ImunologiaMtodo de Pesquisa e Diagnstico ImunolgicoAssuntos: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA); radiology Imaging Associates (RIA); Western Blotting; Imunoprecipitao; Soroaglutinao; Imunoeletroforese; Imunofluorescncia.Mtodos Sorolgicos de Diagnstico e PesquisaOs mtodos utilizam amostrar de fluidos biolgicos de pacientes suspeitos para diagnstico laboratorial. Dependendo da pesquisa que se faa, o mtodo classificado como Direto ou Indireto. O primeiro procura por antgeno (Ag) do agente infeccioso; o segundo, por anticorpo (Ac), responsveis por combater a infeo.As foras de ligao que esto envolvidas nas reaes sorolgicas antgeno-anticorpo so fracas e estabilizam a ligao para formao do complexo. So elas: pontes de hidrognio; ligaes inicas; foras hidrofbicas; foras de Van der Waals.Os fatores que interferem com a ligao para formao do complexo Ac-Ag so: Especificidade dos anticorpos; Afinidade dos anticorpos; Avides dos anticorpos; Concentrao de anticorpos e antgenos; Classe dos anticorpos envolvidos; Pureza dos antgenos utilizados.AfinidadeAfinidade a fora resultante de todas interaes no-covalentes entre um nico stio de ligao do anticorpo e um nico eptopo do antgeno. Sua intensidade depende do grau de complementariedade entre as duas molculas. Assim, anticorpos de baixa afinidade ligam-se de maneira fraca e tendem a se dissociar mais facilmente, por outro lado, os que possuem alta afinidade, apresentam ligaes mais forte e duradouras.AvidezForas que resulta de interaes mltipla entre uma molcula de anticorpo e um antgeno (com todos os seus eptopos). Quanto mais stios de ligaes possui um anticorpo para determinado antgeno, maior ser a sua avidez. Exemplos: Fragmento de Fab < Ig monomrica < Ig dmero < Ig pentmero.Em geral, quanto maior a avidez melhor seu efeito biolgico final (ex.: reconhecimento de antgeno complexo na superfcie de um patgeno). Observa-se tambm que a baixa afinidade apresentada por um anticorpo poder ser compensada pela sua avidez.ConcentraoQuando as concentraes de antgeno e anticorpo so equivalentes, formam-se complexos de tamanho que permite a sua visualizao; nestas concentraes encontra-se a zona de equivalncia. Quando o plasma ou soro a ser analisado apresenta uma alta concentrao de anticorpos, estes se associam aos antgenos, formando pequenos complexos, no visualizados por precipitao; nesta concentrao de anticorpos ocorre o efeito de pr-zona. Quando o anticorpo est pouco concentrado em relao ao antgeno, tambm so formados pequenos complexos e ocorre o efeito denominado de ps-zona.Figura 01. Apresentao esquemtica dos efeitos prozona, zona e ps zona.Em geral, outras variantes tambm devem ser considerara em razo de sua influncia na ligao Ac-Ag: o pH do meio onde ocorre os choques de interao antgeno e anticorpo, quanto mais cido, menos efetiva a ligao; a temperatura torna as reaes mais rpidas, mas deve ser considerara em razo da capacidade de desnaturao que pode provocar entre os envolvidos; e o tempo de reao, quanto maior o tempo de exposio, mais fortes so as ligaes formadas e maior a probabilidade de positivar.Conceitos Bsicos em SorologiaTtuloQuando os ensaios no so quantitativos, a produo de anticorpos contra um determinado antgeno pode ser correlacionada s diluies dos soros utilizadas para a realizao do teste. Nestes ensaios, as partculas antignicas so misturadas com diferentes diluies do soro do paciente e considera-se como resultado de produo de anticorpos a maior diluio em que ocorre a visualizao (precipitao ou aglutinao) da reao antgeno-anticorpo. A esta diluio d-se o nome de ttulo do anticorpo.Teste de Referncia ou Padro OuroTeste j conhecido e utilizado para diagnstico, com o qual uma nova metodologia deve ser comparada durante sua padronizao.Sensibilidade e EspecificidadeA sensibilidade se refere a frao dos que obtiveram resultado positivo entre aqueles que possuam a doena, isto , a proporo de resultados positivos verdadeiros. tambm utilizado para o limiar de deteco de um mtodo, a quantidade mnima de anticorpos (ou antgenos) detectvel.

A especificidade a frao dos que obtiveram resposta negativa entre aqueles que no possuam a caracterstica (doena), isto , a proporo de resultados negativos verdadeiros.

Portanto, um teste com alta sensibilidade diz com maiores chances de acertar quando afirma um resultado positivo, enquanto outro teste com maior especificidade diz, com maiores chances de acertar quando, quando um resultado negativo. Reao CruzadaTermo empregado quando um anticorpo induzido especificamente para um antgeno A capaz de reconhecer um antgeno B contra o qual este no foi especificamente gerado, mas que por apresentar estruturas antigenicamente anlogas mimetiza o antgeno que evocou a resposta. importante ressaltar que a resposta imune adaptativa tem como caracterstica primordial a especificidade. Entretanto, em algumas situaes, a reao cruzada pode ser interpretada como benfica (ex. proteo alcanada com a vacinao contra um dado microorganismo e contra outro antigenicamente relacionado: vacina contra gripe, proteo contra diferentes cepas do vrus da gripe no contidas na vacina; BCG, proteo contra M. tuberculose e M. leprae; etc.). Laboratorialmente, a reao cruzada pode determinar um resultado falso positivo.Preciso e ExatidoPreciso indica o quanto as medidas repetidas esto prximas umas das outras. O conceito preciso (ou fidedignidade, ou reprodutibilidade), em contrapartida, refere-se somente ao grau de disperso da medida quando repetida sob as mesmas condies. Em outras palavras, uma medida precisa se, repetida diversas vezes, apresentar resultados semelhantes.O conceito de exatido (ou acuidade) refere-se ao grau de concordncia de uma medida com seu valor alvo. Ou seja, quanto mais prxima do valor verdadeiro correspondente, mais exata a medida.Para compreender melhor os conceitos de exatido e preciso, usual fazer analogia entre o processo de medio e um exerccio de tiro ao alvo. Na base dessa analogia est a ideia de que, assim como o objetivo de um atirador atingir o centro do alvo, o objetivo da medio determinar o valor verdadeiro do mensurando. A figura 02 ilustra quatro resultados possveis em um teste de tiro.

