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AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

ESTUDOS DOS EFEITOS DA RADIAO GAMA E DE

ACELERADORES DE ELTRONS NA DETECO DE GROS DE

MILHO (Zeamays) GENETICAMENTE MODIFICADO.

RICARDO GANDARA CREDE

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear-Aplicaes.

Orientadora: Dra. Anna Lcia C. H. Villavicencio

So Paulo 2005

I N S T I T U T O D E P E S Q U I S A S E N E R G T I C A S E N U C L E A R E S

A u t a r q u i a assoc iada Un ive r s idade de So P a u l o

E S T U D O S D O S E F E I T O S DA R A D I A O G A M A E D E

A C E L E R A D O R E S D E E L T R O N S NA D E T E C O D E G R O S DE

M I L H O {Zea mays) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O .

R I C A R D O G A N D A R A C R E D E

Disse r t ao a p r e s e n t a d a como

p a r t e dos requ is i tos p a r a

ob teno do G r a u de M e s t r e em

Cinc ias n a r e a de Tecnologia

N u c l e a r - Apl icaes .

O r i e n t a d o r a :

D r a . A n n a L .C . H . Vil lavicencio

So Pau lo

2005

(CASO K; 'C?Al DC Cf/ERS NCLEAa/SP-H^i

II

Este trabalho dedicado a todos aqueles

que fazem ou acreditam na cincia brasileira.

III

Dra. Anna Lucia C. H. Villavicencio pela amizade, carinho, estmulo, paciencia . determinao e orientao no s neste trabalho, como tambm em outros momentos que passamos juntos.

Aos colegas de laboratrio: Dbora, Gustavo. Ingrid, Juliana. Mariana, Michel, Priscila, Reginaldo. Rosamara e Simone, pelo alegre convvio dirio.

Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira, pela ajuda na irradiao das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaes.

Aos incionrios, ps-graduandos e estagirios do Centro de Tecnologia das Radiaes, que fazem deste departamento um timo local de trabalho.

Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares, na pessoa do Dr. Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra. Maria Helena de Oliveira Sampa, chefe de pesquisa do CTR, pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho, juntamente com a Fapesp.

Aos meus pais e meu irmo Rafael, que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadmico.

Ao professor Crodowaldo Pavan, pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo.

Aos professores e amigos Osmir Nunes e Glria Kreinz. pelo incentivo na rea acadmica.

Ao meu amigo e divulgador cientfico Mauro Celso Destcio pelo apoio e companheirismo.

Ao meu amigo Marcello Bittencourt, diretor da Rdio USP, pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadmico.

Aos meus amigos e colegas do Ncleo Jos Reis de Di\ulgao Cientfica e da Rdio USP, com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho.

A todos aqueles que me deram foras e acreditaram em minha capacidade e persistncia.

Muito Obrigado !

A G R A D E C I M E N T O S

IV

Segundo Albert Einstein

"A cincia uma coisa maravilhosa,

desde que voc no tenha que ganhar a vida com ela "

pode ser,

" mas sou brasileiro

e no desisto nunca "

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L T R O N S NA D E T E C O DE GROS DE

M I L H O {ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O .

Ricardo Gndara Crede

R E S U M O

A principal tcnica para deteco de organismos geneticamente modificados -OGM's a reao em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR. A PCR um mtodo que permite a amplificao in vitro de segmentos de DNA, utilizando-se dois iniciadores ("primers") que hibridizam com as fitas opostas, em regies que flanqueiam o segmento a ser amplificado. Para isso, o DNA desnamrado (92-96C), os "primers" so hibridizados (30 a 60C) e posteriormente, a sntese de DNA feita com uma DNA-polimerase e nucleotdeos (dNTPs) (72 "C), por vrios ciclos repetitivos. O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanos na Biologia Molecular, principalmente para anlise de genes, diagnstico de doenas e patgenos, entre outros exemplos. Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificao de constituintes transgnicos em alimentos. Na deteco de gros geneticamente modificados, a tcnica de PCR mostrou-se altamente sens\el, ela permite identificar um gro geneticamente modificado dentre um milho de gros normais. Hoje, a anlise pelo mtodo de PCR, a nica, em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um no transgnico. A identificao de alimentos originrios de gros transgnicos. como soja e milho, atravs da tcnica PCR ainda polmica. Sendo que o resultado do teste mais confivel quando este positivo. Ou seja, a ausncia de deteco no significa que o produto no contenha, de fato, ingredientes transgnicos. Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma seqncia de DNA, preciso que este esteja minimamente preservado. Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializao, que na manipulao dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo, por calor ou radiao) e, com isso no ser mais detectvel. Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na deteco de OGM's em alimentos irradiados contendo milho. Para a irradiao do material foi utilizada uma fonte de ^Co Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada, LTD) e um acelerador de eltrons (radiation Dynamics Inc. USA), aplicando-se doses de 1, 25 e 50 kGy. Aps a irradiao das amostras, os resultados da deteco foram comparados com amostras no irradiadas, mostrando que, quando utilizada a tcnica da PCR, a irradiao no afeta a deteco de milho geneticamente modificado.

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS).

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR. The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments, using two starters ("primers") that hybridize with the opposing ribbons, in regions that match the segment to be amplified. For that, the DNA is disnatured (92-96C), the "primers" are hybridized (30 a 6 0 ^ ) and, after that, the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 C), for some repetitive cycles. The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology, mainly for analysis of genes, diagnosis of ilbiesses and pathogens, among some other examples. Currently, the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods. In the detection of genetically modified grains, the PCR technique showed to be highly sensitive, because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains. Nowadays, the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one. The identification of foods that were made of transgenic grains, as soy and maize, through the PCR technique is still controversial. Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive. Or either, the detection absence does not mean that the product does not have, in fact, transgenic ingredients. It happens because to detect a DNA sequence, is necessar>' to preserve a minimum portion of the DNA. However, what happens many times in the industrialization process is that, in the manipulation of the ingredients, the DNA can be degraded (for example, for heat or radiation) and, consenquently, is not detectable any longer. This work has as a main objective the study of the viabilit\' in the use of the PCR in the detection of GMO's in radiated foods containing maize. For the irradiation of the material, a source of ^''Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc. USA) were used (Atomic Energy of Canada, LTD), applying doses of 1, 25 and 50 kGy. After irradiating the samples, the detection results were compared with non-irradiated samples, showing that, when the PCR technique, was used, the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze.

VII

S U M A R I O

Pgina

1- Introduo 1

2- Objetivos 10

3- Reviso da Literarura 11

-3.1- Uso e ao dos milhos geneticamente modificados 11

-3.2- Deteco de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

3.3- Deteco baseada na presena de DNA 17

3.4- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

3.5- O desenvolvimento da irradiao de alimentos 23

-3.6- Uso da irradiao de alimentos 29

3.7- Aplicao das irradiaes em gros 31

3.8- Perdas na armazenagem de gros 34

3.9- Importncia econmica da produo de milho 36

4- Materiais e Mtodos 40

4.1- Amostras 40

4.2- Irradiao das amostras 41

-4.3- Controles positivos 43

4.4- Adequao das amostras 43

4.5- Extrao do DNA das amostras 43

4.6- Primers 46

4.7- Visualizao do DNA obtido 47

4.8- A reao em cadeia pela polimerase (PCR) 47

4.9- Programao do termociclador 48

4.10- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discusso 62

8- Concluses 69

9- Referncias Bibliogrficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Pgina

Quadro 1: Perdas por pragas em gros armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2: Primers utilizados, nomes, funes, seqncias e segmento amplificado 47

Quadro 3: Resultado final das PCR's e sua equivalncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Pgina

Figura 1: Instalaes de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em So Jos dos Campos - SP 2

Figura 2: Foto do acelerador de eltrons Radiation Dynamics,

pertencente ao IPEN 7

Figura 3: Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4: A esquerda lagarta e direita, forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5: forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6: A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella. a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7: Irradiador semi-industrial multipropsito do

Centro de Tecnologia das Radiaes - CTR do

IPEN/CNEN em So Paulo 28

Figura 8: Di\iso do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9: Produo mdia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10: Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11: Amostras devidamente embaladas para

irradiao na Gammacell 42

Figura 12: Amostras nas embalagens para irradiao

no acelerador de eltrons 42

Figura 13: Laboratrio destinado ao processo de

extrao de DNA 46

Figura 14: termociclador utilizado, modelo

Mastercycler (Eppendor) 49

Figura 15: Trabalho de foto-documentao para

o registro dos resultados 50

Figura 16: Gel determinando insucesso (1,2) e

sucesso (3-8) de uma extrao de DNA 52

Figura 17: Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18: PCR com primer IVRl. mostrando

a presena ou ausncia de milho 55

ssfto wmm. DE EHE^A NUOEAR/SP-I

XI

Figura 19: Amplificao atravs do primer IVRl ,

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20: PCR com primer IVRl, utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21: Resultado de uma PCR para Bt l76,

no amplificao do controle positivo 57

Figura 22: Identificao de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23: Identificao de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24: Identificao de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25: esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26: Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduo:

