estudo dos efeitos da metformina na eletrogênese cardíaca · 1. diabetes mellitus 2....
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
E FISIOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Estudo dos efeitos da Metformina na
eletrogênese cardíaca
Lindalva Layse de Lima Malagueta Vieira
Recife
2015
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
E FISIOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Estudo dos efeitos da Metformina na
eletrogênese cardíaca
Doutoranda Lindalva Layse de Lima Malagueta Vieira
Orientador Adalberto Vieyra
Co-orientadores Prof. Dr. Emiliano Medei
Profª. Drª. Mónica Gallego
Recife
2015
Catalogação na fonte
Elaine Barroso
CRB 1728
Vieira, Lindalva Layse de Lima Malagueta Estudo dos efeitos da Metformina na eletrogênese cardíaca/ Lindalva Layse de Lima Malagueta Vieira – Recife: O Autor, 2015.
121 folhas : il., fig., tab. Orientador: Adalberto Vieyra Co-orientadores: Prof. Dr. Emiliano Medei; Profª. Drª. Mónica Gallego
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas, Bioquímica e Fisiologia, 2015. Inclui bibliografia
1. Diabetes Mellitus 2. Espectrometria 3. Eletrofisiologia I. Vieyra,Adalberto (orientador) II. Título
616.462 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2015-155
III
Lindalva Layse de Lima Malagueta Vieira
Estudo dos efeitos da Metformina na eletrogênese cardíaca
Tese apresentada para o cumprimento parcial das exigências para obtenção do título de Doutor em Bioquímica e Fisiologia pela Universidade Federal de Pernambuco
Aprovado por:
Prof. Dr. Adalberto Vieyra - Presidente
Prof. Dr. José Geraldo Mill
Prof. Dr. Cláudio Gabriel Rodrigues
Prof. Dr. Romildo de Albuquerque Nogueira
Prof. Dr. Dinaldo Cavalcanti de Oliveira
Data: 02/07/2015
IV
Agradeço ao meu Deus, pai e criador
Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do
céu. Há tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar, e tempo de arrancar o que se plantou (Eclesiastes 3:1-2).
V
Dedico aos meus pais
Maria Fatima de Lima
Luiz Aurélio Malagueta Vieira
VI
(In memoriam) do Professor. Dr. Oleg Krasilnikov
meu eterno orientador
VII
AGRADECIMENTOS
Ao meu co-orientador Professor Emiliano Medei por todo apoio e oportunidades no
decorrer destes anos de trabalho.
A minha co-orientadora Professora Mónica Gallego os maiores e mais sinceros
agradecimentos, sua confiança e dedicação foram capazes de me fazer trilhar por um
crescimento profissional que julgava impossível em tão pouco tempo. Sua forma de fazer
ciência é admirável, você é a grande responsável por apreciar e querer dedicar-me a
eletrofisiologia cardíaca.
Ao Professor Oscar Casis, palavras são poucas para descrever o carinho e admiração
que tenho por ti, um ser humano fantástico, profissional exemplar e excelente
cientista/eletrofisiologista e que hoje representa um espelho para minha vida pessoal e
profissional.
Aos Professores Claudio Gabriel Rodrigues, Márcia Bezerra da Silva e Reginaldo
Pereira da Silva, que fazem parte do laboratório de Biofísica e Células-tronco Professor Oleg
Krasilnikov, grata por todos os momentos compartilhados, por sermos uma linda família de
cientistas, por terem sido minha base em momentos tão difíceis, por toda atenção, cuidado e
carinho.
À Professora Liliya Yuldasheva por continuar contribuindo cientificamente com nosso
laboratório e também por conseguir atenuar a falta que sentimos do Prof. Oleg.
A Juan Manuel por todo Apoio técnico, dedicação, paciência e amizade durante minha
estância na Espanha.
VIII
A todos os meus colegas e amigos da UFRJ, em especial Mara Santos, Micaela
Lopez, Julieta Fernandez por toda cumplicidade, amizade e atenção, a Rosilane Taveira
pelo seu otimismo e lindas palavras, a Paulo André pela sua tranquilidade e paciência, a
Gustavo Monnerat e Humberto Muzi por todo apoio e ajuda.
Aos meus grandes amigos da UFPE em especial Gisely Albertim, Dijanah Cota, Sheila
Barros, Juliana Aguiar, Renata Valença, Edjair Cabral, Wyndly Daniel, Carolina Melo, Artur
Alves, Jeann Branco, Deborah Fortes vocês foram essenciais nesta caminhada.
As amizades que foram construídas durante minha estância na Espanha em especial,
Ainhoa Rodriguez, Hiart Alonso, Cristina del Pozo, Xiomara Hernandez.
À minha avó Joseja Farias por sua fé e por criar e manter essa família amiga e incrível
que temos.
Aos meus irmãos Ana e Luiz o meu maior presente, obrigada por todo incentivo, amor,
companheirismo, paciência e confiança, amo vocês.
Aos meus tios e tias pelo carinho, apoio e torcida.
A Luis Del Pozo, meu amor, as coisas nunca acontecem por acaso, juntos somos mais
fortes, obrigada por toda dedicação, paciência, atenção, motivação, você foi fundamental
para eu chegar até aqui.
Aos meus grandes amigos Juliana Brandão, Marina Ferraz, Marcela Melo, Tiago
Araújo, Vilma Gomes, cada um de sua forma me incentivou e contribuiu para essa
conquista.
IX
Este trabalho foi financiado pelas agências de fomento (CNPq, CAPES, FAPERJ),
Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia e Departamento de Educação, Universidades e
Investigação do Governo Vasco (GV) pelo apoio e financiamento deste estudo.
X
RESUMO
A Diabetes Mellitus (DM) é um grave problema de saúde pública, sendo uma
das maiores causas de morbimortalidade na grande maioria dos países. Diferentes
órgãos são acometidos pela DM; contudo, as doenças cardiovasculares são as
maiores responsáveis pela elevada mortalidade vinculada à diabetes. A metformina
é atualmente o principal fármaco utilizado para o tratamento da DM do tipo 2 (DM2),
embora os riscos-benefícios cardiovasculares dessa droga não estejam totalmente
elucidados. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial arritmogênico
da metformina em corações e cardiomiócitos de ratos saudáveis. No tratamento por
10 semanas com metformina os parâmetros biométricos e a glicemia plasmática não
foram modificados, mas foi constatado um prolongamento dos intervalos PR, QT e
QTc no eletrocardiograma, e uma redução da corrente transitória de saída de K+, Ito.
Quando os cardiomiócitos foram incubados por 24 h com metformina, a amplitude da
corrente Ito foi reduzida, enquanto aumentou a duração do potencial de ação
cardíaco (DPA). A exposição de cardiomiócitos isolados à metformina por um
período de 30 min, não reduziu a amplitude da corrente Ito, comprovando que a
redução da corrente Ito em cardiomiócitos tratados por 10 semanas e incubados por
24 h com metformina, não ocorreu por uma ligação direta da droga ao canal. A
corrente de cálcio tipo L (ICa-L) e a dependência de voltagem da inativação e
recuperação da inativação da corrente Ito não foram afetadas em ambas as
situações experimentais. Os níveis de RNAm que codifica as subunidades KV4.2,
KV4.3 e KChIP2 do canal Ito não foram alterados, sugerindo que a redução da
corrente Ito não ocorreria por uma menor síntese proteica das subunidades que
compõem o canal Ito. Propõe-se que, esta redução seria resultante de uma
acelerada degradação dos canais ou de uma deficiência funcional destes na
membrana celular. A partir dos resultados obtidos na presente tese, conclui-se que a
metformina apresenta potenciais efeitos arritmogênicos sobre o coração de animais
saudáveis, capazes de levar eventualmente à morte súbita.
Palavras-chave: Diabetes mellitus; Canais iônicos; Eletrofisiologia cardíaca.
XI
ABSTRACT
Diabetes Mellitus (DM) is a major public health problem, and is one of the
biggest causes of morbidity and mortality in most countries. Many different human
organs are affected by the DM, but cardiovascular diseases are the leading causes of
mortality in patients with DM. Even today, the leading drug used to treat type-2
diabetes is metformin. However, its cardiovascular risk-benefits are not entirely clear.
This study aimed to determine the potential arrhythmogenic effect of metformin in
cardiomyocytes from healthy animals. Therefore, a 10 week treatment with metformin
was performed, and it was proved that biometric and metabolic parameters were not
affected. However, a lengthening of the PR, QT and QTc interval was found on the
electrocardiogram, as well as a reduction in the output of the transitory potassium Ito
current. When cardiomyocytes were incubated for 24 h with metformin, the amplitude
of the Ito current was reduced and duration of cardiac action potential (APD)
increased. Exposure of cardiomyocytes treated with metformin over a period of 30
min did not reduce the amplitude of the current Ito, demonstrating that the reduction
in Ito current cardiomyocytes treated for 10 weeks and incubated for 24 h with
metformin, does not occur by direct binding of the drug to the canal. The L-type
calcium current (ICa-L) and the kinetic properties of voltage-dependent inactivation and
recovery from inactivation of Ito current remained unchanged in both experimental
conditions. RNAm levels of KV4.2, KChIP2 4.3 and Kv subunits remained unchanged.
This suggests that the reduction of the Ito current may not be caused by a decrease in
the protein synthesis subunit which is part of the Ito channel.Therefore, this reduction
may be caused by a main degradation of the channels or by a worse operating
performance in the cell membrane. Experiments accomplished during this thesis try
to demonstrate that metformin causes arrhythmogenic effects in the heart of healthy
animals.
Keywords: Diabetes mellitus; Ion channels; electrophysiology heart.
XII
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. MAPA DO MUNDO ILUSTRANDO NÚMERO DE DIABÉTICOS NAS DIFERENTES REGIOES NO
ANO DE 2014. . ................................................................................................................. 25
FIGURA 2. POTENCIAL DE AÇÃO DE TRÊS REGIÕES DO MÚSCULO VENTRICULAR. . .............. . 28
FIGURA 3. TRAÇADO REPRESENTATIVO DA CORRENTE DE POTÁSSIO TRANSITÓRIA DE SAÍDA EM
CARDIOMIÓCITOS DO VENTRÍCULO ESQUERDO DE RATO. . ............................................. 30
FIGURA 4. A) PLANTA MEDICINAL GALEGA OFFICINALIS. B) ESTRUTURA QUÍMICA
DA METFORMINA. ........................................................................................................................ 31
FIGURA 5. MECANISMO DE AÇÃO DA METFORMINA PELA INIBIÇÃO DO COMPLEXO I DA CADEIA
RESPIRATÓRIA. ................................................................................................................. 36
FIGURA 6. FASES DO POTENCIAL DE AÇAO CARDÍACO. ........................................................... 38
FIGURA 7. ESTRUTURA DOS CANAIS DE K+ DEPENDENTES DE VOLTAGEM. ............................. 39
FIGURA 8. REGISTRO DE ELETROCARDIOGRAMA EM RATA SPRAGUE-DAWLEY CONTROLE NA
DERIVAÇÃO II. ................................................................................................................... 52
FIGURA 9. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS PARÂMETROS AVALIADOS DURANTE O POTENCIAL
DE AÇÃO CARDÍACO NO VENTRÍCULO ESQUERDO. .......................................................... 55
FIGURA 10. FOTOGRAFIA DE CARDIOMIOCITOS DE RATA ISOLADOS DO EPICARDIO DO VENTRÍCULO
ESQUERDO. ....................................................................................................................... 57
XIII
FIGURA 11. APROXIMAÇÃO DA MICROPIPETA A MEMBRANA DO CARDIOMIÓCITO. ............. 58
FIGURA 12. PARAMETROS BIOMÉTRICOS RELACIONADOS À MASSA CORPORAL E À MASSA
CARDÍACA DE ANIMAIS SAUDÁVEIS TRATADOS COM METFORMINA. ............................. 66
FIGURA 13. GLICEMIA PLASMÁTICA DE ANIMAIS TRATADOS COM METFORMINA. ................ 68
FIGURA 14. ELETROCARDIOGRAMA DE ANIMAL TRATADO COM METFORMINA. ................... 69
FIGURA 15. PARAMETROS ELETROCARDIOGRÁFICOS EM ANIMAIS TRATADOS
COM METFORMINA. ................................................................................................................ 70
FIGURA 16. CORRENTE TRANSITÓRIA DE SAÍDA DE POTÁSSIO EM CARDIOMIÓCITOS DE ANIMAIS
TRATADOS COM METFORMINA. ....................................................................................... 72
FIGURA 17. DEPENDÊNCIA DE VOLTAGEM DA INATIVAÇÃO DA CORRENTE ITO EM CARDIOMIÓCITO
DE ANIMAIS TRATADOS COM METFORMINA. .................................................................. 74
FIGURA 18. RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO DA CORRENTE ITO EM CARDIOMIÓCITOS DE ANIMAIS
TATADOS COM METFORMINA. ......................................................................................... 75
FIGURA 19. DENSIDADE DA CORRENTE DE CÁLCIO TIPO L (ICA-L) EM CARDIOMIÓCITOS DE ANIMAIS
TRATADOS COM METFORMINA. ....................................................................................... 76
FIGURA 20. EXPOSIÇÃO POR 30 MIN À METFORMINA EM CARDIOMIÓCITOS DE ANIMAIS
SAUDÁVEIS. ....................................................................................................................... 78
FIGURA 21. EXPOSIÇÃO À METFORMINA DURANTE 24 HORAS EM FATIAS DE EPICARDIO DO
VENTRÍCULO ESQUERDO DE ANIMAIS SAUDÁVEIS. .......................................................... 79
XIV
FIGURA 22. INCUBAÇÃO COM METFORMINA DURANTE 24 HORAS EM CARDIOMIÓCITOS DE
ANIMAIS SAÚDAVEIS. ....................................................................................................... 82
FIGURA 23. DEPENDÊNCIA DE VOLTAGEM DA INATIVAÇÃO DA CORRENTE ITO EM CARDIOMIÓCITOS
INCUBADOS COM METFORMINA DURANTE 24 HORAS. ................................................... 83
FIGURA 24. RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO DA CORRENTE ITO EM CARDIOMIÓCITOS INCUBADOS
COM METFORMINA DURANTE 24 HORAS. ....................................................................... 84
FIGURA 25. DENSIDADE DA CORRENTE DE CÁLCIO TIPO L (ICA-L) EM CARDIOMIÓCITOS INCUBADOS
COM METFORMINA DURANTE 24 HORAS. ....................................................................... 86
FIGURA 26. GENES QUE CODIFICAM PARA AS SUBUNIDADES DO CANAL ITO. ......................... 87
XV
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. PROGRESSÃO DA DIABETES MELLITUS PARA O ANO DE 2035. ............................... 26
TABELA 2. PAINEL ILUSTRANDO A DIVERSIDADE DA CORRENTE TRANSITÓRIA DE SAÍDA DE K+ (ITO)
EM CARDIOMIÓCITOS DE MAMÍFEROS. ........................................................................... 42
TABELA 3. PAINEL ILUSTRATIVO: CANAIS DE CÁLCIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM (ICA-L)
CODIFICADOS POR DISTINTOS GENES. ............................................................................. 48
TABELA 4. PARÂMETROS AVALIADOS NO ECG DE ANIMAIS CONSCIENTES DURANTE O PERÍODO DE
10 SEMANAS. .................................................................................................................... 53
TABELA 5. OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE QRT-PCR. ............................ 63
TABELA 6. PARÂMETROS ELETROCARDIOGRÁFICOS ANALISADOS EM DIFERENTES TEMPOS EM
ANIMAIS SAUDÁVEIS. ....................................................................................................... 71
TABELA 7. PARÂMETROS DO POTENCIAL DE AÇÃO (PA) REGISTRADOS EM FATIAS DE TECIDO DE
EPICARDIO ESQUERDO. .................................................................................................... 80
XVI
LISTA DE ABREVIATURAS
4-AP 4-aminopiridina
ACC Acetil-CoA Carboxilase
AMP Adenosina monofosfato
AMPc Adenosina monofosfato cíclica
AMPK Proteína quinase ativada por AMP
APA Amplitude do potencial de ação
ATP Adenosina trifosfato
Cavs Canal de cálcio dependente de voltagem
Ct Ciclo de threshold
DAG Diacilglicerol
DM Diabetes Mellitus
DM1 Diabetes Mellitus tipo 1
DM2 Diabetes Mellitus tipo 2
DPA Duração do potencial de ação
DPA30 Duração do potencial de ação a 30% de repolarização
DPA90 Duração do potencial de ação a 90% de repolarização
dQT Dispersão do intervalo QT
EASD Associação Européia para o Estudo da Diabetes
ECG Eletrocardiograma
EPM Erro padrão médio
GAPDH Glicerol-aldeído-3-fosfato-desidrogenase
HMG-CoA redutase Hidroxi-metil-glutaril coenzima A redutase
IC Insuficiencia cardíaca
ICa-L Canal de cálcio tipo L
IK Correntes retificadores de potássio
XVII
IP3 Inositol trifosfato
KB Kraftbühe (do alemão) ou “sopa da força”
KChIPs Proteína regulatória dos canais KV
KV Canal de potássio dependente de voltagem
LKB1 Proteína quinase hepática B1 (do inglês)
MCD Miocardiopatia diabética
NCS Sensores de cálcio neuronal
OCT Transportadores catiônicos orgânicos
PA Potencial de ação
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
PLC Fosfolipase C
PRM Potencial de repouso da membrana
RNAm RNA mensageiro
SBD Sociedade Brasileira de Diabetes
Ser Serina
TEA Tetraetilamonio
Thr Treonina
Thr172 Treonina 172
UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study
XVIII
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 20
1.1. Considerações Iniciais .......................................................................................... 20
1.2. Diabetes Mellitus ................................................................................................... 22
1.2.1. Complicações Cardiovasculares ........................................................................... 27
1.3. Metformina ............................................................................................................ .29
1.3.1. Aspectos gerais da metformina ............................................................................. .29
1.3.2. Mecanismo de ação da metformina ...................................................................... .33
1.4. Canais iônicos envolvidos na repolarização cardíaca .......................................... 37
1.4.1. Estrutura dos canais de potássio dependente de voltagem (KV) .......................... 37
1.4.2. Corrente transitória de saída de potássio (Ito) ....................................................... 37
1.4.3. Papel fisiológico da corrente Ito ............................................................................. 41
1.5. Regulação da corrente Ito pelo sistema nervoso simpático ................................... 43
1.5.1. Receptores adrenérgicos no coração ................................................................... 43
1.5.2. Efeitos da estimulação noradrenérgica sobre a corrente Ito .................................. 44
1.5.3. Efeitos inibitórios sobre a corrente Ito .................................................................... 45
1.6. Canais de Cálcio Dependentes de Voltagem (CAVS) .......................................... 45
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 49
2.1. Objetivo geral ........................................................................................................ 49
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 49
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 50
3.1. Animais ................................................................................................................. 50
3.2. Estudo dos efeitos do tratamento de ratos saudáveis com metformina durante 10 semanas sob: glicemia, peso e ECG .................................................. 50
3.2.1. Avaliaçao dos parâmetros biométricos ................................................................. 51
3.2.2. Avaliaçao da glicemia .......................................................................................... 51
3.2.3. Monitoramento e análise do ECG dos animais conscientes ................................. 51
XIX
3.3. Estudo do efeito direto de metformina sob a repolarização ventricular ................ 54
3.3.1. Registro do potencial de ação .............................................................................. 54
3.3.2. Registro das correntes iônicas Ito e ICa-L ................................................................ 56
3.3.3. Registro da corrente transitória de saída de K+ (Ito) e da corrente de Ca2+ do tipo L (ICa-L) ....................................................................................................... 57
3.3.4. Protocolo de registro e medições da corrente Ito .................................................. 59
3.3.5. Amplitude da corrente Ito ....................................................................................... 59
3.3.6. Dependencia de voltagem de inativação da Ito ..................................................... 60
3.3.7. Recuperação da inativação da corrente Ito ........................................................... 60
3.3.8. Protocolo de registro e medições da amplitude da corrente ICa-L .......................... 61
3.4. Medida dos níveis de RNAm por qRT-PCR .......................................................... 62
3.5. Análise estatística ................................................................................................. 64
4. RESULTADOS ..................................................................................................... 65
4.1. Efeitos do tratamento com metformina nos parâmetros biométricos e metabólicos em animais saudáveis ...................................................................... 65
4.2. Implicações do tratamento com metformina no remodelamento elétrico cardíaco em animais saudáveis ............................................................................ 67
4.3. Efeitos da perfusão durante 30 min ou da incubação por 24 h com metformina no remodelamento elétrico de cardiomiócitos saudáveis .................. 77
4.4. Expressão de RNAm que codificam para subunidades que compõem o canal Ito. ................................................................................................................. 85
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 89
6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 96
7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 97
20
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações iniciais
Diabetes Mellitus (DM) é uma síndrome caracterizada por hiperglicemia
crônica e alterações no metabolismo de carboidratos, lipídeos e proteínas,
associadas com deficiência total ou parcial da secreção ou atividade da insulina.
