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Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG Instituto de Ciências Biológicas - ICB Programa de Pós - Graduação em Parasitologia Belo Horizonte - MG Fevereiro - 2015

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Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha

Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças

com infecção assintomática por Leishmania

(Leishmania) infantum

Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Instituto de Ciências Biológicas - ICB

Programa de Pós - Graduação em Parasitologia

Belo Horizonte - MG

Fevereiro - 2015

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Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha

Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças

com infecção assintomática por Leishmania

(Leishmania) infantum

Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Instituto de Ciências Biológicas - ICB

Programa de Pós - Graduação em Parasitologia

Belo Horizonte - MG

Fevereiro - 2015

Dissertação apresentada ao programa de

Pós - Graduação em Parasitologia do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais,

como requisito parcial à obtenção do

título de Mestrado em Parasitologia.

Área de concentração: Epidemiologia de

Doenças Infecciosas e Parasitárias

Orientador: Dra. Mariângela Carneiro -

ICB/UFMG

Co-Orientador: Dra. Vanessa Peruhype

Magalhães Pascoal - CPqRR/FIOCRUZ

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043

Cunha, Gisele Macêdo Rodrigues da Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum [manuscrito] / Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha. – 2015.

117 f. : il. ; 29,5 cm.

Orientador: Mariângela Carneiro. Co-orientador: Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas.

1. Leishmaniose visceral - Teses. 2. Resposta imune – Teses. 3. Citocinas – Teses. 4. Infecção assintomática. 5. Biomarcadores. 6. Parasitologia – Teses. I. Carneiro, Mariângela. II. Pascoal, Vanessa Peruhype Magalhães. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. IV. Título.

CDU: 576.88/.89

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Equipe Colaboradora:

Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal - Pesquisadora do Laboratório de

Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração do Centro de Pesquisas René Rachou

(FIOCRUZ/MG).

Dr. Edward Oliveira - Pesquisador do Laboratório de Pesquisas Clínicas do Centro de

Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ/MG).

Dr. Marcelo Antônio Pascoal Xavier - Pesquisador do Departamento de Anatomia

Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina (UFMG).

Dra. Ana Rabello - Pesquisadora e chefe do Laboratório de Pesquisas Clínicas do

Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ/MG).

Iara Caixeta M. Rocha - Doutoranda do Programa de Pós - Graduação em Parasitologia

do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG).

Letícia Helena Marques dos Santos - Doutoranda do Programa de Pós - Graduação em

Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG).

Thaís Almeida Marques da Silva - Doutoranda do Programa de Pós - Graduação em

Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG).

Dra. Maria Helena F. Morais - Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte

(SMS).

Apoio Financeiro:

CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

MS – Ministério da Saúde

SES/MG - Secretaria de Estado de Saúde - MG

FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

PPSUS/FAPEMIG – Programa de Pesquisa para o SUS/FAPEMIG

Os ensaios sorológicos, moleculares e imunológicos foram realizados no Laboratório de

Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ/MG), sob a

coordenação da Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal e do Dr. Edward Oliveira.

Este projeto foi aprovado nos Comitês de Ética em Pesquisa das seguintes instituições:

Universidade Federal de Minas Gerais em 2009 e 2013 (Parecer 253/09; CAAE:

12046113.0.0000.5149), Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ-MG (Parecer

01/2010) e Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte (Parecer 080.2008).

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Agradecimentos

A Deus, que ilumina minha vida.

À minha mãe Inez Morais Macêdo Cunha e ao meu pai Marcos Rodrigues da Cunha

pelo incentivo e amor.

Às minhas irmãs Gabriela, Mariana e Janaina e meus tios, primos e avós pelo carinho e

amizade.

Ao André pelo companheirismo, compreensão e amor.

À minha orientadora, Dra. Mariângela Carneiro pela oportunidade de poder desenvolver

este trabalho junto ao seu grupo de pequisa, pela atenção, disponibilidade e

generosidade demonstrada sempre que era preciso de seu auxilio.

À minha co-orientadora Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal por ter colaborado para

o desenvolvimento deste trabalho com tanto empenho e dedicação, pelo incentivo e

pelos ensinamentos.

Ao Dr. Edward Oliveira cuja a colaboração e ensinamentos foram muito importantes

para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Marcelo Antônio Pascoal Xavier pela realização das análises estatísticas.

À Dra. Ana Rabello que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho no Laboratório

de Pesquisas Clínicas do CPqRR-FIOCRUZ e pelo apoio fornecido.

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Aos técnicos da Plataforma de Citometria de Fluxo do CPqRR-FIOCRUZ e aos

pesquisadores do Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração do

CPqRR-FIOCRUZ, que me auxiliaram em vários momentos durante a realização dos

meus experimentos.

Aos professores e funcionários da UFMG pelo excelente trabalho prestado, em especial

ao Departamento de Pós – Graduação em Parasitologia, que tornou possível essa

realização.

Aos amigos do Laboratório de Pesquisas Clínicas do CPqRR-FIOCRUZ pela amizade e

boa convivência.

Aos amigos do Laboratório de Epidemiologia de Doenças Infecciosas e Parasitárias do

ICB – UFMG pela amizade e ajuda sincera durante os trabalhos desenvolvidos juntos.

Aos amigos da turma de Mestrado, pela agradável companhia, pela amizade sincera,

pelos momentos de descontração nesta jornada.

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Sumário

Índice de Tabelas...............................................................................................................x

Índice de Figuras..............................................................................................................xi

Resumo...........................................................................................................................xiii

Abstract............................................................................................................................xv

Lista de Abreviaturas.....................................................................................................xvii

1.0 Introdução..................................................................................................................20

1.1 Leishmanioses................................................................................................21

1.2 Leishmaniose Visceral – Agente Etiológico e Epidemiologia......................21

1.3 Manifestações Clínicas e Diagnóstico da Leishmaniose Visceral.................22

1.4 Resposta Imune na Leishmaniose Visceral Humana.....................................29

2.0 Justificativa e Relevância..........................................................................................36

3.0 Objetivo.....................................................................................................................38

3.1Objetivo geral.......................................................................................................39

3.2 Objetivos específicos...........................................................................................39

4.0 Metodologia...............................................................................................................40

4.1 Seleção da população de estudo..........................................................................41

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4.2 Coleta de dados e das amostras...........................................................................43

4.3 Fluxograma metodológico...................................................................................44

4.4 Ensaio imunoenzimático de ELISA-AgT e ELISA-rK39...................................45

4.5 Teste de avidez....................................................................................................46

4.6 Ensaios de qPCR..................................................................................................48

4.6.1 Extração de DNA........................................................................................48

4.6.2 PCR quantitativo em tempo real.................................................................48

4.7 Avaliação do perfil sérico de citocinas................................................................49

4.7.1 Quantificação dos níveis séricos de citocinas por citometria de fluxo.......49

4.7.2 Aquisição e análise dos dados de avaliação dos níveis séricos de

citocinas...............................................................................................................50

4.8 Análise dos dados................................................................................................51

4.8.1 Análises descritivas dos dados....................................................................51

4.8.2 Categorização das variáveis para análise multivariada..............................52

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4.8.3 Análise de regressão logística.....................................................................53

4.8.4 Análise discriminante.................................................................................54

4.8.5 Árvores de classificação.............................................................................54

5.0 Resultados..................................................................................................................56

5.1 Seleção por meio dos testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e do

ensaio molecular de qPCR de crianças com infecção assintomática por L.

infantum...............................................................................................................57

5.2 Perfil de avidez de anticorpos IgG em crianças com LV assintomática e LV

clássica.................................................................................................................62

5.3 Correlação entre as taxas de avidez de anticorpos IgG com a evolução da

infecção em crianças com LV clássica................................................................62

5.4 Correlação entre os índices de reatividade para ELISA-rK39 e a taxa de avidez

de anticorpos IgG, em crianças que apresentam LV assintomática e LV

clássica.................................................................................................................63

5.5 Perfil sérico da quimiocina CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias, anti-

inflamatórias/moduladoras e IL-17A em crianças com LV assintomática e LV

clássica.................................................................................................................64

5.5.1 Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças com LV

assintomática e LV clássica.................................................................................64

5.5.2 Avaliação do perfil sérico de citocinas pró - inflamatórias em crianças com

LV assintomática e LV clássica...........................................................................65

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5.5.3 Avaliação do perfil sérico de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras em

crianças com LV assintomática e LV clássica.....................................................66

5.5.4 Avaliação do perfil sérico da citocina IL-17A em crianças com

LVassintomática e LV clássica............................................................................67

5.6 Identificação de biomarcadores imunológicos úteis para a compreensão dos

fatores que determinam o curso da infecção por L.infantum e que possam ter

potencial aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática............68

5.6.1 Análise de regressão logística.....................................................................68

5.6.2 Análise discriminante.................................................................................70

5.6.3 Árvore de classificação...............................................................................72

6. Discussão.....................................................................................................................74

7.Conclusão.....................................................................................................................87

8. Referências Bibliográficas...........................................................................................89

9. Anexo.........................................................................................................................114

Anexo 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)...........................115

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x

Índice de Tabelas

Tabela 1 Regras para a categorização de cada variável..........................................52

Tabela 2 Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos

(ELISA-AgT e ELISA-rK39) e pelo ensaio molecular (qPCR)

realizados..................................................................................................57

Tabela 3 Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos de

ELISA- AgT, ELISA-rK39 e pela qPCR, dos pacientes com LV

clássica.....................................................................................................59

Tabela 4 Associação dos resultados apresentados pelas 19 amostras que foram

submetidas aos testes sorológicos de ELISA AgT, ELISA-rK39 e a

técnica de qPCR ......................................................................................59

Tabela 5 Caracterização das crianças identificadas com infecção assintomática

(AS), diagnosticadas com LV clássica (LVC) e residentes das áreas

endêmicas que apresentaram ensaio molecular e testes sorológicos

negativos (CN).........................................................................................60

Tabela 6 Perfil de avidez de anticorpos IgG observado em crianças com infecção

assintomática e clássica por L.infantum..................................................62

Tabela 7 Resultados da análise de regressão logística comparando os grupos AS e

LVC em relação aos preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1...................69

Tabela 8 Resultados da análise de regressão logística associando os grupos AS e

LVC aos preditores TA , IL-17A, IFN- e IL-1....................................70

Tabela 9 Resultados da avaliação da função discriminante quadrática entre os

grupos AS e LVC para os preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1..........71

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xi

Índice de Figuras

Figura 1 Belo Horizonte de acordo com as regiões administrativas. Fonte:

PBH, 2014..........................................................................................41

Figura 2 Fluxograma do delineamento do estudo............................................43

Figura 3 Fluxograma metodológico.................................................................45

Figura 4 Plataforma de esferas no sistema CBA..............................................51

Figura 5 Associação entre resultados positivos para infecção assintomática por

L. infantum de acordo com os testes sorológicos (ELISA-AgT e

ELISA-rK39) e a qPCR......................................................................58

Figura 6 Distribuição em porcentagem das crianças incluídas no grupo AS

(Fig. A), LVC (Fig. B) e CN (Fig. C) em relação à idade...............61

Figura 7 Distribuição em porcentagem das crianças que pertencem ao grupo

LVC em relação ao tempo de sintoma quando internadas.................61

Figura 8 Correlação entre tempo de sintoma, determinado em dias, e as taxas

de avidez em crianças com LV clássica.............................................63

Figura 9 Correlações entre os índices IR-rK39 e taxa de avidez em crianças

que apresentam infecção assintomática e clássica............................64

Figura 10 Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças que

pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de

Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43)............65

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xii

Figura 11 Avaliação do perfil de citocinas pró-inflamatórios séricas em crianças

que pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de

Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43)............66

Figura 12 Avaliação do perfil de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras

séricas em crianças pertencentes ao Grupo Controle negativo (CN =

98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle Positivo

(LVC = 43).........................................................................................67

Figura 13 Avaliação do perfil de IL-17A circulante em crianças pertencentes ao

Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81)

e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43).........................................68

Figura 14 Árvore de classificação dos biomarcadores preditores TA, IL-17A,

IFN- e IL-1 entre os grupos AS (AS = 1 ou rosa claro) e LVC

(LVC = 2 ou rosa escuro)...................................................................72

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xiii

Resumo

Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral (LV), a prevalência da infecção

assintomática pode servir como indicador da extensão e manutenção de transmissão do

parasito, pois o número de indivíduos que abrigam temporariamente e silenciosamente,

o parasito, corresponde à maioria dos infectados. Assim é de extrema importância

identificar a infecção assintomática visando monitorar as áreas endêmicas para

direcionar melhor as ações de controle. Porém os métodos de diagnóstico sorológico

desenvolvidos, não apresentam o mesmo desempenho e eficiência para identificação da

LV assintomática. Neste contexto, este estudo buscou avaliar biomarcadores

imunológicos em crianças infectadas e não infectadas por L. infantum com o intuito de

identificar aqueles com potencial aplicação para auxiliar na detecção da infecção

assintomática. Para tanto, amostras de soro de 179 crianças residentes em 3 áreas da

Regional Noroeste de Belo Horizonte foram submetidas aos testes ELISA-AgT, ELISA-

rK39 e qPCR. Na análise dos resultados, foram identificadas 81 amostras positivas.

Observou-se que a co-positividade entre a qPCR e os dois testes sorológicos foi

notavelmente baixa (2 amostras), pois não foi detectado pela qPCR DNA de Leishmania

spp. em amostras de sangue total em um número considerável de indivíduos que

apresentaram diagnóstico positivo para os testes de ELISA-AgT e/ou ELISA-rK39. Por

outro lado, a qPCR permitiu identificar infecção assintomática em indivíduos que

apresentaram diagnóstico sorológico negativo (17 amostras). A taxa de avidez (TA) de

anticorpos IgG, foi determinada em 44 amostras de soro de crianças com infecção

assintomática e 42 com a forma clássica da doença, que apresentaram resultado positivo

para o teste de ELISA-rK39. Os dados mostraram TA média (entre 41 a 70%), em 29

(66%) das amostras avaliadas como infecção assintomática. Altas TA (acima de 70%)

foram observadas em 27 (64%) das crianças com LV clássica. Os resultados

demonstraram ainda associação inversa entre TA e índice de reatividade em crianças

assintomáticas. Para avaliar o perfil imunológico de crianças não infectadas, crianças

identificadas com infecção assintomática e com LV clássica, foi realizada a

quantificação dos níveis séricos da quimiocina CXCL-8, de citocinas pró-inflamatórias,

anti-inflamatórias/moduladoras e da IL-17A por citometria de fluxo. Os dados

mostraram níveis séricos basais da quimiocina CXCL-8, das citocinas IL-6, IL-1,

TNF, IFN-, IL-2, IL-12p70, IL- 10 e IL-4 em crianças assintomáticas.

Por outro lado, observou-se elevados níveis séricos de IL-17A nesse grupo, sugerindo

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xiv

que esse biomarcador desempenha papel protetor na LV assintomática. Em crianças

com LV clássica, observou-se elevados níveis séricos de CXCL-8, IL-6, IL-1, TNF,

IFN- e IL-10. Através da regressão logística foi possível selecionar como potenciais

biomarcadores da infecção por L. infantum, a taxa de avidez, IFN-, IL-17A e IL-1.

Com o emprego da árvore de classificação, foi possível criar uma regra de associação

desses preditores entre crianças com LV assintomática e LV clássica. Valores

categorizados de TA menores que 2,5 juntamente com valores categorizados de IFN-

menores que 2,5 detectados em 40 crianças, indicaram decisão a favor de LV

assintomática. Para valores categorizados de TA maiores que 2,5, acompanhados de

valores categorizados de IFN- maiores que 2,5 e de IL-1 maiores que 1,5 favoreceu a

classificação de 15 crianças como LV clássica. Foi possível observar ainda associações

que indicaram infecção assintomática com os seguintes valores: menor TA, maior IL-

17A e menor IFN-; e indicaram LV clássica com os valores: maior TA, maior IFN-; e

elevado IL-1. A classificação proposta nesse estudo, empregando as abordagens

estatísticas (regressão logística e CART), sugere potencial aplicação como ferramenta

complementar para o diagnóstico da infecção assintomática em crianças residentes em

áreas endêmicas para LV.

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xv

Abstract

In endemic areas for visceral leishmaniasis (VL), the prevalence of asymptomatic

infection can serve as an extension of the indicator and maintenance of transmission of

the parasite, since the number of individuals to temporarily house and quietly, the

parasite corresponds to the most infected. So it is extremely important to identify

asymptomatic infection in order to monitor the endemic areas to better design control

actions. But the methods developed serological diagnosis, do not have the same

performance and efficiency for asymptomatic VL. In this context, this study aimed to

evaluate immunological biomarkers in children infected and not infected by L. infantum

in order to identify those with potential application to aid in the detection of

asymptomatic infection. Therefore, serum samples from 179 children living in three

areas of the Northwest Regional Belo Horizonte were subjected to ELISA-AgT,

ELISA-rK39 and qPCR testing. In the analysis of results, we identified 81 positive

samples. It was observed that co-positivity between the qPCR and the two serological

tests were remarkably low (2 samples), since it was not detected by qPCR DNA of

Leishmania spp. in whole blood samples in a considerable number of individuals with a

positive diagnosis for the ELISA-AgT and / or ELISA-rK39 tests. Moreover, qPCR

possible to identify asymptomatic infection in individuals who showed negative

serological diagnosis (17 samples). Avidity (TA) of IgG antibodies was determined in

44 serum samples from children with asymptomatic infection and 42 with the classic

form of the disease, which tested positive for ELISA-rK39 test. Data show TA average

(between 41 and 70%), 29 (66%) of the samples evaluated as asymptomatic infection.

TA high (over 70%) were observed in 27 (64%) of children with classic VL. The results

also demonstrated an inverse correlation between TA and reactivity index in

asymptomatic children. To assess the immune status of children uninfected children

identified with asymptomatic infection and classical VL was performed to quantify

serum levels of chemotactic to neutrophils chemokine CXCL-8, proinflammatory and

anti-inflammatory / modulator and IL-17A cytokines by flow cytometry. The data

showed basal serum levels of chemokine CXCL-8, cytokines IL-6, IL-1, TNF, IFN-,

IL-2, IL-12p70, IL-10 and IL-4 in asymptomatic children. On the other hand, we

observed elevated serum levels of IL-17A in this group, suggesting that this biomarker

plays protective role in asymptomatic VL. In children with classical VL, we observed

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xvi

increased serum levels of CXCL-8, IL-6, IL-1, TNF, IFN- and IL-10. By logistic

egression could be selected as potential biomarkers of infection by L. infantum, avidity,

IFN-, IL-17A and IL-1. With the use of the classification tree, it was possible to

create an association rule these predictors among children with asymptomatic VL and

VL classic. Categorized values TA less than 2.5 along with categorized values of IFN-

lower than 2.5 detected in 40 children indicated decision in favor of asymptomatic VL.