A produo de alimentos transgnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares. As culturas de variedades

geneticamente modificadas, autorizadas so inmeras: na Argentina, a soja em 1996,

o milho e o algodo em 1998; no Canad, o milho e o algodo em 1996, a canola em

1997, a soja e o melo em 1998, a batata e o trigo em 1999; nos Estados Unidos, o

melo, a soja, o tomate, o algodo e a batata em 1994, a canola e o milho em 1995;

no Japo, a soja, a canola, a batata e o milho em 1996, o algodo e o tomate em

1997; na Unio Europia, o tomate e a canola em 1995, a soja em 1996, o milho em

1997, a batata e o algodo em 1998. O mundo se encontra na era do supermercado

transgnico, alimentos com os genes modificados chegam mesa dos consumidores,

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno, o arroz com

mais protenas, a batata com retardo de escurecimento, o melo com maior

resistncia a doenas, o milho resistente a pragas, a soja com genes de castanha-do-

par que aumenta o seu valor nutritivo, o tomate longa vida, que foi o primeiro

alimento transgnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conser.ao por mais tempo (GREINER, 1999). O desenvolvimento de novos

produtos transgnicos e o crescimento da biotecnologia na produo de novos

cultivares inevitvel. Para o Brasil, a legislao adotada em relao a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGM's , ser de grande importncia,

influenciando diretamente no futuro da produo agrcola nacional (Folha de So

Paulo, 2004). O ato de proibir os transgnicos impedir o progresso cientfico,

econmico e social do pas (PAVAN, 2005).

A biotecnologia e engenharia gentica como novas tecnologias para a cadeia

produti\a. em particular para as companhias oligoplicas desse mercado, so

propagadas sob o argumento de no agredirem o ambiente e contriburem para a

sade, inclusive por contriburem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI, 2001). Os alimentos geneticamente modificados, bem como a

biotecnologia, sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaes

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias, modificando o

comrcio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenno mimdial.

As maiores discordncias sobre transgnicos ocorrem entre os Estados Unidos, que

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia gentica atravs de

multinacionais (figura I), e a Europa, que. juntamente com a maioria dos pases do

terceiro mundo, temem que as lavouras de OGM's - organismos geneticamente

modificados, tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradies

culturais de suas populaes (HOFFMAN, 1999).

Figura 1: Instalaes de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em So Jos dos Campos - SP.

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeio dos alimentos

transgnicos na Europa; inexistncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana gentica, riscos, mesmo se considerados hipotticos, aspecto cultural,

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental. Uma srie de

riscos dos alimentos transgnicos para a sade est sendo levantada e questionada,

por grupos contrrios aos OGM's, que questionam o aumento das alergias.

resistncia aos antibiticos, aumento das substncias txicas e dos resduos nos

alimentos. Com relao segurana alimentar em prol do bem estar da populao,

necessrio um aprofundamento nas pesquisas, para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sade (SPERS e KASSOUF, 1 9 9 6 ) . Questiona-se a garantia da

segurana e qualidade alimentar nutricional dos produtos, bem como, da soluo da

fome, isto , como chegar a superao do problema alimentar no mundo. A

segurana alimentar pressupe o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos. Alguns grupos, julgam que no est nos alimentos

transgnicos a soluo para a erradicao da fome, bem como do oferecimento de

segurana alimentar para a populao (SILVA, 2000).

Amalmente so muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana, 2004). Entre elas pode-se destacar:

- Milho B t l 7 6 : produzido pela Syngenta (ex-Novartis), geneticamente

alterado de forma a produzir o seu prprio pesticida, tomando-se assim resistente a

alguns insetos.

- Milho B t l l : linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas,

produzido pela empresa Syngenta.. Possui a protena inseticida CrylAb, isolada da

bactria Bacillus thurigiensis subsp. Kustaki cepa H D l ; e a protena herbicida acetil

transferase (PAT), isolada da bactria Streptomyces viridrochromogenes.

- Milho MON810: desenvolvido pela empresa Monsanto, este cultivar possui

resistncia a insetos, atravs da presena da protena inseticida CrylAb.

- Milho T25: linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25, contendo a

protena herbicida PAT e produzido pela empresa Aventis/Bayer.

A identificao destes cultivares geneficamente modificados, pode ser

realizada pela tcnica da PCR - reao em cadeia pela polimerase (ROMANO, 1999).

A inveno desta tcnica deu a Kary Mullius o Nobel de Qumica de 1993. A PCR

um mtodo que permite a amplificao in vitro de segmentos de DNA, utilizando-se

dois iniciadores ("primers") que hibridizam com as fitas opostas, em regies que

flanqueiam o segmento a ser amplificado. Para isso. o DNA desnaturado (92-

96C), os "primers" so hibridizados (30 a 60C) e posteriormente, a sntese de DNA

feita com uma DNA-polimerase e nucleotdes (dNTPs) (72C), por vrios ciclos

repetitivos (IKUNO, 2000).

Quando foi inicialmente concebida, a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanas sucessivas de temperatura requeriam a transferncia manual dos

tubos de reao entre os banhos-maria com temperamras diferentes. Alm disso, a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo, pois a temperatura elevada

para a desnaturao do DNA molde, desnaturava tambm esta enzima. Duas

inovaes fizeram com que a PCR se tomasse to simples, fcil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratrios do mundo todo. A primeira foi a purificao de

uma DNA-polimerase obtida de uma bactria termfila (Thermus aquaticus), que

habita fontes de gua quente. A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo aps

sucessivos ciclos de amplificao. Alm disso, foram desenvolvidos termocicladores

automticos, que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuio de

temperatura, requeridos para a PCR (IKUNO, 2000).

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanos na Biologia

Molecular, principalmente para anlise de genes, diagnstico de doenas e

patgenos, entre outros exemplos. Atualmente a PCR muito ulizada para a

identificao de constituintes transgnicos em alimentos (HIRATA, 1999). Na

deteco de gros de soja geneticamente modificados, a tcnica de PCR mostrou-se

altamente sensvel, ela permite identificar um gro de soja geneticamente

5

cmsm m.xmL [B^A NCLEAR/SP-PEW

modificada dentre um milho de gros normais. O tempo necessrio para a anlise

pela tcnica da PCR. gira em torno de 1,5 dias. Hoje. em muitos casos, a anlise

pelo mtodo da PCR, a nica tcnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gro no transgnico (GACHET. 1999).

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a tcnica PCR

demonstraram a existncia de alimentos contendo gros transgnicos no Brasil. Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor, foram realizadas na Europa pelo fato de no existir ainda no

Brasil laboratrios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificao de

alimentos transgnicos ou produzidos com matria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha S.Paulo, 21/06/2000). Apesar da grande polmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgnica Roundup Ready,

produzida pela multinacional Monsanto, contendo o transgene CP4 EPSPS, ainda

no possumos maiores estudos referentes a gros transgnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA, 2000).

Alm disso a identificao de alimentos originrios de gros transgnicos,

como soja e milho, atravs da tcnica PCR ainda polmica. Sendo que o resultado

do teste somente confivel quando este positivo. Ou seja, a ausncia de deteco

no significa que o produto no contenha, de fato, ingredientes transgnicos

(DICKINSON, 1995). Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequncia de

DNA, preciso que este D N A esteja minimamente preservado. O que muitas vezes

acontece no processo de industrializao, que na manipulao dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e, com isso no ser mais detectvel por tcnicas de

biologa-molecular como a PCR (GREINER, 1998).

Os consumidores tm que saber se o alimento que consomem seguro,

independentemente de como ele produzido ou desenvolvido. Por ser uma

tecnologia recente, ainda no houve tempo para a realizao de um bom nmero de

trabalhos cientficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relao as mais diversas reas do conhecimento humano (CAVALLI, 2001). Faltam,

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial, sua importncia

nutricional, seus possveis impactos ambientais e sua relao com outras tecnologias

utilizadas na indstria alimentcia (BINSFELD, 2000).