Atualmente classifica-se a DM em 3 tipos principais, Diabetes Mellitus tipo 1 ou
insulino-dependente (DM1), Diabetes Mellitus tipo 2 ou resistente à insulina (DM2) e
Diabetes Mellitus Gestacional. Dentre os tipos de DM, a DM2 é a de maior incidência
na população com cerca de 90% dos casos, sendo elevado o número de óbitos,
principalmente, por doenças cardiovasculares (BOUDINA et al., 2007; OLOKOBA et
al., 2012; Cho et al., 2013). A DM Gestacional é aquela desenvolvida em mulheres
durante a gestação. Por fim, temos outros tipos de diabetes ocasionados por
defeitos genéticos, utilização de drogas ou indutores químicos (AMERICAN
DIABETES ASSOCIATION, 2012).
Nos últimos anos tem sido relatado que pacientes diabéticos sofrem de uma
forma de doença miocárdica que não está relacionada a doença arterial coronariana
ou à hipertensão arterial sistêmica, denominada de miocardiopatia diabética. A
miocardiopatia diabética (MCD) tem sido reconhecida como uma doença cardíaca
específica que incide em aproximadamente 30% dos pacientes com DM1 (Codinach-
HUIX & FREIXA-PAMIAS, 2002; OKOSHI et al., 2007), sendo primeiramente
descrita por RUBLER e colaboradores (1972). Esta patologia causa alterações
funcionais no sistema elétrico cardíaco, podendo ser constatada através do
eletrocardiograma (ECG). O ECG de pacientes diabéticos quando comparado com
indivíduos saudáveis pode apresentar prolongamento do intervalo QT, QTc (corrigido
pela frequência cardíaca) e aumento da dispersão do intervalo QT (QTd), alterações
que estão associadas a uma maior predisposição destes pacientes sofrerem
arritmias e morte súbita (KAHN et al., 1987; CARDOSO et al., 2001; VEGLIO et al.,
2002).
Apesar dos diversos tratamentos existentes para a Diabetes Mellitus,
associados a uma mudança no estilo de vida (alimentação, atividade física), a
metformina é o fármaco preferencialmente utilizado para o tratamento de DM2.
21
No ano de 1998 foi apresentado, no encontro anual da Associação Européia
para o Estudo da Diabetes (EASD), o estudo multicêntrico, desenvolvido no Reino
Unido denominado UK Prospective Diabetes Study (UKPDS, 34). Para este estudo,
foram recrutados pacientes portadores de DM2, com e sem sobrepeso. Estes foram
tratados somente com dieta ou com dieta e sulfonilureia ou metformina. Os
resultados mostraram um controle adequado da glicemia pelo uso de metformina e,
ainda, redução significativa dos riscos de doenças cardiovasculares e mortalidade.
Ademais, foi visto que este fármaco está associado a uma redução do peso e que
não induz hipoglicemia quando comparado à insulina e à sulfonilureia (UKPDS 33,
1998; UKPDS 34, 1998). Portanto, desde a publicação do UKPDS 34, a metformina
tornou-se o antidiabético oral mais utilizado na maioria dos países
(INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2005; NATHAN et al., 2009).
Todavia, apesar da publicação do estudo clínico randomizado (UKPDS 34)
relatando benefícios do fármaco, atualmente têm surgido questionamentos com
relação ao risco/benefício do seu uso terapêutico (BOUSSAGEON et al., 2012).
Estes questionamentos foram observados no ano de 2012, através da publicação
dos estudos de meta-análise de ensaios clínicos randomizados onde se avaliaram
os riscos e benefícios da metformina, baseados na morbimortalidade por doenças
cardiovasculares em pacientes com DM2 Estes estudos de meta-análise advertem
para efeitos negativos da metformina, relatando um aumento na mortalidade dos
pacientes diabéticos, não obesos, tratados somente com metformina o quando o
tratamento associa metformina e sulfonilureia em relação àqueles indivíduos que
controlam a diabetes apenas com dieta e exercício. Entretanto, a comunidade
científica frequentemente apenas enfatiza os resultados positivos para metformina
obtidos no UKPDS 34, ignorando os dados que foram desfavoráveis
(BOUSSAGEON et al., 2012) e que incluem aumentos de mortalidade por doenças
cardiovasculares entre os usuários da droga.
Em modelos animais de diabetes induzida, foram comprovadas alterações no
ECG, que se refletem no prolongamento da duração do potencial de ação (DPA)
cardíaco (LEGAYE et al., 1988; CASIS et al., 2000). Sendo este prolongamento
causado por mudanças na corrente transitória de saída de K+(Ito), corrente de K+
retificadora retardada ultra-rápida (IKur), rápida (IKr;), lenta (IKs), corrente retificadora de
22
entrada (IK1) e corrente de Ca2+ do tipo L (Ica-L), que estão envolvidas na repolarização
cardíaca (JOURDON & FEUVRAY, 1993; GALLEGO & CASIS, 2014). Foi
previamente demonstrado em cardiomiócitos provenientes de animais diabéticos,
que a amplitude da corrente Ito, responsável pela fase 1 do potencial de ação
cardíaco, está reduzida (MAGYAR et al., 1992; TORRES-JACOME et al., 2013).
Dentre os reguladores da corrente Ito está à proteína quinase ativada por AMP
(AMPK), uma enzima que atua como sensor energético intracelular e que pode ser
ativada em resposta ao estresse metabólico, seja ele fisiológico ou patológico, capaz
de causar alterações na relação AMP/ATP (XU et al., 1996; TORRES-JACOME et
al., 2013). A ativação da AMPK leva à estimulação de vias catabólicas que geram
ATP e inibe vias anabólicas que consomem ATP, como a síntese de determinadas
proteínas (HARDIE, 2014). Vários trabalhos têm relatado o envolvimento desta
quinase na regulação das correntes de K+ (IKs, IKr, Ito) e de Na+ (INa) (LIGHT et al.,
2003; ALESUTAN et al., 2011a; TORRES-JACOME et al., 2013).
Ainda não se conhece o mecanismo de ação pelo qual atua a AMPK
regulando a Ito; entretanto, sabe-se que a metformina é descrita como um ativador
da AMPK (ZHOU et al., 2001; COUGHLAN et al, 2014). Assim, pelo potencial
impacto da AMPK nas atividades metabólica, elétrica e contrátil emerge a extrema
importância conhecer os efeitos da metformina na atividade de canais iônicos
presentes em cardiomiócitos, visto que é o fármaco mais utilizado para o tratamento
da DM2 como previamente destacado (FORETZ & VIOLLET, 2014).
Sabendo-se então que a metformina ativa a AMPK e considerando que esta
enzima participa na regulação da corrente Ito (TORRES-JACOME et al., 2013), a
hipótese de trabalho da presente tese de doutorado é a de que a metformina poderia
alterar as correntes iônicas que participam da fase de repolarização ventricular,
comportando-se assim como um fármaco potencialmente arritmogênico.
1.2. Diabetes Mellitus
Como destacado no ponto anterior, a Diabetes Mellitus (DM) é classificada em
dois tipos principais. A DM1 ou insulino-dependente – que representa cerca de 10%
dos casos de diabetes – ocorre por uma deficiência na produção de insulina devido
a uma reação auto-imune, onde a presença de auto-anticorpos pode levar à
23
destruição de células β das ilhotas pancreáticas de Langerhans. Entretanto, nesta
patologia ainda existem situações onde ocorre destruição das células β na ausência
de auto-anticorpos e, por isso, a DM1 é denominada de idiopática. Já a DM2 ou
resistente à insulina, é aquela onde geralmente o pâncreas produz insulina
normalmente, mas os pacientes apresentam uma resistência à insulina e intolerância
à glicose; este tipo de diabetes representa cerca de 90-95% dos casos, como
mencionado anteriormente (OLOKOBA et al., 2012).
Segundo a Federação Internacional de Diabetes o número de casos de DM2
duplicará até o ano de 2035. Pacientes com DM2 geralmente apresentam
sobrepeso, estilo de vida sedentário e dieta hipercalórica
(www.idf.org/diabetesatlas/2014), fatores ambientais que contribuem para a
resistência à insulina.
Assim, a DM constitui um grave problema de saúde pública mundial devido ao
aumento da prevalência e na morbimortalidade. Pelos dados epidemiológicos
podemos relatar que esta síndrome é uma epidemia em curso, com alta incidência
em todos os continentes. Segundo a Federação Internacional de Diabetes, em 2014,
foram relatados aproximadamente 387 milhões de pessoas com diabetes, com uma
projeção para o ano 2035 de 592 milhões de pessoas diabéticas (Figura 1) e no ano
de 2014 foram constatadas 4,9 milhões de mortes por DM. A maioria das pessoas
acometidas tem entre 40−59 anos de idade, e cerca de 80% delas vivem em países
com poucos recursos (http://www.idf.org/diabetesatlas/2014).
No Brasil, um estudo multicêntrico sobre a prevalência da DM envolvendo
indivíduos de 9 estados no período de 1986 a 1988, numa faixa etária de 30−69
anos, relatou um percentual de 7,6% para casos de DM (MALERBI & FRANCO,
1992). Após 10 anos, outro estudo multicêntrico realizado no estado de São Paulo
seguindo os mesmos padrões anteriormente utilizados, constatou uma prevalência
de 12,1% para DM (TORQUATO et al., 2003). Ainda, segundo Wild e colaboradores
(2004) a população brasileira total portadora de diabetes no ano de 2000 foi
estimada em 4,6 milhões de pessoas, ocupando o oitavo lugar entre os países com
maior prevalência de DM no mundo, com uma previsão para 2030 de 11,3 milhões
de pessoas, chegando assim ao sexto lugar.
24
Figura 1. Mapa do mundo ilustrando o número de pessoas diabéticas nas diferentes regiões
(continentes e subcontinentes) no ano de 2014. (http://www.idf.org/diabetesatlas/update-2014).
25
Além dos vários problemas de saúde causados por esta enfermidade, a DM
tem gerado um alto impacto econômico. Grande parte dos recursos para os serviços
públicos de saúde é destinada para o tratamento desta patologia e suas
complicações, estimando-se o total mundial em mais de 600 bilhões de dólares. (Um
quadro da DM na saúde pública pode ser encontrada na Tabela 1)
(http://www.idf.org/diabetesatlas/2014).
1.2.1. Complicações Cardiovasculares
Evidências epidemiológicas indicam que a diabetes é um fator de risco
independente adicional para as doenças cardiovasculares e complicações
microvasculares. Estima-se que a taxa de doenças cardiovasculares é cerca de duas
vezes maior em pessoas com diabetes (GARCIA et al., 1974; OKOSHI et al., 2007).
Como já mencionado acima, em 1972 foi mostrado pela primeira vez que
pacientes com DM sofrem de uma doença denominada de miocardiopatia diabética
(MCD). Essa patologia é definida como uma disfunção ventricular na ausência de
doença arterial coronariana, doença valvular cardíaca ou hipertensão arterial
(RUBLER et al., 1972). A MCD é um fator de risco para o desenvolvimento de
insuficiência cardíaca em humanos. Esta informação foi comprovada em estudos
epidemiológicos que mostraram um aumento entre 2 (homens) e 5 vezes (mulheres)
na incidência de insuficiência cardíaca (IC) em diabéticos, quando comparado com
indivíduos não diabéticos (KANNEL & MCGEE, 1979; OKOSHI et al., 2007).
As principais manifestações clínicas em pacientes com MCD estão
relacionadas com a alta incidência de arritmias cardíacas, dentre elas a fibrilação
ventricular, principal causadora de morte súbita. Estas arritmias podem ser
comprovadas pelo fato de pacientes diabéticos apresentarem variações no ECG, tais
como no intervalo QT, na onda T e aumento da dispersão do QT (QTd). Estas
alterações no ECG refletem o aumento da duração do potencial de ação e
consequente redução das correntes iônicas envolvidas na repolarização cardíaca
(ROBILLON et al., 1999; CASIS & ECHEVARRIA, 2004; GALLEGO et al., 2009).
26
Tabela 1. Projeção da Diabetes Mellitus para o ano de 2035.
Diabetes no mundo (20 – 79 anos) 2014 2035
População adulta (bilhões) 4,6 5,9
Casos diabetes (milhões) 386,7 591,9
Prevalência global de diabetes (%) 8,3 10,1
Prevalência comparativa (%) 8,2 8,8
Casos não diagnosticados (milhões) 179,2 -Total de mortes por diabetes (milhões) 4,9 -Total de mortes menores de 60 anos de idade (%) 48,2 -Total de gastos com saúde (USD milhões) 612,2 627,3
Número de casos da doença, prevalência no mundo, casos não diagnosticados, morte por diabetes,
mortes com idade inferior a 60 anos e total de gastos em serviços de saúde associados à DM
(http://www.idf.org/diabetesatlas/update-2014).
27
Casis e colaboradores (2000), empregando um modelo animal de DM
induzida, mostraram que existe uma variabilidade regional na duração do PA
cardíaco e que em cardiomiócitos diabéticos o prolongamento do PA é maior no
endocárdio do ventrículo esquerdo e menor no ventrículo direito (Figura 2). O
prolongamento, observado pelos autores na duração do PA pode ser explicado por
uma alteração na densidade da corrente repolarizante (Ito) envolvida no PA.
Em resumo, tem sido descrito que a DM causa redução na amplitude da
corrente Ito (Figura 3) de maneira evidente e bastante homogênea em todas as
regiões cardíacas (MAGYAR et al., 1992; CASIS et al., 2000). Vários trabalhos
utilizando modelos animais de DM induzida relatam uma redução dessa corrente
(MAGYAR et al., 1992; JOURDON & FEUVRAY, 1993; SHIMONI et al., 1994).
1.3. Metformina
1.3.1. Aspectos gerais da metformina
O cloridrato de metformina (dimetilbiguanida) é um derivado da guanidina, um
composto ativo hipoglicemiante identificado pela primeira vez em 1918 na planta
Galega officinalis. Essa planta medicinal, também conhecida como Lilac Francês (Figura 4), foi utilizada por séculos na Europa desde a época medieval como
tratamento popular para poliúria durante a diabetes (ROVARIS et al., 2010; FORETZ
& VIOLLET., 2014).
Em 1957 foram realizados os primeiros experimentos com a classe das
biguanidas: fenformina (feniletilbiguanida), butformina (n-butil-guanidina) e
metformina (dimetilbiguanida), mostrando que entre as biguanidas, a metformina foi
a que apresentou o melhor índice de risco/benefício. Entre 1958 e 1959 as
biguanidas foram introduzidas para uso clínico; entretanto a fenformina e butformina
eram os agentes antidiabéticos de eleição na Alemanha e EUA (FORETZ &
VIOLLET, 2014). Atualmente a metformina é o único fármaco da classe das
biguanidas disponível para o tratamento de DM2, pois em 1976 a fenformina foi
retirada do mercado por causar acidose láctica e problemas cardiovasculares. Diante
dessa situação, a reputação da metformina também foi inicialmente prejudicada
28
Figura 2. Potencial de ação de três regiões do músculo ventricular: Ventrículo direito (RV), epicardio
do ventrículo esquerdo (EpiALV) e endocárdio do ventrículo esquerdo (EndoBLV) . (A) cardiomiócito
de animal controle; (B) cardiomiócito de animal diabético. Figura retirada de Casis et al., 2000.
29
Figura 3. Traçado representativo da corrente de potássio transitória de saída (Ito) em cardiomiócitos
do ventrículo esquerdo de ratos. A) Representação da corrente Ito em cardiomiócitos de animais
saudáveis; B) Representação da corrente Ito em cardiomiócitos de animais diabéticos. Para isso, foi
utilizado um protocolo de voltagem despolarizante, num tempo de 500 ms e incremento de 10 mV.
Figura retirada de Casis et al., 2000.
30
Figura 4. A) Planta medicinal Galega officinalis utilizada desde a idade média para o tratamento de
DM2. B) Estrutura química da metformina composta por duas moléculas biguanidas, descrita em
1922. Figura retirada de Foretz & Viollet, 2014.
31
(FORETZ & VIOLLET, 2014). No entanto, a partir da publicação do UKPDS 34 a
metformina tornou-se o fármaco mais prescrito para o tratamento da DM2 e,
atualmente, está entre os 10 medicamentos mais utilizados em todo o mundo.
Estima-se que em torno de 120 milhões de pessoas usem este fármaco (FORETZ &
VIOLLET, 2014).
