Estudar as moléculas de DNA e Estudar as moléculas de DNA e RNARNA

Características físicas e químicas dos ácidos nucleicos, importantes para o

seu estudo

Estabilidade da molécula de DNAEstabilidade da molécula de DNA

• Pontes de hidrogénio (entre as cadeias)

• Forças de Van der Walls (entre as bases empilhadas)

Emparelhamento de bases , devido àcomplementaridade entre as bases

tem um papel importante nasTécnicas de hibridação

(manipulação dos ácidos nucleicos)

Medição da concentração da dos ácidos Medição da concentração da dos ácidos nucleicosnucleicos em soluçãoem solução

As propriedades de absorção da luz podem ser usadas para:

- detecção- quantificação- teste de pureza

Medição da concentração da dos ácidos Medição da concentração da dos ácidos nucleicosnucleicos em soluçãoem solução

Bases aromáticas absorvem UV a 260 nm (cdo máximo). P u>Py

As bases aromáticas são menos acessíveis à luz UVquando em DNAds

RNA absorve mais luzlogo

o valor de absorção para uma dada e mesma concentração

de DNA e RNA, é maior para o RNA

DO260 (DNA)= 1 50µµµµg/ml

DO260 (RNA)= 1 40µµµµg/ml

Nucleic acids purity

- Pure dsDNA has A260/A280 = 1,8

> 1,8 RNA contamination

<1,8 Protein contamination

- Pure RNA has A260/A280 = 2

Denaturation Renaturation

RenaturaçãoRenaturação da molécula de DNAda molécula de DNA

Desnaturação dos ácidos Desnaturação dos ácidos nucleicosnucleicosTmTm-- temperatura de fusãotemperatura de fusão

Tm (melting temperature)- temperatura à qual metade da sequência de bases de determinada molécula de DNA, está desnaturada. Melting point ou temperatura de fusão dos ácidos nucleicos

% G/C em diferentes organismos% G/C em diferentes organismos

Factores que afectam a Factores que afectam a desnaturação/desnaturação/ renaturaçãorenaturação da dupla héliceda dupla hélice

• % G/C

• Sequência do DNA (DNA repetitivo)• % incompatibilidade de pb

• Dimensão da molécula• Concentração do DNA

• Força iónica (Na+, neutraliza P-; logo quando a concentração salina é mais baixa, a dupla hélice fica mais instável, logo maior a restringência quando se realizam hibridações)

• Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc)

Alguns agentes de desnaturação dos ácidos Alguns agentes de desnaturação dos ácidos nucleicosnucleicos

• Temperatura (calor)- altera o estado tautomérico das bases, ionizando-as e rompendo ligações por pontes de H

• Soluções alcalinas (NaOH)• Formamida• Ureia

Agentes químicosque destabilizampontes de H

Bases:-Alteram estado tautomérico das bases, rompendo asinteracções por ponte de H, desnaturandodesnaturando a dupla hélice, ou estruturas secundárias dos ácidos nucleicos

Ácidos:--HidrolizamHidrolizam os ácidos nucleicos nos seus componentes: bases, açúcares e fosfatos. Soluções ácidas moderadas, clivam ligações clivam ligações glicosídicasglicosídicas, gerando locais apurínicos

Sais:- Estabilizam os grupos fosfato com carga negativa

Acção de ácidos, bases e sais sobre a Acção de ácidos, bases e sais sobre a molécula dos DNAmolécula dos DNA

iminoamino

keto enol

(tautomeric forms)

keto enol

amino imino

-NH2 =NH

C-OHC=O

Isolar DNAIsolar DNA(ex.)(ex.)

O álcool exclui as moléculas de água do DNA, precip itando-o

Grande variedade de técnicas consoante o tipo de estrutura que envolve o DNA: vírus, célula bacteriana, fungos e leveduras, células de eucariotas superiores (plantas e animais).

Exemplo de um método de separação e purificação das Exemplo de um método de separação e purificação das diferentes conformações da molécula de DNAdiferentes conformações da molécula de DNA

Linear and nickedcircular DNA

Covalently closedcircular DNA

RNA

Protein andmembrane

EthidiumEthidium bromidebromide allowsallows DNA DNA visualizationvisualization ononagaroseagarose gelsgels

Visualização do DNAVisualização do DNA

Restrição do DNAElectroforese em gel de agarose

DNA DNA restrictionrestriction

CÁTODOpólo ou eléctrodo negativo para onde se dirigem os catiões (iões de carga positiva )

ÂnodoPólo ou eléctrodo positivo para onde sedirigem os aniões (iões de carga negativa )

ElectroforeseElectroforese em gel de em gel de agaroseagarose

RestrictionRestriction ofof a DNA a DNA fragmentfragment andand migrationmigrationonon agaroseagarose gel gel ofof resultingresulting productsproducts

Marcadores de peso molecularMarcadores de peso molecular

DNA DNA migrationmigration onon agaroseagarose gel: DNA gel: DNA fragmentsfragmentsdimensiondimension vsvs agaroseagarose concentrationconcentration