Figura 02. Esquema representativo de como podemos relacionar os dois conceitos entre si numa afigurao representativa.ReprodutibilidadeA reprodutibilidade de uma experincia cientfica uma das condies que permitem incluir no processo de progresso do conhecimento cientfico as observaes realizadas durante a experincia. Essa condio origina-se no princpio de que no se pode tirar concluses seno de um evento bem descrito, que aconteceu vrias vezes, provocado por pessoas distintas. Essa condio permite se livrar de efeitos aleatrios que podem afetar os resultados, de erros de julgamento ou de manipulaes por parte dos cientistas.Limiar de Reatividade (ou Cut Off)O limiar de referncia ou cut off do teste o ponde de corte para uma varivel acima do qual uma caracterstica passa a ser considerara positiva, isto , o valor mnimo que se precisa alcanar para considerar um paciente positivo.Figura 03. A primeira ondulao o estado de saudvel e a segunda o doente. Percebe-se o cut off como limiar entre a considerao de um indivduo doente e outro saudvel. Na zona de transio esto os falsos negativos e os falsos positivos.O sistema do complementoO sistema do complemento consiste em protenas sricas (inativas na circulao) e de superfcie celular. Quando ativadas, interagem entre si, formando complexos com atividade proteoltica que amplificam a fagocitose e a resposta inflamatria, visando eliminao de agentes infecciosos. As protenas do sistema do complemento correspondem a aproximadamente 5% das globulinas do soro, sendo sintetizadas prioritariamente por clulas do fgado e macrfagos teciduais.Existem 3 vias de ativao: (1) Clssica, dependente de anticorpo; (2) Lectinas e (3) Alternativa, ambas independentes de anticorpo. De modo geral, os componentes clivados originam dois fragmentos, um maior (b) que permanece no local de ativao e um menor (a) que segue para a fase fluida. Vias do Sistema ComplementoVia clssicaOs domnios CH2 (IgG1, 2 e 3) ou CH3 (IgM) dessas imunoglobulinas interagem com C1q, um hexmero no qual esto ligadas as proteases C1r e C1s. Aps a ligao do anticorpo a um antgeno multivalente, o complexo antgeno-anticorpo-C1q promove a ativao enzimtica dos dmeros C1r e C1s. A protease C1s cliva as molculas subsequentes da cascata, C4 e C2, em C4a e C4b e C2a e C2b respectivamente. O fragmento C4b liga-se parede de patgenos ou membrana celular e, em seguida, o C2b, formando uma nova enzima, a C3 convertase (C4b2b). Esse complexo proteoltico cliva a molcula C3 (C3a e C3b). O C3b formado pode ligar-se ao complexo C4bC2b, formando a C5 convertase (C4bC2bC3b), clivando C5 (C5a e C5b) que atua na fase tardia do sistema (C5b-C9) (figura 00).Via das LectinasA protena ligadora de manose (MBL- Mannose binding lectin) inicia a ativao do complemento por meio da ligao manose presente na parede de algumas bactrias (ex. Escherichia coli, Candida albicans). Essa protena estruturalmente semelhante ao C1q da via clssica e tem as proteases MASP1 e MASP2 acopladas MBL, anlogas ao C1r e C1s, respectivamente. Assim, a MASP2 cliva C4 (C4a e C4b) e C2 (C2a e C2b) e o restante da cascata semelhante ao da via clssica.Via alternativaFisiologicamente, ocorre clivagem espontnea em baixas taxas de C3 em C3a e C3b. O C3b instvel em fase fluida e pode ser hidrolisado se permanecer solvel. Por outro lado, o C3b pode ligar-se parede de patgenos e iniciar a ativao da via, com subsequente incorporao e clivagem do fator B (Ba e Bb) pelo fator D. O complexo formado a C3 convertase (C3bBb) da via alternativa, o qual estabilizado pela properdina. Esse complexo cliva C3 (C3a e C3b) promovendo elevada produo de C3b, que pode ligar-se parede de patgenos ou ainda formar a C5 convertase (C3bBbC3b) da via alternativa, que cliva C5 (C5a e C5b).Mesmo sendo ativadas por diferentes maneiras, as 3 vias levam a ativao do C3 e gerao da C5 convertase, molculas indispensveis para a formao do complexo de ataque membrana (MAC Membrane Attack Complex).Figura 00. Vias de Ativao do Sistema do Complemento. As vias de ativao do sistema do complemento compreendem a via Clssica, dependente de anticorpo; Lectinas e Alternativa, ambas independentes de anticorpo.. Complexo de ataque membrana A formao do MAC iniciada com o fragmento C5b ligando-se s molculas subsequentes C6, C7 e C8. Em seguida, h o recrutamento das protenas C9, que se polimerizam e formam o MAC, promovendo a formao de poros na membrana celular, influxo de gua e ons e, finalmente, lise celular.