Apesar do tratamento com metformina mostrar efeitos benéficos em pacientes
com DM2, um ensaio clínico randomizado destinado a avaliar – dentre os inúmeros
estudos existentes – se o tratamento intensivo para redução da glicose em pacientes
com DM2 causa complicações microvasculares, mortes em geral ou mortes por
causa cardiovascular (BOUSSAGEON et al., 2011), evidenciou um limite nos
benefícios dos fármacos que são utilizados para o tratamento da DM2 com
resultados preocupantes em relação à incidência de mortes cardiovasculares. Os
resultados obtidos indicaram um aumento de 43% para mortes por problemas
cardiovasculares e 19% por quaisquer outras causas. Portanto, o risco/benefício dos
fármacos utilizados no controle da glicemia e na prevenção de eventos
cardiovasculares necessita de maiores esclarecimentos. A partir de então, surgiu
uma maior preocupação não só com o controle da glicemia, mas também com os
efeitos adversos que os agentes farmacológicos como a metformina poderiam estar
causando (BOUSSAGEON et al., 2011). O mesmo grupo publicou em 2012 um novo
estudo de meta-análise, agora avaliando a eficácia da metformina no tratamento de
DM2. A partir dos dados obtidos, a eficiência da metformina na prevenção de morte
ou eventos cardiovasculares não foi confirmada. Portanto, não se pode assegurar se
este fármaco aumenta ou reduz os riscos de mortalidade, seja por causa
desconhecida ou por doenças cardiovasculares (BOUSSAGEON et al., 2012). Os
estudos de meta-análise alertam para os fármacos utilizados no tratamento de DM2.
Estes têm como papel principal controlar os níveis glicêmicos, entretanto a
preocupação deve ir mais além e é extremamente importante conhecer os potenciais
efeitos destes fármacos principalmente para o sistema cardiovascular
(BOUSSAGEON et al., 2011; BOUSSAGEON et al., 2012), visto que pacientes com
DM2 já apresentam alterações cardiovasculares decorrentes da própria patologia.
A metformina é apresentada em comprimidos de 500, 850 e 1000 mg, com
dose máxima de 2500 mg ao dia (http://www.mdsaude.com/2011/01/cloridrato-
32
metformina.html; ARAÚJO et al., 2000). Entretanto de acordo com os resultados de
alguns autores, a dose de 2000 mg/dia é mais efetiva (GARBER et al., 1997). A
administração deste fármaco ocorre por via oral (VIOLLET et al., 2012). Este
fármaco não é metabolizado pelo fígado, pois não se liga a proteínas carreadoras
plasmáticas, sendo excretado de forma inalterada pelos rins. Aproximadamente 30%
da dose oral é eliminada diretamente nas fezes e 50 a 60% absorvida através da
borda em escova do epitélio intestinal (BRODY et al., 2006; ROVARIS et al., 2010).
A análise de suas propriedades farmacocinéticas, revela que esta droga apresenta
um tempo de meia-vida que varia de 2−4 h (BRODY et al., 2006).
Os efeitos colaterais da metformina (não incluindo aqueles potencialmente
exercidos na atividade elétrica cardíaca) são bastante reduzidos, quando
comparados a os de outros antidiabéticos. Estima-se que em torno de 20−30% dos
pacientes que utilizam este fármaco apresentam distúrbios gastrointestinais como
náuseas, desconforto abdominal e diarréia (NEVES et al., 2009). Ademais, este
fármaco apresenta uma baixa incidência de acidose láctica: em torno de 1−10 casos
por cada 100.000/ano (WILLS et al., 2010). Este fármaco é conta-indicado para
indivíduos que apresentam problemas renais crônicos ou processos patológicos que
causem hipóxia ou isquemia (THOMSEN & MORCOS, 2003).
1.3.2. Mecanismo de ação da metformina
A metformina tem como principais alvos o fígado, intestino, músculo
esquelético e rim. Essa molécula é altamente hidrofílica, motivo pelo qual sua
passagem por difusão através da membrana plasmática é praticamente nula. Sendo
assim, necessita de um mecanismo que permite sua entrada nas células (FORETZ &
VIOLLET, 2014).
O transporte da metformina ocorre através dos transportadores catiônicos
orgânicos OCT-1 e OCT-2 (WANG et al., 2002; VIOLLET et al., 2012). O
transportador catiônico orgânico tipo 1 OCT-1 está presente na parede intestinal,
fígado e rim, já o OCT-2 encontra-se no rim (WANG et al., 2002). O fato do fígado
apresentar abundantes transportadores OCT-1 e não metabolizar a metformina torna
este órgão mais propício para o acúmulo deste fármaco (FORETZ & VIOLLET,
2014). Shu e colaboradores (2007) constataram que os transportadores OCT-1
33
desempenham papel importante não só na captação de metformina pelas células
hepáticas, como também no controle dos níveis da glicose na corrente sanguínea.
Este grupo suprimiu o gene para OCT-1 em camundongos, tratou os mesmos com
dieta rica em gordura e observou que nestes animais o tratamento com metformina
foi incapaz de reduzir os níveis de glicose sanguínea. Entretanto, no grupo de
camundongos expressando OCT-1 houve redução dos níveis de glicose quando
tratados com metformina (SHU et al., 2007).
A redução da glicemia através da metformina deve-se, principalmente, a suas
ações em nível hepático e muscular. A metformina atua como um ativador da AMPK,
quinase que, como mencionado anteriormente, funciona como um sensor energético
celular, onde em situações de estresse celular ocorre uma diminuição da relação
ATP/AMP e essa quinase passa a ser ativada. A partir de então, a AMPK inibe vias
anabólicas que demandem gasto de ATP e estimula vias catabolicas que gerem
ATP, tentando assim recuperar a homeostase energética celular (YOUNG et al.,
2005; HARDIE, 2014).
Diversos trabalhos comprovaram que a metformina é capaz de ativar a AMPK
em hepatócitos, em músculo esquelético de ratos (ZHOU et al., 2001), e em
hepatócitos humanos (células HepG2) insulino-resistentes (ZANG et al., 2004). Nas
células hepáticas (Figura 5), a inibição da gliconeogênese parece ser o primeiro
efeito da metformina resultante da ativação da AMPK, induzindo também uma
redução da síntese de ácidos graxos, colesterol e lipoproteínas, através da
fosforilação e consequente inativação da acetil-CoA carboxilase (ACC) e da
hidroximetil-glutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase) (ZHOU et al., 2001). Essa
ação contribui para o aumento da oxidação dos ácidos graxos, melhora na
sensibilidade à insulina e com consequente redução dos níveis de glicose sanguínea
(FULLERTON et al., 2013). Já no músculo esquelético, a ativação desta enzima
potencializa a captação de glicose, tanto durante o exercício físico quanto no
repouso (MUSI et al., 2001), contribuindo para o aumento da translocação dos
transportadores GLUT-4 (transportador de glicose insulino-sensível) para a
membrana plasmática independente dos níveis de insulina (TURBAN et al., 2012;
MALIN & KASHYAP, 2014).
34
Figura 5. Mecanismo de ação da metformina pela inibição do complexo I da cadeia respiratória. No
fígado, o transportador catiônico orgânico (OCT-1) é o responsável por transportar a metformina para
dentro dos hepatócitos. Já dentro da célula a metformina tem a capacidade de inibir parcialmente a
cadeia respiratória mitocondrial, mais precisamente o complexo I. Isso se traduz em um declínio das
concentrações de ATP e aumento das de AMP. Essa modificação se reflete na redução da
gliconeogênese hepática. Figura retirada de Violett et al., 2012.
35
Estas informações levaram atualmente a formular 2 principais hipóteses
acerca dos mecanismos de ação da metformina para o controle dos níveis de
glicose. A primeira propõe que ocorra por inibição do complexo I da cadeia
respiratória mitocondrial, diminuindo o fluxo de elétrons ao longo do sistema de
transporte de elétrons e colapsando parcialmente o potencial eletroquímico para H+,
resultando numa diminuição na relação ATP/AMP. O aumento do AMP induz a
ativação da AMPK, levando a inibição da gliconeogênese no fígado como descrito
acima. Sugerindo, portanto, que o complexo I da cadeia respiratória é o alvo primário
da metformina e que a ativação da AMPK ocorre de forma secundária (EL-MIR et al.,
2000; OWEN et al., 2000). Esta hipótese foi comprovada em outros tipos celulares
como músculo esquelético (BRUNMAIR et al., 2004), células endoteliais (DETAILLE
et al., 2005), células ß pancreáticas (HINKE et al., 2007) e neurônios (EL-MIR et al.,
2008).
A segunda hipótese foi formulada uma década atrás, através de um trabalho
publicado por Shaw e colaboradores (2005), demonstrando que a deleção do gene
para o supressor de tumor humano liver kinase B1 (LKB1) em ratos tratados com
metformina, reduziu a fosforilação da AMPK no resíduo Thr172. O gene LKB1, como
demonstrado há mais de 10 anos, codifica uma Ser/Thr quinase que fosforila
diretamente e ativa a AMPK (HONG et al., 2003). Essa hipótese perdurou por muitos
anos (SHAW et al., 2005; FORETZ & VIOLLET, 2009). Contudo, um trabalho mais
recente publicado por Foretz e colaboradores (2010) demonstrou que silenciando
simultaneamente os genes para LKB1/AMPK (LKB1-/AMPK-), a metformina foi
também capaz de reduzir os níveis de glicose por inibição da gliconeogênese
hepática, sugerindo que a metformina age independente de LKB1/AMPK (FORETZ
et al., 2010). Portanto, os mecanismos de ação da metformina continuam
controversos e obscuros, necessitando de maiores estudos para definir os efeitos
dependentes e independentes da AMPK, inclusive ao nível de alvos cardíacos
potencialmente envolvidos nos efeitos arritmogênicos da droga.
36
1.4. Canais iônicos envolvidos na repolarização cardíaca
Durante o processo de repolarização cardíaca, diferentes correntes de K+ (Ito,
IKur, IKr, IKs, IK1) e Ca2+ (Ica-L) desempenham papel importante nas fases da
repolarização ventricular (Figura 6). Sabemos que pacientes diabéticos apresentam
um aumento na duração do potencial de ação (PA) que é decorrente da redução da
corrente Ito. Esta corrente é responsável pela rápida repolarização inicial e também
determina a amplitude e duração da fase 2 ou platô do potencial de ação junto com
a corrente ICa-L (GALLEGO & CASIS, 2014). Portanto, uma alteração nesta corrente
pode repercutir nas demais. Assim sendo, uma redução de Ito pode alterar também a
amplitude da corrente ICa-L envolvida na fase 2 do PA cardíaco.
1.4.1. Estrutura dos canais de K+ dependentes de voltagem (KV)
Dentre todos os tipos canais iônicos conhecidos, os canais de K+ constituem o
maior e mais diversificado grupo,, apresentando cerca de 70 locus conhecidos no
genoma de mamíferos. Estes canais compartilham uma propriedade comum: são
seletivos aos íons K+. Os canais de K+ dependentes de voltagem constituem a maior
e mais diversificada família, composta por 40 tipos distribuidos em 12 subfamílias
(KV1−KV12). Estas subfamílias são divididas de acordo com a semelhança entre as
sequências de aminoácidos (GUTMAN et al., 2005).
Os canais de K+ dependentes de voltagem (KV) são compostos por
subunidades funcionais e regulatórias. As subunidades α são as responsáveis por
formar o canal, sendo que para este ser funcional é necessário um arranjo de 4
subunidades do tipo α. Diante dessa característica, estes canais são denominados
de tetraméricos, podendo apresentar estrututura homotetramérica ou
heterotetramérica variando de acordo com a espécie. O domínio transmembrana
destes canais consiste de 6 segmentos (S1−S6) onde os segmentos S1−S4
funcionam como um domínio sensível a voltagem e os segmentos S5 e S6
participam na formação do filtro de seletividade do canal (Figura 6) (GRIZEL et al.,
2014).
37
Kv4.2Kv4.3Kv1.4
Vista superior Vista frontal
Genes que codificam a
subunidade α
A B
C D
Figura 6. Estrutura dos canais de K+ dependentes de voltagem responsáveis por conduzir a corrente
Ito. (A) Estrutura tetramérica do canal de K+ dependentes de voltagem, este para ser funcional
necessita de 4 subunidades α. Ainda observa-se em distintas cores que os segmentos S5 e S6 de
cada subunidade α de arranjam com os outros segmentos S5 e S6 das outras subunidades e formam
o poro do canal, conferindo a seletividade do respectivo canal. (B) Vista frontal do arranjo das
subunidades α na membrana plasmática associada à subunidade regulatória intracelular que em
cardiomiócitos a principal é a KChIP2. (C) Estrutura de uma subunidade α, composta por 6
segmentos transmembrana (S1−S6), onde o S4 funciona como sensor de voltagem e S5 e S6 formam
o poro do canal. (D) Diferentes genes responsáveis por codificar a subunidade α. Em humanos esta
subunidade é codificada somente por por KV4.3 (resultando num homotetramero). Já no epicárdio de
ratos os genes respectivos codificam um heterotetramero de KV4.2/KV4.3, enquanto no endocárdio
encontra-se um homotetramero de KV4.3, produto do gene KV4.3. O gene KV1.4 está presente em
ambos mamíferos, contudo em menor expressão. Figura adaptada de Pongs & Chwarz, 2010; Grizel
et al., 2014.
38
1.4.2. Corrente transitória de saída de K+ (Ito)
A corrente Ito é responsável por modular o início da repolarização ventricular
que vai desde o pico do PA até a fase 2. Na década de 60−70, se realizaram os
primeiros experimentos para registrar esta corrente, utilizando preparações
multicelulares obtidas a partir das fibras de Purkinje (DECK et al., 1964; FOZZARD &
HIRAOKA, 1973). No ano de 1984, Josephson e colaboradores (1984) registraram
pela primeira vez esta corrente em cardiomiócitos ventriculares de ratos.
A corrente Ito subdivide-se em 2 grupos, sendo eles o de correntes rápidas
(Ito,fast ou Ito,f) e o de correntes lentas (Ito,slow ou Ito,s) (XU et al., 1999; NERBONNE,
2000), subdivisão que ocorre de acordo com as propriedades moleculares, cinéticas
e farmacológicas das respectivas correntes (PATEL & CAMPBELL, 2005).
Os genes KV1.4, KV4.2 ou KV4.3 codificam as subunidades α, responsáveis
por conduzir as correntes Ito. Atualmente está bem aceito que KV1.4 conduz Ito,s,
KV4.2 e KV4.3 conduzem a Ito,f (DIXON et al., 1996), sendo que o arranjo destas
proteínas pode variar de acordo com a espécie animal. Por exemplo, em humanos a
estrutura responsável pela Ito é um homotetrâmero de canais KV4.3, em ratos é o
heterotetrâmero de canais KV4.2/KV4.3; em coelho é o homotetrâmero de canais
KV1.4. Contudo, a estrutura básica é bastante semelhante para todos como descrito
em 1.4.1, se diferenciando nas propriedades cinéticas (PATEL & CAMPBELL, 2005;
GALLEGO et al., 2009).
Os grupos de correntes de K+ transitórias de saída já foram descritas no
coração de diferentes mamíferos (Tabela 2). Por exemplo, a Ito,f, está presente em
cardiomiócitos ventriculares humanos (AMOS et al., 1996), de rato (WICKENDEN et
al., 1999), de gato (FURUKAWA et al., 1990), de cachorro (LITOVSKY &
ANTZELEVITZ, 1988), de furão (CAMPBELL et al., 1993) e de camundongo (XU et
al., 1999); já a Ito,s apresenta-se especialmente em coelhos (GILES & IMAZUMI,
1988). Ainda, as duas correntes foram descritas em camundongos (Xu et al., 1999),
humanos (NÄBAUER et al., 1996) e em ratos (WICKENDEN et al., 1999).
39
Tabela 2. Painel ilustrando a diversidade da corrente transitória de saída de K+ (Ito) em cardiomiócitos
de mamíferos.
As correntes Ito são subdivididas em 2 grupos: Ito,fast ou Ito,f corrente que tem como característica
principal uma ativação/inativação rápida; e a Ito,slow ou Ito,s que apresenta uma ativação/inativação
lenta.
Corrente Ativação Inativação Gene Localização Espécie
Ito, fast Rápida Rápida KV4.2 e/ou
KV4.3 Aurícula
Humano, rato, cachorro
e camundongo
Ito, fast Rápida Rápida KV4.2 e/ou
KV4.3 Ventrículo
Gato, humano, rato,
cachorro, camundongo
Ito, slow Lenta Lenta KV1.4 Aurícula,
Nodo Coelho
Ito, slow Lenta Lenta KV1.4 Ventrículo
Furão, humano,
camundongo, rato, coelho
40
Apesar de existirem ambas as correntes na maioria das espécies,
normalmente uma predomina sobre a outra; por exemplo, em humanos (AMOS et
al., 1996) e ratos predomina a Ito,f (WICKENDEN et al., 1999).
As principais subunidades regulatórias da Ito são as chamadas KV channel
interating proteins (KChIPs), membros da família dos sensores de Ca2+ neuronal
(NCS), uma subfamília de proteínas de ligação de Ca2+ que interagem com os
canais KV através do domínio citoplasmático N-terminal (IKURA, 1996). An e
colaboradores (2000) identificaram 3 isoformas das KChIPs (KChIP1, KChIP2 e
KChIP3) codificadas por diferentes genes. No coração a isoforma presente é a
KChIP2 (AN et al., 2000; ROSATI et al., 2001) responsável por regular as
subunidades α da subfamília KV4.x (AN et al., 2000). As isoformas da proteína
regulatória KChIPs podem modular a corrente Ito, por exemplo diminuindo a
velocidade de inativação do canal, acelerando o componente lento de inativação, ou
acelerando a recuperação da inativação (PATEL & CAMPBELL, 2005). Alguns
destes processos foram investigados na presente tese ao analisar os efeitos da
metformina na atividade elétrica cardíaca.
1.4.3. Papel fisiológico da corrente Ito
Durante as fases do PA cardíaco, diferentes correntes iônicas estão
envolvidas, sendo que na fase 0 a corrente de entrada de Na+ (INa) é a principal
responsável por esta fase; já na fase 1 a corrente transitória de saída de K+ (Ito)
desempenha papel fundamental na repolarização rápida e inicial; na fase 2 ocorre
um contrabalanço entre a corrente de entrada ICa-L e as correntes de K+ retificadoras
rápida e lenta (IKr e IKs). Durante a fase 3 do PA ocorre o fechamento dos canais de
Ca2+ tipo L e abertura com aumento das correntes de K+. Finalmente, a corrente de
K+ retificadora retardada IK1 restaura e mantém o potencial de membrana durante a
fase 4 do PA (observar na Figura 7) (GALLEGO et al., 2014).
A corrente transitória de saída de K+ é uma das correntes repolarizantes
presente no coração e determina a DPA cardíaco. A DPA depende da amplitude da
corrente Ito, ou seja, quanto maior a corrente, menor a DPA. Por exemplo, em
41
Figura 7. Traçado representativo ilustrando as 5 fases envolvidas no potencial de
ação cardíaco (P0, P1, P2, P3 e P4) e suas respectivas correntes ionicas. Estão
representadas as correntes de saída de K+ (Ito, IKs, IKr), corrente retificadora IK1 e as
correntes de entrada de Ca2+ e Na+ respectivamete (Ica-L e INa). Em vermelho damos
ênfase as fases 1 e 2 do potencial de ação cardíaco visto que neste trabalho
inicialmente será abordada a corrente Ito responsável pelo início da fase 1 e duração
da fase 2 do PA cardíaco. Figura retirada e adaptada de Curran & Mohler, 2015.
