resultados indicam que os GISTs são comuns na

população em geral. Alguns autores admitem que os GISTs mais pequenos não progridem para

tumores de dimensões clinicamente relevantes138, 184, 186. No entanto, alguns podem ser precursores

de GISTs com significado clínico33, 187. São necessários estudos adicionais para esclarecer quais os

46

mecanismos biológicos responsáveis pela evolução de tumores microscópicos para GISTs com

significado clínico.

Tabela 1: Estratificação de risco dos GISTs primários segundo o índice mitótico, dimensões e localização anatómica

Parâmetro tumoral Risco de progressão da doençaa

Índice mitótico Dimensões Estômago Duodeno Jejuno/íleo Recto

≤ 5/50 CGA ≤ 2 cm Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum

≤ 5/50 CGA > 2 ≤ 5 cm Muito baixo (1,9%)

Baixo (8,3%) Baixo (4,3%) Baixo (8,5%)

≤ 5/50 CGA > 5 ≤ 10 cm Baixo (3,6%) -c Moderado (24%) -c

≤ 5/50 CGA > 10 cm Moderado (10%)

Alto (34%) Alto (52%) Alto (57%)b

> 5/50 CGA ≤ 2 cm Nenhumb -c Alto (50%)b Alto (54%)

> 5/50 CGA > 2 ≤ 5 cm Moderado (16%)

Alto (50%) Alto (73%) Alto (52%)

> 5/50 CGA > 5 ≤ 10 cm Alto (55%) -c Alto (85%) -c

> 5/50 CGA > 10 cm Alto (86%) Alto (86%) Alto (90%) Alto (71%)

a Definido como metastização ou morte relacionada com o GIST b Número de casos limitado c Dados insuficientes Tabela adaptada de Miettinen et al.184 Dados baseados no follow-up prolongado de 1,055 GISTs gástricos, 629 do intestino delgado, 144 duodenais e 111 rectais38, 96.

Um nomograma prognóstico para estimativa da sobrevida livre de doença após ressecção cirúrgica

macroscópica completa de GISTs primários localizados foi proposto por Gold et al.188. É um

método que utiliza a dimensão, o índice mitótico e a localização dos tumores, para prever a

probabilidade de sobrevida livre de recidiva (SLR). São atribuídos pontos em cada caso, numa

escala baseada na localização (gástrico vs. intestino delgado vs. cólon/recto vs. extragastrointestinal),

na dimensão (variável contínua não-linear) e no índice mitótico (< 5 vs. ≥5/50 CGA) dos tumores.

O total de pontos indica a SLR aos 2 e 5 anos. O nomograma permitiu estimar uma probabilidade

de concordância de 0,78, equivalente à obtida com o sistema AFIP, e superior à do sistema NIH no

mesmo estudo138. Desconhece-se a precisão do nomograma para estimar a SLR a longo prazo em

GISTs indolentes e progressão tardia188. As estimativas da SLR obtidas com o nomograma podem

ser mais úteis para a selecção dos doentes candidatos a tratamento adjuvante com inibidores

tirosina-cinásicos138.

47

Foram propostos outros sistemas de estratificação de risco dos GISTs. Vários autores apresentaram

versões do sistema de estratificação de risco NIH, incluindo outros factores de prognóstico. O

risco de recidiva pode ser estimado com base não só no índice mitótico, dimensão e localização do

tumor, mas também na qualidade das margens cirúrgicas e na ocorrência de ruptura do tumor24.

Apesar da controvérsia existente, a ressecção cirúrgica com margens microscópicas positivas (R1)

pode expor os doentes a risco de recidiva tumoral loco-regional. Rutkowski et al.189 descreveram

que a ressecção não radical (R1) e a ruptura do tumor associam-se a resultados desfavoráveis31.

Joensuu et al. utilizaram o sistema NIH como base e incluiram a presença de ruptura tumoral como

factor de risco para estimar comportamento agressivo, independente do tamanho e do índice

mitótico dos tumores186. Outra modificação da proposta de Joensuu foi a inclusão dos tumores

não-gástricos, do grupo de risco intermédio (classificação NIH), no grupo de risco elevado,

corroborando a importância da classificação de Miettinen/AFIP.

A ocorrência de ruptura tumoral intra-abdominal, antes ou durante a ressecção cirúrgica, tem sido

associada a evolução clínica desfavorável, com metastização peritoneal190, 191. A ruptura do tumor

deve ser sempre valorizada porque traduz risco de evolução desfavorável, independente de qualquer

outro factor prognóstico24.

Para além da dimensão do tumor, do índice mitótico e da localização do tumor, do estado das

margens cirúrgicas e da ruptura tumoral, têm sido investigados outros parâmetros preditivos de

recidiva181. A proliferação tumoral estimada com Ki-67 foi descrita como factor prognóstico

independente192-194. A invasão difusa da mucosa é uma ocorrência rara, associada a evolução mais

agressiva da doença181, 195, 196. A presença de necrose tem sido descrita com valor prognóstico em

algumas séries38, 197, 198. A aneuploidia é um factor de agressividade193, 199, 200, e alguns estudos têm

sugerido que a expressão da telomerase é um factor de mau prognóstico190, 201. A expressão ou o

padrão de expressão KIT e a expressão de CD34 não parecem ser factores independentes de

prognóstico dos doentes com GIST202.

Estadiamento clínico dos GISTs

Woodall et al. propuseram um método de estadiamento dos GISTs baseado num sistema tumor-

grade-metastasis (TGM)203. Os autores, usando resultados do SEER (2537 casos), determinaram a

dimensão 7cm como a mais útil para a previsão do comportamento clínico dos GISTs do que os

valores previamente usados (2 cm, 5cm e 10cm). No entanto, uma percentagem destes casos foi

diagnosticada antes de 2000, sem avaliação da expressão KIT, motivo pelo qual a série estudada

poderá não corresponder totalmente a casos de GIST. Além disso, o método utilizado para a

classificação do grau de diferenciação dos GISTs, em quatro categorias e de forma semelhante à

dos sarcomas dos tecidos moles, não parece ser a mais adequada.

A sétima edição da classificação TNM da International Union Against Cancer (UICC) publicada em

2010 incluiu pela primeira vez a classificação e o estadiamento dos GISTs204. O objectivo principal

da classificação TNM é facilitar uma abordagem homogénea e padronizada dos tumores e o

estabelecimento de follow-up uniforme dos doentes com base no estádio do tumor185.

48

A classificação TNM utiliza critérios da avaliação de risco para caracterizar os tumores em quatro

categorias T, combinando o índice mitótico e a localização do tumor para definir os estádios

clínicos. Em geral, dada a raridade das metástases ganglionares linfáticas nos GISTs, é recomendada

a classificação de todos os casos em que os gânglios linfáticos regionais não foram estudados, como

pN0. A presença de metástases ganglionares linfáticas, tal como a metastização à distância,

corresponde a um estadio IV.

A classificação TNM reproduz, genericamente, os 8 subgrupos de prognóstico definidos pela

classificação de Miettinen/AFIP4. Deste modo, pode-se argumentar que a utilização dos mesmos

critérios de risco para determinar os estádios TNM representa uma agregação diferente dos grupos

de risco estabelecidos por vários grupos de trabalho nos últimos anos185. Um dos aspectos mais

sensíveis é a subdivisão da categoria “alto risco” em dois ou três estádios (II, III ou III-B),

sabendo-se que o valor desta subclassificação dos tumores de alto risco continua a aguardar

validação.

Na proposta de classificação de Miettinen/AFIP os tumores pequenos (< 2 cm) e mitoticamente

inactivos não apresentam risco de progressão e poderão ser considerados como de comportamento

clínico benigno, independente da localização anatómica4. Sendo assim, a inclusão deste grupo de

tumores numa classificação TNM de tumores “malignos” pode ser controversa.

Outra controvérsia relaciona-se com o tipo de crescimento dos GISTs. A classificação TNM não

estabelece a relevância da infiltração da subserosa, do epíploon/mesentério, da invasão do

peritoneu visceral pelas células tumorais, da ruptura tumoral, nem da multiplicidade de tumores

primários no epíploon/mesentério.

É, por isso, evidente a necessidade de um sistema consensual e validado de

classificação/estadiamento que inclua a heterogeneidade do comportamento biológico dos GISTs.

9 - O papel da análise molecular no prognóstico e no tratamento não-cirúrgico dos GISTs

Apesar das semelhanças é importante considerar as diferenças entre GISTs com mutação do KIT e

mutação do PDGFRA e os casos com sequências normais de KIT e de PDGFRA (wild-type). A

resposta clínica objectiva ao imatinib depende da presença e do tipo de mutação do RTK

implicado. Foi proposta uma classificação molecular dos GISTs10, 90, que destaca as diferenças

moleculares destes tumores e fornece uma referência rápida para outras síndromes com que podem

associar-se (Tabela 2).

Com base em quatro ensaios clínicos (fase I-III) que investigaram mais de 700 GISTs com

genótipos diferentes, as taxas de resposta objectiva ao imatinib nos GISTs com mutações no exão

11 e no exão 9 do gene KIT, e nos GISTs wild-type foram, respectivamente, 72-86%, 38-48% e 28%9,

21, 87, 152, 205, 206. Os GISTs com mutação no gene PDGFRA respondem ao imatinib, com a excepção

da mutação D842V no exão 189, 83, 87, 113. As taxas de resposta ao imatinib mais favoráveis [mediana

do tempo livre de progressão da doença mais elevada (~ 24 meses) e mediana da sobrevida mais

longa (~ 63 meses)]9, 87, 206 são descritas nos GISTs com mutações no exão 11 do KIT.

49

Tabela 2: Classificação molecular dos GISTs

Frequência Comentários

KIT

Exão 11 67% A maioria é sensível ao imatinib

Exão 9 10% Requer dose mais elevada de imatinib

Exão 13 & 17 3%

PDGFRA

Exão 12 & 14 2% Sensível ao imatinib

Exão 18 5% D842V é resistente ao imatinib

Wild type 15% Mutações BRAF ou KRAS raras

GIST Familiar Raros Mutações KIT ou PDGFRA germinativas

Carney-Stratakis Raros Mutações SDHB, SDHC, SDHD

GIST Pediátrico Raros Mutações KIT e PDGFRA são raras

Tríade de Carney Raros Sem mutações KIT ou PDGFRA

GIST associado a NF-1 Raros Mutações KIT ou PDGFRA pouco comuns

Adaptado de Corless, C.10

Os doentes com mutações no exão 11 do gene KIT são habitualmente tratados com imatinib, numa

dose diária de 400 mg, e a escalada da dose para 800 mg/dia tem sido recomendada nos casos de

progressão da doença durante o tratamento. Os doentes que têm mutação no exão 9 do KIT

apresentam sobrevida livre de progressão da doença mais longa quando tratados com a dose inicial

de 800 mg/dia87, 89, 206. De acordo com o consenso actual, o estado mutacional KIT deve ser

avaliado por rotina em GISTs inoperáveis, com administração de 800 mg/dia de imatinib nos casos

em se identifica mutação no exão 9 do KIT24, 138.

A realização da análise molecular de rotina em todos os GISTs continua a ser um tema muito

controverso. Os resultados dos principais centros de referência Europeus e dos Estados Unidos

fornecem evidência a favor da realização destes testes nos GISTs irressecáveis e/ou metastáticos,

beneficiando os doentes que têm mutação no exão 9 do KIT. A análise mutacional pode também

ser considerada na decisão de realizar tratamento adjuvante com imatinib em GISTs primários de

risco “intermédio e alto"24, 138. Deste modo, podem ser excluídos GISTs com mutações resistentes

ao imatinib (ex: mutações D842V do PDGFRA). Estes testes, na opção neoadjuvante, permitem

ajustar a decisão terapêutica de forma mais adequada.

Embora o tratamento de primeira linha dos doentes com GIST metastático/irressecável seja, de

acordo com o estado actual da arte, a utilização do imatinib, é possível que no futuro este regime

terapêutico possa ser alterado para outros inibidores tirosina-cinásicos ou terapêuticas alternativas,

com base no estudo molecular dos tumores89, 207.

50

10 - Tratamento

10. a) Doença primária localizada

É consensual o tratamento de GISTs primários de dimensão ≥ 2 cm e sem evidência de

disseminação peritoneal ou metastização à distância com ressecção cirúrgica macroscópica

completa24, 138. No entanto, quando são detectados “nódulos subepiteliais” esófago-gástricos ou

duodenais com diâmetro <2 cm, a abordagem padrão dos doentes consiste na avaliação com

ecografia endoscópica e na vigilância activa, porque muitos destes nódulos, quando correspondem a

GISTs, são tumores de baixo risco biológico1, 184, ou com significado clínico desconhecido. A

exérese cirúrgica é reservada para os doentes cujo tumor aumenta de dimensão ou é sintomático.

Os resultados de uma análise retrospectiva recente208 indicam que apenas alguns (3/23; 13,0%) dos

tumores pequenos sem características eco-endoscópicas de risco (maior dimensão, limites

extraluminais irregulares, padrão ecográfico heterogéneo, presença de áreas císticas e focos

hiperecogénicos) progridem durante o seguimento de longo prazo com eco-endoscopia. Como

alternativa, a decisão pode ser partilhada com o doente, no sentido de se poder optar por uma

avaliação histológica inicial (biópsia com agulha) ou pela excisão, quando a morbilidade não é

substancial. Nos “nódulos” intra-abdominais não passíveis de avaliação endoscópica, a

exérese/ressecção laparoscópica/laparotómica é a abordagem padrão. Nos “nódulos” rectais (ou

do espaço recto-vaginal), a abordagem deve ser a realização de biópsia/exérese, após avaliação por

ecografia endoscópica, independente da dimensão do tumor, porque os GISTs nesta localização

têm risco biológico mais elevado e as implicações de uma intervenção cirúrgica nesta região são

mais críticas, sobretudo nos tumores de grandes dimensões24.

As orientações da ESMO e da NCCN indicam que os tumores com dimensões > 2 cm devem ser

ressecados24, 138, porque, sendo GISTs, implicam maior risco de comportamento agressivo.

Para doentes com GIST primário localizado, a ressecção cirúrgica continua a ser a única

possibilidade de cura209. Normalmente causa pouca morbilidade em tumores <10 cm limitados ao

estômago ou intestino delgado. Ao contrário dos carcinomas GIs , os GIST não se originam nas

camadas epiteliais e apresentam biologia e comportamento diferente, com implicações distintas

relativamente às margens cirúrgicas e à linfadenectomia dos gânglios linfáticos loco-regionais.

Dependendo do órgão onde se origina, da localização exacta, e das dimensões do tumor, podem ser

necessárias abordagens cirúrgicas diferentes. O objectivo do tratamento é a ressecção completa do

GIST, com margens microscópicas negativas (R0) e preservando a pseudo-cápsula intacta (i.e.

evitando a ruptura tumoral)24, 138.

Como o GIST não tem geralmente padrão infiltrativo intraparietal, raramente é necessário efectuar

ressecções alargadas27. As recomendações actuais para as margens cirúrgicas têm por base a

experiência, o consenso, e a aplicação de conceitos patobiológicos sobre GIST24, 138. Não há dados

prospectivos conclusivos sobre a extensão das margens de ressecção e o risco de recidiva local ou à

distância do GIST.

A ressecção “em cunha” é a opção mais utilizada nos GISTs do estômago e a ressecção segmentar

nos GISTs do intestino delgado. Nos GISTs de grandes dimensões, na pequena curvatura e/ou

51

com envolvimento pilórico, pode não ser possível a ressecção “em cunha”, sendo mais adequada a

gastrectomia distal. A gastrectomia total não é habitualmente necessária, devendo ser considerada

em função da localização (junção esófago-gástrica) e/ou a extensão do tumor.

Os GISTs do recto são incomuns e o diagnóstico definitivo é, frequentemente, obtido aquando do

estudo anátomo-patológico da peça operatória. O GIST rectal de pequenas dimensões, localizado

no terço inferior, pode ser removido com ressecção parietal completa, com abordagem trans-anal

ou trans-esfinctérica210. Esse tipo de abordagem deve ser efectuada com os cuidados necessários,

porque foram descritas taxas menores de ressecção R0 (32% vs. 82%) e taxas maiores de recidiva

local (77% vs. 31%), quando comparadas com a ressecção anterior baixa do recto, que é o

procedimento recomendado para GISTs dos terços superior e médio211, 212.

A técnica cirúrgica utilizada para ressecar os GISTs tem implicações determinantes na ocorrência de

recidiva tumoral. A ruptura do tumor deve ser estritamente evitada, especialmente quando tem

Fig. 4: Aspecto macroscópico de ressecção de GIST gástrico com invasão do cólon transverso.

grandes áreas císticas ou necróticas. A enucleação simples dos GISTs é considerada uma opção

inadequada, porque pode não remover parte da pseudo-cápsula que contém células tumorais viáveis

e associa-se a maior frequência de ruptura tumoral. Por estes motivos, a enucleação não é

aconselhável, mesmo quando o objectivo é preservar uma estrutura vital213.

Quando o GIST apresenta grandes dimensões pode ser submetido a tratamento pré-operatório

com imatinib (neoadjuvante), com o objectivo de se obter condições de ressecabilidade do tumor

que é, muitas vezes, necrótico e friável214. Esta opção pode facilitar a ressecção cirúrgica com

52

preservação da função ou do órgão, particularmente em GISTs da junção esófago-gástrica, da

segunda porção do duodeno e do 1/3 inferior do recto24, 138. Quando há invasão de órgãos

adjacentes, a ressecção “em bloco” pode ser uma alternativa. A ressecção incompleta do tumor

deve ser efectuada apenas como opção terapêutica paliativa, em casos de hemorragia, dor ou

sintomas relevantes, secundários ao efeito de massa.

Muitos autores descreveram que os GISTs metastizam raramente para os gânglios linfáticos,

mesmo nos casos de alto risco. Bucher et al.215 descreveram 5/80 doentes (6%) com GIST

localizado com metástases hematogéneas, com ou sem envolvimento ganglionar linfático. Na série

de Rutkowski et al.189 (n=335) descreve-se quatro casos (1,2%) com metastização ganglionar. Os

estudos publicados indicam que não se justifica a realização de linfadenectomia de rotina no

tratamento cirúrgico dos GISTs, excepto quando é detectado envolvimento ganglionar

macroscópico24, 27, 138, 215-217.

Tumor residual microscópico (R1)

De acordo com as orientações da ESMO e da NCCN, nos casos em que foi efectuada ressecção

microscopicamente incompleta (R1) pode ser considerado o alargamento de margens quando a

localização exacta da lesão é identificavel e o risco de morbilidade cirúrgica é baixo.

Quando a ressecção R0 resulta previsivelmente em complicações funcionais ou co-morbilidades

importantes, e o tratamento médico neoadjuvante não é eficaz ou não pode ser administrado, a

decisão de realizar uma ressecção R1 deve ser discutida com o doente. A ressecção R1 pode ser

aceitável em GISTs de baixo risco. Não há estudos que demonstrem a associação de ressecção R1

com sobrevida mais curta dos doentes218.

Cirurgia Laparoscópica

A cirurgia laparoscópica no GIST está a ser progressivamente mais utilizada nos últimos anos. O

diagnóstico endoscópico melhorou a capacidade de identificar GISTs gástricos de pequenas

dimensões com baixo risco de agressividade1, 184. A abordagem minimamente invasiva tem vindo a

ser adoptada na generalidade destes tumores, devido aos benefícios potenciais decorrentes de se

evitar a laparotomia dos doentes. Recomenda-se que a técnica deve seguir rigorosamente os

princípios oncológicos da cirurgia aberta: ressecção completa do tumor com margens livres (R0),

evitando a disseminação de células tumorais na cavidade peritoneal24, 138, 219. Nos GISTs de grandes

dimensões, a ressecção R1 pode complicar-se com ruptura intra-operatória do tumor e

disseminação peritoneal. Por este motivo, a ressecção laparoscópica tem sido desaconselhada em

doentes com GISTs de grandes dimensões173, 218. Novitsky et al.220 sugeriram que esta

recomendação devia ser revista, porque não foi baseada em evidências, mas traduz apenas uma

medida preventiva para cirurgiões inexperientes neste procedimento. Diversos autores propuseram

a adopção de orientações mais alargadas para a cirurgia laparoscópica nos GISTs221, 222. Várias séries

descrevem a realização de ressecção por via laparoscópica de tumores com dimensões entre 0,3-

12,5 cm218, 223, sugerindo a laparoscopia na ressecção de GISTs, sobretudo em localização gástrica.

53

Não há estudos de ensaios clínicos controlados randomizados e prospectivos que permitam validar

estas opções.

A NCCN (2007) considera aceitável a ressecção laparoscópica de tumores até 5 cm de dimensão, e

que os tumores > 5 cm, dependendo da localização e da morfologia, podem ser ressecados por via

laparoscópica ou por técnicas de laparoscopia hand-assisted21, 138, 220, 223.

Antes de iniciar a ressecção do tumor, deve ser realizada uma exploração formal da cavidade

abdominal para excluir a presença de metastização no peritoneu ou no fígado. A ecografia intra-

operatória pode ser útil na avaliação de metástases hepáticas e, nas lesões suspeitas, para orientar a

realização de biópsias. A endoscopia intra-operatória tem sido frequentemente utilizada para a

localização dos GISTs de pequenas dimensões e na selecção da técnica de ressecção mais adequada.

Para evitar o risco de ruptura, os GISTs não devem ser manipulados directamente com os

instrumentos laparoscópicos220. Embora não existam dados disponíveis, a utilização de saco de

extracção da peça operatória parece essencial para evitar a disseminação de células tumorais na

cavidade abdominal ou no orifício da porta respectiva, e eventualmente metastização24, 220, 224.

Nas diversas séries publicadas, têm sido utilizadas diferentes abordagens, dependendo de vários

factores (ex: dimensão, localização e forma macroscópica do tumor), para o tratamento dos GISTs

gástricos: ressecções “em cunha” ou segmentares por via laparoscópica, laparoscópica-endoscópica

(intragástrica) ou laparoscópica hand-assisted220. Os GISTs da parede anterior e da pequena e grande

curvatura do estômago são geralmente submetidos a ressecção “em cunha”, com máquina de

anastomose linear endoscópica. As lesões de maiores dimensões podem ser ressecadas com

margens livres, utilizando o bisturi ultrassónico220. Os tumores da parede posterior são muitas vezes

abordados pela retrocavidade dos epíploons, mas a abordagem trans-gástrica, com gastrotomia

anterior, constitui alternativa válida, especialmente nos GISTs localizados próximo da junção

esófago-gástrica225-228. Esta opção é, no entanto, tecnicamente mais exigente226, e há relatos de

ressecções incompletas213 e de complicações pós-operatórias, como estenoses e “fugas” na linha de

sutura224. A abordagem combinada endoscópica-laparoscópica intragástrica tem sido descrita como

método alternativo no tratamento dos GISTs da junção esófago-gástrica220, 224.

A localização do tumor não deve ser considerada contra-indicação absoluta para cirurgia

minimamente invasiva, desde que assegurada a experiência técnica necessária e todas as precauções

indispensáveis224. No entanto, nos GISTs com maiores dimensões e/ou com localizações

desfavoráveis, como a pequena curvatura ou a junção esófago-gástrica, pode não ser possível

efectuar ressecção “em cunha” com margens livres de tumor, podendo ser necessário optar por

gastrectomia subtotal ou total. Nestes casos, o tratamento neoadjuvante com imatinib, como

sugerido nas recomendações ESMO e NCCN, pode ser uma opção válida, para redução da

dimensão do tumor que permita a cirurgia conservadora do órgão224. Contudo, a exequibilidade e

os resultados deste tipo de abordagens são ainda objecto de avaliação em curso229.

A cirurgia laparoscópica pode aplicar-se a GISTs com localizações diversas, como é o exemplo dos

GISTs rectais de pequenas dimensões. No entanto, os dados disponíveis relativamente a ressecções

laparoscópicas de GISTs noutras localizações (extragástricas) são escassos138.

54

Os resultados globais publicados da cirurgia laparoscópica descrevem que as complicações intra-

operatórias e pós-operatórias são relativamente raras, ocorrendo, respectivamente, em 6,8% e 7,7%

dos doentes218. As ressecções decorrem com perdas mínimas de sangue, satisfazendo os tempos de

cirurgia e períodos curtos de estadia hospitalar223, 224. Evita-se também a morbilidade relacionada

com a ferida operatória da laparotomia220. A "curva de aprendizagem" nos procedimentos

laparoscópicos faz presumir que, com a maior experiência técnica, os tempos operatórios serão

progressivamente melhorados230, 231.

Apesar dos dados de follow-up dos doentes serem escassos, não excedendo ~5 anos218, algumas

séries descreveram segurança oncológica na abordagem laparoscópica220, 232, 233, com eficácia e taxas

de recidiva semelhantes às obtidas com cirurgia convencional.

A aplicabilidade da abordagem laparoscópica deve assentar numa variedade de factores, incluindo

as características do doente, a dimensão e a forma macroscópica do tumor, o padrão de invasão e a

localização do tumor, bem como a experiência e qualificação em cirurgia laparoscópica do

cirurgião220.

Os dados da literatura indicam que as ressecções laparoscópicas ou assistidas por laparoscopia são

exequíveis e associam-se a taxas de recidiva reduzidas, períodos curtos de internamento e

morbilidade baixa213, 217, 220, 232, 234, 235. Esta abordagem deve ser recomendada como opção de

escolha para a maioria dos doentes com GISTs gástricos de pequenas e médias dimensões220, 224.

GIST primário localmente avançado

Nos GISTs localmente avançados, não metastáticos, pode ser impossível a realização de ressecção

R0. Nestes casos, deve considerar-se a citorredução tumoral com terapêutica neoadjuvante com

imatinib. Esta abordagem pode facilitar a obtenção de margens cirúrgicas R0 e permitir uma

cirurgia menos mutilante, com melhores resultados funcionais, de acordo com orientações da

ESMO e da NCCN . Esta recomendação baseia-se em publicações de dados retrospectivos, não

randomizados236, 237. O tratamento primário com imatinib, para citorredução do tumor, pode ser

considerado nos GISTs em que se prevê um risco elevado de hemorragia ou ruptura tumoral

durante a cirurgia. A resposta terapêutica máxima é atingida geralmente após 6-12 meses de

tratamento. A intervenção cirúrgica subsequente pode, na maioria dos casos, ser realizada com

segurança24, 214, 238. No entanto, nem sempre é necessário esperar pela resposta máxima antes de

realizar a cirurgia. A análise mutacional pode auxiliar a ponderar a terapêutica neoadjuvante dos

GISTs com menos sensibilidade ao imatinib (por exemplo, com mutações D842V do PDGFRA), e

permitir adoptar o esquema terapêutico mais adequado. A PET ou PET-TC, ou a avaliação da

densidade do tumor com TC pode ser particularmente útil na avaliação rápida da resposta à

terapêutica, não condicionando atraso na intervenção cirúrgica dos GISTs que não respondem ao

tratamento239-242.

É imprescindível estabelecer um plano terapêutico multidisciplinar, envolvendo patologistas,

radiologistas, cirurgiões e médicos oncologistas. A partilha de experiências, disponível em centros

55

de referência para sarcomas e GISTs e/ou em redes de referenciação de doentes oncológicos, deve

ser entendida como fundamental no tratamento dos GISTs24.

Tratamento adjuvante

Após ressecção, o risco de recidiva de GISTs pode ser substancial180, 243, conforme definido pela

classificação de risco (classificação de Miettinen/AFIP). Tendo em conta a eficácia do imatinib na

doença metastática, o seu uso em tratamento adjuvante tem sido avaliado em vários estudos244-246.

Um ensaio clínico intergrupo de fase II (Z9000) do American College of Surgeons Oncology Group

(ACOSOG) avaliou o tratamento adjuvante com imatinib, administrado numa dose de 400 mg/dia

durante 12 meses, após ressecção completa do tumor primário em GISTs de risco elevado (n=107).

Os GISTs de alto risco foram definidos como tumores com dimensões> 10 cm, com ruptura ou

hemorragia intraperitoneal, ou tumores multifocais (> 5). Os resultados descrevem que o imatinib é

bem tolerado no contexto adjuvante, prolonga a sobrevida livre de recidiva e está associado a

sobrevida global melhor, em comparação com controlos históricos244.

Foi concluído um ensaio clínico intergrupo do ACOSOG (Z9001), de fase III, randomizado,

duplamente cego, em que os doentes receberam imatinib (400 mg/dia) ou placebo durante 1 ano,

após efectuarem uma ressecção macroscópica completa de GISTs primários KIT-positivos e com

diâmetro ≥3 cm. Os doentes foram apenas estratificados segundo o tamanho do tumor (3 – 6 cm, 6

– 10 cm, and ≥ 10 cm). Com um tempo mediano de follow-up (713 doentes) de 19,7 meses, o estudo

descreve que o tratamento adjuvante com imatinib aumentou significativamente a sobrevida livre de

recidiva dos doentes, relativamente ao grupo placebo (98% vs. 83%). Resultados idênticos foram

descritos nos diferentes subgrupos de estratificação, segundo a dimensão do tumor, mas a maior

diferença entre o braço terapêutico e o braço placebo foi observada nos GISTs de risco mais

elevado, com diâmetro ≥10 cm. Não foram observadas diferenças na sobrevida global entre os dois

braços do estudo246. Estes resultados apoiaram decisivamente o papel do imatinib no tratamento

adjuvante do GIST. No entanto, é necessário um período de follow-up mais longo para conclusões

definitivas sobre algumas questões fundamentais: taxa de recidiva absoluta após um intervalo de

tempo de follow-up maior; tempo de atraso no aparecimento da recidiva; e, no caso de recidiva,

tempo decorrido até ocorrer resistência secundária ao imatinib. Com base neste estudo, o imatinib

foi aprovado, como terapêutica adjuvante no GIST, pela FDA (Federal Drug Administration) e pela

EMA (European Medicine Agency). Embora ainda não exista consenso geral relativamente a que

subgrupo de doentes deve ser administrado o tratamento adjuvante, é amplamente aceite que deve

ser proposto aos doentes com GISTs de risco elevado. Segundo as recomendações actuais, o

imatinib adjuvante pode ser proposto como opção para doentes com um risco substancial de

recidiva (ESMO)24, mais concretamente, para doentes com GISTs de risco intermédio ou elevado

(NCCN)138.

A análise mutacional dos GISTs pode ser relevante para complementar a avaliação de risco na

selecção dos doentes que são previsivelmente mais susceptíveis de beneficiar com o tratamento

adjuvante. Os resultados dos estudos disponíveis sustentam o tratamento adjuvante durante um

período de 12 meses. Estão em curso dois ensaios clínicos fase III (EORTC 62024; SSG

56

XVIII/AIO), para avaliar períodos de tratamento mais longos (0 vs. 2 e 1 vs. 3 anos,

respectivamente)247, 248. Foi recentemente iniciado um estudo fase II de tratamento adjuvante,

denominado Post-resection Evaluation of Recurrence-free Survival for GastroIntestinal Stromal Tumors with

Adjuvant Imatinib (PERSIST)-5 (ClinicalTrials.gov identifier: NCT00867113) para avaliar a sobrevida

livre de recidiva em doentes com GIST de alto risco tratados com imatinib (400 mg/dia) durante 5

anos após ressecção cirúrgica.

No caso de ruptura pré ou per-operatória do tumor, com disseminação de células tumorais na

cavidade peritoneal, pode assumir-se um estado de doença peritoneal oculta. Este estado coloca os

doentes perante um risco elevado de recidiva peritoneal e, por esse motivo, podem considerar-se

candidatos a tratamento com imatinib. A duração ideal do tratamento nestes casos é ainda

desconhecida24.