Figura 00. Formao comum das trs vias do sistema do Sistema Complemento. Estruturao com Complexo de Ataque a Membrana.Funes do Sistema do ComplementoPara que o sistema do complemento exera suas funes efetoras no sistema imunolgico, necessrio que haja a interao das protenas do complemento com seus respectivos receptores presentes em diversas clulas da resposta imune inata e adaptativa. Opsonizao e fagocitose O C3b, C4b e o iC3b so opsoninas, ou seja, recobrem a superfcie de microrganismos para que os mesmos sejam mais facilmente fagocitados. A fagocitose ocorre quando h interao do fragmento opsonizante com seu respectivo receptor nos fagcitos mononucleares e neutrfilos. Desse modo, C3b e C4b ligam-se ao receptor CR1, enquanto iC3b liga-se a CR3 e CR4.Estimulao inflamatriaOs produtos de clivagem C3a e C5a atuam como anafilatoxinas, promovendo a desgranulao de mastcitos, que liberam aminas vasoativas e leucotrienos no stio infeccioso. A interao desses produtos com seus respectivos receptores C3aR e C5aR, presentes em clulas endoteliais e granulcitos, estimula a quimiotaxia de leuccitos. Em conjunto, esses eventos contribuem para o processo inflamatrio com aumento da permeabilidade capilar e influxo de clulas. (Inflamao Resposta Imune Inata)Remoo de imunocomplexosNas respostas humorais, a interao antgeno-anticorpo pode levar formao de imunocomplexos, que precisam ser eliminados. A ligao de C3b a esses imunocomplexos facilita a remoo dos mesmos pela ligao de C3b ao CR1 expresso em hemcias. Essas migram para o fgado ou bao carregando os imunocomplexos que so eliminados pelo sistema fagocitrio mononuclear. CitliseA lise de organismos estranhos ou de clulas-alvo mediada pelo MAC.Protenas Reguladoras do Sistema ComplementoAps a ativao do complemento e realizao de suas funes efetoras, com consequente eliminao do patgeno ou clula alvo, necessrio que haja a regulao da ativao desses componentes. Para isso, existe nas superfcies celulares ou no plasma de mamferos uma srie de protenas reguladoras que desempenham essa funo:ReguladorLocalizaoFunoDoena relacionada

Inibidor de C1 (C1 INH)PlasmaInibe a atividade proteoltica de C1r e C1sAngiodema hereditrio

DAF, MCP e CR1MembranaInibem a formao da C3 convertase da via clssica deslocando C2b de C4b; e da via alternativa deslocando Bb de C3b.Hemoglubinria Paroxistica Noturna

Fator IPlasmaInduz a clivagem de C3b em iC3b tendo como cofatores MCP/CR1-

Fator HPlasmaInibe a formao da C3 convertase da via alternativa atravs de sua ligao a C3b, impedindo o acoplamento do fator B.Evaso do sistema imune por Schistosoma, Neisseria gonorrheae e Haemophilus

Protena SPlasmaLiga-se ao C7 impedindo que ele se insira na poro hidrofbica da membrana, impossibilitando a formao do MACInfeces por Neisserias

CD59MembranaLiga-se ao complexo C5b-C8 impedindo a ligao de C9 e consequente formao do MACInfeces por Neisserias

Teste de Fixao do ComplementoComplexos antgeno/anticorpo podem tambm ser medidos por sua resposta em fixar o complemento, uma vez que o complexo antgeno/anticorpo ir consumir o complemento presente no meio, enquanto que antgenos ou anticorpos livres no iro. Testes para complexos antgeno/anticorpo que se baseiam no consumo do complemento so denominados Testes de Fixao de Complemento (TFC ou FC) e so usados para semi-quantificar reaes antgeno/anticorpo. Este teste s ir funcionar com anticorpos que fixam complementos (IgG e IgM so os melhores).O princpio do teste de fixao do complemento est ilustrado na figura 00. O antgeno e o complemento so misturados ao soro teste para ser investigado para presena de anticorpos e aguardada a formao de complexos antgeno/anticorpo. Um tubo controle com antgeno e complemento tambm preparado. Se nenhum complexo antgeno/anticorpo estiver presente no tubo, nenhum complemento ser fixado. Entretanto, se complexos antgeno/anticorpo estiverem presentes eles iro fixar o complemento e consequentemente diminuir a quantidade de complemento no tubo. Aps se aguardar a fixao do complemento, adicionada uma quantidade padro de clulas vermelhas sanguneas, previamente sensibilizadas com anticorpos anti-eritrcitos. A quantidade de clulas vermelhas sanguneas cobertas por anticorpos predeterminada para ser suficiente para usar todo o complemento inicialmente adicionado, se este ainda estivesse l. Se todo o complemento ainda estivesse presente (i.e., nenhum complexo antgeno/anticorpo se formou entre o antgeno e o anticorpo em questo), todas as clulas vermelhas sero lisadas. Se complexos antgeno/anticorpo so formados entre o antgeno e o anticorpo em questo, algum complemento ser consumido e, portanto, quando as clulas vermelhas cobertas com anticorpo so adicionadas nem todas elas iro lisar. Pela simples medio da quantidade de lise de clulas vermelhas pelos complexos antgeno/anticorpo pela medio da liberao de hemoglobina no meio, pode-se quantificar indiretamente os complexos antgeno/anticorpo no tubo. Testes de fixao de complemento so mais comumente utilizados para pesquisa de anticorpos em uma amostra teste mas eles podem ser modificados para medio do antgeno.

Figura 00. Demonstrao das fases do teste de fixao do complemento. A presena de patgeno ou sua prvia exposio, indicada pelo anticorpo, confirmada com a ausncia de hemlise (a). No teste negativo o complemento e antgeno adicionados provocam a hemlise (b).