42
cardiomiócitos de roedores adultos e em células auriculares humanas, a fase 2 dura
menos, refletindo em uma menor DPA (WETTWER et al., 1993; WANG et al., 1994;
AMOS et al., 1996; RODEN & GEORGE, 1997; CASIS et al., 1998).
A fase 2 do PA inicia-se quando a corrente Ito começa se inativando. Portanto,
quanto maior a amplitude da corrente Ito, mais tempo esta corrente necessita para se
inativar e, com isso, a fase platô ocorre em potenciais mais repolarizados. Isso
explica por que em regiões ventriculares onde a amplitude da corrente Ito é maior,
como por exemplo, em ventrículo direito e epicardio do ventrículo esquerdo, o PA é
menor (CASIS et al., 1998). Por outro lado, a redução na amplitude da corrente Ito
prolonga a DPA (DUKES & MORAD, 1989). O prolongamento na DPA pode ser
encontrado em distintas patologias como diabetes, hipertrofia, insuficiência
cardíaca, isquemia, infarto do miocárdio. Este prolongamento pode ser explicado
por uma redução na amplitude da corrente Ito, redução essa que gera o surgimento
de arritmias e uma maior susceptibilidade de morte súbita (LUE & BOYDEN, 1992;
BEUCKELMANN et al., 1993; RODEN & GEORGE, 1997). Esta foi uma ideia que
esteve presente ao delinear os objetivos da presente tese.
1.5. Regulação da corrente Ito pelo sistema nervoso simpático
1.5.1. Receptores adrenérgicos no coração
O sistema nervoso simpático desempenha papel importante no que se
refere à forma e duração do PA cardíaco, uma vez que tem a capacidade de regular
as correntes iônicas envolvidas no processo de repolarização ventricular (GALLEGO
et al., 2014). Os receptores adrenérgicos fazem parte da família de receptores
acoplados à proteína G. Essa proteína é composta por uma cadeia polipeptídica,
contendo 7 segmentos transmembrana, com o extremo N- terminal extracelular e o
extremo C-terminal intracelular. Na região entre os segmentos S5 e S6 ocorre à
interação entre o receptor e a proteína G (HOELZ et al., 2013).
Os receptores α-adrenérgicos subdividem-se em α1 e α2, sendo expresso no
coração apenas o receptor do tipo α1. Existem diferentes subtipos de receptores α1,
sendo que o mais expresso no coração e predominante em humanos é o do tipo α1A
43
(BYLUND et al., 1994; PRICE et al., 1994). Em geral, os receptores α1-adrenérgicos
estão ligados à proteína Gαq e sua ativação estimula a PLC. Essa enzima produz IP3
que estimula a saída do Ca2+ armazenado nos compartimentos intracelulares e DAG
que estimula a PKC. Essa quinase é capaz de regular diversas proteínas celulares,
dentre elas, os canais iônicos de Ca2+ e K+ (SINGER-LAHAT et al., 1992;
NAKAMURA et al., 1997).
Os receptores β-adrenérgicos são os maiores reguladores quando se analisa
a fisiologia cardíaca como um todo. Existem 4 tipos de receptores β (β1, β2, β3 e β4)
todos presentes no coração dos seres humanos (BYLUND et al., 1998). A ativação
destes receptores resulta da ligação com a proteína Gαs, e leva a um aumento nos
níveis de AMPc, resultando na ativação de PKA. Dentre os tipos de receptores
citados, o tipo β1 é amplamente distribuído no tecido cardíaco, produzindo efeitos
inotrópicos (aumento da força de contração cardíaca) e cronotrópicos (aumento do
ritmo cardíaco) positivos (SETIÉN et al., 2013).
A noradrenalina é um tipo de catecolamina que atua sobre a corrente Ito de
duas formas distintas. Através dos receptores β-adrenérgicos (β-AR), desempenha
um efeito trófico sobre a corrente Ito assegurando sua ocorrência em níveis
fisiológicos normais. Enquanto que através dos receptores α1-adrenérgicos (α-AR)
atua de forma oposta, estimulando a redução da amplitude da corrente Ito
(GALLEGO et al., 2005).
1.5.2. Efeitos da estimulação noradrenérgica sobre a corrente Ito
Ao estudar os efeitos da noradrenalina obtiveram-se informações
contraditórias no que diz respeito aos efeitos que este hormônio exerce sobre a
corrente Ito. Vários trabalhos têm sido publicados relatando que o sistema nervoso
simpático exerce efeitos tróficos sobre várias correntes iônicas, dentre as quais
encontra-se a Ito. A maioria dos trabalhos relata que durante o desenvolvimento
embrionário a amplitude da corrente Ito é pequena. Por exemplo, em cachorros, a
maturação da corrente Ito ocorre entre a 10ª e a 20ª semana de desenvolvimento
pós-natal (JECK & BOYDEN, 1992; PACIORETTY & GILMOUR, 1995), período
44
também em que se completa a maturação do sistema nervoso simpático (URSELL et
al., 1990). Em ratos, a maturação da inervação do sistema nervoso simpático e a
maturação da corrente Ito ocorrem de forma paralela entre o 5ª e o 15ª dia de
desenvolvimento pós-natal (LIU et al., 1998; CHAPARRO et al., 1998), efeitos que
são mediados pelos receptores β-adrenérgicos.
Como já citado anteriormente, diversos estudos demonstraram que distintas
patologias causam redução da corrente Ito, dentre elas estão a DM1 (CASIS et al.,
2000), a hipertrofia cardíaca (TOMITA et al., 1994), o infarto do miocárdio (LUE &
BOYDEN, 1992), as arritmias ventriculares (FREEMAN et al., 1997), e a insuficiência
cardíaca (NÄBAUER et al., 1993). Além disso, nestas patologias em que ocorre uma
redução da corrente Ito, o sistema nervoso simpático também está alterado devido a
uma diminuição na produção da adrenalina, noradrenelina e dopamina, sugerindo
uma redução na atividade neuronal simpática (YOSHIDA et al., 1985; PACIORETTY
& GILMOUR, 1998; GALLEGO et al., 2014). O sistema nervoso simpático
desempenha papel importante na regulação da frequência cardíaca, força de
contração como também de diferentes correntes de K+ cardíacas, incluindo a
corrente Ito (GALLEGO et al., 2014; SETIÉN et al., 2013).
1.5.3. Efeitos inibitórios sobre a corrente Ito
De maneira contrastante, outros estudos vêm demonstrando que a estimulação
noradrenérgica reduz a Ito em diferentes modelos experimentais como rato (TOHSE
et al., 1990), cachorro (NAKAYAMA & FOZZARD, 1988), gato (HARTMANN et al.,
1988), frango (LEATHERMAN et al., 1987), coelho (FEDIDA et al., 1990). A redução
desta corrente parece dever-se à ativação dos receptores α1-adrenérgicos. Em
cardiomiócitos de rato, o mecanismo responsável pela ativação dos receptores α1-
adrenérgicos (GALLEGO & CASIS, 2001; GALLEGO et al., 2005), induzindo a
redução da corrente Ito, essa redução parece estar relacionado também à ativação
da proteína Gαs. Este acoplamento ativa a via AMPc/PKA, fosforilando o canal Ito e,
com isso, reduzindo a amplitude da corrente Ito em até 35%. Claramente, estes
efeitos opostos resultam da fosforilação seletiva de diferentes aminoácidos
associados à ativação de uma ou outra classe de receptores adrenérgicos.
45
1.6. Canais de Ca2+ dependentes de voltagem
As subunidades dos canais de Ca2+ são codificadas por 10 diferentes genes.
Historicamente vários nomes foram dados aos produtos destes genes, originando
nomenclaturas distintas e muitas das vezes confusas. Atualmente, a nomenclatura
utilizada para os canais de Ca2+ é baseada na definida para os canais de K+, ou
seja, utilizando o símbolo químico do principal íon permeável (Ca2+), associado ao
seu regulador fisiológico (voltagem) (CATTERALL et al., 2005).
As subunidades dos CAVS (canais de cálcio dependentes de voltagem) são
divididas em 3 famílias (Cav1, Cav2 e Cav3) de acordo com sua estrutura e
funcionalidade (Ertel et al., 2000). A família Cav1 apresenta as subfamílias
Cav1.1-Cav1.4, contendo as isoformas α1s, α1D e α1F as quais conduzem as corrente
de Ca2+ tipo L (ICa-L). Das 10 isoformas da subunidade α1, somente a α1c (Cav 1.2)
encontra-se em altos níveis no músculo cardíaco e vascular, representando mais de
80% das subunidades α1 associadas ao canal de Ca2+ tipo L. A isoforma α1D (Cav
1.3) também está presente no músculo atrial, porém em nível menor (NASCIMENTO
et al., 2008).
Conforme as diferentes características de suas correntes, estes canais foram
divididos nos tipos T, L, N, P, Q e R (conforme mostrado na Tabela 3). Dentre os
tipos de canais de Ca2+ citados anteriormente, 2 estão presentes no coração: o tipo L
e o tipo T. O papel fisiológico dos canais do tipo T depende da espécie do mamífero,
idade e região cardíaca. Duas isoformas de canais de Ca2+ tipo T (Cav3.1 e Cav3.2)
são funcionalmente expressas no coração de embriões; contudo durante o
desenvolvimento embrionário essa expressão torna-se reduzida. Em indivíduos
adultos este tipo de canal é praticamente indetectável em cardiomiócitos
ventriculares, prevalecendo nas células envolvidas no sistema de condução
cardíaco, facilitando assim a despolarização do nodo sinoatrial (ONO & LIJIMA,
2010).
As correntes de Ca2+ tipo L (ICa-L) presentes no átrio e ventrículo direito de
cardiomiócitos humanos exibem propriedades semelhantes quando comparadas as
46
Tabela 3. Painel ilustrativo canais de cálcio dependentes de voltagem (ICa) codificados por distintos
genes.
Os canais de Ca2+ dependentes de voltagem se agrupam em 3 famílias (CaV1, CaV2 e CaV3), com
distintos tipos de canais (L, P/Q, N, R e T), conforme indicado acima, segundo Catterall et al., 2005.
Família/subfamília Canal/corrente Gene
CaV1.1 L CACNA1S
CaV1.2 L CACNA1C
CaV1.3 L CACNA1D
CaV1.4 L CACNA1F
CaV2.1 P/Q CACNA1A
CaV2.2 N CACN1B
CaV2.3 R CACNA1E
CaV3.1 T CACNA1G
CaV3.2 T CACNA1H
CaV3.3 T CACNA1I
47
encontradas em outras espécies de mamíferos (CORABOEUF & NARGEOT, 1993;
RICHARD et al., 1998). A amplitude da ICa-L é maior no ventrículo quando
comparada com a da aurícula, sendo também maior em indivíduos na idade adulta
que durante a infância (COHEN & LEDERER, 1993). As propriedades cinéticas
deste tipo de canal em humanos são similares às encontradas em cardiomiócitos de
animais (BEUCKELMANN et al., 1991; OUADID et al., 1991; SUN et al., 1997;
PELZMANN et al., 1998). Os canais de Ca2+ do tipo L desempenham um papel
principal no processo de acoplamento, excitação e contração desencadeando a
liberação de íons Ca2+ armazenados no reticulo sarcoplasmático, como também são
responsáveis por manter o longo período de despolarização da fase 2 do PA atrial e
ventricular, bem como pela fase 0 do PA lento nas células do nodo sinoatrial e nodo
atrioventricular (HAGIWARA et al., 1988; MCDONALD et al., 1994).
Observa-se que, quando se comparam as correntes de Ca2+dependentes de
voltagem tipo L e tipo T, apesar das duas serem correntes de influxo, existe algumas
diferenças como: (i) os canais do Ca2+ tipo L (Ica, L) são ativados a partir de potenciais
menos negativos (-30 a -20 mV) e quanto à cinética inativam-se mais lentamente; (ii)
os canais de Ca2+ do tipo T (ICa,T) são ativados quando o potencial de membrana
alcança -60 a -50 mV e cineticamente se ativam e inativam mais rapidamente.
Os canais de Ca2+ do tipo L apresentam 2 tipos principais de inativação: (i)
dependente de voltagem; (ii) dependente de Ca2+. A substituição no meio
extracelular dos íons Ca2+ por Ba2+ é uma forma de eliminar a componente de
inativação dependente do Ca2+, restando assim apenas o componente de inativação
dependente de voltagem. Atualmente se aceita que há 2 principais mecanismos de
inativação dependentes de voltagem, por constrição do poro (inativação do tipo C)
ou oclusão do poro (inativação do tipo N), tipos de inativação que também podem
ser vistos nos canais de Na+ e KV. A inativação dos canais de Ca2+ tipo T parece
ocorrer pelo mecanismo de "bola e cadeia" (inativação tipo N); entretanto este
mecanismo ainda não foi totalmente esclarecido (NASCIMENTO et al., 2008).
As correntes descritas nas seções anteriores podem estar envolvidas nos
mecanismos fisiopatogênicos de arritmias ocasionados pela administração de
48
metformina. Por isso, elas foram levadas em consideração para formular os objetivos
e para delinear diversos protocolos experimentais da presente tese.
49
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo geral desta tese foi investigar o efeito da metformina na
eletrogênese cardíaca e seu potencial arritmogênico, avaliando potenciais
mecanismos subjacentes ao nível de canais de K+ e Ca2+.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar se o tratamento prolongado (10 semanas) com metformina modulam os parâmetros eletrocardiográficos em animais saudáveis;
Investigar se a exposição à metformina modifica as principais correntes que participam na repolarização ventricular, estudando as correntes Ito e ICa-L;
Definir os mecanismos moleculares responsáveis por alterações nas correntes estudadas.
50
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Os procedimentos experimentais desenvolvidos na presente tese foram
aprovados pelo comitê de ética da Universidade del País Vasco (UPV/EHU,
CEBA/273M/2012). Os protocolos de manipulação, tratamento e sacrifício destes
animais seguiram as diretrizes nacionais (Real Decreto 223 de 14 de março de
1988) e européias (Diretriz 609 do Conselho da Comunidade Econômica Européia
de 24 de março de 1986). Uma vez que partes dos resultados foram obtidos na
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) os procedimentos também contaram
com a aprovação da Comissão de Ética para o Uso de Animais em Pesquisa do
Centro de Ciências da Saúde da UFRJ (CEUA, número 26).
Foram utilizados ratos fêmeas Sprague-Dawley entre 2 e 3 meses de idade,
com peso entre 220 e 250 g, mantidos em um ambiente controlado de temperatura
(22 ± 1º C) e exposição à luz num ciclo padrão claro/escuro (12 h/12 h). Para os
experimentos de potencial de ação e reação em cadeia da polimerase em tempo real
(qRT-PCR) – conduzidos na UFRJ − foram utilizadas fêmeas Wistar com idade e
peso semelhantes aos do grupo anterior.
3.2. Estudo dos efeitos do tratamento de ratos saudáveis com metformina durante 10 semanas sob: glicemia, peso e ECG
Para avaliar o efeito da metformina nos parâmetros eletrocardiográficos foram
utilizados 2 grupos experimentais: (i) grupo controle; (ii) grupo tratado com
metformina 35 mg/kg por dia (Sigma-Aldrich®), administrada diariamente na água de
beber durante 10 semanas consecutivas. Neste estudo foram utilizadas
concentrações de 35 mg/kg por dia de metformina em 40 ml de água, mimetizando
assim a dose utilizada nos pacientes que necessitam de doses altas deste fármaco.
Ainda, o tempo de tratamento por 10 semanas foi escolhido para simular um
tratamento prolongado. Após e durante o tempo experimental (10 semanas)
diferentes parâmetros biométricos e funcionais foram registrados, tal como descrito a
seguir.
51
3.2.1. Avaliação dos parâmetros biométricos
Os animais de ambos os grupos experimentais foram pesados ao inicio
(tempo 0) e semanalmente durante 10 semanas em balança analítica (Mettler). Ao
final dos experimentos descritos em cada protocolo e das avaliações in vivo, os
animais foram anestesiados e sacrificados mediante uma injeção intraperitoneal de
hidrato de cloral (Sigma-Aldrich®) a 6% diluído em soro fisiológico (NaCl 0,9%). Os
corações foram pesados e a massa cardíaca foi aferida em termos absolutos (g) e
relativos, normalizando o peso do coração pelo peso corporal correspondente
(mg/g), uma relação utilizada para detectar hipertrofia cardíaca (SCHAIBLE &
SCHEUER, 1979).
3.2.2. Avaliação da glicemia
Como a metformina é um agente utilizado na Diabetes Mellitus visando
diminuir os níveis glicêmicos, no presente trabalho foi acompanhada a glicemia dos
animais em jejum de 12 h. A primeira medida foi realizada antes de iniciar o
tratamento com metformina (Tempo 0) e depois a cada 15 dias, durante o período de
tratamento de 10 semanas. Para dosar a glicose plasmática foi utilizado um
glicosímetro e tiras-reagentes apropriadas (Onetouch®). Os animais foram
anestesiados com isoflurano (Sigma-Aldrich®) com auxílio de uma câmara de
ventilação. Posteriormente, utilizando uma agulha de 0,60 × 25 mm (Sterican®) foi
coletada uma gota de sangue caudal, colocada na fita reagente e, com o
glicosímetro, foram aferidos os valores de glicemia.
3.2.3. Monitoramento e análise do eletrocardiograma (ECG) de animais conscientes
Para aquisição do ECG, foram implantados três eletrodos subcutâneos de aço
cirúrgico mediante anestesia com isoflurano e auxílio de uma câmara de ventilação.
Para isso, as áreas de interesse foram depiladas, desinfestadas com álcool 70% e,
com auxílio de uma agulha de 0,13 × 65 mm (Sterican®), a pele foi perfurada para
rapidamente inserir os eletrodos no tecido subcutâneo. Os eletrodos foram
localizados nas seguintes regiões: (i) acima da pata traseira direita; (ii) acima da pata
52
traseira esquerda; e (iii) acima da pata dianteira direita, correspondendo à derivação
DII do ECG, o que permite obter um registro típico como o mostrado na Figura 8.