Follow-up dos doentes

Não existem dados publicados conclusivos sobre qual o seguimento de rotina ideal para os doentes

com GIST localizado submetidos a tratamento cirúrgico. Os esquemas de follow-up variam de

instituição para instituição. A avaliação de risco baseada no índice mitótico, na dimensão e na

localização do tumor, pode ajudar na selecção da melhor estratégia de seguimento. Nos doentes

com GISTs de risco alto, a recidiva ocorre geralmente nos primeiros 2-3 anos após ressecção. Nos

GISTs de risco baixo, a recidiva é menos provável e surge, na maior parte dos casos, após 2-3 anos.

Como as metástases podem ocorrer 10-15 anos após a cirurgia, o seguimento dos doentes deve ser

prolongado 12.

Existindo actualmente um tratamento eficaz para os GISTs recidivados e/ou metastáticos, algumas

instituições de referência propõem a realização de TC todos os 3-4 meses durante 3 anos, nos

doentes com GISTs de risco intermédio ou alto; depois, de 6/6 meses até aos 5 anos; e

posteriormente com periodicidade anual. Nos doentes com tumores de risco baixo, é proposta a

realização de TC de 6/6 meses durante os primeiros 5 anos. Os doentes com GISTs de risco muito

baixo não necessitam provavelmente de seguimento de rotina, embora o risco de comportamento

agressivo não deva ser considerado nulo24, 138.

10. b) Doença recidivada e metastática

Reconhece-se que o tratamento cirúrgico isolado não é curativo nos casos de GIST avançado, com

doença recidivada e/ou metastática, mesmo quando se removem todas as lesões metastáticas

abdominais.

Na recidiva, cerca de 2/3 dos doentes têm envolvimento hepático e 1/2 doença peritoneal27. As

metástases extra-abdominais no pulmão ou no esqueleto são mais raras, podendo desenvolver-se

em estadios mais avançados.

57

As metástases hepáticas são geralmente multifocais, difusas e difíceis de ressecar. Cerca de 26% dos

doentes, submetidos a metastasectomia249, desenvolvem recidiva após ressecção hepática174. A

exérese das lesões peritoneais associa-se geralmente a recidiva subsequente.

A quimioterapia convencional para o tratamento do GIST tem uma taxa diminuta (cerca de 5%) de

resposta249-252. A radioterapia tem também valor reduzido, devido à localização dos tumores e à

limitação nas doses que podem ser utilizadas202. A embolização da artéria hepática e a cirurgia de

citorredução, seguida de quimioterapia intraperitoneal, foram também objecto de investigação, mas

os resultados obtidos são desencorajadores253, 254.

O tratamento de escolha do GIST recidivado/metastático consiste, com poucas excepções, na

administração do mesilato de imatinib (ESMO, NCNN). Os doentes com GIST primário e doença

metastática síncrona de baixo volume podem ser seleccionados num primeiro tempo para ressecção

cirúrgica, especialmente se forem sintomáticos. No entanto, as orientações de consenso

recomendam a associação ao tratamento com imatinib, mesmo nos casos em que toda a doença

macroscópica é ressecada24.

O uso do mesilato de imatinib revolucionou o tratamento dos GISTs. O imatinib é um inibidor

selectivo de tirosina-cínases específicas, incluindo o KIT, PDGFRα, ARG, c-FMS, ABL e BCR-

ABL253. O imatinib causa uma inibição competitiva no local de ligação do ATP do receptor KIT,

levando à inibição da auto-fosforilação e subsequente interrupção das vias de sinalização envolvidas

na proliferação e na sobrevida celular255. O imatinib foi inicialmente desenvolvido como um

inibidor do PDGFRα. A sua primeira utilização terapêutica foi no tratamento da leucemia mielóide

crónica (LMC), em que uma proteína de fusão BCR-ABL (Breakpoint cluster region-Abelson gene protein)

causa desregulação da actividade tirosina-cinásica256. Descreveu-se que o imatinib induz uma

resposta completa em quase todos os doentes com LMC em fase crónica, tendo sido aprovado pela

FDA para o tratamento dos doentes com LMC em 2001257.

Em 2001, Joensuu et al. publicaram a experiência com imatinib num único doente com GIST

metastático23. Os resultados confirmados nas imagens seriadas da RMN e da PET foram muito

promissores. Esta publicação de um caso clínico desencadeou a realização de vários ensaios

clínicos, sendo actualmente descrito que até 80% dos doentes com GIST metastático têm resposta

parcial ou estabilidade da doença após terapêutica com imatinib56. O imatinib é geralmente bem

tolerado e os efeitos laterais incluem edemas, erupção cutânea, diarreia, náuseas, dores abdominais e

fadiga.

Eficácia e tolerabilidade do imatinib como terapêutica de 1ª linha

A eficácia e a tolerabilidade com 400 e 800 mg/dia de imatinib na terapêutica de 1ª linha dos GISTs

têm sido descritas em ensaios clínicos fase II/III.

Num estudo fase II, multicêntrico e randomizado (B2222), com imatinib na dose de 400 ou 600

mg/dia em doentes com GIST avançado258, a taxa de resposta, baseada nos critérios Southwest

Oncology Group (SWOG)259, foi de 53,7% (n=79) com resposta parcial e 27,9% (n=41) com doença

estável, não se obtendo resposta completa em nenhum doente. Nos resultados a longo prazo deste

58

estudo206 (tabela 3) descreve-se que, com uma mediana de seguimento de 71 meses, as taxas de

resposta, a mediana da sobrevida livre de progressão (SLP) e a mediana da sobrevida global (SG)

foram idênticas em ambos os braços terapêuticos. Neste estudo, a mediana da resposta terapêutica

foi de 29 meses e a mediana da SG 57 meses.

Tabela 3: Resultados de ensaios clínicos fase II e III com os inibidores tirosina-cinásicos (ITC) imatinib e sunitinib, em doentes com GIST localmente avançado ou metastático

Ensaio clínico Desenho do estudo (N)

ITC, dose (mg/dia)

Resposta terapêutica

Follow-up

B2222 (Blanke, Demetri et al. 2008)

Fase II-R (147)

Imatinib, 400 vs. 600

RC: 1,4%, RP: 66,7%

TPT (mediana): 20 e 26 meses, respectivamente (p=0,37). SG (mediana): 57 meses.

EORTC (STBSG) (Verweij, van Oosterom et al. 2003)

Fase II (27)

Imatinib, 400x2

RC: 4%, RP: 67%, DE: 18%

SLP a 1 ano: 73%

STI571B1202 (Nishida, Shirao et al. 2008)

Fase II-R (47)

Imatinib, 400 vs. 600

RP: 69%, DE: 26%

SLP (mediana): 96 semanas. SG aos 3 anos estimada: 73,6%

European-Australasian (Verweij, Casali et al. 2004)

Fase III-R (946)

Imatinib, 400 vs. 800

RC: 5%, RP: 45%, DE: 32% vs. RC: 6%, RP: 48%, DE: 32%

SG a 1 e 2 anos: 85% vs. 86% e 69% vs. 74%. SLP aos 2 anos: 50% vs. 56% (p=0,026).

Intergroup S0033 (Blanke, Rankin et al. 2008)

Fase III-R (746)

Imatinib, 400 vs. 800

RC: 5%, RP: 40%, DE: 25% vs. RC: 3%, RP: 42%, DE: 22%

SLP e SG (medianas): 18 vs. 20 meses e 55 vs. 51 meses (p=NS)

Sunitinib phase III (Demetri, van Oosterom et al. 2006)

Fase III-R (312)a

Sunitinib, 50mg/kg (esq. 4/2) vs. placebo

RP: 7%, DE: 58% vs. RP: 0%, DE: 48%

SLP (mediana): 24,1 vs. 6 semanas (p<0,0001)

EORTC- European Organisation for Research and Treatment of Cancer, STBSG- Soft Tissue and Bone Sarcoma Group, RC- resposta completa, RP- resposta parcial, DE- doença estável, SG- sobrevida global, SLP- sobrevida livre de progressão, TPT- tempo para progressão do tumor, R- randomizado, N- número de doentes, NS- não significativo. a - terapêutica de 2ª linha.

Outro estudo fase II, iniciado pelo EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group260, corroborou os

resultados obtidos com o imatinib (tabela 3). Este ensaio avaliou a eficácia de 400 mg de imatinib

administrado duas vezes/dia. Aos 12 meses, 73% dos casos estavam livres de progressão da

doença. Neste estudo, os efeitos laterais associados à dose de 800 mg/dia mais comuns foram:

anemia (92%), edema palpebral (84%), rash cutâneo (69%), fadiga (76%), náuseas (57%),

59

neutropenia (47%) e diarreia (47%). Os eventos adversos descritos foram geralmente classificados

como sendo de grau leve a moderado, não obrigando à exclusão de nenhum doente nesse estudo.

Dois ensaios clínicos fase III, multicêntricos e randomizados205, 261, 262, procuraram validar os

resultados obtidos nos estudos fase I/II e determinar a dose terapêutica ideal de imatinib. Ambos

os estudos avaliaram a eficácia do imatinib comparando a dose padrão (400 mg/dia) com uma dose

mais elevada (800 mg/dia) em doentes com GIST avançado ou metastático, com ou sem

quimioterapia prévia. Aos doentes incluídos no regime de uma dose diária (400 mg) que

apresentaram progressão da doença, foi oferecida a opção de passar para o braço terapêutico de

duas tomas por dia (800 mg). As melhores taxas de resposta objectiva nos dois estudos são

apresentadas na tabela 3.

No estudo mais alargado do EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group (European-Australasian trial

/EORTC-ISG-AGITG) (n = 946)261, não se observaram diferenças significativas nas taxas de

resposta entre braços terapêuticos. No entanto, após uma mediana de 760 dias de seguimento dos

doentes, verificou-se diferença significativa na percentagem de doentes livres de progressão da

doença entre os grupos de 800 e 400 mg/dia de imatinib (50 vs. 44%, respectivamente),

correspondendo, respectivamente, a taxas de SLP aos 2 anos de 56% e 50%.

O estudo efectuado nos Estados Unidos e Canadá (S0033)205 corroborou que os benefícios obtidos

com o imatinib eram consistentes com os resultados previamente publicados (tabela 3). Após uma

mediana de follow-up de 4,5 anos não se observaram diferenças significativas nas taxas de resposta

entre os doentes que receberam 800 mg/dia e os que foram tratados com 400 mg/dia de imatinib,

nem na mediana da SLP entre os dois grupos (20 vs. 18 meses, respectivamente). As taxas de SLP

aos 2 anos também não foram significativamente diferentes (46% vs. 41%, respectivamente).

Nos dois estudos, a estimativa da taxa de sobrevida global aos 2 anos foi de 74-72% para os

doentes tratados com imatinib 800 mg/dia, e 69-76% para os doentes que receberam 400 mg/dia.

Não se observou qualquer vantagem em termos de sobrevida global comparando a dose de 800

mg/dia com a de 400 mg/dia de imatinib.

O imatinib foi descrito como razoavelmente bem tolerado pelos doentes, embora fosse

relativamente comum a ocorrência de efeitos laterais de grau ligeiro a moderado. O braço

terapêutico com dose mais elevada associou-se a maior incidência de efeitos adversos grau 3-4 em

ambos os estudos205, 261. No ensaio Europeu-Australiano261, os eventos hematológicos adversos

mais frequentes foram a anemia e a neutropenia. Os efeitos colaterais não-hematológicos mais

frequentes foram: edema, astenia, náuseas, dor pleurítica, diarreia e rash cutâneo.

No estudo Norte-americano (S0033)205, a percentagem de doentes com eventos adversos de grau 3

a 5 foi maior no grupo submetido a tratamento com imatinib 800 mg/dia do que no grupo de 400

mg/dia (63 vs. 43%, respectivamente). A toxicidade hematológica mais importante foi a anemia

(grau 3) e a neutropenia grave. Os efeitos colaterais não-hematológicos mais frequentes foram:

toxicidade gastrointestinal, náuseas ou diarreia (grau 3 ou 4), toxicidade cardíaca (grau 3 a 5) e

hemorragia (grau 3 a 5). O imatinib não pode ser completamente excluído como causa de morte em

13 casos (1%), no primeiro estudo, e em 11 doentes, no segundo. Embora o imatinib fosse

60

geralmente bem tolerado, foi possível identificar, em ambos os ensaios clínicos, necessidade de mais

reduções de dose e/ou interrupções do tratamento no grupo de doentes tratados com a dose mais

elevada.

Com o objectivo de aumentar o poder e a acuidade dos dados e avaliar o benefício clínico da dose

de 800 mg de imatinib, os estudos Europeu-Australiano e Norte-Americano foram agrupados num

estudo designado como meta-análise MetaGIST263. Foi avaliado um total de 1640 doentes com

GIST avançado, tendo sido investigados diferentes subgrupos de doentes e possíveis factores de

prognóstico. A análise dos dados combinados mostrou, para uma mediana de follow-up de 45 meses,

um pequeno (mas significativo) aumento da SLP no grupo com 800 mg de imatinib, que não foi

possível extrapolar para a SG. A eficácia associada à transferência de doentes para o grupo com 800

mg de imatinib, após a progressão com 400 mg/dia, e a disponibilidade de novos fármacos para a

terapêutica de 2ª linha dificultam a interpretação destes resultados de SG. A presença de mutações

KIT no exão 9 foi o único factor preditivo para a SLP mais longa e para uma maior taxa de resposta

objectiva, atribuíveis à dose elevada de imatinib263. Como a toxicidade associada ao tratamento com

800 mg diários de imatinib poder ser relativamente grave, as orientações internacionais

recomendam iniciar o tratamento dos doentes com GISTs irressecáveis ou metastáticos com a dose

de 800 mg/dia apenas nos casos com mutação no exão 9 do KIT24, 138.

Embora a dosagem do imatinib tenha sido extensivamente analisada, continua ainda por estabelecer

em definitivo se o tratamento dos GISTs avançados deve ser mantido continuamente. O ensaio

clínico fase III BFR14 (ClinicalTrials.gov identifier: NCT00367861) pretende responder a esta

questão, estudando os efeitos do tratamento contínuo versus interrupção da terapêutica com

imatinib em GISTs avançados. A análise preliminar deste estudo, que avaliou os resultados nos

doentes submetidos a tratamento durante 1 ano, descreve uma SLP significativamente maior nos

casos submetidos a tratamento contínuo, em comparação com os casos cuja terapêutica foi

interrompida. A mediana da SLP, após randomização, foi de 6 meses no grupo com interrupção e

18 meses no braço de tratamento contínuo (p ≤ 0,0001)264. Relatos mais recentes deste ensaio

clínico compararam também a interrupção vs. continuidade da terapêutica aos 3 e aos 5 anos265, 266.

Foram descritas vantagens significativas na SLP dos doentes no braço de tratamento ininterrupto,

em ambos os pontos temporais analisados. A mediana da SLP dos doentes randomizados no braço

da interrupção terapêutica foi significativamente maior nos casos submetidos a tratamento durante

5 anos (12,2 meses), relativamente aos que foram tratados durante 1 (5,7 meses) ou 3 anos (6. 3

meses). Deste modo, os autores concluíram que o imatinib deve ser administrado sem interrupções

até ocorrer intolerância ao tratamento ou progressão da doença266. As orientações de consenso

suportam estes achados, recomendando que a administração de imatinib, nos doentes com GISTs

irressecáveis e/ou metastáticos, deve ser mantida de forma contínua e indefinida24, 138.

Resistência e progressão da doença nos doentes submetidos a tratamento de 1ª linha com imatinib

Num grupo de casos, tem sido documentado crescimento tumoral durante os primeiros 6 meses de

tratamento. A progressão do tumor nos primeiros 6 meses de tratamento com imatinib é designada

61

resistência primária. Resultados de ensaios clínicos descrevem que 12-14% dos doentes evidenciam

progressão da doença nos primeiros 3 meses após o início do tratamento com imatinib258, 267.

Está amplamente documentado que o estado mutacional inicial dos genes KIT e PDGFR influencia

a resposta ao imatinib9, 87, 268. Em alguns ensaios clínicos fase II e III, que utilizaram o imatinib em

doentes com GISTs avançados9, 87, 205, descreveram-se taxas de resposta parcial mais elevadas nos

casos com mutações no exão 11 do KIT, em comparação com os doentes com mutação no exão 9

ou sem qualquer mutação detectável. Além disso, os doentes com mutações no exão 11 tiveram

uma mediana da sobrevida global mais longa do que os doentes com mutação no exão 9 ou outra

mutação /nenhuma mutação detectável no gene KIT (63 meses vs. 44 e 26 meses, respectivamente;

p=0,005)205. Mais de 1/3 dos casos com mutação do PDGFR83 exibiram resposta ao imatinib9,

particularmente os casos com mutação nos exões 12 e 14, assim como alguns com mutações no

exão 1883.

Quase todos os doentes com progressão precoce da doença durante o tratamento com imatinib

(400 mg/dia) apresentam mutações no exão 9 do KIT ou no PDGFRA, ou têm GISTs wild-type9, 87,

268. Em particular, os GISTs que expressam a mutação D842V no exão 18 do PDGFR (a maioria

das mutações PDGFR) podem não ter qualquer resposta clínica ao imatinib9. Esta falta de resposta

ao imatinib foi demonstrada em GISTs com algumas mutações no exão 17 do KIT, tais como as

mutações D816H e D816V82. No entanto, os GISTs com mutações no exão 9 do KIT podem

responder a doses mais elevadas (800 mg/dia) de imatinib87, 263, 267, mas com maior incidência de

eventos adversos261.

A ocorrência de progressão precoce durante o tratamento com imatinib é atribuída sobretudo ao

estado mutacional dos tumores. No entanto, as mutações do KIT secundárias (~ 10% dos casos207)

e alguns parâmetros clínicos podem também estar envolvidos. No estudo fase III Europeu-

Australiano, utilizando imatinib nas doses de 400 mg e 800 mg/dia, a presença de metastização

pulmonar e a ausência de metástases hepáticas, bem como valores baixos de hemoglobina e

contagem elevada de neutrófilos, foram factores preditivos independentes de resistência precoce ao

imatinib267.

A maioria dos doentes que inicialmente apresentam resposta ou estabilidade da doença acaba por

desenvolver, geralmente após 12-36 meses de tratamento, progressão numa ou mais lesões

tumorais. Este evento é habitualmente designado como resistência secundária ao tratamento12, 269. A

resistência secundária é mais frequentemente causada por mutações secundárias (adquiridas) no

domínio cínase do KIT, tendo sido mais raramente descritos outros mecanismos, como a

amplificação génica KIT/PDGFRA e a activação de oncogenes alternativos270, 271. As mutações

secundárias do KIT desenvolvem-se mais frequentemente nos GISTs com mutações primárias no

exão 11 do que nos casos com mutações no exão 9 207, e são habitualmente substituições simples de

nucleotídeos que afectam codões na bolsa de ligação-ATP (exões 13 e 14) e na ansa de activação

cinásica (exão 17 e 18). Vários estudos têm descrito a existência deste tipo de mutações em 44-67%

dos GISTs que progridem durante a terapêutica com imatinib152, 269, 272, 273. A mutação secundária

mais frequente nos GISTs com mutação primária no exão 11 do KIT é a mutação pontual V654A

na bolsa de ligação-ATP152, 268. As mutações secundárias são raras nos GISTs com mutações no

exão 9 do KIT ou wild-type que têm resistência primária ao imatinib.

62

Liegl et al. descreveram heterogeneidade inter- e intralesional das mutações associadas a resistência

nos doentes tratados apenas com imatinib ou com imatinib e sunitinib: 83% dos doentes neste

estudo apresentaram mutações secundárias do KIT, incluindo casos (67%) com duas a cinco

mutações secundárias diferentes em metástases independentes e casos (34%) com duas mutações

secundárias do KIT na mesma metástase271.

A progressão tardia é definida como a progressão que ocorre em doentes que inicialmente

obtiveram resposta ou que apresentaram um intervalo de SLP superior a 3-6 meses, depois do

início do tratamento com imatinib274. Nestes casos, a progressão ocorre como resultado da

resistência adquirida ou secundária ao imatinib, em grande parte associada ao desenvolvimento de

mutações secundárias no gene KIT. No entanto, outros mecanismos relacionados com factores

farmacocinéticos podem estar envolvidos na progressão tardia, como por exemplo as alterações na

disponibilidade sistémica dos medicamentos ao longo do tempo, devido a maior depuração275 e/ou

ao aumento da ligação do imatinib a α1-ácido glicoproteína276.

Foi também estudado o efeito da insuficiência renal na farmacocinética e na toxicidade do imatinib,

num ensaio clínico fase I, em que se administrou imatinib a doentes com tumores sólidos

avançados e função renal variável (de normal a insuficiência grave)277. O estudo concluiu que é

necessária precaução nos casos de disfunção renal grave, porque estes doentes poderão não tolerar

doses de 800 ou 600 mg/dia de imatinib.

Estas observações sugerem que pode ser necessária uma monitorização dos níveis plasmáticos do

fármaco para assegurar uma exposição adequada ao tratamento instituído e, desse modo, preservar

a resposta terapêutica e evitar a progressão da doença.

Outros factores clínicos podem desempenhar um papel relevante no desenvolvimento de

resistência tardia durante o tratamento com imatinib: valores base elevados na contagem de

neutrófilos; tumores primários em localização extragástrica; tumores de grandes dimensões; dose

inicial de imatinib de 400 mg/dia267. Além disso, como os doentes podem omitir tomas do fármaco

por várias razões (ex: efeitos adversos, preocupações com os custos), este facto deve ser

considerado quando se avalia a resposta ao tratamento.

Avaliação da resposta ao tratamento

A resposta ao tratamento com inibidores tirosina-cinásicos nos doentes com GIST foi definida

como a ausência de progressão da doença no momento da primeira avaliação formal267,

habitualmente realizada 2-3 meses após o início do tratamento. No entanto, alguns autores

defendem um período mais alargado (até 6 meses) para avaliação inicial da resposta ou progressão

tumoral, porque o tempo que decorre até ao início da resposta terapêutica pode ser variável.

É essencial avaliar com precisão a resposta ao tratamento, para que se possa determinar quais os

tratamentos que devem ser mantidos ou alterados, e melhorar os resultados. O sistema padrão de

avaliação da resposta tumoral objectiva, amplamente aceite e utilizado, é o RECIST (Response

Evaluation Criteria in Solid Tumors), que tem como critérios base as dimensões do tumor278. Na

maioria dos doentes, a actividade anti-tumoral do imatinib traduz-se numa redução das dimensões

do tumor. Contudo, os GISTs submetidos a tratamento com imatinib podem não exibir redução

63

imediata das dimensões, mas manifestar uma inibição do crescimento267 ou evidenciar necrose e/ou

degenerescência cística/mixóide. Deste modo, nas imagens da TC, alguns doentes podem

apresentar apenas alterações da densidade das lesões tumorais. Mesmo um aumento da dimensão

pode ser indicativo de resposta se, na TC, a densidade das lesões diminuir. Os GISTs podem

aumentar de dimensões na presença de uma resposta terapêutica efectiva, de acordo com a

avaliação clínica ou com a PET279. O aparecimento de novos nódulos pode corresponder apenas ao

facto de estes se tornarem mais evidentes quando, pelo efeito terapêutico, ficam menos densos.

Os critérios de Choi (redução de 10% da dimensão do tumor ou diminuição de 15% da densidade

tumoral nas imagens da TC com contraste e.v.) foram propostos como método alternativo mais

preciso de avaliação da resposta dos GISTs ao tratamento279. Para além da dimensão das lesões

(usado no RECIST), os critérios de Choi avaliam a densidade do tumor e apresentam melhor

relação com o intervalo de tempo livre de progressão da doença e com a sobrevida dos doentes,

quando comparados com os critérios RECIST279, 280.

A progressão pode não ser acompanhada por alterações na dimensão do tumor. O aumento da

densidade das lesões tumorais pode indicar progressão do tumor, como por exemplo no padrão

típico de progressão caracterizado por imagem de “nódulo dentro de um nódulo”.

As recomendações de consenso24 indicam que a dimensão e a densidade do tumor na TC, ou as

alterações equivalentes na RMN ou na ecografia com contraste e.v., podem ser considerados os

critérios de avaliação da resposta ao tratamento.

A PET-FDG tem revelado sensibilidade na detecção precoce de resposta ao imatinib em doentes

com GIST, e pode ser muito útil na previsão de resposta a longo prazo281. A PET-FDG pode ser

também útil em casos de dúvida ou nos doentes em que é altamente desejável uma previsão

precoce da resposta ao tratamento pré-operatório. No entanto, antes do início do tratamento,

algumas lesões não são detectáveis pela PET. Recentemente, a PET foi também avaliada

prospectivamente em doentes tratados com sunitinib, após falência da terapêutica de 1ª linha

(imatinib)282. Um único exame realizado às 4 semanas de tratamento pode prever a longo prazo a

resposta ao sunitinib. Actualmente, como a PET não é um meio auxiliar de diagnóstico facilmente

acessível e/ou disponível como a TC, não é considerada como exame de 1ª escolha.

Tratamento cirúrgico pós-imatinib em doentes com GIST avançado /metastático

A resistência secundária ao imatinib é a principal complicação que limita a sua eficácia a longo

prazo. Esta resistência está relacionada com vários factores, incluindo as alterações farmacocinéticas

e as mutações adquiridas, que se tornam comuns e clinicamente relevantes após exposição

prolongada ao tratamento12, 267, 269. Estes factos dão suporte para a utilização da cirurgia como parte

integrante de uma abordagem multimodal no tratamento do GIST metastático174, 283. Muitos

centros começaram a incluir a cirurgia na terapêutica dos doentes com GIST metastático. Realizar a

ressecção cirúrgica aquando da melhor resposta ao tratamento com imatinib pode ser uma

possibilidade de reduzir o volume /quantidade de tumor viável e o risco de resistência secundária.

A cirurgia pode ser considerada apenas nos casos em que ocorre progressão focal, com o objectivo

64

de ressecar as lesões que já desenvolveram resistência secundária. Ambas as estratégias podem ser

exequíveis174, 283.

Alguns estudos retrospectivos descrevem resultados favoráveis em doentes que respondem ao

tratamento com imatinib e são submetidos a ressecção cirúrgica283-288.

A ressecção cirúrgica não está geralmente indicada para os doentes com GIST metastático e

resistência multifocal e/ou difusa ao imatinib285-287.

Mussi et al. publicaram um estudo de 80 doentes submetidos a cirurgia após terapêutica com

imatinib, efectuada em três centros (Milan, Mannheim and Robert-Rössle Clinic Berlin)283. Os doentes

foram divididos em 2 grupos: casos com cirurgia realizada na melhor resposta clínica ao imatinib e

casos com cirurgia na progressão focal da doença. Os resultados obtidos descreveram diferença na

sobrevida dos doentes que foram submetidos a cirurgia na melhor resposta clínica, comparada com

a dos que foram operados com doença focalmente progressiva, com SLP e SE significativamente

inferiores no último grupo. Os autores concluíram que a cirurgia em lesões focalmente progressivas

pode ser considerada como parte integrante das opções terapêuticas de segunda/terceira linha em

casos seleccionados. Porque estes resultados são comparáveis aos obtidos pelos inibidores tirosina

cinásicos de segunda linha, não tão bem tolerados como o imatinib, a cirurgia pode ser considerada

como opção nos doentes com bom estado geral e com GISTs em localização favorável para

ressecção cirúrgica, bem como nos casos que toleram mal o tratamento médico de segunda linha24,

283.

A cirurgia da doença residual na melhor resposta clínica parece estar associada a um benefício da

sobrevida, também quando comparada com os controlos históricos de séries idênticas, referentes a

doentes tratados apenas com imatinib206. Como os doentes seleccionados para cirurgia são

provavelmente aqueles que apresentam melhor estado geral, menor volume tumoral e resposta

duradoura ao tratamento, é provável que estes resultados estejam enviesados pela selecção dos

doentes24, 283. A utilidade efectiva da cirurgia neste contexto necessita de validação em estudos

randomizados.

O tratamento cirúrgico dos doentes com GIST metastático que respondem ao tratamento está

ainda em fase de investigação. Fora dos ensaios clínicos, esta opção deve ser individualizada e a

decisão partilhada com o doente24.

A excisão cirúrgica da progressão tumoral focal, como o “nódulo dentro de nódulo”, pode ser

considerada uma opção terapêutica paliativa em casos seleccionados com progressão limitada da

doença. Nestes casos, podem ser também seleccionados outros procedimentos não-cirúrgicos de

tratamento local, como as técnicas de ablação24.

10. c) Eficácia da terapêutica de segunda linha dirigida a alvos moleculares nos GISTs

Nos doentes com GIST que apresentam progressão da doença com 400 mg/dia de imatinib como

terapêutica de 1ª linha, os dados clínicos disponíveis sugerem que pode ser considerado o

tratamento de 2ª linha com imatinib 800 mg/dia ou com sunitinib, e que nos casos que progridem

com 800 mg/dia de imatinib a terapêutica pode ser alterada para sunitinib24, 138.

65

A eficácia da terapêutica com 800 mg/dia de imatinib após progressão da doença foi estudada nos

dois ensaios clínicos fase III discutidos anteriormente205, 261, 262. Os doentes com progressão da

doença no regime terapêutico com 400 mg/dia de imatinib podiam passar para o braço terapêutico

de 400 mg de imatinib duas vezes por dia (800 mg/dia). Em ambos os estudos, os doentes que

passaram do grupo com 400 mg/dia de imatinib para o de 800 mg/dia obtiveram benefício de SLP.

A abordagem habitual dos doentes com 400 mg de imatinib e progressão do tumor consiste no

aumento da dose para 800 mg/dia, com a possível excepção dos GISTs que apresentam mutações

resistentes24. A escalada da dose pode ser particularmente útil nos GISTs com mutação do KIT no

exão 9, nos casos que sofrem alterações farmacocinéticas ao longo do tempo, ou possivelmente em

casos que apresentem algumas alterações moleculares.

Não foi publicado até à data nenhum estudo que tivesse comparado a eficácia e toxicidade do

sunitinib com a eficácia e toxicidade do imatinib em dose elevada (800 mg/dia), nos doentes com

GISTs que apresentam progressão com 400 mg/dia de imatinib. Um ensaio clínico randomizado

fase III, previsto inicialmente para avaliar este tipo de resultados [sunitinib (37,5 mg/dia) vs.

imatinib (800 mg/dia)], foi encerrado prematuramente em 2009289.

A escolha terapêutica de segunda linha pode ser influenciada pelos resultados da avaliação

molecular, especialmente quando a falência do imatinib resulta de mutações primárias ou de

mutações secundárias resistentes, e pelas respostas dos diversos estados mutacionais (ex: mutação

no exão 9 do KIT e KIT/PDGFRA wild-type) dos GISTs ao imatinib e ao sunitinib.

Eficácia e tolerabilidade do sunitinib

O sunitinib é o único agente aprovado para tratamento de segunda linha nos doentes com GISTs

irressecáveis e/ou metastáticos que progridem durante a terapêutica com imatinib ou que

desenvolvem intolerância terapêutica ao imatinib24, 138. O sunitinib, administrado por via oral, é um

inibidor tirosina-cinásico com múltiplos alvos moleculares: receptor KIT, receptores VEGF

(vascular endothelial growth factor)-1 a -3, PDGFRα e -β, receptor do factor neurotrófico derivado de

linhas de células gliais (RET /rearranged during transfection), CSF-1R (macrophage colony-stimulating factor 1

receptor), e do FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3 receptor). Estudos pré-clínicos efectuados in vitro e in

vivo descreveram que o sunitinib se liga fortemente a diferentes receptores cinásicos responsáveis

pelo crescimento dos GISTs (KIT e PDGFRA)84, 290.