For categorized TA values greater than 2.5, together with classified values greater than

2.5 IFN- and IL-1 greater than 1.5 promoted the 15 children as classical VL

classification. It was also possible to observe associations indicated asymptomatic

infection with the following values: lower TA, higher IL-17A and lower IFN-; and

classical VL indicated with the values: high TA, higher IFN- and high IL-1. The

classification proposed in this study using the statistical approaches (logistic regression

and CART), suggests potential application as a complementary tool for the diagnosis of

asymptomatic infection in children living in endemic areas for VL.

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xvii

Lista de Abreviatura

ACTB - Gene Humano da β-actina

AgT - Antígeno Total de L. infantum

AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

AS - Grupo de Estudo

CART - Árvore de Classificação e Regressão

CBA - Cytometric Bead Array

CN - Grupo Controle Negativo

CPqRR – Centro de Pesquisas Rene Rachou

cut-off- Ponto de Corte

DAT - Teste de Aglutinação Direta

LPC - Laboratório de Pesquisas Clínicas

DNA - Ácido Desoxirribonucleico

EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético

ELISA - Enzyme –Linked Immunosorbent Assay

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz

FSC - Tamanho

HIV - Vírus da imunodeficiência Humana

IFN- - Interferon-gama

IgG - Imunoglobulina G

IL-1 - Interleucina 1

IL-1β - Interleucina 1 beta

IL-2 - Interleucina 2

IL-4 - Interleucina 4

IL-5 - Interleucina 5

IL-6 - Interleucina 6

CXCL-8 - quimiocina quimiotática para neutrófilos

IL-10 - Interleucina 10

IL-12 - Interleucina 12

IL-12p70 - Interleucina 12p70

IL-17 -Interleucina 17

IL-17A - Interleucina 17A

IL-21 - Interleucina 21

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xviii

IL-22 - Interleucina 22

IR- Índice de Reatividade

LAT - Teste de Aglutinação em Látex

LBP - Proteínas de Ligação de Lípideos

LT - Leishmaniose Tegumentar

LV - Leishmaniose Visceral

LVC - Como Grupo Controle Positivo

mL - Mililitro

MG - Minas Gerais

NK - Células Natural Killer

nm - Nanometros

OR - Razão de Chances

PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

PE - Ficoeritrina

pg - picogramas

qPCR - Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa

RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta

rK39 - Antígeno Recombinante K39

RNA - Ácido Ribonucléico

rRNA - Ácido Ribonucléico Ribossomal

SSC - Granulosidade

SSU rRNA - Gene da Pequena Subunidade do RNA ribossomal de Leishmania

spp.

STF-T - Salina Tamponada com Fosfatos Contendo Tween-20 a 0,05%

STF-T - Leite 1% - Salina Tamponada com Fosfatos Contendo Tween-20 a

0,05% Acrescida de 1% de Leite em Pó Desnatado

STF-T - Leite 5% - Salina Tamponada com Fosfatos Contendo Tween-20 a

0,05% Acrescida de 5% de Leite em Pó Desnatado

TA - Taxa de Avidez

TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TGF-β - Transforming Growth Factor Beta

TNF - Fator de Necrose Tumoral

TNF-α - Fator de Necrose Tumoral Alfa

TR - Teste Rápido de Imunocromatografia

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xix

U- - Densidade Óptica das Amostras não Tratadas com Uréia

U+ - Densidade Óptica das Amostras Tratadas com Uréia

g - Micrograma

μl - Microlitro

μM - Micromolar

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1.0 INTRODUÇÃO

Page 22: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Introdução

21

1.1 Leishmanioses

Protozoários do gênero Leishmania são parasitos intracelulares obrigatórios

que provocam um amplo espectro de doenças, coletivamente conhecidas como

leishmanioses. No homem, as manifestações dessa doença podem variar de formas

clínicas menos graves como a leishmaniose tegumentar (LT), que apresenta duas

principais formas: LT cutânea e muco-cutânea, e a leishmaniose visceral (LV), que se

não diagnosticada e tratada precocemente pode levar ao óbito na maioria dos casos

(OMS, 2010).

Estima-se que aproximadamente 12 milhões de pessoas estejam infectadas e que

cerca de 350 milhões encontram-se em risco de adquirir a doença em todo o mundo,

com incidência anual estimada em cerca de 1 - 1,5 milhões de casos para a LT e

500.000 casos para a LV (OMS, 2010; Alvar et al., 2012).

1.2 Leishmaniose Visceral – Agente Etiológico e Epidemiologia

A leishmaniose visceral é causada, por parasitos pertencentes ao complexo

donovani, que compreendem as espécies Leishmania (Leishmania) donovani e

Leishmania (Leishmania) infantum (ou L. (L.) chagasi) agente etiológico da

leishmaniose visceral nas Américas. A transmissão da doença se dá pela picada das

fêmeas de insetos da ordem Díptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, do

gênero Phlebotomous e Lutzomyia no velho e novo mundo, respectivamente

(Cummings., 2010).

No Brasil, os canídeos domésticos e silvestres são os mais importantes e

significativos reservatórios da doença. Em áreas endêmicas tem se relatado que a

enzootia canina precede a ocorrência de casos humanos e que a infecção em cães é mais

prevalente do que no homem (Oliveira et al., 2001).

Por muito tempo, no país, a LV foi conhecida como uma zoonose tipicamente

rural, porém, desde a década de 90 tem ocorrido aumento significativo do número de

casos registrados e atualmente encontra-se em pleno processo de dispersão e

disseminação para diferentes regiões, tanto em áreas rurais quanto em áreas urbanas

(Gontijo & Melo, 2004) atingindo as 5 regiões brasileiras, sendo registrados em média

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Introdução

22

cerca de 3.500 casos anuais e apresentando incidência de 2,0 casos/100.000 habitantes

(SINAM, 2009).

Vários fatores têm sido relacionados com o rápido processo de urbanização da

doença e o aumento do número de casos, destacando-se entre eles: as mudanças na

estrutura agrária, que provocaram a migração de grande parte da população rural para os

centros urbanos, mudanças ambientais e climáticas, adaptação do vetor aos ambientes

urbanos, a expansão da epidemia da AIDS e do uso de drogas imunossupressores,

aliados a descontinuidade e dificuldades nas ações de controle da doença em grandes

aglomerados urbanos, onde problemas de desnutrição, moradia, saneamento básico,

acesso a educação e a saúde estão presentes (Gontijo & Melo, 2004).

Belo Horizonte, capital do estado de Minas Gerais, ilustra claramente o processo

de urbanização da LV nas cidades brasileiras. Desde 1994 o número de casos de LV

humana tem-se elevado (Luz et al., 2001). No período de 1994 a 2011, foram

confirmados 1.553 casos da doença (PBH, 2012). No período de 2006 a 2013, a

letalidade foi superior a do país, variando de 6% a 23,0%. Apesar do maior percentual

de casos se concentrarem em crianças e adolescentes até 14 anos (36,8%), apenas 7,6%

do total de óbitos ocorreu nesta faixa etária (PBH, 2013). Entre os fatores de risco

envolvidos na transmissão da LV na cidade destaca-se a renda, a educação e o número

de cães infectados por habitantes (de Araújo et al., 2012).

1.3 Manifestações Clínicas e Diagnóstico da Leishmaniose Visceral

A infecção por L. (L.) infantum apresenta um amplo espectro clínico, incluindo

desde formas assintomáticas a quadros muito graves, com potencial de evolução para

óbito e, os fatores associados ao estabelecimento e a manutenção das diferentes formas

clínicas da LV não são completamente compreendidos (Faleiro et al., 2014). No entanto,

aspectos inerentes ao hospedeiro como: fatores genéticos (Bucheton et al., 2006;

Mehrotra et al., 2011; Fakiola et al., 2013), o estado nutricional (Badaró et al., 1986 a e

b; Anstead et al., 2001; Queiroz et al,. 2004; Hughes & Kelly, 2006; Nyle´n & Sacks,

2007), a idade (Badaró et al., 1986 a e b; Queiroz et al,. 2004) e a resposta imune

desencadeada pela infecção (Faleiro et al., 2014) foram associados com a

suscetibilidade para o desenvolvimento da forma clínica clássica da LV. Além disso,

infecções por helmintos também foram identificadas como fator que pode favorecer a

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Introdução

23

replicação do parasito (O’Neal et al., 2007; Maurya et al., 2012).

Condições de depressão do sistema imune, tais como a infecção pelo vírus HIV

e o uso de drogas imunossupressores por pacientes transplantados ou com doença

autoimune, também tornam as pessoas mais vulneráveis ao desenvolvimento da forma

clínica clássica da LV, pois prejudicam a capacidade do sistema imune em resolver a

infecção por Leishmania e permite a reativação da infecção que pode ocorrer muito

tempo depois do contato primário com o parasito (Antinori et al., 2008; Cascio et al.,

2010; Antinori et al., 2012; Pitini et al., 2012).

Na América Latina, particularmente no Brasil a co-infecção Leishmania - HIV é

uma condição emergente (Cota et al., 2014). Em pacientes infectados pelo HIV e não

infectados as características clínicas da LV clássica são semelhantes, a principal

diferença é a menor taxa de resposta ao tratamento e consequente alta taxa de recidiva

da doença em pacientes co-infectados (Cota et al., 2014). No entanto há relatos de que

em alguns pacientes a infecção por HIV pode modificar as manifestações clínicas da LV

clássica, o que dificulta o diagnóstico clínico em áreas onde a doença está em expansão.

Além disso, o quadro clínico da LV clássica é semelhante ao de outras doenças

oportunistas disseminadas, o que aumenta ainda mais a dificuldade no diagnóstico de

pacientes co-infectados por HIV- Leishmania (Cota et al., 2014).

Em pacientes imunocompetentes, a forma clínica clássica é o resultado de uma

infecção crônica, cujo o período de incubação varia de 10 dias a 1 ano (OMS, 2010). A

doença é de instalação insidiosa e evolução prolongada, sendo a medula óssea, o fígado

e o baço os órgãos frequentemente afetados. As manifestações clínicas apresentadas

pelos indivíduos infectados incluem: hepatoesplenomegalia, que é caracterizada por

aumento do abdômen com baço e fígado palpáveis, febre irregular, tosse seca, diarréia,

mal estar, anorexia, perda de peso, palidez cutâneo-mucosa, hemorragias (epistaxe,

gengivorragia e petéquias) e icterícia, ocorre desnutrição proteico-calórica, os cabelos

ficam quebradiços, os cílios alongados e a pele seca, podendo a infecção levar o

paciente à caquexia. Os exames laboratoriais evidenciam anemia, pancitopenia,

leucopenia, trombocitopenia, provas de função hepática bastante alteradas e inversão na

relação albumina/gama-globulinas (MS, 2006). A hiperpigmentação da pele é

comumente observada em pacientes infectados por L. donovani, daí a derivação do

nome kala-azar, que quer dizer, febre negra (OMS, 2010). A doença pode ser fatal se

não for tratada e, o tratamento apropriado, geralmente leva a cura completa. A

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Introdução

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recorrência da doença é rara no hospedeiro imunocompetente e quando acontece, ocorre

logo após o final do tratamento e é geralmente sensível a um novo ciclo de tratamento

(MS, 2006)

Vários métodos podem ser utilizados no diagnóstico da LV, mas o diagnóstico

definitivo da doença é dado por meio de métodos parasitológicos ou moleculares (Reus

et al., 2005; Del Olmo et al., 2009).

O diagnóstico parasitológico pode ser realizado através da visualização de

formas amastigotas em preparações de concentrado de leucócitos de sangue periférico,

aspirado de medula óssea, baço, fígado e linfonodo corados pelo Giemsa ou Wright,

Leishman, Panóptico e examinadas ao microscópio óptico (Elmahallawy et al., 2014).

Quando se obtém fragmentos por biópsia do órgão infectado, são elaborados cortes

histológicos para a pesquisa do parasito. A técnica que utiliza como amostra biológica o

aspirado de baço é a mais sensível, seguida pela que utiliza aspirado de medula óssea,

biopsia hepática e aspirado de linfonodos, sendo os procedimentos de coleta para

realização destas técnicas invasivos, gerando dificuldades de diferentes ordens (MS,

2006).

Apesar da técnica de visualização no microscópio óptico de formas amastigotas

em esfregaços de aspirado de medula óssea corados pelo Giemsa apresentar

sensibilidade de 60% a 85%, é a mais comumente utilizada, já que a técnica que utiliza

esfregaços de aspirado de baço apesar de ter sensibilidade maior (93%), apresenta riscos

para o paciente, pois a punção aspirativa do baço pode levar a ruptura do órgão e a

hemorragias fatais (Zijlstraet al., 1992; MS, 2006). Já a técnica que utiliza esfregaços de

concentrado de leucócitos de sangue periférico, apesar de não oferecer nenhum risco ao

paciente no momento da coleta, sendo a punção de sangue periférico menos incomoda e

mais fácil de ser realizada que a punção de medula óssea, apresenta sensibilidade muito

baixa, pois há poucas células parasitadas circulantes, principalmente em pacientes com

baixo parasitismo (John & Petri, 2006; Barrett & Crof, 2012). A biópsia de fígado

também é um método de coleta de material biológico mais seguro que a punção

aspirativa de baço, mas formas amastigotas só são visualizadas em cortes histológicos

em infecções com alta carga parasitária (John & Petri, 2006; Barrett & Crof, 2012).

O isolamento em meio de cultura (in vitro), onde o material biológico obtido por

punção aspirativa ou por biópsia são inoculados em meios de cultura especiais, pode

melhorar a sensibilidade diagnóstica, mas é demorado e caro, estando restrito aos

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Introdução

25

centros de referência (Elmahallawy et al., 2014).

O diagnótico também pode ser realizado pela detecção de anticorpos específicos

pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático de ELISA,

teste de aglutinação direta (DAT), teste rápido de imunocromatografia (TR),

“immunoblotting” (“Western-blotting”) e teste de aglutinação em látex (LAT)

(Elmahallawy et al., 2014). .

Porém, todos os testes de detecção de anticorpos apresentam o mesmo

inconveniente: não diferenciam se a infecção é atual ou passada, pois os anticorpos

permanecem circulantes no sangue periférico durante muitos anos após o paciente ter se

curado, sendo que em regiões endêmicas, indivíduos assintomáticos também podem

apresentar resultado positivo para estes testes. Neste contexto, em pacientes que

apresentam apenas um teste sorológico reagente, na ausência de manifestações clínicas

sugestivas de LV, não é autorizado o inicio do tratamento. Sendo assim, os testes

sorológicos são comumente utilizados apenas para reforçar o diagnóstico da LV (MS,

2006).

No Brasil, o kit de RIFI é produzido por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ (Rio

de Janeiro, Brasil) e fornecido pelo Ministério da Saúde para ser usado na rotina dos

laboratórios públicos, para o diagnóstico de LV clássica humana. Em 2010, o Ministério

da Saúde introduziu o teste rápido Kalazar-Detect™

(INBIOS Internacional, Seattle, WA,

EUA) e manteve a RIFI na rotina para diagnóstico da LV nos Laboratórios Centrais e

Laboratórios de Referência do Brasil, apesar das limitações de requerer microscópio de

fluorescência, laboratórios relativamente bem equipados e apresentar baixo desempenho

no diagnóstico da doença (Oliveira et al., 2013).

O DAT é um teste sorológico usado em todo o mundo, que não depende de

equipamentos para ser realizado, sendo uma ferramenta simples e robusta, para o

diagnóstico da LV, apresentando bom desempenho (Andrade et al., 1986; Sundar et al.,

2006; Oliveira et al., 2013). Recentemente foi validado um protótipo de kit do teste de

aglutinação direta para o diagnóstico laboratorial da LV clássica, no Laboratório de

Pesquisas Clínicas do CPqRR-FIOCRUZ (DAT-LPC), que utiliza antígeno liofilizado

desenvolvido com Leishmania (L.) infantum. O teste demonstrou sensibilidade de

99,0% e especificidade de 98,2%, taxas superiores às que vêm sendo apresentadas pela

RIFI, adotada pelo Ministério da Saúde. Diante desses resultados, foi sugerido ao

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Introdução

26

Ministério da Saúde substituir a RIFI pelo DAT como teste de diagnóstico de rotina no

sistema público de saúde brasileiro (Oliveira et al., 2013).

O teste de ELISA pode ser realizado facilmente e é adaptável para utilização

com várias moléculas antigênicas, sendo uma técnica altamente sensível, mas a sua

especificidade depende do antígeno utilizado (Elmahallawy et al., 2014). Testes de

ELISA utilizando antígeno solúvel produzido a partir de promastigotas, apresentam alta

sensibilidade e especificidade, porém apresentam reação cruzada com amostras de

pacientes com tuberculose, toxoplasmose e com infecção por diferentes

tripanosomatídeos (Bray, 1976; Kumar et al., 2001). Quanto aos antígenos purificados,

foram testadas diferentes moléculas (com pesos moleculares de 116 kDa, 72 kDa, e 66

kDa), sendo a sensibilidade apresentada pelos testes muito baixa (Vinayak et al., 1994;

Maurya et al., 2010). Já os antígenos recombinantes clonados a partir de proteínas de

Leishmania infantum como rK39 (Burns et al., 1993; Badaró et al., 1996; Houghton et

al., 1998; Singh et al., 2010), rK9, rK26 (Mohapatra et al., 2010) e Leishmania

donovani como rKE16 (Sivakumar et al., 2006) e rK28 (Pattabhi et al., 2010), tem

mostrado alta sensibilidade e especificidade quando testados em pacientes

imunocompetentes com LV clássica em diferentes países. A proteína de choque térmico

HPS70, as proteínas histonas H2A, H2B, H3 e H4 e as proteínas de ligação de lípideos

(LBP) também podem ter potencial para o uso no diagnóstico sorológico da LV clássica

(Amorim et al., 1996; Pérez-Alvarez et al., 2001).

Nos últimos anos, diversos ensaios moleculares, particularmente a reação em

cadeia da polimerase (PCR), foram sucessivamente avaliados como alternativa sensível

e específica para o diagnóstico das leishmanioses (Piarroux et al., 1993 e 1994;

Schallig & Oskam, 2002; Antinori et al., 2007; Deborggraeve et al., 2008 a e b; Laurent

et al., 2009; Srivastava et al., 2011; Nicodemo et al., 2013; Khan et al., 2014). A PCR

pode ser usada para detectar DNA de Leishmania spp. em diferentes amostras

biológicas, tais como, sangue periférico (Disch et al., 2003), soro (de Assis et al., 2008),

urina (Fisa et al., 2008) e aspirados de medula óssea (Fraga et al., 2010). Dessa forma, a

PCR vem sendo avaliada para o diagnóstico da LV clássica, LV assintomática e

controle de cura (Disch et al., 2004; Antinori et al., 2007; Moreno et al., 2009)

Mais recentemente, a reação de amplificação quantitativa em tempo real (qPCR)

tem sido a melhor alternativa para avaliação da infecção por Leishmania spp. e

quantificação da carga parasitária em diferentes amostras biológicas (Bretagne et al.,

Page 28: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Introdução

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2001; Mary et al., 2006; Cota et al., 2013). Assim, a qPCR pode possibilitar ao médico

e ao pesquisador acompanhar a evolução da infecção e monitorar os resultados de um

determinado esquema terapêutico a partir de amostras provenientes de humanos

(Nicolas et al., 2002 a e b; Mary et al., 2004; Rolão et al., 2004; Castilho et al., 2008;

Cota et al., 2013).