Os registros sempre foram realizados nos animais acordados e após 24 h de
terem sido implantados os eletrodos, visando evitar influências do anestésico nos
registros. Ainda, os mesmos se realizaram sempre nos horários da manhã, evitando
assim efeitos do ritmo circadiano no ECG. Os eletrodos permaneceram nos animais
durante todo o tratamento e, como mencionado acima, foram conectados aos cabos
de registro na posição adequada para obter a derivação DII. Estes por sua vez,
foram conectados a um amplificador (Biopac Mp35®) com sinal filtrado em 150 Hz e
o ECG foi registrado a uma velocidade de 50 mm/s por aproximadamente 10 min
com auxílio de um computador acoplado. Vale ressaltar que a aquisição dos dados
foi realizada pelo menos 5 a 10 min após a conexão dos cabos aos eletrodos,
visando não influenciar os dados com o estado “agitado” dos animais nesses
primeiros momentos. Os dados foram armazenados no computador e analisados off-
line com o auxílio do software LabChart 7 (ADInstruments). Para as análises dos
registros foram selecionados 10 batimentos cardíacos estáveis e consecutivos de
pelo menos 3 tempos diferentes durante o total do registro (10 min). Os parâmetros
analisados estão resumidos na Tabela 4.
3.3. Estudo do efeito direto de metformina sob a repolarização ventricular
3.3.1. Registro do potencial de ação
Com o objetivo de avaliar o efeito da metformina sob o potencial de ação
cardíaco (PA), foram utilizados ratos Wistar fêmeas de 200−250 g. Os animais foram
heparinizados (500 µl de uma solução de heparina sódica diluída em 0,25 ml de
água ultrapura Hemofol® por 100 g de peso do animal), anestesiados com isoflurano
e posteriormente sacrificados por deslocamento cervical. Primeiramente, os
corações foram extraídos da cavidade torácida e rapidamente colocados em um
sistema de Langendorff onde foram canulados pela artéria aorta e perfundidos com
um fluxo constante de 10 ml/min com 50 ml de solução Tyrode por aproximadamente
5 min, contendo (em mM): NaCl 150,8; KCl 5,4; CaCl2 1,8; MgCl2 1, glicose 11;
53
Figura 8. Registro de eletrocardiograma em rato Sprague-Dawley controle na derivação II. A letras
sinalizam as ondas clásicas do ECG.
54
Tabela 4. Parâmetros avaliados no ECG de animais conscientes durante o período de 10 semanas.
Parâmetro ECG Unidade Descrição
Intervalo RR ms Intervalo entre duas ondas R. Representa a frequência de despolarização ventricular.
Intervalo PR ms
Intervalo entre o início da onda P e início do complexo QRS. Corresponde ao tempo de despolarização dos átrios e à condução do impulso elétrico desde o nodo atrio-ventricular até os ventrículos.
Complexo QRS ms Complexo medido desde o começo da onda Q até o final da onda S. Corresponde à despolarização ventricular.
Intervalo QT ms
Intervalo medido desde o começo do complexo QRS até o final da onda T. Reflete a duração da atividade elétrica ventricular.
Intervalo QTc ms
Duração do intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca. O intervalo QT foi corrigido pela fórmula de Bazett: QTc = QT/√RR, onde RR corresponde ao intervalo (em s) desde o começo de um complexo QRS até o início do seguinte (Bazett, 1920).
Tpeak-Tend ms
Duração do intervalo correspondente desde o pico da onda T até o final da onda T. Representa a dispersão transmural da repolarização (Mill, 2008).
55
HEPES 10 (pH ajustado para 7,4 com NaOH). A solução foi mantida a temperatura
constante de 37 ± 0,5 °C. Um grupo de corações foi perfundido com solução Tyrode
acrescida de metformina (10 mM), após 5 min de perfusão, o ventrículo esquerdo de
cada coração foi isolado e incubado por 24 h a 4 °C nas mesmas soluções com as
quais foram perfundidos. A concentração de metformina escolhida obedece ao fato
de que já foi demostrado que 10 mM do fármaco é suficiente para ativar a AMPK,
enzima que participa no postulado mecanismo pelo qual a metformina poderia
modular diferentes correntes iônicas envolvidas na gênese do PA (ZHOU et al.,
2001).
Após 24 h de incubação, os ventrículos foram colocados em uma cuba de
acrílico, inicialmente a temperatura ambiente. Durante 20−30 min a cuba era
aquecida e a temperatura aumentada gradativamente até chegar a 37 ± 0,5 °C. O
tecido era fixado com pequenos alfinetes de aço inoxidável no fundo da câmara
revestida com Sylgard (Sylgar®) mantendo a superfície epicárdica exposta para
cima. As preparações foram continuamente perfundidas a fluxo constante de 5
ml/min com auxílio de uma bomba peristáltica (Gibson®) empregando uma solução
Tyrode oxigenada, mantidas a 37 °C e estimuladas nas frequências de 300, 500,
800 e 1000 ms com auxílio de um estimulador (Digitimer DS2) e de um controlador
de frequência (Digitimer D4030).
Os potenciais transmembrana foram registrados utilizando microeletrodos de
vidro (resistência de 10–40 MΩ) obtidos através de uma microforja (Narishige®) e
preenchidos com uma solução de KCl 3 M. Os sinais amplificados foram
digitalizados (Digidata 1440A interface AD/DA system Axon Instrument) e
armazenados no computador para posterior análise utilizando o software Clampfit
(Axon Instruments). Foram avaliados os seguintes parâmetros: potencial de repouso
da membrana (PRM); amplitude do PA (APA); duração do PA (DPA) aos níveis de
30% (DPA30) e 90% (DPA90) da repolarização; e triangulação do PA (DPA90 - DPA30)
(Figura 9).
56
Figura 9. Representação esquemática dos parâmetros avaliados durante o registro do PA cardíaco
no ventrículo esquerdo. Para descrição dos parâmetros ver texto.
57
3.3.2. Registro das correntes iônicas Ito e ICa-L
Para obtenção dos registros foi utilizada a técnica do patch-clamp, na
configuração whole-cell. Os cardiomiócitos de corações de ratos adultos foram
isolados conforme previamente descrito por Mitra & Morad (1985). Este
procedimento combina a utilização da enzima colagenase do tipo 1 e da enzima
protease XIV (Sigma-Aldrich®) em distintas proporções, conforme descrito a seguir.
Inicialmente, os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal
de hidrato de cloral 6% (Sigma-Aldrich®) na proporção de 3 ml desta solução por kg
de peso. Em seguida, a cavidade torácica foi aberta e o coração retirado e
rapidamente canulado pela artéria aorta em um aparelho de Langendorff. Este foi
perfundido com solução Tyrode contendo (em mM): KCl 5,4; NaH2PO4 0,42; HEPES-
Na 25; NaCl 130; NaHCO3 5,8; glicose 12; taurina 20; MgCl2 1,05; CaCl2 1,8;
durante um período de aproximadamente 5 min.
Posteriormente, a solução foi substituída por uma solução Tyrode sem Ca2+
(nominal 0) por 10 min. Depois de decorrido este tempo, foi utilizada esta última
solução suplementada com colagenase tipo 1 (0,5 mg/ml) e protease tipo XIV (0,03
mg/ml) (Sigma-Aldrich®) por 15 min. Por último, foi usada uma solução de Kraftbühe
(KB – “sopa da força”) contendo (em mM): taurina 10; ácido glutâmico 70; creatina 5;
ácido succínico 5; glicose 10; KH2PO4 10; KCl 20; HEPES-K 10; EGTA-K 0,2;
durante 5 min. Em todas as soluções utilizadas o pH foi ajustado para 7,4 com
NaOH ou KOH. Durante todo o experimento as soluções eram borbulhadas com O2
e a temperatura mantida a 37 ± 0,5 oC.
Ao final do processo o coração foi retirado do aparelho de Langendoff e o
epicárdio do ventrículo esquerdo foi utilizado para obter os cardiomiócitos por
agitação mecânica após digestão enzimática. Após o isolamento os cardiomiócitos
(Figura 10) foram guardados em 10 ml de solução KB e permaneceram nesta
solução por um período mínimo de 2 h a 4 °C antes da obtenção dos registros
eletrofisiológicos.
58
Figura 10. Fotografia de cardiomiocitos de rato isolados do epicárdio do ventrículo esquerdo. Obtida
no Laboratório de Eletrofisiológia Cardíaca Antonio Paes de Carvalho, IBCCF, UFRJ.
59
3.3.3. Registro da corrente transitória de saída de K+ (Ito) e da corrente de Ca2+ do tipo L (ICa-L)
Como mencionado anteriomente, as correntes foram registradas utilizando a
técnica de patch-clamp na configuração whole-cell. Uma pequena quantidade de
cardiomiócitos foi colocada em uma câmara com volume de 0,5 ml montada em um
microscópio invertido (Leica Microsystems).
Após um tempo de aproximadamente 15 min, as células se depositam no
fundo da câmara. Para registrar a corrente Ito foi utilizada uma solução externa
contendo (em mM): NaCl 86, KCl 4; CaCl2 0,5; MgCl2 1; CoCl2 2; HEPES-Na 10;
tetraetilamônio (TEA-Cl) 50; glicose 11. Para registrar as correntes ICa-L foi utilizada a
seguinte solução externa (em mM): NaCl 86, MgCl2 1; KCl 4; HEPES-Na 10; CaCl2
1,8; glicose 12; TEA-Cl 50; 4-aminopiridina (4-AP) 4. Em ambas soluções externas o
pH foi ajustado para 7,4 com NaOH.
Para obtenção dos registros foi utilizado um amplificador (Axopatch 200A),
conectado a um conversor analógico digital Digidata 1200 (Axon Instruments). As
micropipetas foram fabricadas a partir de tubos de borosilicato (Sutter Instruments®)
utilizando um esticador de pipeta vertical PP-830 (Narishige). As micropipetas
utilizadas tiveram uma resistência entre 1 e 3 MΩ. As pipetas foram preenchidas
com uma solução interna contendo (em mM) L-Asp 80; KH2PO4 10; MgSO4 1; ATP-
Na 3; EGTA-K 10; KCl 50; HEPES-K 5 O pH da solução foi ajustado para 7,2 com
KOH.
Após o contato da micropipeta com a membrana celular (Figura 11) realiza-se
um primeira pressão negativa com auxílio de uma seringa de 1 ml, com o intuito de
que a resistência entre a micropipeta e a membrana celular chegue a gigaohm. A
partir de então é aplicada uma segunda pressão negativa na célula para romper a
membrana e permitir o contato direto entre micropipeta e interior da célula, obtendo
a configuração whole-cell.
60
Figura 11. Aproximação da micropipeta à membrana do cardiomiócito. O micromanipulador em que
está conectada a micropipeta apresenta movimentos rápidos e lentos, permitindo que a micropipeta
se aproxime da célula lentamente, até conseguir contato com a membrana celular. Obtida no Laboratório de Eletrofisiológia Cardíaca Antonio Paes de Carvalho, IBCCF, UFRJ.
61
Uma vez realizado o patch a capacitância da membrana foi compensada
eletronicamente. Para isto era utilizado um protocolo de voltagem partindo de um
potencial de holding de -40 mV realizando pulsos de voltagem desde -50 para -60
mV. Os protocolos utilizados foram controlados usando o programa Clampex do
software pClamp 5.1 (Axon Instruments).
3.3.4. Protocolo de registro e medições da corrente Ito
Para isolar e registrar esta corrente foram utilizados bloqueadores químicos e
o protocolo de voltagem específico, como citado acima. Assim, na solução externa
foi adicionado Co2+ para bloquer as correntes de Ca2+ e TEA-Cl para bloquear
outras correntes de K+ diferentes da Ito. Ademais, foi aplicado um protocolo de pulsos
partindo de um potencial holding de -60 mV, visando inativar os canais de Na+.
A utilização de bloqueadores químicos e a estimulação elétrica adequada
isola parcialmente a Ito do restante das correntes de K+. Mas não pode se evitar a
superposição com a corrente de estado estacionário ou sustentado (Iss), que se ativa
no mesmo potencial de Ito. Entretanto, a Iss é independente de tempo e, portanto,
pode ser substraída digitalmente dos registros de Ito sem alterar suas características
(CASIS et al., 1998).
3.3.5. Amplitude da corrente Ito
Para estudar a dependência de voltagem da corrente Ito foi utilizado um
protocolo de pulsos partindo de um potencial de holding de -60 mV e pulsos
crescentes que vão desde -30 mV à +50 mV com incrementos de 10 mV com
duração de 500 ms. A amplitude da corrente Ito foi normalizada pela capacitância da
célula (veja detalhes acima) e expressa como densidade de corrente (pA/pF).
Como citado anteriormente, no protocolo de estimulação foi registrada
simultaneamente tanto a corrente Ito quando a corrente Iss. Uma das principais
diferenças é que a corrente Ito se inativa a 200 ms, enquanto que a corrente Iss é
independente do tempo e somente se inativa quando a estimulação é interrompida.
62
A partir destas diferenças foi criado um protocolo de estimulação que permitiu
separá-las para uma melhor análise. Para isto utilizou-se um protocolo onde o tempo
do pulso era de 500 ms. Inicialmente as duas correntes estavam presentes,
momento no qual aparece a amplitude máxima da corrente Ito, mas no final do
estímulo a corrente Ito está completamente inativada e o que se registra é apenas a
corrente Iss. Portanto, subtraindo-se a amplitude da corrente Iss ao final do estímulo,
foi possível obter os valores de amplitude máxima para a corrente Ito.
3.3.6. Dependência de voltagem de inativação da Ito
O fenômeno de inativação da corrente Ito foi estudado em: (i) cardiomiócitos
isolados de ventrículos provenientes de animais tratados com metformina oral por 10
semanas e nos respectivos controles (solução de Kraftbühe apenas), e (ii)
cardiomiócitos isolados de animais saudáveis expostos ou não a metformina 10 mM
durante 24 h. A partir de um potencial holding de -60 mV foram aplicados pré-pulsos
crescentes desde -100 mV até +10 mV com incrementos de 5 mV e duração do
pulso de 5 s. Após os 5 s, aplicou-se um pulso de voltagem desde o pré-pulso até
+50 mV com duração do pulso de 500 ms. A dependência de voltagem de inativação
foi obtida através dos valores da amplitude da corrente pico em cada valor de
voltagem, dividida pela amplitude da corrente máxima (I/Imax). A função de
Boltzmann I/Imax = A/[1 + exp(V-Vh/S)] + R foi ajustada aos pontos experimentais em
cada ensaio individual no estudo de 10 semanas para obter valores médios da
voltagem média de inativação (Vh). Nos experimentos de exposição aguda foi
utilizada a equação I/Imax = A/[1+ exp (V-Vh/S], uma vez que não foi encontrada, na
relação corrente/voltagem (curva I/V), uma fração residual de corrente a um
potencial de pré-pulso de 0 mV (compare, nos Resultados, as Figuras 16 e 22).
Assume-se que os valores de “S” não foram modificados pelo tratamento com
metformina nos 2 grupos experimentais, em função da estreita proximidade entre os
valores de I/Imax para cada potencial de pré-pulso.
Vh é a voltagem média de inativação da corrente, onde 50% dos canais estão
inativos; S representa a inclinação e indica a dependência de voltagem da
inativação, já que quanto maior a inclinação maior a dependência; A representa a
63
proporção ou amplitude relativa máxima do componente de inativação da Ito; R é a
proporção da corrente Iss que não se inativa; V é a voltagem do pré-pulso.
3.3.7. Recuperação da inativação da corrente Ito
Para avaliar a recuperação da inativação da corrente Ito foi utilizado um
protocolo de pulsos que consta de um pré-pulso inicial (p) que vai desde -60 mV até
+50 mV com duração do pulso de 100 ms. Logo um pulso teste (t) partindo de -60
mV até +50 mV com uma duração do pulso de 200 ms. Entre o pré-pulso e o pulso
teste o intervalo de tempo é crescente com incrementos de 25 ms. À medida que
aumenta o intervalo de tempo aumenta o número de canais disponíveis e, portanto,
observa-se uma maior densidade de corrente Ito.
As curvas de recuperação da inativação da corrente Ito de cardiomiócitos
saudáveis foram obtidas a partir da relação entre a amplitude do pulso teste (It) e
seu respectivo pré-pulso (Ip), graficados com respeito ao intervalo de tempo entre o
pré-pulso e o pulso teste. A equação It/Ip = A (1 - e(-t/τ)) foi ajustada aos pontos da
curva de recuperação da inativação para obter os valores da constante de tempo de
recuperação da inativação τ que indica o tempo necessário para que 63,2% dos
canais passem do estado inativo para o de repouso.
3.3.8. Protocolo de registro e medição da amplitude da corrente de Ca2+ do tipo L (ICa-L)
Para registrar e isolar a corrente de Ca2+ do tipo L foram utilizados os
bloqueadores químicos 4-AP e TEA-Cl, ambos inibidores de correntes de K+.
Protocolos de voltagem específicos foram utilizados visando eliminar a corrente de
Na+. A maioria dos canais de Ca2+ se tornam ativados ou inativados de um podo que
parece ser idéntico aos canais de Na+, mas no caso dos canais de Ca2+ do tipo L, o
mais abundante no coração, a transição parece ocorrer mais lentamente e a
potenciais mais positivos. Com o intuito de evitar que as correntes de Na+
interferissem no registro da corrente de Ca2+ do tipo L, foi aplicado um pré-pulso a -
64
30 mV com duração de 30 ms partindo de um potencial de holding de -70 mV. A
partir desta condição, com os canais de Na+ inativados, foi aplicado um protocolo de
pulsos de voltagem partindo de -30 mV até +50 mV com duração do pulso de 500
ms. Os valores de corrente obtidos em cada pulso foram normalizados pela
capacitância da sua respectiva célula, obtendo assim valores de densidade de
corrente corrigidos por sua respectiva capacitancia da célula (pA/pF).
3.4. Medida dos níveis de RNAm por qRT-PCR
Os níveis de RNAm dos genes KV4.3, KV4.2 e KChIP2 do ventrículo esquerdo
foram medidos por PCR em tempo real (qRT-PCR). Os tecidos utilizados em
experimentos funcionais, previamente incubados ou não por 24 h com metformina,
foram conservados a -80 °C. O RNAm foi extraído utilizando 30 mg de tecido
utilizando RNeasy® Fibrous Tissue mini kit (Qiagen), seguindo as instruções do
fabricante. Após a extração a concentração de RNA foi determinada utilizando o
espectrofotômetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific). Para o ensaio de
transcriptase reversa foram processados 1000 ng de cDNA (Applied Byosistems) de
acordo com as instruções do fabricante. As reações foram realizadas num
termociclador (MJ Research) com variações de temperatura, inicialmente a 25 °C
por 10 min, 37 °C por 120 min, 85 °C por 5 min e 4 °C por 10 min.