Alguns estudos clínicos avaliaram a eficácia e a segurança do sunitinib nos doentes com GIST

avançado, após falência da terapêutica de primeira linha com imatinib291 26.

Num ensaio clínico fase II de doentes com GISTs avançados (n = 97), que apresentaram

progressão da doença após tratamento com imatinib291, o TPT mediano estimado foi de 34

semanas. No momento da análise dos dados, 7% dos doentes evidenciaram resposta parcial (RP) e

29% tinham doença estável (DE) ≥ 6 meses.

A eficácia do sunitinib nestes casos foi descrita num ensaio clínico randomizado fase III efectuado

em doentes com intolerância ao imatinib ou com GISTs resistentes ao tratamento26 (tabela 3). Os

doentes foram randomizados numa proporção de 2:1, para tratamento com 50 mg de sunitinib/dia

66

(esquema 4/2: 4 semanas de tratamento /2 semanas de pausa) ou com placebo. A análise dos

resultados mostrou que a mediana do TPT foi de 27,3 semanas nos doentes tratados com sunitinib

e 6,4 semanas nos doentes com placebo (p<0,0001). A mediana da SLP (24,1 semanas) foi

significativamente superior nos doentes tratados com sunitinib, quando comparada com a do grupo

com placebo (p<0,0001). O estudo foi aberto precocemente, após análise preliminar dos resultados,

e todos os doentes com placebo foram autorizados a passar para o braço terapêutico (sunitinib).

Nos doentes transferidos para o grupo com sunitinib, em 10% (6/59) observou-se RP e em 7%

(4/59) estabilidade da doença durante pelo menos 26 semanas após a transferência26.

A análise da sobrevida a longo prazo dos doentes incluídos neste estudo282 não revelou diferença

significativa na SG dos doentes que receberam sunitinib, quando comparada com a dos que

receberam placebo. No entanto, este resultado encontra-se enviesado pela inclusão dos doentes

provenientes do grupo placebo no braço de tratamento activo com sunitinib.

Na sequência dos resultados obtidos, o sunitinib foi aprovado pela FDA e pela EMA para o

tratamento dos doentes com GIST que apresentam progressão da doença sob terapêutica com

imatinib, ou nos casos de intolerância ao imatinib292.

Os efeitos adversos associados ao tratamento com sunitinib no estudo fase III26 foram descritos

como geralmente leves a moderados e controlados com a redução de dose. Os eventos de grau 3-4

mais frequentes foram: fadiga (10%), hipertensão arterial (7%), síndrome hand-foot (6%), diarreia

(5%) e astenia (5%). Foram também descritos cinco (2%) eventos adversos de grau 5: insuficiência

hepática, insuficiência ventricular esquerda, paragem cardíaca, isquemia cerebral e falência multi-

orgânica. Apesar dos benefícios clínicos obtidos em doentes com GISTs refractários ao imatinib, o

uso de sunitinib pode ser influenciado por toxicidades associadas ao tratamento prolongado. Têm

sido descritas cardiotoxicidade e hipotireoidismo nos doentes com ciclos repetidos de tratamento

com sunitinib no esquema 4/2293, 294. Dos 24 doentes avaliados num estudo realizado por

Mannavola et al., 46% desenvolveram hipotireoidismo e 25% uma elevação dos níveis da hormona

tireo-estimulante (TSH)294. Noutro estudo que avaliou a segurança terapêutica do sunitinib

(n=75)293, 11% dos doentes desenvolveram um evento cardiovascular após um tempo mediano de

tratamento de 34 semanas.

Um ensaio clínico fase II avaliou a dosagem diária (37,5 mg/dia) contínua de sunitinib em 60

doentes com GISTs metastáticos que apresentaram intolerância ou resistência ao imatinib295. Os

resultados preliminares deste estudo sugerem que a administração diária contínua de sunitinib

constitui um esquema de dosagem alternativo eficaz e bem tolerado.

Embora não exista nenhum estudo comparativo formal realizado no âmbito de um ensaio clínico

randomizado, o esquema terapêutico com dosagem diária mais baixa e contínua pode ser

considerada como opção válida em doentes seleccionados24. De facto, nos doentes cujos efeitos

adversos não são atenuados pelas pausas na dosagem do esquema intermitente, a decisão de

reiniciar o tratamento com sunitinib em dosagem diária contínua pode ser uma estratégia mais

eficaz, garantir a adesão terapêutica dos doentes e retardar a progressão da doença.

67

Há alguns indícios de que o ajuste das dosagens de imatinib de acordo com a monitorização dos

níveis séricos pode ser útil em doentes com GIST296. Esta evidência pode ser aplicável para outros

agentes terapêuticos específicos, como o sunitinib, mas carece de validação.

A resposta ao sunitinib e o genótipo dos GISTs

Nos resultados preliminares de um estudo fase I/II com sunitinib em doentes com GIST

descreveu-se benefício clínico em todas as principais mutações KIT297. Uma extensão deste estudo

indica que o benefício clínico do sunitinib se relaciona em parte com o estado mutacional dos

tumores, particularmente com o genótipo tirosina-cínase dos GISTs207. O benefício clínico (RP ou

DE ≥ 6 meses) foi observado nos três genótipos mais comuns: 34% nos tumores com mutações

primárias no exão 11 do KIT, 58% nos casos com mutações no exão 9 e 56% nos tumores wild-type

para o gene KIT ou com mutações do PDGFRA; a taxa de RP dos GISTs com mutações primárias

no exão 9, em comparação com os que apresentam mutações no exão 11 do KIT, foi de 37 vs. 5%,

respectivamente (p=0,002). A mediana da SLP e da SG foi significativamente superior nos doentes

com mutações primárias no exão 9 do KIT (19,4 e 26,9 meses, p=0,0005 e p=0,012,

respectivamente) e nos tumores com genótipo wild-type (19 e 30,5 meses, p=0,0356 e p=0,0132,

respectivamente), quando comparados com os casos que tinham mutações do KIT no exão 11207.

Estes resultados indicam que o tipo de mutações primárias e secundárias no receptor tirosina-

cinásico influenciam significativamente a actividade anti-tumoral do sunitinib, e que este pode ser

particularmente eficaz nos doentes que têm mutações do KIT no exão 9.

O imatinib continua a ser actualmente a opção de escolha no tratamento de primeira linha dos

doentes com GISTs irressecáveis e metastáticos. No entanto, a evidência mais recente sugere que o

sunitinib poderá ser eficaz como tratamento de primeira linha dos GISTs que têm mutações do KIT

no exão 9 e dos GISTs sem mutações KIT/PDGFRA (ex: GISTs pediátricos)12, 89, 207, 272.

Estudos in vitro descreveram que o sunitinib é eficaz nos GISTs que têm mutações secundárias

localizadas na bolsa de ligação-ATP (exões 13 e 14), mas não em casos com mutações secundárias

na ansa de activação cinásica (exões 17 e 18). Estes achados foram concordantes com os resultados

clínicos obtidos no estudo publicado por Heinrich et al.207: maior benefício clínico (61%) nos

doentes com mutações do KIT secundárias no exão 13 ou 14, quando comparado com o obtido

(15%) nos doentes com mutações secundárias no exão 17 ou 18 do KIT (p=0,011). A mutação

secundária associada a resistência mais frequente nos GISTs que têm mutações primárias no exão

11 do KIT, e que progridem durante o tratamento com imatinib, é a mutação pontual V654A na

bolsa de ligação-ATP152, 268. Esta mutação é sensível ao sunitinib, com base em estudos in vitro207.

Diversos autores descreveram que alguns tumores com mutações do KIT no exão 17 resistentes ao

imatinib (ex: mutações D816H e D816V) eram também resistentes ao sunitinib82.

Progressão da doença após tratamento com sunitinib

À semelhança do que acontece com o imatinib, o desenvolvimento de genótipos resistentes leva à

progressão da doença nos doentes tratados com sunitinib. Factores farmacocinéticos podem

68

também desempenhar um papel relevante na progressão da doença298. É possível que mecanismos

farmacocinéticos descritos para o imatinib estejam envolvidos noutros inibidores dos receptores

tirosina-cinásicos, mas é necessária investigação adicional para conclusões definitivas.

10. d) Opções terapêuticas após falência do tratamento dirigido a alvos moleculares

Embora seja possível obter uma resposta prolongada com os agentes terapêuticos (imatinib e

sunitinib) dirigidos a alvos moleculares, a maioria dos doentes com GISTs avançados desenvolvem

eventualmente resistência. Não há actualmente nenhum agente de terceira linha aprovado para

tratamento nos doentes com GIST avançado com progressão após terapêutica de segunda linha. As

opções possíveis são a inclusão num ensaio clínico ou a instituição de medidas paliativas. Após

falência da terapêutica com imatinib e sunitinib, as orientações internacionais recomendam que

deve ser considerada a opção do doente participar num dos ensaios clínicos em curso, testando

novas abordagens ou novas combinações terapêuticas para controlo da doença24, 138. Vários agentes

(ex: sorafenid, nilotinib, dasatinib e masitinib) estão a ser avaliados (tabela 4)28, 299-305. As

combinações de agentes inibidores tirosina-cinásicos devem ser desencorajadas fora dos ensaios

clínicos devido ao potencial de toxicidade.

Tabela 4. Novas terapêuticas dirigidas a alvos moleculares para o tratamento do GIST avançado (em investigação)

Agente Alvo(s)

Sorafenib

KIT, PDGFRA/B, VEGFR2–3, Raf, FLT3, RET

Nilotinib (AMN107) KIT, PDGFRA/B, BCR-ABL

Dasatinib (BMS-354825) KIT, PDGFRB, BCR-ABL, SRC

Masitinib (AB1010) KIT, PDGFRA/B, FGFR3

Motesanib (AMG 706) KIT, PDGFRA/B, VEGFR1–3, FLT3 ou RET

Vatalanib (PTK787/ZK222584) KIT, PDGFRA/B, VEGFR1–3

Regorafenib KIT, PDGFRB, VEGFR1–3, B-Raf, RET

Cediranib (AZD2171) KIT, PDGFRA/B, VEGFR1–3, FLT3, RET

Panobinostat Histone deacetylase

PKC412 KIT, PDGFRA/B, VEGFR2, proteína cínase C

Everolimus mTOR

Retaspimycin (IPI-504) HSP-90

PDGFRA/B = Platelet-derived growth factor receptor α/β; FLT3 = FMS-like tyrosine kinase 3; RET = glial cell-line derived neurotrophic factor receptor (REarranged during Transfection); BCR-ABL = breakpoint cluster region-Abelson gene; SRC = proto-oncogenic tyrosine kinases; FGFR3 = fibroblast growth factor receptor 3; Raf = serine/threonine-protein kinase; mTOR = mammalian target of rapamycin; HSP-90 = heat shock protein 90.

Tabela adaptada de Reichardt, P.306

69

Estudos recentes descreveram que os doentes com GISTs que progrediram após diferentes opções

terapêuticas (estabelecidas e/ou experimentais) podem obter benefício clínico quando é

reintroduzido o mesmo agente terapêutico a que tinham previamente respondido (imatinib;

sunitinib)307, 308. Quando não existe outra opção, a manutenção do tratamento com o mesmo agente

pode retardar a progressão da doença.

Na ausência de ensaios clínicos para tratamento alternativo, a continuação ou a reintrodução do

inibidor tirosina-cinásico a que o doente já foi exposto pode ser uma opção adequada24, 138.

70

71

OBJECTIVOS

72

73

OBJECTIVOS

Objectivo geral

O objectivo geral da presente dissertação consistiu na caracterização clínico-patológica, imuno-

histoquímica e molecular de uma série de doentes consecutivos com GIST, diagnosticados e

tratados numa unidade de cuidados terciários de saúde (Hospital de São João) em Portugal.

Pretendia-se caracterizar os fundamentos do diagnóstico e clarificar os princípios do tratamento

destes tumores, numa perspectiva multidisciplinar, com especial ênfase na terapêutica cirúrgica.

Adicionalmente, pela análise da sobrevida dos doentes, pretendia-se clarificar o possível impacto de

parâmetros de prognóstico e preditivos da resposta terapêutica em doentes com GIST.

Objectivos específicos

1. A ressecção cirúrgica é o tratamento de eleição para os GISTs primários e pode ser curativa. No

entanto, o impacto da extensão da ressecção sobre o prognóstico dos doentes continua a ser

objecto de discussão.

Objectivo: Analisar o valor prognóstico da qualidade das margens cirúrgicas no tratamento dos

doentes com GIST primário.

2. Os GISTs em localização extragástrica ou extra-intestinal são menos frequentes e têm sido pouco

analisados. Nestes casos, o diagnóstico diferencial com outros tumores mesenquimatosos é

particularmente importante, não só pelo risco de comportamento agressivo, mas também pelas

implicações terapêuticas específicas, que incluem drogas dirigidas a alvos moleculares.

Objectivo: Avaliar os procedimentos de diagnóstico de GIST no esófago, que é uma localização

rara deste tipo de tumores, e rever as opções terapêuticas mais adequadas nesta localização.

3. Há evidências que indicam que os GISTs incluem tumores geneticamente muito heterogéneos,

com prognósticos distintos e respostas variáveis ao tratamento com os inibidores tirosina-cinásicos

aprovados para o tratamento não-cirúrgico (ex: imatinib e sunitinib) dos doentes.

Objectivo: Avaliar o estado mutacional dos genes KIT e PDGFRA numa série de doentes, para

correlacionar as características clínico-patológicas e moleculares identificadas e o seu impacto no

prognóstico dos doentes com GIST.

4. Os GISTs resultam geralmente de mutações oncogénicas nos genes KIT ou PDGFRA, e numa

percentagem variável (10-40%) de casos não se identificam alterações genéticas nestes genes

(GISTs wild-type).

74

Objectivo: Esclarecer as alterações moleculares alternativas em GISTs wild-type, procurando

identificar alterações potencialmente úteis para o diagnóstico e eventualmente preditivas de resposta

a terapêuticas dirigidas a novos alvos moleculares em doentes com GIST.

5. Os parâmetros com impacto prognóstico importante nos GISTs primários incluem: dimensão

maior, localização no tubo digestivo/extragastrointestinal, ruptura tumoral, índice mitótico, tipo de

mutações do KIT / PDGFRA e qualidade da ressecção cirúrgica. Contudo, alguns casos continuam

a revelar comportamento biológico imprevisível, levando à necessidade da pesquisa de novos

marcadores moleculares com valor prognóstico e/ou preditivo para os doentes.

Alguns marcadores (ex: proteína RKIP - Raf kinase inhibitory protein) são considerados supressores da

metastização e têm sido reconhecidos como parâmetros de prognóstico em diferentes cancros (ex:

carcinomas da próstata, colo-rectais e gástricos).

Objectivo: Avaliar a expressão de RKIP, a sua associação com diferentes parâmetros clínico-

patológicos, e esclarecer o papel deste marcador em doentes com GISTs primários.

75

MATERIAL E MÉTODOS

76

77

MATERIAL E MÉTODOS

Uma vez que cada subcapítulo da secção de resultados corresponde a um trabalho publicado com

material e métodos, decidiu-se simplificar o mais possível a estrutura deste capítulo nesta dissertação.

Foram avaliados os registos clínicos e patológicos e o material relacionado com todos os casos

consecutivos de tumores estromais gastrointestinais (GISTs) diagnosticados e tratados no período

decorrido entre 1989 e 2006 (18 anos) nos serviços de Cirurgia Geral e Anatomia Patológica do

Hospital de S. João do Porto, Portugal.

De entre todos os doentes admitidos com o diagnóstico de “tumor mesenquimatoso” do tubo

digestivo neste período, foram identificados 114 casos em que se confirmou o diagnóstico de

GIST.

1 - Parâmetros clínicos e cirúrgicos

Foram estudados os seguintes parâmetros clínicos dos doentes: género, idade, localização do tumor

primário, sintomas clínicos e sinais de apresentação. O tipo de ressecção cirúrgica (enucleação,

ressecção atípica/em cunha, ressecção segmentar, ressecção total/subtotal de órgão e ressecção

“em bloco”) do tumor foi avaliado em cada um dos 96 casos com ressecção macroscópica

completa. Os procedimentos cirúrgicos foram agrupados da seguinte forma: enucleação, ressecção

em cunha/segmentar, ressecção total/subtotal de órgão e ressecção “em bloco”.

2 - Parâmetros anátomo-patológicos e imuno-histoquímicos

Todo o material anátomo-patológico disponível foi avaliado em cortes de 4-µm corados por

hematoxilina-eosina (HE) [número médio de fragmentos estudados por caso: 6,1 (intervalo: 1-26)],

e o diagnóstico de GIST foi estabelecido de acordo com a classificação da Organização Mundial de

Saúde (OMS) 309. Os parâmetros analisados em cada tumor foram: o maior diâmetro (cm), estado

das margens de ressecção [negativas (R0) e positivas (microscópicas/R1 e macroscópicas/R2)], tipo

celular (fusiforme, epitelióide e misto), presença ou ausência de necrose, índice mitótico (número de

mitoses por 50 CGA) e classificação de risco do GIST ─ muito baixo (MB), baixo (B), intermédio

(I) e alto (A) risco 182.

Os estudos imuno-histoquímicos foram realizados em cortes de 3-µm representativos de cada

tumor usando o princípio do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase. Foram utilizados os

78

seguintes anticorpos policlonais anti-humanos de coelho: CD117, actina, desmina, proteína S100 e

CD34. Foram também utilizados anticorpos primários dirigidos contra o fosfo-KIT, SCF, fosfo-

ERK e RKIP. Os procedimentos imuno-histoquímicos foram realizados segundo metodologia já

descrita pelo nosso grupo e por outros autores310-313, com algumas modificações. Muito

resumidamente, as lâminas desparafinadas e rehidratadas foram incubadas durante 10 minutos em

3% de peróxido de hidrogénio em metanol, para inibir a peroxídase endógena. Após incubação

com anticorpo primário, foi aplicado o anticorpo secundário biotinilado anti-polivalente de cabra

durante 10 minutos, seguido de incubação com os complexos estreptavidina-peroxídase. A reacção

imunológica foi visualizada utilizando DAB (diaminobenzidina) como cromogéneo. Qualquer

imuno-reactividade (forte/fraca, focal, moderada ou difusa) membranar (CD117) e/ou

citoplasmática (CD117, actina, desmina e CD34), e nuclear (proteína S100) das células foi

considerada como positiva. No estudo imuno-histoquímico da expressão de fosfo-KIT, SCF, fosfo-

ERK e RKIP avaliou-se a extensão e a intensidade da imuno-reactividade. A extensão da imuno-

reactividade foi avaliada numa escala de 0 a 3 (0, ausência de células positivas; 1, <25% de células

positivas; 2, 26-50% de células positivas; e 3,>50% de células positivas) e a intensidade também

numa escala de 0 a 3 (0, negativa; 1, fraca; 2, moderada; 3, forte). A pontuação final usada resultou

da soma das pontuações atribuídas à extensão e à intensidade (negativa: 0 a 2; moderadamente

positiva: 3 e 4; e fortemente positiva: 5 e 6). Foram incluídos controlos positivos e negativos

apropriados para cada procedimento. Para os controlos negativos foram omitidos anticorpos

primários. Todos os cortes foram contrastados com hematoxilina.

3 - Extracção de ADN

As amostras foram obtidas por dissecção de áreas seleccionadas, com pelo menos 85% de tecido

tumoral, para um tubo de micro-centrifugação, utilizando agulha esterilizada (Neolus 25G - 0,5 mm).

A extracção de ADN foi realizada como previamente descrito314. Resumidamente, as amostras

foram desparafinadas mediante extracção seriada com xilol e etanol em concentrações decrescentes

(100%-70%-50%), e secagem ao ar. O ADN foi extraído utilizando o QIAamp® DNA Micro Kit da

Qiagen.

4 - Análise de mutações nos genes KIT e PDGFRA

A análise mutacional do gene KIT foi realizada seguindo metodologia descrita previamente36, 311, 314.

Nos GISTs wild-type para o gene KIT foram ainda investigadas mutações hotspot no gene PDGFRA.

O ADN foi submetido a amplificações por reacção de polimerização em cadeia (PCR; polymerase

chain reaction) seguida de sequenciação directa, para os exões 11 do KIT e 12, 14 e 18 do PDGFRA, e

de uma pré-selecção pela técnica de polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP; single

strand conformational polymorphism), seguida de sequenciação directa dos casos positivos, para os exões

9, 13, 14 e 17 do KIT. Resumidamente, a reacção PCR foi realizada com um volume final de 25µL,

79

nas seguintes condições: 1x Buffer (Bioron, Germany), 1,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTPs

(desoxirribonucleotídeos-trifosfato), 0,5 µM de iniciadores e 1 U de SuperHot Taq Polymerase. A análise

SSCP dos exões 9, 13, 14 e 17 foi realizada num gel 1x MDE (mutation detection enhancement), com

adição de percentagens diferentes de glicerol na análise de diferentes exões. Vinte microlitros de

produto da PCR foram incubados a 95ºC durante 10 minutos com um volume igual do

tampão de corrida de formamida [98% de formamida, 10 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético

(EDTA) e 1 mg/mL de azul de bromofenol e xileno cianol]. Os géis SSCP foram processados a

20ºC, e as amostras com padrão SSCP diferente do normal foram sequenciadas directamente.

Todos os casos foram confirmados duas vezes, com nova amplificação por PCR e técnicas de SSCP

e de sequenciação directa.

5 - Análise de mutações na região 3’ do exão 11 do KIT e nos genes H-RAS, K-RAS, N-RAS e BRAF

A pré-selecção das regiões hotspot do KIT (região 3’ do exão 11), H-RAS, K-RAS, N-RAS [exões 1

(codões 12-13) e 2 (codão 61)] e BRAF (exões 11 e 15) foi efectuada por PCR – SSCP, seguida pela

realização de sequenciação directa do ADN nas amostras que evidenciaram uma alteração da

mobilidade. Resumidamente, a reacção PCR foi realizada com um volume total de 25µL,

consistindo em 1 µL de solução de ADN, 0,3 µM de iniciadores paralelos e anti-paralelos, 200 µM

de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1x Taq Buffer incompleto e 1 U de Taq Superhot DNA Polymerase. A

reacção consistiu numa desnaturação inicial a 96ºC durante 10 minutos, seguida por 40 ciclos de

desnaturação a 96ºC durante 45 segundos, hibridação a 55-60ºC durante 45 segundos e extensão a

72ºC durante 45 segundos, seguida de uma extensão final de 10 minutos a 72ºC, num Thermocycler.

As sequências iniciadoras para todos os genes foram como anteriormente descrito315-317. Os

produtos da PCR foram misturados com quantidade equivalente do tampão desnaturante de

formamida [98% de formamida, 10 mM de EDTA, 1 mg ⁄ml de azul de bromofenol e xileno

cianol]. Após desnaturação a 98ºC durante 10 minutos e arrefecimento em gelo, 20 µL da mistura

foram adicionados a um gel 1x MDE e percentagens variáveis de glicerol para os genes KIT, K-

RAS, H-RAS e N-RAS, e a um gel 0,8x MDE sem glicerol para o BRAF. As amostras que, na

análise SSCP, apresentaram um padrão diferente do habitual foram sequenciadas directamente.

Todos os casos foram confirmados duas vezes, com nova amplificação por PCR independente

seguida de sequenciação directa.

6 - Análise da metilação no promotor do gene RKIP

Foi determinado o padrão de metilação do ADN na região promotora do gene RKIP através da

PCR específica para metilação (MSP; methylation-specific PCR), segundo técnica anteriormente

descrita318, com algumas modificações. Foi previamente efectuado tratamento de 200 ng de ADN

com bissulfito, usando o EZ DNA Methylation Golf Kit. Foram usados iniciadores específicos para

80

distinguir o ADN metilado (produto de PCR com 204 pb) do ADN não metilado (produto de PCR

com 205 pb), tal como os controlos de ADN metilado e ADN não metilado adequados.

7 - Follow-up e análise estatística

Os dados relativos ao follow-up dos doentes foram obtidos através de entrevistas directas com os

doentes ou com familiares, bem como pela análise dos registos hospitalares. A análise da sobrevida

dos doentes referenciados e seguidos em regime ambulatório baseou-se na actualização sistemática

dos dados da avaliação clínica e imagiológica de cada doente. Foi possível obter informação para

todos os casos seleccionados nas diferentes avaliações efectuadas. Os parâmetros clínicos e

patológicos estudados foram analisados como possíveis factores de prognóstico para recidiva local

ou à distância (metastização) e sobrevida especifica (SE), relacionada com a doença. A sobrevida

livre de doença (SLR) foi calculada a partir da data da cirurgia até à primeira evidência de recidiva,

local ou à distância (ou ambas), nos tumores submetidos a ressecção macroscópica completa; foram

excluídos desta análise os tumores com ressecção R2. A sobrevida foi calculada a partir da data de

diagnóstico até à morte relacionada ou não com a doença, ou censurada na data da última

observação.

A análise da sobrevida global (SG), da SE e da SLR dos casos submetidos a ressecção foram

determinadas pelo método de Kaplan-Meier e pelo teste Log rank, com o programa SPSS, versões

14.0 e 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). A associação entre variáveis clínico-patológicas ou

moleculares e a recidiva do tumor foi analisada com o teste Qui-quadrado ou com o teste exacto de

Fisher, consoante os casos. O hazard ratio (HR) foi calculado (na análise univariada) com o modelo

de regressão de Cox separadamente para cada variável, e foi considerado estatisticamente

significativo o valor de probabilidade inferior a 0,05 (p≤0,05). A análise multivariada foi efectuada

com o modelo de riscos proporcionais de Cox e apenas foram incluídas as variáveis consideradas

estatisticamente significativas na análise univariada.

81

RESULTADOS

Os cinco trabalhos que a seguir se apresentam reproduzem os estudos efectuados para o

esclarecimento das questões levantadas no capítulo de objectivos desta dissertação.

82

83

Trabalho I

84

Surgical Margin Status and Prognosis of GastrointestinalStromal Tumor

Antonio M. Gouveia Æ Amadeu P. Pimenta Æ Ana F. Capelinha ÆDionısio de la Cruz Æ Paula Silva Æ Jose M. Lopes

Published online: 7 August 2008

� Societe Internationale de Chirurgie 2008

Abstract

Background Surgery is the best treatment for primary

GIST and may be curative, but resection extension/com-

pleteness impact on the prognosis remains controversial.

The authors aim was to evaluate the clinicopathological

(CP) parameters and surgical margins status influence on

GIST patients’ outcome.

Materials and methods The study evaluated 113 con-

secutive patients with sporadic GIST; the influence of CP

parameters on recurrence-free survival (RFS) and disease-

specific survival (DSS) was determined by univariate

analysis (UA) and multivariate analysis (MA).

Results Of 104 cases, macroscopically complete resec-

tion was achieved in 96: R0 surgical margin status in 78

and R1 in 18. Recurrence rates (12.5%) were significantly

lower in R0 (9.0%) than in R1 (27.8%). Tumor [10 cm,

mitotic count[5/50 high power field (HPF), and high-risk

GIST predicted poor RFS and DSS (UA). Disease-specific

survival was significantly shorter after macroscopic

incomplete (R2) resection, for mixed cellular morphology,

and in tumors with necrosis (UA). High-risk GIST (p =

0.016) and R2 resection (p = 0.013) predicted poor DSS of

patients (MA).

Conclusions High risk and positive macroscopic surgical

margin status are parameters associated with poor disease-

specific survival in GIST patients.

Introduction

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common

of the mesenchymal tumors, accounting for up to 3% of

malignant tumors of the gastrointestinal tract (GI). Lack of

reproducible diagnostic criteria led to previous classifica-

tion of such tumors as leiomyomas, leiomyoblastomas, and

leiomyosarcomas, avoiding accurate actual use based on

older published work of GI sarcoma surgical management.

Recent reports define GIST as a c-KIT (CD117) positive

mesenchymal tumor [1].

Gastrointestinal stromal tumors vary in their malignant

potential, with a spectrum ranging from virtually benign

tumors, to tumors with uncertain malignant potential, to

highly malignant tumors. The proportion of overtly

malignant or high-risk GISTs accounts for 20–45% of

diagnosed GISTs [2, 3].

Surgery is the best treatment for primary GISTs and may

be curative [4–11]. After successful complete or en bloc

removal of the tumor and surrounding tissue, surgery for

GIST should establish a complete margin of normal tissue

around the primary tumor site [4–7, 12–17]. Incomplete

resection is considered a major factor predictive of poor

prognosis in GIST patients. However, the effect of com-

pleteness and extension of GIST resection on the prognosis

of patients remains controversial [4, 7, 12, 13, 16, 17].

Because controversy remains regarding the prognostic

value of surgical margins in the management of patients

with GIST, we aimed to develop a study in which to

A. M. Gouveia � A. P. Pimenta

Department of Surgery, Hospital de S. Joao/Porto Medical

School, Al. Prof. Hernani Monteiro, 4202-451 Porto, Portugal

A. M. Gouveia � A. P. Pimenta � P. Silva � J. M. Lopes (&)

Institute of Molecular Pathology and Immunology of the

University of Porto (IPATIMUP), R. Dr. Roberto Frias,

4200-465 Porto, Portugal

e-mail: jmlopes@ipatimup.pt

A. F. Capelinha � D. de la Cruz � P. Silva � J. M. Lopes

Department of Pathology, Hospital de S. Joao/Porto Medical

School, Al. Prof. Hernani Monteiro, 4202-451 Porto, Portugal

123

World J Surg (2008) 32:2375–2382

DOI 10.1007/s00268-008-9704-8

evaluate prognostic clinicopathological parameters and

surgical margins status on the outcome in a series of 113

consecutive patients diagnosed with primary GIST at the

University Hospital of S. Joao, Porto, Portugal.

Materials and methods

Clinical and pathological files and material related to all

consecutively primary gastrointestinal stromal tumors

(GISTs) diagnosed in the 18 years between 1989 and 2006

were retrieved from the Surgery and Pathology Depart-

ments of Hospital S. Joao, Porto, Portugal.

Clinical and surgical parameters

Clinical parameters of the patients included gender, age,

primary tumor site, clinical symptoms, and signs at pre-

sentation. The type of surgical resection (enucleation,

wedge resection, segmental resection, total/subtotal organ

resection, en bloc resection) of the tumor was evaluated in

each case. Surgical procedures were grouped as follows:

wedge/segmental, enucleation, total/subtotal organ resec-

tion, and en bloc resection.

Pathological parameters

All available pathological material was evaluated on 4-lm

hematoxylin & eosin–stained sections [mean number of

fragments studied per case: 6.1 (range: 1–26)], and the

diagnosis of GIST was established according to the WHO

classification [1].

Analyzed parameters for each tumor included largest

size (cm), negative (R0) and positive (microscopic-R1, and

macroscopic-R2) resection margin status [18], cell type

(spindle, epithelioid, and mixed), presence or absence of

necrosis, mitotic activity [number of mitoses per 50 high

power field (HPF), 9400], and risk group of the GIST—

very low (VL), low (L), intermediate (I), and high (H) [19].

The immunohistochemistry analysis was performed on

representative 3-lm sections of each tumor using the

streptavidin-biotin-peroxidase complex principle. Rabbit

polyclonal anti-human antibodies used were raised against

CD117 (dilution 1:500; clone A 4502, DAKO A/S, Den-

mark), actin (dilution 1:100; clone HHF35, DAKO, A/S,

Denmark), desmin (dilution 1:50; Zymed Laboratories,

South San Francisco, CA), S100 protein (dilution 1:1000;

DAKO A/S, Denmark), and CD34 (dilution 1:40; clone

QBEnd/10, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle-upon-

Tyne, UK).

