estudo de interação de clonazepam e excipientes em...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Franciny Aparecida Alves
Estudo de interação de Clonazepam e excipientes
em formulações farmacêuticas sólidas e validação
de método indicativo de estabilidade
CAMPINAS
2017
Franciny Aparecida Alves
ESTUDO DE INTERAÇÃO DE CLONAZEPAM E
EXCIPIENTES EM FORMULAÇÕES
FARMACÊUTICAS SÓLIDAS E VALIDAÇÃO DE
MÉTODO INDICATIVO DE ESTABILIDADE
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de
Mestra em Ciências na área de Fármacos,
Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientador: PAULO CÉSAR PIRES ROSA
O arquivo digital corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno
Franciny Aparecida Alves e orientada pelo Dr. Paulo César Pires Rosa.
CAMPINAS
2017
Campinas, 20/12/2017.
Comissão Examinadora de Defesa
Prof. Dr. Paulo César Pires Rosa (orientador)
Profa. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya
Profa. Dra. José Luiz Costa
Observação: Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata
de defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Não é o que você faz, mas quanto amor você dedica no que faz que realmente importa ”
Madre Teresa de Calcutá
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus, que me possibilitou a oportunidade e o interesse em realizar esse
trabalho.
Aos meus pais, José Carlos e Marlene, por transmitirem valores não só por palavras, mas com
exemplo de vida, e por me fazerem acreditar que seria capaz de vencer os desafios.
Ao meu esposo Bruno, que desde que entrou na minha vida, deu mais sentido a tudo, transformando
dificuldades em desafios, fortalecendo minha vontade de vencer e realizar meus objetivos, pelo
companheirismo e por me encorajar a seguir em frente, me apoiando sempre.
Aos meus avós, tios, primos e todos meus familiares, pelo amor, carinho e por apoiar, torcer e vibrar
pelas minhas conquistas.
Aos meus amigos que me ajudaram, apoiaram e tornam minha vida mais feliz.
Às professoras Dra. Alexandra Sawaya, Dra. Marcia Cristina, pelas contribuições durante a
qualificação do projeto de pesquisa. À colaboração dos professores Dr. José Luiz Costa, Dra.Maria
de Lourdes Moraes e novamente Dra. Alexandra Sawaya na análise prévia e aos professores Dr.
José Luiz Costa, Dra. Alexandra Sawaya, por aceitarem compor a banca da defesa e fazer as
contribuições finais para a dissertação.
Ao Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa, pela oportunidade, paciência e por todos os ensinamentos.
Meus sinceros agradecimentos, sem seu direcionamento e apoio, com certeza, este projeto jamais
teria se concretizado.
Muito obrigado a todos vocês!
RESUMO
Os estados de ansiedade e os distúrbios do sono representam problemas comuns, e
os agentes sedativo-hipnóticos estão entre as drogas mais largamente prescritas em
todo o mundo. Clonazepam, é um derivado benzodiazepínico amplamente
administrado como ansiolítico, anticonvulsivante, relaxante muscular e anestésico
sedativo. O delineamento do estudo de interação de excipientes de formulação de
Clonazepam e o desenvolvimento de método indicativo de estabilidade são as
grandes dificuldades na área farmacêutica, desafiando profissionais de
desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Através deste estudo é possível
evidenciar a estabilidade do medicamento. Este trabalho teve como principais
objetivos, aplicar a análise por Infravermelho (IR) para verificação da degradação e
alteração dos grupos funcionais; aplicar análise térmica, devido a importância no
estudo de caracterização, a determinação do grau de pureza e a realização de
ensaios de estabilidade e cinética de decomposição; e desenvolver e validar um
método para a quantificação de Clonazepam, com uma nova análise cromatográfica
sem uso de tampão na fase móvel, para ser aplicado nos estudos de estabilidade de
formulações farmacêuticas e na análise de produtos de degradação. Os resultados
obtidos da análise térmica mostraram que os excipientes estudados não
evidenciaram mudanças no comportamento térmico das misturas binárias
clonazepam-excipiente sem indicação de incompatibilidade. O método analítico
desenvolvido por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) mostrou-se
adequado para a quantificação de Clonazepam e de suas impurezas, baseando-se
nos parâmetros de validação da resolução da ANVISA (899/2003). A implementação
da análise térmica e a aplicação de novos métodos analíticos têm sido consideradas
importantes ferramentas nas diferentes áreas da indústria farmacêutica, fornecendo
informações que determinam os parâmetros de qualidade tecnológicos do
medicamento, visando o desenvolvimento de novas formulações.
PALAVRAS-CHAVE: Clonazepam; Estabilidade; Produtos de Degradação;
Excipientes; Desenvolvimento de Métodos; Validação; Análise Térmica.
ABSTRACT
Anxiety and sleeping disturbs states represent common problems and the sedative-
hypnotics agents are among the most widely prescribed drugs all over the world.