A relao do uso de radiao ionizante em alimentos que contem em sua

composio os organismos geneticamente modificados um destes pontos obscuros,

Ainda no existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interao

destas duas tecnologias que so capazes de atuar sobre a constituio do DNA de

produtos alimentcios. O termo radiao refere-se aos processos fsicos de emisso e

propagao de energia, seja por intermdio de fenmenos ondulatorios, seja por

meio de partculas dotadas de energia cintica. A irradiao o processo de

aplicao desta energia a um material, tal como os alimentos, com a finalidade de

esteriliz-los ou preserv-los pela destruio de parasitas, insetos e outras pragas,

reduo da carga microbiana, inibio de brotamento e prolongamento da vida til

(FDA, 1997). O tipo de radiao usada a denominada radiao ionizante, pois ela

produz partculas eletricamente modificadas (ons). O emprego das radiaes

ionizantes gama e feixe de eltrons, na preservao de alimentos est crescendo

mundialmente. A grande diferena entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^ e os eltrons oriundos de um acelerador industrial, o seu poder de penetrao

(DlEHL, 1995). Enquanto os feixes de eltrons atingem poucos centmetros de

profiindidade, a capacidade de penetrao dos raios gama maior (URBAIN , 1986).

Isso faz com que os aceleradores de eltrons (figura 2) s possam ser usados em

produtos com pouca espessura, garantindo assim a adequada irradiao do material.

Figura 2: Foto do acelerador do eltrons Radiation Dynamics, pertencente ao IPEN.

Nem todos os tipos de radiao so apropriados para o processamento de

alimentos, assim sendo a FAO/OIEA/OMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex /Uunentarius, 1983; US.Food. 1986; DiEHL, 1995;

ICGF, 1995). A irradiao dos alimentos constitu importante mtodo capaz de

diminuir as perdas econmicas provenientes da deteriorao e a eliminao de

patgenos, aumentando o nivel de segurana dos alimentos e favorecendo a

aceitao dos produtos exportados pelos pases em desenvolvimento (LOAHARANU,

1994). Nos das atuais, a uradiao de alimentos contribu imensamente no controle

dos perigos microbiolgicos ( A N - H U N G FU et al., 1995). Apesar do alto nivel de

segurana dos produtos alimenticios fornecidos para consumo, os perigos e riscos

microbiolgicos contmuam existmdo, resultando em nmeros expressivos nas

estatsticas de incidncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL, 1995).

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido deteriorao

constituem importante problema que atinge, principalmente, pases em

desenvolvimento. Estuna-se que cerca de 5 0 % dos produtos perecveis como carne,

peixes, frutas e vegetais, sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO , 1998). Grande parte das perdas amda se deve mfestao de

msetos, deteriorao, amadurecimento natural e por alteraes fisiolgicas como o

brotamento de tubrculos, contribuindo, drretamente, para agravar os problemas de

fome e desnutrio da populao, gerando em conseqncia a diminuio da

produtividade e aumentando a predisposio a enfermidades. Na esfera do comrcio

mtemacional, so mterpostas barreiras fitossanitria dificultando a exportao de

alimentos (DiEHL, 1995). Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiao,

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) esto sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas.

Figura 3: Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN.

COItSS,0 EfiE'SA NUCLEAfi/5P-IPEI

o uso de radiao ionizante no processamento de alimentos possvel graas

a existncia de algumas caractersticas relacionadas a molcula de DNA

(DELINCE, 2002). A irradiao em doses incapazes de modificar as caractersticas

naturais dos alimentos e afetar as demais molculas celulares, j so suficientes para

alterar o DNA, provocando sua quebra e destruio (POLLARD, 1966). Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiao so mostrados por diversos

autores, sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

no (VILLAVICENCIO, 2000). Neste trabalho: "ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIAO GAMA E DE ACELERADORES DE ELTRONS NA DETECO

DE GROS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO" foram

estudadas as possveis conseqncias da radiao na molcula de DNA, o que

poderia interferir na deteco de milhos geneticamente modifcados atravs da

tcnica da PCR.

2- Objetivos

Este trabalho teve como principis objetivos:

- Avaliar os efeitos da radiao gama de ^Co e de aceleradores de eltrons na

deteco de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente.

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificao de organismos

geneticamente modificados.

- Avaliar as atuais tcnicas de PCR na identificao de gros geneticamente

modificados e suas possveis falhas a partir de alimentos processados.

11

3 - Reviso da Literatura

3 .1 - Uso e ao dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia, genes que codificam protenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis {Et). Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas, para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro, Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al,

1 9 8 7 ) ; algodoeiro, Gossypium hirsutum (PERLAK et ai, 1990); batata, Solanum

tuberosum (Perlak et a., 1993); e milho. Zea mays (KoziEL et al., 1993 e

ARMSTRONG et al., 1995). O milho geneticamente modificado, resistente a

insetos, foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera), uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos. As

protenas Bt so eficientes, principalmente, no controle de espcies de ordens

Lepidoptera e Coleptera. Em plantas geneticamente modificadas, as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a protena Bt que aUia nas clulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al, 1997). A protena Bt promove a ruptura

osmtica irreversvel das clulas e causa a morte dos insetos, antes que os mesmos

consigam causar danos econmicos cultura (PETRANTONIO et ai, 1993).

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na insero do gene CrylAb em

milho, sendo a protena CrylAb expressa em altas concentraes nos tecidos da

planta. Os autores, em teste de campo, observaram eficincia no controle de

Ostrinia. nubialis, tanto em relao aos consumo de folhas, quanto pernirao do

colmo da planta. Armstrong et al. (1995) avaliando o potencial de vrias linhagens

de milhos geneticamente modificados, no controle de Ostrinia nubialis, (fig.5)

verificaram excelentes resultados quanto resistncia das plantas testadas a esta

praga, levando concluso de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP).

12

Figura 4: A esquerda lagarta e a direita, forma adulta de Spodotera fnigiperda.

Figura 5: Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho.

Figura 6: A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella, a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho.

13

A resistncia de diversos hbridos de milho geneticamente modificado,

contendo a protena CrylAb. s lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al. (1997). Em laboratorio, utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado dieta artificial para avaliar o efeito da protena Bt nos

lepidpteros. Observaram baixa sobrevivncia das duas espcies em dieta com

tecido liofilizado dos hbridos de milhos modificados. Em campo, os hbridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos. Os estudos demonstraram

a ao txica da protena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella. Lunch et al. (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (protena

CrylAb), confirmaram os efeitos adversos da protena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento biolgico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea. Os dados

de campo indicaram adequada proteo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1.

Barry et al. (2000) efetuaram testes de campo, com milhos resistentes, que

expressavam as protenas CrylAb e CrylAc, com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaes de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella. As plantas

resistentes apresentaram significativa reduo de danos nas folhas e nos colmos, em

relao ao milho convencional. Buntin et al. (2001) avaliaram a eficcia dos milhos

MON810 e B t l l , que expressam a protena CrylAb, no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998. Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaes e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas,

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea. Os autores observaram,

no entanto, que apesar de significativa reduo na infestao dos lepidpteros,

lagartas de ambas as espcies se estabeleceram em vrias espigas do milho

modificado, embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano, em relao ao milho convencional. Os autores concluram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas.

No Brasil, Martinelli (2001) avaliou o padro de resistncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4, que expressam protenas Bt, para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea, em condies de campo. De acordo com os

dados obtidos foi possvel obsenar danos em folhas de milho modificado, porm em

nvel reduzido comparativamente ao milho convencional. Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4, sendo que nestes a progresso da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hbridos convencionais. O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteo da planta em relao ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea.

Huang et al. (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifcados, que expressam protenas Bt, no controle de Ostrinia

nubialis em condies de telado. Os autores avaliaram o padro de resistncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a protena Cry-lAc e

MON8I0, B t l l e Bt l76 que expressam a protena CrylAb, no controle deste

crambdeo, utilizando populaes selecionadas em laboratorio para a resistncia

formulao comercial Bt. Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hbridos convencionais. A infestao artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estdios de 8 a 11 folhas, colocando-se 30 lagartas recm-eclodidas no

cartucho das plantas. Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padres de resistncia quanto ao dano nas

folhas e colmo, bem como na sobrevivncia das lagartas. Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padro de resistncia, protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixssima sobrevivncia dos insetos,

inclusive da populao mais resistente.

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficincia

dos milhos MON810, MON802. B t l l e Btl76 (protena OylAb), DBT418

(protena CRylAc) e CHB351 (protena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro, quarto e quinto instares, em diferentes estdios fenolgicos do

milho (WALKER et al., 2000). Infestaes artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estdios fenolgicos

da planta. Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padres de proteo da planta s infestaes e danos da praga. Os milhos MON810,

MON802, B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas, em todos os

instares. O milho CHB351 no apresentou eficincia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura. Os autores concluram que a

expresso da protena ao longo do desenvolvimento fonolgico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga.