As reações de amplificação foram realizadas em placas de 96 poços pelo
sistema de PCR em tempo real com volume final de 15 µl, contendo 2,5 µl de cDNA
diluído 10 vezes (grupos controle ou metformina 24 h), 7,5 µl de Power SYBR
Master Mix (Applied Biosystems) e 150 nM de oligos sense e anti-sense de KV4.2,
Kv4.3 e KChIP2 (ver a sequência dos oligonucleotídeos na Tabela 5), seguindo as
instruções do fabricante. O programa de amplificação teve os seguintes ciclos de
variação de temperatura: 55 ºC durante 2 min, 95 ºC durante 10 min, 40 ciclos a 95
ºC por 30 s e 58 ºC por 1 min. Os experimentos foram realizados em duplicatas. O
gene GAPDH foi utilizado como normalizador interno. A quantificação relativa de
RNAm do gene específico foi determinado pelo método de Ct (ciclo de threshold),
expresso pela fórmula 2- (∆∆Ct), onde ∆Ct se refere ao Ct do gene alvo menos o Ct do
controle endógeno (GAPDH). O ∆∆Ct do grupo metformina é definido como a
65
Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados nas reações de qRT-PCR.
Nome do Gene Senso 5`3` Anti-senso 5`3`
KV4.2 AGCAAGTTCACCAGCATCC TCCGCTCAGAGAGCAGATAGAC
KV4.3 GCCAGCAAGTTCACAAGCAT CAGAGCAATGACCAGGACGC
KChIP2 TGTACCGAGGCTTCAAGAAC GGTTGGTGTCAAAGGCATTG
GAPDH TGATTCTACCCACGGCAAGT AGCATCACCCCATTTGATGT
66
diferença entre ∆Ct do grupo tratado e a média do ∆Ct do grupo controle. A mudança
na expressão relativa dos genes alvos foi representada em média ± EPM do 2-(ΔΔCt).
3.5. Análise estatística
Para análise dos dados foram utilizados os softwares Graphpad Prism® 5
(GraphPad Prism 5) e origin® 8 (Originlab Corporation). Para comparar duas médias
os resultados foram submetidos ao teste t de Student. E para comparar mais de
duas médias os resultados foram submetidos a análise de variância (ANOVA, 2
fatores). A significância estabelecida para a análise estatística foi de P < 0,05.
67
4. RESULTADOS
4.1. Efeitos do tratamento com metformina nos parâmetros biométricos e metabólicos em animais saudáveis
Neste estudo foi inicialmente avaliado se o tratamento com metformina
influencia no peso corporal de animais saudáveis. O peso corporal dos animais foi
medido uma vez por semana durante um período de 10 semanas. Observou-se
que o tratamento com metformina não modificou o peso dos animais saudáveis
quando comparados com animais não tratados com metformina, conforme mostra a
Figura 12A. Buscou-se também investigar se a utilização deste fármaco em
animais saudáveis seria capaz de causar hipertrofia cardíaca. Os animais foram
sacrificados após um período de 10 semanas e os corações foram pesados. Os
resultados mostraram que o tratamento com metformina não alterou nem o peso do
coração nem a relação peso coração/peso corporal (mg/g), parâmetro amplamente
aceito como indicador de hipertrofia cardíaca (Sen et al., 1974) (Figura 12B, C).
Um controle inicial destes experimentos foi avaliar se o tratamento com metformina
nestes animais saudáveis, não diabéticos, seria capaz de alterar os níveis de
glicose plasmática. Para isso, foram medidas as glicemias em jejum (12 h), dos
animais controles e tratados com metformina, a cada 15 dias por um período de 10
semanas. Os dados obtidos demonstraram que o tratamento com metformina não
mudou os valores de glicose plasmática em animais saudáveis, conforme mostrado
na Figura 13.
68
A B
NS
NS
Controle Metformina0
1
2
3
4
5
Peso
Car
díac
o re
lativ
o (m
g/g)
C
Controle Metformina0,0
0,5
1,0
1,5
Peso
car
díac
o (g
)
NS
Controle Metformina
0 2 4 6 8 100
50
100
150
200
250
300
350
400
Peso
cor
pora
l (g)
Tempo (semanas)
NS
Figura 12. O tratamento com metformina não altera dados biométricos relacionados à massa
corporal e à massa cardíaca de animais saudáveis. Avaliação temporal do peso corporal em
animais controle (n = 11) e tratado com metformina durante 10 semanas (n = 16) (A); B e C: peso do
coração e relação peso coração/peso corporal ao final de 10 semanas, em animais controle e
tratado com metformina. Os valores foram expressos em médias ± EPM. NS: sem diferença
estatisticamente significativa. No caso da evolução da massa corporal, não houve diferenças entre
os valores ponderais correspondentes a cada uma das semanas analisadas (ANOVA, 2 fatores,
comparando os pares C e M de cada semana). Ainda, com relação à massa cardíaca, também não
houve diferença significativa entre os dois grupos experimentais após as 10 semanas (teste t de
Student).
69
Figura 13. O tratamento com metformina não alterou os valores de glicemia no grupo de animais
saudáveis. Valores de glicemia (mg/dL) em jejum (12 h) no grupo (C) controle (n = 11) e tratado com
metformina (M) durante 10 semanas (n = 16). Os valores foram expressos em médias ± EPM. NS:
sem diferença estatisticamente significativa entre os valores pareados de cada semana (ANOVA, 2
fatores comparando os pares C e M de cada semana).
0 2 4 6 8 100
50
100
150
200
Glic
emia
(mg/
dL)
Tempo (semanas)
Controle Metformina
NS
70
4.2. Implicações do tratamento com metformina no remodelamento elétrico cardíaco em animais saudáveis
Investigou-se se o fármaco administrado em um animal não diabético tem a
capacidade de induzir alterações nos diferentes parâmetros eletrocardiográficos. O
ECG foi registrado semanalmente e os parâmetros eletrocardiográficos avaliados.
São apresentados na Figura 14, traçados representativos de um ECG em um
mesmo animal saudável antes de iniciar o tratamento com metformina (Figura 14A,
C) e após 10 semanas de tratamento (Figura 14B, D). Observou-se que a
metformina é capaz de causar alterações elétricas no animal saudável 10 semanas
após tratamento, apresentando um prolongamento, tanto do intervalo PR como o
intervalo QT. A evolução temporal dos parâmetros eletrocardiográficos analisados
pode ser também observada na Figura 15. A Tabela 6 apresenta os valores (média
± EPM) dos parâmetros de eletrocardiografia analisados no tempo inicial e após 1,
4, 7 e 10 semanas.
Com o intuito de avaliar de forma mais detalhada os efeitos do fármaco na
função elétrica cardíaca de animais saudáveis, foi analisado, através da técnica de
patch-clamp na configuração de whole-cell, se a corrente transitória de saída de
potássio (Ito) e/ou a corrente de cálcio do tipo L (ICa-L) poderiam estar envolvidas no
aumento dos intervalos QT e QTc do ECG observado nos animais tratados. A
Figura 16 mostra uma redução da corrente Ito em cardiomiócitos do ventrículo
esquerdo de animais saudáveis que foram tratados com metformina durante 10
semanas, quando comparado ao grupo de animais que não receberam tratamento,
como pode ser inicialmente apreciado nos registros representativos (Figura 16A,
B). A Figura 16C mostra na curva corrente-voltagem, que avalia a densidade da Ito,
corrigida pela capacitância das células em diferentes voltagens, observando-se
diferenças significativas desde os +20 mV até +50 mV.
71
Intervalo PR
Intervalo QT
CA
Intervalo QT
D
Intervalo PR
0.25
mV
100 ms0.25
mV
100 ms
0.25
mV
100 ms 0.25
mV
100 ms
Semana 10
B
Antes do tratamento
Semana 10
Após tratamento Após tratamento
Antes do tratamento
Figura 14. O tratamento com metformina aumenta a duração do intervalo PR e do intervalo QT.
ECGs representativos mostrando por meio de linhas pontilhadas os intervalos PR e QT de
diferentes animais, antes de iniciar tratamento (A, C) e após 10 semanas de tratamento com
metformina (B, D). Os traçados demonstram um prolongamento do intervalo PR (compare A e B) e
outro do intervalo QT (compare C e D) após 10 semanas de tratamento com metformina.
72
F de interação = 7,46P = 0,1076
F de interação = 13,68P = 0,0024
F de interação = 4,67P = 0,3345
F de interação = 7,94P = 0,0830
F de interação = 4,37P = 0,01718
F de interação = 5,18P = 0,02114
Figura 15. O tratamento com metformina aumentou os intervalos PR, QT e QTc no ECG. Os
gráficos acima mostraram o aumento no intervalo PR na semana 10 e dos intervalos QT e QTc a
partir da semana 7 em animais tratados com metformina (n = 16), quando comparado aos animais
controles na mesma semana (n = 11). Não foram observadas diferenças nos outros parâmetros
eletrocardiográficos analisados. Os valores foram expressos em médias ± EPM. * P < 0,05 em
relação ao grupo controle na mesma semana (ANOVA, 2 fatores, comparando os pares (C e M) de
cada semana).
73
Tabela 6. Parâmetros eletrocardiográficos analisados em diferentes tempos em animais saudáveis.
Parâmetros
ECG
Tempo (semanas)
0 1 4 7 10
RR (ms) C 144,5 ± 1,6 146,3 ± 3,8 151,8 ± 3,2 146,7 ± 5,6 140,6 ± 2,2
M 139,6 ± 3,2 144 ± 2,2 144,5 ± 2,9 144,3 ± 2,3 147,6 ± 4,1
PR (ms) C 41,8 ± 0,8 41,9 ± 0,8 42,8 ± 1,0 41,9 ± 1,0 41,7 ± 1,1
M 43,5 ± 0,6 42,2 ± 0,9 43,7 ± 1,3 44,9 ± 1,1 48,9 ± 1 *
QRS (ms) C 16,7 ± 0,7 15,8 ± 0,2 16,5 ± 0,2 16,3 ± 0,2 17,2 ± 1,8
M 16 ± 0,5 17,1 ± 0,7 17,1 ± 0,3 18,5 ± 0,7 16,3 ± 0,1
QT (ms) C 62,9 ± 0,61 63,2 ± 0,82 63,2 ± 2,05 61,9 ± 1,57 61,4 ± 1,52
M 63,5 ± 1,18 65,4 ± 1,63 67,0 ± 1,33 69,8 ± 2,01 * 70,0 ± 1,85 *
QTc (ms) C 168,7 ± 2,8 166,7 ± 3,3 162,5 ± 4,4 161,5 ± 5,3 165,7 ± 3,2
M 168,8 ± 1,6 170,5 ± 3,2 173,2 ± 2,9 177,7 ± 4,3 * 182,7 ± 3,5 *
Tpeak-Tend (ms)
C 34,4 ± 0,98 35,5 ± 1,63 34,7 ± 1,97 31,9 ± 2,22 26,6 ± 5,92
M 34, 1 ± 1,74 33,1 ± 1,55 34,9 ± 1,8 34,9 ± 2,41 34,3 ± 3,23
Os valores correspondem a médias ± EPM. * P < 0,05 quando comparado ao grupo controle na
mesma semana. C: grupo controle (n = 11); M: grupo metformina (n = 16). As diferenças
estatisticamente significativas foram também sombreadas para uma melhor visualização; ANOVA, 2
fatores, comparando os pares (C e M) de cada semana.
74
100 ms10pA
/pF
ControleControle
Metformina
C
B
100 ms10pA
/pF
A
-40 -20 20 40 60
5
10
15
20
25
***De
nsid
ade
de C
orre
nte
(pA/
pF)
Potencial de Membrana (mV)
Controle Metformina
*
Controle
-60 mV
+50 mV 500 ms
-60 mV
-30 mV
Figura 16. O tratamento com metformina reduz a corrente transitória de saída de potássio (Ito). Para
registrar a corrente Ito foi utilizado um protocolo de voltagem (veja figura entre os dois traçados
representativos A e B), partindo de um potencial holding de -60 mV com pulsos crescentes de 10
mV, desde -30 mV até +50 mV, durante 500 ms. Traçado representativo da corrente Ito em
cardiomiócito de animal controle (A) e animal tratado com metformina por 10 semanas (B). C: curva
corrente-voltagem da Ito em cardiomiócitos controle (n = 5; 17 células) e tratados com metformina (n
= 5; 12 células). Os valores de amplitude da corrente foram normalizados pela capacitância de sua
respectiva célula. Os valores foram expressos em médias ± EPM; * P < 0,05, em relação ao grupo
controle na mesma voltagem (ANOVA, 2 fatores).
75
Pelo fato da Ito estar reduzida no tratamento com metformina precisava-se
analisar se esta diminuição poderia estar sendo causada por mudanças nas
propriedades biofísicas deste canal. Para isso, foi avaliada a dependência de
voltagem da inativação em cardiomiócitos de animal controle e tratado com
metformina. Os experimentos mostrados na Figura 17 permitiram constatar que o
tratamento com metformina não altera a dependência de voltagem de inativação e
a voltagem média de inativação (Vh). Outro parâmetro biofísico analisado foi a
constante de tempo (τ) de recuperação da inativação da corrente Ito e, conforme
observado na Figura 18, não foram constatadas diferenças nesse parâmetro.
O conjunto seguinte de experimentos mostra que o tratamento com
metformina não afeta a densidade da ICa-L, a partir da análise inicial dos traçados
representativos (Figura 19A, B). A Figura 19C apresenta curva corrente-voltagem,
onde a +10 mV observa-se a amplitude máxima da ICa-L na condição controle (-4,65
± 0,85 pA/pF) e tratado com metformina (-5,11 ± 1,10 pA/pF) não existindo
diferença entre os grupos experimentais.
Após os resultados obtidos transcorridas 10 semanas de tratamento com
metformina em animais saudáveis, que mostram prolongamento dos intervalos QT
e QTc, foram realizados experimentos também utilizando animais saudáveis,
visando investigar se os efeitos da droga sobre a repolarização ventricular seriam
decorrentes de um efeito direto ou induzidos por um conjunto de respostas
fisiológicas deflagradas em resposta à longa exposição à droga. Num conjunto de
experimentos, cardiomiócitos isolados de epicardio do ventrículo esquerdo foram
expostos de forma aguda à metformina (10 mM, 30 min), avaliando a densidade da
corrente Ito, antes, durante e após a perfusão com a droga. Em outro conjunto de
experimentos, tiras (preparação multicelular) de epicardio ventricular esquerdo
foram incubadas por 24 h sem e com metformina (10 mM) avaliando o perfil do
registro do potencial de ação (PA) e das correntes iônicas Ito, uma das principais
implicadas na repolarização ventricular no coração de rato.
76
Figura 17. O tratamento com metformina por 10 semanas não afeta a dependência de voltagem da
inativação da corrente Ito. A: protocolo de voltagem (esquerda) e registro representativo da corrente
após pré-pulso (direita) para estudo da corrente Ito em cardiomiócito controle. B: representação
gráfica dos valores obtidos utilizando o protocolo de dependência de voltagem da inativação da
corrente Ito em cardiomiócitos de animais controles (n = 3; 10 células) e tratados com metformina (n
= 5; 8 células). O gráfico mostra os valores de I/Imax (amplitude da corrente pico em cada valor de
voltagem, dividida pela amplitude da corrente máxima) como médias ± EPM. ANOVA, 2 fatores, foi
aplicado como teste de significância para avaliar diferenças entre os pontos experimentais (observar
em B) nas condições controle e metformina. A função de Boltzmann I/Imax = A/[1 + exp(V-Vh/S)] + R
(ver ponto 3.8.3 de Materiais e Métodos) foi ajustada aos pontos experimentais em cada
experimento individual para obter valores Vh expressos em médias ± EPM. (C) NS: sem diferença
estatisticamente significativa (P > 0,05, teste t de Student). Assume-se que os valores de “S” não
foram modificados pelo tratamento com metformina em função da estreita proximidade entre os
valores de I/Imax para cada potencial de pré-pulso.
C
-100 -80 -60 -40 -20 20
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
I/Im
ax
Potencial de Pré-Pulso (mV)
Controle Metformina
NS
B 5 s 500 ms
A+10 mV
5 s-100 mV
Pré-pulso
-60 mV
+50 mV
-60 mV
77
0 100 200 300 400 5000,00
0,25
0,50
0,75
1,00
I t/Ip
Intervalo (ms)
Controle Metformina NS
B C
APulso
Teste (t)
200 ms
Pré-pulso
(p)
100 ms
100 ms
- 60 mV
+ 50 mV20
00 p
A
Pré-pulsoPulsos
Figura 18. O tratamento com metformina não altera a constante de tempo (τ) de recuperação da
inativação da corrente Ito em cardiomiócitos. A: representação esquemática do protocolo de pulsos
(esquerda) e registro representativo de recuperação da inativação da corrente Ito em cardiomiócito
de animal controle (direita); B: curva de recuperação da inativação da corrente Ito de cardiomiócitos
de animais controle (n = 4; 5 células) e tratados com metformina durante 10 semanas (n = 4; 9
células). Cada ponto representa a relação entre a amplitude do pulso teste (It) e seu respectivo pré-
pulso (Ip), graficados em relação ao intervalo de tempo “t” entre o pré-pulso e o pulso teste. ANOVA,
2 fatores, foi aplicado como teste de significância para avaliar os pontos experimentais nas
condições controle e metformina (em B) nos diferentes intervalos de tempo. C: a equação I/Ic = A(1-
e(-t/τ)) foi ajustada aos pontos do gráfico B para obter os valores da constante de tempo de
recuperação da inativação (τ), expressos em médias ± EPM. NS: sem diferença estatisticamente
significativa (P > 0,05, teste t de Student).
78
A
B
Controle
Metformina
2,5
pA/p
F
100 ms
2,5
pA/p
F
100 ms
-40 -20 20 40 60
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
1
Dens
idad
e de
Cor
rent
e (p
A/pF
)
Potencial de Membrana (mV)
Controle Metformina
NS
500 ms
-70 mV-70 mV
-30 mV
+50 mV
30 ms
C
Figura 19. O tratamento com metformina por 10 semanas não altera a densidade da ICa-L de
cardiomiócitos isolados. Para registrar a corrente ICa-L, foi utilizado um protocolo de pulsos partindo
de um potencial holding de -70 mV, com pulsos crescentes de -30 mV a +50 mV em um tempo de
500 ms, com incrementos de 10 mV (observar entre os dois traçados superiores). Para inativar
outras correntes entrantes (por exemplo INa) foi aplicado um pré-pulso despolarizante partindo de
um potencial holding de -70 mV até -30 mV, com duração de 30 ms. Traçado representativo da
corrente ICa-L de cardiomiócitos de animais (controle) (A) e tratados com metformina durante 10
semanas (B). C: relação corrente-voltagem de ICa-L de cardiomiócitos de animais controle (n = 4; 8
células) e tratados com metformina (n = 4; 8 células). Os valores de amplitude da corrente foram
normalizados pela capacitância de sua respectiva célula. Os valores foram expressos em médias ±
EPM. NS: sem diferença significativa quando se comparam valores na mesma voltagem (ANOVA, 2
fatores).