Pode ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo, quando ento realizada uma diluio seriada da amostra, observando-se a mxima diluio onde ocorre reao positiva.Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)O ELISA uma tcnica de Imunoensaio enzimtico (EIA) heterogneo, muito utilizada para diagnostico principalmente por causa de seu baixo custo e por detectar quantidades extremamente pequenas de antgeno ou anticorpos. Esse exame se baseia na deteco de anticorpos ou de antgenos especficos, atravs da reao anticorpo-antgeno.Esse mtodo diagnostico pode ser feito, basicamente, de duas formas as quais so realizadas a partir de amostras sorolgicas do paciente: ELISA Direto: tcnica utilizada para a deteco de antgeno presente na amostra analisada. ELISA Indireto: tcnica utilizada para a deteco de anticorpos presente na amostra analisada. Sendo que a eficincia desse exame limitada pela reao de anticorpos de longa durao, presente em indivduos que apresentaram a infeco e se encontram curados.Para esse tipo de ensaio so utilizados: Placas de ELISA; Micropipetas; Reagentes especificos para a analise (anticorpos e anti-anticorpos conjugados a enzimas); Substrato enzimatico; Soluo de parada; Tampo de lavagem.ELISA Direto ou SanducheO ELISA direto uma tcnica utilizada para a deteco de antgeno, sendo assim, pega-se uma placa contendo - aderida na parte solida - anticorpos para a patologia (uma placa sensibilizada) a ser analisada e seguem-se as seguintes etapas: Coloca-se o soro do paciente nos poos presentes na placa. Se existir presena de antgenos, esses se ligaro aos anticorpos presentes na placa formando um complexo: anticorpo (ligado placa) antgeno; Aps esse processo realizada uma lavagem da placa (essa lavagem feita usando um tampo de lavagem), para retirar os antgenos no ligados; Adiciona-se um anticorpo (conjugado) para esse antgeno, assim formar-se um complexo: anticorpo (ligado placa) antgeno anticorpo; Aps um perodo de incubao, realiza-se outra lavagem da placa, para retirar os anticorpos que no formaram o complexo; O cromgeno e o substrato so adicionados, se existir complexo anticorpo (ligado placa) antgeno anticorpo (conjugado) na placa ento haver produo de cor; Por fim adiciona-se uma soluo de parada, ou seja, uma soluo que interrompa a ao da enzima para que assim a soluo no fique com uma colorao muito forte e atrapalhe a leitura do teste.Elisa IndiretoO ELISA indireto uma tcnica utilizada para deteco de anticorpo, sendo assim, pega-se uma placa contendo - aderida na parte solida antgenos para a patologia a ser analisada e seguem-se as seguintes etapas: Coloca-se o soro do paciente nos poos presentes na placa. Se existir presena de anticorpos, esses se ligaro aos antgenos presentes na placa formando um complexo: antgeno (ligado placa) anticorpo. Aps esse processo realizada uma lavagem da placa (essa lavagem feita usando um tampo de lavagem), para retirar os anticorpos no ligados; Adiciona-se depois um anti-anticorpo conjugado (por exemplo a uma enzima, como a peroxidase), assim se formar um complexo: antgeno (ligado placa) anticorpo anti-anticorpo conjugado; Realiza-se outra lavagem, para se retirar o excesso de anti-anticorpo conjugado, que no formou o complexo citado acima; Nos casos em que o conjugado uma enzima, adiciona-se um substrato para a enzima (no caso da enzima ser a peroxidase, utiliza-se como substrato o perxido de hidrognio e cromgenos). O substrato adicionado, ao se ligar enzima do complexo, forma um produto colorido; Por fim adiciona-se uma soluo de parada, ou seja, uma soluo que interrompa a ao da enzima para que assim a soluo no fique com uma colorao muito forte e atrapalhe a leitura do teste.Observao: no diagnstico sorolgico de doenas infectocontagiosas, onde a deteco de anticorpos IgG, IgA ou IgE seja significativa. A deteco de IgM por esta tcnica pode levar a resultado falso-positivo, por ao do fator reumatoide, autoanticorpo que quase sempre uma IgM anti-IgG. Exemplos onde o seu uso intenso: diagnstico sorolgico da Doena de Chagas e da SIDA/AIDSOutro Mtodo: Elisa por Competio uma tcnica utilizada para procura de antgenos no sangue do paciente, portanto, utiliza uma placa com anticorpos especficos aderidos em sua superfcie, e segue as seguintes etapas: Adiciona-se o soro do paciente e em seguida uma soluo com antgeno marcado (conjugado). Os antgenos competiro pelos stios de ligao dos anticorpos e aquele que estiver em maior concentrao ligar mais; Realiza-se a lavagem para se retirar o excesso de antgenos no ligados aos stios dos anticorpos; Adiciona-se o cromgeno e o substrato. Caso o conjugado tenha se ligado ao anticorpo da placa, ocorrer reao com a produo de cor, caso contrrio, no haver o desenvolvimento de cor. A intensidade da cor produzida inversamente proporcional a concentrao de antgeno no sangue do paciente, isto , quanto maior a intensidade da cor, menor a quantidade de antgeno no soro.Elisa de Captura uma tcnica desenvolvida para verificar a presena de anticorpo IgM especfico no soro do paciente. Prepara-se uma placa com poos contendo IgG monoclonal contra IgM e procede as etapas: Adicionar soluo com o IgM para ser pesquisado. A imunoglobulina E formar um complexo o IgG-IgM e manter a imunoglobulina M aderida no poo; Lava-se para a retirada do anticorpo no capturado pela igG; Adiciona-se um antgeno especfico marcando com uma enzima (conjugado) para o anticorpo pesquisado; Lava-se novamente; Adiciona-se o cromgeno e o substrato. A apresentao de cor indica a presena do anticorpo pesquisado.ResultadosOs resultados para o ELISA so analisados de diversas maneira, dependendo da substancia conjugada ao anti-anticorpo utilizado para a realizao do procedimento (por exemplo no caso de uma enzima utilizado a reao desta com um substrato, no caso de um radioistopo utilizada a emisso de radioatividade, dentre outras formas). A leitura do resultado pode ser realizada de, basicamente, duas maneiras: Qualitativa: sendo o resultado positivo ou negativo. Quantitativa: feita com utilizao de equipamentos de leitura como Espectrofotmetro ou uma Leitora de Microplacas por Absorbncia, sendo obtida at mesmo a concentrao do antgeno ou anticorpo da amostra.Radioimunoensaio (RIA)Este mtodo usa o antgeno marcado radioativamente e anticorpos para determinar a concentrao de antgenos com uma preciso bastante elevada, sendo bastante usada para a determinao da concentrao de hormnios.Este mtodo se baseia basicamente na reao reversvel antgeno anticorpo. Como podemos ver na figura 01 o antgeno marcado (At*) compete pelo anticorpo (Ac) com o antgeno no marcado (At) para formar o complexo AcAt (marcado ou no).