Diferentemente da LV clássica, a infecção assintomática é caracterizada por

ausência de manifestações clínicas (sinais e sintomas) na anamnese e no exame físico

realizado pelo médico, podendo ser detectada em pessoas sem história prévia de LV

clássica e normalmente está associada à presença de um caso da doença na família ou na

vizinhança. É importante destacar que, o Ministério da Saúde, preconiza que os

indivíduos com infecção assintomática não devem ser tratados e esses casos não devem

ser notificados (MS, 2006).

Em áreas endêmicas, o número de indivíduos infectados com o parasito, mas que

não desenvolvem a doença, corresponde à maioria dos infectados. Estudos estimam que

a proporção de infecções assintomáticas é de 5 a 10 vezes maior do que o número de

casos de LV clássica em indivíduos imunocompetentes (Desjeux, 1992;

Sakthianandeswaren et al., 2009; OMS, 2010; Antinori et al., 2012), podendo assim, a

prevalência da LV assintomática servir como indicador da extensão e manutenção de

transmissão do parasito (Costa et al., 2002; Riera et al., 2004; Romero et al., 2009; dos

Santos Marques et al., 2012).

Neste contexto, inquéritos epidemiológicos vêm sendo realizados com o intuito

de identificar os indivíduos que apresentam a infecção assintomática por L.infantum,

visando monitorar as áreas endêmicas para direcionar melhor as ações de controle (de

Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos Santos Marques et al.; 2012). Para

tanto, estes estudos vêem empregando como método para identificar os indivíduos

assintomáticos, a detecção de anticorpos anti-leishmania pela reação de

imunofluorescência indireta - RIFI (de Gouvea Viana et al., 2008) e pelo ensaio

imunoenzimático de ELISA (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos

Santos Marques et al.; 2012) ou o teste intradérmico de Montenegro, que ao contrário

do que ocorre na LT, não pode ser utilizado para o diagnóstico da forma clínica clássica

da LV, pois é sempre negativo durante o período da doença e torna-se positivo após a

cura clínica na maioria dos pacientes em um período de seis meses a três anos após o

término do tratamento (de Gouvea Viana et al., 2008).

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Introdução

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Diferentes estudos mostraram que os testes sorológicos podem não ser eficientes

quando utilizados sozinhos para a identificação de indivíduos assintomáticos, que vivem

numa área endêmica uma vez que, indivíduos que desenvolveram a forma clínica

assintomática, apresentam baixa carga parasitária e, como consequência os títulos de

anticorpos em geral são baixos, tendendo a desaparecer da corrente sanguínea com o

decorrer do tempo (de Gouvea Viana et al., 2008). Mesmo assim, os testes sorológicos

são utilizados para realização de inquéritos epidemiológicos, porque são mais práticos e

aplicáveis quando são testadas muitas amostras. Além dissoa combinação de várias

ferramentas de diagnóstico não seria viável (de Gouvea Viana et al., 2008; dos Santos

Marques et al.; 2012).

Diante deste cenário, onde a utilização de um único método de diagnóstico

compromete e dificulta o amplo reconhecimento de indivíduos com infecção

assintomática, os métodos moleculares, realizados através da detecção de DNA do

parasito em amostras de sangue periférico, mesmo apesar do elevado custo, têm sido

considerados como métodos de diagnóstico complementar, importante para a detecção

da infecção assintomática (de Gouvea Viana et al., 2008; dos Santos Marques et al.;

2012). As técnicas moleculares fornecem resultados mais robustos do que os outros

métodos uma vez que, estudos recentes demonstraram que a degradação do DNA ocorre

rapidamente após a morte do parasito, o que sugere que os resultados obtidos são devido

aos parasitos que estão viáveis e recentes no hospedeiro (Prina et al.; 2007).

No entanto, mesmo com os avanços obtidos pelo desenvolvimento das técnicas

moleculares, os estudos clínicos e laboratoriais, abordando indivíduos assintomáticos,

são escassos e diversificados em termos de definição, sendo que a dificuldade de

diagnosticar indivíduos que abrigam temporariamente e, silenciosamente, o parasito,

ainda é uma limitação desses estudos. Em razão disso, torna-se necessário a realização

de novos estudos para validar uma melhor estratégia de diagnóstico da infecção

assintomática (de Gouvea Viana et al., 2008).

Quanto à possibilidade de evolução da infecção assintomática para forma clínica

clássica, estudos recentes demonstraram que indivíduos residentes de áreas endêmicas,

supostamente infectados pela espécie L. infantum, que não desenvolveram a doença, não

apresentam riscos de progressão para a forma clínica clássica, podendo a infecção

assintomática ser apenas temporária e evoluir para total convalescência (Silva et al.,

2011). No entanto, o mesmo não é observado em indivíduos com infecção

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Introdução

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assintomática por L. donovani em áreas endêmicas, sendo relatada alta taxa de

progressão para a forma clássica da doença (Das VN et al., 2011).

Estudos demonstraram que indivíduos com infecção assintomática por L.

infantum provavelmente não infectam flebotomíneos, devido à parasitemia muito baixa

ou indetectável (Costa et al., 2000). No entanto, a possibilidade de que estas pessoas

possam atuar como reservatórios da infecção vem sendo sugerida por vários

pesquisadores e não deve ser descartada, já que o papel desempenhado por estes

indivíduos no ciclo de transmissão da doença ainda é desconhecida e em países

endêmicos é encontrada grande proporção de indivíduos com infecção assintomática

(Costa et al., 2002). Por outro lado, em infecções assintomáticas por L. donovani, os

indivíduos podem atuar como reservatórios, podendo potencialmente infectar

flebotomíneos (OMS, 2010), pois estudos têm mostrado alto nível de parasitemia em

amostras de sangue destes indivíduos, sendo assim, alvos importantes para a realização

de estratégias de controle da doença (OMS, 2010; Sharma et al., 2000).

1.4 Resposta Imune na Leishmaniose Visceral Humana

A infecção por Leishmania inicia-se quando formas promastigotas infectantes

são inoculadas na pele do hospedeiro vertebrado, desencadeando uma reação

inflamatória local com acúmulo de leucócitos no sítio de infecção (Teixeira et al., 2006,

Silveira et al., 2009). Nesse microambiente, aproximadamente 90% dos parasitos são

lisados pelo complemento através do complexo de ataque à membrana (C5b-C9)

(Domínguez et al., 2002, Domínguez et al., 2003, von Stebut, 2007). No entanto,

aqueles parasitos não destruídos podem se ligar a receptores específicos na superfície de

fagócitos e serem internalizados por um processo denominado fagocitose (Mosser &

Rosenthal, 1993, von Stebut, 2007, Peters et al., 2008).

A interação inicial promastigotas-macrófagos é fundamental para o

estabelecimento da infecção no hospedeiro vertebrado (Rosenthal et al., 1996, von

Stebut, 2007). Nesse contexto, diversos estudos já demonstraram a importância de

determinados receptores no processo de reconhecimento/adesão: receptores manose-

fucose e fibronectina, receptor para glicosilação avançada, bem como receptores Fc e

do complemento (Mosser & Edelson, 1985, Mosser & Handman, 1992, Mosser,

Springer & Diamond, 1992, Guy & Belosevic, 1993). Segundo alguns autores, a

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Introdução

30

opsonização através do terceiro componente do complemento (C3) promove aumento

significativo da capacidade fagocítica de macrófagos (Mosser & Edelson, 1985, Mosser,

Springer & Diamond, 1992, von Stebut, 2007). Mosser & Edelson (1987) observaram

também que a incorporação de C3 à promastigotas de L. major aumenta drasticamente a

sobrevivência do parasito dentro dessas células.

Outro grupo de receptores com destaque no reconhecimento de patógenos são os

Receptores de Reconhecimento Padrão (PPRs). Os PPRs são constituídos por vários

membros, incluindo os receptores do tipo Toll (TLRs) que reconhecem patógenos

distintos associados a padrões moleculares (PAMPs) (Janssens and Beyaert, 2003). Os

TLRs estão envolvidos em uma variedade de fenômenos celulares, dentre eles pode-se

destacar: fagocitose, maturação, atividade microbicida do fagossoma via indução da

expressão de iNOS, bem como produção de citocinas moduladoras e pró-inflamatórias

(Singh, Srivastava & Singh, 2012).

Além disso, já foi demonstrado que a Leishmania possui diversos mecanismos

de escape para evadir da resposta imune do hospedeiro e estabelecer a infecção. Dentre

esses mecanimos, alguns podem ser destacados: 1) Inibição da produção da citocina

inflamatória interleucina (IL)-12 (Belkaid, Butcher & Sacks, 1998); Degradação da

molécula de ativação HLA-DR em macrófagos infectados (de Souza-Leao et al., 1995);

3) Inibição da ação do complemento, através da expressão de proteínas quinases que

fosforilam os componentes C3, C5 e C9 (von Stebut, 2007).

Em síntese, ao escaparem dos componentes do meio extracelular, os parasitos

irão penetrar nas células fagocíticas pela interação moléculas de superfície do parasito e

receptores dessas células. No interior dessas células, o parasito assume a forma

amastigota. Há uma complexa interação parasito – hospedeiro dentro do microambiente

dos fagolisossomos e, eventualmente, os mecanismos imunes de defesa são evadidos

(Sher, 2002).

A imunopatogênese da leishmaniose está fortemente associada a dois tipos de

resposta imune: a resposta Tipo1 e Tipo2. Tanto as células que participam da resposta

celular e quanto as que participam da resposta humoral desempenham papel

fundamental na formação da resposta imune do hospedeiro à infecção por Leishmania

pela secreção de citocinas (Cummingset al., 2010).

As citocinas podem atuar tanto de forma sinérgica quanto antagonicamente

através de vias complexas de sinalização, promovendo tanto o desenvolvimento de uma

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Introdução

31

resposta imune protetora, tendo papel benéfico na resolução da doença, quanto não

protetora, importante na patogênese (Cummingset al., 2010).

Ao contrário das dificuldades em se caracterizar o perfil de citocinas,

importantes para o desenvolvimento de uma resposta imune envolvida na

suscetibilidade à LV clássica, os mecanismos de resistência à infecção já são bem

estabelecidos. Assim, o desenvolvimento de resposta imune mediada por células, capaz

de ativar macrófagos para eliminar os parasitos intracelulares, controlar a infecção por

Leishmania spp. e promover a resolução da doença em seres humanos está associado

com as citocinas pró-inflamatórias IL-12 (Watford et al., 2004), IFN-γ (Mosser &

Edwards, 2008), e TNF-α (Liew et al., 1990 a e b).

A citocina IL-12, produzida principalmente por macrófagos e células

dendríticas, em resposta a agentes patogênicos (Trinchieri, 2003), promove a

diferenciação das células T CD4+ do tipo Th1 e induz a produção de IFN-γ, por células

T ativadas e células Natural Killer (NK) (Watford et al., 2004; Mondal et al., 2010). A

principal função biológica do IFN-γ é ativar os macrófagos e aumentar a atividade

microbicida destas células para matar agentes patogênicos intracelulares (Sacks &

Noben-Trauth, 2002; Tripathi et al., 2007; Mosser & Edwards, 2008; Kaye & Scott,

2011). O IFN-γ exerce uma ação sinérgica com TNF-α induzindo a expressão de iNOS

( óxido nítrico sintase induzível) e a produção de NO (óxido nítrico) pelos fagócitos

infectados por parasitos intracelulares, promovendo, assim, a eliminação destes e

resolvendo a infecção por Leishmania spp. (Liew et al., 1990 a e b; Ray et al., 2000;

Cunningham et al., 2002).

Em seres humanos, a LV clássica é considerada um protótipo de disfunção

imunológica específica, onde tanto a imunidade celular quanto a humoral estão

comprometidas. Durante a doença ativa uma resposta imune ineficaz contra o parasito é

desenvolvida, levando a sua disseminação no hospedeiro e a um desequilibrio

generalizado da resposta imune, dominado pelo aumento dos níveis de citocinas anti-

inflamatórias IL-10 e TGF-β, que agem de forma a modular a resposta imune celular,

tão importante no controle da infecção (Murray et al., 2005; Goto et al., 2009; Kaye &

Scott, 2011). Essas citocinas (IL-10 e TGF-β) seriam responsáveis pela inibição da

ativação de macrófagos e expressão de iNOS (Melby et al. 2001).

Porém, ainda há controvérsias quanto ao perfil da resposta imune desenvolvida

na LV clássica, o microambiente de citocinas presente durante a infecção e o papel que

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Introdução

32

estas desempenham na patogênese da doença humana. Estudos, que avaliaram o padrão

de citocinas, para classificar o perfil da resposta imune desenvolvida na LV clássica,

associaram a resistência à infecção com a ativação e diferenciação de células T do tipo 1

e a progressão da doença foi associada com uma resposta predominante de células T do

tipo 2, determinando, assim, um perfil polarizado de resposta imune relacionado com

LV (Carvalho et al., 1981 e 1989; Kharazmiet al., 1999). Estudos recentes, têm

questionado a simplicidade deste modelo e revelaram a existência de complexidades na

regulação de citocinas e nos mecanismos de aquisição de resistência ou suscetibilidade a

infecção (Holaday et al., 1993; Mary et al., 1999; Peruhype-Magalhães et al., 2005;

Ansariet al., 2006; Costa et al., 2012).

Avaliações do perfil de citocinas na LV, demonstraram que indivíduos com LV

clássica são capazes de produzir tanto citocinas de resposta imune do tipo 1 quanto do

tipo 2, com altos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-6, TNFα e IFN-γ ( Medeiros

et al., 2000; Lagler et al., 2003; Gama et al., 2004; Ansari et al., 2006; Peruhype-

Magalhães et al., 2006; Duarte et al., 2008; Gautam et al., 2011), e de citocinas anti-

inflamatórias/moduladoras IL-10 e TGF-β (Holaday et al., 1993; Mary et al., 1999;

Ansariet al., 2006; Saha et al., 2007; Duarte et al., 2009; Frade et al., 2011; Costa et al.,

2012), o que demonstra uma exarcerbação da resposta imune nestes pacientes (Holaday

et al., 1993; Mary et al., 1999; Ansari et al., 2006; Costa et al., 2012). Sendo assim,

esses estudos sugerem que a resposta imune desenvolvida por indivíduos com LV

clássica é desbalanceada, ocorrendo um desequilíbrio nos níveis de citocinas do tipo1 e

do tipo 2, havendo tanto elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias que vêm sendo

associados com a resistência à infecção, quanto elevados níveis de citocinas anti-

inflamatórias/moduladoras associados a suscetibilidade, que podem ser importantes no

desenvolvimento da doença.

Especialmente em relação às citocinas pró-inflamatórias, é importante observar

que apesar da presença de níveis elevados durante a LV clássica, há progressão da

doença. IL-6 e TNF- são mediadores centrais de alterações fisiopatológicas associadas

à sepse, a distúrbios orgânicos e à resposta de fase aguda (Neta et al. 1992). Indivíduos

portadores da LV clássica em geral apresentam febre, anorexia, caquexia, aumento na

síntese de proteínas de fase aguda e hipergamaglobulinemia. Estas citocinas podem

induzir todos estes sinais e sintomas (Tracey et al. 1988; Hirano, 1998). Alguns estudos

têem mostrado que os níveis séricos de IL-6 em pacientes com LV clássica permanecem

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Introdução

33

significativamente elevados em comparação com indivíduos do grupo controle, mesmo

após o tratamento, o que indica que ela pode ter papel na patogênese e também trazem

benefício na resolução da doença (Caldas et al., 2005; Ansari et al., 2006). Outros

estudos, têm relacionado a citocina IL-6 com a diferenciação de células Th2 (Diehl &

Ricon, 2002), inflamação e com a resposta Th1 (Yamamoto et al., 2000), bem como,

com o desenvolvimento de células Th17 (Ouyang et al., 2009), sugerindo que a IL-6 é

importante na manutenção de um equilíbrio entre as respostas de células T durante a

doença (Bhattacharya & Ali, 2013). Diante desses dados, pode-se sugerir que o papel

desempenhado por esta citocina na progressão/controle da doença ainda é inconclusivo.

Já a citocina TNF-α apresenta papel bem definido no controle da doença. TNF-α em

sinergia com a IL-12, promovem produção de IFN- por células NK (Tripp et al. 1993)

e em associação ao IFN-, induzem mecanismos citotóxicos efetores em macrófagos.

Quanto ao elevado nível de IFN-γ, parece que a progressão da doença pode ser

explicada devido a um bloqueio do receptor de IFN-γ em macrófagos, provocando perda

da sua função protetora (Ansari et al., 2006).

Estudos recentes tem mostrado que a citocina IL-17A, desempenha papel

importante na LV humana. É possível que a IL-17A promova o recrutamento e ativação

de neutrófilos, que são conhecidos por exercerem importante função reguladora e/ou

efetora durante a infecção por Leishmania spp., desempenhando papel importante na

LV (Charmoy et al., 2010) . De fato, há relatos do envolvimento de diferentes citocinas

produzidas por células Th17 como a IL-21 (Ansari et al., 2011) e a IL-22, além da IL-

17A (Pitta et al., 2009), na leishmaniose visceral (Pitta et al., 2009; Ansari et al.,2011).

No entanto, a função exata que desempenham na LV parece ser dependente em grande

parte das espécies de parasitos e da genética do hospedeiro (Bhattacharya & Ali, 2013).

A medida que as pesquisas que buscam classificar o perfil da resposta imune

desenvolvida na LV clássica avançam, mais evidências surgem que a IL-10 é a principal

citocina que contribui para a patogênese da LV humana, estando associada com a

gravidade da doença (Holaday et al., 1993; Caldas et al., 2005; Kurkjian et al., 2006;

Nylen & Sacks, 2007; Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012). Por outro lado, surgem

controvérsias sobre o papel desempenhado pela IL-4 durante a LV clássica, uma vez

que estudos demonstraram níveis baixos da citocina em áreas nodais e portal de lesões

hepáticas, bem como, no soro de pacientes (Ansari et al., 2006), contradizendo estudos

que sugeriram aumento de IL-4 durante a doença (Peruhype-Magalhaes et al., 2005).

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Introdução

34

A IL- 10 é uma citocina anti-inflamatória/moduladora produzida por células T,

monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, entre outras ( Buxbaum & Scott,

2005) e tem como principal função, inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-

1, IL-6, IL-12 e TNF-α por macrófagos e células dendríticas (Imada & Leonard, 2000)

e, portanto, diminui a expansão das células do tipo Th1 necessárias para imunidade

protetora durante a infecção por Leishmania spp. (Thomas & Buxbaum, 2008;

Castellano et al., 2009). A IL-10 então seria a principal citocina envolvida na regulação

da resposta imune na infecção por Leishmania spp. e o principal mecanismo regulador

envolvido, seria o efeito desativador de macrófagos (Carvalho et al., 1994).