Briefly, deparaffinized and rehydrated slides were sub-

jected to 10 min incubation in 3% hydrogen peroxide in

methanol, in order to inhibit endogenous peroxidase. No

antigen retrieval was used. After incubation with primary

antibody at room temperature for 30 min, the secondary

biotinylated goat anti-polyvalent antibody was applied for

10 min, followed by incubation with the streptavidin-per-

oxidase complex. The immune reaction was visualized by

DAB as a chromogen (Ultravision Detection System Anti-

polyvalent, HRP/DAB; Lab Vision, Fremont, CA). Any

(strong/weak, focal, moderate, or diffuse) membrane

(CD117) and/or cytoplasm (CD117, actin, desmin, and

CD34), and nuclear (S100 protein) immunoreactivity of the

cells was considered as positive staining. Appropriated

positive and negative controls were included in each run:

interstitial cells of Cajal in a section of normal intestine

were used as positive control for CD117; smooth layers, for

actin and desmin; small nerves, for S100 protein; and

vessels, for CD34. For negative controls, primary anti-

bodies were omitted. Mast cells, smooth layers, small

nerves, and vessels were used as internal positive controls

in the cases tested. All sections were counterstained with

hematoxylin.

Follow-up and statistical analysis

Follow-up information was collected through direct inter-

view with patients or their relatives, and by review of in-

hospital patient files. Outcome data were available for all

patients as of December 2007. Studied clinical and patho-

logical parameters were analyzed as possible prognostic

factors for local or distant (metastasis) recurrence and dis-

ease-specific survival (DSS). Recurrence-free survival

(RFS) was calculated from the time of surgery until the first

evidence of recurrence, either distant or local, or both, in

tumors with macroscopic complete resection; tumors with

R2 resection were excluded for this calculation. Survival

was calculated from the time of diagnosis until death related

or not with the disease, or censored at the time of latest

follow-up. Eight GIST patients with surgically resected

tumors were treated with imatinib, as follows: because of

tumor recurrence in five patients; as neodjuvant treatment in

one case; as adjuvant treatment in one en-bloc-resected

high-risk tumor; and because of R2 status margin in one

patient. Recurrence-free survival, overall survival (OS), and

DSS of all resected tumors were determined by Kaplan-

Meier analysis [20], with SPSS software for Windows

(version 14.0). Association between clinicopathological

variables (e.g., risk group and margin status) and tumor

recurrence was evaluated with the chi-square test or Fish-

er’s exact test, as appropriate. Crude hazard ratio (HR) was

computed (univariate analysis) with separate Cox regres-

sions for each variable, and a probability value of less than

0.05 (p value\0.05) was considered statistically significant.

Multivariate analysis was performed with the Cox propor-

tional hazards model, and only variables that were deemed

2376 World J Surg (2008) 32:2375–2382

123

statistically significant by univariate analysis were consid-

ered for the final Cox model.

Results

Clinical data

The patients entered into this study were 113 Caucasian

patients with 114 sporadic tumors; one patient had

metachronous gastric and colon GISTs. The series included

59 (52.2%) women and 54 (47.8%) men, with a median age

of 66 years (range: 20–88 years). At presentation, major

symptoms and signs included gastrointestinal bleeding

(37.0%), abdominal pain (12.9%), abdominal mass (7.4%),

tumor rupture (6.5%), and bowel obstruction (3.7%). Some

24.1% of patients were asymptomatic and their tumors

were incidental findings on radiological examination and

after surgery for other conditions.

By site, the tumors were located as follows: stomach

(58.6%), small bowel (30.6%), colon/rectum (4.5%), mes-

entery (3.6%), esophagus (1.8%), and omentum (0.9%); in

three cases accurate localization was not possible because

of the large dimension of the tumors.

One patient, diagnosed by endoscopic biopsy, was not

submitted to surgery because of extensive local disease and

poor general condition. Surgical resection was macro-

scopically complete in 96 (84.9%) and incomplete in 8

tumors. In the remaining 9 (8%) cases, tumor resection was

not performed because of the presence of liver metastases

and diffuse peritoneal disease (3 cases), and extensive local

invasion (6 cases).

The median follow-up time of patients was 42.6 months

(range: 1–206 months), and the 5-year cumulative overall

survival was 63.8%.

Surgical treatment

Only patients with surgically resected tumors (n = 104)

were considered for further analysis. The mean and median

ages of those men and women were 63.4 years and

66 years, respectively (range: 20–88 years), and the male/

female ratio was 0.8/1. Tumor frequency by primary site

was as follows: 62 (59.6%) stomach, 33 (31.7%) small

bowel, 4 (3.8%) colon and rectum, 3 (2.9%) mesentery, and

1 each in the esophagus and omentum.

The surgical procedures by primary site of tumor were

as follows: stomach: wedge resection (29 [46.8%]), enu-

cleation (12), distal/subtotal gastrectomy (12), total

gastrectomy (7), and extended en bloc resection (2); small

bowel: segmental resection (24 [72.7%]), enucleation (7),

pancreaticoduodenectomy (1), and extended resection (1);

colon: segmental resection (2), total colectomy (1), and en

bloc resection (1); for esophagus: Ivor-Lewis resection (1);

for mesentery: enucleation (2) and segmental resection (1);

for omentum: enucleation (1).

In 7 cases tumor rupture occurred in association with

either peritonitis (4 cases) or hemoperitoneum (3 cases);

tumor resection was accomplished in 5 patients, and

postoperative death occurred secondary to peritonitis and

shock/multiorgan failure in two patients; despite tumor

resection, peritoneal recurrence leading to death occurred

in 2 patients.

Pathological parameters

The mean and median tumor sizes were 6.8 cm and 5.1 cm,

respectively (range: 0.5–24 cm). The tumor dimension was

B5 cm in 52 cases, from [5 to B10 cm in 30 cases, and

[10 cm in 22 cases.

Tumor cell morphology of the GISTs was spindle in

66.3%, epithelioid in 12.5%, and mixed in 21.2%. Strong

membrane and/or cytoplasm tumor cell immunoreactivity

for CD117 was found in variable focal, moderate, or dif-

fuse areas in 96 (92.3%) of the GISTs. In three cases,

CD117 immunoreactivity was weak. Eight (7.7%) GISTs

did not disclose CD117 immunoreactive tumor cells.

Interstitial cells of Cajal and mast cells, as internal positive

controls, were variably observed in every case. The fre-

quency and expression features of the other antibodies was

variable from case to case, and within the same tumor, as

follows: focal/rare tumor cells for actin (52.1%), desmin

(6.4%), and S100 protein (17.9%); and moderate/diffuse

for CD34 (72.7%)—data not shown. Six of eight CD117-

negative GISTs expressed CD34 without any tumor cell

expression for other markers tested.

Tumor necrosis was observed in 55 cases. The mean/

median mitotic rates were 4.6/3.0 mitoses/50 HPF (range:

0–27 mitoses). Mitotic count was B5 mitoses/50 HPF in 80

tumors and [5 mitoses/50 HPF in 24 tumors. The GISTs

were classified according to risk group as follows: 70

(67.3%) very low/low/intermediate risk (14 VL; 33 L; 23

I); and 34 (32.7%) high risk.

Margin status was classified as R0 in 78 tumors, R1 in

18 (9 enucleations; 9 wedge/segmental resections), and R2

in 8 (1 enucleation; 3 wedge/segmental resections; 2 total/

subtotal organ resections; 2 en bloc resections).

Follow-up and outcome

The 5-year recurrence-free survival (RFS) was 89.8% and

77.3% at 10 years, with a median follow-up time of

46 months (range: 1–206 months). The overall recurrence

rate was 12.5% (12 cases) distributed as follows: local

stomach serosa (1); diffuse peritoneal metastases (4); liver

metastases (4); and synchronous peritoneal and liver

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123

metastases (3). The percentage of recurrence was signifi-

cantly lower (p = 0.045) in R0 tumors (9.0%) than in R1

(27.8%) tumors. The recurrence rate in very low/low and

intermediate risk tumors (4.4% and 4.5%, respectively)

was significantly lower (p = 0.001) than in high-risk

(34.6%) GISTs. Imatinib treatment (400 mg daily) was

carried out in five recurrent GISTs with escalation to

600 mg daily whenever indicated. Surgical treatment was

attempted in three cases: (a) R0 resection (local gastric

recurrence); (b) R2 resection (extensive peritoneal metas-

tases); and (c) surgical biopsy (synchronous peritoneal and

liver metastases). These patients are alive without (a) and

with (b, c) evidence of disease at last follow-up.

The 5-year/10-year cumulative disease-specific survival

(DSS) was 87.7%/81.7%, with a median follow-up time of

45.9 months (range: 1–206 months). None of the 39

(37.9%) patients who died, 5 of them within the immediate

postoperative (one month) period, were submitted to

autopsy study. In 13 patients the cause of death was the

tumor. In the surviving patients, 5 are with and 59 are

without evidence of disease; 7 are under imatinib treat-

ment, without evidence of disease (n = 2), with a partial

response (n = 2), and with stable disease (n = 3).

Prognostic evaluation

Table 1 summarizes clinicopathological parameters of the

series. In the univariate analysis, tumor size [10 cm and

number of mitoses per 50 HPF [5 were predictive of a

poor RFS (HR = 5.61; p = 0.015 and HR = 4.22; p = 0.013,

respectively) and DSS (HR = 8.83; p = 0.006 and HR =

5.24; p = 0.004, respectively). Patients with high-risk

GISTs had a significantly shorter RFS and DSS than those

with very low/low/intermediate risk GISTs (HR = 7.63; p =

0.002 and HR = 22.8; p \ 0.003, respectively). The DSS

was shorter after macroscopical incomplete (R2) resection

(Fig. 1), and this difference was statistically significant

(HR = 13.56; p\0.001); RFS showed a trend to be shorter

after R1 resection (HR = 3.03; p = 0.059) Disease-specific

survival was shorter for mixed cellular type and in tumors

with necrosis (HR = 3.81; p = 0.027 and HR = 5.73; p =

0.023, respectively). Age, gender, and primary site of

tumor were not significant prognostic parameters.

Prognostic value of risk group and margin status for DSS

was significant in the multivariate study (Table 2): high-risk

tumors (p = 0.016) and macroscopic positive (R2) margin status

(p = 0.013) were predictive of poor survival in GIST patients.

Discussion

Gastrointestinal stromal tumors occur predominantly in

middle-aged and older patients (median age 63 years [21,

22]), without gender predominance. They are infrequent in

patients younger than 40 years. They originate in the GI

tract with a frequency as follows: stomach (40–70%), small

intestine (20–40%), colon and rectum (5–15%), esophagus

(\5%), and rarely in the mesentery, omentum, retroperi-

toneum, and other intra-abdominal structures [4, 15, 22–

28]. Our series, like those in most reports, reveals no

influence of either age or gender on the survival of GIST

patients.

Small GISTs (B2 cm) are virtually benign, usually

asymptomatic, and are detected during investigations or

surgical procedures for unrelated disease. The symptoms of

GIST are most commonly related to mass effect or bleed-

ing. The most common symptom at presentation is GI

bleeding [21] resulting from erosion of the tumor into the

lumen of the GI tract. Tumor rupture into the abdominal

cavity is also possible, causing life-threatening hemor-

rhage. Patients with GIST may also exhibit various other

symptoms that include early satiety, abdominal pain or

discomfort, nausea, vomiting, obstruction, abdominal

mass, dysphagia, jaundice, and anemia-related symptoms

[21, 29]. In our series, asymptomatic GIST comprised 1/4

(24.1%) of all cases, and this may account for the lower

incidence of synchronous metastatic disease and more

favorable prognosis compared with most of the reported

data.

Gastrointestinal stromal tumors can be composed of

spindle (70%), epithelioid (20%), or mixed cells [19]. Our

histological findings are consistent with the results

obtained by most groups. Immunohistochemistry, as an

important tool in the differential diagnosis from other

neoplasms, disclosed 7.7% CD117-negative tumors in our

series. Molecular analysis of KIT and PDGFRA hot spot

genes described in GISTs and already published by our

group [30] fits with reported series and may help the final

diagnosis of difficult cases.

Many clinical and pathological parameters may influ-

ence survival of GIST patients [4, 10, 11, 13, 24, 31–42]. In

our study, parameters found in multivariate analysis to

significantly influence DSS were incomplete macroscopic

(R2) tumor resection and high risk group. Other parame-

ters, such as tumor size[10 cm, mitotic count[5/50 HPF,

cellular morphology, and tumor necrosis, showed statistical

significance in the univariate analysis for DSS. Prognosis

after primary surgical resection is dependant on GIST

malignant potential [4, 5], but prognostic grading systems

to identify high risk or malignant GIST remain contro-

versial and are still under investigation [10, 19, 36, 43, 44].

With various grading systems, the rate of recurrence after

primary surgical treatment of high-grade GISTs reported in

the literature is high [5, 10–13, 19, 37, 45] and their

prognosis is poor [4, 5, 10, 11, 32, 33, 37, 38, 46, 47]. With

the consensus grading system [19], the RFS and OS after

2378 World J Surg (2008) 32:2375–2382

123

primary surgical treatment of high-risk GIST is short [11,

19, 37, 47]. The recurrence rate in our series was signifi-

cantly associated with the risk grade of GIST, and high-risk

tumors were associated with poor DSS in both the uni-

variate and the multivariate analyses.

Several reports showed higher risk for recurrent disease

and shorter OS after primary resection of large tumors

([5 cm or[10 cm) [4, 5, 10, 24, 31, 32, 36–38, 46–52]. We

found tumor size larger than 10 cm to be a predictive factor

for poor DSS in the univariate analysis. Primary tumor site

Table 1 Clinicopathological parameters and recurrence-free survival/disease-specific survival of Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST)

patients

Parameters RFSa DSS

n (%) Events (n) HR 95% CIb p Value n (%) Events (n) HR 95% CI b p Value

Agec (years)

B60 37 (39) 4 1 – 39 (38) 4 1 –

[60 59 (61) 8 1.63 0.49–5.44 ns 64 (62) 9 1.61 0.49–5.25 ns

Genderc

Female 54 (56) 5 1 – 57 (55) 4 1 –

Male 42 (44) 7 1.83 0.58–5.79 ns 46 (45) 9 2.92 0.89–9.51 0.075

Tumor site

Stomach 60 (63) 7 1 – 62 (59) 6 1 –

Small bowel 29 (30) 3 0.91 0.24–3.54 ns 33 (32) 5 1.56 0.47–5.10 ns

Other 7 (7) 2 2.43 0.50–11.78 ns 9 (9) 2 2.36 0.48–11.74 ns

Type of surgery

Wedge/segmental resection 53 (55) 6 NA NA 56 (54) 7 NA NA

Enucleation 21 (22) 2 NA NA 22 (21) 0 NA NA

Total/subtotal organ resection 20 (21) 4 NA NA 22 (21) 4 NA NA

En bloc resection 2 (2) 0 NA NA 4 (4) 2 NA NA

Tumor size (cm)

B5 51 (53) 3 1 – 52 (50) 2 1 –

[5 to B10 29 (30) 3 1.44 0.29–7.18 ns 30 (29) 3 1.56 0.22–11.11 ns

[10 16 (17) 6 5.61 1.40–22.50 0.015 22 (21) 8 8.83 1.87–41.77 0.006

Cellular morphology

Spindle 67 (70) 5 1 – 69 (66) 5 1 –

Epithelioid 12 (12) 3 3.13 0.75–13.15 ns 13 (13) 2 2.06 0.39–10.63 ns

Mixed 17 (18) 4 3.13 0.84–11.66 ns 22 (21) 6 3.81 1.16–12.50 0.027

Necrosis

Absent 49 (51) 4 1 – 49 (47) 2 1 –

Present 47 (49) 8 2.43 0.73–8.08 ns 55 (53) 11 5.73 1.27–25.89 0.023

Mitotic count (/50 HPF)

B5 77 (80) 6 1 – 80 (77) 5 1 –

[5 19 (20) 6 4.22 1.36–13.11 0.013 24 (23) 8 5.24 1.71–16.06 0.004

Risk group

Very low/low/Intermediate 69 (72) 3 1 – 70 (67) 2 1 –

High 27 (28) 9 7.63 2.06–28.19 0.002 34 (33) 11 22.8 2.93–176.29 0.003

Margin status

R0 78 (81) 7 1 – 78 (75) 5 1 –

R1 18 (19) 5 3.03 0.96–9.56 0.059 18 (17) 3 2.44 0.58–10.21 ns

R2 NA – – – – 8 (8) 5 13.56 3.89–47.26 \0.001

a Excluded R2 casesb 95% confidence interval for HRc One patient with two metachronous tumors

RFS, recurrence-free survival; DSS, disease-specific survival; HR , hazard ratio; HPF, high power field (9400); NA, not applicable; ns, not

significant

World J Surg (2008) 32:2375–2382 2379

123

(stomach or small bowel) was not correlated with RFS or

DSS in our patients. A number of previous reports showed

better OS for stomach primary GISTs [24, 53, 54], but the

frequency of lower versus higher risk GISTs varies among

the different sites. Lower risk tumors usually outnumber

malignant GISTs in the stomach, probably because GIST is

often an incidental finding in this location [36].

Conventional chemotherapy and external beam radio-

therapy are well-known unsuccessful treatments for

advanced GISTs. Imatinib has been effective in patients

with metastatic and recurrent GIST [55–59]. Furthermore,

it may be used as neoadjuvant treatment by experienced

multidisciplinary teams, particularly when function-sparing

surgery is the goal (e.g., rectal or esophageal tumors). I-

matinib treatment is acceptable for patients with high-grade

GISTs, after incomplete resection, or tumor rupture, to

control the risk of recurrence [15, 44, 58, 60, 61]. The

results achieved in the few cases of our series treated with

imatinib fit with those reported in literature.

Five-year survival rates after GIST resection is reported

to range from 32% to 76% [4, 7, 9, 10, 12, 13, 24, 31–33,

36, 37, 39, 52, 62], probably as a result of different clini-

copathological features and management procedures of the

studied cohorts. Series concerning primary GISTs report

higher resectability rates and longer overall survival. In

addition, old published series of GI sarcomas may be

contaminated with other (non-GIST) histology tumor types

[4, 24, 52, 63–65]. Only a few series have evaluated the

DSS of GIST patients, showing higher 5-year DSS than

5-year OS [4, 10–12, 33, 35, 37–39, 66]. In our series,

surgical resection of primary GISTs was associated with

87.7% 5-year DSS, which compares favorably with

reported studies. In our patients, 5-year RFS after macro-

scopic tumor resection was 89.8%. At variance with the

findings reported by Ng et al. [33], our results show that

only 5/12 recurrences occurred during the first 2 years of

follow-up, and 4/12 occurred after 5 years of follow-up. As

expected, most recurrences were abdominal metastasis

(liver metastasis, peritoneal sarcomatosis, or both), a result

reported by others [4, 13, 35, 67]. In one case with local

recurrence complete tumor resection was achieved.

Because GISTs tend to protrude from the primary site

and displace the surrounding organs/structures, wedge or

segmental resection is usually an adequate surgical option.

The surgeon should make every effort to achieve complete

resection of the tumor, which may require a subtotal or

total organ resection or the removal of adjacent organs. In

our study, resection of the tumor was achieved in 85%,

which compares favorably with other reports (range: 48–

90%) [4, 7, 9, 44, 52]. Considering extension of the sur-

gical procedure to achieve complete resection, the role of

lymphatic dissection may be an issue [4, 5, 7, 12, 13, 33,

65, 68] in the treatment of GISTs. Because of the low rate

of reported lymph node involvement (4%) and/or sub-

sequent lymph node metastases [5], there seems to be no

added survival benefit from radical resection or extensive

lymphadenectomy in the surgical treatment of GISTs. Even

in high-grade GISTs, lymphadenectomy is indicated only

when there is evidence of lymph node tumor involvement.

The postoperative course of patients with preoperative

tumor rupture or tumor rupture during resection surgery

was similar to that of patients with R2 resection, as in our

series, with shorter overall survival (median survival of

17 months) in a reported series of GISTs [33]. Thus, as

others do, we believe that laparotomy is in general more

appropriate than laparoscopy in the treatment of tumors

with features predictive of friability and of large GISTs.

Review of major published series shows several authors

who emphasize complete macroscopic resection [4, 5, 15,

33, 35, 41, 47], whereas others highlight R0 resections

[8–10, 12, 13, 17, 32, 42, 69] as good standard of care in

the surgical treatment of GISTs. Some report that

Fig. 1 Disease-specific cumulative survival according to margin

status of Gastrointestinal Stromal Tumors (GISTs, n = 104). Cumu-

lative survival is significantly lower in cases with R2 tumor resection

(p \ 0.001)

Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors of disease-

specific survival of GIST patients

Parameter HR 95% CIa p

Risk group

Very low/low/intermediate 1.00

High 13.87 1.65–116.86 0.016

Margin status

R0 1.00

R1 1.54 0.34–7.08 0.57

R2 5.72 1.44–22.71 0.013

a 95% confidence interval for HR

2380 World J Surg (2008) 32:2375–2382

123

microscopic (positive or negative) surgical margin status,

at variance with reports of other solid malignant tumors, do

not influence patient survival or even tumor recurrence in

GIST [4, 5, 70]. However, the number of microscopic

positive margins after macroscopic complete resection in

the published series is relatively small and cannot serve as

the basis for sound statistical conclusions. These series

included a high number of large and high-grade GISTs, in

which complete resection does not seem to avoid tumor

recurrence and shorter patient survival. In addition, some

of these reports may be biased by adjuvant treatment of

advanced, incompletely resected GISTs [4, 48]. Other

authors report that microscopic negative surgical margin

status (R0) influence GIST prognosis [9–12, 16, 32, 37, 51,

71]. These results may be influenced by a higher number of

incomplete resections in high-risk GISTs [37].

In our series, complete surgical resection (R0 or R1) was

achieved in 92.3% of GISTs, and microscopic negative

margin status (R0) was accomplished in 75% of resected

GISTs. The recurrence rate was significantly lower in R0

than in R1 resections, but only the presence of macroscopic

residual tumor (R2) was significantly associated with dis-

ease progression and short survival of our patients. In

accordance with DeMatteo et al. [4] and Pierie et al. [5],

our study of a small number of cases confirms that gross

tumor resection influences outcome, with shorter DSS in

GIST patients with R2 surgical margin status. We believe

that surgical resection should include a margin of at least

1 cm of normal tissue [6, 17, 42, 70], and that an intra-

operative examination of frozen tissue sections by a

pathologist is called for when there is a possibility of a

positive tumor margin.

Acknowledgment This work was supported in part by Novartis

Oncology, Portugal.

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Trabalho II

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Diseases of the Esophagus (2005) 18, 70–73© 2005 ISDE

Blackwell Publishing, Ltd.Original article

Esophageal GIST: Therapeutic implications of an uncommon presentation of a rare tumor

A. M. Gouveia,1,3 A. P. Pimenta,1,3 J. M. Lopes,2,3 A. F. Capelinha,2 S. S. Ferreira,1 C. Valbuena,2 M. C. Oliveira1,3

1Serviço de Cirurgia B and 2Pathology Department, Oporto Medical School and Hospital de São João and 3Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Oporto, (IPATIMUP), Oporto, Portugal

SUMMARY. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are rarely reported in the esophagus. The authorsreport a patient with an esophageal GIST, incidentally found after an echocardiogram. CT scan and endo-scopic ultrasonography showed the tumor in the dependence of the muscularis propria of the esophageal wall.An Ivor–Lewis esophagectomy was performed. The tumor was well-circumscribed involving the submucosal andthe muscular layers of the esophagus, measuring 13.5 ×××× 8.5 ×××× 7.6 cm, without involving the surgical margins.Histologically, the tumor consisted of spindle cells, with low mitotic index (2/50 HPF), that were immuno-reactive for KIT (CD117) and CD34, consistent with GIST of high risk of aggressive behavior. No adjuvanttherapy was given to the patient, who is alive and without evidence of disease 1 year after surgery. Sinceesophageal GISTs are rarely reported in the literature and usually have a poor prognosis, the diagnostic differ-entiation of these tumors from other more common mesenchymal neoplasms is essential, both for therapeuticand prognostic reasons.

KEY WORDS: clinical features, esophagectomy, esophagus, GIST, immunohistochemistry, treatment.

INTRODUCTION

Gastrointestinal stromal tumors (GIST) aredefined as c-KIT (CD117, stem cell factor receptor)– positive mesenchymal spindle or epithelioid celltumors in the gastrointestinal (GI) tract. Depend-ing upon the histologic findings, GISTs wereclassified for many years as leiomyomas, leiomyo-blastomas and leiomyosarcomas, as a result of theirapparent origin in the muscularis propria of theGI tract wall. Although rare, they are the mostcommon mesenchymal tumors of the GI tract andaccount for up to 3% of GI tract malignant tumors.GISTs predominate in the stomach (50–70%) andsmall bowel (20–33%).

In the esophagus, squamous carcinoma and adeno-carcinoma are the common malignant tumorsand leiomyoma the most frequent mesenchymalneoplasm. GISTs have been documented very rarely(< 5%) in the esophagus. Therefore, the diagnosticdifferentiation of GISTs from other mesenchymalneoplasms, particularly in the esophagus, is essen-

tial not only because the former group has a highrisk of malignant behavior, but is usually respon-sive to a new recently targeted therapy, STI-571(imatinib mesylate) – a receptor tyrosine kinaseinhibitor of the activated KIT protein, as fre-quently observed in GISTs.

We report herein an esophageal GIST incident-ally found in a patient who underwent an echocar-diogram. Clinical presentation, diagnosis, and riskclassification of aggressive behavior will be dis-cussed, as well as the available therapeutic optionsfor these tumors.

Patient report

In the course of a hypertension investigation a59-year-old man underwent an echocardiogramthat raised the suspicion of an aortic dilatation. Hehad no digestive symptoms and his past medical his-tory was unremarkable. Clinical examination wasirrelevant and his hematological and biochemicalprofile was normal. A CT scan revealed a well-outlined tumor in the posterior mediastinum,apparently originating in the left lateral esophagealwall without involving the lumen of the esophagus(Fig. 1a). The tumor was independent from the

Address correspondence to: Dr António M. Gouveia, Serviço de Cirurgia B, Hospital de São João, 4202–451 Porto, Portugal. Email: am.gouveia@netcabo.pt

Esophageal GIST 71

aorta, and extended from the tracheal bifurcationto the esophagogastric junction: it was a solidlesion, capturing contrast heterogeneously with apoorly outlined central hipocapturing region. Anesophagogastroscopy showed deformity of the eso-phageal wall extending from 35 cm to 40 cm fromthe incisors, apparently caused by compression of asubepithelial mass (Fig. 1c); no lesions were foundin the stomach. Endoscopic ultrasonography con-firmed the tumor features revealed by the CT scanand showed that the tumor was located in themuscularis propria (Fig. 1b).

An Ivor–Lewis esophagectomy was performed tocompletely resect the tumor and the patient had anuneventful postoperative recovery, without adjuvantchemotherapy or radiotherapy.

The patient is asymptomatic and with no clinicalevidence of tumor recurrence or metastasis after12 months of follow-up.

Pathologic features

The tumor was a well-circumscribed gray-whitefibrous mass measuring 13.5 × 8.5 × 7.6 cm, involv-ing the submucosa and the muscular layers, andsparing the mucosa of the esophagus (Fig. 1d). Thecut surface showed foci of hemorrhage, necrosisand cystic areas in the tumor.

Histologically, the lesion was composed of amoderately cellular proliferation of spindle cellsembedded in a collagenous matrix (Fig. 2b) withfoci of hyalinization. The cells had cytoplasmic vacuo-lization, low pleomorphism and there were somebizarre cells (Fig. 2b-inset). Mitotic index was 2/50high power fields (HPF: 0.152 mm2). There were

areas of tumor hemorrhage and necrosis. There wasno invasion of the mucosa (Fig. 2a) and the surgi-cal margins were free of tumor. Immunohisto-chemical studies were performed and tumor cellsstained diffusely for KIT (CD117; Fig. 2d), and CD34(Fig. 2c), and focally for HHF35. None of the cellsstained for pS100 or desmin. Proliferation index,using Ki-67, was less than 1%.

The diagnosis of esophageal GIST, with high riskof aggressive behavior, was performed using the cri-teria of the International Consensus on GIST.1

DISCUSSION

Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are themost common mesenchymal tumors of the humangastrointestinal (GI) tract, but they are rare (1–3%)in the esophagus.2,3

‘Gastrointestinal stromal tumor’ used to be acollective term referring to primary mesenchymaltumors of the GI tract, but now it is consideredto be a particular tumor that originates from theinterstitial cell of Cajal (ICC), or its precursor, inthe GI tract wall and has expression of the tyrosinekinase receptor KIT in almost all cases.4–7

In 1998 the presence of gain-of-function muta-tions in the c-KIT proto-oncogene were found inGISTs.4 Those mutations are thought to be respon-sible for constitutive ligand-independent activationof KIT and subsequent tumor pathogenesis.1,4,8,9

More recently, PDGFRA activating mutations weredescribed in the small group of GISTs (about 10%)lacking KIT mutations.10

The specific diagnosis of GIST before biopsy orsurgery is quite difficult in any location. Althoughthe diagnosis can be often suspected histologically,

Fig. 1 Esophageal GIST: (a) CT scan disclosing well-circumscribed tumor in the posterior mediastinum; (b) endoscopic ultrasonography showing the intraparietal esophageal location of the tumor; (c) endoscopy showing the endoluminal esophageal aspect of the tumor, without ulcerating the mucosa; and (d) macroscopy of the tumor, after longitudinal section of the esophagus. Note the smooth appearance of the mucosa over the tumor.

Fig. 2 Esophageal GIST: (a) histologic low power view showing submucosal involvement by the tumor; (b) tumor spindle cells and collagenous stroma, inset: bizarre tumor cells; (c) CD34 immunoreactivity of tumor cells; and (d) CD117 (KIT) immunoreactivity of tumor cells.

72 Diseases of the Esophagus

the term GIST is usually applied, as in our case, forneoplasms displaying KIT (CD117) immunoposi-tivity, with very rare exceptions.1

In a published series of 68 patients with esopha-geal mesenchymal tumors,11 Miettinen et al. found48 (71%) leiomyomas and 17 (25%) GISTs. TheGISTs were located in the distal esophagus anddysphagia was the typical symptom. In two patientsthe tumor was an incidental radiologic finding, asin our case, in spite of the large dimension of thetumor. It is noteworthy that this was the only casewith esophageal localization found by us in a seriesof 78 GISTs.12

According to the consensus approach for defin-ing risk of aggressive behavior, GISTs are classifiedinto low-, intermediate- and high-risk groups,depending on the size and mitotic index of thetumor.1 There is a tendency to consider smallGISTs (< 2 cm in diameter) with low mitotic activ-ity as having a good prognosis. However, a fewGISTs apparently lacking mitotic activity maymetastasize, which raises difficulties in predictingthe behavior of GISTs on an individual basis.Therefore, we concur that it is important to stressthat all patients with GIST must be carefully andregularly followed up for an indefinite period, inlight of the uncertainties expressed above and thedocumented tendency of these tumors to pursue anindolent clinical course with significant risk of laterelapse.1 Some authors reported that esophagealGISTs are often diagnosed late and tend to beassociated with a poor prognosis.1,13 In the paperpublished by Miettinen et al.,11 12 out of 17esophageal GISTs were classified as high risk, as inour case.