Clonazepam is a benzodiazepine derivative largely given as an anxiolytic,
anticonvulsant, muscle relaxant and sedative anaesthetic. The delineation of the
study on the interaction of excipients of Clonazepam formulation and the
development of indicative method of stability are the major difficulties in the
pharmaceutic area, challenging pharmaceutics products developers. Through the
present study, it is possible to demonstrate the medication stability. This study has
had as main objectives to apply the analysis via Infrared (IR) to verify the degradation
and alteration of the functional groups; to apply thermal analysis, due to their
importance in the characterization study, the determination of the purity degree and
the execution of stability and decomposition kinetic tests; and to develop and validate
a method for the quantification of Clonazepam, with a new chromatographic analysis
with no use of buffer in the mobile phase to be applied in the studies of stability of
pharmaceutic formulations and in the analysis of degradation products. The results
obtained from the thermal analysis have showed that the studied excipients did not
reveal changes in the thermal behaviour of the binary mixtures, clonazepam-
excipient, with no indication of incompatibility. The analytic method developed by
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) has been shown adequate for
quantification of Clonazepam and its impurities, based on the validation parameters
of the Brazilian Health Regulatory Agency’s (ANVISA) resolution (899/2003). The
implementation of thermal analysis and the application of new analytic methods have
been considered important tools in the diverse areas of the pharmaceutical industry,
providing information that define the technological quality parameters of the
medication, aiming the development of new formulations.
KEYWORDS: Clonazepam; Stability; Degradation Products; Excipients; Methods
Development; Validation; Thermal Analysis.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Estrutura molecular do Clonazepam (A), Composto Relacionado A (B),
Composto Relacionado B (C) respectivamente. ....................................................... 22
FIGURA 2 – Fluxograma de validação de métodos analíticos.................................. 50
FIGURA 3 – Espectro de Infravermelho do Clonazepam ......................................... 56
FIGURA 4 – Espectro de Infravermelho do Amido. .................................................. 57
FIGURA 5 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Amido.......... 57
FIGURA 6 – Espectro de Infravermelho do Estearato de magnésio ......................... 58
FIGURA 7 – Espectro de Infravermelho da mistura de CLZ e Estearato de magnésio
.................................................................................................................................. 58
FIGURA 8 – Espectro de Infravermelho da Celulose microcristalina ........................ 59
FIGURA 9– Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Celulose
microcristalina. .......................................................................................................... 60
FIGURA 10 – Espectro de Infravermelho da Lactose monohidratada ...................... 60
FIGURA 11 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Lactose
monohidratada .......................................................................................................... 61
FIGURA 12 – Espectro de Infravermelho da mistura de excipientes ........................ 61
FIGURA 13 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e excipientes
................................................................................................................................. 62
FIGURA 14 – Curva de DSC do Clonazepam .......................................................... 63
FIGURA 15 – Curva de DSC do Amido .................................................................... 63
FIGURA 16 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Amido. ......................... 64
FIGURA 17 – Curva de DSC comparativa de Clonazepam e Amido ........................ 64
FIGURA 18A – Curva de TG e DTG do Clonazepam. .............................................. 66
FIGURA 18B - Curva de TG e DTG do Amido (b), mistura de Clonazepam com
Amido (c) e comparativo (d). ..................................................................................... 67
FIGURA 19 – Curva de DSC do Estearato de magnésio ......................................... 68
FIGURA 20 – Curva de DSC da mistura de CLZ e Estearato de magnésio ............. 68
FIGURA 21 – Curva de DSC Comparativa de CLZ e Estearato de magnésio.......... 69
FIGURA 22 – Curva de TG e DTG do CLZ (a), Estearato de magnésio (b),
mistura de Clonazepam com Estearato de magnésio (c) e comparativo (d) ............ 71
FIGURA 23 – Curva de DSC da Celulose microcristalina ........................................ 72
FIGURA 24 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Celulose microcristalina
................................................................................................................................. .73
FIGURA 25 – Curva de DSC Comparativa de Clonazepam e Celulose microcristalina
.................................................................................................................................. 73
FIGURA 26 – Curva de TG e DTG do Clonazepam(a), Celulose microcristalina(b),
mistura de Clonazepam com Celulose microcristalina(c), e comparativo(d) ............ 76
FIGURA 27 – Curva de DSC da Lactose .................................................................. 77
FIGURA 28 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Lactose ........................ 78
FIGURA 29 – Curva de DSC comparativa do Clonazepam e Lactose ..................... 78
FIGURA 30A – Curva de TG e DTG do Clonazepam (a) e Lactose (b) .................... 80
FIGURA 30B – Curva de TG e DTG para mistura de CLZ com Lactose (c) e
comparativo (d) ......................................................................................................... 80
FIGURA 31 – Curva de DSC mistura de excipientes ................................................ 82
FIGURA 32 – Curva de DSC Clonazepam e mistura de excipientes ........................ 83
FIGURA 33 – Curva de TG da mistura de Clonazepam e excipientes ..................... 84
FIGURA 34 – Cromatograma da solução de padrões de CLZ, CR A, CR B ............ 85
FIGURA 35 – Cromatograma da solução amostra de CLZ à 0,1mg/mL ................... 86
FIGURA 36 – Curva Analítica - Área x Concentração Clonazepam ......................... 91
FIGURA 37 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica
Clonazepam .............................................................................................................. 91
FIGURA 38 – Gráfico de Resíduos Clonazepam ...................................................... 92
FIGURA 39 – Gráfico de Resíduos Padronizados Clonazepam ............................... 92
FIGURA 40 – Curva Analítica - Área x Concentração CR A ..................................... 93
FIGURA 41 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica CR A
.................................................................................................................................. 94
FIGURA 42 – Gráfico de Resíduos CR A ................................................................. 94
FIGURA 43 – Gráfico de Resíduos Padronizados CR A .......................................... 95
FIGURA 44 – Curva Analítica - Área x Concentração CR B ..................................... 96
FIGURA 45 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica CR B
.................................................................................................................................. 96
FIGURA 46 – Gráfico de Resíduos CR B ................................................................. 97
FIGURA 47 – Gráfico de Resíduos Padronizados CR B .......................................... 97
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Ensaios necessários para a validação ................................................. 37
TABELA 2 – Parâmetros e critérios de aceitação estudados na validação .............. 44
TABELA 3 – Misturas binárias de excipientes .......................................................... 47
TABELA 4 – Formulação da amostra simulada ........................................................ 49
TABELA 5 – Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de Linearidade
.................................................................................................................................. 52
TABELA 6 – Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de Exatidão.
.................................................................................................................................. 53
TABELA 7 – Absorção dos principais grupos funcionais para o Clonazepam .......... 56
TABELA 8 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para
Clonazepam e Amido ............................................................................................... 65
TABELA 9 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para
Clonazepam e Estearato de magnésio ..................................................................... 69
TABELA 10 – Dados dos ensaio de TG para Clonazepam , Estearato de magnésio e
mistura de Clonazepam com Estearato de magnésio .............................................. 71
TABELA 11 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para
Clonazepam e Celulose microcristalina .................................................................... 74
TABELA 12 – Dados dos ensaios de TG para Clonazepam, Celulose microcristalina
e mistura de Clonazepam com Celulose microcristalina .......................................... 74
TABELA 13 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para
Clonazepam e Lactose ............................................................................................. 79
TABELA 14 – Dados dos ensaio de TG para Clonazepam, Lactose e mistura de
Clonazepam com Lactose ........................................................................................ 81
TABELA 15 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para
mistura de excipientes. ............................................................................................. 81
TABELA 16 – Adequação do sistema . ..................................................................... 87
TABELA 17 – Seletividade / Especificidade.............................................................. 88
TABELA 18 – Degradação Forçada Padrão. ............................................................ 88
TABELA 19 – Degradação Forçada Amostra. .......................................................... 88
TABELA 20 – Produtos de Degradação encontrados no teste de degradação
Forçada .................................................................................................................... 89
TABELA 21 – Linearidade Clonazepam. .................................................................. 90
TABELA 22 – Linearidade CR A. .............................................................................. 93
TABELA 23 – Linearidade CR B. .............................................................................. 95
TABELA 24 – Limite de Quantificação de Clonazepam. ........................................... 98
TABELA 25 – Limite de Quantificação de CR A. ...................................................... 98
TABELA 26 – Limite de Quantificação de CR B ....................................................... 98
TABELA 27 – Padrão CLZ – Precisão Intradia. ........................................................ 99
TABELA 28 – Padrão CLZ – Precisão Interdia . ....................................................... 99
TABELA 29 – Exatidão do Clonazepam . ............................................................... 100
TABELA 30 – Exatidão do CR A . ........................................................................... 100
TABELA 31 – Exatidão do CR B . ........................................................................... 101
TABELA 32 – Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CLZ. .............. 102
TABELA 33 – Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CR A. ............ 102
TABELA 34 – Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CR B. ............ 102
TABELA 35 – Estudo de estabilidade ..................................................................... 104
TABELA 36 – Produtos de degradação encontrados no teste de estabilidade....... 104
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µ – Micro
°C – Graus Célcius
% - Porcentagem
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BZDs - Benzodiazepícos
C8 – Octil
C – Carbono
Cf – Concentração Final
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cm-1 – Centímetro a menos 1
CMD - Concentração média determinada
CR A – Composto Relacionado A
CR B – Composto Relacionado B
DP – Desvio Padrão
DPR – Desvio Padrão Relativo
DSC - Calorimetria Exploratória Diferencial
DTA - Análise Térmica Diferencial
DTG - Termogravimetria Derivada
Ed - Edição
FE – Fase Estacionária
FM – Fase Móvel
FT/IR - Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
g - Grama
GABA - Ácido gama-aminobutírico
H - Hidrogênio
HPLC - High Performance Liquide Chromatography
ICH - International Conference on Harmonisation