Figura 01. Quadro demostrando a relao das equaes de equilbrioQuando se adiciona o antgeno no marcado (cuja concentrao desconhecida) a reao Ac + At* em equilbrio com AcAt* ser deslocada para a esquerda, pois a concentrao de um dos reagentes, isto Ac, diminuiu, fazendo com que a concentrao de AcAt* tambm diminua (segundo a lei de equilbrio de Le Chatelier). Assim sendo, isolando-se o complexo AcAt (marcado ou no) e medindo-se a radiaoatividade deste complexo (com isso somente detectando AcAt*) ser possvel determinar At, que justamente a concentrao de antgeno que se pretende determinar.Como em outros mtodos quantitativos, estes mtodos tambm exigem que se faa uma curva padro (usando concentraes conhecidas de At) e comparar estes valores com os encontrados nas amostras desconhecidas. A luz produzida inversamente proporcional a concentrao do antgeno no marcado.Algumas variantes desta tcnica podem usar, ao invs do antgeno marcado, anticorpo marcado (radioimunoensaio de competio com o Ac marcado), sendo o procedimento experimental bastante semelhante.Etapas Fixao do anticorpo no suporte slido; Adio de quantidade determinada de antgenos marcados; Adio do soro teste; Lavagem; Medida da radioatividade da fase slida.Radioimunoensaio de capturaNo radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um suporte. A soluo teste, com quantidade desconhecida de antgeno, ou as solues padro, com concentraes conhecidas do antgeno so adicionadas. Aps a incubao, remove-se o antgeno no-ligado e adicionam-se anticorpos marcados especficos para o antgeno, com stio de ligao diferente do stio do anticorpo de fase slida. O anticorpo marcado no-ligado removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase slida.A partir da resposta obtida, a concentrao do antgeno em teste estimada por interpolao na curva.Western Blotting (Immunoblotting)Um Western blot. um mtodo em biologia molecular e bioqumica para detectar protenas em um homogenato (clulas bem trituradas) ou um extrato de um tecido biolgico. Essa tcnica usa eletroforese em gel para separar as protenas desnaturadas por massa. As protenas so ento transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose), onde so usados como sonda anticorpos especficos protena. Como um resultado, os pesquisadores podem examinar a quantidade de protena em uma dada amostra e comparar os nveis entre diversos grupos.O nome Western blot. um trocadilho do nome Southern blot., uma tcnica para deteco de DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. Tambm h uma tcnica chamada Northern blot. que serve para a deteco de RNA.Mtodo de execuo do Western blottingPreparao do TecidoTipicamente, amostras podem ser tomadas, tanto de um tecido biolgico quanto de uma cultura de clulas. As amostras so resfriadas ou aquecidas rapidamente. Elas so homogenizadas por sonicao (quebra das clulas por ondas sonoras de alta freqncia) ou por fora mecnica. O resultante a mistura homognea dos componentes da clula, e pode ser usado da forma que est ou sujeita a centrifugao em uma srie de passos para se isolar as fraes do material citosico e nuclear. Na amostra preparada ento quantificada, para que uma quantidade consistente de protena possa ser retirada de cada amostra diferente.As amostras so fervidas de um a cinco minutos em uma soluo tampo, contendo corante, um composto sulfuroso e um detergente conhecido como dodecil sulfato de sdio (SDS). A ebulio e o detergente desnaturam a protena, desenovelando-a completamente. O SDS ento cerca a protena, deixando-a coberta por uma carga negativa, e o enxofre impede a formao de pontes de dissulfeto na protena.Eletroforese em GelAs protenas da amostra so separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em gel. Gis tm vrias formulaes dependendo do laboratrio, peso molecular das protenas de interesse e tampes disponveis, os gis de poliacrilamida so os mais comuns. Desde que as protenas caminham apenas em uma direo ao longo do gel, as amostras so carregadas lado-a-lado em "valas" feitas no gel. As protenas so ento separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. Uma canaleta reservada para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponvel comercialmente de protenas de pesos moleculares conhecidos.Tambm possvel usar um gel 2-D que separa as protenas de uma nica amostra em duas dimenses e as protenas so separadas na primeira dimenso de acordo com o ponto isoeltrico (pH no qual elas tm uma carga total igual a zero), e na segunda de acordo com seus pesos moleculares.TransfernciaA fim de fazer as protenas acessveis deteco do anticorpo, elas so movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF. A membrana colocada face-a-face com o gel, e uma corrente eltrica aplicada entre grandes placas de cada lado, ento as protenas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantm a mesma disposio que continham no gel. Como resultado desse processo de "borramento" (blotting em Ingls), as protenas so expostas a uma fina camada para deteco (figura). Ambas as variedades de membranas so escolhidas por suas propriedades de ligar protenas no especificamente (isto , liga todas as protenas igualmente bem). A ligao das protenas membrana baseada tanto em interaes hidrofbicas quanto em interaes de cargas entre a membrana e as protenas. As membranas de nitrocelulose so mais baratas que as de PVDF, porm so mais frgeis e no suportam bem a repetidas amostragens.Figura. Esquema ilustrativo da transferncia de protenas do gel para uma membrada.BloqueioDesde que a membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar protenas, passos precisam ser feitos para impedir as interaes no especficas entre a membrana e o anticorpo usado para a deteco da protena alvo. O bloqueio da