79
4.3. Efeitos da perfusão durante 30 min ou da incubação por 24 h com metformina no remodelamento elétrico de cardiomiócitos saudáveis
O primeiro conjunto de experimentos permite avaliar se a metformina reduz
a corrente Ito por interação direta no canal. A Figura 20 apresenta registros
representativos mostrando que a exposição dos cardiomiócitos à metformina (B)
não alterou a densidade da corrente Ito quando comparado ao grupo controle (A). A
Figura 20C mostra a curva corrente-voltagem da Ito indicando que não existe
diferença entre os grupos, permitindo concluir que a redução da densidade de
corrente (observada na Figura 16) não ocorre por bloqueio direto do canal. Por fim,
a Figura 20D mostra que em nenhum intervalo entre 0 e 30 min houve diminuição
da corrente Ito. Outros experimentos mostrados adiante poderão oferecer
alternativas para explicar – ao menos em parte – este fenômeno de redução.
Passando aos experimentos com uma preparação multicelular, a Figura 21 mostra
que a incubação de tiras do epicárdio do ventrículo esquerdo com metformina por
24 h induziu o prolongamento do PA (incubado; traçado cinza no painel A) quando
comparado ao traçado correspondente obtido utilizando o ventrículo não incubado
com metformina (controle; traçado preto no painel A). Ainda, foi constatado que
este prolongamento do PA é independente da frequência de estimulação, visto que
em todas os ciclos de estimulação utilizadas no protocolo (300, 500, 800 e 1000
ms) foi observado o prolongamento do potencial de ação aos 90% da repolarização
(DPA90) (Figura 21B). Observou-se também prolongamento do potencial de ação a
30% da repolarização (DPA30) nos ciclos de estimulação de 300, 800 e 1000,
exceto em 500 ms (Figura 21C), dados também agrupados na Tabela 7. Quando
se analisa a triangulação (DPA90 - DPA30), parâmetro que representa a duração da
fase 3 do PA e cujo aumento é considerado um preditor de arritmias (Casis et al.,
2000), foi constatado um aumento nas distintas frequências de estimulação com
relação a situação controle. Ainda, na Tabela 7 apreciam-se os valores dos outros
parâmetros do registro do potencial de ação que foram avaliados nas diferentes
condições experimentais: A amplitude do potencial de ação (APA) e potencial de
repouso da membrana (PRM) que não foram modificados pela incubação com
metformina.
80
-40 -20 20 40 60
5
10
15
20
25
Dens
idad
e de
Cor
rent
e (p
A/pF
)
Potencial de Membrana (mV)
Controle Metformina 30 min
NS
A
B
C
-60 mV
+50 mV 500 ms
-60 mV
-30 mV
100 ms
10pA
/pF
100 ms
10pA
/pF
D
0 5 10 15 20 25 300
5
10
15
20
25 Metformina 30 min
Dens
idade
de
Corre
nte
+ 50
mV
(pA/
pF)
Tempo (min)
Figura 20. A exposição por 30 min à metformina não afeta a densidade da corrente Ito de
cardiomiócitos isolados de animais saudáveis. Para registrar a corrente Ito foi utilizado um protocolo
de voltagem (observar protocolo entre os dois traçados representativos), partindo de um potencial
holding de -60 mV com pulso crescentes de 10 mV, desde -30 mV até +50 mV, durante 500 ms.
Registro representativo de corrente Ito em cardiomiócito controle (A) e após 30 min de exposição à
metformina (10 mM) (B). (C): Curva corrente-voltagem de células controle (n = 5; 11 células) e
expostas a metformina por 30 min (n = 5; 11 células). D: Amplitude de corrente registrada durante o
período de incubação com metformina (até 30 min). Os valores de amplitude da corrente foram
normalizados pela capacitância de sua respectiva célula. Os valores foram expressos em médias ±
EPM. NS: sem diferença significativa quando se comparam os valores na mesma voltagem
(ANOVA, 2 fatores).
81
300 600 9000
10
20
30
**
Dur
ação
do
PA
30
(ms)
Controle Metformina 24 h
*
300 600 9000
50
100
150
Controle Metformina 24 h
* **
Dur
ação
do
PA
90
(ms)
Ciclo de estimulação (ms)
*
BA
Controle
Metformina 24 h
100 ms
C
Ciclo de estimulação (ms)
50 m
V
Figura 21. A exposição à metformina de fatias de epicardio de ventrículo esquerdo durante 24 h
prolonga a duração do potencial de ação (PA). A: traçado representativo do PA no epicardio do
ventrículo esquerdo, obtido a uma frequência de estimulação de 500 ms na condição controle
(traçado preto) e incubado por 24 h na presença de metformina (traçado cinza). Duração do PA a
90% (B) e a 30% de repolarização (C) nas frequências de estimulação de 300, 500, 800 e 1000 ms
nas condições controle (n = 4; 12 células) e incubado com metformina (10 mM durante 24 h; n = 4;
12 células). Os valores foram expressos em médias ± EPM. * P < 0,05, em relação ao controle na
respectiva frequência de estimulação (ANOVA, 2 fatores).
82
Tabela 7. Parâmetros do potencial de ação (PA) registrados em fatias de tecido de epicardio
esquerdo.
Parâmetros
PA
Ciclos de estimulação (ms)
300 500 800 1000
APA (mV) C 63,21 ± 1,77 61,89 ± 2,04 62,22 ± 2,19 61,81 ± 2,14
M 62,37 ± 1,48 65,15 ± 3,49 67,11 ± 2,63 65,53 ± 3,05
PRM (mV) C -67,91 ± 2,36 -68,05 ± 2,71 -68,84 ± 2,09 -67,73 ± 1,73
M -67,53 ± 2,11 -67,45 ± 1,75 -68,58 ± 1,81 -69,32 ± 1,81
DPA30 (ms) C 15,24 ± 1,79 17,95 ± 1,31 14,43 ± 1,78 12,98 ± 1,81
M 22,33 ± 1,56 * 20,91 ± 1,66 20,86 ± 1,72 * 20,10 ± 1,55 *
DPA90 (ms) C 90,84 ± 4,39 101,77 ± 5,11 98,56 ± 4,19 104,78 ± 4,21
M 114,19 ± 4,22 * 122,27 ± 5,03 * 126,16 ± 6,06 * 124,93 ± 6,33 *
Triangulação (ms)
C 75,60 ± 4,38 83,82 ± 5,51 84,13 ± 4,51 91,83 ± 4,63
M 91,83 ± 4,38 * 101,35 ± 4,65 * 105,20 ± 5,55 * 105,70 ± 6,56 *
APA: amplitude do potencial de ação; PRM: potencial de repouso da membrana; DPA30: duração do
potencial de ação aos 30% da repolarização; DPA90: duração do potencial de ação aos 90% da
repolarização; triangulação: DPA90 - DPA30. Parâmetros registrados nas condições controle (n = 4;
12 células) e incubado 24 h com metformina 10 mM (n = 4; 12 células). * P < 0,05 comparado com o
respectivo controle na mesma frequência (ANOVA, 2 fatores). As diferenças estatísticas foram
também sombreadas para uma melhor visualização.
83
Já que a diminuição da corrente de Ito não estaria relacionada a uma união
direta da metformina com o canal decidiu-se a seguir, investigar se a incubação por
24 h com a droga, tempo suficiente para induzir mudanças genômicas em
cardiomiócitos (Torres-Jacome et al., 2013; Monnerat-Cahli et al., 2014), poderia
explicar, pelo menos em parte, a menor densidade de Ito observada nos animais
tratados durante 10 semanas na Figura 16. A Figura 22 mostra como a incubação
de cardiomiócitos por 24 h com metformina induz a redução da densidade da
corrente Ito quando comparado ao grupo de cardiomiócitos não incubados
(controle) como pode ser observado já nos registros representativos (A e B). O
gráfico da Figura 22C representa a densidade da corrente a diferentes voltagens.
No pulso a +50 mV observa-se valor máximo da corrente Ito (pA/pF) em
cardiomiócitos incubados por 24 h com metformina (12,66 ± 1,16) e em
cardiomiócitos controle (20,11 ± 2,48). A diferença entre os grupos foi significativa a
partir do pulso a +30 mV. Após ter sido constatado que a incubação com
metformina reduz a densidade da Ito, parâmetros biofísicos como dependência de
voltagem da inativação e recuperação da inativação foram avaliados no intuito de
investigar se estes poderiam ser os mecanismos responsáveis por tal redução. Foi
seguido o protocolo mostrado na figura 23A (esquerda) que, após um pré-pulso de
5s permite obter registros como aquele mostrado na mesma figura. A Figura 23B
mostra que a incubação por 24 h com metformina não afetou a dependência de
voltagem da inativação. A Figura 23C confirma que não existe diferença nos
valores de voltagem média de inativação (Vh) entre os 2 grupos experimentais.
Outro parâmetro avaliado, e que poderia ter sido alterado pela incubação
com metformina, é a recuperação da inativação da corrente Ito. Se a recuperação
da inativação destes canais estiver mais lenta, é possível que estes canais não
tenham tempo suficiente para passar do estado inativo para o de repouso, e
estarem disponíveis para abrir novamente, podendo retardar a repolarização
ventricular do PA. Foi aplicado o protocolo esquematizado na Figura 24A
(esquerda) com pré-pulso e pulso separados por intervalos crescentes de tempo
para modificar a fração da população de canais que transitaram para o estado
84
A
-40 -20 20 40 60
5
10
15
20
25
**
Dens
idad
e de
Cor
rent
e (p
A/pF
)
Potencial de Membrana (mV)
Controle Metformina 24 h
*
B
Metformina 24 h
100 ms
10pA
/pF
100 ms
10pA
/pF
C
Controle
-60 mV
+50 mV 500 ms
-60 mV
-30 mV
Figura 22. A incubação com metformina durante 24 h reduz a densidade da corrente Ito em
cardiomiócitos saudáveis. Para registrar a corrente Ito foi utilizado um protocolo (inserido entre os
traçados dos painéis A e B) partindo de um potencial holding de -60 mV com pulsos crescentes de
10 mV, desde -30 mV até +50 mV, durante 500 ms. Traçado representativo da Ito em cardiomiócito
controle (A) e incubado por 24 h com metformina (10 mM) (B). C: curva corrente-voltagem da Ito em
cardiomiócitos na situação controle (n = 4; 8 células) e incubado com metformina por 24 h (n = 5; 15
células). Os valores de corrente foram normalizados pela capacitância de suas respectivas células e
expressos em médias ± EPM. * P < 0,05 quando comparado ao controle na mesma voltagem
(ANOVA, 2 fatores).
85
-100 -75 -50 -25
0,25
0,50
0,75
1,00
Potencial de Pré-Pulso (mV)
Controle Metformina 24 h
I/Im
ax
NS
BC
5 s 500 ms
A+10 mV
5 s-100 mV
Pré-pulso
-60 mV
+50 mV
-60 mV
Figura 23. A Incubação com metformina 10 mM por 24 h não altera a dependência de voltagem da
inativação da corrente Ito. A: protocolo de voltagem (esquerda) e registro representativo da corrente
após pré-pulso para estudo da corrente Ito em cardiomiócitos controle (direita). B: representação
gráfica dos valores obtidos utilizando o protocolo de dependência de voltagem da inativação da
corrente Ito em cardiomiócitos controle (n = 4; 6 células) e incubados com metformina 24 h (n = 3; 7
células). O gráfico mostra os valores de I/Imax (amplitude da corrente pico em cada valor de
voltagem, dividida pela amplitude da corrente máxima) como médias ± EPM. O teste estatístico
ANOVA, 2 fatores, foi aplicado como teste de significância para avaliar os pontos experimentais (em
B) nas condições controle e metformina 24 h. A função de Boltzmann I/Imax = A/[1 + exp(V-Vh/S)] (ver
ponto 3.8.3 de Materiais e Métodos) foi ajustada aos pontos experimentais em cada experimento
individual para obter valores Vh expressos em médias ± EPM (C). NS: sem diferença
estatisticamente significativa (teste t de Student). Assume-se que os valores de “S” não foram
modificados pela incubação 24 h com metformina em função da clara proximidade entre os valores
de I/Imax para cada potencial de pré-pulso.
86
A
B C
0 100 200 300 400 5000,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
I t/Ip
Intervalo (ms)
Controle Metformina 24 h
NS
Pulso
Teste (t)
200 ms
Pré-pulso
(p)
100 ms
100 ms
- 60 mV
+ 50 mV
2000
pA
Figura 24. A Incubação por 24 h com metformina não altera a recuperação da inativação e a
constante de tempo de recuperação da inativação da corrente Ito de cardiomiócitos. A: representação
esquemática do protocolo de pulsos (esquerda) e registro representativo de recuperação da
inativação da Ito de cardiomiócito de animal controle (direita). B: curva de recuperação da inativação
da corrente Ito de cardiomiócitos de animais controle (n = 3; 6 células) e incubados com metformina
24 h (n = 4; 9 células). Cada ponto representa a relação entre a amplitude do pulso teste (It) e seu
respectivo pré-pulso (Ip) graficados com respeito ao intervalo de tempo entre o pré-pulso e o pulso
teste. O teste estatístico ANOVA, 2 fatores, foi aplicado como teste de significância para avaliar os
pontos experimentais nas condições controle e metformina (observar em B) nos diferentes
intervalos de tempo. C: a equação It/Ip = A(1-e(-t/τ)) foi ajustada aos pontos do gráfico B, para obter
os valores da constante de tempo de recuperação da inativação (τ), expressos em médias ± EPM.
NS: sem diferença estatisticamente significativa (teste t de Student).
87
aberto. Isto foi verificado no experimento representativo mostrado no lado direito da
mesma figura. Na Figura 24B observa-se que a incubação com metformina não
afeta a recuperação da inativação da corrente Ito quando comparado com a
situação não incubado (controle) em todos os intervalos entre o pré-pulso e pulso
(variando entre 25 e 475 ms). Foi constatado, como mostrado na Figura 24C, que a
constante de tempo de recuperação da inativação (τ) que representa o tempo que
demoram 63,2% dos canais para passarem do estado inativo para o estado de
repouso não foi afetada pela incubação com metformina por 24 h.
Na Figura 25 observa-se que a incubação de cardiomiócitos com metformina
durante 24 h também não afetou a densidade da corrente de cálcio do tipo L (ICa-L)
quando comparada ao grupo não incubado (controle). Empregando o protocolo
esquematizado entre os painéis A e B desta figura foram obtidos os registos
representativos nas duas condiçoes experimentais. A Figura 25C apresenta a curva
corrente-voltagem da ICa-L a diferentes voltagens, sendo que a amplitude máxima
da corrente foi observada a +10 mV. Neste potencial, a densidade de corrente no
grupo controle foi -4,65 ± 0,85 pA/pF e 5,68 ± 0,54 pA/pF no grupo incubado 24 h
com metformina.
4.4. Expressão de RNAm que codificam para subunidades que compõem o canal Ito.
Como observado nos resultados, foi encontrada uma diminuição na corrente
Ito, mas não na ICa-L. Este achado poderia justificar, pelo menos em parte, o
prolongamento do PA quando o ventrículo foi incubado com metformina por 24 h.
Ainda, como os parâmetros biofísicos estudados na corrente Ito não apresentaram
alterações 24 h após incubação com metformina, foi formulada a hipótese de que
os estudos de expressão gênica apresentados a seguir poderiam esclarecer se a
redução na densidade da corrente Ito poderia ser decorrente de uma menor
síntese/expressão das subunidades que formam este canal. A Figura 26 mostra
que a expressão de RNAm que codificam para as subunidades KV4.2, KV4.3 e
KChIP2 não foi reduzida após incubação durante 24 h com metformina.
88
2,5
pA/p
F
100 ms
-40 -20 20 40 60
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
1
Den
sida
de d
e C
orre
nte
(pA
/pF)
Controle Metformina 24 h
Potencial de Membrana (mV)
NS
A
B
Controle
Metformina 24 h
2,5
pA/p
F
100 ms
500 ms
-70 mV-70 mV
-30 mV
+50 mV
30 ms
C
Figura 25. A incubação com metformina durante 24 h não altera a densidade da corrente ICa-L em
cardiomiócitos isolados. Para registrar a corrente ICa-L, foi utilizado um protocolo de pulsos a partir
de um potencial holding de -70 mV, com pulsos despolarizantes de -30 mV a +50 mV, com
incrementos de 10 mV com duração de 500 ms (protocolo representado entre os traçados dos
painéis A e B). Para inativar outras correntes de entrada (por exemplo INa) foi aplicado um pré-pulso
despolarizante partindo de um potencial holding de -70 mV até -30 mV, com duração de 30 ms.
Traçados representativos da corrente ICa-L em cardiomiócitos de animal controle (A) e incubados por
24 h com metformina (B). C: curva corrente-voltagem de ICa-L em cardiomiócitos controle (n = 4; 8
células) e incubados com metformina 24 h (n = 4; 5 células). Os valores de corrente foram
normalizados pela capacitância da célula. Os valores foram expressos em médias ± EPM. NS: sem
diferença significativa quando se comparam valores na mesma voltagem (ANOVA, 2 fatores).
89
ANS
Kv 4.20,0
0,5
1,0
1,5
Exp
ress
ão re
lativ
a
Controle Metformina 24 h
Kv 4.30,0
0,5
1,0
1,5
Exp
ress
ão re
lativ
a
Controle Metformina 24 h
B
NS
KChIP20,0
0,5
1,0
1,5
Exp
ress
ão re
lativ
a
Controle Metformina 24 h C
NS
Figura 26. A incubação com metformina não altera os níveis de RNAm que codificam para
subunidades do canal Ito. Níveis de RNAm das subunidades KV4.2 (A), KV4.3 (B) e KChIP2 (C). O
gráfico de barras corresponde a médias de 5 experimentos realizados em duplicata ± EPM. Os
valores obtidos foram normalizados pelo controle interno gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH). NS: sem diferença significativa quando comparado com controle (teste t de Student).
90
Diante dos resultados obtidos, formularam-se novas hipóteses que possam
explicar redução da corrente Ito e níveis de RNAm normais. Estas novas idéias
serão abordadas com maiores detalhes durante o decorrer da discussão.
5. DISCUSSÃO
Neste estudo constatou-se que o tratamento com metformina não afetou a
evolução do peso corporal (Figura 12), resultado controle de efeito da droga no
metabolismo global e no rendimento energético em animais saudáveis que não
apresentavam obesidade. Vários trabalhos destacam que o uso da metformina é
capaz de controlar o peso corporal, tanto em animais obesos e/ou diabéticos
(ROURU et al., 1992; MATSUI et al., 2010). Ainda, um estudo clínico randomizado
realizado pelo Healthcare Research and Quality nos EUA (LeBLANC et al., 2011)
comprovou que a metformina reduz o peso corporal em adultos com sobrepeso ou
obesos quando comparado ao um efeito placebo. Uma das possíveis explicações
para redução do peso corporal em mamíferos não saudáveis pode ser resultado da
ativação da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) pela metformina afetando,
nestas populações com anabolismo incrementado, a carga celular de adenilato.