IFA – Insumo Farmacêutico Ativo
IV – Infra-Vermelho
J - Jaule
L – Litros
LQ – Limite de Quantificação
M - Molar
mg – Miligramas
min - Minutos
mL – Mililitros
mm – Milímetros
N - Nitrogênio
ng - Nanogramas
nm – Nanômetro
O - Oxigênio
pKa – Log negativo da Constante de Acidez
pKb – Log negativo da Constante Básica
p/p – Peso por Peso
p/v – Peso por Volume
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
RE – Resolução
RRT – Tempo de Retenção Relativo
SNC – Sistema Nervoso Central
T - Temperatura
TG - Termogravimetria
USP – United States Pharmacopeial
UR – Umidade Relativa
v/v/v – Volume por volume por volume
v/v – Volume por volume
WHO - World Health Organization
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS .............................................................................. 18
1.1 Introdução ......................................................................................................... 18
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 20
2.1.1 Objetivo geral ............................................................................................. 20
2.1.2 Objetivos específicos ................................................................................ 20
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 21
3.1 Benzodiazepínicos ........................................................................................... 21
3.2 Clonazepam ...................................................................................................... 22
3.3 Estudo de compatibilidade fármaco x excipiente ......................................... 24
3.3.1 Excipientes ..................................................................................................... 26
3.4 Análise Térmica ................................................................................................ 26
3.5 Espectroscopia de Infravermelho ................................................................... 27
3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) ......................................... 28
3.7 Estabilidade ...................................................................................................... 29
3.7.1 Estudo de Degradação Forçada ............................................................... 33
3.8 Desenvolvimento de Métodos ......................................................................... 35
3.9 Validação de Métodos ...................................................................................... 36
3.9.1 Especificidade/Seletividade ...................................................................... 38
3.9.2 Linearidade ................................................................................................ 39
3.9.3 Exatidão ...................................................................................................... 40
3.9.3.1 Fármaco .................................................................................................. 40
3.9.3.2 Forma Farmacêutica .............................................................................. 41
3.9.3.3 Impurezas ................................................................................................ 41
3.9.4 Precisão ...................................................................................................... 41
3.9.4.1 Repetitividade (Precisão Intradia) ......................................................... 43
3.9.4.2 Precisão Intermediária (Precisão Interdia) ........................................... 43
3.9.4.3 Reprodutibiblidade ................................................................................. 44
3.9.5 Limite de Quantificação ............................................................................ 44
3.9.6 Robustez .................................................................................................... 44
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 46
4.1 Materiais ............................................................................................................ 46
4.1.1 Matérias-primas ......................................................................................... 46
4.1.2 Reagentes .................................................................................................. 46
4.1.3 Consumíveis .............................................................................................. 47
4.1.4 Aparelhagem experimental ....................................................................... 47
4.2 Métodos ............................................................................................................ 47
4.2.1 Estudo de interação fármaco + excipiente .............................................. 47
4.2.2 Infravermelho ............................................................................................. 48
4.2.3 Termogravimetria ...................................................................................... 48
4.2.3.1 Calorimetria exploratória diferencial .................................................... 49
4.2.4 Desenvolvimento do método cromatográfico ......................................... 49
4.2.4.1 Preparo das Soluções ............................................................................ 49
4.2.4.2 Condições Cromatográficas .................................................................. 50
4.2.5 Validação do Método ................................................................................. 51
4.2.5.1 Elaboração do protocolo ....................................................................... 51
4.2.5.2 Seletividade/Especificidade .................................................................. 52
4.2.5.2.1 Degradação Forçada ........................................................................... 52
4.2.5.3 Linearidade ............................................................................................. 53
4.2.5.4 Exatidão .................................................................................................. 54
4.2.5.5 Precisão .................................................................................................. 54
4.2.5.6 Limite de Quantificação ......................................................................... 55
4.2.5.7 Robustez ................................................................................................. 55
4.2.5.8 Estudo de estabilidade .......................................................................... 56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 57
5.1 Infravermelho ................................................................................................... 47
5.2 Calorimetria Exploratória Diferencial e Termogravimetria ........................... 62