Complete surgical resection is the standard oftreatment for primary GIST, with no need for widemargins or regional lymphadenectomy. In our case,due to the large dimension of the tumor, an Ivor–Lewis esophagectomy was performed and the surgi-cal margins were free of tumor. Survival of patientswith GIST, after resection of all gross disease,varies considerably in published series. Five-yearsurvival rates for these patients range from 35% to65%, depending on the inclusion of patients withdisseminated disease.3,14,15

Gastrointestinal stromal tumors appear to serveas a model for molecular-based diagnosis and treat-ment of solid tumors and for this reason patholo-gists will play a vital role in the diagnosis andtreatment of these cases.20,22–24 Treatment of GISTshas changed dramatically since the introduction ofimatinib mesylate (Glivec/Gleevec; Novartis Onco-logy). This is a small molecule that selectivelyinhibits the enzymatic activity of the ABL andBCR-ABL fusion protein, platelet derived growthfactor receptor, and KIT tyrosine kinases. Imatinibmesylate inhibits the mutated KIT receptor

observed in most GISTs, leading to the onset ofapoptosis and decreased proliferation of tumorcells. Preliminary results of several trials indicatethat imatinib is an effective and safe treatment inpatients with unresectable, recurrent, and metastatictumors.16–21 The role of imatinib in the adjuvant set-ting has also been the subject of recent interest.Bumming et al. reported four patients treated formicroscopic positive margins with a recurrence-freeinterval of 7–13 months.25 The American College ofSurgeons Oncology Group (ACOSOG) is sponsor-ing two ongoing adjuvant trials, in patients withprimary tumors presenting selected risk criteria(larger tumors; intraperitoneal tumor rupture orhemorrhage; multifocal tumors).

Although a radical excision of the tumor wasperformed in all but one patient of the Miettinenet al. series,11 nine patients of this series died of dis-ease, with a median survival of 29 months, stressingthe aggression of GISTs in esophageal localization.Thus, it would be interesting to consider the useof imatinib in the adjuvant setting, particularly inlarge and high-risk GISTs of the esophagus.

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99

Trabalho III

100

Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs:evaluation of a Portuguese series

A L Gomes,1 A Gouveia,2,3,5 A F Capelinha,2,4,5 D de la Cruz,4 P Silva,2,4,5 R M Reis,1

A Pimenta,3,4,5 J M Lopes2,4,5

1 Life and Health SciencesResearch Institute (ICVS),School of Health Sciences,University of Minho, Braga,Portugal; 2 IPATIMUP, Instituteof Molecular Pathology andImmunology of the University ofPorto, Porto, Portugal;3 Department of Surgery, PortoUniversity, Porto, Portugal;4 Department of Pathology, H.S.Joao, Porto University, Porto,Portugal; 5 Medical Faculty ofPorto University, Porto, Portugal

Correspondence to:Professor Dr Jose Manuel Lopes,Rua Roberto Frias, s/n, 4200-465 Porto, Portugal; jmlopes@ipatimup.pt

ALG and AG contributed equallyto this study.

Accepted 10 April 2007Published Online First9 November 2007

This paper is freely availableonline under the BMJ Journalsunlocked scheme, see http://jcp.bmj.com/info/unlocked.dtl

ABSTRACTAim: To assess KIT and PDGFRA mutations frequencies ina Portuguese series of gastrointestinal stromal tumours(GISTs).Methods: 78 GISTs were evaluated for CD117 expressionand screened for mutations in KIT (exons 9, 11, 13, 14and 17) and PDGFRA (exons 12, 14 and 18) genes.Results: KIT activating mutations were identified in 44(56%) of the 78 GISTs. Forty cases (91%) presented amutation in KIT exon 11, and 4 (9%) in exon 9. One caseshowed a 4 bp deletion in intron 14. PDGFRA mutationswere observed in 5 cases (6%): 2 (3%) in exon 12 and 3(4%) in exon 18. Survival analysis was performed in 63 ofthe 78 GISTs. The presence of mutated KIT wassignificantly correlated with shorter survival of patients(p = 0.0460), and inversely associated with epithelioidhistological type of GISTs (p = 0.0064).Conclusions: Overall, the incidence of both KIT andPDGFRA mutations in these Portuguese series was 63%,being in agreement with other studies, mainly of Iberianpopulations. The great majority of mutations were locatedin KIT exon 11, statistically associated with worseprognosis and indicative of favourable response toimatinib-based therapy in this Portuguese series of GISTs.

Gastrointestinal stromal tumours (GISTs)although rare, are considered to be the mostfrequent gastrointestinal mesenchymal tumoursin humans.1 A Scandinavian study estimated theincidence of GISTs to be between 20 and 40 permillion.2 In Portugal, as far as we know, anepidemiological study is yet to be done.

The cellular origin of GISTs is not fully under-stood, but they are thought to arise from inter-stitial cells of Cajal or their precursors, due to theirsimilar positive KIT (CD117) and CD34 stainingand negative staining for both desmin and S-100protein immunostaining.1 3 GISTs are rarely foundoutside the gastrointestinal tract, being mostcommonly found in the stomach (40–70%), smallintestine (20–50%) and colon or rectum (5–15%).1 2 4 Nowadays, the diagnosis of GISTs ispartially dependent on tumour cells overexpressionof CD117 together with CD34.5 The expression ofsuch immunohistochemistry features is useful todifferentiate GISTs from other mesenchymaltumours of the gastrointestinal tract, namelyleiomyomas and leiomyosarcomas, nerve sheathtumours, and other primary and metastatictumours possibly occurring in this location.1 2 4

KIT belongs to the class III receptor tyrosinekinases (RTKs), which also include platelet-derivedgrowth factor A and B (PDGFRA, PDGFRB),colony stimulating factor-1 receptor (CSF1R) and

FMS-related tyrosine kinase 3 (FLT3).6 These RTKsare characterised by the presence of an extracellulardomain, a transmembrane domain, a juxtamem-brane domain, and an intracellular domain wherethe two kinase domains are lodged.7 RTK activa-tion occurs when by ligand binding, the receptordimerises and suffers conformational transforma-tions, which induce activation of the kinasedomains. These, in turn, lead to activation ofimportant intracellular signalling pathways, suchas RAS/mitogen activated protein kinase (RAS/MAPK), phosphoinositide-3 kinase (PI3K), andsignal transducers and activators of transcription(STAT), which regulate many physiological func-tions such as cell survival, proliferation, differentia-tion, adhesion and apoptosis.7 8

GISTs are molecularly characterised by muta-tions in KIT oncogene, located in the long arm ofchromosome 4 (4q11–12).9 There is a broadspectrum of KIT mutations in GISTs, ranging from20% to 80%, most of them being located in thejuxtamembrane domain (exon 11), followed bymutations in the extracellular domain (exon 9),and seldom in the kinase (exon 13 and 17) and ATPpocket (exon 14) domains.10–12 Later studiesreported the presence of activating mutations inthe PDGFRA oncogene in wild-type KIT bearingGISTs.13 14 PDGFRA is also located at 4q11–12 andexhibits similar RTK cellular functions.13 14 Thehotspot regions in this gene lie in the juxtamem-brane (exon 12) and kinase (exons 14 and 18)domains, and have been reported in 5–12% ofcases.12 14 The frequency of KIT/PDGFRA muta-tions in GISTs varies from series to series, probablyreflecting epidemiological and methodological dif-ferences in the various studies on record.10 12

Until recently, the treatment of GISTs waslimited to surgical removal of the tumour.Unfortunately, even in patients where the tumourwas completely and successfully removed, therewas a high probability of recurrence.1 The devel-opment of imatinib mesylate (Glivec/Gleevec,Novartis, Basel, Switzerland), a selective inhibitorof RTKs, has brought new hope for GIST patients.Imatinib targets KIT by competing with its ATPbinding site, preventing further phosphorylationsof downstream intracellular signalling moleculesresponsible for its oncogenic properties.15 16 Severalstudies have showed the importance of KIT andPDGFRA molecular status in the imatinibresponse.10 12 It has been reported that patientswith tumours harbouring exon 11 KIT mutationsare more likely to respond to imatinib therapy thanthose with either exon 9 KIT mutations orundetectable mutations.10 12

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In Portugal, the incidence of both KIT and PDGFRAmutations in GISTs is, to the best of our knowledge, unknown.Since different genotypic features give rise to different drugresponses and thus different prognosis, it becomes important todefine which patients will positively respond to imatinibtreatment. Therefore, we characterised the occurrence of KITand PDGFRA mutations in a series of Portuguese GIST patients.

MATERIALS AND METHODS

Tissue samplesSeventy-eight formalin-fixed and paraffin-embedded consecu-tively diagnosed primary, previously untreated, sporadic GISTs,classified according to World Health Organization criteria5 andrisk group,17 were retrieved from files (1989–2005) from thePathology Department of S. Joao Hospital, Porto, Portugal. Allpatients were Caucasian and of Portuguese origin, with a meanage of 61.7 years (range 20–88). Thirty-eight (48.7%) patientswere female and 40 (51.3%) were male. Follow-up data,managed according to the guidelines of the European Societyof Medical Oncology,18 were available in 63 patients (range 0.2–206.0 months, mean 122.8 (12.1) months, median 132.6 (26.8)months) in September 2006.

ImmunohistochemistryThe immunohistochemistry procedure was performed accordingto the streptavidin–biotin–peroxidase complex principle, usingrabbit polyclonal anti-human antibodies raised against CD117(dilution 1:500; clone A 4502, DAKO, Carpinteria, Denmark),actin (dilution 1:100; clone HHF35, DAKO), desmin (dilution1:50; Zymed Laboratories, San Francisco, California, USA), S100protein (dilution 1:1000; DAKO) and endothelial cell markerCD34 (dilution 1:40; clone QBEnd/10, NovoCastra Laboratories,Newcastle-upon-Tyne, UK). Briefly, deparaffinised and rehy-drated slides were subjected to 10 min incubation in 3% hydrogenperoxide in methanol, in order to inhibit endogenous peroxidase.No antigen retrieval was used. After incubation with primary

antibody at room temperature for 30 min, the secondarybiotinylated goat anti-polyvalent antibody was applied for10 min, followed by incubation with streptavidin–peroxidasecomplex. The immune reaction was visualised by DAB as achromogen (Ultravision Detection System Anti-polyvalent, HRP/DAB; Lab Vision, Fremont, California, USA). Any (strong/weak,focal, moderate or diffuse) membrane (CD117) and/or cytoplasm(CD117, actin, desmin, and CD34), and nuclear (S100 protein)immunoreactivity of the cells was considered as positive staining.Appropriated positive and negative controls were included in eachrun: interstitial cells of Cajal in a section of normal intestine wereused as positive control for CD117, smooth layers for actin anddesmin, small nerves for S100 protein, and vessels for CD34. Fornegative controls, primary antibodies were omitted. Mast cells,smooth layers, small nerves, and vessels were used as internalpositive controls in the cases tested. All sections were counter-stained with haematoxylin.

DNA isolationSelected areas containing at least 85% of tumour tissue weremacrodissected into a microfuge tube using a sterile needle(Neolus, 25 G, 0.5 mm). DNA isolation was performed asdescribed previously.19 Briefly, the dissected tissue was depar-affinised by a serial extraction with xylol and ethanol (100%–70%–50%) and allowed to air-dry. DNA was extracted usingQiagen’s QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany),following the manufacturer’s instructions. DNA samples werestored at 220uC for further analysis.

KIT mutation analysisKIT mutation analysis was performed as described pre-viously.19 20 DNA was subjected to PCR amplifications followedby direct sequencing for exon 11, and pre-screening by singlestrand conformational polymorphism (SSCP) analysis for exons9, 13, 14 and 17, followed by direct sequencing of SSCP positivecases. Briefly, the PCR reaction was carried in a final volume of

Figure 1 Morphological andimmunohistochemical features ofgastrointestinal stromal tumours (GISTs).(A) spindle cell and (B) epithelioid tumourcells with (C) membranar/cytoplasmicand (D) cytoplasmic/paranuclear dotimmunoreactivity for CD117. Noteimmunoreactivity of interstitial cells ofCajal (C, inset). H&E and ABCimmunohistochemistry (2006).

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25 ml, under the following conditions: 16 buffer (Bioron,Ludwigshafen, Germany); 1.5 mM MgCl2 (Bioron); 200 mMdNTPs (Fermentas, Hanover, Maryland, USA); 0.5 mM primers(previously described by Corless et al,21 except for exon 14: 59-TCTCAC CTT CTT TCT AAC CTT TTC TT-39 (forward); 59-CCCATG AAC TGC CTG TCA AC-39 (reverse); MWG-Biotech,Ebersberg, Germany); and 1 unit of Super Hot Taq Polymerase(Bioron, Germany). SSCP analysis of exons 9, 13, 14 and 17 wasperformed in a 16 MDE gel (MDE: mutation detectionenhancement, Cambrex, Charles City, Iowa, USA), with 6%glycerol addition in the exon 13 analysis, and 3% glycerol additionin exon 14 analysis. PCR product (20 ml) was incubated at 95uCfor 10 min with an equal volume of formamide loading buffer(98% formamide, 10 mM EDTA, and 1 mg/ml bromophenol blueand xilene cyanol). SSCP gels were run at 20uC. Samples with aSSCP pattern different from the normal pattern were directlysequenced. All cases were confirmed twice with a new PCRamplification, SSCP and direct sequencing analysis.

PDGFRA mutation analysisTumours bearing a wild-type KIT gene were further screened forhotspot PDGFRA mutations (exons 12, 14 and 18) as previouslydescribed.19 20 Briefly, the PCR reaction was carried out in a finalvolume of 25 ml, under the following conditions: 16 buffer(Bioron); 1.5 mM MgCl2 (Bioron); 200 mM dNTPs (Fermentas);0.5 mM primers (previously described by Heinrich et al13; MWG-Biotech) and 1 unit of Super Hot Taq Polymerase (Bioron). PCRwas followed by direct sequencing. All cases were confirmed twicewith a new PCR amplification and direct sequencing analysis.

Statistical analysisThe available clinical and molecular data were analysed withStatView for Windows, V.5.0. Overall survival time analysis using

Kaplan–Meyer and log rank tests was performed with SPSS forWindows, V.14.0. Probability values ,0.05 were consideredsignificant.

RESULTS

ImmunohistochemistryStrong membrane and/or cytoplasm tumour cells immunoreactiv-ity for CD117 was found in variably focal, moderate or diffuseareas in 72 (92%) GIST cases (fig 1). In three cases, CD117immunoreactivity was weak. Six GIST cases (8%) did not showCD117 immunoreactive tumour cells. Interstitial cells of Cajal andmast cells, used as internal positive controls, were always variablyobserved in each case. Table 1 summarises statistical analysis ofCD117 immunostaining and clinical–pathological features.CD117 immunoreactivity was significantly associated(p = 0.015) with spindle cell and epithelioid GIST subtypes. Thefrequency and expression features of the other antibodies wasvariable from case to case, and within the same tumour, as follows:actin (51%), desmin (6%), S100 protein (18%), and CD34 (73%);immunoexpression was observed in focal areas/rare tumour cellsfor actin, desmin, and S100 protein, whereas CD34 immunoex-pression was found in moderate or diffuse areas (data not shown).Four of the six CD117 negative GISTs expressed CD34 withoutany tumour cell expression for the other markers tested.

KIT mutation analysisMutation screening analysis revealed that 44 of 78 GISTs (56%)presented KIT activating mutations (table 2). Forty casesshowed mutation in exon 11 (91%, 40/44) and four cases inexon 9 (9%, 4/44). Among the exon 11 mutations, we observed3–54 bp in-frame deletions in 24 tumours (60%, 24/40), eitheralone (62%, 15/24) or associated with missense mutations orinsertions (38%, 9/24), single base substitutions in 15 tumours(38%, 15/40) and an in-frame insertion associated with a pointmutation in 1 tumour (2%, 1/40). Additionally, a silentmutation (Y570Y) was detected in two GISTs. The exon 9sequence alterations consisted of Ala–Tyr duplication betweencodons 502 and 503 in three GIST cases, and a point mutation(G470R) in one case. One silent mutation was detected in bothexons 13 and 17 (P627P and S865S, respectively). Also, a 4 bpdeletion was detected affecting the intronic sequence followingexon 14 (IVS14+24:del4). In addition, to exclude the possibilityof false-negatives in the SSCP screening at exons 9, 13, 14 and17, 10 KIT wild-type GISTs were direct sequenced for all exons.No additional mutations were identified.

Table 3 shows statistical analysis of KIT mutations andclinical–pathological features. No correlation was detectedbetween KIT mutation status and CD117 expression(p = 0.39). However, all but two GISTs harbouring KITmutation were positive for CD117 expression. Additionally,the three GISTs with weak CD117 immunoreactivity depictedwild-type KIT. A statistically significant correlation wasobtained between the epithelioid morphology and lack of KITmutation (p = 0.0064). The presence of mutated KIT wassignificantly associated with shorter survival of patients(p = 0.0460) (fig 2). No correlation was obtained between anyspecific type of KIT mutation (point mutation, deletion, ormixed mutation), or its location (exon 9 or exon 11), andpatient survival (data not shown).

PDGFRA mutation analysisIn KIT wild-type GISTs, PDGFRA activating mutations wereidentified in five cases; two in exon 12, and three in exon 18

Table 1 Correlation analysis of CD117 with clinical and pathologicalfeatures of gastrointestinal stromal tumours (n = 63)

Parameter (n = 63)CD117 negative(%)

CD117 positive(%) p value

Age, y (SD) 54.6 (12.1) 61.2 (15.5) 0.37

Gender 0.13

Male 13.7 86.3

Female 3.3 96.7

Location 0.18

Gastric 5.9 94.1

Small intestine 5.0 95.0

Other 25.0 75.0

Dimension (cm) 0.76

,5 4.0 96.0

>5 5.7 94.3

Mitotic index (HPF) 0.34

,5 11.4 88.6

5–10 0.0 100.0

.10 0.0 100.0

Risk grade 0.93

VLR–LR 5.0 95.0

IR 6.7 93.3

HR 4.0 96.0

Histological type 0.02

Spindle cell 2.5 97.5

Epithelioid 0.0 100.0

Mixed 25.0 75.0

Follow-up, months (SD) 92.3 (32.8) 120.8 (12.6) 0.96

HPF, high power field (6400); VLR, very low risk; LR, low risk; IR, intermediate risk;HR, high risk.

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tion.

Original article

206 J Clin Pathol 2008;61:203–208. doi:10.1136/jcp.2007.047043

(table 4). The mutations in exon 12 consisted of a pointmutation (D583G) and an in-frame deletion (583del586). Twocases disclosed a point mutation (D842V) in exon 18; there wasanother case with a point mutation (I843T) together with an in-frame deletion (844del847). In addition, we identified two silentmutations, one in exon 12 (D577D) and another in exon 18(I834I). No mutation was observed in exon 14 of PDGFRA.Furthermore, mutational analysis of exons 12 and 18 showedthe presence of a known homozygous substitution A.G(polymorphism R) in the third position of the codon for proline567 in exon 12, and an insertion in intron 18 (IVS18-50insA).

All GISTs with PDGFRA mutations showed CD117 immu-noreactive tumour cells.

DISCUSSIONThe intensive cancer research in the last decade has highlightedthe fundamental role of RTKs, in particular of KIT andPDGFRA in GIST pathogenesis.10 These two RTKs are of greatvalue for therapeutic management as a result of the develop-ment of RTK inhibitors, such as imatinib and sunitinib.22–24

There is, however, insufficient epidemiological data on thefrequency and type of mutations in the KIT and PDGFRA genesin GISTs from countries in southern Europe countries, such asPortugal.

In this study, we have shown that 92% of GISTs expressCD117, irrespective of the topography, age or gender, inaccordance with previous studies in other populations.25 26 Nostatistically significant correlation was depicted between CD117expression and presence of KIT mutations (p = 0.3933). In fact,two of the six CD117-negative GISTs contained a KIT mutation(a missense mutation in exon 9, and a three base-pair deletion inexon 11). Other authors have also encountered KIT mutationsin CD117-negative GIST cases.27 Our molecular study wasuseful for the definitive diagnosis of GIST in 2/6 CD117negative cases. The frequency of the CD117-negative wild-typecases for KIT and PDGFRA mutations found in our series (5%),fits with results described in the literature.27

We showed the presence of KIT mutations in 56% of GISTcases, 91% (40/44) being located in exon 11. These frequenciesare in accordance with previously published ranges for otherpopulations (30–80%), particularly those of the IberianPeninsula.1 10 28 In 75% (30/40) of these cases, mutations were

clustered in the region between codons 550 and 561, known tobe the most frequently altered section of exon 11, with 57% (17/30) affecting codon 557 or 558. These two codons are reportedto be associated with the metastatic behaviour of GISTs.10 29

However, of these 17 GIST cases, only four recurred (4/17,24%). Even though it has been previously reported that all pointmutations occur exclusively in codons 557, 559, 560 and 576, wehave additionally encountered a novel point mutation in codon570 (Y570F).1 Mutations in KIT exon 9 have been correlatedwith a small intestinal topography, but only one of our fourGIST cases harbouring a mutation in this exon was located inthe small intestine.1 10 In the present study, and in agreementwith previous reports, KIT mutation positive status was shownto be associated with worse GIST prognosis, translated intoshorter patient survival.10

Figure 2 Kaplan–Meier curve for the 63 patients with gastrointestinalstromal tumours, regarding KIT alterations. Patients having a wild-typeKIT (n = 27) have a better prognosis than patients having tumoursharbouring mutated KIT (n = 36) (p = 0.046).

Table 3 Correlation of KIT mutations with clinical-pathological featuresof gastrointestinal stromal tumours (n = 63)

ParameterKIT mutationnegative (%)

KIT mutationpositive (%) p value

Age, y (SD) 57.2 (16.6) 62.8 (14.2) 0.16

Gender 0.94

Male 43.3 56.7

Female 42.4 57.6

Location 0.27

Gastric 51.4 48.6

Small intestine 35.0 65.0

Other 25.0 75.0

Dimension (cm) 0.93

,5 44.0 56.0

>5 42.8 57.2

Mitotic index (50 HPF) 0.80

,5 45.4 54.5

5–10 44.4 55.6

.10 33.3 66.7

Risk grade 0.70

VLR–LR 40.0 60.0

IR 53.3 46.7

HR 42.3 57.7

Histological subtype 0.01

Spindle 41.5 58.5

Epithelioid 100.0 0.0

Mixed 25.0 75.0

CD117 expression 0.39

Positive 40.4 59.6

Negative 60.0 40.0

Follow-up, months (SD) 148.7 (17.1) 100.8 (12.1) 0.05

HPF, high power field (6400); VLR, very low risk; LR, low risk; IR, intermediate risk;HR, high risk.

Table 4 Amino acid sequence of exons 12 and 18 of wild-type andmutated PDGFRA protein

Exon 12 580

Wild type L P Y D S R W E F P

Case 4 L P Y G S R W E F P

Case 71 L P Y – – – – E F P

Exon 18 840

Wild type A R D I M H D S N Y

Cases 41, 54 A R V I M H D S N Y

Case 34 A R D T – – – – N Y

–, deleted amino acid residues.

Original article

J Clin Pathol 2008;61:203–208. doi:10.1136/jcp.2007.047043 207

Concerning PDGFRA, mutations were detected in 6% (5/78)of our cases, corresponding to 15% of KIT wild-type GISTs.Two of these mutations are known to be imatinib-resistant(D842V).22 An association between gastric location and presenceof PDGFRA mutation has been reported.30 In our series,although the number of cases with mutations in PDGFRA islow for statistical evaluation (n = 5), 80% (4/5) of mutationsoccurred in the stomach.

It is now well established that the response of GIST patientsto imatinib-based therapy is dependent not only on thepresence, but also on the type of KIT and PDGFRA mutationexhibited.10 16 22 Specifically, mutations affecting the juxtamem-brane domain (exon 11, partial response in up to 84% of cases)or the extracellular domain (exon 9, partial response in up to48%) predict objective response to imatinib.10 16 22 On the otherhand, it is also known that some mutations are responsible forimatinib resistance, namely in KIT V654A and W670I (exon 13),D816V and T823D (exon 17), and PDGFRA D842V (exon18).16 31 32 Of these resistant mutations, only D842V mutationwas detected in two GISTs in our series. Recently, the US Foodand Drug Administration approved a new RTK inhibitor,sunitinib (Sutent, Pfizer, New York, USA) as a second-linetherapy for GIST patients who experience disease progression inspite of increased doses of imatinib, mainly due to primary oracquired secondary imatinib-resistant mutations, or who areunable to tolerate treatment with imatinib.24 33 Therefore, withthese two RTK inhibitors available, there is an imperative needto redefine GIST pathological (diagnosis/prognostic) evaluation,as well as to consider molecular characterisation of both KITand PDGFRA, in order to achieve an efficient and predictivetailored therapeutic management for each individual patient.

In conclusion, we have reported for the first time thefrequency of KIT and PDGFRA mutations in a large series ofPortuguese GIST patients. We have shown the presence of KITmutations in 56% of cases and PDGFRA mutations in 6% ofcases. In addition, the presence of mutated KIT was associatedwith a shorter patient survival. The great majority of KITactivating mutations (91%) were located in exon 11, indicativeof a favourable response to imatinib-based therapy in themanagement of these patients. Finally, our results might beuseful to integrate a multi-institutional consortium database forthe clarification of the epidemiology, biology and managementof GIST patients.

Funding: Supported by NOVARTIS Oncology, Portugal. ALG is the recipient offellowship grant (SFRH/BI/15257/2004) from FCT, Lisbon, Portugal.

Competing interests: None declared.

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Take-home messages

c The frequency of KIT and PDGFRA activating mutations hasbeen described in a series of Portuguese gastrointestinalstromal tumours (GISTs).

c Of the Portuguese patients with GISTs, 56% harboured KITmutations and 6% exhibited PDGFRA mutations.

c The presence of KIT mutations in GISTs was associated with aworse patient prognosis; however, these mutations areindicative of favourable response to imatinib-based therapy.

Original article

208 J Clin Pathol 2008;61:203–208. doi:10.1136/jcp.2007.047043

doi: 10.1136/jcp.2007.0470432007

2008 61: 203-208 originally published online September 7,J Clin Pathol A L Gomes, A Gouveia, A F Capelinha, et al. GISTs: evaluation of a Portuguese series

inPDGFRA and KITMolecular alterations of

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109

Trabalho IV

110

Low frequency of MAP kinase pathway alterationsin KIT and PDGFRA wild-type GISTs

Olga Martinho,1 Antonio Gouveia,2,3,4 Marta Viana-Pereira,1 Paula Silva,2,4

Amadeu Pimenta,2,3,4 Rui Manuel Reis1 & Jose Manuel Lopes2,4,5

1Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga,2IPATIMUP, Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto, 3Department of Surgery,

H.S. Joao, 4Medical Faculty of Porto University, and 5Department of Pathology, H.S. Joao, Porto, Portugal

Date of submission 10 July 2008Accepted for publication 16 December 2008

Martinho O, Gouveia A, Viana-Pereira M, Silva P, Pimenta A, Reis R M & Lopes J M

(2009) Histopathology 55, 53–62

Low frequency of MAP kinase pathway alterations in KIT and PDGFRA wild-type GISTs

Aims: Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) arecommonly driven by oncogenic mutations in KIT andPDGFRA. However, 10–40% of these patients are wild-type for these genes. The prognostic significance ofwild-type GISTs is controversial, and they rarelyrespond to imatinib. The aim of this study was toelucidate the molecular lesions underlying wild-typeGISTs tumorigenesis.Methods and results: Twenty-nine KIT and PDGFRAwild-type GISTs were re-assessed for the presence of‘cryptic’ KIT exon 11 duplications. Using a specificpolymerase chain reaction assay, three previouslyundetected mutations were identified. In the remaining26 wild-type GISTs, KIT, stem cell factor (SCF),phospho-KIT and phospho-ERK expression was evalu-

ated by immunohistochemistry. Samples were screenedfor gain-of-function mutations in the mitogen-activatedprotein kinase (MAPK) cascade. KIT and SCFco-expression associated with KIT activation wasobserved in approximately 30% of cases. Furthermore,phospho-ERK expression showed that MAPK is acti-vated in approximately 30% of cases. None of RASfamily (H-, K- and N-RAS) oncogenes exhibited acti-vating mutations, whereas BRAF mutations werefound in approximately 4% of cases.Conclusions: In the absence of RAS mutations, MAPKcould be activated through SCF ⁄ KIT autocrine ⁄ para-crine mechanisms and ⁄ or mutated BRAF in a subset ofKIT ⁄ PDGFRA wild-type GISTs.

Keywords: activation, GISTs, MAP kinase, mutations, wild-type

Abbreviations: DSS, disease-specific survival; EDTA, ethylenediamine tetraaceticacid; GIST, gastrointestinal stromaltumour; MAPK, mitogen-activated protein kinase; MDE, Mutation Detection Enhancement; NSCLC, non-small celllung cancer; PDGFRA, platelet-derived growth factor receptor a; RTK, receptor tyrosine kinase; SCF, stem cellfactor; SSCP, single-strand conformation polymorphism; VEGFR, vascular endothelial growth factor receptor;WHO, World Health Organization

Introduction

Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are the mostcommon primary mesenchymal tumours of the diges-tive tract.1,2 According to the World Health Organiza-tion (WHO) classification, GIST diagnosis should be

reserved for KIT (CD117)-positive mesenchymaltumours of the gastrointestinal tract. However, itis currently accepted that a small fraction of GISTs(5–10%) are CD117 negative.3–7 KIT is an oncoproteinthat belongs to the class III receptor tyrosine kinase(RTK) subfamily, being the stem cell factor (SCF) theligand, also known as KIT ligand, steel factor or mastcell growth factor.8–10 Upon binding of SCF to KIThomodimers, it induces dimerization and autophos-phorylation, which leads to activation of several

Address for correspondence: J M Lopes, Rua Dr Roberto Frias,

s ⁄ n, 4200-465 Porto, Portugal. e-mail: jmlopes@ipatimup.pt

O.M. and A.G. contributed equally to this work.

� 2009 The Authors. Journal compilation � 2009 Blackwell Publishing Limited.

Histopathology 2009, 55, 53–62. DOI: 10.1111/j.1365-2559.2009.03323.x

intracellular signalling cascades such as mitogen-acti-vated protein kinase (MAPK) (RAS ⁄ RAF ⁄ MEK ⁄ ERK),PI3K ⁄ AKT and STAT, regulating cellular proliferationand survival of cells.9,10

In GISTs, KIT overexpression is mainly driven bygain-of-function mutations of KIT gene, with a fre-quency that varies between studies from 30% to80%.11,12 The great majority of KIT mutations occurat exon 11, followed by exon 9 and rarely at exons 13,14 and 17.11,12 In addition, KIT wild-type GISTs canexhibit activating mutations of other class III RTKgenes, the platelet-derived growth factor receptor a(PDGFRA), which affects exon 18 more often, andrarely exons 12 and 14.12–14 It has been shown thatGIST patients harbouring KIT and PDGFRA activatingmutations are effectively treated with specific tyrosinekinase inhibitors such as Imatinib mesilate (Glivec�;Gleevec�).15,16 KIT and PDGFRA mutation frequencyvariation in GISTs may depend to some extent ontumour location, methodology and type of tissue used(frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded).11,12,14,17

Recently, Lasota et al. have suggested that KIT exon11 duplications may be undetected in formalin-fixedparaffin-embedded samples, due to the preferentialpolymerase chain reaction (PCR) amplification of thewild-type KIT allele over the large fragment mutantallele.18 In fact, using a PCR assay specific for the 30

region affected by duplications at exon 11, the authorsshowed the presence of these types of mutation in 4 ⁄ 16previously considered wild-type KIT formalin-fixedparaffin-embedded GISTs.18

Contrasting with the extensive knowledge of KIT andPDGFRA activation by gene mutations, few studieshave investigated the disruption of KIT signallingindependently of these genetic alterations.19–22 TheMAPK (RAS ⁄ RAF ⁄ MEK ⁄ ERK) pathway, one of theKIT downstream cascades, is highly preserved andimplicated in cell growth, differentiation, migration andsurvival.23 Activated RTK phosphorylates RAS, whichbinds RAF-1 kinase that phosphorylates MEK1 ⁄ 2,leading to ERK1 ⁄ 2 activation. Phosphorylated ERKtranslocates into nucleus and regulates gene expressionthrough several transcription factors such as c-Myc,CREB and AP-1, ultimately leading to changes in geneexpression.23 In several types of solid tumours, such aspancreatic, colonic, papillary thyroid and melanomas,this signalling pathway can be constitutively up-regulated by activating mutations of RAS family genes(N-RAS, K-RAS and H-RAS), or by downstream RAFfamily member gene BRAF.9,23–26 Importantly, con-stitutive activation of this RAS ⁄ RAF ⁄ ERK cascadecould modulate patient response to anti-RTK therapies,independently of the upstream RTK status.