Hbridos de milhos doce geneticamente modifcados como milho B t l l

(protena CrylAb), foram testados, em campo, para a avaliao da eficincia no

controle de Ostrinia nubialis, Heliothis zea e Spodotera frugiperda. Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padro de resistncia,

independente do complexo de pragas, densidade da praga e localizao geogrfica

(BURKNESS et al, 2002).

3.2- Deteco de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A deteco de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presena de protenas especficas. As novas protenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por mtodos qumicos ou

imunolgicos quer qualitativa quer quantitativamente. A deteco qumica de

16

protenas transgnicas pode ser realizada utilizando cromatografa gasosa com

deteco por espectrometria de massa (GC-MS). cromatografia lquida de alta

resoluo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH, & WAIBLINGER, 2001).

Os organismos geneticamente modificados tambm podem ser detectados

imunologicamente. Neste caso, as protenas expressas podem ser detectadas nas

matrias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios, Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). No caso do Western Blot a

protena extrada da amostra imobilizada numa membrana. As protenas ligadas

membrana so imersas numa soluo contendo um anticorpo que reconhece a

protena alvo. O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formao de um

composto corado cuja intensidade de cor proporcional quantidade de protena.

Por exemplo, a protena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

tolerncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al, 1999).

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princpio, mas o anticorpo est

ligado ao plstico dos poos das microplacas em vez de se ligar a membranas. Um

mtodo para deteco e quantificao de soja geneticamente modificada, em

alimentos e fraes alimentares, usando materiais de referncia, foi validado atravs

de um ensaio inter-laboratorial, escala europia, coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists, Inc.) para deteco e quantificao de

milho MON8I0 que expressa a protena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt), por um kit ELISA (LiPP et ai, 2000).

Em relao aos testes imunolgicos, alm dos j mencionados, existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes rpidos em tira "strip tests", que j esto sendo

comercializados e que podem ser realizados, por exemplo, no local da colheita do

cereal ou num silo. Estes testes so fceis de utilizar, no so dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decises rpidas (STAVE & DURANDEUA, 2 0 0 0 ;

ILSI/AACC, 2 0 0 2 ) .

Em qualquer dos casos o nvel de expresso das protenas o fator limitante

para a utilizao destes mtodos, mas segundo Stave as protenas transgnicas esto

dentro do limite de deteco dos imunoensaios (STAVE, 1 9 9 9 ) . Nas anlises

baseadas na deteco de protenas h ainda que ter em conta, que uma protena

transgnica pode no ser expressa ou ainda ser expressa em nveis muito baixos

pelas partes da planta que so utilizadas em produtos alimentcios. Alm disso,

algumas seqncias de DNA introduzidas em cultivares no expressam protenas,

como nos casos j descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER, 1 9 9 5 ) .

3.3 - Deteco baseada na presena de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado, todo o DNA

exgeno , em princpio, suscetvel de ser detectado, ou seja: seqncias de

promotores, genes de interesse introduzidos, sinais de terminao e genes

marcadores usados para seleo das plantas modificadas em laboratrio. Na Unio

Europia, apesar da legislao permitir que a deteco seja baseada na presena de

protenas ou DNA, o DNA foi a molcula eleita para a deteco de organismos

geneticamente modificados. A tcnica utilizada nos laboratrios para a deteco do

DNA a PCR (WlTTWER, 2 0 0 1 ) .

A extrao de DNA para anlise de gneros alimentcios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados um ponto crtico para todos os passos

analticos subsequentes, tanto para a deteco qualitativa como para a anlise

quantitativa. Numerosos mtodos de extrao j foram testados. Estes mtodos vo

desde kits de extrao comercializados, a mtodos clssicos com maiores ou

[g

menores alteraes conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a/., 1998). Tendo em conta que a reao da PCR pode ser inibida por substncias

contidas num alimento, como lipdios, cidos graxos, polissacardeos, entre outros, a

escolha de controles de qualidade determinante para se evitarem falsos negativos,

este controle pode ser realizado por amplificao com "primers"' universais para

plastos vegetais ou especficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai, 1991).

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90/220/CEE. Assim a possibilidade de implementao de

um mtodo de rastreio que permita a deteco destas plantas, independentemente da

variedade utilizada muito importante para as autoridades de controle. Em 1997 foi

publicado um mtodo baseado na deteco de duas seqncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgnicas (LlPP et ai, 1999). Estas seqncias contm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do vrus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens. Na Europa, mtodos de deteco qualitativos para rastreio j foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais: dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC, ""Commission of the European Union, Institute for Health and

Consumer Protection", dois sob a coordenao do projeto Europeu DMIF-GEN -

'^Development of methods to indentify foods", e um sob a coordenao

Bundesinstitut fr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinrmedizin -

BgVV(LlPP et al., 2000)..

Devido necessidade de identificar variedades especficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos mtodos que permitem aos

laboratrios de controle realizar reaes da PCR com "primers'" especficos para

diferentes organismos geneticamente modifcados. A anlise qualitativa d uma

indicao sobre a presena de um organismo geneticamente modificado autorizado,

19

mas para responder necessidade de romlagem necessrio um teste quantitativo

subsequente. A rotulagem necessria se for possvel demonstrar, ao nvel do

ingrediente, que est presente mais do que 1% de OGM autorizado (PlETSCH, &

WAIBLINGER, 2001).

Um mtodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) j foi testado para

anlise de alimentos e matrias primas. Este mtodo baseia-se na co-amplifcao,

no mesmo tubo de reao, do DNA padro e do DNA alvo. O DNA padro consiste

num plasmdio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado. Depois da reao da PCR os produtos so separados em

um gel de agarose sendo o DNA padro diferencivel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido. Se os critrios de validao forem atingidos, no ponto de

equivalncia as concentraes do padro interno e do DNA alvo sero iguais. Com

este mtodo no se obtm correlaes lineares entre amostras de concentraes

conhecidas, mas um conjunto de pontos de calibrao com os quais as amostras

desconhecidas so comparadas, da que seja muitas vezes considerado um mtodo

semi-quantitativo (LAUTER, 2000).

Alm de muito trabalhoso este mtodo, baseado na comparao visual ou

instrumental de bandas as quais so por vezes difceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al, 2000). Convencionalmente, a anlise de produtos da PCR um passo separado

que ocorre depois da reao da PCR estar concluda. A eletroforese em gel de

agarose , nesse caso, utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos. A tcnica de anlise dos produtos de PCR durante a amplificao tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time). A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificao utilizando fluorescncia. Se

representando a fluorescncia versus o nmero de ciclos, a acumulao de produtos

de PCR, pode ser visualizada numa curva de crescimento. semelhante a uma curva

de crescimento de urna bactria. Monitorar a fluorescncia durante cada ciclo uma

20

forma muito adequada de quamificar o nmero de cpias obtidas. Muitas cpias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nmero baixo de ciclos, poucas

cpias deslocam a curva para o outro lado. A quantificao do DNA alvo realizada

medindo a fluorescncia na fase linear logartmica. A maioria das aplicaes da

PCR em tempo real, requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA.

Contudo, algumas aplicaes requerem uma maior especificidade, podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescncia para monitorizar a PCR.

Essas sondas podem ser de hidrlise "TaqMan" ou de hibridizao. Foram

publicados recentemente mtodos para quantificao de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER , 2001).

J foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja, sob a

coordenao do projeto JRC, e sob a coordenao do BgVV. Da anlise dos

resultados destes mtodos quantitativos verifica-se que so necessrios mais dados

para desenvolver e validar os mtodos, com nveis elevados de preciso e exatido.

Nesta rea, as dvidas esto ainda nas diferenas existentes, ou no, entre os

diferentes equipamentos disponveis no mercado, nos parmetros de validao,

controle de qualidade analtico para certificao dos mtodos, assim como no tipo de

material de referncia utilizado para realizar as curvas de calibrao (LAUTER,

2000).

3.4 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos est prevista no Cdigo de Defesa do Consumidor

(Lei n 8.078, de 11/09/90 _ an. 6. Ill e art. 8). Trata-se de uma norma para

garantir ao cidado a informao sobre um produto, permitindo-lhe o direito de

21

escolha. Alm disso, ela possibilita a rastfeabilidade, pois em casos de efeitos na

sade humana, os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos.

No Brasil, a fiscalizao sobre a romlagem est a cargo da Vigilncia Sanitria.