5.2.1 Clonazepam e Amido .................................................................................. 62
5.2.1.1 DSC Clonazepam e Amido ...................................................................... 62
5.2.1.2 TG Clonazepam e Amido ......................................................................... 65
5.2.2 Clonazepam e Estearato de Magnésio ...................................................... 67
5.2.2.1 DSC Clonazepam e Estearato de Magnésio .......................................... 67
5.2.2.2 TG Clonazepam e Estearato de Magnésio ............................................. 69
5.2.3 Clonazepam e Celulose microcristalina ................................................... 71
5.2.3.1 DSC Clonazepam e Celulose microcristalina ........................................ 71
5.2.3.2 TG Clonazepam e Celulose microcristalina .......................................... 73
5.2.4 Clonazepam e Lactose monoidratada ....................................................... 76
5.2.4.1 DSC Clonazepam e Lactose monoidratada ........................................... 76
5.2.4.2 TG Clonazepam e Lactose monoidratada .............................................. 79
5.2.5 Excipientes e Clonazepam com excipientes ............................................ 81
5.2.5.1 DSC Excipientes e Clonazepam com excipientes ................................. 81
5.2.5.2 TG Excipientes e Clonazepam com excipientes ................................... 83
5.3 Desenvolvimento de métodos ...................................................................... 84
5.4 Validação de métodos ................................................................................... 86
5.4.1 Adequação do Sistema .............................................................................. 86
5.4.2 Especificidade/Seletividade ........................................................................ 87
5.4.3 Linearidade .................................................................................................. 90
5.4.4 Limite de Quantificação ............................................................................. 98
5.4.5 Precisão ........................................................................................................ 98
5.4.6 Exatidão ..................................................................................................... 100
5.4.7 Robustez .................................................................................................... 101
5.4.8 Estabilidade ................................................................................................ 103
6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 106
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 108
ANEXOS ................................................................................................................. 108
18
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
1.1 Introdução
Os estados de ansiedade e os distúrbios do sono representam problemas
comuns, e os agentes sedativo-hipnóticos estão entre as drogas mais largamente
prescritas em todo o mundo. Clonazepam (CLZ) é o principio ativo do medicamento
referência, genérico e similar, na forma farmacêutica de comprimido, solução. É um
derivado benzodiazepínico amplamente administrado como ansiolítico,
anticonvulsivante, relaxante muscular e anestésico sedativo. Possui ação inibitória
das funções do sistema nervoso central e sua biotransformação ocorre principalmente
pela redução do grupo 7-nitro, durante a qual, espécies tóxicas podem ser formadas
(SHARMA et al, 2010).
Os ansiolíticos à base de Clonazepam são as substâncias mais consumidas no
Brasil entre os 166 princípios ativos de remédios tarja preta segundo o Boletim do
Sistema Nacional de Gerenciamento de Produtos Controlados da ANVISA, entre
2007 e 2010. Além disso, o consumo brasileiro de CLZ, em 2007 era de 29 mil caixas
por ano. Em 2015, este número atingiu os 23 milhões, de acordo com a IMS Health
agravando ainda mais a situação.
O emprego de métodos analíticos sensíveis é imprescindível para que o
controle de qualidade possa garantir a eficácia e a segurança do uso de um
medicamento. A escolha do método a ser utilizado na análise depende de vários
fatores, tais como a natureza do fármaco, pureza e quantidade de amostra. Além
disso, deve-se levar em conta as condições do laboratório e os custos envolvidos na
análise (AVEDAÑO, 1993).
Entre os métodos para este fim destacam-se os métodos espectroscópicos,
cromatográficos e térmicos. Neste contexto, a análise térmica constitui um grupo de
técnicas de grande interesse na área farmacêutica, visto que propicia a obtenção de
dados relevantes quanto ao comportamento térmico de fármacos e insumos
farmacêuticos, em tempo relativamente curto, fundamentais para a a avaliação de
possíveis incompatibilidades e para o desenvolvimento de novos produtos.
As principais técnicas termoanalíticas aplicadas nessa área são: calorimetria
exploratória diferencial (DSC), análise térmica diferencial (DTA) e a termogravimetria
19
(TG) (GIRON, 1986; CLAS et al., 1999). A aplicação da análise térmica no Brasil com
esta finalidade é recente e vem crescendo significativamente nos últimos dez anos.
Poucos trabalhos foram publicados na literatura contendo dados de análise térmica
para o CLZ. Esse fato motiva a avaliação da estabilidade térmica desse fármaco e de
compatibilidade fármaco/excipiente.
Em complementação às avaliações de interação fármaco-excipiente, o estudo
de compatibilidade através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência pode
ser realizado pelo análise do produto de degradação de um fármaco ou somente
como técnica complementar as outras técnicas. Além disso, a cromatografia tornou-
se uma ferramenta muito útil para a determinação de benzodiazepínicos.
Tradicionalmente, o clonazepam é quantificado por método cromatográfico
farmacopéico. Devido à relevância terapêutica do clonazepam e de sua ampla
comercialização no país, torna-se importante o desenvolvimento do presente trabalho
de forma a contribuir para a avaliação da qualidade das especialidades farmacêuticas
contendo este fármaco.
20
2 OBJETIVOS
2.1.1 Objetivo geral
Desenvolver e validar um método para quantificação do Clonazepam e seus
produtos de degradação e aplicá-lo no estudo de degradação forçada. Avaliar
interações entre CLZ e excipientes por análises térmicas e infravermelho.
2.1.2 Objetivos específicos
Desenvolver e validar método cromatográfico e avaliar a estabilidade térmica
do Clonazepam e seus processos de decomposição.
Avaliar as possíveis interações entre o Clonazepam e excipientes utilizados
em formulações farmacêuticas por análise térmica e infravermelho.
Avaliar as misturas binárias Clonazepam/ Excipientes por IR, TG, DSC.