Recently, we assessed KIT and PDGFRA mutationstatus in a formalin-fixed paraffin-embedded series ofGISTs.27 In the present study we aimed to clarify thepoorly characterized molecular picture of KIT andPDGFRA wild-type GISTs. Initially, the presence of‘cryptic’ KIT exon 11 duplication mutations wasre-evaluated. Then, the activation status of KIT andthe pattern of KIT ⁄ SCF autocrine ⁄ paracrine stimula-tion loops were assessed. We also evaluated alterationsof the MAPK signalling pathway by the analysis of RASfamily and BRAF mutations and the expression levelsof phosphorylated ERK. Doing so, we aimed to identifynew potential prognostic and therapeutic markers forKIT and PDGFRA wild-type GISTs.

Materials and methods

tissue samples

Twenty-nine formalin-fixed paraffin-embedded primarysporadic GISTs, previously characterized immuno-histochemically for CD117, actin, S100, desminand CD34, and molecularly for KIT and PDGFRAmutations, were retrieved from the Pathology Depart-ment of S. Joao Hospital files (1989–2005), Porto,Portugal.27 All patients were Caucasian of Portugueseorigin. Tumours were classified according to WHO,and the parameters analysed in each case included:age, gender, primary tumour site, tumour size,histological type, mitotic index and risk group.3,28

Follow-up data were available in all patients, as ofDecember 2007, and collected through direct inter-view with patients or their relatives, and by review ofin-hospital patient files.

dna isolation

Selected areas containing ‡85% of tumour tissue weremacrodissected into a microfuge tube using a sterileneedle (Neolus, 25 G, 0.5 mm; Leuven, Belgium) andDNA isolation was performed using Qiagen’s QIAamp�

DNA Micro kit (Qiagen, Hilden, Germany), as previ-ously described.27

mutation analysis of spec if ic 30

region of kit

exon 1 1 , h-ras, k-ras, n-ras and braf

Polymerase chain reaction-single-strandconformation polymorphismPre-screening of the hotspot regions affecting KIT (30

region of exon 11), H-RAS, K-RAS, N-RAS [exons 1(codons 12–13) and 2 (codon 61)] and BRAF (exons11 and 15) genes was performed by PCR–single-strand

54 O Martinho et al.

� 2009 The Authors. Journal compilation � 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55, 53–62.

conformation polymorphism (SSCP), followed by directDNA sequencing of samples that showed a mobilityshift in the PCR-SSCP analysis.

Briefly, the PCR was carried out in a total volume of25 ll, consisting of 1 ll of DNA solution, 0.3 lm ofboth sense and antisense primers (MWG-Biotech,Ebersberg, Germany), 200 lm of dNTPs (Fermentas,Glen Burnie, MD, USA), 1.5 mm of MgCl2 (Bioron,Ludwigshafen, Germany), 1· Taq Buffer incomplete(Bioron) and 1 U of Taq Superhot DNA Polymerase(Bioron). The reaction consisted of an initial denatur-ation at 96�C for 10 min, followed by 40 cycles ofdenaturation at 96�C for 45 s, annealing at 55–60�Cfor 45 s and extension at 72�C for 45 s, followed by afinal extension for 10 min at 72�C, in a Thermocycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Primer sequences for allgenes were as previously described.18,29,30

PCR products were mixed with an equivalent volumeof denaturing loading buffer [98% formamide, 10 mm

ethylenediamine tetraaceticacid (EDTA), 1 mg ⁄ mlbromophenol blue and xylene cyanol]. After denatur-ing at 98�C for 10 min and quenching on ice, 20 ll ofthe mixture was loaded onto a 1· Mutation DetectionEnhancement (MDE) gel (Cambrex, East Rutherford,NJ, USA) and 6% of glycerol for KIT, without glycerolfor K-RAS and with 3% glycerol for H-RAS and N-RASgenes and on a 0.8· MDE gel without glycerol forBRAF. The run was performed at 20�C for 16 h.Samples with a SSCP pattern different from the normalwere further directly sequenced (Stabvida, Oeiras,Portugal), as described.27 All cases were confirmedtwice with a new and independent PCR amplificationfollowed by direct sequencing.

immunohistochemistry analysis

of phospho-kit, scf and phospho-erk

Representative 3-lm-thick sections were subjected toimmunohistochemical analysis according to the strep-tavidin–biotin peroxidase complex system (UltraVisionLarge Volume Detection System Anti-Polyvalent,Horseradish Peroxidase; Lab Vision Corporation, Fre-mont, CA, USA). Immunohistochemistry procedureswere carried out as already published by us and otherauthors,31–35 with some modifications. Briefly, depa-raffinized and rehydrated slides were submitted to heat-induced antigen retrieval for 20 min at 98�C with10 mm citrate buffer (pH 6.0) for phospho-KIT andphospho-ERK, and with 1 mm EDTA buffer (pH 7.8) forSCF. After incubation with the primary antibodiesraised against phospho-kit Tyr703 (dilution 1:30;incubation ON at 4�C; clone ZMD.243; Zymed Labora-tories, San Francisco, CA, USA), SCF (dilution 1:200;

incubation ON at 4�C; clone G-3; Santa Cruz Biotech-nology, Santa Cruz, CA, USA) and phospho-p44 ⁄ 42MAPK Thr202 ⁄ Tyr204 (dilution 1:100; incubationON at 4�C; clone 20G11; Cell Signalling Technology,Beverly, MA, USA), the secondary biotinylated goatanti-polyvalent antibody was applied for 10 min fol-lowed by incubation with the streptavidin–peroxidasecomplex. The immune reaction was visualized by 3,30-diamonobenzidine as a chromogen. All sections werecounterstained with Gill-2 haematoxylin. Appropriatepositive controls were included in each run: humancolonic tissue showing extracellular staining of glan-dular cells was used for SCF, GIST with KIT genemutation for phospho-KIT, and a cell block of a breastcarcinoma cell line (MDA-MB-435) with BRAF muta-tion (V600E) was used for phospho-ERK. For negativecontrols, primary antibodies were omitted and alsoreplaced with a universal negative control antibody(carcinoembryonic antigen, rabbit antihuman; DakoCorp., Carpinteria, CA, USA). Furhtermore, CD117)leiomyoma cases36 were used as negative controls forphospho-KIT expression, as described.31

Tumour samples were evaluated for both extent andintensity of immunoreactivity. The extent of immuno-reactivity was evaluated on a scale of 0–3 (0, absence ofpositive cells; 1, <25% positive cells; 2, 26–50% positivecells; and 3, >50% positive cells) and the intensity alsoon a scale of 0–3 (0, negative; 1, weak; 2, moderate; 3,strong). The final score used was the sum of both extentand intensity scores, with values between 0 and 2 beingclassified as negative, 3 and 4 as moderately positive,and 5 and 6 as strongly positive.

statistical analysis

The available clinicopathological and immunohisto-chemical data were analysed with SPSS software forWindows, version 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).Correlations between categorical variables were per-formed using Fisher0s exact test. Disease-specific survival(DSS) was calculated from the time of diagnosis untildeath related to the disease, or censored at the time oflatest follow-up. Cumulative survival probabilities werecalculated using the Kaplan–Meier method. Differencesbetween survival rates were tested with the log rank test.A P-value < 0.05 was considered to be significant.

Results

re-evaluation of kit mutations

Twenty-nine of 78 previously described27 wild-type KITand PDGFRA GISTs were screened for KIT mutations

MAPK pathway in wild-type GISTs 55

� 2009 The Authors. Journal compilation � 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55, 53–62.

using a PCR assay designed to amplify a region in the30 part of KIT exon 11 commonly affected by duplica-tions.18 The PCR-SSCP followed by direct sequencinganalysis allowed identification of three novel casesharbouring KIT exon 11 duplications: case G6(579_583dup), case G36 (578_591dup) and caseG58 (573_580dup), which ranged from 14 to 42nucleotides (Figure 1A). Consequently, the frequencyof wild-type KIT and PDGFRA GISTs in our series was33.3% (26 ⁄ 78).

h-ras, k-ras, n-ras and braf mutations

In the remaining 26 KIT and PDGFRA wild-typeGISTs, we performed analysis of the hotspot regions ofRAS family and BRAF genes. The study of codon12 ⁄ 13 of H-RAS gene did not reveal any mutation(Table 1). We identified only a T fi C substitution atcodon 27 in two cases, which originates a silentmutation (H27H). The analysis of the other hotspotregion, codon 61, did not show any mutation(Table 1). No genetic alterations were identified inthe hotspot regions of the other RAS family genes,K-RAS and N-RAS (Table 1).

The mutation screening of BRAF exons 11 and 15showed the presence of the hotspot V600E mutation inone of 26 cases (3.8%) (Table 1 and Figure 1B). Inorder to determine whether BRAF V600E mutationwas also present in GISTs exhibiting KIT or PDGFRAmutations, we extended the analysis of BRAF exon 15

to the remaining cases of the series. No additionalmutation was identified in the 52 KIT or PDGFRAmutated GISTs. Overall, the frequency of BRAF muta-tion in our GIST series was 1.3% (1 ⁄ 78). The V600EBRAF mutated case (G9) was a bona fide intermediate-risk spindle cell GIST from the small bowel of a 71-yearold man (Figure 2).

express ion of kit ( cd 1 1 7 ) , phosphorylated-kit

and scf

Table 1 summarizes CD117, phospho-KIT and SCFexpression. CD117 immunoreactivity was observed in23 (88.5%) of 26 wild-type KIT and PDGFRA GISTs.27

In order to evaluate whether KIT was activated inthese tumours, we performed immunohistochemicalanalysis with an antibody to KIT phosphorylatedresidues Tyr703. Strong cytoplasmic immunoreactivity(Figure 3A) was observed in two, and moderatepositivity in three GISTs. To determine whether thisKIT activation was associated with an autocrine ⁄ para-crine stimulation loop, we evaluated the expression ofSCF. Positive cytoplasmic SCF expression was observedin 20 (76.9%) of the 26 cases, 10 depicting moderateand 10 strong positivity (Figure 3B). Co-expression ofSCF ⁄ CD117 was present in 65.4% of the cases. Allphospho-KIT positive GISTs showed co-expression ofSCF ⁄ CD117.

express ion of phosphorylated erk

In order to study MAPK pathway activation, weevaluated the expression of ERK1 ⁄ 2 using an antibodyfor the p44 ⁄ 42 MAPK phosphorylated at residuesThr202 ⁄ Tyr204 (ERK1 and ERK2). We found moder-ate phospho-ERK expression in eight cases (30.8%)(Figure 3C). Phospho-ERK stained both nuclear andcytoplasmic compartments. As expected, the caseharbouring BRAF activating mutation (case G9) alsoshowed phospho-ERK positivity. Furthermore, weobserved a significant correlation between phospho-KIT and phospho-ERK expression (P = 0.02). All casesexpressing both phospho-KIT and phospho-ERKshowed co-expression of SCF.

clinicopathological features

and statist ical analysis

Table 2 summarizes the clinicopathological parametersof the 26 re-evaluated KIT and PDGFRA wild-typeGISTs. The mean and median age of patients atdiagnosis was 59.9 and 62.5 years, respectively(range 20–82 years), and the male ⁄ female ratio was

A

A

B

A A A A A A A A A A ANT

T T T T T T T T T T TA A A A A A A AC C C CCG G G G G G G G G

T T T T TGC G G G GC C C C C C C

Figure 1. A, DNA sequencing of KIT exon 11 573_580dup

mutation in case G58; arrow indicates beginning of duplicated

DNA sequence. B, DNA sequencing of BRAF exon 15 V600E

mutation from case G9; arrow indicates the mutated base.

56 O Martinho et al.

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1.6. The 5-year cumulative DSS was 83.6%, with amedian follow-up time of 62.07 months (mean83.95 ± 61.10; range 1–204 months). All but twopatients were submitted to surgical resection of primaryGIST. None of the nine (34.6%) deceased patients, one

within the postoperative (1 month) period, had anautopsy. In four patients the cause of death was dueto the tumour disease. In the remaining patients, oneis with and 16 are without evidence of disease.Three patients are currently under imatinib treatment

Table 1. Immunohistochemistry and molecular analysis of wild-type gastrointestinal stromal tumours

Case

Immunohistochemical analysis Molecular analysis

CD117 p-KIT SCF p-ERKKRASmutations

HRASmutations

NRASmutations

BRAFmutations

G3 + + + + WT WT WT WT

G8 + ) + ) WT WT WT WT

G9 + + + + WT WT WT V600E

G20 + ) + + WT WT WT WT

G21 + ) ) ) WT WT WT WT

G23 + ) + + WT H27H WT WT

G25 + ) ) ) WT WT WT WT

G26 + ) + ) WT WT WT WT

G27 + ) + ) WT WT WT WT

G29 + + + ) WT WT WT WT

G30 ) ) + ) WT H27H WT WT

G31 + ) + ) WT WT WT WT

G32 + ) ) ) WT WT WT WT

G35 + ) + ) WT WT WT WT

G43 + + + + WT WT WT WT

G44 + ) ) ) WT WT WT WT

G46 + ) + ) WT WT WT WT

G49 + ) + + WT WT WT WT

G52 + ) + ) WT WT WT WT

G53 + ) + ) WT WT WT WT

G56 + ) ) ) WT WT WT WT

G60 + ) ) ) WT WT WT WT

G61 ) ) + ) WT WT WT WT

G62 ) ) + + WT WT WT WT

G63 + ) + ) WT WT WT WT

G72 + + + + WT WT WT WT

p-KIT, phosphorylated KIT; p-ERK, phosphorylated-ERK; +, positive; ), negative; WT, wild-type.

MAPK pathway in wild-type GISTs 57

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without evidence of disease (n = 2) or with stabledisease (n = 1).

On statistical univariate analysis, we found that ashorter DSS was significantly associated with tumour

size >100 mm (P = 0.005) and high-risk GISTs(P = 0.027). Age, gender, primary site of tumour,histological type and mitotic index were not significantprognostic markers (Table 2). Regarding immuno-

A B

C

Figure 2. Pathological features of V600E BRAF mutated gastrointestinal stromal tumour (case G9), showing low power of intestinal submucosal

tumour (A, H&E), disclosing CD117+ (B) and CD34+ (C) spindle tumour cells.

A B C

Figure 3. MAP kinase pathway immunohistochemistry markers in wild-type gastrointestinal stromal tumours. A, Positive expression of

phospho-KIT. B, Positive expression of stem cell factor. C, Positive expression of phospho-ERK.

58 O Martinho et al.

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histochemical parameters, no significant correlationwas found between the analysed molecules and clinico-pathological features (Table 2).

Discussion

The majority of GISTs are driven by KIT and PDGFRAoncogenic mutations.7,15 Nevertheless, a subset of GISTpatients, varying from 10% to 40%, are wild-type forboth KIT and PDGFRA genes.4,7,15,27,37 The prognosticfactors of wild-type GISTs are still a matter of debate.Some studies have shown a better prognosis of wild-type GISTs when compared with mutated cases,12,27

although a recent population-based study has failed toconfirm these findings.38 In the present series, wefound that clinicopathological features commonlyassociated with overall GIST patients’ outcome, i.e.largest tumour size and high-risk grade, also constitutepoor prognostic factors in wild-type GISTs. It has beenshown that patients with wild-type GIST rarely respondto imatinib,39,40 and their response to sunitinib-basedtherapy is still unclear.7,15 Thus, these patients raiseimportant therapeutic challenges. Another unexploredand puzzling issue is the molecular lesions underlyingKIT and PDGFRA wild-type GIST tumours.

In the present study, we have investigated the role ofSCF ⁄ KIT autocrine or paracrine stimulation loops, andthe contribution of MAPK (RAS ⁄ RAF ⁄ MEK ⁄ ERK)cascade alterations in a subset of previously describedKIT ⁄ PDGFRA wild-type GISTs.27 In the light of newfindings of undetectable KIT exon 11 duplication typeof mutations in formalin-fixed paraffin-embedded tis-sues,18 we initially re-assessed all wild-type cases. Withthis approach, we were able to detect three new caseswith duplication-type of mutations in exon 11, leadingto 33% of wild-type GISTs in this Portuguese series,which fits with other series, namely from the IberianPeninsula.37

The co-expression of both ligand and receptor inapproximately 65% of cases and the expressionof phospho-KIT in approximately 30% of SCF ⁄ KITco-expressing cases support the possibility of auto-crine ⁄ paracrine mechanisms in wild-type GISTs. Ourfindings are in agreement with a recent report thatfound SCF ⁄ KIT co-expression in the majority of GISTs,independently of KIT and PDGFRA mutation status.35

KIT activation, assessed by Western blot in cell linesand frozen tissues, has previously been reported in 70–80% of wild-type GISTs with the same proportion andlevel found in KIT ⁄ PDGFRA mutated GISTs.20,35 Sim-ilar to our study, others have also observed thatKIT ⁄ SCF co-expression does not always lead to KITactivation.35 The observed discrepancy in the number

Table 2. Clinicopathological parameters and correlation withdisease-specific survival of wild-type gastrointestinal stromaltumours

Parameters (n = 26) N % P-value*

Age (years)£60 12 46.2 NS

>60 14 53.8

GenderMale 16 61.5 NS

Female 10 38.5

Tumour localStomach 16 61.5 NS

Small bowel 9 34.6

Other 1 3.8

Tumour size (mm)£50 7 26.9 0.005

>50 £ 100 13 50.0

>100 6 23.1

Histological typeSpindle 18 69.2 NS

Epithelioid 5 19.2

Mixed 3 11.5

Mitotic index (50 ⁄ HPF)£5 19 73.1 NS

>5 7 26.9

Risk gradeVL ⁄ L ⁄ I 16 61.5 0.027

H 10 38.5

p-KITPositive 5 19.2 NS

Negative 21 80.8

SCFPositive 20 76.9 NS

Negative 6 23.1

p-ERKPositive 8 30.8 NS

Negative 18 69.2

N, number of cases; NS, not significant values (P > 0,05);HPF, high-power field; VL, very low; L, low; I, intermediate;H, high risk; p-KIT, phosphorylated KIT; SCF, stem cell factor;p-ERK, phosphorylated ERK.

*Log rank test

MAPK pathway in wild-type GISTs 59

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of cases with KIT activation may be explained by thedifferences in methodologies and tissue fixation of thetumours. In our study, the antibody used recognizesKIT phosphorylation at tyrosine 703, whereas in theaforementioned studies the antibody recognizes tyro-sine 721.20,35 Despite the well-known advantages ofimmunohistochemical evaluation on formalin-fixedparaffin-embedded tissues, this method is less consis-tent than Western blot analysis for the evaluation ofprotein phosphorylation status. Therefore, furtherstudies are warranted to determine the frequency ofKIT activation and, most importantly, the efficacy ofavailable treatments in wild-type GISTs.

Despite the high frequency of RAS family genemutation in several types of neoplasms such aspancreatic, papillary thyroid, colonic and non-smallcell lung cancer (NSCLC),23,41 none of the 26 analysedGISTs exhibited non-synonymous mutation of theH-RAS, K-RAS and N-RAS hotspot regions. The anal-ysis of BRAF, another important oncogene of theMAPK cascade pathway, showed the presence ofhotspot-activating V600E mutation in one wild-typecase (approximately 4%). The V600E mutationaccounts for 90% of BRAF mutations in humancancers and is associated with higher kinase activity,which stimulates ERK activity independently of RASstatus.42 In our series, no BRAF mutation was iden-tified in KIT or PDGFRA mutated GISTs, suggestingthat BRAF, KIT and PDGFRA mutations are mutuallyexclusive. So far, there are no reports on the analysis ofRAS and BRAF gene mutations in GISTs.

To elucidate further the role of MAPK pathway inwild-type GISTs, we evaluated phospho-ERK expres-sion, which was observed in 30% of our wild-typecases. Previous studies with GIST cell lines havesuggested that ERK activation is dependent on KITsignalling19 and that some KIT wild-type cell lines alsoexhibit ERK activation.21 Our results are in agreementwith these findings, since phospho-ERK expression wassignificantly (P = 0.02) correlated with phospho-KITexpression. However, phospho-ERK expression in 50%of our cases without phospho-KIT expression suggeststhat KIT-independent ERK activation is probably drivenby other pathways (e.g. AKT ⁄ PI3K and JAK ⁄ STAT) inwild-type GISTs.16,20

Currently, some drugs that target the RAS ⁄ RAF andMEK molecules are under clinical trials and others inpreclinical assays. Hitherto, no ERK1 or ERK2 inhib-itors have been reported.41 The most successful anti-RAF inhibitor is Sorafenib (Nexavar�). Sorafenib is apotent inhibitor of both wild-type and mutant (V600E)BRAF and has proven to target other RTKs also,including KIT, vascular endothelial growth factor

receptor (VEGFR)-2, VEGFR-3, PDGFRB, i.e. it is amulti-kinase inhibitor.43 The Food and Drug Adminis-tration has approved Sorafenib for advanced renal cellcarcinoma. Sorafenib is also being evaluated forNSCLC, prostatic, breast, pancreatic and melanomatumours.43,44 Several studies have shown that Sorafe-nib anti-tumour activity is associated with an anti-angiogenic effect.43,44 In contrast to Sorafenib, smallmolecule inhibitors of MEK1 ⁄ 2 are highly specificinhibitors. AZD6244 (ARRY-142886) preclinical stu-dies has been very promising, thus leading to furtherclinical trials.45,46 Interestingly, Solit and colleagueshave reported that BRAF mutant tumours are verysensitive to MEK inhibition.47

In conclusion, our study constitutes the most com-prehensive analysis of MAPK deregulation in KIT andPDGFRA wild-type GISTs. We have described theabsence of RAS mutations, and suggest that MAPKpathway can be activated through SCF ⁄ KIT auto-crine ⁄ paracrine mechanisms and ⁄ or mutated BRAF ina subset of wild-type GISTs. Despite the low frequencyof MAPK molecular alterations, additional studies arewarranted to evaluate the potential role of MAPKpathway targeting in wild-type (KIT and PDGFRA)GISTs.

Note: While the present paper was under revision, astudy from Agaram NP and colleagues, also reportedthe presence of the V600E hotspot BRAF mutation ina small fraction of KIT and PDGFRA wild-type GISTs.48

Acknowledgements

The authors thank Drª Joana Paredes (IPATIMUP,Porto, Portugal) for kindly providing the MDA-MB-435breast tumour cell line. O.M. is the recipient of a PhDfellowship (SFRH ⁄ BD ⁄ 36463 ⁄ 2007) from FCT, Por-tugal. This study was partially supported by NovartisOncology, Portugal.

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121

Trabalho V

122

ORIGINAL ARTICLE

Loss of RKIP expression is associated with poor survivalin GISTs

Olga Martinho & António Gouveia & Paula Silva &

Amadeu Pimenta & Rui Manuel Reis &

José Manuel Lopes

Received: 8 June 2009 /Revised: 17 July 2009 /Accepted: 30 July 2009 /Published online: 25 August 2009# Springer-Verlag 2009

Abstract Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are raremesenchymal tumours of the digestive tract and arecommonly driven by oncogenic mutations in KIT andPDGFRA genes. Tumour size, location, mitotic index andKIT/PDGFRA mutations are the most important prognosticparameters in GISTs. However, additional studies screeningfor new molecular prognostic markers in GISTs aremissing. Raf kinase inhibitor protein (RKIP) has beenconsidered as a suppressor of metastasis and a prognosticmarker in several neoplasms. In the present study we aimedto examine whether RKIP expression is associated withGIST clinical–pathological features. Using immunohisto-

chemistry, we determined RKIP expression levels in a well-characterised series of 70 GISTs. We found that RKIP isexpressed in the great majority of cases, and absent inapproximately 9% of GISTs. Additionally, we found thatloss of RKIP expression was not due to the promotermethylation as assessed by methylation-specific PCR. Lossof RKIP expression was associated with poor disease-specific survival and with tumour necrosis in GISTs.Furthermore, a statistical tendency was observed betweenthe positive RKIP expression and absence of metastasis. Sofar, this is the first study assessing RKIP expression levelsin GISTs. We conclude that loss of RKIP expression couldhave an important role as prognostic marker in GISTs.

Keywords RKIP. Expression . Survival . GISTs

Introduction

Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are rare mesen-chymal tumours of the digestive tract [1, 2]. Gain-of-function mutations in KIT and PDGFRA oncogenes havebeen identified in a great majority of GISTs and areconsidered to be one of the first molecular events in theirpathogenesis [3, 4]. The tyrosine kinase inhibitor imatinibmesylate is the gold standard in the treatment of metastaticGISTs, leading up to 75% response rates [5]. Severalstudies have shown the importance of KIT and PDGFRAmolecular status in imatinib response [6, 7].

Tumour size, location and mitotic index are the mostimportant prognostic parameters of GISTs [8, 9]. Severalauthors have proven the usefulness of these and otherclassification parameters in GISTs clinical follow-up [10,11]. Moreover, other studies have shown that molecular

Olga Martinho and António Gouveia contributed equally to the study.

O. Martinho : R. M. ReisLife and Health Sciences Research Institute (ICVS),School of Health Sciences, University of Minho,Braga, Portugal

A. Gouveia : P. Silva :A. Pimenta : J. M. Lopes (*)IPATIMUP, Institute of Molecular Pathologyand Immunology of the University of Porto,Rua Dr. Roberto Frias, s/n,4200-465 Porto, Portugale-mail: jmlopes@ipatimup.pt

A. Gouveia :A. PimentaDepartment of Surgery,Porto, Portugal

J. M. LopesDepartment of Pathology, H.S. João,Porto, Portugal

A. Gouveia : P. Silva :A. Pimenta : J. M. LopesMedical Faculty of Porto University,Porto, Portugal

Virchows Arch (2009) 455:277–284DOI 10.1007/s00428-009-0821-z

genetic markers, such as the type of KIT and PDGFRAmutations, might also have prognostic value [12, 13].However, a part of GISTs behave unpredictably leading tothe need of screening new molecular prognostic markers.

The MAP kinase (RAS/RAF/MEK/ERK) pathway, oneof the KIT downstream cascades, is highly preserved andimplicated in cell growth, differentiation, migration andsurvival [14]. Activated RTK phosphorylates RAS, whichbinds RAF-1 kinase that phosphorylates MEK1/2, leadingto ERK1/2 activation. Phosphorylated ERKs translocatesinto nucleus and regulates gene expression through severaltranscription factors like c-Myc, CREB and AP-1, ulti-mately leading to changes in gene expression [14].Recently, we and others observed activation of this pathwayin GISTs by presence of BRAF activating mutations [15,16]. In addition, we described the absence of RASmutations, and suggest that MAP kinase could also beactivated through SCF/KIT autocrine/paracrine mechanismsin a subset of KIT/PDGFRA wild-type GISTs [16].

Raf kinase inhibitory protein (RKIP; also known asPEBP, for phosphatidylethanolamine-binding protein) wasoriginally identified as an endogenous inhibitor of the RAS/RAF/MEK/ERK pathway by interfering with the phosphor-ylation and activation of MEK by Raf-1 [17, 18].Subsequently, RKIP was shown also to suppress theactivation of the nuclear factor Kappa B (NFkB) cellsurvival pathway by blocking the inactivation of theinhibitor of NFkB, namely IkB [19]. In mammals, RKIPis also a negative regulator of G-protein coupled receptors[GPCRs] by inhibiting GRK-2 [20], and may be involvedin regulating the partitioning of chromosomes and mitosisprogression through RKIP binding to centrosomal andkinetochore regions of metaphase chromosomes [21]. Thecollective evidence indicates that RKIP regulates theactivity and mediates the crosstalk between several impor-tant cellular signalling pathways including cell differentia-tion, cell cycle, apoptosis and cell migration. Attenuation ofRKIP function is implicated in several human diseases,such as neurologic diseases and metastases in cancer [22,23].

RKIP is a widely expressed and highly conservedprotein [24–26], which is downregulated in severaltumours, including highly metastatic prostate carcinoma,breast, colon and gastric carcinoma, hepatocellular carci-noma, melanoma, insulinoma and ovarian carcinoma [27–36]. Furthermore, RKIP is also a prognostic marker inprostate, colorectal and gastric carcinomas [34, 36–38].The molecular mechanisms underlying RKIP down-regulation in cancer is not yet fully understood. Someauthors suggested RKIP promoter methylation as apotential RKIP silencing event [21, 39].

In the present study we aimed to clarify the role of RKIPin the prognosis of GISTs.

Materials and methods

Tissue samples

Seventy formalin-fixed paraffin-embedded primary spo-radic GISTs, classified according to WHO criteria and riskgroup [40], previously characterised immunohistochemi-cally for CD117, actin, S100, desmin and CD34, andmolecularly for KIT and PDGFRA mutations, wereretrieved from the Pathology Department of S. JoãoHospital files (1989–2005), Porto, Portugal [10, 41]. Allpatients were Caucasian and of Portuguese origin, with amean age of 62.1 years (range 20–88). Thirty-six (51.4%)patients were female and 34 (48.6%) were male. Mostfrequent tumour location was gastric (n=40) and smallintestine (n=23); other location were: colon (n=2), rectum(n=1), oesophagus (n=1) and omentum/mesentery (n=3).Three GIST patients with surgically resected tumours weretreated with imatinib (400 mg daily, with escalation to600 mg daily whenever indicated), because of tumourrecurrence. Of these patients, two are alive with stabledisease and one died due to the disease. Follow-up datawas available in all patients, as at December 2007, andcollected through direct interview with patients or theirrelatives, and by review of in-hospital patient files. Themedian follow-up time of patients was 54.1 months(range, 1–206). The diagnosis of metastases, includingthe two cases with very limited biopsy material, was basedon definitive imagiological evidence obtained during thefollow-up of the patients.

Immunohistochemistry analysis for RKIP

Representative 3-µm thick sections were subjected toimmunohistochemical analysis according to the streptavidin–biotin peroxidase complex system (UltraVision Large VolumeDetection System Anti-Polyvalent, HRP; Lab Vision Corpo-ration). Briefly, deparaffinised and rehydrated slides weresubmitted to heat-induced antigen retrieval for 20 min at 98°Cwith 10 mM citrate buffer (pH6.0). After incubation with theprimary antibodies raised against RKIP (dilution 1:600;incubation 2 h at RT; Upstate Biotechnology, Lake Placid,NY), the secondary biotinylated goat anti-polyvalent antibodywas applied for 10 min followed by incubation with thestreptavidin–peroxidase complex. The immune reaction wasvisualised by 3,3′-diamonobenzidine as a chromogen. Allsections were counterstained with Gill-2 haematoxylin. Fornegative controls, primary antibody was replaced by auniversal negative control antibody (CEA, rabbit anti-human,DAKO Corporation, Carpinteria, CA). A prostate carcinomawas used as positive control.