A IL-10 está relacionada com a redução direta na ativação de células T e/ou um

efeito inibidor das células do sistema monofagocitário, participando do processo de

supressão da resposta imune protetora (Holaday et al., 1993; Caldas et al., 2005;

Kurkjian et al., 2006; Nylen & Sacks, 2007; Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012).

Nesse contexto, a associação entre níveis elevados de IL-10 e estágio avançado da

doença vem sendo documentado em pacientes com LV ( Lagler et al., 2003; Hailu et al.,

2004; Caldas et al ., 2005; Hailu et al ., 2005; Peruhype-Magalhaes et al., 2005; Ansari

et al., 2006; Ghosh et al., 2006; Kurkjian et al., 2006; Saha et al., 2007; Chandra &

Naik, 2008; Khoshdel et al., 2009; Mondal et al., 2010; Gautam et al., 2011; Kushawaha

et al., 2011; Nandan et al., 2012; Singh et al., 2012). Além disso, a IL-10 também

promove a ativação, sobrevivência e a produção de anticorpos por células B e o

desenvolvimento de resposta imune humoral que desempenha papel prejudicial na

defesa do hospedeiro contra a infecção por Leishmania spp. por facilitar a entrada dos

parasitos nas células hospedeiras (Buxbaum, 2008). Assim, considerando-se que a IL-10

desempenha papel importante na supressão da resposta imune, esta citocina torna-se um

importante alvo terapêutico para a LV humana (Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012).

A forma clínica assintomática foi caracterizada pela presença de resposta

proliferativa e elevada produção de IFN-γ em diferentes estudos (Carvalho et al., 1992;

Holaday et al., 1993 e Costa et al.,1999).

Em estudos mais recentes, Peruhype-Magalhães et al (2005), ao analisar o perfil

de citocinas produzido por células da imunidade inata de indivíduos assintomáticos,

após estimulação antigênica demonstrou aumento da produção de IFN-γ, IL-12, IL-4,

IL-10 e IL-5, sugerindo assim que os indivíduos assintomáticos apresentam perfil

misto/balanceado de citocina (Tipo 1/Tipo 2). Esse perfil misto/balanceado é importante

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Introdução

35

não só para controlar a replicação do parasito, mas também para a manutenção do

estado imunológico destes indivíduos, estando relacionado com o desenvolvimento de

mecanismos antiparasitários eficazes que garantem a proteção e a ausência de sinais e

sintomas da doença .

Carvalho et al. (2003), também tem caracterizado a forma clínica assintomática

imunologicamente pela presença de resposta imune mista/balanceada (Tipo 1/Tipo 2).

Assim, enquanto a imunidade celular (tipo 1) é importante para a eliminação efetiva do

parasito, a modulação dessa resposta através do estabelecimento da imunidade do tipo 2

é igualmente importante, a fim de assegurar a preservação da homeostase imune,

bloqueando uma resposta celular exacerbada. A IL-10 é o principal imunomodulador,

atenuando a resposta celular do hospedeiro e favorecendo o controle da resposta imune

após a eliminação do parasito. Já a citocina IL-5 parece ser importante no controle da

infecção por L. infantum pois alguns trabalhos tem mostrado que a citocina promove a

diferenciação e ativação de eosinófilos e aumenta a produção e ativação de linfócitos T

citotóxicos específicos (Nagasawa et al., 1991; Peruhype-Magalhães et al., 2005).

Por outro lado, estudos avaliando o perfil de citocinas séricas ou plasmáticas

demonstraram que indivíduos com infecção assintomática apresentam perfil basal de

citocinas, semelhante a indivíduos não infectados (Peruhype-Magalhães et al., 2006;

Khoshdel et al., 2009; Costa et al., 2012).

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2.0 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

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Justificativa e Relevância

37

A LV apresenta grande importância médica e social devido à sua gravidade e à

alta taxa de letalidade. No Brasil, é considerada endêmica em várias regiões e encontra-

se em franca expansão em várias áreas urbanas, periurbanas e rurais.

Nestas regiões endêmicas, observa-se que o número de indivíduos que abrigam

temporariamente e silenciosamente, o parasito, corresponde à maioria dos infectados,

podendo a prevalência da infecção assintomática servir como indicador da extensão e

manutenção de transmissão do parasito. Assim é de extrema importância identificar a

infecção assintomática visando monitorar as áreas endêmicas para direcionar melhor as

ações de controle. Porém os métodos de diagnóstico desenvolvidos, não apresentam o

mesmo desempenho e eficiência para identificação da LV assintomática e poucos

estudos têm sido direcionados a esta forma clínica.

Nesse contexto, análises detalhadas, considerando simultaneamente a avaliação

da maturação dos anticorpos IgG, em termos de avidez em crianças com infecção

assintomática, bem como, o estudo do perfil sérico da quimiocina CXCL-8, de

citocinas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias/moduladoras e da IL-17A podem ser

úteis na identificação de biomarcadores que possam ter potencial aplicação para auxiliar

na detecção desta forma clínica da LV. Além disso, o entendimento e identificação de

fatores que levam à infecção assintomática poderão fornecer informações importantes

para a compreensão da evolução da doença, provocada por L. infantum. E não podemos

deixar de destacar que esse tipo de abordagem, especificamente em crianças, não tem

sido elaborada e restam várias questões a serem elucidadas.

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3.0 OBJETIVO

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Objetivo

39

3.1 Objetivo geral

Avaliar biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática

por L.infantum.

3.2 Objetivos específicos

Selecionar, por meio dos ensaios de ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR, crianças

com infecção assintomática por L. infantum;

Determinar o perfil de avidez de anticorpos IgG em crianças com LV

assintomática e LV clássica;

Correlacionar as taxas de avidez de anticorpos IgG com a evolução da infecção

em crianças com LV clássica;

Correlacionar o índice de reatividade do ELISA-rK39 e a taxa de avidez de

anticorpos IgG em crianças com LV assintomática e LV clássica e avaliar a

potencial aplicação como marcador sorológico indicativo de infecção recente ou

não;

Avaliar o perfil sérico da quimiocina CXCL-8, de citocinas pró-inflamatórias,

anti-inflamatórias/moduladoras e da IL-17A em crianças com infecção

assintomática por L. infantum;

Identificar biomarcadores imunológicos úteis para a compreensão dos fatores

que determinam o curso da infecção por L. infantum e que possam ter potencial

aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática.

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4.0 METODOLOGIA

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Metodologia

41

4.1 Seleção da população de estudo

Um estudo coorte está sendo realizado desde 2009 para avaliação do Programa

de Controle da LV na Regional Noroeste de Belo Horizonte (Fig. 1). Como parte desse

trabalho, foi realizado um estudo transversal em 2012 com o objetivo de avaliar a

prevalência da infecção assintomática por L.infantum, a resposta imune do grupo de

assintomáticos e elucidar os fatores de risco individuais e de contexto, relacionados à

infecção por L. infantum em uma amostra de crianças com idades entre 0 a 10 anos,

residentes em três áreas de abrangência da Regional Noroeste de Belo Horizonte

(Serrano, Pindorama e Glória) que apresentam tempos diferentes de evolução e histórico

de controle da doença.

O tamanho da amostra para calcular a prevalência no estudo transversal, foi

estimado com base nos seguintes parâmetros: (1) prevalência média da infecção humana

de 15/100 em crianças menores de 5 anos obtido em um estudo realizado em Belo

Figura 1: Belo Horizonte de acordo

com as regiões administrativas. Fonte:

PBH, 2014.

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Metodologia

42

Horizonte -MG (dos Santos Marques et al.; 2012); (2) erro α=0,05; (3) efeito

desenho=1,5. O valor estimado foi de 294 crianças em cada área a ser avaliada,

totalizando aproximadamente 900 crianças.

Portanto, para a realização do estudo transversal uma amostra de 937 crianças foi

selecionada, sendo incluídas crianças que foram resgatadas no estudo transversal

realizado em 2009-2010, que apresentavam resultados negativos em todos os testes

realizados: ELISA-AgT, ELISA-rK39, DAT e qPCR e crianças, que participaram do

estudo pela primeira vez, sendo selecionadas aleatoriamente, utilizando o arquivo de

dados do Programa de Saúde da Família da Região Noroeste (Fig. 2).

A coleta de dados e das amostras foi realizada nas residências das crianças

selecionadas, após leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido,

por um dos pais ou responsável. Foi coletado sangue periférico por punção digital

absorvidas em papel filtro de 317 crianças residentes da região Pindorama, 328 crianças

residentes da região Glória e 292 crianças residentes da região Serrano. No momento da

coleta, realizou-se uma entrevista com um dos pais ou responsável para identificação de

fatores associados a infecção por L. infantum, utilizando-se um questionário

padronizado. As amostras foram submetidas a exames sorológicos (ELISA-AgT e

ELISA-rK39). Nessa avaliação, 209 crianças apresentaram resultado positivo em pelo

menos um dos testes sorológicos (Fig. 2).

Para o desenvolvimento deste estudo no ano de 2013 (doze meses após a

realização da primeira coleta realizada durante o estudo transversal de 2012), os pais ou

os responsáveis das 209 crianças que apresentaram resultado positivo em pelo menos

um dos testes sorológicos (ELISA-AgT e ELISA-rK39) foram convidados a participar

desta nova etapa da pesquisa, onde as crianças foram submetidas a uma nova coleta de

amostra biológica e a realização de exame clínico (Fig. 2).

Assim, foi coletado sangue periférico por punção venosa de 141 crianças que

apresentaram diagnóstico positivo em pelo menos um dos testes sorológicos realizados

(ELISA-AgT e ELISA-rK39), sendo que 68 crianças não foram encontras ou os seus

responsáveis não aceitaram participar desta nova etapa de coleta (Fig. 2).

Foram também incluídas neste estudo 35 crianças que apresentaram diagnóstico

negativo nos dois testes sorológicos (ELISA-AgT e ELISA-rK39) realizados durante o

estudo transversal e 3 crianças que não participaram do estudo transversal e estão

participando da pesquisa pela primeira vez. Assim, foi coletado sangue periférico por

punção venosa de 179 crianças (Fig. 2).

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Metodologia

43

4.2 Coleta de dados e das amostras

Os objetivos da pesquisa foram explicados previamente por telefone ao

responsável pela criança selecionada. Caso houvesse interesse do responsável permitir a

participação do menor sob sua responsabilidade, este foi convidado a comparecer nos

respectivos centros de saúde de cada área de abrangência com a criança onde esta foi

examinada por um médico pediatra e submetida ao procedimento de coleta de sangue

por punção venosa realizado por um profissional de saúde qualificado. Novamente um

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (anexo 1), foi lido e assinado por

um dos pais ou responsáveis pela criança antes da realização da coleta do sangue. De

acordo com o protocolo do estudo, a criança que por ventura apresentasse sintomas

clínicos da LV, seria encaminhada para realização de exames preconizados pelo

Ministério da Saúde para o diagnóstico da doença e para a realização do tratamento caso

fosse confirmada a infecção.

Figura 2: Fluxograma da seleção da população de estudo.

ELISA - AgT

728 crianças com resultado

negativo em todos os testes

sorológicos

35 crianças com resultado

negativo em todos os testes

sorológicos

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Metodologia

44

As amostras de sangue periférico que foram coletadas em tubos sem

anticoagulante, foram posteriormente centrifugadas a 3000 x g durante 15 minutos a

25°C, para se obter o soro, que foi alíquotado e mantido a -70°C até a realização dos

experimentos. Já as amostras de sangue periférico coletadas em tubos contendo EDTA,

foram somente aliquotadas e mantidas a -70°C, até o momento de uso.

4.3 Fluxograma metodológico

A partir das amostras de sangue periférico coletadas foram realizados os testes

sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e o ensaio molecular de qPCR, para

selecionar as crianças com infecção assintomática (Fig. 3).

O perfil imunológico do grupo de crianças com infecção assintomática foi

determinado através da comparação com um grupo controle negativo e um grupo

controle positivo. Sendo assim, das 179 crianças que compareceram para a coleta de

sangue periférico, aquelas que apresentaram diagnóstico positivo em qualquer um dos

testes realizados (ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR) foram diagnosticadas com

infecção assintomática, sendo incluídas no Grupo de Estudo (AS) deste trabalho (Fig.

3). As crianças que apresentaram diagnóstico negativo em todos os testes realizados

(ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR) foram incluídas no Grupo Controle Negativo

(CN). Como Grupo Controle Positivo (LVC), foram usadas 43 amostras de soro

coletadas de crianças também com idades entre 0 a 10 anos, com LV clássica,

diagnosticadas e acompanhadas no Hospital Infantil João Paulo II, e que pertencem ao

biorrepositório do Laboratório de Pesquisas Clínicas (CPqRR/FIOCRUZ-MG). Estas

amostras também foram submetidas ao teste de ELISA-AgT e ELISA-rK39. Dos 43

pacientes selecionados apenas 19 possuíam amostras de sangue total que foram

submetidas ao ensaio molecular de qPCR (Fig. 3).

Para avaliar o perfil imunológico dos diferentes grupos de estudo foi realizada a

quantificação dos níveis séricos de citocinas por citometria de fluxo (Fig. 3).

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Metodologia

45

Para determinar o perfil de avidez de anticorpos IgG do Grupo de Estudo (AS) e

do Grupo Controle Positivo (LVC) amostras de soro que apresentaram resultado

positivo para o teste de ELISA-rK39 foram submetidas ao teste de avidez com

tratamento por agente caotropico.

4.4 Ensaio imunoenzimático de ELISA-AgT e ELISA-rK39

Microplacas de poliestireno (Nunc-maxi sorp) foram sensibilizadas durante 18

horas em geladeira (2-8ºC), com 50μL de antígeno solúvel (MHOM/BR/2002/LPC-

RPV) produzido e cedido pelo laboratório de Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas

René Rachou (FIOCRUZ/MG), a partir de promastigotas de L. infantum , segundo Ho

et al. (1983) e Pedras et al. (2008), diluídos numa concentração de 3g/mL em tampão

carbonato/bicarbonato, pH 9,6 ou com 50µL de antígeno recombinante K39, produzido

e cedido pelo Infectious Disease Research Institute, Seattle, WA, USA, diluído também

em tampão carbonato/bicarbonato, pH 9,6, numa concentração de 1g/mL. Em seguida,

as microplacas foram lavadas quatro vezes com 300µL de salina tamponada com

fosfatos contendo Tween-20 a 0,05% (STF-T) por orifício e foram adicionados 200µL

de solução STF-T acrescida de 5% de leite em pó desnatado (STF-T-Leite 5%) em

todos os orifícios das microplacas, que foram novamente incubadas por 2 horas em

Figura 3: Fluxograma metodológico.

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Metodologia

46

câmara úmida a 37ºC. Após a incubação, as microplacas foram lavadas novamente

quatro vezes, embaladas e armazenadas a -20ºC, até o momento de uso.

Para realização do ensaio imunoenzimático, foram depositados, em duplicata,

nos orifícios das microplacas 50µL de soro diluído 1/1.000 (para o teste de ELISA-

AgT) ou 1/100 (para o teste de ELISA-rK39), em solução STF-T-Leite 1%, que foram

incubadas por uma hora em câmara úmida a 37ºC. Após novas lavagens, foram

adicionados 50µL do conjugado (anticorpo anti-IgG humano ligado à peroxidase,

Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) diluído a 1/10.000 (para o teste de ELISA-

AgT) ou 1/50.000 (para o teste de ELISA-rK39) em solução de STF-T-Leite 1% e as

microplacas foram incubadas por uma hora em câmara úmida a 37º C. Em seguida, as

microplacas foram lavadas novamente e foram adicionados 50µL de mistura

cromogênica (Tetrametilbenzidina+Peróxido de Hidrogênio, Sigma-Aldrich, Saint

Louis, Missouri, USA). As microplacas foram incubadas por 5 minutos ao abrigo da luz

e foram aplicados 50µL de solução de ácido sulfúrico 1N em cada poço. As leituras de

absorbância foram realizadas no leitor de microplaca (Modelo 550, BioRad, Ja)

utilizando o comprimento de onda de 450 nm.

O ponto de corte (cut-off) foi definido diariamente pela média das leituras de

absorbância de 15 amostras negativas somado a três desvios-padrão. Como controle

positivo, foi ensaiada, também em duplicada, uma amostra positiva. O resultado de cada

paciente foi expresso em índice de reatividade, que correspondente à média dos valores

das leituras de absorbância da duplicata dividida pelo ponto de corte diário de cada

ensaio, sendo consideradas positivas somente aquelas amostras que apresentaram um

índice maior do que 1.1.

Os títulos do conjugado (IgG humano ligado a peroxidase) de 1/10.000 usado

para o teste de ELISA-AgT e 1/50.000 usado para o teste de ELISA-rK39, foram

determinados por meio de titulação em bloco usando os títulos de 1:10.000, 1:20.000,

1:30.000 para o teste de ELISA-AgT e 1:30.000, 1:50.000, 1:80.000 para o teste de

ELISA-rK39 no ensaio de seis amostras de pacientes com LV clássica (controles

positivos) e 10 amostras de indivíduos saudáveis (controles negativos).

4.5 Teste de avidez

A avidez de anticorpos IgG foi avaliada pela técnica de ELISA. Portanto, para a

execução dos testes, microplacas que foram sensibilizadas com 50µL de antígeno

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Metodologia

47

recombinante K39, produzido e cedido pelo Infectious Disease Research Institute,

Seattle, WA, USA, diluído em tampão carbonato/bicarbonato, pH 9,6, numa

concentração de 1g/mL, como descrito anteriormente, foram incubadas por uma hora

em câmara úmida a 37°C contendo 50µL de soro diluído 1/100, em solução STF-T-

Leite 1%. Cada amostra de soro foi depositada em quatro orifícios da placa.

Previamente à adição do conjugado, o soro foi desprezado e foram depositados

300µL de solução de uréia a 6M diluída em STF-T na duplicata de cada amostra. Logo

após, as microplacas foram incubadas por cinco minutos em temperatura ambiente. Em

seguida, os poços que foram incubados com solução de uréia a 6M diluída em STF-T

foram lavados três vezes com 300µL de STF-T e as duplicatas das mesmas amostras

que não receberam o tratamento foram lavados quatro vezes. Após a lavagem, foram

adicionados 50µL do conjugado (anticorpo anti-IgG humano ligado a peroxidase -

Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) diluído a 1/30.000, em solução de STF-T-

Leite 1% e, as etapas restantes do ensaio, foram desenvolvidas como descrito

anteriormente.

O ponto de corte (cut-off) foi definido diariamente pela média das leituras de

absorbância de 15 amostras negativas aplicadas em duplicata somado a três desvios-

padrão. Como controle positivo, foi ensaiada, uma amostra positiva, também aplicada

em duplicata. Tais amostras não foram tratadas com a solução de uréia a 6M diluída em

STF-T.