21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Benzodiazepínicos
Na década de 50, diante do elevado risco oferecido pelo tratamento ansiolítico
com barbitúricos, foram mobilizados esforços visando à descoberta de novas
substâncias tranquilizantes (FERRAZ, 2010). Assim, se deu a descoberta dos
benzodiazepínicos (BZDs), possibilitando a diferenciação entre sedativos, hipnóticos
e tranquilizantes, sendo o clordiazepóxido o primeiro da classe a ser comercializado
(COELHO, 2011; FORSAN, 2010).
O mecanismo de ação dessas substâncias se baseia na interação com um
grupo de receptores denominados receptores ácido gama-aminobutírico (GABAA)
localizados no sistema nervoso central (SNC) e que são responsáveis pela resposta
inibitória. Essa interação ocorre de forma indireta, pois os receptores dos
benzodiazepínicos se situam na mesma estrutura desses receptores e dessa forma
aumentam a resposta do GABA (neurotransmissor inibitório). Desse modo, os
compostos supracitados apresentam os efeitos de sedação, redução da ansiedade e
agressividade, indução do sono, relaxamento muscular, amnésia anterógrada e
anticonvulsivante (FUCHS; WANNMACHER, 2010; RANG; DALE, 2012)
A classe dos BZDs apresentou vantagens como segurança e uma tolerância
diminuída, fatores responsáveis pela sua aceitação e formidável sucesso (FERRAZ,
2010). Além disso, segundo Fuchs e Wannmacher (2010), eles substituíram os
barbitúricos como hipnóticos, uma vez que os BZDs possuem um maior índice
terapêutico e não são indutores enzimáticos.
Motivada por sua relativa segurança, na medida em que são necessárias altas
doses de BZDs para um efeito tóxico, sua prescrição e utilização ocorrem de forma
abusiva; mesmo sendo medicamentos controlados e dispensados apenas mediante
apresentação de receituário médico (TELLES FILHO et al., 2011).
Estimativas apontam que o consumo de Benzodiazepínicos dobra a cada
período de cinco anos. Esse consumo crescente pode ter sido resultado da
introdução copiosa de novas drogas pertencentes a essa classe, a pressão
crescente através de propaganda efetuada pela indústria farmacêutica ou, ainda,
hábitos de prescrição inadequada por parte dos prescritores (CASTRO et al., 2013).
22
Em estudo realizado por Auchewskiet et al. (2004), foi observado que os
principais efeitos adversos que comprometem o usuário de BZDs são a diminuição
da atividade psicomotora, prejuízo da memória e o desenvolvimento de dependência.
Em casos de superdosagem pode haver hipotonia muscular, dificuldade de
deambulação e desmaio, contudo a letalidade é rara. Entretanto, episódios graves
de intoxicação por fármacos desse grupo são desencadeados pela administração
conjunta de outros depressores do SNC (OGA et al. 2014).
Além dos casos de intoxicação advindos da superdosagem também são
relatados que os BZDs estão relacionados a crimes como suicídio, homicídio,
violência sexual e acidentes no trânsito (SMINK et al., 2008).
As pesquisas mais recentes apontam o clonazepam como um dos
Benzodiazepínicos mais utilizados no Brasil (TELLES FILHO et al., 2011). A alta
prevalência do uso desse fármaco a nível nacional pode ser explicada pela
existência do Programa Nacional de Assistência Farmacêutica que distribui o
medicamento Clonazepam gratuitamente, mediante apresentação de receita.
(BRASIL, 2007). Devido a uma maior popularização e aceitação terapêutica, o CLZ
vem se destacando nos últimos estudos de caráter epidemiológico como o
benzodiazepínico mais usado (BETTIOL, 2012).
3.2 Clonazepam
O Clonazepam (Figura 1) é um benzodiazepínico de ação curta a
intermediária. Devido a suas marcantes propriedades antiepilépticas, quando
comparado a outros benzodiazepínicos, é muito utilizado na clínica como adjuvante
no tratamento de convulsões. A nomenclatura química do CLZ [5- (2-clorofenil) -1,3-
di-hidro-7-nitro-2H-1,4-benzodiazepi-2-ona] denota sua classificação como 7-
nitrobenzodiazepina (NEGRUSZ et al., 2003).
A molécula do referido fármaco foi sintetizada a partir do nitrazepam através
do processo de halogenação. O CLZ se caracteriza por apresentar uma estrutura
molecular relativamente simples e por isso foi um dos primeiros de sua classe a ser
sintetizado em laboratório, sendo considerado um “Benzodiazepínico clássico”
(FERRAZ, 2010).
23
A) B) C)
Figura 1 – Estrutura molecular do Clonazepam (A), Composto Relacionado A
(B), Composto Relacionado B (C) respectivamente.