Tumour samples were evaluated for both extension andintensity of the immunoreactions. The score used was the

278 Virchows Arch (2009) 455:277–284

sum of the percentage of positive cells (0, negative; 1, lessthan 25% positive cells; 2, 26% to 50% positive cells and 3,more than 50% positive cells) and the staining intensity (0,negative; 1, weak; 2, moderate and 3, strong). Scoresbetween 0 and 2 were classified as negative, 3 and 4 asmoderate positive and 5 and 6 as strongly positive.

DNA isolation

Selected areas contained at least 85% of tumour tissue weremacrodissected into a microfuge tube using a sterile needle(Neolus, 25G-0.5 mm) and DNA isolation was performedusing Qiagen’s QIAamp® DNA Micro Kit, as previouslydescribed [42].

Methylation analysis of RKIP promoter

DNA methylation pattern in the promoter region of theRKIP gene was determined by methylation-specific PCR(MSP), as previously described [39] with some modifica-tions. Briefly, bisulphite treatment of 200 ng DNA wasdone using EZ DNA Methylation Golf Kit (Zymo ResearchCorporation, USA) according to the manufactures instruc-

tions. The PCR was carried out in a total volume of 15µl,consisting of 1µl of bisulphite modified DNA, 0.2µM ofboth sense and anti-sense primers (MWG-Biotech, Ebers-berg, Germany), 200µM of dNTPs (Fermentas, USA),1,5 mM of MgCl2 (Bioron, Germany), 1× Taq Bufferincomplete (Bioron, Germany) and 1 U of Taq SuperhotDNA Polymerase (Bioron, Germany). The reaction con-sisted of an initial denaturation at 95°C for 10 min,followed by 40 cycles with denaturation at 95°C for 30 s,annealing at 52–58°C for 30 s and extension at 72°C for30 s, followed by a final extension for 10 min at 72°C, in aThermocycler (BioRad). To MSP reaction, were usedspecific primers to distinguish methylated DNA (204 bpPCR product) from unmethylated DNA (205 bp PCRproduct), as described [39]. CpGenome Universal Methyl-ated DNA (Chemicon International, USA) was used asmethylated control. Blood DNA of a young healthyindividual was used as unmethylated control.

Statistical analysis

The available clinical–pathological and immunohistochem-istry data were analysed with SPSS software for Windows,

Fig. 1 Immunohistochemistry analysis of RKIP in GISTs. a Weak expression (×200), b strong expression (×200), c negative expression (×200), dpositive expression of RKIP in normal adjacent tissue (×200)

Virchows Arch (2009) 455:277–284 279

version 15.0. Correlations between categorical variableswere performed using Fischer’s exact test. Disease-specificsurvival (DSS) was calculated from the time of diagnosisuntil death related with the disease, or censored at the timeof latest follow-up, as described [10]. Cumulative survivalprobabilities were calculated using the Kaplan–Meiermethod. Differences between survival rates were testedwith the log-rank test. p value inferior to 0.05 wasconsidered significant.

Fig. 2 Agarose gel (2%) showing MSP result for methylation analysisof RKIP gene in the two cases with RKIP loss of expression (G30 andG60). Un unmethylated, M methylated, L 100 bp ladder

Parameter RKIP expression

N Negative (%) Positive (%) pa

CD117 expression

Negative 6 2 (33.3) 4 (66.7) 0.079

Positive 64 4 (6.3) 60 (93.7)

KIT/PDGFRA mutations

Mutant 44 4 (9.1) 40 (90.9) 1.000

Wild-type 26 2 (7.7) 24 (92.3)

Age (years)

≤60 30 2 (6.7) 28 (93.3) 0.694

>60 40 4 (10) 36 (90)

Gender

Male 34 3 (8.8) 31 (91.2) 1.000

Female 36 3 (8.3) 33 (91.7)

Tumour local

Small intestine 23 0 (0) 23 (100) 0.051

Gastric 40 4 (10) 36 (90)

Other 7 2 (28.6) 5 (71.4)

Risk grade

Very low/low/intermediate 41 2b (4.9) 39 (95.1) 0.224

High 29 4 (13.8) 25 (86.2)

Cellular morphology

Spindle 45 4 (8.9) 41 (91.1) 0.842

Epithelioid 8 0 (0) 8 (100)

Mixed 17 2 (11.8) 15 (88.2)

Tumour size (cm)

≤5 29 1 (3.4) 28 (96.6) 0.268

>5 to ≤10 23 2 (8.7) 21 (91.3)

>10 18 3 (16.7) 15 (83.3)

Mitotic index (50/HPF)

≤5 50 3 (6) 47 (94) 0.343

>5 20 3 (15) 17 (85)

Necrosis

Absent 29 0 (0) 29 (100) 0.038*

Present 41 6 (14.6) 35 (85.4)

Metastasis

Absent 58 3 (5.2) 55 (94.8) 0.058

Present 12 3 (25) 9 (75)

Mean survival time (months ± SD) 70 60.60±20.07 167.87±10.35 0.023*c

Table 1 Association betweenRKIP expression and clinical–pathological parameters inGISTs (n=70)

N number of cases, HPF highpower field (×400)

*p<0.05, statistically significantvaluesa Fischer´s exact testb One case low and one caseintermediate riskc Log-rank test

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Results

RKIP expression

In the present study, we used a series of 70 GISTs whichcomprises 91.4% of CD117 positive cases and 63% of KIT/PDGFRA mutated GISTs, as previously characterised [41].Immunohistochemical approach was done to detect RKIPprotein expression and distribution in GIST cases. Weobserved cytoplasmatic expression of RKIP in 64 (91.5%)of the 70 GISTs studied: 30 cases showed moderate and 34strong positivity (Fig. 1a and b). The remaining 8.5% (6/70)of cases were considered as negative for RKIP expression(Fig. 1c). In a subset of cases, it was possible to analyse thenormal adjacent tissue that showed to be strongly positivefor RKIP expression (Fig. 1d).

RKIP methylation

To determine whether absence of RKIP expression was due togene promoter hypermethylation, we performed methylation-specifc PCR in all six cases without RKIP expression. None ofthe cases exhibited RKIP promoter hypermethylation (Fig. 2).

Clinical–pathological features and statistical analysis

After univariate statistical analysis we observed that there isno correlation between RKIP expression and CD117staining and KIT/PDGFRA mutations status (Table 1).Concerning clinical–pathological data, no significant corre-lations (p>0.05) were found between RKIP expression andage, gender, risk grade, cellular morphology, tumour sizeand mitotic index (Table 1). RKIP negativity was correlatedwith presence of necrosis (p=0.038). There was a tendency(p=0.051) for absence of RKIP expression in gastric GISTsand a tendency (p=0.058) for the development of metas-tasis in RKIP negative cases (Table 1).

Regarding clinical–pathological parameters and disease-specific survival (univariate analysis), we found that a shorterDSS was significantly associated with male gender (p=0.014),high-risk GISTs (p<0.001), tumour size >10 cm (p=0.001),mitotic index >5 (p=0.009) and development of metastasis(p<0.001). Loss of RKIP expression was significantly (p=0.023) associated with poor DSS (Table 1 and Fig. 3). Onlythree cases were treated with imatinib-based therapy, ham-pering any statistical analysis. The low number of casesprecluded multivariate analysis of the studied parameters.

Discussion

Unresectable or metastatic GIST is a fatal disease resistantto conventional cytotoxic chemo and radiotherapy. The

median survival time for patients with metastatic GIST isapproximately 20 months, and 9–12 months for patientswith local recurrences [43]. Treatment with imatinibmesylate is the first option for metastatic disease [44].However, further molecular characterization is warrantedfor the treatment of primary and secondary imatinib-resistant GISTs. Furthermore, excepting KIT and PDGFRAmutations, no other molecular alterations have beenconsistently associated with prognosis of GISTs [12, 13].

RKIP is considered to be a signal transduction modulatorand a metastasis suppressor [45]. The first evidence camefrom cell lines derived from metastatic prostate carcinomas,which display decreased levels of RKIP as compared withprimary tumour cell lines [27]. In human breast carcinoma[32] and metastatic colorectal carcinoma [34, 46], RKIPexpression is consistently lost in lymph node metastases butnot in primary tumours, supporting the suggestion thatRKIP is downregulated in metastatic development. More-over, overexpression of RKIP in vitro and in vivo prostateand melanoma tumour models suggest that RKIP representan important suppressor of metastasis by decreasingvascular invasion [27, 29]. Consistent with the role ofRKIP as a potent suppressor of metastatic development,several studies described that highly metastatic prostatecarcinoma [27], malignant melanoma [29], breast cancerlymph node metastases [32], insulinoma [31], colorectalcarcinoma [46], hepatocarcinoma [33], ovarian carcinoma[35], Merckel cell carcinoma [47] and thyroid carcinoma[48] display frequently a marked decrease in RKIPexpression.

Work by Eves et al. [49] also indicates that the absenceof RKIP may increase the genetic instability of the cell

Fig. 3 Disease-specific survival (DSS) according to RKIP expressionin GISTs (n=70). Cumulative survival is significantly lower in caseswith RKIP loss of expression (p=0.023)

Virchows Arch (2009) 455:277–284 281

while work with hepatoma cells suggests that the absenceof RKIP may increase the rate of cell division [33].

Furthermore, loss of cytoplasmatic RKIP has also beenassociated with colorectal carcinoma recurrence [34] andwith poor prognosis in prostate, colorectal and gastricadenocarcinomas [34, 36–38]. Recently, it was proposedthat the level of RKIP in the blood can be used as aprognostic marker for prostate cancer patients [38]. Thus,loss of RKIP expression may be considered as a marker oftumour progression.

In our series, well-established prognostic markers (malegender, high risk, tumour size >10 cm, mitotic index >5 anddevelopment of metastasis) were significantly associatedwith DSS [10]. Regarding RKIP expression, our results inGISTs has shown that a negative cytoplasmatic expression,found in approximately 9% of the cases, is significantlycorrelated with the presence of necrosis and with DSS ofGIST patients. Furthermore, a tendency was observedbetween the presence of RKIP expression and absence ofmetastasis. So far, there are no reported studies of RKIPexpression in GISTs. We recently demonstrated that MAPKpathway alterations occur at low frequency in KIT andPDGFRA wild-type GISTs, corroborating the low percent-age of RKIP absence of expression in the present study[16]. Further studies with a largest series are needed tovalidate RKIP expression as a prognostic marker in GISTs.Furthermore, it will be also interesting in the future toassess the expression levels of RKIP in the metastaticbiopsies of GISTs.

Despite the increasing evidence that RKIP is lost duringtumour progression, especially in metastasis, the mecha-nisms of RKIP down-regulation remains to be unraveled[21]. To further elucidate the genetic event that underliesRKIP down-regulation in GISTs, we analysed the methyl-ation status of the CpG islands of RKIP promoter in RKIPnegative GISTs. All six GISTs without RKIP expressionwere found unmethylated for RKIP promoter. Formerstudies concerning RKIP methylation are discrepant. RKIPmethylation was described in a cohort of 12 patients withhyperplastic polyposis coli [39]. Noteworthy, the sameauthors, using 28 colorectal carcinomas, reported thatmethylation of the RKIP promoter was not responsible forloss of RKIP expression [46]. Recently, Al-Mulla et al. [21]reported that 72.5% of 40 RKIP negative colorectalcarcinomas were methylated at the RKIP promoter, andsuggested it as the major mechanism by which RKIP issilenced [21].

The role of RKIP in tumour progression and inmetastases development raises hope for tailored therapeuticapproaches, using drug-induced modulation of RKIPexpression, to control tumour aggressiveness. Locostatinhas already been shown to abrogate the ability of RKIP toinhibit Raf-1 [50]. In some prostate and breast carcinoma

cell lines, increasing levels of RKIP expression re-sensitisecells to drug-induced apoptosis. In drug-sensitive cell lines,down-regulation of RKIP led to the resistance to DNA-damaging drugs [9-nitrocamptothecin, taxol and cisplatin][28]. Rituximab up-regulates RKIP, which has been shownto sensitise non-Hodgkin’s lymphoma cell lines tochemotherapeutic-induced apoptosis [51]. Both inhibitionof the MEK–ERK pathway and inhibition of the NFkBpathway were suggested as possible mechanisms for thesedrug-sensitising effects [51]. Recently, RKIP expressionlevels in pituitary adenomas were found to correlate withboth acute and long-term clinical response to octreotide[52]. Furthermore, Bonavida et al. demonstrated that nitricoxide mediated chemo/immunosensitization via inhibitionof NFkB may also involve the induction of RKIP. Inductionof RKIP inhibits anti-apoptotic pathways that regulatetumour cell sensitivity to apoptotic stimuli [53].

In the present study we describe for the first time thatGIST RKIP expression levels correlate with clinical–pathological parameters in univariate analysis. We foundthat the loss of RKIP expression was independent ofpromoter methylation in a subset of GISTs. Most important,loss of RKIP was associated with tumour necrosis and witha poor survival, i.e., a potential prognostic marker for GISTpatients. Further studies with larger series and with in vivo/in vitro tumour models are warranted to evaluate the role ofRKIP in metastatic development and survival of GISTpatients.

Acknowledgements OM is recipient of a PhD fellowship (SFRH/BD/36463/2007) from FCT, Portugal. This study was partiallysupported by NOVARTIS Oncology, Portugal.

Conflicts of interest statement We declare that we have no conflictof interest.

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131

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

132

133

DISCUSSÃO / CONCLUSÕES

Uma vez que nos resultados da tese se incluem os trabalhos publicados com discussão, decidiu-se

simplificar o mais possível o conteúdo deste capítulo nesta dissertação. Para maior facilidade de

exposição, decidiu-se também seguir a mesma sequência do capítulo de objectivos.

I. Objectivo: Analisar o valor prognóstico da qualidade das margens cirúrgicas no tratamento dos

doentes com GIST primário.

As opções cirúrgicas mais utilizadas no tratamento dos doentes com GISTs primários localizados

são a ressecção “em cunha”, nos GISTs do estômago, e a ressecção segmentar, nos GISTs do

intestino delgado, sem necessidade de linfadenectomia de rotina. Como estes tumores não têm

geralmente padrão infiltrativo intraparietal, estas opções são, de facto, consideradas adequadas ao

tratamento da maioria dos doentes com GIST. No entanto, dependendo do órgão onde se origina o

GIST, da localização exacta e da dimensão do tumor, podem ser necessárias abordagens cirúrgicas

distintas: ressecção parcial ou total de órgão, ou eventual remoção de tecidos adjacentes.

A ressecção cirúrgica no GIST deve garantir uma margem completa de tecido normal em redor do

tumor primário. A revisão das principais séries publicadas permite constatar que vários autores se

referem a ressecção macroscópica completa27, 190, 243, 319-322 dos tumores, enquanto outros

especificam a ressecção R0191, 215, 323-327 como procedimento padrão no tratamento cirúrgico dos

GISTs. Alguns autores defendem que o estado microscópico das margens cirúrgicas (positivo ou

negativo), em contraste com os resultados obtidos noutros tumores sólidos malignos, não

influencia a sobrevida dos doentes, nem mesmo a recidiva do GIST27, 319, 328. Num estudo de 200

doentes com GIST, DeMatteo et al.27 sugerem que as margens microscópicas não influenciam

significativamente a evolução dos tumores e que a recidiva ocorre mais provavelmente como

resultado das características biológicas intrínsecas do tumor. Contudo, nas séries publicadas, o

número relativamente pequeno de casos com margens microscópicas positivas, após ressecção

macroscópica completa, não permite um esclarecimento cabal sobre a adequação desta sugestão.

De facto, as séries incluem um número substancial de GISTs de grandes dimensões e de alto risco

biológico, nos quais a ressecção completa pode não evitar a recidiva (particularmente à distância) do

tumor nem a sobrevida mais curta dos doentes. A análise dos resultados do estudo de DeMatteo et

al. confirma que a maioria das ressecções cirúrgicas foi realizada em GISTs volumosos e de alto

risco biológico215, 329. O valor da margem microscópica negativa (por exemplo, GISTs> 10 cm) é

muito discutível, pois é possível admitir que os tumores podem libertar células, não detectáveis,

para a cavidade peritoneal27, 320. Adicionalmente, alguns destes resultados podem estar enviesados

134

pelo efeito do tratamento adjuvante realizado nos GISTs avançados ou submetidos a ressecção

incompleta27, 330.

Outros autores sugerem que o resultado negativo (R0) na avaliação das margens cirúrgicas

microscópicas pode modificar o prognóstico dos GISTs215, 324, 325, 329, 331-336. No entanto, estes

resultados podem também ter sido influenciados pelo número de ressecções incompletas em GISTs

de alto risco biológico329.

Na nossa série de 104 casos submetidos a cirurgia de ressecção, foi realizada ressecção completa

macroscópica (R0 ou R1) em 92,3% (n=96) dos GISTs e verificou-se a existência de margens

microscópicas negativas (R0) em 75% (n=78) dos casos. A ressecção cirúrgica dos GISTs primários

associou-se a sobrevida específica aos 5 anos de 87,7% e a sobrevida livre de recidiva aos 5 anos de

89,8%, valores que se comparam favoravelmente com os resultados de outros estudos publicados.

A taxa de recidiva de GIST foi significativamente menor nos casos com ressecção R0, quando

comparada com a dos casos com ressecção R1 (p = 0,045), mas apenas a presença de tumor

residual macroscópico (R2) se associou de forma significativa (análise multivariada) a progressão da

doença e a sobrevida mais curta dos doentes (p = 0,013). Tal como nos estudos de DeMatteo et al.27

e Pierie et al.319, o nosso estudo sugere que a ressecção macroscópica do tumor tem impacto

positivo no prognóstico, sendo mais curta a sobrevida específica nos doentes com GISTs em que

foram obtidas margens cirúrgicas R2.

Apesar da controvérsia existente, como abordado neste trabalho, a ressecção cirúrgica com margens

microscópicas positivas (R1) pode expor os doentes a um risco elevado de recidiva tumoral loco-

regional. O objectivo da cirurgia em todos os casos de GIST primário deve ser, segundo as

recomendações de consenso actuais: ressecção completa do tumor, com margens microscópicas

negativas (R0), e preservando a pseudo-cápsula intacta (i.e. evitando a ruptura tumoral)24, 138.

Os dados da literatura, baseados em resultados de análise retrospectiva, mostram que as ressecções

por via laparoscópica, ou assistidas por laparoscopia, são exequíveis e associam-se a taxas de

recidiva reduzidas, períodos curtos de internamento e morbilidade baixa213, 217, 220, 232, 234, 235. Esta

abordagem deve ser considerada a opção de escolha, por exemplo, para a maioria dos doentes com

GISTs gástricos de pequenas e médias dimensões220, 224. Recomenda-se, no entanto, que a técnica

deve obedecer estritamente aos princípios oncológicos acima definidos24, 138, 219.

A abordagem cirúrgica recomendada para os GISTs do intestino delgado é a ressecção segmentar

com margens macroscópicas de 2 a 3 cm, e para GISTs gástricos considera-se suficiente uma

margem de ressecção de 1 a 2 cm218, 225, 326, 337. O exame intra-operatório de amostras de tecido peri-

tumoral por um anátomo-patologista deve ser obrigatório quando existe a possibilidade de as

margens cirúrgicas serem positivas.

135

De acordo com as orientações actuais da ESMO e da NCCN, nos casos em que se realiza uma

ressecção microscópica incompleta (R1) é de considerar o alargamento de margens quando a

localização exacta da lesão pode ser identificada e o risco de morbilidade cirúrgica é baixo.

As recomendações actuais para as margens cirúrgicas têm por base a experiência, o consenso e a

aplicação dos conhecimentos biológicos sobre GIST24, 138. De facto, não há dados prospectivos que

permitam concluir sobre o impacto da qualidade das margens de ressecção (R0 e R1),

designadamente as microscópicas, no risco de recidiva (local ou à distância) do GIST.

Conclusão:

As principais séries publicadas permitem confirmar que não há consenso geral sobre o impacto do

estado microscópico das margens cirúrgicas (positivo/R1 ou negativo/R0) no prognóstico dos

doentes com GIST. Na nossa série, foi realizada ressecção completa macroscópica (R0 ou R1) em

92,3% dos GISTs. A taxa de recidiva foi significativamente menor nos casos com ressecção R0,

mas na análise multivariada apenas a presença de tumor residual macroscópico (R2) se associou

significativamente a sobrevida mais curta dos doentes. De acordo com as recomendações de

consenso actuais, os nossos resultados sublinham o valor prognóstico da ressecção macroscópica

completa dos tumores, com o objectivo de se obterem margens microscópicas negativas e evitar a

ruptura do tumor. Neste contexto, pode ser considerado o exame intra-operatório de amostras peri-

tumorais e o alargamento de margens, após ressecção microscópica incompleta (R1). Os resultados

publicados indicam que a ressecção laparoscópica ou assistida por laparoscopia, é exequível e

apresenta, na maioria dos casos de GISTs gástricos, segurança e eficácia comparável à da cirurgia

convencional.

No entanto, não existem dados prospectivos que permitam concluir sobre o impacto da extensão

das margens de ressecção, designadamente microscópica, no risco de recidiva (local ou à distância)

de GIST.

136

II. Objectivo: Avaliar os procedimentos de diagnóstico de GIST no esófago, que é uma localização

rara deste tipo de tumores, e rever as opções terapêuticas mais adequadas nesta localização.

Os GISTs são os tumores mesenquimatosos mais comuns do tracto gastrointestinal, mas são

raramente diagnosticados (1-3%) no esófago27, 338. O diagnóstico específico de GIST antes da

biópsia ou cirurgia é bastante difícil em qualquer localização, mas constitui um desafio no esófago,

devido às semelhanças na apresentação clínica, endoscópica e radiográfica com o leiomioma

esofágico, que é um tumor mais comum nesta localização. A ultrassonografia endoscópica pode ser

útil no diagnóstico destes casos e confirmar que o tumor se origina da parede do esófago.

Adicionalmente, a realização de biópsia com agulha fina através da ultrassonografia endoscópica

permite frequentemente a realização de um diagnóstico, designadamente pela identificação de

células fusiformes/epitelióides que expressam os marcadores imuno-histoquímicos característicos

de GIST ou, em alternativa, de outros tipos celulares que excluem o diagnóstico de GIST339-341.

Quando são detectados nódulos subepiteliais esofágicos, gástricos ou duodenais com diâmetro < 2

cm, a abordagem recomendada consiste na avaliação com ecografia endoscópica e vigilância activa

do doente. Estes nódulos, quando correspondem a GISTs, são tumores habitualmente de baixo

risco biológico1, 184. Nestas circunstâncias, a exérese cirúrgica é reservada para os doentes cujo

tumor aumenta de dimensões ou é sintomático. Adicionalmente, quando estes nódulos apresentem

características eco-endoscópicas suspeitas (maior dimensão, limites extraluminais irregulares, padrão

ecográfico heterogéneo, presença de áreas císticas e focos hiperecogénicos) está indicada a

obtenção de um diagnóstico citológico / histológico, necessário para a decisão subsequente170, 171.

Numa série de 68 doentes com tumores mesenquimatosos do esófago94, Miettinen et al.

descreveram 48 (71%) leiomiomas e 17 (25%) GISTs. Os GISTs localizavam-se no esófago distal e

o sintoma típico era a disfagia. Em dois doentes o tumor foi um achado radiológico incidental,

como pudemos constatar no nosso caso, apesar das grandes dimensões do tumor (13,5x8,5x7,6

cm). A realização de ultrassonografia endoscópica (sem biópsia) no nosso doente confirmou que o

tumor se encontrava na dependência da muscular própria da parede esofágica.

Alguns autores sustentam que os GISTs esofágicos são frequentemente diagnosticados muito tarde

e tendem a ser associados a mau prognóstico1, 181. No estudo publicado por Miettinen et al.94, 12 dos

17 GISTs esofágicos foram classificados como tumores de alto risco, tal como verificado no

presente caso.

Quando indicada, a ressecção cirúrgica completa, sem linfadenectomia loco-regional, é considerada

o tratamento padrão dos GISTs primários. Nos GISTs com localização esofágica, o tratamento que

melhor serve este princípio é a esofagectomia341. Nas lesões distais, sobretudo em doentes de risco

cirúrgico, a operação de Merendino (ressecção esofágica segmentar e interposição jejunal) pode ser

uma opção oncologicamente segura e funcionalmente superior à esofagectomia mais comum, a

operação de Ivor Lewis342. Alguns autores descreveram casos de GISTs, alguns com dimensões até

7,5 cm, submetidos a enucleação simples, aparentemente obtendo remoção completa e mesmo R0

137

dos tumores343, 344. No entanto, este procedimento pode comprometer a remoção completa da

pseudo-cápsula, facilitar a persistência de células tumorais viáveis e associar-se a maior risco de

ruptura tumoral, eventualmente não cumprindo os princípios da cirurgia oncológica213.

A cirurgia laparoscópica no GIST tem vindo a expandir-se rapidamente nos últimos anos,

sobretudo na abordagem de GISTs localizados no estômago. A cirurgia minimamente invasiva

pode aplicar-se também a GISTs noutras localizações, mas os dados disponíveis relativamente a

ressecções de casos localizados no esófago são escassos e na generalidade referentes a enucleação

tumoral. A localização do tumor não pode ser considerada contra-indicação absoluta para cirurgia

minimamente invasiva, desde que assegurada a experiência técnica necessária224 e que os

procedimentos sigam rigorosamente os mesmos princípios oncológicos da cirurgia por via aberta:

ressecção completa do tumor com margens livres (R0), evitando a ruptura e disseminação de células

tumorais24, 138, 219.

No presente caso foi realizada uma esofagectomia transtorácica de tipo Ivor Lewis, que estava

indicada em função das características clínico-imagiológicas do GIST, e obtiveram-se margens

cirúrgicas livres de tumor (R0). No exame histológico, o tumor era constituído por células

fusiformes, com baixo índice mitótico (2/50 CGA) e com expressão imuno-histoquímica de KIT

(CD117) e CD34. Tratava-se de um GIST de alto risco de agressividade. No estudo molecular

(incluído no trabalho III desta dissertação) verificou-se a existência de uma mutação no exão 11 do

gene KIT (557del558).

Não foi efectuada terapêutica adjuvante porque à data do tratamento do caso (2003) esta opção não

estava indicada nem aprovada. O doente está vivo e sem evidência de recidiva da doença, 7 anos

após a cirurgia.

Nas séries publicadas, a sobrevida dos doentes com GIST, após ressecção de toda a doença

macroscópica, varia consideravelmente. Estes doentes apresentam taxas de sobrevida aos cinco

anos entre 35% e 65%, dependendo da inclusão de maior ou menor percentagem de casos com

doença disseminada27, 190, 345.

O uso de inibidores tirosina-cinásicos veio revolucionar a terapêutica dos GISTs, e em particular

dos tumores localmente avançados. Estes casos podem beneficiar do tratamento pré-operatório

com imatinib (neoadjuvante), com o objectivo de facilitar a obtenção de margens cirúrgicas R0 e

permitir uma cirurgia com preservação da função e do órgão, como é o exemplo dos GISTs

localizados na junção esófago-gástrica214. Esta é a recomendação de consenso da ESMO e da

NCCN também para GISTs noutras localizações igualmente raras e de abordagem cirúrgica

particularmente mutilante, como são a segunda porção do duodeno e o recto baixo24, 138.

Um aspecto prático muito relevante para a indicação de terapêutica neoadjuvante com imatinib,

particularmente nestas localizações (esofágica, duodenal e rectal), é a necessidade da obtenção de

um diagnóstico anátomo-patológico pré-terapêutico. Actualmente aceita-se que a biópsia com

agulha fina ou a microbiópsia (core biopsy) guiada com ultrassonografia endoscópica estão

particularmente indicadas nestes doentes, porque do seu resultado depende a eventual abordagem

terapêutica a adoptar24, 172.

138

Recentemente, com base nos resultados do ensaio clínico do ACOSOG (Z9001), o imatinib (400

mg/dia, durante 1 ano) foi aprovado como terapêutica adjuvante no GIST. Segundo as

recomendações actuais, o tratamento adjuvante com imatinib é amplamente aceite como opção

para doentes com GISTs de risco biológico intermédio/elevado24, 138. No entanto, permanecem por

esclarecer algumas questões fundamentais, incluindo a heterogeneidade biológica reconhecida nos

GISTs, sobre esta opção terapêutica: a taxa de recidiva absoluta após maior tempo de follow-up

(casos com recidiva precoce vs. recidiva tardia); o benefício obtido no intervalo de tempo livre de

recidiva; e, aquando da eventual recidiva, o tempo para ocorrência de resistência secundária ao

imatinib.

Conclusão:

A opção terapêutica mais adequada para os GISTs do esófago depende da confirmação diagnóstica

prévia, da localização no esófago, da dimensão/extensão loco-regional do tumor e do risco

cirúrgico do doente. Nos GISTs com dimensões < 2 cm é de ponderar a abordagem conservadora

com vigilância periódica do doente. A esofagectomia, seguindo os princípios oncológicos, é o

procedimento cirúrgico indicado na maioria dos casos, para uma ressecção R0. A cirurgia

minimamente invasiva pode ser considerada, quando é possível respeitar os mesmos princípios da

cirurgia oncológica. A terapêutica neoadjuvante deve ser uma opção a considerar nos casos

localmente avançados. A terapêutica adjuvante é uma opção possível, que carece de mais evidências

para GISTs nesta localização específica.

139

III. Objectivo: Avaliar o estado mutacional dos genes KIT e PDGFRA numa série de doentes,

para correlacionar as características clínico-patológicas e moleculares identificadas e o seu impacto

no prognóstico dos doentes com GIST.

A investigação intensiva na biologia dos tumores verificada na última década destacou o papel

fundamental dos receptores tirosina-cinásicos, em especial do KIT e do PDGFRA, na patogénese

dos GISTs55. Estes receptores apresentam actualmente grande importância na abordagem

terapêutica dos GISTs, relacionada com o desenvolvimento de inibidores tirosina-cinásicos como o

imatinib e o sunitinib9, 346.

Não existem ainda dados epidemiológicos consistentes sobre a frequência e o tipo de mutações nos

genes KIT e PDGFRA em GISTs diagnosticados nos países da Europa do Sul, nomeadamente em

Portugal.

No nosso estudo, verificámos que 92% dos GISTs expressavam CD117 (KIT), independentemente

da topografia, idade ou género, de acordo com os resultados de estudos anteriores efectuados

noutras populações38, 347. Não foi detectada qualquer associação estatisticamente significativa entre a

expressão de CD117 e a presença de mutações do KIT. De facto, dois dos seis GISTs sem

expressão de CD117 (KIT) apresentavam mutações do KIT (uma mutação missense no exão 9 e uma

delecção de 3 pb no exão 11). Apesar dos GISTs negativos para o CD117 poderem corresponder a

tumores wild-type (sem mutações KIT/PDGFRA) ou a tumores com mutações do PDGFRA106, 107,

foi também descrita a existência de mutações do KIT em casos CD117-negativos107. A análise

molecular efectuada nos nossos doentes foi importante para o diagnóstico definitivo de GIST em 2

dos 6 casos negativos para CD117. A frequência de casos negativos para CD117 e wild-type para as

mutações do KIT e do PGDFRA encontrados na nossa série de doentes (5%) coaduna-se com os

resultados descritos na literatura107.

Nos 78 doentes analisados, identificámos a presença de mutações do KIT em 56,4% (44/78) dos

casos, sendo 91% (40/44) localizados no exão 11 e 9% (4/44) no exão 9. Estes valores estão em

conformidade com os resultados anteriormente publicados por outros autores (30-80%),

particularmente na Península Ibérica55, 102, 348.