O índice de reatividade de cada amostra que corresponde à média dos valores

das leituras de absorbância da duplicata não tratada com úreia dividida pelo ponto de

corte diário de cada ensaio, foi calculado.

Os resultados expressos em taxa de avidez (TA), foram determinados pela razão

entre os valores da densidade óptica das amostras tratadas com uréia (U+) e a densidade

óptica das amostras não tratadas (U-) e expresso em porcentagem ([TA = U+/U- x

100]), sendo arbitrariamente definidos que: TA menor que 40% é considerado de baixa

avidez, entre 41 e 70%, é considerado de média avidez e maior que 70%, é considerado

de alta avidez (de Souza et al., 2005).

O titulo do conjugado (IgG humano ligado a peroxidase) de 1/30.000, foi

determinado por meio de titulação em bloco usando os títulos de 1:10.000, 1:30.000 e

1:50.000 no ensaio de seis amostras de pacientes com LV clássica (controles positivos)

e 10 amostras de indivíduos saudáveis (controles negativos).

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Metodologia

48

4.6 Ensaios de qPCR

4.6.1 Extração de DNA

As amostras de sangue periférico, coletadas em tubos contendo o anticoagulante

EDTA, foram descongeladas e homogeneizadas por inversão por 20 minutos. O DNA

total foi extraído por meio do equipamento Maxwell ®

16 Instrument (Promega,

Madison, Wisconsin, USA), utilizando o Kit para extração de DNA: Maxwell® 16 Lev

Blood DNA Kit (Promega, Madison, Wisconsin, USA), seguindo o protocolo do

fabricante.

4.6.2 PCR quantitativo em tempo real

O ensaio molecular de qPCR foi utilizado como um método de diagnóstico, por

detectar a presença do DNA do parasito em amostras clínicas. Nesse ensaio foram

utilizados os iniciadores senso (5`AAGTGCTTTCCCATCGCAACT – 3`) e o antisenso

(5`GACGCACTAAACCCCTCCAA – 3`) que amplificam um fragmento de 67 pares

de bases do gene da pequena subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de

Leishmania spp. (van Eys et al., 1992).

A reação foi preparada, em duplicata, para um volume final de 20µL, contendo

3µL do DNA, diluído 1:10 em água, 0,3μM dos iniciadores senso e antisenso, 0,25μM

da sonda TaqMan®, (FAM 5`- CGGTTCGGTGTGTGGCGCC –3` TAMRA)

(Wortmann et al., 2001) e 10µL de TaqMan® MasterMix (Roche, Branchburg, New

Jersey, USA). O programa de amplificação utilizado apresenta as seguintes etapas:

50°C por 2 minutos para a ativação da enzima UDG, 95ºC por 10 minutos, seguido de

40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto.

Como controle interno dos procedimentos de extração de DNA e de

amplificação foi realizada outra reação, onde 3µL do DNA extraído diluído 1:10 em

água estéril, juntamente com os iniciadores Aco1 e Aco2 (Musso et al., 1996) a uma

concentração de 0,15μM e ao SYBR Green MasterMix (Life Technologies, Warrington,

UK) a uma concentração de 1x, foram utilizados com o objetivo de amplificar o gene

humano da β-actina (ACTB), gerando fragmentos de 120pb. O volume final presente

na reação foi de 20µL e todas as amostras foram também avaliadas em duplicata. Foram

utilizados parâmetros universais para amplificação e em cada reação, para confirmar a

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Metodologia

49

especificidade do ensaio, uma análise final da curva de fusão foi realizado. A

temperatura de fusão dos produtos de amplificação foi determinado automaticamente

por análise de software.

Em cada ensaio foi incluído um controle negativo, que consite na mistura da

reação e água em vez de DNA. Além disso, foram realizados ensaios específicos para a

amplificação do gene da pequena subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de

Leishmania spp. e do gene ACTB para a avaliação dos controles negativos das

extrações.

Ao longo dos ensaios para a amplificação do gene da pequena subunidade do

RNA ribossomal (SSU rRNA) de Leishmania spp. uma amostra de DNA extraída de

sangue periférico de um paciente com LV clássica, foi ensaiada sendo considerada

controle positivo da reação. O equipamento utilizado na realização dos ensaios foi o

modelo StepOne plus (Life Technologies, Warrington, UK).

4.7 Avaliação do perfil sérico de citocinas

4.7.1 Quantificação dos níveis séricos de citocinas por citometria de fluxo

Para a determinação dos níveis séricos de citocinas, 150µL do soro de cada

indivíduo foram centrifugados a 14.000 rpm durante 10 minutos a 18°C e 50µL da

porção central da amostra (na região entre o sedimento e a gordura) foi alíquotada e

mantida a -20°C até a realização dos experimentos. Os níveis séricos de citocinas foram

quantificados utilizando-se o sistema Cytometric Bead Array (CBA), Becton

Dickinson-BD (San Diego, California, USA), que emprega uma mistura de seis a sete

esferas de poliestireno (dependendo do Kit utilizado), de intensidades de fluorescência

discretas e distintas, recobertas com anticorpos específicos para as citocinas humanas.

Essa metodologia permite a avaliação simultânea de diversas citocinas no mesmo

ensaio, empregando pequenos volumes de amostra.

Assim, alíquotas de 25µL de soro teste, dos padrões de citocinas, submetidos a

diluição seriada com diluente G (reagente presente no kit CBA) (“Top Standart” –

5000pg/mL, 1:2 – 2500pg/mL, 1:4 – 1250pg/mL, 1:8 – 625pg/mL, 1:16 – 312,5pg/mL,

1:32 – 156pg/mL, 1:64 – 80pg/mL, 1:128 – 40pg/mL e 1:256 – 20pg/mL) e 25µL de

diluente G apenas (Controle Negativo), foram transferidas para tubos de poliestireno de

5mL (Falcon n° 2052). Em seguida, a cada tubo foram adicionados 17,5µL da mistura

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Metodologia

50

de esferas de captura, conjugadas com anticorpos monoclonais anti-IL-2, IL-4, IL-6, IL-

10, TNF, IFN- e IL-17 (para o Human Th1/Th2/Th17 Cytokine CBA Kit) e 20µL do

reagente B (reagente presente no kit CBA), que corresponde a um coquetel de

anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas, conjugados com o fluorocromo

ficoeritrina (PE) ou 15µL da mistura de esferas de captura, conjugadas com anticorpos

monoclonais anti-IL-1β, IL-6, CXCL-8, IL-10, IL-12p70 e TNF (para o Human

Inflammation CBA Kit) e 18µL do reagente B, citado acima, com subsequente

homogeneização e incubação por 3 horas, à temperatura ambiente, ao abrigo da luz.

Após a incubação, foram adicionados a cada tubo 500µL da solução F (tampão de

lavagem, reagente presente no kit CBA), seguido de centrifugação a 1.500 rpm, por 10

minutos a 18°C. Após centrifugação, foram aspirados aproximadamente 280µL do

sobrenadante de cada tubo. As esferas de captura foram então ressuspendidas no vortex

e as amostras foram imediatamente analizadas em citômetro de fluxo.

4.7.2 Aquisição e análise dos dados de avaliação dos níveis séricos de

citocinas

A aquisição dos dados obtidos foi realizada no citômetro de fluxo LSR Fortessa®

(BD), através da utilização do “BD CBA Template”. As esferas fluorescentes presentes

no kit CBA são projetadas para serem excitadas com o “Laser Vermelho”, filtro de

detecção 660/20. Já os anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas usados na

revelação estavam conjugados ao fluorocromo PE, excitado com o “Laser Azul”, filtro

de detecção 575/26. Após as etapas de marcação, um total de 3.000 eventos/região (R1)

foram obtidos com base em gráficos de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC)

para cada citocina avaliada pelo método. Para a análise dos dados, inicialmente as

microesferas conjugadas com anticorpos monoclonais de captura correspondentes a

cada citocina, foram segregadas em gráficos de distribuição pontual de microesferas

marcadas x PE, onde as seis/sete esferas com intensidades de fluorescência distintas

ocuparam posições específicas ao longo do eixo Y. A análise do deslocamento das

esferas ao longo do eixo X foi empregada como variável proporcional à concentração de

cada citocina presente na amostra (Fig. 4).

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Metodologia

51

Figura 4: Plataforma de esferas no sistema CBA. (A) Discriminação das microesferas

conjugadas com anticorpos monoclonais de captura anti-citocinas, posicionadas em

regiões específicas ao longo do eixo Y (APC-A) em gráficos de distribuição puntual PE-

A versus APC-A. (B) Deslocamento das microesferas, ao longo do eixo X (PE-A) em

gráficos de distribuição puntual PE-A versus APC-A, indicativo da concentração de

cada citocina presente nas amostras testes em análise.

Para a obtenção dos resultados da análise quantitativa de citocinas séricas, uma

curva padrão foi construída utilizando os dados dos padrões de citocinas em

concentrações conhecidas (20pg/mL – 5000pg/mL) e empregada para determinar as

concentrações de cada citocina no soro teste. Um modelo de ajustamento através da

curva do 5º parâmetro logístico, que permite o ajuste da melhor curva não linear para

dados detectáveis, foi utilizado. Dessa forma, foi possível extrapolar valores de

intensidades de fluorescência de amostras que não caíram dentro dos limites da curva

padrão. Para análise dos dados foi utilizado o software BD FCAP.

4.8 Análise dos dados

4.8.1 Análises descritivas dos dados

As análises estatísticas para avaliação do perfil sérico de citocinas foram

realizadas com auxílio do software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad San Diego, CA,

EUA). O teste de normalidade para os resultados de dosagem de citocinas indicou

A B

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Metodologia

52

distribuição não paramétrica dos dados. Dessa forma, aplicou-se o teste Kruskal-Wallis,

seguido do teste de comparações múltiplas Dunn´s.

O teste de normalidade foi realizado com os resultados dos índices de

reatividade do ELISA-rK39 (IR-rK39) e as taxas de avidez, que indicou distribuição

paramétrica dos dados. Assim, o teste de Pearson foi realizado para verificar correlações

entre os IR-rK39 e as taxas de avidez em crianças do Grupo de Estudo (AS) e do Grupo

Controle Positivo (LVC). O teste de Person também foi realizado para verificar

correlações entre as taxas de avidez e o tempo de sintomas quando internados dos

pacientes com LV clássica.

As diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando p <

0,05.

4.8.2 Categorização das variáveis para análise multivariada

As distribuições das variáveis no Grupo Controle Negativo (CN) foram

utilizadas para a categorização. As regras para a categorização de cada variável estão

demonstradas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Regras para a categorização de cada variável.

Variável/Categoria 0 1 2 3

(> mínimo) (>1º Quartil) (> Mediana) (>3º Quartil)

Índice de Reatividade

ELISA-AgT (IR-AgT) 0 0,44 0,57 0,75

Índice de Reatividade

ELISA-rK39 (IR-rK39) 0 0,53 0,59 0,79

Taxa de Avidez (TA) 0 44,79 58,87 69,04

IL-17A 0 0,1 2,69 5,71

IFN- 0 0,1 0,39 1,28

IL-4 0 0,1 0,18 0,71

IL-2 0 0,1 0,8 1,4

IL-12p70 0 0,84 2,24 4,69

TNF 0 0,01 0,1 0,33

IL-10 0 1,52 2,85 6,07

IL-6 0 1,75 3,41 6,22

IL-1 0 0,01 0,1 0,55

IL-8 0 7,3 13,21 21,67

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Metodologia

53

4.8.3 Análise de regressão logística

Com o propósito de analisar a relação entre duas ou mais variáveis

independentes, numéricas ou categóricas e, variável resposta categórica, por meio de

modelos matemáticos, empregou-se a análise de regressão. Foram utilizadas as análises

de regressão binária ou binomial quando a variável resposta apresentou dois níveis de

codificação e multinomial quando a variável resposta apresentou mais de dois níveis de

codificação.

Assumindo que a variável resposta tivesse distribuição de probabilidade

binomial 𝑌𝑖~𝐵(𝑚𝑖, 𝜋𝑖) , tal que 𝑃(𝑌𝑖 = 𝑦𝑖) = (𝑚𝑖𝑦𝑖

) 𝜋𝑖𝑦𝑖(1 − 𝜋𝑖)

𝑚𝑖−𝑦𝑖 , foi utilizada a

função de ligação logito 𝑙𝑛 (𝜋𝑖

1− 𝜋𝑖) = 𝛽0 + 𝛽𝑖𝑥𝑖. O método da máxima verossimilhança

foi usado para estimativa dos parâmetros 𝛽0 𝑒 𝛽𝑖.

A interpretação dos parâmetros 𝛽0 𝑒 𝛽𝑖 do modelo de regressão logística foi

obtida comparando-se a probabilidade de sucesso com a probabilidade de fracasso,

usando a função odds ratio - OR (razão de chances). Essa função, obtida a partir da

razão entre essas duas probabilidades, foi representada pela equação: OR = g(x) =

𝜋(𝑥)𝑖

1− 𝜋(𝑥)𝑖 = 𝑒𝛽0+ 𝛽𝑖𝑥𝑖 .

As relações entre variáveis seguiram as seguintes orientações: para 𝛽𝑖 > 0, OR

foi considerada maior que 1 (OR > 1) e para 𝛽𝑖 < 0, OR foi considerada menor que 1

(OR < 1).

Posteriormente à estimativa dos coeficientes, a significância das variáveis no

modelo foi avaliada pelos testes de Wald e da Razão da Verossimilhança e a seleção das

variáveis seguiu o método Stepwise. O teste de Wald, obtido por comparação entre a

estimativa de máxima verossimilhança do parâmetro 𝛽𝑖 e a estimativa de seu erro

padrão, foi utilizado para seleção de variáveis quando a probabilidade foi menor que

0,25 (p < 0,25). A estatística do teste Wald, sob a hipótese nula 𝐻0: 𝛽𝑖 = 0 , tem

distribuição normal padrão.

O teste da Razão da Verossimilhança (G) comparou os valores da estatística

Deviance (D) com e sem a variável selecionada no modelo, conforme a descrição: G =

D(modelo sem a variável) – D(modelo com a variável). Sob a hipótese nula 𝐻0: 𝛽𝑖 = 0,

a estatística G, que tem distribuição qui-quadrado com 1 grau de liberdade, foi utilizada

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Metodologia

54

para definição das variáveis do modelo final quando a probabilidade foi menor que 0,05

(p < 0,05).

4.8.4 Análise discriminante

Com o objetivo de classificar os elementos da amostra foi utilizada a análise

discriminante, um método estatístico que permite a construção de uma regra matemática

de classificação ou discriminação, fundamentada na teoria das probabilidades. Para sua

aplicação, os grupos foram definidos a priori, considerando-se suas características

gerais. A técnica aferiu as medidas das “p-variáveis” previamente selecionadas pelo

modelo de regressão logística e estabeleceu uma regra para classificação de novos

elementos nos dois grupos estudados, com o menor erro de decisão possível.

O princípio da máxima verossimilhança foi utilizado para construção da regra de

classificação e a qualidade da discriminação relacionou-se ao grau de intersecção entre

as duas distribuições de probabilidades. Assim, a razão de verossimelhança:γ (x) =

𝑓𝑢𝑛çã𝑜 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑥 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 1

𝑓𝑢𝑛çã𝑜 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑥 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 2 =

𝑓1(𝑥)

𝑓2(𝑥), estava relacionada com a diferença das

distâncias euclidianas ponderadas ao quadrado de x a 𝜇1 e x a 𝜇2 , sendo o fator de

ponderação igual ao inverso da variância 𝜎2 . Quando γ (x) > 1, x foi classificado no

grupo 1 porque se localizava mais próximo de 𝜇1. Quando γ < 1, x foi classificado no

grupo 2 porque se localizava mais próximo de 𝜇2.

A avaliação da qualidade do ajuste da regra de discriminação foi feita através da

estatística de teste de Hotelling (H) para dois grupos independentes. Sob a hipótese de

normalidade multivariada, a estatística H tem distribuição F com p e (n1 + n2 – p – 1)

graus de liberdade. Assim, para o nível α = 0,05, a hipótese de igualdade das médias foi

rejeitada quando o valor da estatística F foi maior que o valor crítico tabelado.

4.8.5 Árvores de classificação

Para maior aplicabilidade e praticidade dos modelos estatísticos preditivos, a

árvore de classificação e regressão (CART), uma abordagem não-paramétrica que

utiliza classificação (quando a variável resposta assume valores categóricos), quanto à

regressão (quando a variável resposta assume valores contínuos) das variáveis, foi

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Metodologia

55

utilizada para subdividir o conjunto de dados em grupos mais homogêneos em relação à

probabilidade do desfecho que está sendo avaliado.

A partir das variáveis selecionadas pelo modelo de regressão logística, CART

realizou uma partição recursiva binária a partir do conjunto inteiro, denominado nó

principal ou raiz, em subconjuntos cada vez mais homogêneos. Os critérios de seleção

para a melhor divisão foram baseados na maior homogeneidade ou menor grau de

impureza dos subconjuntos. Este grau de impureza que foi definido pela estatística

Deviance (D). Com base nessas medidas, o algoritmo realizou pesquisa para todas as

variáveis e selecionou a variável que promoveu a melhor divisão em termos de gerar

grupos mais homogêneos em relação à probabilidade do desfecho. Após alcance de

equilíbrio entre grau de homogeneidade em uma amostra específica e taxa de

classificação correta do modelo quando aplicado a um novo conjunto de dados, a árvore

foi podada e a acurácia na classificação do conjunto de dados foi determinada.

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5.0 RESULTADOS

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Resultados

57

5.1 Seleção por meio dos testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e do

ensaio molecular de qPCR de crianças com infecção assintomática por L.

infantum

As 179 amostras de sangue periférico coletadas por punção venosa foram

submetidas aos testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e ao ensaio molecular

de qPCR, com o intuito de selecionar as crianças com infecção assintomática por L.

infantum. Pelo teste de ELISA-AgT foram diagnosticadas 30 amostras positivas,

enquanto que para o ensaio de ELISA-rK39 foram diagnosticadas 44 amostras

positivas, sendo que um total de 64 amostras foram positivas em pelo menos um dos

testes realizados (Tab. 2). Já pelo ensaio molecular de qPCR foram diagnosticadas 24

amostras positivas (Tab. 2).

Tabela 2: Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos (ELISA-

AgT e ELISA-rK39) e pelo ensaio molecular (qPCR) realizados.

Positivas Negativas

ELISA – AgT 30 149

ELISA – rK39 44 135

ELISA – AgT e/ou ELISA – rK39 64*

115

qPCR 24 155

*10 amostras foram positivas nos dois testes sorológicos simultaneamente.

Observou-se que algumas amostras foram positivas em mais de um teste de

diagnóstico. Sendo 10 amostras diagnosticadas positivas simultaneamente nos dois

testes sorológicos realizados e apenas 7 amostras foram positivas em pelo menos um

dos testes sorológicos e pelo ensaio molecular de qPCR simultaneamente (Fig. 5).