É indicado em casos de stress pós-traumático, transtornos obsessivo-
compulsivos e pânico associado a fobias, além de possuir utilizações no tratamento
da epilepsia. Como os benzodiazepínicos são drogas sedativas, eles são utilizados
como agentes de indução da anestesia geral em cirurgia e endoscopia. (DRUMMER,
1998)
O clonazepam se apresenta em termos físico-químicos como um pó cristalino
branco e insolúvel em água (solubilidade igual a 100mg/L), com coeficiente de
partição de 2,41, ponto de fusão variando entre 236,5-238,5°C, peso molecular de
315,71g/mol e um PKa de 1,50 (DRUGBANK, 2005; FERNER, 2008).
Segundo Ganança et al. (2002), as características farmacológicas do CLZ são
similares às dos demais benzodiazepínicos; possuindo efeitos ansiolíticos, sedativos
e propriedades serotoninérgicas. Esse composto é capaz de estimular a produção de
serotonina a nível central e facilitar a transmissão do Ácido-Gama-Aminobutírico
(GABA). Além dessas propriedades, o mesmo é considerado um fármaco seletivo
para o tratamento da epilipsia, pois potencializa os canais de GABA no núcleo
talâmico impedindo, dessa forma, o ciclo tálamo-cortical sincrônico reticular,
responsável por descargas repetitivas nos ataques epilépticos (GOLAM, 2009;
RANG; DALE, 2012).
A dose diária de uso geralmente se situa entre 1,5 e 10mg. Esse fármaco é
rapidamente e totalmente absorvido após a administração por via oral. A
biodisponibilidade absoluta do clonazepam é de aproximadamente 90%, com uma
concentração máxima sendo alcançada entre 1-4 horas (GOODMAN et al., 2012).
Possui metabolização hepática (citocromo P450, incluindo CYP3A) e a
24
biotransformação acontece prioritamente através da redução do grupo 7-nitro para o
derivado 7-aminoclonazepam, sendo que apenas 2% da dose são excretadas de
forma inalterada na urina (DRUGBANK, 2005).
Segundo Bares et al. (2004), o citado fármaco demonstra uma estreita faixa
terapêutica plasmática de 10 a 50 ng/mL. Devido a isso, o monitoramento do
tratamento com o clonazepam em pacientes epilépticos é recomendado. Além disso,
também são muitos os relatos descrevendo casos de abuso desse medicamento,
envolvendo tentativas de suicídio, crimes sexuais, homicídios, entre outros
(ADAMOWICZ, KALA, 2010; BATISSE et al., 2014; SMINK et al., 2008).
O polimorfismo pode ocasionar desvios de qualidade durante o processo
produtivo e influenciar o desempenho dos medicamentos. Muitas das propriedades
físico-químicas de um sólido variam quando a estrutura cristalina deste é alterada.
Além de alterações nas propriedades físico-químicas, o polimorfismo pode ocasionar
alterações na estabilidade química, principalmente, para os compostos com
predisposição à degradação no estado sólido (ARAUJO et al., 2012). De acordo com
Santos et al. (2014), o CLZ possui uma forma de cristal conhecida, porém não foi
possível fazer sua classificação polimórfica.
Assim, atualmente é preconizada a realização de análises para sua detecção
em diferentes matrizes biológicas e com diversas finalidades e, estas em sua
maioria, empregam métodos cromatográficos como a Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) e a cromatografia gasosa (CG) (BARES, 2004; CHEZÉ et al.,
2004).
3.3 Estudo de compatibilidade fármaco x excipiente
Entende-se como incompatibilidade química entre substâncias a existência de
qualquer interação entre elas, em função do aquecimento, que dá origem a
alterações da estrutura química da substância avaliada, seja por decomposição da
molécula original ou pela formação de uma nova espécie química. Estas informações
adquirem atenção especial na área farmacêutica, pois certas interações físicas e
químicas entre fármaco e excipientes da formulação podem afetar não somente a
natureza química, mas também a estabilidade e a biodisponibilidade do ingrediente
25
farmacologicamente ativo e, por consequência, afetar seu efeito terapêutico e a
eficácia do medicamento (ARAÚJO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2005).
Uma formulação é composta, além do fármaco ou insumo farmacêutico ativo,
de vários componentes conhecidos como excipientes (adjuvantes farmacotécnicos)
com função farmacêutica variada e especializada, como por exemplo, excipientes
usados para melhorar o sabor, odor, aspecto como corantes podem ocasionar a
degradação do IFA. O desenvolvimento de uma formulação apropriada exige
considerar as características físicas, químicas e biológicas de todos os componentes
utilizados na produção do produto. Uma formulação bem-sucedida de uma forma
farmacêutica depende da seleção cuidadosa dos excipientes que serão adicionados
para facilitar a administração, promover a biodisponibilidade do fármaco e protegê-lo
de fatores extrínsecos que levariam à degradação (AULTON, 2005; DESAI et al.,
2003).