Contudo, a deciso e mesmo o contedo e outras caractersticas do rmlo esto no

mbito do Ministrio da Justia. O IDEC est representando os consumidores nesta

rodada de negociaes e fez sugestes para aparecer no rtulo no s a expresso

"produto transgnico", mas tambm a caracterstica e o nome do organismo doador

do gene. esperado ainda que o pas normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A , 1999)

Internacionalmente, existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma verso preliminar a ser discutida na reunio do Codex

Alimentarius. Levando-se em considerao o ocorrido na Conferncia de Partes da

CDB - Conveno sobre Diversidade Biolgica, pode ser que, as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgnicos ou com ingredientes de

OGM, sejam aprovadas em uma das prximas reunies do Codex. As plantas

transgnicas, aprovadas para o cultivo comercial nos EUA, tiveram sua liberao

baseada no princpio da equivalncia substancial. Assim, a soja RR foi considerada

"equivalente" sua antecedente namral, a soja convencional, porque no difere desta

nos aspectos cor, textura, teor de leo, composio e teor de aminocidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioqumica. Desta forma, no foram submetidas

rotulagem pela agncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberao (NODARi & GUERRA , 2003)

Este conceito de equivalncia substancial tem sido alvo de crticas, porque,

entre outras razes a falta de critrios mais rigorosos pode ser til indstria, mas

inaceitvel do ponto de vista do consumidor e da sade pblica (MILLSTONE et ai,

1999). Equivalncia significa dispor de igual valor ou outro atributo, normalmente

expresso em unidades ou parmetros: um grama do produto Y equivale a X energia.

77

Ela se refere sempre quantidade ou algo mensurvel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparvel (MOMMA. 1999). H, portanto, dificuldades prticas no

conceito de equivalncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

tcnicas convencionais de melhoramento gentico, pois a rigor, genomicamente,

elas no so equivalentes nem iguais. S seriam iguais se uma fosse originria da

outra por multiplicao vegetativa ou micropropagao. A construo gentica

inserida na planta contm elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela, proporcionando novos produtos gnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotrpicos substanciais, e no podem, por isso, ser considerados desprezveis

(GACHET , 1999).

Esta estratgia (equivalncia substancial) foi introduzida na dcada passada

para evitar que as indstrias tivessem custos maiores com testes de longa durao,

como ocorreu na rea farmacolgica. Quando se utiliza a equivalncia substancial,

nenhum teste requerido para excluir a presena de toxinas prejudiciais,

carcinognicas e ou mutagnicas. Este princpio equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes biolgicos, toxicolgicos e imunolgicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA & NODARi, 2 0 0 1 ) . O procedimento em si no tem

base cientfica.

Desta forma, o FDA exige apenas testes de curta durao com animais e

testes bioqumicos para avaliar, entre outros, aspectos a alergenicidade. Esta

insuficincia de dados, que no consegue subsidiar cientificamente a anlise da

segurana alimentar, est sendo questionada por vrias organizaes civis

americanas (WILLIAMS, 1 9 9 7 ) .

23

3.5 - O desenvolv imento da irradiao de a l imentos:

O primeiro documento na rea sobre essa tecnologia data de 1905, quando,

no Reino Unido. J. Aplleby e A. J. Banks patentearam-na sob n- 1609. Na rea

alimenticia, o emprego da irradiao ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservao dos alimentos, principalmente cereais e seus produtos, com raios

alfa, beta e gama provenientes de rdio ou outras substncias radioativas. O fato de

seu emprego tomar desnecessrio o uso de substncias qumicas na conservao de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia. Entretanto, as preparaes

com rdio, sugeridas como fonte de radiao, no existiam em quantidade suficiente

para a irradiao comercial de alimentos. Em 1920, quinze anos aps essa primeira

investida, Scwartz. do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry, sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco. Entretanto, persistia o problema de insuficincia de

material para ser usado como fonte na irradiao comercial de alimento (DiEHL,

1990).

Somente nos anos 40, aps a Segunda Guerra Mundial, essas fontes

tomaram-se viveis, sendo possvel reduzir os custos do processo. Mas a idia de se

utilizar a radiao para o tratamento de alimentos j no era nova. J em 1930, na

Frana, Wrst patenteou uma inveno assim descrita por ele: "Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metlicas so submetidos ao de raios X (alta

voltagem) para destmir bactrias". Entretanto, a patente nunca foi colocada em

prtica, provavelmente devido indisponibilidade de grandes fontes de radiao que

viabilizassem comercialmente o processo. Em 1947, o interesse pelo assunto voltou

tona graas uma publicao sobre o tema de Brasch e Huber (1947), co-

inventores de um acelerador de eltrons pulsante, o Capacitron. Para eles. as cames

e outros produtos alimentcios, poderiam ser esterilizados por pulsos de eltrons de

alta energia, enquanto em outros produtos, como leite e seus derivados, o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso. J nessa poca

foi sugerida a retirada do oxignio da embalagem para minimizar o problema. Esses

pesquisadores foram mais alm ao considerarem o parmetro custo - benefcio: "a

irradiao no elevar o preo fnal do produto" (BRASCH e HUBER, 1947).

Enquanto isso. outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT). Estas pesquisas serviram como base

para a reviso sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951), que concluram

que a irradiao com neutrons produz radioatividade no alimento. O uso de raios

ultravioleta (UV) e partculas alfa foi descartado, devido ao baixo poder de

penetrao e os raios X, em conseqncia da baixa efcincia das mquinas

geradoras. Portanto, sobraram apenas os aceleradores de eltrons, ento

denominados raios catdicos. Os raios gama de istopos radioativos no chegaram a

ser mencionados, provavelmente porque no havia istopos adequados, como ^^Co e

''^Cs, em quantidade comercial. Foi nessa poca que, nos Estados Unidos, o

Programa "Atomns for Peace" sob a coordenao da United States Atomic Energy

Commission (USAEC), atual Atomic Energy Department, fnanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas. Primeiramente, esses raios

eram fornecidos por combustvel exaurido de reatores nucleares. Mas, por

problemas relacionados com a dosimetra, as instituies acadmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^Co. Entre elas, na dcada de 50, podem ser citados o MIT,

University of California, Davis, University of Washington, Seattle, e, mais

recentemente nos anos 60, a University of Florida, Gainesville (DiEHL, 1990).

No Reino Unido, j no incio da dcada de 50, pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos, e outros

pases que tambm comearam a estudar o tema. Neste perodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment.

25

Concomitantemente, programas de mbito nacional sobre a irradiao de alimentos

estavam em andamento na Blgica, Canad, Frana e Holanda. O primeiro relato do

uso comercial da irradiao de alimentos data de 1957. Na antiga Repblica Federal

da Alemanha, o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higinica de especiarias, com o emprego de um gerador de eltrons Van der Graaf.

No entanto, uma nova legislao proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia. Em 1960, no Canad, a irradiao de batatas foi permitida para impedir a

germinao. Utilizava-se uma fonte de ^Co, desenhada para processar

aproximadamente 15.000 toneladas/ms. A fbrica funcionou durante uma safra,

fechando por motivos econmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ, 1983).

Em 1966, do esforo e dedicao de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de So Paulo, surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura, uma instituio pioneira na Amrica Latina. Ainda

em 1966, realizou-se em Karlsruhe, Alemanha, o Primeiro Simpsio Internacional

sobre Irradiao de Alimentos, organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA), no qual representantes de 28 pases revisaram as pesquisas

realizadas. Porm, mesmo nos pases com pesquisas mais avanadas, as autoridades

responsveis pela sade pblica ainda hesitavam na liberao da comercializao

dos alimentos irradiados. Nessa poca, apesar de Canad, Estados Unidos e a antiga

Unio Sovitica terem liberado cinco produtos alimentcios tratados com radiao,

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH, 1966).

No Brasil, a irradiao de alimentos comea a se intensificar durante a

dcada de 70. Em 1974, o Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaes um acelerador de eltrons de 1,5 MeV para

aplicaes industriais. E em 1975 cria-se um convnio com a Universidade de So

Paulo, para implantao de cursos de ps-graduao no instituto. Com o passar dos

anos, o CENA cresce e desenvolve divises cientficas voltadas a irradiao de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN, 2004; CENA, 2004). As dcadas de 70 e 80

foram dedicadas s pesquisas toxicolgicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados, uma vez que esse era o aspecto mais questionado. Os projetos

foram desenvolvidos em 24 pases sob a coordenao de um Comit formado pela

International Atomic Energv' Agency (lAEA/Viena), Food Agriculture Organization

(FAO/Roma) e Organization for Economic Cooperation (OEC/Paris) e teve como

rgo consultivo a Organizao Mundial da Sade (OMS). Aps intensivos estudos,

que envolveram, alm de testes qumicos, experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados, o Comit concluiu, em novembro de 1980, "que a

exposio de qualquer produto alimentcio a doses de at 10 kG> no apresenta

perigo toxicolgico; portanto, testes toxicolgicos com alimentos assim tratados no

so mais necessrios" (WHO, 1981).