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Resultados

58

Figura 5: Associação entre resultados positivos para infecção assintomática por L.

infantum de acordo com os testes sorológicos (ELISA-AgT e ELISA-rK39) e a qPCR.

Sendo assim, das 179 crianças avaliadas no estudo, 81 crianças apresentaram

diagnóstico positivo em qualquer um dos testes realizados (ELISA-AgT, ELISA-rK39 e

qPCR) e foram diagnosticadas com infecção assintomática, sendo incluídas no Grupo

de Estudo (AS) deste trabalho (Fig. 5) e 98 crianças que apresentaram diagnóstico

negativo em todos os testes realizados (ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR), foram

incluídas no Grupo Controle Negativo (CN) .

As 43 amostras de soro coletadas de crianças com LV clássica, diagnosticadas e

acompanhadas no Hospital Infantil João Paulo II, armazenadas em congelador -70°C no

Laboratório de Pesquisas Clínicas (CPqRR/FIOCRUZ-MG), foram incluídas no Grupo

Controle Positivo (LVC) e submetidas ao teste de ELISA-AgT e ELISA-rK39.

Dos 43 pacientes selecionados apenas 19 possuíam amostras de sangue total que

foram submetidas ao ensaio molecular de qPCR.

Na tabela 3 podemos observar a distribuição dos resultados apresentados pelos

testes sorológicos de ELISA-AgT, ELISA-rK39 e pela qPCR para o grupo LVC.

ELISA- AgT

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Resultados

59

Tabela 3: Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos de ELISA-

AgT, ELISA-rK39 e pela qPCR, dos pacientes com LV clássica.

Positivas Negativas Total de Amostras

Ensaiadas por Teste

ELISA – AgT 43 0 43

ELISA – rK39 42 1

qPCR 15 4 19

A tabela 4 mostra a distribuição dos resultados apresentados pelas 19 amostras

que foram submetidas aos testes sorológicos de ELISA AgT, ELISA-rK39 e ao ensaio

molecular de qPCR. Através da tabela podemos observar que 15 amostras foram

positivas simultaneamente para os dois testes sorológicos realizados e a qPCR e apenas

4 amostras apresentaram resultados negativos pelo ensaio molecular.

Tabela 4: Associação dos resultados apresentados pelas 19 amostras que foram

submetidas aos testes sorológicos de ELISA AgT, ELISA-rK39 e ao ensaio molecular

de qPCR .

qPCR

Positivo Negativo

ELISA- AgT Positivo 15 4

Negativo 0 0

ELISA - rK39 Positivo 15 4

Negativo 0 0

ELISA- AgT e ELISA - rK39 Positivo 15 4

Negativo 0 0

Considerando a amostragem total, das 222 crianças, 46,85% são do sexo

feminino e 53,15% do sexo masculino, a média de idade da população estudada é de

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Resultados

60

59,14 meses (± 5 anos), sendo a menor idade 3 meses e a maior idade 10 anos. Na

tabela 5 é possível observar a distribuição das crianças de acordo com o grupo no qual

foram inseridas, o tempo de sintoma quando internadas, no caso das crianças com LV

clássica, a idade e o sexo.

Tabela 5: Caracterização das crianças identificadas com infecção assintomática (AS),

diagnosticadas com LV clássica (LVC) e residentes das áreas endêmicas que

apresentaram testes sorológicos e ensaio molecular negativos (CN).

Grupos Número de crianças Sexo

Idade

Tempo de

sintoma quando

internada

M F 4 a 40

dias

2 a 4

meses

AS 81 49 32 1 a 9 anos * *

LVC 43 22 21 3 meses a 10 anos 39 4

CN 98 47 51 1 a 10 anos * *

M = masculino; F = feminino

A figura 6 abaixo mostra a distribuição das crianças em porcentagem de acordo

com a idade, nos diferentes grupos. Os dados demonstraram que 75% dos casos de LV

clássica ocorreram em crianças com idade entre 1 a 5 anos.

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Resultados

61

Figura 6: Distribuição em porcentagem das crianças incluídas no grupo AS (Fig. A),

LVC (Fig. B) b) e CN (Fig. C) em relação à idade.

Já a figura 7 abaixo, mostra em porcentagem a distribuição das crianças que

pertencem ao Grupo Controle Positivo (LVC) de acordo com o tempo de evolução da

doença.

Figura 7: Distribuição em porcentagem das crianças que pertencem ao grupo LVC em

relação ao tempo de sintoma quando internadas.

As crianças do grupo LVC, apresentavam a doença na fase aguda, já que o

tempo de manifestações clínicas até o momento da internação de 39 crianças (91%)

variou de 4 dias a pouco mais de 1 mês e 4 pacientes apresentaram as manifestações

clínicas da doença entre 2 a 4 meses (Tab. 5 e Fig. 7).

A B C

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Resultados

62

5.2 Perfil de avidez de anticorpos IgG em crianças com LV assintomática e LV

clássica

As 86 amostras de soro que apresentaram resultado positivo para o teste de

ELISA-rK39 foram submetidas ao teste de avidez de anticorpos IgG. Destas amostras

44 pertencem a crianças identificadas com infecção assintomática (Grupo de Estudo) e

42 pertencem a crianças que foram diagnosticadas com LV clássica (Grupo Controle

Positivo). Os dados mostraram média taxa de avidez (entre 41 e 70%), em 29 (66%) das

amostras avaliadas no Grupo AS. Altas taxas de avidez (acima de 70%) foram

observadas em 27 (64%) das crianças com LV clássica. A tabela 6 mostra o perfil de

avidez de anticorpos IgG encontrado no Grupo de Estudo (AS) e no Grupo Controle

Positivo (LVC).

Tabela 6: Perfil de avidez de anticorpos IgG observado em crianças com infecção

assintomática e clássica por L.infantum.

Formas

Clínicas da LV

Taxa de Avidez dos anticorpos IgG Número de

Crianças < 40% (baixa) 41 – 70% (média) >70% (alta)

Assintomática 9 (20%) 29 (66%) 6 (14%) 44

Clássica 5 (12%) 10 (24%) 27 (64%) 42

5.3 Correlação entre as taxas de avidez de anticorpos IgG com a evolução da

infecção em crianças com LV clássica

O Teste de Pearson foi realizado para verificação da correlação entre o tempo de

sintomas quando internadas e as taxas de avidez de anticorpos IgG (TA), em crianças

que pertencem ao Grupo Controle Positivo (LVC) (Fig. 8). Os resultados demonstraram

correlação fraca e não significativa de 0,250 (p = 0,110).

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Resultados

63

Figura 8: Correlação entre tempo de sintoma, determinado em dias, e as taxas de avidez

em crianças com LV clássica. Os resultados, apresentados no gráfico de dispersão,

destacam concentração não linear dos valores da avidez entre 0 e 40 dias.

5.4 Correlação entre os índices de reatividade para ELISA-rK39 e a taxa de

avidez de anticorpos IgG, em crianças que apresentam LV assintomática e

LV clássica

Testes de Pearson também foram realizados para verificar correlações entre os

índices de reatividade para ELISA-rK39 (IR-rK39) e as taxas de avidez (TA) em

crianças do Grupo de Estudo (AS) e do Grupo Controle Positivo (LVC). Em crianças

AS, foi observado o resultado de - 0,646 (p = 0,0001) para a correlação IR-rK39/TA.

No grupo LVC, foi observado o resultado de 0,823 (p = 0,0001) também para a

correlação IR-rK39/TA. Estas correlações estão representadas na figura de dispersão

bidimensional abaixo (Fig. 9).

1101009080706050403020

120

100

80

60

40

20

0

AV

Tempo

r=0,250; p=0,110

TA

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Resultados

64

Figura 9: Correlações entre os índices IR-rK39 e taxa de avidez em crianças que

apresentam infecção assintomática e clássica. Os resultados, apresentados no gráfico de

dispersão bidimensional, destacam relação linear entre os índices IR-rK39 e avidez no

Grupo LVC e concentração não linear dos valores da avidez entre baixos valores dos

índices de IR-rK39.

Os dados demonstraram moderada correlação negativa entre IR-rK39/TA, em

crianças do grupo AS e forte correlação positiva entre IR-rK39/TA, no grupo LVC. Os

dados sugerem que a taxa de avidez dos anticorpos IgG pode vir a ser um marcador

sorológico indicativo de infecção recente ou não.

5.5 Perfil sérico da quimiocina CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias, anti-

inflamatórias/moduladoras e IL-17A em crianças com LV assintomática e

LV clássica

5.5.1 Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças com LV

assintomática e LV clássica

O perfil de CXCL-8 circulante de crianças que pertencem ao Grupo Controle

Negativo (CN), ao Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo Controle Positivo (LVC), foi

avaliado pelo método CBA e está representado na figura 10 abaixo. Os dados

AS - r = - 0,654; p = 0,0001

LVC - r = 0,823; p = 0,0001

TA

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Resultados

65

demonstraram menor nível sérico de CXCL-8 nos grupos CN e AS quando comparados

ao grupo LVC.

Figura 10: Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças que

pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao

Grupo Controle Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como níveis

séricos da CXCL-8 em pg/mL, em gráficos de barra destacando a mediana e o intervalo

interquartil. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) dos grupos CN e AS

em relação ao grupo LVC estão representadas pela letra c.

5.5.2 Avaliação do perfil sérico de citocinas pró-inflamatórias em crianças

com LV assintomática e LV clássica

O perfil de citocinas pró - inflamatórias circulantes de crianças que pertencem ao

Grupo Controle Negativo (CN), ao Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo Controle Positivo

(LVC), foi avaliado pelo método CBA e está representado na figura 11 abaixo. Os

dados demonstraram menor nível sérico das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1,

TNF e IFN- nos grupos CN e AS quando comparados ao grupo LVC. Nenhuma

diferença estatisticamente significativa foi observada para as citocinas IL-12p70 e IL-2

entre os grupos avaliados.

Avaliação do Perfil Sérico de IL-8 (CXCL8)

CN AS

LCV

0

75

150

cc

CX

CL-8

(pg/m

L)

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Resultados

66

Figura 11: Avaliação do perfil sérico de citocinas pró-inflamatórios em crianças que

pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao

Grupo Controle Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como níveis

séricos de IL-6, IL-1, TNF, IL-12p70, IL-2 e IFN- em pg/mL, em gráficos de barra

destacando a mediana e o intervalo interquartil. As diferenças estatisticamente

significativas (p < 0,05) dos grupos CN e AS em relação ao grupo LVC estão

representadas pela letra c.

5.5.3 Avaliação do perfil sérico de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras

em crianças com LV assintomática e LV clássica

O perfil de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras circulantes de crianças

pertencentes ao Grupo Controle Negativo (CN), Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo

Controle Positivo (LVC), foi avaliado pelo método CBA e está representado na figura

12 abaixo. Os dados demonstraram menor nível sérico da citocina moduladora IL-10

nos grupos CN e AS quando comparados ao grupo LVC. Nenhuma diferença

estatisticamente significativa foi observada para a citocina anti-inflamatória IL-4 entre

os grupos avaliados.

IL-6 IL-1

TNF IL-12p70

IL-2 IFN-

Perf

il d

e C

itocin

as

Séricas (

pg/m

L)

Avaliação do Perfil de Citocinas Pró-Inflamatórias

0

5

1010

80

150

cc

0.00

0.25

0.500.50

10.25

20.00

cc

0.00

0.25

0.500.50

5.25

10.00

cc

0

8

16

CN ASLVC

0

2

4

CN ASLVC

0.00

1.25

2.502.50

76.25

150.00

c

c

Citocin

as p

ró -

inflam

ató

ria

s (

pg/m

L)

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Resultados

67

Figura 12: Avaliação do perfil sérico de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras em

crianças pertencentes ao Grupo Controle negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS

= 81) e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como

níveis séricos de IL-4 e IL-10 em pg/mL, em gráficos de barra destacando a mediana e o

intervalo interquartil. A diferença estatisticamente significativa (p<0,05) dos grupos CN

e AS em relação ao grupo LVC está representada pela letra c.

5.5.4 Avaliação do perfil sérico da citocina IL-17A em crianças com LV

assintomática e LV clássica

O perfil de IL-17A circulante de crianças pertencentes ao Grupo Controle

Negativo (CN), ao Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo Controle Positivo (LVC), foi

avaliado pelo método CBA e está representado na figura 13 abaixo. Os dados

demonstraram maior nível sérico da citocina IL-17A no grupo AS quando comparado

ao grupo LVC.

IL-4 IL-10

Avaliação do Perfil de Citocinas Anti-Inflamatórias/moduladorasP

erf

ild

e C

ito

cin

as

rica

s(p

g/m

L)

CN AS

LVC

0

1

2

CN AS

LVC

0

50

100

c c

Citocin

as a

nti –

inflam

ató

rias/

modula

dora

s (

pg

/mL)

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Resultados

68

Figura 13: Avaliação do perfil de IL-17A circulante em crianças pertencentes ao Grupo

Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle

Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como níveis séricos de IL-17A

em pg/mL, em gráficos de barra destacando a mediana e o intervalo interquartil. A

diferença estatisticamente significativa (p<0,05) do grupo AS em relação ao grupo LVC

está representada pela letra c.

5.6 Identificação de biomarcadores imunológicos úteis para a compreensão dos

fatores que determinam o curso da infecção por L. infantum e que possam

ter potencial aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática.

5.6.1 Análise de regressão logística

Para identificação de biomarcadores que pudessem estar associados à LV

assintomática e que fossem úteis para melhor compreender fatores determinantes para o

curso da infecção, análises estatísticas multivariadas foram usadas.

Primeiramente uma análise de regressão logística foi realizada. A primeira etapa

da análise de regressão logística, caracterizada pela análise univariada, identificou as

variáveis IR-rK39, TA, IL-17A, IFN-, TNF, IL-1 e IL-8 como representativas para

modelagem logística (p< 0,25). Essas variáveis pré-selecionadas foram incluídas no

modelo geral da análise de regressão logística e, pelo método Stepwise, ao comparar os

testes da Razão da Verossimilhança (G) dos modelos com e sem a variável previamente

Avaliação do Perfil Sérico de IL-17A

I

L-1

7A

(pg/m

L)

CN ASLVC

0.00

0.25

0.500.50

5.25

10.00 c

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Resultados

69

selecionada, foram definidos os biomarcadores TA, IL-17A, IFN-, e IL-1 para o

modelo final.

Considerando os Grupos de Estudo (AS) e Controle Positivo (LVC), foi aplicada

a fórmula geral 𝑙𝑜𝑔 [𝜋𝐿𝑉𝐶

𝜋𝐴𝑆] = 𝛼 + 𝛽𝑖𝑥𝑖, onde i representa o biomarcador selecionado, α

representa o intercepto, β representa o coeficiente do biomarcador e x representa o valor

quantitativo do biomarcador. A análise de regressão ajustou o modelo final 𝑙𝑜𝑔 [𝜋𝐿𝑉𝐶

𝜋𝐴𝑆] =

−3,68 + 0,61𝑥𝐴𝑉 + (−0,59)𝑥𝐼𝐿−17𝐴 + 0,99𝑥𝐼𝐹𝑁− + 0,46𝑥𝐼𝐿−1 para os dados. A

tabela 7 abaixo demonstra os valores dos coeficientes do modelo, com respectivos

intervalos de confiança, escores Z e valores P.

Tabela 7: Resultados da análise de regressão logística comparando os grupos AS e

LVC em relação aos preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1

Modelo final comparativo entre AS e LVC

Coeficiente β IC 95% Escore Z Valor P

Intercepto -3,68 (-5,34;-2,01) 4,35 0,0131

Avidez 0,61 (0,23;0,98) 3,11 0,0018

IL-17A -0,59 (-0,98;-0,19) -2,92 0,0034

IFN- 0,99 (0,42;1,55) 3,36 0,0007

IL-1 0,46 (0,12;0,79) 2,64 0,0081

Log-Likelihood = -49.301; Likelihood ratio test: chisq = 61.463 (p.value = 1.4285e-12)

A partir do modelo final acima, foram calculadas as Odds Ratios (OR) dos

preditores selecionados pela fórmula: 𝑒𝛽𝑖.

A tabela 8 abaixo representa os valores das OR para os preditores selecionados,

com respectivos intervalos de confiança e valores P.

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Resultados

70

Tabela 8: Resultados da análise de regressão logística associando os grupos AS e LVC

aos preditores TA , IL-17A, IFN- e IL-1

OR IC 95% Valor P

TA 1,84 (1,27;2,67) 0,0023

IL-17A 0,55 (0,37;0,82) 0,0039

IFN- 2,69 (1,52;4,75) 0,0001

IL-1 1,58 (1,14;2,21) 0,0013

Os resultados indicaram uma substancial diminuição na OR no grupo LVC

relacionada à IL-17A (OR = 0,55; IC 95%: 0,37;0,82) (P = 0,0039). Como este

biomarcador esta mais elevado no grupo AS, podemos sugerir uma possivel proteção

para desenvolvimento da LVclássica. Inversamente, os resultados apontaram relevantes

aumentos nas OR no grupo LVC relacionados às citocinas IFN- e IL-1. De acordo

com o modelo ajustado, níveis circulantes de IFN- quase três vezes superiores aos

níveis do grupo AS foram encontrados no grupo LVC (OR = 2,69; IC 95%: 1,52;4,75)

(P = 0,0001). No mesmo sentido das citocinas IFN- e IL-1, a TA no grupo LVC foi

quase duas vezes superior ao grupo AS (OR = 1,84; IC 95%: 1,27;2,67)(P = 0,0023).

5.6.2 Análise discriminante

Após a realização da análise de regressão logística foi realizada a análise

discriminante dos dados. A tabela 9 abaixo apresenta os resultados obtidos da função

discriminante quadrática pelos métodos de ressubstituição e de validação cruzada dos

preditores selecionados previamente pela análise de regressão logística.

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Resultados

71

Tabela 9: Resultados da avaliação da função discriminante quadrática entre os grupos

AS e LVC para os preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1

Função quadrática

Método de Ressubstituição

População classificada População real

Grupo AS LVC

AS 65 5

LVC 16 38

Total 81 43

Número de acertos 65 38

Proporção de acerto 0,802 0,884

N = 124; No de acertos = 103; Proporção global de acerto = 0,83

Método da validação cruzada

População classificada População real

Grupo AS LVC

AS 63 7

LVC 18 36

Total 81 43

Número de acertos 63 36

Proporção de acerto 0,778 0,837

N = 124; No de acertos = 99; Proporção global de acerto = 0,798

Foram observados 16 elementos do grupo AS e 5 elementos do grupo LVC

classificados incorretamente, o que resultou nas seguintes porcentagens de acertos: 80%

para o grupo AS e 88% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 83%

para o método de ressubstituição. Para a validação cruzada, os dados mostraram 77%

para o grupo AS e 83% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 79%

para o método de validação cruzada. Estas proporções globais indicaram boa qualidade

da função discriminante dos biomarcadores preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1 entre

os grupos AS e LVC.