Tendo em vista que a AMPK é expressa nas células neuronais (TURNLEY et al.,
1999) do hipotálamo, e que participa na regulação da ingestão energética e do
peso corporal, esta quinase poderia estar regulando os sinais anorexígenos no
hipotálamo em mamíferos com sobrepeso (XUE & KAHN, 2006; SIMLER et al.,
2007)
A observação de que o tratamento com metformina não causou hipoglicemia
em animais saudáveis com glicemia normal (Figura 13) se insere no mesmo quadro
de metabolismo não afetado o que não é o caso quando há combinação de
dislipidemis e hiperglicemia. Há, por exemplo, trabalhos que relatam a capacidade
deste fármaco em reduzir os níveis de hemoglobina glicosilada e melhorar o perfil
lipídico dos pacientes com hiperglicemia (BAILEY, 1999; FISMAN et al., 2004).
Costa e colaboradores (2008) descrevem que doses baixas (3,5 μg/g por dia) e
intermediárias (30 μg/g por dia) de metformina reduzem significativamente os níveis
de glicose plasmática quando comparado com ratos diabéticos sem tratamento. De
91
forma contrastante, o mesmo estudo ressalva que apesar dos efeitos benéficos
deste fármaco, o uso da metformina em altas doses 74 μg/g por dia não diminui a
hiperglicemia e que este fato predispõe a um aumento nas doenças
cardiovasculares (BAILEY et al., 2005; AN et al., 2006).
Os dados de glicemia plasmática obtidos no presente estudo foram de
extrema importância como controle para os experimentos de eletrocardiograma
(ECG), visto que a hipoglicemia causa uma maior susceptibilidade de gerar
arritmias (CHOW et al., 2014), e isso poderia mascarar um possível efeito da
metformina no ECG.
Ao avaliarmos a atividade elétrica cardíaca através do ECG (Figura 14,
Figura 15 e Tabela 6) foi constatado que o tratamento com metformina numa dose
alta (35 mg/kg por dia) – a mesma utilizada por um paciente diabético – mostrou
um risco para aparecimento de arritmias ventriculares e uma possível
predisposição à morte súbita, observados através do prolongamento do intervalo
QT e QTc. Estes achados se tornam assim especialmente relevantes tendo em
vista que foram utilizados animais saudáveis. Prolongamentos como estes foram
observados por Costa e colaboradores (2008) utilizando uma concentração de
metformina (74 μg/g por dia), uma dose considerada alta, usada por pacientes
diabéticos. Contudo, a literatura relata que a dose administrada em um paciente
diabético varia entre 500-2500 mg por dia, equivalente a 7,14 mg/kg por dia e 35,71
mg/kg por dia respectivamente o que preliminarmente poderia levar a pensar que
haveria pouco risco de aparecimento deste remodelamento elétrico com estas
últimas doses. Se observarmos a dose utilizada por este grupo (74 μg/g por dia),
portanto 100 vezes menor quando comparada com a dose baixa (7,14 mg/kg por
dia) administrada por um diabético, as alterações no intervalo QT, QTc e QTd
constatadas em ratos diabéticos podem estar atreladas às alterações geradas pela
própria doença. Apesar disso, Costa e colaboradores atribuiram estas mudanças
no ECG a possíveis alterações nos canais de K+ dependentes de voltagem, como
também a uma hipercalcemia, uma vez que o aumento da concentração de Ca2+
diminui a velocidade de condução ventricular, encurtando o período refratário,
podendo assim causar arritmias (KIEWIET et al., 2004).
92
NAJEED e colaboradores (2002) de forma contrastante ao observado por
Costa e colaboradores e no presente estudo verificaram uma redução no intervalo
QT, enquanto que o intervalo QTd permaneceu inalterado quando comparado ao
QTd dos pacientes (humanos) antes de iniciar o tratamento com metformina. Esta
redução do QT foi atribuída ao fato de que a metformina não causa bloqueio dos
canais de K+ sensíveis ao ATP, sugerindo que poderia existir uma seletividade da
droga em relação aos diferentes canais de K+ presentes em tecidos excitáveis. De
maneira interessante, há estudos demonstrando que o tratamento com metformina
aumenta a frequência cardíaca e a pressão sanguínea quando comparado à
repaglinida uma nova classe de anti-diabético oral (LUND et al., 2008), no que
poderia representar um fator adverso adicional. Por outro lado, os resultados
obtidos num estudo de Sundaresan e colaboradores (1997), comparando efeitos da
metformina e glibenclamida, apontam também para a redução do QT, como
demonstração de que os efeitos da metformina constituem uma questão em aberto
desde as últimas décadas, que ainda assim permanece. Contribuindo para ampliar
a diversidade de observações, outros trabalhos não constataram diferenças
significativas na frequência cardíaca com o uso metformina (CAMPBELL et al.,
1987; NATALI et al., 2004) e repaglinida (WOLFFENBUTTEL et al., 1993;
MARBURY et al., 1999; MADSBAD et al., 2001). O aumento da frequência
cardíaca é um fator de relevância, visto que está diretamente relacionado com o
aumento da mortalidade (THAULOW & ERIKSEN, 1991), e que a utilização de
agentes β-bloqueadores reduz o índice de mortalidade na proporção que diminuem
a frequência cardíaca (KJEKSHUS, 1986). Possivelmente, uma conjunção de
fatores como dose, comorbidades, patrimônio genético − dentre outros − podem
contribuir para este variado espectro de respostas, ainda não totalmente
compreendido. Todavia, a possibilidade clara de arritmias demonstrada na
presente tese, torna o uso da metformina em pessoas saudáveis como um fator de
risco.
Apesar do tratamento com metformina ter demonstrado claramente um
potencial arritmogênico (Figura 14 e Figura 15, Tabela 6), a quantificação de
arritmias (como extrasistoles e salvas) no ECG de animais saudáveis mostrou
eventos muito esporádicos em intervalos de dias e até semanas, o que a princípio
93
poderia apontar para uma possibilidade bastante remota de ocorrência em grandes
populações que utilizem esta droga. Mas, em contrapartida, um estudo clínico no
ano de 2011, com um paciente diabético tratado com metformina, demonstrou que
este fármaco induziu a fibrilação atrial após 48 h de tratamento, e quando
interrompida a administração a atividade elétrica cardíaca normal foi reestabelecida
(BOOLANI et al., 2011). Porém, até onde chega nosso conhecimento, não há
estudos que possam confirmar esta informação referente à induçao de arritmias e
sua reversão pela suspensão do tratamento.
Os dados obtidos neste estudo constaram que a metformina causa redução
da corrente transitória de saída de potássio (Ito) (Figura 16 e Figura 22), sem alterar
os parâmetros biofísicos de dependência de voltagem da inativação (Figura 17 e
Figura 23) e recuperação da inativação (Figura 18 e Figura 24), como também as
correntes de cálcio do tipo L (Figura 19 e Figura 25). Estes resultados são
interessantes e ao mesmo tempo intrigantes se pensarmos que a corrente Ito se
mostrou reduzida em cardiomiócitos de animais saudáveis que foram submetidos
ao tratamento com metformina em uma dose alta como as utilizadas por um
paciente diabético (Figura 16). De maneira ainda não completamente
compreendida, alterações semelhantes também podem ser encontradas em
modelos animais diabéticos induzidos (CASIS et al., 2000; MEDEI et al., 2010;
TORRES-JACOME et al., 2013), o que reforça a visão que associa impacto desta
corrente com o remodelamento elétrico revelado no ECG. E, diante do fato das
propriedades biofísicas da corrente Ito e da densidade da corrente de Ca2+ tipo L
não estarem alteradas, sugerimos que a redução da densidade da corrente Ito
poderia estar associada a uma diminuição na quantidade de canais funcionais de
K+ na membrana plasmática. Estes resultados, associados aos mostrados na
Figura 26, nos levaram também a postular que a metformina pode potencializar
alterações no ECG já existente nos pacientes diabéticos, através das alterações
pós-translacionais que diminuem a quantidade de canais funcionalmente
competentes, já que a transcrição de mRNAs (pelo menos os que codificam para
subunidades de alguns destes canais) não foi alterado pela droga (Figura 26).
Os dados referentes ao ECG discutidos acima parecem confirmar que existe
um efeito na repolarização ventricular associados à exposição à metformina,
94
possivelmente como consequência da diminuição da densidade da corrente Ito.
Dado que no animal inteiro temos a influencia de outros sistemas, tais como
sistema nervoso, sistema endócrino, sistema imune, dentre outros, a realização de
experimentos in vitro ajudaram a ampliar a visão sobre o efeito deste fármaco sob a
repolarização ventricular e a postular possíveis mecanismos.
Para tentar elucidar o mecanismo pelo qual ocorre a redução da corrente Ito
realizaram-se experimentos agudos (Figura 20) com metformina por 30 min. Estes
resultados sugerem fortemente que a redução da corrente Ito não ocorre por uma
união direta do fármaco ao canal que ocorreria em tempos muito curtos. Conforme
descrito previamente em alguns trabalhos (GALLEGO & CASIS, 2001; GALLEGO
et al., 2005), 15 min é tempo suficiente para a ativação dos receptores α-
adrenérgicos e consequentemente para a redução da densidade da corrente Ito
através da fosforilação do canal mediada por PKA. Ainda, foi relatado que a
perfusão aguda com imipramina por um período menor que 15 min é suficiente
para bloquear completamente a corrente Ito (CASIS & SÁNCHEZ-CHAPULA,
1998), mostrando que outras drogas hipoglicemiantes seriam capazes de deflagrar
processos muito rápidos envolvendo talvez redes de sinalização. Assim, estes
resultados agudos nos permitiram postular que a redução da corrente Ito observada
in vivo, pode estar sendo causada pela influencia de outros sistemas ou poderia
esta sendo ocasionada por um efeito do fármaco através de mecanismos que
necessitam de um tempo maior para sua manifestação, como o processamento
pós-transducional e a inserção funcionalmente competente na membrana dos
cardiomiócitos.
Os resultados de cardiomiócitos incubados durante 24 h com metformina à
10 mM mostraram que este é um tempo suficiente para que ocorra prolongamento
na duração e aumento da triangulação do potencial de ação cardíaco (Figura 21,
Tabela 7), como também redução da corrente Ito (Figura 22). Em recente trabalho,
foi mostrado que 24 h de incubação com ativadores de receptores de membrana é
tempo suficiente para modular a repolarização ventricular no PA cardíaco
(MONNERAT-CAHLI et al., 2014). Outros estudos demonstraram que em
cardiomiócitos diabéticos isolados, a incubação com fatores tróficos como insulina
ou noradrenalina por 24 h é suficiente para recuperar a densidade desta corrente
95
(GALLEGO et al., 2000; TORRES-JACOME et al., 2013; SETIÉN et al., 2013),
dados que apontam fortemente para a ativação de eventos rápidos que envolvem
primeiros mensageiros chave em vias de sinalização chave em processos
metabólicos, como as vias de utilização/processamento de glicídeos e lipídeos.
Em termos de metabolismo energético, as alterações na atividade elétrica
cardíaca observada tanto in vivo como in vitro poderiam ser explicadas, pelo menos
em parte, pelo efeito exercido através metformina sobre a AMPK. Esta hipótese se
apoia nos dados obtidos por Torres-Jacome e colaboradores (2013), mostrando
que a incubação de cardiomiócitos provenientes de animais saudáveis com um
análogo do AMP (AICAR), utilizado habitualmente como ativador desta quinase, foi
capaz de reduzir a densidade da corrente Ito. Interessantemente, outros autores já
relataram que a ativação de AMPK pode gerar uma diminuição em outras correntes
iônicas que participam da gênese do potencial de ação cardíaco tais como: (i) a
corrente de Na+; (ii) a corrente IKs; (iii) a corrente retificadora retardada IK1; e (iv) a
corrente IKr (LIGHT et al., 2003; ALESUTAN et al., 2011a; ALESUTAN et al., 2011b;
ALMILAJI et al., 2013).
Como discutido acima, os resultados obtidos nesta tese pareciam
inicialmente sugerir um efeito genômico sobre corrente Ito. Foi assim proposta a
hipótese de que a metformina provocaria uma diminuição da expressão de RNAm
que codificam as subunidades α do canal de K+ que conduz a corrente Ito (PATEL &
CAMPBELL, 2005). No entanto, ao avaliar os níveis de RNAm dos genes que
codificam estas subunidades (Figura 26), observou-se que a exposição a
metformina não causou redução na expressão relativa do RNAm, portanto a
redução da corrente Ito seria devida a outros mecanismos que impactariam o
funcionamento competente dos canais responsáveis pela sua gênese.
Uma das possíveis explicações para os níveis de RNAm normais – e ao
mesmo tempo com uma densidade da corrente Ito reduzida − é que a integridade do
citoesqueleto nos cardiomiócitos possa ter sido afetada pela exposição à
metformina. Um trabalho publicado por Shimoni e colaboradores (1998), mostra
que o aumento da amplitude da corrente Ito induzidas por ativação da MAPK ocorre
devido a um aumento na síntese protéica do canal (SHIMONI et al., 1998),
96
sugerindo que o oposto poderia ocorrer com a diminuição da síntese. Contudo,
este efeito entre abundância proteica e amplitude da corrente depende da
integridade do citoesqueleto, o que permitiria a translocação dos canais recém-
formados para membrana plasmática (SHIMONI et al., 1999).
Um outro ponto que se deve levar em consideração é que a expressão
funcional dos canais iônicos na membrana celular é um resultado de um equilíbrio
entre a síntese e o transporte por um lado e a internalização e a degradação por
outro. Muitas proteínas de membrana são degradadas nos lisossomos após ter
sido convenientemente marcadas com um único resíduo de ubiquitina por enzimas
ubiquitina ligases (HAGLUND et al., 2003). Dos canais iônicos ativados por
voltagem presentes no coração, o processo de degradação que provavelmente
melhor se conhece é o do canal HERG (human éter-a-go-go related gene)
responsável pela corrente IKr no ventrículo humano. Trabalhos realizados em
cultivos celulares e em cardiomiócitos neonatais de rato demonstraram que o canal
HERG é retirado da membrana plasmática mediante um processo de endocitose
dependente de caveolina-3. Esta proteína facilita a ubiquitinação do canal pela
ubiquitina ligase Nedd-4-2 gerando sua posterior degradação (GUO et al, 2011;
ALBESA et al., 2011). Diante dos resultados obtidos nesta tese, poderia ser
sugerido que a ativação da AMPK através da metformina poderia acelerar o
processo de degradação do canal pela correspondente ubiquitina ligase. Podendo
assim explicar a redução na expressão funcional do canal na membrana celular,
mesmo quando a expressão do RNAm esteja preservada. Esta hipótese está
reforçada pelo fato de que tanto os canais HERG como o canal Ito estão associados
à caveolina-3 em cardiomiócitos ventriculares de rato (ALDAY et al., 2010).
Por fim, recentes estudos vêm demonstrando o papel dos microRNAs
(miRNAs) em diferentes doenças (FIGUEIRA et al., 2014), um aspecto que merece
consideração no contexto da presente tese e de futuros direcionamentos deste
trabalho. Os miRNAs são pequenas moléculas de RNA que atuam como
reguladores de expressão de proteínas em células eucarióticas, tendo a
capacidade de impedir processos traducionais e, consequentemente, estimular a
degradação de RNAs transcritos (CAI et al., 2010; COLLINO et al., 2011). Cada
miRNA tem a capacidade de regular múltiplos genes, e uma deficiência na
97
regulação destes, pode causar mudanças fisiológicas severas. Atualmente
correlaciona-se o envolvimento de miRNAs específicos com processos patológicos
na miocardiopatia diabética por meio da modulação de genes alvos e das proteínas
associadas. Destaca-se o aumento do miR-133, responsável por causar uma
redução dos canais de K+ e possivelmente pela geração de arritmias em coração
de coelho diabético (XIAO et al., 2007). Esse fato nos leva a postular que uma
possível participação de miRNAs específicos teria um papel relevante na
modulação dos canais de K+ dependentes de voltagem responsáveis por conduzir a
corrente Ito.
Apesar de inúmeros trabalhos citarem a metformina como exercendo efeitos
cardioprotetores em situações patológicas como infarto do miocárdio (CALVERT et
al., 2008), insuficiência cardíaca (GUNDERWAR et al., 2009) e hipertrofia cardíaca
(ZHANG et al., 2011), as implicações deste fármaco na atividade elétrica cardíaca
necessita de maiores esclarecimentos. Especialmente porque a metformina vem
sendo amplamente indicada para pacientes portadores de síndrome metabólica,
que não são diabéticos e que, portanto, estariam fazendo uso deste fármaco de
forma indiscriminada (ORCHARD et al., 2005).
Mas, apesar desta primeira visão negativa, diversos trabalhos vem
descrevendo que os fármacos utilizados para o controle da glicose sanguínea
podem ser um alvo importante como regulador de peso corporal (LIM & ECKEL,
2014). Um estudo publicado por Mkrtumian e colaboradores (2014) demonstraram
que o tratamento com metformina foi capaz de reduzir o peso corporal e a
circunferência abdominal em pacientes com obesidade abdominal, sugerindo que
este fármaco poderia ser introduzido na clínica para tratar e prevenir obesidade
abdominal. Corroborando com os dados anteriores, Savchenko e colaboradores
(2013) constataram que a associaçao da metformina com ramipril reduz a
obesidade abdominal em pacientes com sindrome metabólica, sendo esta
associaçao de fármacos sugerida como uma profilaxia para o desenvolvimento de
DM2 e complicaçoes cardiovasculares. Ladeira-Lopes e colaboradores (2014)
mostraram, num estudo de fase II, que o tratamento com metformina em pacientes
não-diabéticos com sindrome metabólica foi capaz de melhorar a disfunção
ventricular esquerda quando comparado apenas a uma mudança no estilo de vida.
98
Estes resultados nos mostram que este fármaco poderia ser indicado para o uso
em pacientes com sindrome metabólica. Mas os resultados apresentados nesta
tese demonstraram claramente os efeitos negativos deste fármaco na função
elétrica cardíaca em corações saudáveis, o que torna seu emprego na sindrome
metabólica como controlador de peso corporal, como uma estratégia terapêutica
que requer prudência e novos estudos.
6. Conclusão
Os resultados obtidos nesta tese constataram que a metformina provocou
um aumento dos intervalos PR, QT, QTc, prolongamento na duração do PA a
30% e 90% da repolarização, aumento na triangulação do PA e redução da
corrente Ito, alertando para um grande potencial arritmogênico deste fármaco
em corações saudáveis.
O mecanismo pelo qual a metformina reduz a corrente Ito não seria
resultado de uma união direta ao canal, e nem de alterações na transcrição
das principais subunidades formadoras do canal, indicando para diversas
possibilidades de mudanças pos-traducionais, como por exemplo
fosforilações regulatórias mediadas por cinases.
Os dados obtidos abrem novas perspectivas para elucidar os mecanismos
de ação da metformina e suas implicações para a atividade elétrica cardíaca
em indivíduos saudáveis, inclusive aquelas capazes de levar à morte súbita.
99
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