As mutações no exão 11 do gene KIT são descritas em GISTs que, habitualmente, ocorrem em

todo o tracto gastrointestinal (GI), sem preferência por qualquer localização específica38, 94-98. Não

foi ainda estabelecida uma relação clara entre os diferentes tipos de mutações do KIT neste exão e a

morfologia celular dos tumores. Na nossa série, foi possível observar uma correlação significativa

entre a morfologia celular epitelióide e a ausência de mutações do KIT (p=0,0064).

Vários tipos de mutações podem ser observadas no exão 11, mas as delecções são as que se

identificam mais frequentemente. Em 75% (30/40) dos casos da nossa série, as mutações

encontravam-se entre os codões 550 e 561, conhecida por ser a região mais frequentemente

envolvida no exão 11, com 57% (17/30) dos casos a corresponderem a mutações nos codões 557

ou 558. Alguns autores descreveram existir uma associação entre as mutações nestes dois codões e

um comportamento mais agressivo dos GISTs55, 101. No entanto, apenas quatro destes 17 casos da

140

nossa série recidivaram (4/17, 24%). Apesar de ter sido anteriormente descrito que todas as

mutações pontuais ocorrem exclusivamente nos codões 557, 559, 560 e 576, encontrámos uma

mutação pontual nova no codão 570 (Y570F)348.

As mutações no exão 9 do KIT têm sido relacionadas com a localização no intestino delgado, mas

apenas 1 dos 4 casos de GIST da nossa série com mutação neste exão tinha esta localização55, 348.

O impacto prognóstico das mutações nos genes de receptores tirosina-cinásicos foi avaliado em

diversos estudos retrospectivos publicados, mas existe ainda alguma controvérsia relativamente ao

significado prognóstico das mutações do KIT no exão 11 dos GISTs. No presente estudo, e de

acordo com resultados anteriormente publicados55, 99, o estado mutacional KIT positivo associou-se

a pior prognóstico e a sobrevida mais curta dos doentes (p=0,046).

Estudos mais recentes sugerem que os diferentes tipos de mutações no exão 11 podem

correlacionar-se com a evolução clínica dos tumores75. Os GISTs gástricos com delecções neste

exão parecem ter tendência para cursar, na ausência de tratamento com imatinib, com um

comportamento clínico mais agressivo do que os tumores com substituições de um nucleotídeo38.

Na nossa série, não se observou relação significativa entre o tipo de mutação do KIT (mutação

pontual, delecção ou mutação mista), ou a sua localização (exão 9 ou exão 11), e a sobrevida dos

doentes (dados não publicados).

A análise do gene PDGFRA nos nossos doentes revelou a presença de mutações em 6% (5/78) dos

casos (15% dos GISTs KIT wild-type), o que está de acordo com os resultados publicados por outros

autores.

Foi também descrita a existência de uma associação entre alguns aspectos clínico-patológicos dos

tumores, como a localização gástrica, e a presença de mutação no gene PDGFRA72, 106, 108, 349.

Embora o número de casos com mutações do PDGFRA na nossa série seja baixo para avaliação

estatística (n=5), 80% (4/5) das mutações ocorreram em tumores gástricos. Todos os GISTs com

mutações no gene PDGFRA apresentavam expressão de CD117.

O uso do mesilato de imatinib (Glivec® /Gleevec®, Novartis), um inibidor selectivo dos

receptores tirosina-cinásicos, trouxe novas perspectivas para o tratamento dos doentes com GIST.

Foi demonstrado que a resposta clínica objectiva ao imatinib depende da presença e do tipo de

mutações nos genes KIT e PDGFRA9, 55, 350. As taxas de resposta objectiva ao imatinib obtidas em

diferentes ensaios clínicos efectuados em GISTs com mutações no exão 11 e no exão 9 do KIT, e

em GISTs wild-type, foram 72-86%, 38-48% e 28%, respectivamente9, 21, 87, 152, 205, 206. Os doentes com

mutações no exão 9 do KIT apresentam sobrevida livre de progressão tumoral mais longa quando

tratados com uma dose inicial de 800 mg/dia87, 89, 263.

É reconhecido que algumas mutações específicas são responsáveis pela resistência ao imatinib:

mutações do KIT V654A e W670I (exão 13), D816V e T823D (exão 17), e a mutação do PDGFRA

D842V (exão 18)269, 350, 351. De todas estas mutações resistentes ao imatinib, apenas a mutação

D842V foi detectada em dois GISTs da nossa série de doentes.

141

A FDA e a EMA aprovaram recentemente um novo inibidor dos receptores tirosina-cinásicos, o

sunitinib (Sutent ®, Pfizer), para o tratamento de segunda linha dos doentes com GIST que

apresentam progressão da doença sob terapêutica com imatinib, principalmente devida a mutações

resistentes primárias ou secundárias, ou nos casos de intolerância ao imatinib272, 292, 346.

Resultados de estudos efectuados com sunitinib, em doentes com GIST avançado, mostraram

benefício clínico em todas as principais mutações do KIT207. Foi publicada evidência de benefício

clínico para os três genótipos mais comuns: 34% nos tumores com mutações no exão 11 do KIT,

58% nos casos com mutações no exão 9 e 56% nos tumores wild-type para o gene KIT ou com

mutações do PDGFRA. A taxa de resposta parcial (37%) obtida nos GISTs com mutações

primárias no exão 9 indica que o sunitinib pode ser particularmente eficaz nos doentes que

apresentam mutações do KIT neste exão.

A introdução dos inibidores tirosina-cinásicos na terapêutica dos doentes com GIST veio realçar a

importância dos parâmetros de avaliação patológica (diagnóstica/ prognóstica/preditiva) nos

doentes com GIST, incluindo a caracterização molecular dos genes KIT e PDGFRA,

potencialmente útil numa abordagem terapêutica eficaz e ajustada a cada caso individual.

Actualmente, a opção pela realização da análise molecular de rotina em todos os GISTs continua a

ser um assunto controverso. O estudo mutacional dos genes KIT e PDGFRA deve ser

especialmente considerado para confirmação do diagnóstico definitivo dos GISTs sem expressão

de CD117 (e DOG1), e porque permite prever a resposta dos tumores à terapêutica com inibidores

tirosina-cinásicos, pode ser útil para seleccionar os doentes que realmente poderão beneficiar do

tratamento com imatinib, sobretudo quando candidatos a administração de doses mais elevadas

(800 mg/dia)24, 138 ou de outro tratamento alternativo.

O estudo molecular pode também ser considerado um auxiliar importante para a decisão de

tratamento adjuvante com imatinib, em GISTs primários de risco intermédio e alto24, 138. Deste

modo, podem desde logo ser excluídos os GISTs com mutações reconhecidamente resistentes ao

imatinib (ex: mutações D842V do PDGFRA). Estes testes, na opção neoadjuvante, permitem

também ajustar o esquema terapêutico de forma mais adequada.

Finalmente, os resultados deste estudo são também úteis para potenciar um banco de dados multi-

institucional com o objectivo de contribuir para o esclarecimento da epidemiologia, biologia e

tratamento dos doentes com GIST em Portugal.

Conclusão:

Neste estudo descrevemos pela primeira vez a frequência de mutações do KIT e do PDGFRA

numa grande série de doentes portugueses com GIST. A incidência global de mutações do KIT e do

PDGFRA nestes doentes (63%) é concordante com os resultados de outros estudos, especialmente

em populações ibéricas. Foram identificadas mutações no gene KIT em 56% dos casos e mutações

do PDGFRA em 6% dos casos. A presença de mutações do KIT parece associar-se com a

142

sobrevida mais curta dos doentes. A grande maioria (91%) das mutações activantes do gene KIT

localizou-se no exão 11, indicando a possibilidade de uma resposta favorável à terapêutica destes

doentes com imatinib.

O imatinib continua a ser actualmente a opção de escolha no tratamento de primeira linha dos

doentes com GISTs irressecáveis e metastáticos. Em geral, as taxas de resposta ao imatinib mais

favoráveis são observadas nos GISTs que têm mutações no exão 11 do KIT. No entanto, as

evidências mais recentes sugerem que o sunitinib, aprovado para a terapêutica de segunda linha,

pode ser particularmente eficaz no tratamento dos GISTs que têm mutações do KIT no exão 9 e

nos GIST wild-type.

O estudo mutacional dos genes KIT e PDGFRA deve ser considerado no diagnóstico definitivo dos

GISTs negativos para CD117. Nas circunstâncias actuais, e na ausência de evidências conclusivas, a

análise molecular deve ser imprescindível na selecção dos casos de GISTs avançados para ponderar

o tratamento (ex: inibidor tirosina-cinásico) mais indicado em cada doente particular com GIST.

143

IV. Objectivo: Esclarecer as alterações moleculares alternativas em GISTs wild-type, procurando

identificar alterações potencialmente úteis para o diagnóstico e eventualmente preditivas de resposta

a terapêuticas dirigidas a novos alvos moleculares em doentes com GIST.

A maioria dos GISTs tem origem em mutações activantes no gene KIT, com uma frequência que

varia, nos diferentes estudos publicados, entre 30% e 85 % dos casos10, 11, 55, 64. A maior

percentagem de mutações do KIT ocorre no exão 11, seguida pelas mutações no exão 9 e,

raramente, nos exões 13 e 17. Adicionalmente, os GISTs KIT wild-type podem ter mutações

activantes noutro gene de receptor tirosina-cinásico classe III, o PDGFRA (platelet-derived growth

factor receptor A), que ocorrem, na maioria dos casos, no exão 18 e, raramente, nos exões 12 e 1455, 72,

75. Foi possível verificar que os doentes com GISTs com mutações activantes nestes genes (KIT e

PDGFRA) podem ser tratados eficazmente com inibidores tirosina-cinásicos específicos352, 353. No

entanto, existe um subgrupo de doentes com GIST (10-15%, até 40% dos casos) que são wild-type

para os genes KIT e PDGFRA10, 38, 102, 352. Esta variação observada na frequência das mutações do

KIT e do PDGFRA nos GISTs pode depender, em parte, da localização do tumor, da metodologia

e do tipo de tecido (congelado ou fixado em formol e incluído em parafina) usado nos diferentes

estudos55, 64, 75, 354.

Este trabalho teve como objectivo estudar as características moleculares ainda pouco esclarecidas

dos GISTs wild-type para os genes KIT e PDGFRA. Pretendia-se, deste modo, identificar novos

marcadores de prognóstico e potenciais agentes terapêuticos para este subgrupo de GISTs.

Inicialmente, avaliou-se a possibilidade da existência de eventuais mutações (duplicação no exão 11

do KIT), não identificadas no estudo prévio (trabalho III) da nossa série. Lasota et al. sugeriram que

as duplicações no exão 11 do KIT podem não ser detectadas em amostras fixadas em formol e

incluídas em parafina, devido à amplificação preferencial da PCR (reacção em cadeia da polimerase)

do alelo do KIT wild-type, não permitindo identificar um fragmento grande do alelo mutante317. Em

face destas evidências, decidiu-se reavaliar todos os casos wild-type (n=29) da nossa série. Foi assim

possível identificar três casos com duplicação no exão 11, permitindo ajustar para 33% (26/78) a

percentagem efectiva de GISTs wild-type na nossa série, o que está de acordo com os resultados

descritos noutras séries, designadamente da Península Ibérica102.

Nos 26 GISTs wild-type assim definidos, foi avaliada a expressão imuno-histoquímica do KIT

(CD117), do factor de crescimento SCF (stem cell factor; ligando KIT) e do estado de activação do

KIT (fosfo-KIT). A expressão conjunta do ligando (SCF) e do receptor KIT (CD117) em cerca de

65% e a expressão de fosfo-KIT em aproximadamente 30% dos casos com expressão de KIT e

SCF suporta a possibilidade da existência de mecanismos autócrinos/parácrinos como via

patogénica alternativa em GISTs wild-type. Os nossos resultados são concordantes com os obtidos

num estudo recente, que descreveu co-expressão do KIT/SCF na maioria dos GISTs,

independentemente do estado mutacional dos genes KIT e PDGFRA313. A activação do KIT

(fosfo-KIT), avaliada por western blot em linhas celulares e tecidos congelados, foi descrita em 70-

80% dos GISTs wild-type na mesma proporção e nível de activação observados em GISTs com

144

mutações do KIT/PDGFRA16, 313. Tal como neste estudo, outros autores também descreveram que

a co-expressão do KIT/SCF não induz sempre a activação do receptor KIT313. Esta discrepância

observada no número de casos com activação do KIT pode ser explicada por diferenças na

metodologia utilizada e no tipo de fixação tecidular dos tumores. O anticorpo usado no nosso

estudo reconhece a fosforilação do KIT na tirosina 703, enquanto nos estudos anteriormente

referidos o anticorpo usado reconhece a fosforilação do KIT na tirosina 72116, 313. Apesar das

vantagens reconhecidas na avaliação imuno-histoquímica de tecidos fixados em formol e incluídos

em parafina, este método é menos consistente do que a análise por western blot para avaliação do

estado de fosforilação das proteínas. Consequentemente, serão necessários estudos adicionais para

determinar a frequência da activação do KIT e, muito especialmente, sobre o seu impacto na

eficácia dos tratamentos possíveis e adequados para doentes com GISTs wild-type.

Outro aspecto pouco estudado e muito importante é esclarecer as alterações moleculares implicadas

na patogénese dos GISTs (KIT e PDGFRA) wild-type. De facto, contrastando com o conhecimento

substancial actual sobre os efeitos da activação dos receptores KIT e PDGFRA resultantes das

respectivas mutações oncogénicas, há poucos estudos publicados sobre as alterações nas vias de

sinalização intracelular, incluindo a do KIT/PDGFRA, independentes das mutações referidas16, 63,

76, 355. A via da MAPK (RAS/RAF/MEK/ERK) é uma das cascatas de fosforilação a jusante do

receptor KIT, que está preservada e implicada no crescimento, diferenciação, migração e sobrevida

celular356. Em vários tipos de tumores sólidos, incluindo o carcinoma do pâncreas, do cólon, o

carcinoma papilar da tireóide e o melanoma, esta via de sinalização MAPK pode ser regulada

constitutivamente por mutações activantes nos genes da família RAS (RAt Sarcoma) ― H-RAS, K-

RAS e N-RAS (Harvey-Ras, Kirsten-Ras, Neuroblastoma-Ras), e no gene BRAF, membro da família

RAF (proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)67, 356-359.

Neste trabalho, a avaliação da contribuição de alterações na via de sinalização MAPK nos GISTs

wild-type consistiu na análise mutacional dos genes da família RAS e BRAF e na avaliação dos níveis

de expressão imuno-histoquímica de ERK fosforilada. Apesar da elevada frequência de mutações

nos genes da família RAS em vários tipos de tumores, incluindo os carcinomas do pâncreas, o

carcinoma papilar da tireóide, o carcinoma do cólon e o carcinoma do pulmão de células não-

pequenas356, 360, não se identificou em nenhum dos 26 GISTs desta série mutações do H-RAS, do

K-RAS, nem das regiões hotspot do N-RAS. A análise do BRAF, outro oncogene importante da via

MAPK, permitiu identificar a presença da mutação activante V600E em cerca de 4% (um caso) dos

GISTs wild-type desta série. A mutação V600E é responsável por 90% das mutações do BRAF nos

tumores malignos humanos e associa-se a maior actividade cinásica, que induz a activação de ERK,

independente do estado de activação de RAS361. Por outro lado, não se identificou nesta série

qualquer mutação do BRAF nos GISTs com mutações do KIT ou do PDGFRA, sugerindo que as

mutações do BRAF, KIT e PDGFRA são mutuamente exclusivas.

Quando o presente trabalho foi iniciado, não existiam publicações sobre a análise de mutações do

RAS ou BRAF em GISTs. Posteriormente, outros estudos descreveram mutações V600E no exão

15 do BRAF em 5-13% dos GISTs wild-type de adultos (5%= 3/61 casos115, 7%= 2/28 casos114,

13%= 9/70 casos116). Os GISTs com mutação do BRAF parecem localizar-se preferencialmente no

145

intestino delgado, sendo ainda controversa a sua associação com o comportamento biológico em

GISTs de alto risco.

Para melhor esclarecimento do papel da via da MAPK em GISTs wild-type, avaliou-se a expressão de

fosfo-ERK que foi identificada em 30% dos casos wild-type da nossa série. Estudos previamente

publicados sugeriram que a activação de ERK (extracellular signal-regulated kinase) em GISTs depende

da sinalização KIT63 e que algumas linhas celulares KIT wild-type também têm activação de ERK76.

Os nossos resultados estão de acordo com estes resultados publicados, salientando-se que

identificamos uma correlação significativa (p=0,02) entre a expressão de fosfo-ERK e a expressão

de fosfo-KIT. No entanto, a expressão de fosfo-ERK em 50% dos casos da nossa série sem

expressão de fosfo-KIT, sugere que a activação de ERK independente da activação de KIT nos

GISTs wild-type é causada provavelmente por outras vias (ex: AKT/PI3K e JAK/STAT) de

sinalização intracelular16, 353.

Os factores de prognóstico dos GISTs wild-type são ainda controversos. Alguns estudos sugerem um

prognóstico melhor nos GISTs wild-type, quando comparados com os tumores com mutações55,

sendo que estes resultados não foram confirmados num estudo de base populacional362. Nesta

nossa série, verificámos que parâmetros clínico-patológicos habitualmente associados a

comportamento agressivo nos doentes com GIST, incluindo a maior dimensão do tumor e o grupo

de alto risco de agressividade, são também factores de mau prognóstico em doentes com GISTs

wild-type.

Existem trabalhos publicados de ensaios clínicos fase II e III descrevendo que os doentes com

GISTs wild-type raramente respondem ao tratamento com imatinib9, 87, 205, 258. Estes doentes

constituem um desafio terapêutico muito importante. As evidências mais recentes sugerem que o

sunitinib pode ser particularmente eficaz no tratamento dos GISTs com mutações do KIT no exão

9 e nos GISTs com genótipo wild-type (sem mutações do KIT / PDGFRA)89, 207, 272, mas as

indicações terapêuticas precisas para este último subgrupo de doentes não estão ainda claramente

estabelecidas.

A activação constitutiva da via de sinalização intracelular RAS/RAF/MEK/ERK pode também

regular a resposta dos doentes a terapêuticas dirigidas aos receptores tirosina-cinásicos,

independente do estado a montante dos receptores tirosina-cinásicos.

Alguns fármacos dirigidos contra moléculas RAS/RAF/MEK são actualmente objecto de estudo

em ensaios clínicos ou pré-clínicos em curso. Não foram ainda descritos inibidores de ERK1 ou

ERK2 com aplicabilidade clinicamente relevante360. O inibidor anti-RAF sorafenib (Nexavar ®) é

um inibidor tirosina-cinásico potente do BRAF wild-type e do BRAF com mutação V600E, e

descreveu-se que é um inibidor multi-cinásico que inibe outros receptores tirosina-cinásicos,

incluindo o KIT, o receptor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) -2, o VEGFR-3

e o PDGFRB363. A FDA aprovou o sorafenib para o tratamento do carcinoma de células renais e

do hepatocarcinoma avançados, estando também a ser avaliado no carcinoma do pulmão de células

não-pequenas, nos carcinomas da próstata, da mama e do pâncreas e no melanoma363, 364. Vários

146

estudos descreveram a associação da actividade anti-tumoral do sorafenib a um efeito anti-

angiogénico363, 364.

Em contraste com o sorafenib, as pequenas moléculas inibidoras da MEK1/2 (MAPK/ERK kinase

1 / 2) são consideradas inibidores mais específicos. Os estudos pré-clínicos com AZD6244

(ARRY-142886) revelaram resultados promissores e levaram ao desenvolvimento de ensaios

clínicos adicionais365, 366. Neste contexto, é interessante sublinhar que Solit et al. descreveram que os

tumores com mutação do BRAF são muito sensíveis à inibição cinásica de MEK367.

Os resultados promissores recentemente descritos com o inibidor da cínase RAF PLX4032

(Plexxikon), também conhecido como RG7204, em doentes com melanomas que têm mutação

V600E, sugerem a possibilidade de se obter respostas semelhantes noutros tipos de tumores que

partilhem dependência oncogénica do gene RAF na sua patogénese368, 369.

Conclusão:

A via da MAPK (RAS/RAF/MEK/ERK) a jusante do receptor KIT está implicada na patogénese

de vários tipos de tumores sólidos. O nosso estudo constitui uma análise compreensiva da

desregulação da via MAPK nos GISTs wild-type para os genes KIT e PDGFRA. Na ausência de

mutações RAS sugere-se que a via da MAPK pode ser activada através de mecanismos

autócrinos/parácrinos de SCF/KIT e/ou por mutação do gene BRAF num subgrupo de GISTs

wild-type. A mutação activante V600E do BRAF foi observada num (4%) dos GISTs wild-type da

nossa série. Posteriormente, outros estudos descreveram mutações V600E no exão 15 do BRAF

em 5-13% dos GISTs wild-type de adultos.

Alguns fármacos dirigidos contra moléculas RAS/RAF/MEK são actualmente objecto de estudo

em ensaios clínicos ou pré-clínicos. As mutações activantes V600E nos GISTs wild-type levantam a

possibilidade de terapêutica com inibidores da cínase RAF [ex: PLX4032 (Plexxikon)] neste

subgrupo de tumores. Apesar da reduzida frequência das alterações moleculares da via da MAPK,

são necessários estudos adicionais que avaliem o potencial do tratamento dirigido a moléculas desta

via em GISTs (KIT e PDGFRA) wild-type.

147

V. Objectivo: Avaliar a expressão de RKIP, a sua associação com diferentes parâmetros clínico-

patológicos, e esclarecer o papel deste marcador em doentes com GISTs primários.

O GIST irressecável e/ou metastático é uma doença potencialmente fatal e reconhecidamente

resistente à quimioterapia convencional e à radioterapia. A mediana de sobrevida dos doentes com

GIST metastático é de aproximadamente 20 meses e nos doentes com recidiva local é de 9-12

meses27. O mesilato de imatinib é uma opção de primeira escolha para o tratamento da doença

metastática258. No entanto, continua a ser necessária uma caracterização molecular mais completa e

adequada dos tumores para o tratamento mais eficaz dos GISTs com resistência primária e/ou

secundária ao imatinib. Nestas circunstâncias, com a excepção das mutações do KIT e do

PDGFRA, actualmente não existe outra alteração molecular preditiva, de forma consistente, do

prognóstico dos doentes com GIST101, 326.

A proteína RKIP é considerada um modulador de transdução de sinal (Fig. 5) e um supressor de

metastização tumoral370. A primeira evidência surgiu no estudo de Fu et al., em que se descreveu

que as linhas celulares derivadas de metástases de carcinomas da próstata tinham diminuição dos

níveis da expressão de RKIP, quando comparadas com linhas celulares do tumor primário371. No

Fig. 5: RKIP e via de sinalização da MAPK.

148

carcinoma da mama372 e no carcinoma colo-rectal metastático372, 373 foi também descrita a perda da

expressão de RKIP nas metástases ganglionares linfáticas, mas não nos tumores primários. Estes

resultados suportam a possibilidade da expressão RKIP poder ser sujeita a regulação negativa nos

tumores em que se desenvolve doença metastática. Adicionalmente, a sobre-expressão de RKIP in

vitro e in vivo em modelos de tumores da próstata e de melanomas sugere que esta proteína

representa um importante supressor da metastização, diminuindo a invasão vascular371, 374. Vários

estudos corroboraram o papel de RKIP como supressor potente da patogénese das metástases de

tumores, descrevendo frequentemente diminuição acentuada da expressão de RKIP: carcinoma da

próstata metastático371, melanoma maligno374, metástases ganglionares linfáticas do carcinoma da

mama372, insulinoma375, carcinoma colo-rectal373, hepatocarcinoma376, carcinoma do ovário377,

carcinoma de células de Merkel378 e carcinoma da tireóide379.

O estudo de Eves et al.380 sugere também que a ausência de RKIP pode aumentar a instabilidade

genética das células e, no trabalho de Lee et al.376, em células de hepatoma, sugere-se que a ausência

de RKIP pode aumentar a taxa de divisão celular. A perda de expressão citoplasmática de RKIP

tem sido também associada a recidiva tumoral, no carcinoma colo-rectal381, e a mau prognóstico,

nos adenocarcinomas da próstata, colo-rectal e do estômago381-384. Foi recentemente proposto que

o nível sérico de RKIP pode ser usado como marcador de prognóstico em doentes com cancro da

próstata384. A perda de expressão RKIP pode ser, desta forma, considerado um marcador de

progressão tumoral.

Na nossa série de doentes submetidos a cirurgia de ressecção (n=104; trabalho I), marcadores de

prognóstico bem estabelecidos como o diâmetro do tumor > 10 cm, o índice mitótico > 5

mitoses/CGA, a classificação de alto risco, e o estado das margens cirúrgicas (R2), além do

desenvolvimento de metástases, associaram-se significativamente com a SE dos doentes (análise

univariada). No presente estudo (n=70) identificou-se ausência de expressão citoplasmática de

RKIP em 8,5% dos casos (6/70), significativamente associada com a presença de necrose (p=0,038)

e com a SE (p=0,023) dos doentes com GIST. Adicionalmente, observou-se uma tendência para a

associação entre a presença de expressão RKIP e a ausência de metastização. Não existem outros

estudos publicados sobre a expressão de RKIP em GISTs, com base na pesquisa bibliográfica mais

recente. Descreveu-se no estudo prévio da nossa série (trabalho IV) que a frequência de alterações

da via MAPK em GISTs KIT e PDGFRA wild-type é baixa, o que está de acordo com a percentagem

baixa de casos sem expressão RKIP observada no presente estudo385. No entanto, serão necessários

estudos adicionais, com séries maiores, para validação da expressão RKIP como eventual marcador

de prognóstico em doentes com GIST. Além disso, será também importante avaliar os níveis de

expressão RKIP em biópsias de lesões metastáticas de GISTs.

Apesar da evidência crescente de que a expressão de RKIP se perde durante a progressão do tumor,

especialmente nas lesões metastáticas, continuam por esclarecer os mecanismos da regulação

negativa de RKIP386. Para esclarecer melhor o evento genético subjacente à regulação negativa de

RKIP nos GISTs, analisou-se o estado de metilação das regiões CpG (cytosine-phosphate-guanine) do

promotor do RKIP nos GISTs sem expressão deste marcador da nossa série. Não foi observada

metilação do promotor do RKIP em nenhum dos seis GISTs sem expressão de RKIP. Nos estudos

previamente publicados, os resultados sobre a metilação do RKIP são discrepantes. A metilação do

RKIP foi descrita num grupo de 12 doentes com polipose hiperplásica do cólon318. Curiosamente,

149

os mesmos autores constataram que a metilação do promotor do RKIP não era responsável pela

perda de expressão de RKIP em 28 casos de carcinoma colo-rectal373. Recentemente, Al-Mulla et

al.386 descreveram que 72,5% dos 40 carcinomas colo-rectais sem expressão de RKIP apresentavam

metilação do promotor do RKIP e sugeriram que este seria o mecanismo responsável pela

expressão de RKIP negativa386.

O papel de RKIP na progressão tumoral e no desenvolvimento de metástases pode permitir novas

abordagens terapêuticas específicas, baseadas na modulação da expressão de RKIP induzida por

fármacos, para controlo da agressividade tumoral. O locostatin parece poder anular a capacidade de

RKIP inibir a cínase Raf-1387. Os níveis aumentados de expressão RKIP, em linhas celulares de

carcinoma da próstata e da mama, re-sensibilizam as células para a apoptose induzida por fármacos.

Nas linhas celulares sensíveis à acção dos fármacos, a regulação negativa de RKIP induziu o

desenvolvimento de resistência a agentes quimioterápicos que lesam o ADN (9-nitrocamptothecin,

taxol e cisplatina)388. O anticorpo monoclonal rituximab regula positivamente a proteína RKIP, e

pode sensibilizar linhas celulares de linfoma não-Hodgkin para a apoptose induzida por agentes

quimioterápicos389. A inibição da via MEK–ERK e a inibição da via NFkB (nuclear factor kappa-light-

chain-enhancer of activated B cells) foram propostas como mecanismos implicados neste efeito de

quimio-sensibilização389. Recentemente, foi descrita a relação dos níveis de expressão RKIP em

adenomas hipofisários com a resposta clínica a curto e longo prazo ao tratamento com

octreotido390. Bonavida et al. descreveram que a quimio/imuno-sensibilização mediada pelo óxido

nítrico, através da inibição da NFkB, pode também envolver a indução de RKIP. A indução de

RKIP inibe as vias anti-apoptóticas que regulam a sensibilidade das células tumorais aos estímulos

apoptóticos391.

Conclusão:

No presente estudo, descreveu-se pela primeira vez uma associação significativa entre os níveis de

expressão tumoral de RKIP e parâmetros clínico-patológicos em doentes com GIST. Verificou-se

que a perda de expressão de RKIP num subgrupo de GISTs (6/70) parece ser independente da

metilação do promotor. Salienta-se que a perda de RKIP na nossa série se associou

significativamente a necrose do tumor e a sobrevida mais curta dos doentes. A participação de

RKIP na progressão tumoral e no desenvolvimento de metástases sugere que este marcador pode

ter potencial prognóstico, e pode permitir novas abordagens terapêuticas específicas, baseadas na

modulação da expressão de RKIP em doentes com GIST. No entanto, são ainda necessários

estudos adicionais, com séries maiores, e modelos tumorais in vivo e in vitro, que permitam clarificar

o papel do RKIP na progressão da doença e na sobrevida dos doentes.

150

151

PERSPECTIVAS FUTURAS

Nos estudos subsequentes dar-se-á continuidade à análise da sobrevida dos doentes referenciados e

seguidos em regime de consulta externa, baseada numa actualização constante dos dados da

avaliação clínica e imagiológica de cada caso.

Procurar-se-á a detecção precoce de recidivas e o início do tratamento atempado mais adequado. A

caracterização molecular de cada GIST pode revelar-se fundamental para adaptar a estratégia

terapêutica concreta, baseada nas mutações específicas identificadas.

Neste sentido, adquire particular interesse ponderar a avaliação da utilização de inibidores tirosina-

cinásicos (ex: imatinib, sunitinib, e novas terapêuticas emergentes) em contexto neoadjuvante e

adjuvante, pelo potencial de redução das recidivas locais e/ou da doença metastática.

Nos casos de GIST avançado já em tratamento com ITKs, será importante avaliar a resposta

terapêutica e, em casos seleccionados, ponderar o benefício da opção cirúrgica complementar. A

cirurgia de citorredução pode ser útil em casos de progressão localizada do tumor e, minorando o

potencial desenvolvimento de mutações secundárias, em doentes com GISTs que respondem ao

tratamento com ITKs. A ressecção cirúrgica no GIST metastizado pode ser, assim, considerada

como opção adicional no arsenal terapêutico de segunda /terceira linhas, em doentes seleccionados.

Sempre que possível, será sistematicamente obtido material criopreservado para banco de tumor e

tecido não tumoral, com consentimento informado dos doentes, para estudos moleculares que

permitam contribuir para o esclarecimento dos mecanismos da resistência aos inibidores tirosina-

cinásicos e da progressão da doença.

Com estes estudos, e com a análise da expressão imuno-histoquímica dos tumores, pretende-se dar

continuidade, designadamente, ao estudo das diferentes proteínas envolvidas nas vias de sinalização

intracelular (ex: PI3K e MAPK) implicadas na patogénese dos GISTs, que possam permitir

identificar biomarcadores de resposta e potenciais alvos para novas terapêuticas dirigidas em casos

de resistência aos tratamentos actualmente aprovados.

152

153

REFERÊNCIAS 1. Fletcher CD, Berman JJ, Corless C, et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: A

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