ligao no especfica alcanado pondo-se a membrana em uma soluo diluda de uma protena - tipicamente albumina de soro bovino (BSA) ou leite seco desnatado, com uma pequena quantidade de detergente como Tween 20 ou carbono coloidal.DetecoDurante o processo de deteco testa-se a membrana com anticorpos da protena de interesse, e se liga eles com uma enzima reveladora, a qual leva a uma mudana de cor ou sinal fotomtrico.Anticorpo PrimrioAnticorpos so gerados quando uma espcie hospedeira ou uma cultura de clulas imunes so expostos protena de interesse (ou a uma parte dela). Normalmente uma parte da resposta imune colhida e usada como ferramenta de deteco especfica e sensvel que se liga protena diretamente - por isso anticorpo primrio.Depois de bloqueada a membrana, uma soluo diluda do anticorpo primrio (geralmente entre 0,5 e 5 microgramas/mL) encubada com a membrana sobre leve agitao. Tipicamente, a soluo composta de uma soluo salina tamponada, e s vezes com BSA ou leite em p. A soluo de anticorpos e a membrana podem ser seladas e incubadas juntas de 30 minutos a uma noite. Tambm podem ser incubadas em diferentes temperaturas, com temperaturas mais altas sendo associadas com mais ligaes, tanto especficas protena alvo (o sinal) e no especficas (o rudo).Anticorpo SecundrioDepois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primrio no ligado, ela exposta a outro anticorpo, direcionado a pores espcies-especficas do anticorpo primrio. Este conhecido como anticorpo secundrio. Ele geralmente ligado a biotina ou a uma enzima reveladora, como por exemplo fosfatase alcalina. Esse passo confere a vantagem de que vrios anticorpos secundrios se ligaro a um anticorpo primrio, providenciando um sinal intensificado.Mais comumente, uma peroxidase - ligada secundariamente - usada em conjuno com um agente quimioluminescente, e a reao produz fluorescncia proporcionalmente quantidade de protena. Um filme fotogrfico colocado contra a membrana, e exposta luz da reao criada a imagem dos anticorpos ligados ao blot.Como os procedimentos ELISPOT e ELISA, a enzima pode ser provida com uma molcula substrato que ser convertida pela enzima a um produto colorido de reao que ser visvel na membrana.Uma terceira alternativa usar um marcador radioativo acoplada ao anticorpo secundrio, por exemplo, marcando uma protena capaz de se ligar ao anticorpo como a protena A de Staphylococcus com um istopo radioativo de iodo.VisualizaoAs protenas no western blot so detectadas diretamente por uso de corantes orgnicos, marcadores fluorescentes, vrios mtodos com colorao de prata e partculas coloidais como ouro, prata, cobre, ferro ou Indian. O tipo de colorao a ser utilizado deve ser compatvel com a membrana usada para a transferncia de protenas. Aps a adio do anticorpo primrio e anticorpo secundrio, dois mtodos de deteco de antgenos so comumente usados: radioativo e imunoenzimtica. O mtodo radioativo promove a ionizao e subsequente autoradiografia para visualizao da interao antgeno-anticorpo. A importncia deste mtodo de deteco est em franco desuso, por apresentar um alto custo e riscos sade. A quimioluminescncia preconiza a incubao de um substrato fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo secundrio gera uma colorao. Esta florescncia detectada por um filme fotogrfico ou cmeras especiais que capturam uma imagem digitalizada do Western blot. A imagem analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de protena colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade ptica. Atualmente, a quimioluminescncia o mtodo imunoenzimtico de eleio em Western Blot. Normalmente, peroxidase ou fosfatase alcalina ligados aos anticorpos so usados com inmeros substratos solveis que produzem produtos coloridos insolveis. Esses mtodos so de simples execuo e no requerem equipamentos sofisticados, alm de conferirem resultados rpidos. As desvantagens do mtodo compreendem na dificuldade de obteno de fotografias com qualidade, diferentemente do mtodo radioativo, pois a colorao da reao apresenta baixo contraste, somando-se a isto, o fato de no produzir resultados quantitativos (necessita do densimetro).ImunoprecipitaoA tcnica consiste na induo da precipitao de compostos atravs da formao do complexo antgeno-anticorpo, com a sucessiva quantificao. Sua principal caracterstica que um de dos componentes do complexo encontra-se na forma insolvel em suspenso, de forma natural nas clulas ou adsorvido artificialmente.Entre todos os interferentes que observamos, o que mais interfere na formao do precipitado so as concentraes de antgeno e anticorpo.ImunodifusoNa imunodifuso radial o anticorpo incorporado no gel de gar quando este for derramado e diluies diferentes do antgeno so aplicadas nos poos perfurados no gar. medida que o antgeno se difunde no gel ele reage com o anticorpo e quando o ponto de equivalncia atingido formado um anel de precipitao, conforme ilustrado na figura 00.O dimetro do anel proporcional ao log da concentrao do antgeno, uma vez que a quantidade de anticorpo constante. Portanto, ao correr diferentes concentraes de um antgeno padro pode-se gerar uma curva padro a partir da qual se pode quantificar a quantidade de um antgeno em uma amostra desconhecida. Por essa razo, este um teste quantitativo. Se aparecerem no teste mais de um anel, ocorreram mais de uma reao antgeno/anticorpo. Isso pode ser devido misturada de antgenos ou de anticorpos. Este teste comumente usado em laboratrio clnico para a determinao dos nveis de imunoglobulina em amostras de pacientes.Figura 00. Esquema ilustrativo do efeito de difuso e formao do complexo antgeno-anticorpo. A baixo est um grfico que se pode fazer para a quantificao.As principais desvantagens da imunodifuso radial so:

a)Mtodo semiquantitativo, b)ser de baixa sensibilidade e;c)requer o uso de extratos antignicos em concentrao elevada, da ordem de mg/mL.Radial SimplesO teste de imunodifuso radial simples permite determinar a concentrao de uma amostra de antgeno. O anticorpo especfico incorporado agarose que recobre uma lmina de vidro. Em orifcios feitos na agarose, so adicionadas diferentes concentraes do antgeno. A lmina incubada por 24/48 horas. Observa-se o halo de precipitao em volta dos orifcios.Radial DuplaEm uma camada de agarose que recobre uma lmina de vidro so feitos orifcios. Em um orifcio adicionado antgeno e em outro soro. A lmina incubada por 24/48 horas. Durante a incubao ocorre a difuso do anticorpo e do antgeno na agarose, com a formao de complexos antgeno-anticorpo insolveis, que precipitam e formam linhas entre os orifcios. A formao da linha de precipitao indica a presena de anticorpos especficos figura 00.Figura 00. As solues sofrem difuso e formam complexos Ac-Ag na zona de equivalncia, levando a formao da linha de precipitao. O arco de precipitao fica mais evidente aps lavagem e utilizao de corante.ImunoeletroforeseEm imunoeletroforese, uma mistura complexa de antgenos aplicada em um poo perfurado em um gel de gar e os antgenos so submetidos eletroforese, de forma que os antgenos so separados de acordo com suas cargas. Aps a eletroforese, um sulco feito no gel e os anticorpos so adicionados. medida que os anticorpos se difundem no gar so produzidas linhas de precipitina na zona de equivalncia quando ocorre uma reao antgeno/anticorpo, conforme ilustrado na Figura 00.Este teste usado para a anlise qualitativa de misturas complexas de antgenos, embora uma medida grosseira da quantidade (espessura da linha) pode ser obtida. Este teste comumente usado para a anlise de componentes no soro de um paciente. O soro colocado no poo e anticorpos para soro total colocado no sulco. Atravs da comparao com o soro normal, possvel determinar se h deficincias em um ou mais componentes do soro ou se h uma superabundncia de algum dos componentes do soro (espessura da linha). Este teste pode tambm ser usado para avaliar a pureza das protenas de soro isoladas.Figura 00. A figura demonstra as etapas da imunoeletroforese: aplicao do antgeno, separao de acordo com a carga, aplicao dos anticorpos e formao de complexos na zona de equivalncia.ImunofixaoQuando paraprotenas (globulinas anormais na amostra biolgica) so detectadas na eletroforese de soro, urina ou lquor, devem ser classificadas pela imunofixao. As imunoglobulinas monoclonais, tambm chamadas de Protenas M, derivam de uma nica linhagem de clulas plasmticas que podem produzir altas concentraes de um nico anticorpo monoclonal que aparece como uma linha estreita na eletroforese (ex.: mieloma mltiplo, macroglobulinemia de Waldestrom, amiloidose, gamopatia monoclonal de significado indeterminado). A imunofixao, que substitui a tcnica de imunoeletroforese por ser mais sensvel e rpida, combina as tcnicas de eltroforese e imunoprecipitao. Aps a separao das protenas sricas por eletroforese, anti-soro (contra IgA, IgG, IgM, cadeia leve Kappa e Lambda) colocado sobre as fraes separadas (figura 00). As protenas no precipitadas so lavadas e o imunoprecipitado a seguir corado. A presena de protena M caracterizada na imunofixao pela presena de uma banda bem definida associada com uma classe de cadeia pesada (IgM, IgG ou IgA) e banda de mesma mobilidade que reage com cadeia kappa ou lambda. Este mtodo tem grande aplicao na identifio de proteinas M presentes em pequenas quantidades, que so difceis de detectar por outros mtodos. Figura 00. Imunofixao do soro humano. Utilizou-se a eletroforese para a separao do soro em cada gel e, em seguida, aplicou-se o anti-soro para cada uma das imunoglobulinas num gel diferente.FloculaoO processo consiste na formao de agregados de partculas finais em suspenso num lquido, chamados de flocos. No sistema floculado no h a formao de um "bolo" (adensamento de material ao fundo do recipiente) dado que todos os flocos esto na suspenso.Exame de VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory)A sfilis uma doena infecciosa humana produzida por uma espiroqueta, o Treponema pallidum. Ela primeiramente uma doena transmitida sexualmente. Outras possveis viam de transmisso a transfuso de sangue infectado, hoje praticamente eliminada atravs de triagem sorolgica de rotina, e a perinatal (sfilis congnita) transmitida in tero, pelos treponemas procedentes da me infectada para o feto em desenvolvimento.Os testes sorolgicos para sfilis so classificados como no-treponmicos, usados mais comumente para a triagem, como o VDRL, e treponmicos, usados como testes confirmatrios para os soros reativos nos testes de triagem.A combinao de lecitina, colesterol e cardiolipina possui semelhana imunolgica com antgenos de Treponema pallidum, mas consistindo em um antgeno no treponmico. Quando a suspenso antignica do VDRL misturada com o soro, plasma ou lquido cefalorraquidiano (LCR) que contenham anticorpos (reaginas), as partculas de antgeno floculam e o resultado da reao observado ao microscpio. A ausncia de floculao indica resultado negativo (figura 00).Figura 00. Demonstrao de dois testes VDRL reais com resultados positivos (a esquerda) e negativos (a direita).ImunoaglutinaoTeste de Aglutinao DiretoNa reao de aglutinao direta procura-se por partculas antignicas insolveis em sua forma ntegra ou fragmentada. Hemcias, bactrias, fungos, protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos especficos so realizados empregando-se diluies em srie do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antgeno. Aps um perodo de incubao, a aglutinao se completa e o resultado geralmente expresso como o ttulo do anti-soro, isto , a mxima diluio em que ocorre a aglutinao.Teste de Inibio de Hemaglutinao DiretaA inibio da hemaglutinao direta baseada na capacidade que certos antgenos virais tm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemcias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partculas virais, resultando na inibio da aglutinao, indicando um teste positivo para a presena de anticorpos. Estes testes no distinguem entre IgG e IgM. Este mtodo usado para detectar anticorpos contra o vrus da rubola, sarampo, influenza e certos enterovrus.Teste de Aglutinao Passiva ou IndiretaPara o teste de aglutinao passiva, as hemcias e as partculas inertes (ltex, bentonita, sepharose, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsoro passiva, devida ao contato direto com os antgenos solveis, por adsoro via agentes qumicos, como cido tnico, cloreto de cromo ou por conjugao do antgeno, por meio de ligaes qumicas covalentes, fornecendo reagentes estveis. Devido grande diversidade de antgenos que podem se ligar s clulas ou partculas, a aplicao dos testes de aglutinao passiva muito variada e utilizada para procura de anticorpos.Teste de Hemaglutinao passivaA verificao de Boyden, em 1951, de que protenas podiam ser adsorvidas a hemcias tratadas com cido tnico e que essas clulas podiam ser aglutinadas por anticorpos especficos possibilitou o emprego dos mtodos de aglutinao para a deteco de anticorpos contra vrias substncias.Hemcias esto entre os melhores suportes de antgenos para os testes de aglutinao, pois h uma srie de antgenos que pode ser ligada sua superfcie para fornecer um sistema indicador sensvel na deteco de anticorpos. Alm disso, os testes em placa permitem que a determinao do ponto final da reao seja feita diretamente. Hemcias possuem uma superfcie complexa, o que facilita