Nos Estados Unidos, esse processo considerado um aditivo alimentcio, o

seu uso em qualquer produto s aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) aps exaustivos estudos quanto a segurana radiolgica, toxicolgica e

microbiolgica, alm dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino, 1995).

Atualmente, o FDA j considera aprovada a irradiao de condimentos e especiarias

secas, de came suna para controle de Trichinella trichinae, de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e, em aves, para eliminar bactrias,

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO, 1995; DERR, 1996).

Desde a aprovao, em 1980. pelo Comit formado pela FAO/IAEA/OMS, o

nmero de pases com regulamentao sobre o emprego desse processo tem

aumentado e, dos mais de 40 que j o aprovaram, 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA. 2001).

Um impulso foi dado ao emprego da irradiao de alimentos na dcada de 90,

nos Estados Unidos, devido a surtos de doenas transmitidas por alimentos - DTAs,

causados por Escherichia coli 0157:H7, considerados desastrosos para a indstria

de came. Com a aprovao da irradiao de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999, o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA,

1997; USDA, 1999). J em 1996, foi solicitado junto ao FDA. a regulamentao do

uso em ovos e fmtos do mar, principalmente ostras (DERR. 1996), mas ainda no

aprovada.

No Brasil, a primeira legislao sobre o emprego da radiao ionizante como

processo de conservao foi estabelecida atravs de Decreto-Lei nmero 72.718, de

29 de agosto de 1973. As portarias nmero 9, de maro de 1985 e nmero 30, de 25

de setembro de 1989, aprovadas posteriormente pela Diviso de Vigilncia Sanitria

de Alimentos, foram revogadas pela Resoluo RDC nmero 21, de 26 de janeiro de

2001, da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA, 2001).

Essa legislao considerada a mais avanada na rea, intemacionalmente.

Tendo como base as concluses a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAO/IAEA/WHO (WHO, 2001), a legislao brasileira aprova o uso da radiao em

qualquer alimento com qualquer dose, desde que sejam observadas as seguintes

condies:

a- A dose mnima absorvida deve ser suficiente para alcanar a finalidade

pretendida

b- A dose mnima absorvida deve ser inferior quela que comprometa as

propriedades funcionais e/ou atributos sensoriais dos alimentos.

c- A embalagem deve ter condies higinicas aceitveis para o processo de

irradiao e

d- O rtulo do produto deve conter os dizeres "Alimento Tratado por

Radiao".

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsveis em

irradiar produtos em escala industrial, a EMBR.\RAD - Empresa Brasileira de

Radiaes e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizao, que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia. Localizada em Cotia, a EMBRARAD tem atualmente 50

mcionnos e cerca de 400 clientes no Pais. Desse nmero, 58% da receita gerada

na irradiao de material mdico-cirrgico, 12% de fitoterpico e ervas e 10% de

cosmtico. Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 4,8 milhes, o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada de 1980, ano de sua inaugurao. J a

CBE foi fundada em 1999 e detm tecnologia 100% nacional. Localizada em Jarmu,

mterior paulista, a empresa tem 40 funcionrios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN, 2005). Em 2004, o Centro de Tecnologia das Radiaes -

CTR do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN, inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7). O equipamento do IPEN

com tecnologia 100% nacional, tambm utiliza como fonte o ''"Co, entretanto possui

dimenses menores sendo considerado um equipamento multipropsito de carter

semi-mdustnal (RELA ei al, 2005).

Figura 7: Irradiador semi-industrial multipropsito do Centro de Tecnologia das

Radiaes -CTR do IPEN/CNEN em So Paulo.

29

3.6 - Uso da irradiao de aumentos

Ficou estabelecido, em um dos relatrios do Comit Conjunto de Peritos da

FAO/WHO (Organizao Mundial da Sade) que "... a proliferao de doenas

provocadas por alimentos contaminados talvez o problema de sade mais

difundido no mundo contemporneo e uma importante causa de produtividade

econmica baixa". Alm disso, um grande nmero de alimentos tais como came

bovina e de peixe, frutos do mar, pemas de r e especiarias so freqentemente

rejeitados por pases importadores, sob alegao de qualidade higinica deficiente,

incluindo contaminao com microorganismos patognicos. A magnitude da perda

econmica, devida a doenas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patognicos e sua rejeio, pode ser grande e muito embaraosa para o

comrcio intemacional (lAEA, 1 9 8 6 ) .

Uma das mais recentes solues para este problema o tratamento com

radiaes ionizantes. A exposio dos alimentos radiao, dependendo do produto

e da dose empregada, inibe o brotamento, retarda o amadurecimento e destri ou

reduz para nveis aceitveis, bactrias, parasitas, fungos, vms e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenas. O processo rpido e seguro. Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislao no aumenta a temperamra

no deixa resduos txicos, no altera significativamente o aspecto, o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos, deixando-os o mais perto possvel do seu estado

natural. Os custos tambm so comparveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN, 1 9 8 6 ; VILLAVICENCIO et ai, 2 0 0 0 ) .

Em doses e condies adequadas da radiao, quase todos os alimentos

podem ser irradiados, desde gros at aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes, frutas e verduras frescas. Aps a irradiao, os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados, sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestao (AQUINO, 2003).

O tratamento com radiaes ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado s tcnicas j existentes, tais como secagem, fermentao, tratamento

qumico, tratamento pelo calor, conservao a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI & JESUS, 1994.). Uma grande vantagem do processo de

irradiao que ele permite a diminuio do uso de produtos qumicos, usados como

conservantes e antibiticos, em alimentos. Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes, que levam para a industria

qumica mais de 20 milhes de dlares/ano. Essas substncias provocam anualmente

500 mil intoxicaes e matam cerca de 15 mil pessoas nos pases do terceiro mundo,

alm de provocar crises alrgicas, destruir a camada de oznio e possuir, em alguns

casos, propriedades cancergenas (lAEA, 2001).

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaes ionizantes

em alimentos, a Comisso de Especialistas em Irradiao de Alimentos da

FAO/IAEAAVHO (lAEA - Agncia Internacional de Energia Atmica) definiu os

tipos de radiao e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos: raios

gama dos radionucldeos ' Co ou '^^Cs com energias mdias de l,25MeV e

0,66MeV, respectivamente; raios-X com energia mxima de 5MeV e feixe de

eltrons com energia mxima de lOMeV. Estes valores de energias esto muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensurvel em qualquer material,

incluindo os alimentos. Para cada tipo de alimento, e de tratamento, definida uma

dose mdia ou mxima, apropriada de radiao (Villavicencio, 1998). As radiaes

gama, de grande penetrabilidade, so utilizadas na irradiao de produtos de grande

espessura. Os eltrons que possuem pequena penetrao (apenas alguns milmetros)

so usados para a irradiao superficial de alimentos ou para produtos a granel, de

31

3.7- Aplicao das irradiaes em gros

Tendo em vista os elevados danos causados aos gros e produtos

armazenados pelos insetos, toma-se necessrio por em prtica meios de controle, a

fim de se evitar os prejuzos. Um dos mtodos mais utilizados a aplicao de

produtos qumicos, que apresenta vrios inconvenientes, entre eles a possibilidade

de causar intoxicao ao consumidor por deixar resduos nos alimentos tratados. Por

ser um mtodo livre de resduos para o controle de pragas, o tratamento com

radiao um substituto vivel fumigao para satisfazer os regulamentos

quarentenrios de vrios pases (DUARTE e ARTHUR, 1994).

O principal interesse na irradiao de gros e derivados o de controlar a

infestao. Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade, constituindo um fator de rejeio pelos consumidores. A prpria

atividade metablica dos insetos auxilia na formao de substratos adequados

contaminao com microorganismos, o que acarreta mais perdas e reduo no valor

nutritivo dos alimentos. O termo usado para designar a irradiao de alimentos para

controlar insetos desinfestao por irradiao (BRIGDE. 2002).

fina espessura. Irradiadores com fontes de ^"Co so os mais utilizados, atualmente,

para o processamento de alimentos (lAEA, 2001).

Cabe obser\'ar que a legislao intemacional afirma que a irradiao deve ser

usada em alimentos de boa qualidade, visando reduzir a deteriorao posterior dos

produtos e controlar a infestao e a contaminao por microorganismos mas, nem a

irradiao, nem outros mtodos, podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO, 1 9 9 8 ) .

32

Para que a desinfestao por irradiao possa pro\ocar completa letalidade

dos insetos, num perodo de 24 horas, como possvel atravs do uso de pesticidas

tradicionais, doses de 3 a 5 kGy seriam necessrias. Entretanto, este nvel de dose

produz alteraes na cor, aroma e sabor e provoca modificaes nos seus nutrientes.