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Resultados

72

5.6.3 Árvore de classificação

O método CART (Classification and Regression Trees), proposto para

classificação dos biomarcadores TA, IL-17A, IFN- e IL-1, que foram previamente

categorizados (vide Tabela 1) e selecionados na análise de regressão logística (vide

tópico 5.6.1 Análise de Regressão Logística), criou uma regra de classificação desses

preditores entre os grupos AS e LVC. A figura 14 demonstra a árvore de classificação

dos biomarcadores TA, IL-17A, IFN- e IL-1 pelo método CART.

Figura 14: Árvore de classificação dos biomarcadores preditores TA, IL-17A, IFN- e

IL-1 entre os grupos AS (AS = 1 ou rosa claro) e LVC (LVC = 2 ou rosa escuro). Nos

retângulos, a gradação da cor rosa, do claro ao escuro, destaca o aumento da

probabilidade de desenvolvimento da LVC e, o “N”, com seu respectivo percentual, a

quantidade de crianças alocadas após a divisão do nó antecedente. Para converter o

valor padronizado do biomarcador ao seu correspondente sérico, utilizar a Tabela 1 de

1.3

N=124 100%

TA < 2.5sim não

1

1.2

N=86 69%

IFN- < 2.5

2

1

N=40 32%

4

1.7

N=38 31%

IFN- < 2.5

3

1.3

N=46 37%

IL17A ≥ 0.5

5

1.1

N=33 27%

8

1.6

N=13 10%

9

1.2

N=9 7%

6

1.9

N=29 24%

IL1 < 1.5

1.7

N=14 12%

10

2

N=15 12%

11

7

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Resultados

73

padronização das variáveis para análise multivariada (subitem 4.8.2 Categorização das

variáveis para análise multivariada, em Metodologia).

A primeira variável de inicialização (“nó raiz”) foi a taxa de avidez. Valores

categorizados de taxa de avidez menores que 2,5 ou valores reais menores que 73,58%

juntamente com valores categorizados de IFN- menores que 2,5 ou valores reais

menores que 0,48 pg/mL, detectados em 40 crianças, indicaram decisão a favor de LV

assintomática.

Para valores categorizados de taxa de avidez maiores que 2,5 ou valores reais

maiores que 73,58%, acompanhados de valores categorizados (ou reais) de IFN-

maiores que 2,5 (0,48 pg/mL ) e de IL-1 maiores que 1,5 (0,075 pg/mL ), a decisão

favoreceu 15 crianças com LV clássica.

Entre os polos AS e LVC demonstrados na Figura 12, foi possível observar

associações entre os biomarcadores preditores TA, IFN-, IL-17A e IL-1 que,

globalmente, indicaram o grupo AS com os seguintes valores: menor TA, maior IL-17A

e menor IFN-; e indicaram o grupo LVC com os valores: maior TA, maior IFN-; e

elevado IL-1.

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6.0 DISCUSSÃO

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Discussão

75

Uma lacuna frequentemente evidenciada em inquéritos epidemiológicos

realizados em áreas endêmicas para LV é a dificuldade no diagnóstico da infecção

assintomática por L. infantum. Os métodos de diagnóstico sorológico disponíveis, que

são altamente sensíveis para detecção da LV clássica, não apresentam o mesmo

desempenho e eficiência, quando utilizados para identificação da infecção assintomática

(de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos Santos Marques et al., 2012).

Neste contexto, no presente estudo, foi adotado como estratégia para

diagnosticar a infecção assintomática, a combinação de dois testes sorológicos (ELISA-

AgT e ELISA-rK39) e a técnica molecular de PCR em tempo real quantitativo para

aumentar a sensibilidade na detecção de indivíduos com infecção assintomática por L.

infantum, residentes em três áreas de abrangência da Regional Noroeste de Belo

Horizonte (Serrano, Pindorama e Glória).

Na análise dos resultados dos testes diagnósticos realizados, foi observado que a

co-positividade entre a qPCR e os dois testes sorológicos foi notavelmente baixa, pois

não foi detectado pela técnica molecular de qPCR DNA de Leishmania em amostras de

sangue total em um número considerável de indivíduos que apresentaram diagnóstico

positivo para os testes de ELISA-AgT e/ou ELISA-rK39. Por outro lado, a técnica

molecular de qPCR permitiu a identificação da infecção assintomática de indivíduos

que apresentaram diagnóstico negativo em todos os testes sorológicos realizados (Figura

5).

Estes resultados reforçam a conclusão de outros estudos já realizados no Brasil,

onde os autores sugerem que a utilização de um único método de diagnóstico é

inadequada para a ampla identificação da infecção assintomática, e que métodos

moleculares podem ser complementares para ampliar a capacidade de detecção da

infecção assintomática (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos Santos

Marques et al., 2012). É importante ressaltar que a utilização isolada de métodos

sorológicos pode subestimar as verdadeiras taxas da infecção assintomática em áreas

endêmicas.

No entanto, a combinação de diferentes métodos para identificação da infecção

assintomática, apesar de aumentar a probabilidade em identificar maior número de

indivíduos infectados, aumentando a sensibilidade, pode diminuir a especificidade, pois

tais técnicas apresentam baixos índices de concordância (dos Santos Marques et al.,

2012). Sendo assim, a possibilidade de classificação errada não pode ser

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Discussão

76

descartada, ou seja, algumas amostras negativas podem estar sendo definidas como

positivas, uma vez que o método de ELISA é pouco preciso na detecção de

assintomáticos (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009).

Para explicar a baixa co-positividade entre as técnicas de diagnóstico molecular

e sorológicas utilizadas, dos Santos Marques et al. (2012) sugere que, no início da

infecção, antes de ocorrer a soroconversão, as técnicas moleculares são mais sensíveis

que as técnicas sorológicas, porém, com a progressão da infecção ocorre o aumento da

produção de anticorpos, favorecendo a sensibilidade dos métodos sorológicos. Assim, a

possibilidade de uso de técnicas altamente sensíveis não-invasivas, como a PCR (de

Gouvea et al., 2008) e a qPCR (dos Santos Marques et al., 2012) realizada a partir de

DNA extraído do sangue periférico, para diagnóstico da LV, têm permitido a

identificação de indivíduos assintomáticos, que não seriam identificados, caso fossem

utilizadas apenas técnicas sorológicas. Também é importante considerar a possibilidade

de amostras falso-positivas detectadas na sorologia.

Embora os testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 sejam imprecisos

para diagnosticar infecções assintomáticas, os mesmos apresentaram sensibilidade de

89,8%, 88,6% e especificidade de 81% e 92,4%, respectivamente quando foram

avaliados em um estudo para o diagnóstico da forma clássica da LV (Pedras et al.,

2008), demonstrando bom desempenho e eficiência para a detecção da doença. Ao

analisar os resultados apresentados pelos testes sorológicos realizados com amostras

provenientes de crianças sintomáticas, com a confirmação da forma clínica clássica, foi

detectada que a co-positividade entre os dois testes foi considerável (Tabela 3),

concordando com o que foi demonstrado por Pedras et al. (2008).

Considerando que em áreas endêmicas, o número de indivíduos infectados com

o parasito, mas que não desenvolvem a doença, corresponde à maioria dos infectados

(Desjeux, 1992; Sakthianandeswaren et al., 2009; OMS, 2010; Antinori et al., 2012), a

prevalência da LV assintomática pode ser um indicador da extensão e manutenção de

transmissão do parasito (Costa et al., 2002; Riera et al., 2004; Romero et al., 2009; dos

Santos Marques et al., 2012).

Assim é de extrema importância identificar a infecção assintomática visando

monitorar as áreas endêmicas para direcionar melhor as ações de controle. Porém os

métodos de diagnóstico disponíveis, não apresentam o mesmo desempenho e eficiência

para detecção da LV assintomática, podendo a utilização isolada destes subestimar as

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Discussão

77

verdadeiras taxas de indivíduos que abrigam temporariamente e silenciosamente, o

parasito em áreas endêmicas.

Diante destas dificuldades e desafios enfrentados em identificar a infecção

assintomática, este estudo buscou avaliar a taxa de avidez de anticorpos IgG anti-

Leishmania spp. e o perfil sérico de citocinas em crianças assintomáticas, crianças

sintomáticas, com a confirmação da forma clínica clássica e crianças não infectadas,

com o objetivo de identificar biomarcadores sorológicos e imunológicos, com potencial

aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática. Estes marcadores

poderão também fornecer informações para uma melhor compreensão da evolução da

infecção por L. infantum.

Assim, 86 amostras de soro de crianças com idade entre 0 e 10 anos que

apresentaram resultado positivo para o teste de ELISA-rK39 foram submetidas ao teste

de avidez de anticorpos IgG. Destas amostras 44 pertencem a crianças identificadas com

infecção assintomática (Grupo de Estudo) e 42 pertencem a crianças que foram

diagnosticadas com LV clássica (Grupo Controle Positivo). As crianças do grupo LVC,

apresentavam a doença na fase aguda, já que o tempo de manifestações clínicas até o

momento da internação de 39 crianças (91%) variou de 4 dias a pouco mais de 1 mês e

4 pacientes apresentavam as manifestações clínicas da doença entre 2 a 4 meses,

portanto não foram avaliadas crianças com doença crônica, pois nenhuma delas

apresentou mais de 6 meses de sintomas (Figura 7).

Altas taxas de avidez, acima de 70% foram observadas em 27 (64%) pacientes

com LV clássica, (Tabela 6), sendo esse resultado consistente com o longo período de

incubação, geralmente observada na doença, e estando de acordo com o que foi

sugerido por estudos realizados por Redhu et al. (2006) e Tiburcio et al. (2013).

Ao analisar as taxas de avidez de anticorpos IgG e o tempo de evolução da

infecção em crianças com LV clássica, não foi encontrada nenhuma correlação, sendo

observadas altas taxas de avidez (94% a 100%) em pacientes que apresentavam entre 4

dias a 4 meses de manifestações clínicas da doença (Figura 8).

Estes resultados discordam dos apresentados em um estudo realizado na Índia

por Redhu et al. (2006) que avaliou a taxa de avidez de anticorpos IgG, contra o

antígeno recombinante rKE-16. Os autores concluíram que pacientes com doença

crônica que não responderam ao tratamento apresentavam taxas de avidez maiores que

70%, enquanto aqueles infectados que apresentavam manifestações clínicas nos últimos

Page 79: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Discussão

78

6 meses tinham valores de avidez menores que 70%, podendo o teste ser utilizado com

sucesso para estimar o tempo e a duração da infecção por Leishmania donovani.

O que pode explicar resultados tão discordantes, é que Redhu et al. (2006)

avaliou a LV causada por L. donovani que apresenta manifestações clínicas mais graves

e tempo de evolução da doença diferente do apresentado pela LV causada por L.

infantum (Chappuis et al., 2007). Outro fator que poderia explicar a divergência entre os

resultados apresentados pelo presente estudo e os dados demonstrados por Redhu et al.

(2006) foi a utilização de diferentes antígenos recombinantes na avaliação das taxas de

avidez de anticorpos IgG. Redhu et al. (2006) utilizou o antígeno recombinante KE-16 e

o presente estudo utilizou o antígeno recombinante K39. Além disso, o estudo realizado

por Redhu et al. (2006) avaliou pacientes em diferentes faixas etárias, havendo crianças

de 7 meses e adultos de 65 anos e também pacientes com doença crônica.

Embora não tenha o sido observada associação entre o tempo de sintoma clínico

na LV clássica e a taxa de avidez de IgG, quando correlacionamos os índices de

reatividade para o ELISA-rK39 e a taxa de avidez de IgG apresentada por crianças com

a doença, foi possível observar que os maiores índices de reatividade estão

correlacionados com altas taxas de avidez (Figura 9).

Das 42 crianças com LV clássica que foram avaliadas, 24 apresentaram taxa de

avidez na faixa de 86% a 100% e índice de reatividade maior do que 10, variando de 10

até 12. Apenas uma criança apresentou taxa de avidez de 100% e índice de reatividade

de 4,3. Já as 17 crianças que apresentaram taxa de avidez na faixa de 21% a 78%,

apresentaram índice de reatividade igual ou menor a 9,9 (Figura 9).

Por outro lado, quando correlacionamos os índices de reatividade para o ELISA-

rK39 e a taxa de avidez de IgG de crianças com infecção assintomática, foi possível

observar que os maiores índices de reatividade estão correlacionados com baixa taxa de

avidez e os menores índices de reatividade estão correlacionados com media e alta taxa

de avidez (Figura 9).

Das 44 crianças identificadas com infecção assintomática, 11 apresentaram a taxa de

avidez na faixa de 14% a 45% e índice de reatividade maior do que 2, variando de 2 até

8,5, sendo que apenas 2 crianças apresentaram taxa de avidez de 45% e índice de

reatividade menor que 2. Já as 31 crianças que apresentaram taxa de avidez na faixa de

50% a 80%, apenas uma apresentou índice de reatividade de 4,3, o restante apresentou

índice de reatividade igual ou menor a 1,9. Taxas de avidez, acima de 40% até 70%

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Discussão

79

predominaram em crianças com LV assintomática, apresentando 66% (29) dos

indivíduos anticorpos de média avidez. Nenhuma criança identificada com infecção

assintomática apresentou taxa de avidez superior a 80% (Figura 9).

Quanto aos resultados discordantes apresentados por três amostras, podemos

considerar a possibilidade de que estas crianças foram erroneamente classificadas com

infecção assintomática pelo teste de ELISA-rK39, já que as amostras destas crianças

foram diagnosticadas como negativas pela técnica de qPCR. Estes resultados

demonstram que o teste de ELISA é impreciso para diagnosticar infecções

assintomáticas como vem sendo demonstrado na literatura (de Gouvea Viana et al.,

2008; Moreno et al., 2009; dos Santos Marques et al., 2012).

Desta forma, estes resultados obtidos evidenciam que crianças com infecção

assintomática além de apresentarem perfis de avidez de anticorpos IgG correlacionados

aos índices de reatividade distintos dos apresentados por crianças com LV clássica,

também apresentam perfis distintos entre si que podem estar provavelmente associados

com o período de tempo após a infecção. Resultados semelhantes também foram

demonstrados pelo estudo realizado por Tiburcio et al. (2013), que observou predomínio

de anticorpos de baixa avidez em indivíduos assintomáticos, logo após a detecção da

infecção, semelhante ao apresentado por indivíduos com LV clássica, que receberam o

tratamento. Houve aumento da taxa de avidez nos indivíduos assintomáticos, quando

avaliados aproximadamente 3 anos após a avaliação inicial (Tiburcio et al., 2013)

Indivíduos infectados mais que não desenvolvem a doença apresentam baixa

carga parasitária e como consequência os níveis séricos de anticorpos em geral são

baixos, e com o decorrer do tempo, estes títulos tendem a diminuir, sendo mais altos no

inicio da infecção (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009). Portanto,

podemos sugerir que indivíduos identificados com infecção assintomática que

apresentaram altos índices de reatividade, podem ter entrado em contato com o parasito

recentemente. Como baixas taxas de avidez de anticorpos IgG está correlacionada a

altos índices de reatividade, a avidez pode vir a ser um potencial marcador sorológico

para avaliar a possível evolução da infecção em crianças assintomáticas. Porém mesmo

com tantas evidências apresentadas por esse estudo e também por Tiburcio et al. (2013),

para confirmar esta hipótese, ainda é necessário que mais estudos sejam realizados.

Ao avaliarmos a dosagem sérica da quimiocina quimiotática para neutrófilos

CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1, TNF, IFN-, IL-12p70 e IL-2 e

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Discussão

80

das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-4, com o intuito de identificarmos

biomarcadores imunológicos na LV, nossos dados demonstraram que indivíduos

identificados com infecção assintomática apresentam perfil basal de citocinas,

semelhante aos indivíduos não infectados (Figura 10, 11 e 12). Esses dados corroboram

com aqueles obtidos por diferentes trabalhos que avaliaram o perfil de citocinas

circulantes na LV (Peruhype-Magalhães et al., 2006; Khoshdel et al., 2009; Costa et al.,

2012).

Considerando a ausência de sinais e sintomas relacionados a leishmaniose

visceral na avaliação clínica e o resultado positivo em um dos testes sorológicos ou

molecular, é possível sugerir que no momento em que são infectados por L. infantum, os

indivíduos assintomáticos controlam de maneira efetiva a infecção, mantendo a

homeostasia do sistema imune, o que explica a presença de perfil sérico de citocinas

semelhantes aos indivíduos não infectados (Peruhype-Magalhães et al., 2006).

Ao avaliarmos a dosagem sérica da citocina IL-17A, observamos que as crianças

identificadas com LV assintomática apresentaram níveis séricos da citocina IL-17A

mais altos do que aquelas crianças que desenvolveram a doença e aquelas que não estão

infectadas incluídas no grupo controle negativo, residentes das áreas endêmicas (Figura

13). Esses dados sugerem que a IL-17A desempenha papel protetor na LV, podendo ser

indicada como biomarcador imunológico para infecção assintomática. Além disso,

nossos resultados têm mostrado concordância com um estudo que buscou compreender

a importância da resposta Th1, Th2 e Th17 na LV induzida por Leishmania donovani. O

autor observou que a IL-17A, juntamente com a IL-22 e citocinas do tipo Th1,

desempenham papéis complementares no desenvolvimento de resposta imune protetora

contra LV clássica humana e qualquer alteração neste mecanismo poderia aumentar o

risco da doença (Pitta et al., 2009). Neste estudo foi relatado que indivíduos que não

desenvolveram, ou que estavam protegidos da LV durante um surto, produziram níveis

mais altos de IL-17A do que aqueles com LV clássica (Pitta et al., 2009).

As avaliações dos níveis séricos das citocinas em crianças com LV clássica

causada por L. infantum demonstraram altos níveis da quimiocina quimiotática para

neutrófilos CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1, TNF, IFN- e da

citocina anti-inflamatória/moduladora IL-10, o que indica uma exacerbação da resposta

imune nestas crianças, havendo tanto elevados níveis séricos de citocinas do tipo 1 que

vêm sendo associados com a resistência à infecção, quanto elevados níveis séricos de

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Discussão

81

citocinas do tipo 2 associados à suscetibilidade, que podem ser importantes no

desenvolvimento da doença ( Figura 10, 11 e 12).

Altos níveis de citocinas pró-inflamatórias na LV clássica podem também ser

associados às alterações fisiopatológicas, que ocorrem durante a doença (Costa et al.,

2012). Já elevados níveis de IL-10 tem sido associados à sobrevivência e persistência do

parasito dentro dos macrófagos (Peruhype-Magalhães et al., 2006; Nylen & Sacks,

2007) e a medida que as pesquisas que buscam classificar o perfil da resposta imune

desenvolvida na LV clássica avançam, mais evidências surgem e indicam que a IL-10 é

a principal citocina que contribui para a patogênese da LV humana, estando associada

com a gravidade da doença (Holaday et al., 1993; Caldas et al., 2005; Kurkjian et al.,

2006; Nylen & Sacks, 2007; Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012). Esta elevação nos

níveis das citocinas IL-10, TNF e IFN- e o relato do desenvolvimento de perfil de

resposta imune descontrolado e ineficaz para o controle da LV clássica, também foi

apresentada por outros estudos (Peruhype-Magalhães et al., 2005 e 2006; Costa et al.,

2012).