a ligao de muitos antgenos e, freqentemente, acarreta a presena de anticorpos heterfilos no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execuo do teste.Antgenos polissacardeos prontamente aderem a hemcias, enquanto antgenos proticos requerem pr-tratamento com cido tnico ou cloreto de cromo.O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e considerado positivo quando se verifica a formao de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em V, e negativo quando as hemcias sedimentam formando um boto compacto. O ttulo da amostra testada ser a mxima diluio em que ainda se observa a formao do tapete.O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinao que os IgG, a quantidade de antgeno necessria para se obter a mxima reatividade com IgM muito maior do que a necessria para a mxima reatividade com IgG. Teste de Inibio de Hemaglutinao PassivaO teste de inibio de hemaglutinao passiva sensvel e especfico na deteco de pequenas quantidades de antgenos solveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substncia homloga com que a hemcia foi sensibilizada.O princpio do teste baseia-se na competio, pelos stios de combinao do anticorpo, entre o antgeno fixado hemcia e o antgeno solvel ou o hapteno. O grau de inibio relaciona-se com a quantidade do antgeno presente na amostra e, tambm com a afinidade pelos stios de combinao do anticorpo.Teste de Aglutinao do LtexPartculas de ltex so esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsoro de protena solvel e antgenos polissacardicos, funcionando como sistema indicador da reao antgeno-anticorpo.O teste pode ser empregado na pesquisa de antgenos ou de anticorpos. A aplicao mais comum na deteco do fator reumatide, que anticorpo da classe IgM pentamrico dirigido contra IgG. Adsorvendo IgG passivamente s partculas do ltex, haver a exposio dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatide, resultando em aglutinao. Este mtodo mais sensvel e menos especfico que a hemaglutinao passiva para a deteco de fator reumatide. O fator reumatide deve ser um autoanticorpo poro Fc de IgG agregada ou alterada, ocorrendo doenas autoimunes, em processo agudos ou crnicos, em doenas reumticas, em doenas infecciosas, degenerativas, etc. Tambm empregada na pesquisa da protena C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de vrias infeces, como estafiloccica ou estreptoccica, febre reumtica, etc.SoroaglutinaoO teste de soroaglutinao fundamenta-se na imunofloculao, pois recorre formao de complexos antgeno-anticorpo, produzindo partculas visveis aos olhos desarmados. A tcnica se divide em duas formas: direta (rpida) e indireta (lenta).Soroaglutinao Direta (Rpida)A tcnica de soroaglutinao rpida o teste sorolgico mais simples e comumente utilizado. Sua realizao efetuada em superfcie de vidro, podendo ser um suporte especfico para o teste ou uma lmina simples. O teste efetuado com uma gota de antgeno e uma gota de amostra de soro sobre esta superfcie. O teste pode ser visualizado a olho nu com de uma lente sob incidncia de luz. Caso existam anticorpos especficos (aglutininas) no soro, ir ocorrer a formao de grumos ou floculao pelos complexo antgeno-anticorpo. A presena destes grupos indica que no soro testado possui anticorpos, portanto, o indivduo j fora exposto ao agente patgeno.Soroaglutinao Indireta (Lenta)A tcnica indireta (lenta) tambm forma complexos antgeno-anticorpo, contudo, o que se observa no lugar de grumos ou flocos hemlise eritrcitos sensibilizados. Para tanto, seleciona-se clulas vermelhas de mamferos para serem sensibilizadas com o antgeno que se deseja pesquisar. Quando misturadas, o soro que se deseja verificar e a suspenso de hemcias sensibilizada, os anticorpos formao complexos que rompero com a membrana celular dos eritrcitos e liberaro hemoglobinas que tornaro a reao visvel. Portanto o soro do paciente no poder estar inativado.ImunofluorescnciaO teste de imunofluorescncia um dos mais utilizados no diagnstico de laboratrio para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espcimes clnicas. Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade especfica com o antgeno. Teste de Imunofluorescncia DiretaO teste de imunofluorescncia direta empregado na pesquisa e na localizao de antgenos em clulas ou tecidos atravs de um anticorpo especfico marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antgeno, formando um imunocomplexo estvel. O anticorpo no ligado removido por lavagens e o preparado observado em microscpio de fluorescncia.O teste tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, estreptococos -hemoltico do grupo A e vrios vrus, com os do herpes simples tipo 1 e 2, o citomegalovrus, os da influenza tipo A e B, os da parainfluenza 1,2 e 3, o da varicela-zoster e o adenovrus.Teste de Imunofluorescncia IndiretaA sensibilidade dos testes de imunofluorescncia limitada ao nvel de fluorescncia detectvel pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescncia indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antgenos ou de anticorpos. Para a Pesquisa de AntgenosConsiste na incubao da clula ou tecido em que se quer pesquisar o antgeno com o anticorpo especfico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a formao de um imunocomplexo. Aps a lavagem, a preparao incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espcie de animal.Para a Pesquisa de AnticorposAntgenos padronizados so fixados a lminas de vidro. O soro do paciente diludo, colocado sobre o antgeno e incubado para permitir a formao do complexo antgeno-anticorpo. Aps lavagens, a preparao incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo especfico para o antgeno (figura 00).Figura 00. Teste de imunofluorescncia indireto para pesquisa de anticorpos. Utiliza-se um antgeno fixo para formao do complexo antgeno-anticorpo com o soro do paciente. Aps, emprega-se um anticorpo anti-imunoglobulina com marcar para detectar a presena.ImunocromatografiaOs testes dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos. So testes de triagem, portanto de elevada sensibilidade, e consequentemente elevado custo. Alguns deles, como a determinao da glicemia (glicosmetros), usam mtodos enzimticos qumicos, e outros so imunolgicos como para o teste de gravidez.O sistema realizado em uma matriz constituda de membrana de nitrocelulose ou de nilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualizao do teste. O antgeno ou o anticorpo fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana bloqueado com protena inerte como nos testes imunoenzimticos (ELISA).Para deteco de antgenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Um dos mtodos imunolgicos desses testes emprega corante insolvel, como ouro coloidal (rseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interao antgeno-anticorpo.A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido, formando o complexo antgeno e anticorpo, que percorrem por migrao cromatografia a matriz de teste. Posteriormente a fase lquida passa pela linha de captura, onde os imunocomplexos encontraro anticorpos que os prendero e permitiro serem revelados atravs do depsito do corante coloidal (figura 00).Figura 00. Esquema representativo do teste imunicromatogrfico. Este teste est direcionado para a pesquisa de antgenos na amorestra.Para assegurar a qualidade dos reagentes e a realizao adequada do procedimento, esses testes rpidos utilizam controles internos, como nos testes imunoenzimticos (figura 00).Figura 00. Teste imunocromatogrfico. O controle deve sempre ser levado em considerao para a observncia da qualidade.