Farinha de milho, por exemplo, quando utilizadas para a fabricao alimentos,

devem possuir certas caractersticas reolgicas mnimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita, que dependem muitas vezes de componentes

especficos do amido e das protenas. Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e no devem, portanto, ser usadas em alguns gros e seus derivados

(URBAIN, 1 9 8 6 . ) . Alm da farinha, outras partes isoladas dos gros, como farelo e

grmen, tambm tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO, 2003).

O maior problema na desinfestao de commodities (como milho ou trigo) o

grande nmero de espcies de insetos que podem estar presentes. Assim, no

tratamento por irradiao, deve-se escolher a dose mais baixa possvel, por motivos

econmicos e para no alterar a qualidade dos produtos. Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espcie mais resistente (VILLAVICENCIO,

1 9 9 8 ) .

Foi estabelecido que, para desinfestar gros e derivados sem causar efeitos

indesejveis aos alimentos, uma dose de irradiao entre 0,2 a l,OkGy deve ser

utilizada, dependendo da contaminao inicial, composio qumica e umidade,

espcie, sexo e estgio de vida do inseto, temperatura, tipo de radiao e, mesmo,

taxa de dose. O emprego dessas doses no necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA, 2004.).

A radiossensibilidade de 30 espcies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratrio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos, California, usando tcnicas e critrios semelhantes de avaliao. Em gros o

uso de baixas doses de irradiao para a desinfestao de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos qumicos, muitos dos quais produzem danos toxicolgicos (KiLCAST,

1994). O aumento da vida de prateleira, inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas, assim como o incremento das propriedades tecnolgicas, uma

constante nessa metodologia (AHMED , 1993). Alm disso, a irradiao uma

tcnica que pode ser usada como tratamento quarentenrio, sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes qumicos utilizados para

desinfestao de insetos (KFERSTEIN, 1993). A fumigao com fosfma, usada para

a desinfestao de insetos em uma grande variedade de gros armazenados e que

possui ao lenta, uma das tcnicas que podem ser substitudas pelo uso da

irradiao (SPALDING, 1977; POTENZA, 2004).

Em combinao com outros processos, como, por exemplo, baixa atividade

de gua, atmosfera modificada e embalagens; o uso da irradiao pode oferecer

produtos mais estveis em condies tropicais (lAEA TECDOC - 871, 1996).

Processos tecnolgicos altemati\os de conservao destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiao e outros processos, minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados. Estando os gros apropriadamente embalados, aps seguir uma boa

qualidade de processamento, o tratamento por radiao ir preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizao, e desinfestao de insetos, conforme o

caso requerido. Numa irradiao, onde no houver uma correta embalagem do

produto, haver uma reincidncia de infestao e o processo se tomar intil

(DiEHL, 1995).

3 4

3.8 - Perdas na armazenagem de gros

As perdas de gros ocasionadas por pragas em armazns, presena de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares, deteriorao da massa de gros,

germinao, contaminao fngica, presena de micotoxinas, efeitos na sade

humana e animal, dificuldades para exportao de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco; so alguns dos problemas que a m

armazenagem de gros produz na sociedade brasileira. As perdas quantitativas,

mdias brasileiras de gros, estimadas pela FAO e pelo Ministrio da Agriculmra,

Pecuria e Abastecimento (MAPA), so de aproximadamente 10% do total

produzido a cada ano (Quadro 1). Isto representa cerca de 9,8 milhes de tonelada

por ano (LORINl, 2004).

Quadro 1 - Perdas por pragas em gros armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gro Produo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41.536.000 4.154.000 465 milhes

Soja 37.216.000 3.722.000 587 milhes

Arroz 10.366.000 1.037.000 216 milhes

Trigo 2.967.000 296.000 44 milhes

Feijo 2.591.000 259.000 109 milhes

Cevada 338.000 33.000 5,8 milhes

Outros 3.103.300 310.000 -

Total* 98.117.000 9.811.000 1.426.8 milhes

Safra 2000/2001 - Fonte : Lorini 2004

35

Alm dessas, existem as perdas qualitativas, que so de maior importncia,

uma vez que comprometem o uso de todo o gro produzido, ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado. No caso de trigo, os moinhos no aceitam lotes

de trigo com insetos, pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha, j

que esta ter fragmentos de insetos indesej\eis na indstria de panificao e em

outros subprodutos de trigo. Essas so as razes principais do porque se deve fazer o

"manejo integrado de pragas na unidade armazenadora", pois isso permite zerar as

pragas nos gros armazenados. Para o sucesso do manejo integrado, exige-se a

realizao de vrios procedimentos como: mudana de comportamento dos

armazenadores, conhecimento da unidade armazenadora de gros, medidas de

limpeza e higienizao da unidade armazenadora, correta identificao de pragas,

conhecimento da resistncia de pragas aos inseticidas qumicos, potencial de

destruio de cada espcie-praga, proteo do gro com inseticidas, tratamento

curativo, monitoramento da massa de gros e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI, 2 0 0 4 ) .

Dentre todos estes procedimentos \oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gros, existe tambm a possibilidade de uso da radiao

ionizante. Sendo que esta tcnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questo da contaminao de gros (AQUINO, 2 0 0 3 ) .

No aspecto financeiro a utilizao da radiao toma-se economicamente

vivel, tanto no que se refere ao custo da operao quanto durabilidade de

produtos perecveis, pois aumenta vida til de gros armazenados, dando ao

produtor a opo de comercializ-los aps o perodo de pico da safra, conseguindo,

assim, preos melhores ( I C G F I , 1 9 9 9 ; RELA et al, 2 0 0 5 ) .

Quanto contaminao de gros armazenados, causada por produtos

qumicos utilizados nas lavouras e nas indstrias, seja para o manejo de pragas ou

controle biolgico de vegetais a irradiao surge como altemativa aos amais

file:///oltados

3 6

mtodos. A irradiao isenta de resduos, no altera as qualidades organolpticas

do produto e no afeta sua aparncia tomando-se um mtodo seguro (WHO, 1999)

3.9 - Importncia econmica da produo de mi lho

A produo mundial de milho compete com a de trigo pelo tmlo de gro

mais produzido no mundo. Esse fato, relativamente recente, deve-se ao forte

crescimento da demanda mundial. Nas safras de 92/93 e 93/94 o consumo estava na

faixa de 510 milhes de toneladas/ano; j para a safra 96/97, o USDA indicou o

consumo de 550 milhes de toneladas, um salto de 7,8% em apenas trs anos (Atlas

Scio-Econmico, 2005)

A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e,

portanto, de padro de consumo (maior consumo de protenas) dos pases asiticos,

em especial dos Tigres e da China. A taxa de crescimento do consumo mundial foi

de 2,3% ao ano nos ltimos dez anos. Nos Estados Unidos essa taxa foi de 3,1%,

enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 4,5%), puxado principalmente

por cames de frango e sunos, grandes consumidores de milho na sua produo. A

demanda mundial s no foi maior nesse perodo porque a ex-Unio Sovitica est

consumindo hoje quase dez vezes menos que a mdia de consumo da dcada de 80,

passando de 30 milhes de toneladas para pouco menos de 4 milhes em 1995

(PESSOA , 2004).

A produo mundial, apesar de crescente, no est conseguindo acompanhar

o ritmo de crescimento do consumo, em parte devido irregularidade nas ltimas

safras dos Estados Unidos, maior produtor mundial, respondendo por metade do

milho anualmente produzido. Em 2004 a produo mundial de milho chegou

cerca de 705 milhes de toneladas (Atlas Scio-Econmico, 2005).

37

Consumo

Humano

3 %

Autoconsumo

2 5 %

Avicultura

2 5 %

Sementes

38

mil toneladas

Paran Rio (kande Minas Gs^ais So Paulo Santa do Sul Catarina

Gois

IS;>7oduo n&B 199 a 2000 Mpoduo mdia2001 a 2003

Fonte: IBGE - Produo Agr co la Munic ipa l

Figura 9: Produo mdia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a

2000 e 2001 a 2003

A cultura do milho est se transformando em lavoura de ponta, com vrias

regies produtoras alcanando produtividade altssima e com expanso de rea em

regies que podem ser intensivamente mecanizveis, como o Cerrado. O uso

crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do

aumento de produo (EMBRAPA, 2005).

Vale ressaltar que a cultura do milho, ao contrrio da soja, amda conta com

grandes possibilidades de aumento de produo va crescimento de produtividade.

Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistncia, o milho tem uma

produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio

realizado em pequenas propriedades, com baixo uso de tecnologia, em especial no

Sul e no Nordeste (IBGE, 2005).

39

Seguindo os passos da soja, o milho do Centro-oeste vem crescendo de

importncia no cenrio nacional, mas padece dos mesmos males oriundos do custo

Brasil. Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportao devido aos

elevados custos de transporte at os portos, o milho dessa regio enfrenta custos

proporcionalmente mais elevados para chegar at as grandes indstrias de aves e

sunos concentradas na regio Sul. Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 250,00

a de milho custa apenas US$ 100,00 (Atlas Scio-Econmico, 2005).

A tendncia que os grandes consumidores orientem seus investimentos

futuros para as regies onde h excedente de gros. A prtica de adicionar valor ao

produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada

transportada at os grandes centros consumidores. Os melhoramentos em logstica

tomam-se fundamentais para o xito de tais investimentos (VIEIRA, 2004).

A eliminao da incidncia de ICMS sobre as exportaes de gros e a

regulamentao da quebra do monoplio nacional na navegao de cabotagem

podem trazer grande impulso produo de milho, em especial na regio Sul. A

exportao pode, em mdio prazo, se constituir numa nova opo, tendo em vista a

expectativa de dficit crescente de produo em nvel mundial. As atuais

importaes nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos, que ocorrem em boa

medida devido aos elevados custos do transporte martimo interno, podem ser

substitudas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados, 2005).

Assume-se, para traar um cenrio para a produo brasileira de milho, que o

custo Brasil sofrer considervel reduo nos prximos anos; que os investimentos

previstos pelas grandes integraes do Sul com a regio Centro-oeste sejam

efetivados e que a produtividade seguir crescendo no perodo. Com isso pode-se

esperar que o milho seja, ao lado da soja, um grande impulsionador do crescimento

da produo brasileira de gros nos prximos anos, com uma colheita de mais de 45

milhes de toneladas ao ano (IBGE, 2005).

40

4 - Materiais e Mtodos:

4.1 - Amostras: As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados

no experimento, foram adquiridas no comrcio local e em diferentes pontos de

distribuio. Foram utilizadas trinta amostras diferentes, listadas a seguir:

1- Nutriton - Mococa - Lote 005/002, produzido em 15/02/04.

2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H, validade 22/04/05.

3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B, produzido em 04/08/2004.

4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido at 15/04/05.

5- Bolo de Milho - Dr. Oetker - Lote 056, validade agosto de 2005.

6- Mistura para bolo (fub) - Dona Benta - Lote 1 3 1 , validade 13/08/05.

7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips

8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido at 21/05/2005.

9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 17/11/04.

10- Flocos de Milho - Me Terra - Lote fabricado em 13/08/2004.

11- Com Flakes - Kellogg's - Lote produzido em 00:59 de 09/10/04.

12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004.

13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido at 03/04/05.

14- Kimilho Floco - Yoki - Lote 28J04T, validade 28/07/05.

15- Kimilho (pr-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido at 06/07/05.

16- Milharina (pr-cozida) - Quaker - Lote com validade at julho de 2005.

17- Milanesa - Kodilar - Lote 09, validade fevereiro de 2005.

18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi08:46JB.

19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09.

20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4.

21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4.

22- Fajita - Lote L58223 AI valido at 21/05/2005.

23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho

41

24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo

25- Milho Cusco (Pem) - Cinza

26- Milho Nacional Granel (comercial)

27- Pipoca Mxico - La Merced - Lote HC3.

28- Pipoca USA - Lote 2162426401.

29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q, vlido at 01/10/05.

30- Milho enlatado, em conserva - CompreBem - Lote: L20DT09:13*M1*

1 'i^ 1^

1^

Figura 10: Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento.

4.2 - Irradiao das amostras: Foi realizada, em temperatura ambiente

(25C) sob condies aerbicas, no Centro de Tecnologa das Radiaes (CTR) do

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (IPEN) em fonte de ' ' 'Co,

Gammacell 220 (A.E.C.Ltda) nas doses de 1; 25 e 50 kGy com taxa de dose de 4,15

kGy/h e acelerador de eltrons (Radiation Dynamics Lnc. USA, 1.5MeV-25mA),

tambm com doses de 1, 25 e 50 kGy. Tais equipamentos foram calibrados

42

Figura 11: Amostras devidamente embaladas para irradiao na Gammacell.

Para a irradiao na Gammacell, as amostras foram acondicionadas em

microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes, de acordo com a dose a ser

recebida (figura 11 ).

Figura 12: Amostras nas embalagens para irradiao no acelerador de eltrons.

utilizando-se o sistema dosimtrico de Fricke, sendo o experimento acompanhado

por dosmetros Harwell mbar 3042, utilizados para garantia e controle de dose das

amostras.

43

Para a irradiao do material, no acelerador de eltrons, pequenas quantidades

de cada amostra, cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plsticos

devidamente lacrados. Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiao

no acelerador de eltrons, podendo ser manipulado deitado, o que proporcionava

uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12).

4.3 - Controles positivos: Os controles positivos para B t l l , Btl76 e

MON810 foram fornecidos atravs de uma cooperao intemacional do IPEN com o

Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition, de

Karlsmhe, na Alemanha. Estes materiais eram constituintes de kits comerciais,

existentes na Europa, para a deteco de milhos geneticamente modificados.

4.4 - Adequao das amostras: A metodologia utilizada para a extrao do

DNA estava adaptada para amostras secas na forma de p, geralmente farelo ou

farinha oriunda de sementes modas. Para que esta metodologia pudesse ser

realizada sem prejuzo em uma maior variedade de alimentos, foram desenvolvidas

tcnicas de adequao com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas

neste experimento na forma de p. Neste caso foram utilizados um moedor eltrico

para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem. Em alguns casos a

adequao das amostras tambm envolvia um processo de homogeneizao, pois na

maioria das vezes, a presena de milho na amostra estava concentrada em alguma

poro do alimento, o que aumentava as chances de identificao do material

geneticamente modificado.

4.5 - Extrao do DNA das amostras: Na extrao do DNA das amostras,

foi utilizada uma tcnica "in house" baseada na ufilizao de trs (1. 2 e 3) tampes

44

de lavagem e extrao. Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampes foram

utilizados os seguintes protocolos:

Tampo 1:

100 mM Tris 0,60 g

20mMNa2-EDTA 0,37 g

1.4MNaCl 4,1 g

20g / lCTAB I g

pH 8.0

Tampo 2:

40 mM NaCl (Mr=58,44 g/mol) 0,11688 g

5 g/1 CTAB 0,25 g

pH 8.0

Tampo 3:

1.2 M NaCl (Mr-58,44 g/mol) 3,509 g

pH 8.0

Os tampes aps seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra

ambiente, a fim de serem utilizados no protocolo a seguir:

Para cada extrao de DNA, 200 mg da amostra seca na forma de p, foram

transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi, contendo lOOOp,! do tampo 1. Os

tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex. Aps sua homogenizao

este material foi incubado a 65 C em sistema de banho-maria com agitao leve. Aps

trinta minutos de incubao, os tubos foram centriigados por 10 minutos a lO.OOOG e

25C. Com este procedimento as partculas slidas das amostras depositaram-se no

4 5

fundo dos tubos. Com auxlio da pipeta, 500 pL do sobrenadante foram retirados e

colocados em novos tubos de 2 mi.

Ao sobrenadante nos novos tubos, foram adicionados 200pL de clorofrmio

hidrofbico. Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois

centrifugadas por 10 min a lO.OOOG e 25C. Deste centrifugado foram transferidos

para novos tubos de 2ml a fase superior (gua) com um volume equivalente a 300

pL. Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL

(equivalente a dois volumes) do tampo nmero dois. Depois de homogenizados,

este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25C

(temperatura ambiente).

Concluda a incubao, os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a

lO.OOOG a 25C o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma nica vez

sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante, mantendo-se o DNA

acumulado no fundo dos tubos. Aps este descarte, os tubos seguiam invertidos

(ponta-cabea) para um processo de secagem em estufa a at 45C. Secos, os tubos

recebiam 350pL do tampo trs e eram levemente agitados para dissoluo do DNA.

Logo aps foram adicionados 350pL de clorofrmio (figura 13), misturado com

cuidado por aproximadamente 30 segundos. Mais uma vez o material era

centrifugado por 10 minutos a lO.OOOG e sua fase superior (aquosa), 250pL

transferida a novos tubos, agora cnicos de 1,5ml.

46

Figura 13: Laboratrio destinado ao processo de extrao de DNA.

Aos tubos cnicos foram adicionados 150pL (0,6 volumes) de iso