O papel desempenhado pela citocina IFN-γ na leishmaniose já foi bem definido

por diferentes estudos (Heinzel et al., 1989; Liew et al., 1990 a e b; Heinzel et al.,

1991). A sua participação na ativação e no aumento da atividade microbicida de

macrófagos para matar agentes patogênicos intracelulares foi relatada por inúmeros

trabalhos (Sacks & Noben-Trauth., 2002; Tripathi et al., 2007; Mosser & Edwards,

2008; Kaye & Scott, 2011) e o seu papel no controle da leishmaniose através da indução

da expressão de iNOS ( óxido nítrico sintase induzível) e da produção de NO (óxido

nítrico) pelos fagócitos infectados por parasitos intracelulares, promovendo, assim, a

eliminação destes e resolvendo a infecção por Leishmania spp. é muito bem aceito

(Sacks & Noben-Trauth, 2002; Tripathi et al., 2007). Porém, apesar da presença de

níveis elevados de IFN-γ durante a LV clássica, há progressão da doença. Esse fato

pode ser explicado pela perda de atividade dessa citocina em pacientes doentes (Barral-

Netto et al., 1989) que pode estar relacionada com a presença simultânea de níveis

elevados de IL-10. A IL-10 parece ser a principal citocina envolvida na desativação de

macrófagos na leishmaniose humana (Carvalho et al., 1994; de Medeiros et al.,

1998; Caldas et al., 2005), não podendo descartar o papel de outras citocinas capazes de

neutralizar as atividades do IFN-γ, tais como TGF-β (Barral-Netto et al., 1992; Barral et

al., 1993; Caldas et al., 2005). Outro fator que pode justificar a relação entre o elevado

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Discussão

82

nível de IFN-γ e a progressão da doença é o bloqueio do receptor de IFN-γ em

macrófagos, provocando perda da sua função protetora (Ansari et al., 2006).

Outras citocinas encontradas em altas concentrações em pacientes com LV

clássica foram o TNF-α, IL-6 e IL-8. Dados semelhantes também foram encontrados

por Peruhype-Magalhães et al. (2006) e Costa et al. (2013), que também observaram

elevados níveis de IL-1 em pacientes com LV clássica.

O TNF- tem papel importante na progressão das doenças infecciosas, porque

induz a produção excessiva de NO. Essa citocina, juntamente com IL-6 são mediadores

centrais de alterações fisiopatológicas associadas à sepse, a distúrbios orgânicos e à

resposta de fase aguda (Neta et al., 1992). O TNF- α é responsável por parte dos sinais e

sintomas da doença, tais como febre, anorexia, perda de peso, maior gasto de energia,

palidez cutânea e das mucosas e induz ativação policlonal das células B (Tracey et al.,

1988; Hirano, 1998; Engwerda et al., 2004).

Os níveis séricos de IL-6 em pacientes com LV clássica, permanecem

significativamente elevados em comparação com indivíduos do grupo controle, mesmo

após o tratamento, o que indica que ela pode ter papel na patogênese e também papel

benéfico na resolução da doença (Caldas et al., 2005; Ansari et al., 2006). Considerando

o papel benéfico da IL-6, alguns estudos tem relacionado essa citocina com a resposta

Th1 (Yamamoto et al., 2000), bem como, com o desenvolvimento de células Th17

(Ouyang et al., 2009), sugerindo que a IL-6 seja importante na manutenção de um

equilíbrio entre as respostas de células T durante a doença (Bhattacharya & Ali, 2013).

Também a IL-1 afeta a patogenicidade da leishmaniose pela geração de

resposta inflamatória tecidual e modulação da resposta imune adaptativa mediada por

células T. IL-1 parece estar associada à severidade da LV (Voronov et al., 2010;

Moravej et al., 2012).

A IL-8, quimiocina envolvida no recrutamento e ativação de neutrófilos para o

local da infecção (Sallusto, 1999), tem apresentado nível elevado no sobrenadante de

cultura de PBMC e no soro de indivíduos portadores de LV clássica (Raziuddin et al.,

1994; Santos-Oliveira et al., 2011; Datta et al., 2015). Estes dados dão suporte às nossas

análises dos níveis séricos de IL-8 e mostram o envolvimento de células da imunidade

inata no estabelecimento da resposta imune na LV humana.

A citocina IL-4 que foi inicialmente considerada como um marcador para

doença (Mary et al., 1999), no presente estudo apresenta níveis muito baixos no soro de

Page 84: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Discussão

83

pacientes com LV clássica, semelhantes aos encontrados em indivíduos não infectados,

concordando com resultados obtidos por outros estudos (Ansari et al., 2006; Peruhype-

Magalhães et al., 2006). Os dados sugerem então papel pouco expressivo da IL-4 no

contexto da doença ativa.

Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada para as citocinas

IL-12p70 e IL-2 entre os grupos avaliados. Hailu et al. ( 2004) também não encontrou

níveis elevados de IL-12p70 nos diferentes grupos que avaliou. Em experimentos

realizados in vitro, tem-se observado que níveis muito baixos de IL-12p70 são

suficientes para influenciar a produção de IFN-γ, o que também pode explicar elevados

níveis de IFN-γ apresentados por pacientes com LV clássica (Lauw et al., 1999). Já em

relação à IL-2, Peruhype-Magalhães et al. (2006) também não observou aumento dos

níveis séricos dessa citocina em pacientes com LV clássica, sugerindo a ausência de

ativação linfocítica eficaz durante a doença ativa.

Para a identificação de biomarcadores que pudessem estar associados à LV

assintomática e que fossem úteis para melhor compreender fatores determinantes para o

curso da infecção, a análise estatística de regressão logística foi realizada, identificando

as variáveis IR-rK39, TA (Taxa de Avidez), IL-17A, IFN-, TNF, IL-1 e IL-8 como

representativas e através de novas análises, foram definidos os biomarcadores TA, IL-

17A, IFN-, e IL-1 para o modelo final.

As análises de regressão logística comparando os grupos AS e LVC em relação

aos biomarcadores selecionados TA, IL-17A, IFN- e IL-1, indicaram que em

pacientes com LV clássica há diminuição na concentração da citocina IL-17A, quando

comparados com indivíduos assintomáticos. Esse dado reforça a hipótese dessa citocina

apresentar papel protetor na infecção por L. infantum. Nascimento et al. (2014),

demonstrou que a IL-17A atua sinergicamente com o IFN-γ potencializando a produção

de NO e a atividade leishmanicida em macrófagos murinos infectados com L. infantum.

Os resultados indicaram que L. infantum induz a produção de IL-17A, que promove o

controle da replicação de parasitos por auxiliar a resposta de linfócitos T tipo 1 e

produção de NO e, impedindo a expansão de células T produtoras de IL-10. Também

como já mencionado, estudos que avaliaram os níveis de IL-17A em pacientes com LV

clássica e de indivíduos que não desenvolveram a doença ativa, ou estavam protegidos

da doença durante um surto, assim como este presente estudo, demonstram associação

desta citocina com o desenvolvimento de resposta imune protetora para LV, tendo papel

Page 85: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Discussão

84

benéfico na resolução da doença (Pitta et al., 2009). Assim observamos que apesar de

diferentes estudos sugerirem diferentes papéis para a IL-17A no contexto das

leishmanioses, nossos dados demonstraram claramente que essa citocina seria um

potencial biomarcador imunológico na LV assintomática podendo contribuir para o

esclarecimento do papel desempenhado pela IL-17A na LV provocada pela infecção por

L. infantum.

Por outro lado, os resultados apontaram relevantes aumentos da concentração

das citocinas IFN- e IL-1 no soro de pacientes com LV clássica, quando comparados

com o grupo AS. De acordo com as analises geradas pelo modelo, os níveis circulantes

do IFN-γ em pacientes com LV clássica foi quase três vezes superiores aos níveis do

grupo AS. No mesmo sentido das citocinas IFN- e IL-1, a taxa de avidez no grupo

LVC foi quase duas vezes superior ao grupo AS, o que está de acordo com o que foi

sugerido por estudos realizados por Redhu et al. (2006) e Tiburcio et al. (2013), que

também demonstraram que altas taxas de avidez predominam em pacientes com LV

clássica.

Assim, levando em consideração as nossas observações e as de outros estudos

(Peruhype-Magalhães et al., 2006; Costa et al., 2013) de que os níveis séricos da

citocina IFN-, são elevados durante a LV clássica e que na LV, o desenvolvimento da

doença ou o controle da infecção depende da eficácia da citocina IFN-γ produzida por

células das respostas imunes inata e adaptativa, que ativam macrófagos para eliminar

parasitos intracelulares (Ribeiro-de-Jesus et al., 1998), sugerimos que o papel benéfico

dessa citocina na resolução da doença está deprimido. Na LV ativa parece ocorrer

ausência de resposta a estímulos de citocinas do tipo 1. Isto pode indicar a possibilidade

de que um aumento de citocinas de resposta imune tipo 1 em paralelo a um grande

bloqueio de receptores de citocinas Th1, como o do IFN- e/ou CXCR3 leva a processos

imunológicos que conduzem à desativação de macrófagos provocando, assim, a

progressão da infecção (Hailu et al., 2004; Ansari et al., 2006).

Após a realização da análise de regressão logística que selecionou as variáveis

que podem ser indicadas como biomarcadores foi realizada a análise discriminante dos

dados. Nesta análise os resultados da dosagem de citocinas e da taxa de avidez das 81

amostras provenientes de crianças identificadas com infecção assintomática e as 43

amostras provenientes de crianças com LV clássica foram utilizados para classificar as

Page 86: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Discussão

85

amostras como pertencentes ao grupo AS ou LVC através dos critérios estabelecidos

pela análise de regressão logística.

Foram observados 16 elementos do grupo AS e 5 elementos do grupo LVC

classificados incorretamente, o que resultou nas seguintes porcentagens de acertos: 80%

para o grupo AS e 88% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 83%

para o método de ressubstituição. Para a validação cruzada, os dados mostraram 77%

para o grupo AS e 83% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 79%

para o método de validação cruzada. Estas proporções globais indicaram boa qualidade

da função discriminante dos biomarcadores preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1 entre

os grupos AS e LVC.

A árvore de decisão, método CART (Classification and Regression Trees),

proposto para classificação dos biomarcadores TA, IL-17A, IFN- e IL-1, que foram

previamente categorizados e selecionados na análise de regressão logística, criou uma

regra de associação desses preditores entre os grupos AS e LVC. Essa estratégia

confirma os dados das análises de regressão logística e possibilita estabelecer uma

interpretação clara e objetiva dos resultados. Dessa forma, a análise empregando a

árvore de decisão nos mostra que crianças apresentando resultados de taxa de avidez

menores que 2,5 (73,58%) e níveis séricos da citocina IFN- também menores que 2,5

(0,48 pg/mL) são classificadas como assintomáticas. Caso os valores da taxa de avidez

sejam menores que 2,5 (73,58%) e os níveis séricos da citocina IFN- seja maior que

2,5 (0,48 pg/mL), a possibilidade de classificá-las como assintomáticas não deve ser

descartada. Nesse caso, a dosagem dos níveis séricos da citocina IL-17A deve ser

considerada e caso seja menor que 0,5 (0,05 pg/mL), a criança será classificada como

pertencente ao grupo LVC. Naqueles casos em que a dosagem dos níveis séricos da

citocina IL-17A for maior que 0,5 (0,05 pg/mL), aumenta a chance da criança pertencer

ao grupo AS (Figura 14).

A análise da árvore de decisão também mostrou que indivíduos que apresentam

valores da taxa de avidez maiores que 2,5 (73,58%), níveis séricos da citocina IFN-

maior que 2,5 (0,48 pg/mL) e da citocina IL-1β maior que 1,5 (0,075 pg/ml), têm

elevada probabilidade de pertencer ao grupo LVC. Além disso, naqueles casos em que a

dosagem da citocina IL-1β sérica for menor que 1,5 (0,075 pg/mL), a criança também

será classificada como pertencente ao grupo LVC (Figura 14).

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Discussão

86

A classificação proposta nesse estudo, empregando as abordagens estatísticas

(regressão logística e CART), sugere potencial aplicação como ferramenta

complementar para o diagnóstico da infecção assintomática em crianças residentes em

áreas endêmicas para LV. No entanto, novos estudos são necessários para validar a real

aplicabilidade dessa abordagem no contexto da infecção por L. infantum, especialmente

em indivíduos adultos e portadores do HIV.

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7.0 CONCLUSÃO

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Conclusão

88

1- Os testes de ELISA-AgT e ELISA-rK39, que são altamente sensíveis para

detecção da LV clássica, não apresentam o mesmo desempenho e eficiência,

quando utilizados para identificação da infecção assintomática. Recomenda-se a

associação de testes sorológicos e moleculares para estimar as taxas de infecção

assintomática em indivíduos residentes em áreas endêmicas;

2- Os resultados demonstraram associação inversa entre taxa de avidez e índice de

reatividade em crianças assintomáticas, o que sugere que a avidez pode vir a ser

um potencial marcador sorológico para determinar infecção assintomática e

avaliar tempo de evolução da infecção;

3- A avaliação do perfil de citocinas na LV demonstrou que, indivíduos com LV

assintomática apresentam perfil basal de citocinas tipo 1 / tipo 2, semelhante aos

indivíduos não infectados. No entanto, observou-se níveis séricos elevados de

IL-17A, sugerindo papel protetor desse biomarcador imunológico na LV

assintomática;

4- A árvore de classificação de biomarcadores (TA, IFN-, IL-17A e IL-1),

previamente categorizados e selecionados na análise de regressão logística, criou

uma regra de associação desses preditores entre os grupos AS e LVC, que pode

ser utilizada como estratégia complementar para o diagnóstico da infecção

assintomática.

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8.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Referências Bibliográficas

90

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Page 115: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

9.0 ANEXO

Page 116: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Anexo

115

Anexo 1: Consentimento Livre e Esclarecido - Crianças e menores de 18 anos

Convite para participar

Seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade, cujo nome é

_____________________________________ está convidado(a) para participar,

voluntariamente da segunda etapa do Projeto “Avaliação da associação entre o risco

para leishmaniose visceral e fatores ambientais, socioeconômicos e sanitários em

diferentes áreas de Belo Horizonte, Minas Gerais, 2010 a 2013.”

Leia e/ou ouça atentamente as informações a seguir antes de dar o seu consentimento.

Informações sobre o Estudo

O projeto em andamento é conduzido pela Universidade Federal de Minas

Gerais (UFMG) e a Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte. Seu objetivo é

avaliar o risco de adoecimento por Leishmaniose Visceral em sua região.

Ao concordar com a participação de seu filho(a) ou menor sob sua

responsabilidade você respondeu a um questionário confidencial e autorizou a coleta de

uma pequena quantidade de sangue por punção capilar na ponta do dedo da mão para

pesquisa de anticorpos (células de defesa do corpo humano) para o parasito Leishmania

chagasi, agente causador da leishmaniose visceral em Belo Horizonte.

Sua participação

Ao concordar com a continuidade de participação de seu filho(a) ou menor sob sua

responsabilidade nessa nova etapa você permitirá que

1. Seja coletada de seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade uma pequena

quantidade de sangue por punção venosa para realização de um exame de sangue do

tipo Hemograma, para caracterização imunológica e para pesquisa de fragmentos do

parasito transmissor. A coleta de sangue será realizada por técnicos especialmente

treinados e utiliza-se material esterilizado e descartável, ou seja, material que só é usado

uma única vez.

2. Seja atendido por um médico especialista, contratado pelo projeto no centro de saúde

de sua referência para avaliação clínica da criança.

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Anexo

116

Riscos e Benefícios

Os benefícios provenientes da participação do seu filho(a) ou menor sob sua

responsabilidade consistem na geração de novos conhecimentos para embasar as ações

de prevenção e controle da leishmaniose visceral no município; além de subsídios para

futuras análises de adequação do programa de controle vigente. O risco para o seu

filho(a) ou menor sob sua responsabilidade que porventura participe da pesquisa está no

momento da coleta de sangue. Entretanto, a mesma será realizada por profissionais

especializados em local adequado, portanto o risco de perda de integridade da pele é

mínimo.

Confidencialidade:

Toda informação pessoal obtida nesta pesquisa é considerada confidencial e a

identificação de seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade será mantida como

informação sigilosa. A amostra de sangue de seu filho(a) ou menor sob sua

responsabilidade será guardada apenas com um número, sem o nome. Os relatórios e

resultados deste estudo serão publicados na forma de textos, tabelas, gráficos e figuras,

sem nenhuma forma de identificação individual.

Pagamento por participação:

A participação do seu filho(a) ou do menor sob sua responsabilidade é isenta de

despesas e não haverá qualquer pagamento pela participação.

Acesso às informações

Você e seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade poderão receber, se assim o

quiser, os resultados de seus exames. Estes resultados só serão revelados a você ou seu

filho(a) ou menor sob sua responsabilidade, pela equipe da pesquisa. Para informações

adicionais sobre este estudo, você ou seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade

poderá se comunicar com Letícia Helena dos Santos Marques, nos telefones 3409-2973

e 9318-4975 no horário de 8 às 12 horas e de 14 às 18 horas de segunda à sexta-feira.

Para informações éticas do estudo, você poderá contatar o Comitê de Ética da UFMG -

Av. Antônio Carlos, 6627 Unidade Administrativa II - 2º andar - Sala 2005 Campus

Pampulha. Telefone: 3409-4592.

Page 118: Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com ...€¦ · Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum

Anexo

117

Você e seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade também podem e devem fazer

todas as perguntas que julgar necessárias, assim como recorrer a seu médico ou agente

de saúde para maiores informações, se assim entender.

Informações adicionais

A participação é totalmente voluntária e você e seu filho(a) ou menor sob sua

responsabilidade poderão se recusar a participar do estudo sem qualquer prejuízo

pessoal para ambos.

Você e seu filho (a) ou menor sob sua responsabilidade têm a liberdade de desistir ou de

interromper a colaboração e participação nesta pesquisa no momento em que desejar,

sem necessidade de qualquer explicação.

A desistência não causará nenhum prejuízo à saúde ou bem estar físico do seu filho ou

menor sob sua responsabilidade. Não virá interferir no atendimento e na assistência a

ser prestada em caso de necessidade.

Declaro que li e entendi as informações relativas a este estudo. Concordo com a

participação voluntária de meu filho(a) ou menor sob minha responsabilidade nesta

pesquisa.

Nome do responsável: ____________________________________________________

Assinatura do participante ou responsável: ____________________________________

Assinatura da criança maior de 7 anos: _______________________________________

Belo Horizonte, de de 2013.

ENDEREÇO E TELEFONE DOS PESQUISADORES

Mariângela Carneiro

Avenida Antonio Carlos 6627-

Campus UFMG

Departamento de Parasitologia/ICB

Bloco E4 - Sala 254

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