A ocorrência de interações no estado sólido entre fármacos e excipientes em
formas farmacêuticas sólidas pode ocasionar mudanças na estabilidade física e
química como solubilidade, dissolução e possivelmente biodisponibilidade dos
fármacos. A avaliação desta interação pode ser analisada por métodos
espectroscópicos, térmicos e cromatográficos. Estas análises são realizadas,
porque, se o fármaco for compatível com os excipientes em altas temperaturas, é
necessariamente compatível com os mesmos em temperatura ambiente (DESAI et
al., 2003).
Atualmente, o estudo de compatibilidade fármaco-excipiente envolve técnicas
de análise térmica, como DSC (THOMAS & NAATH, 2008, OLIVEIRA et al., 2011). O
DSC associado às técnicas de TG tem-se mostrado de muita utilidade nos estudos
de pré-formulação na investigação e predição de incompatibilidades físico-químicas
entre fármaco e excipientes (CLAS et al., 1999).
Os estudos de compatibilidade fármaco-excipientes são geralmente
conduzidos através da obtenção de curvas de DSC do fármaco, do excipiente e da
mistura na proporção inicial de 1:1 do fármaco e do excipiente.
26
3.3.1 Excipientes
O conceito tradicional de excipientes farmacêuticos postula-os como
substâncias que não apresentam funções farmacológicas e que são inseridos em
uma formulação para facilitar sua administração e promover sua preservação. A
qualidade destes excipientes está intimamente ligada à qualidade do medicamento e
sua ação terapêutica esperada no organismo (LIRA, 2004).
As fórmulas farmacêuticas podem ser compostas por diversas classes de
excipientes como diluentes, absorventes, veículos, agentes suspensores,
revestimentos, agentes estabilizantes, flavorizantes, corantes, edulcorantes, agentes
molhantes, desagregantes, deslizantes, dentre outros (FERREIRA, 2008). Porém as
que apresentam importância para as formas farmacêuticas sólidas de uso oral são:
dessecantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes e molhantes.
Os dessecantes, são substâncias que por serem higroscópicas, protegem a
formulação contra umidade. Os desintegrantes ou desagregantes são utilizados para
acelerar a desintegração das formas farmacêuticas sólidas em água ou nos líquidos
do organismo. A presença do agente desintegrante na formulação visa facilitar a
desagregação da forma farmacêutica, aumentando a área superficial e promovendo
a dissolução do fármaco (VILLANOVA, 2009). Os diluentes são substâncias
geralmente inertes, adicionadas ao fármaco com a finalidade de fornecer formas
farmacêuticas sólidas com volume adequado. A presença de diluentes muito
hidrofílicos como a lactose, pode aumentar a captura de líquidos e,
conseqüentemente aumentar a molhabilidade das partículas, acelerando a
velocidade de liberação dos fármacos. Os lubrificantes favorecem o fluxo dos pós,
facilitando seu deslocamento no momento do preparo. Os agentes molhantes
quando adicionados à formulação, aumentam a molhabilidade do ativo e promovem
o aumento da velocidade de dissolução do fármaco. (FERREIRA, 2008).
3.4 Análise Térmica
O conhecimento das propriedades físico-químicas de fármacos é fator
indispensável durante o desenvolvimento de medicamentos. O planejamento racional
de uma forma farmacêutica deve, portanto, iniciar com a caracterização do princípio
27
ativo em questão, de modo a otimizar parâmetros de qualidade da forma
farmacêutica final.
O termo análise térmica refere-se a um grupo de técnicas nas quais
propriedades físico-químicas de uma substância são mensuradas em função do
tempo ou da temperatura enquanto a amostra é submetida a um programa
controlado de temperatura (GIRON, 2002).
DSC e TG são as técnicas termoanalíticas mais difundidas e empregadas
para o desenvolvimento de diferentes estudos sendo aplicadas a uma grande
variedade de materiais farmacêuticos (OZAWA, 2000).
A aplicação de métodos térmicos de análise, em especial o DSC e a TG tem
sido de fundamental importância no estudo de caracterização, desenvolvimento e
controle de qualidade de produtos farmacêuticos (BUCKTON et al, 1991). As
principais aplicações nessa área têm visado a caracterização de matérias-primas e
produtos acabados (BROWN et al, 1999; THOMPSON, 2000) a determinação do
grau de pureza (KSIQZCZAK et al, 2004) e a realização de ensaios de estabilidade e
cinética de decomposição (IGLESIAS et al, 1998; MEDEIROS et al, 2001).
A determinação do ponto de fusão utilizando métodos calorimétricos vem
sendo bastante empregada como método de avaliação do grau de pureza de
fármacos e identificação de polimorfismos (KSIQZCZAK et al, 2004; WIDMANN,
1991). Através da DSC pode-se determinar a faixa de fusão de uma substância e,
baseando-se na equação de Van’t Hoff (FORD, 1989) é possível determinar a fração
molar de impurezas contidas neste material. Quando uma substância é submetida a
aquecimento, o conjunto das impurezas é fundido formando no sistema uma fase
líquida. Acima desta temperatura então, a fase sólida consiste somente em
substância pura. A presença de impurezas, mesmo em pequena quantidade na
amostra produz considerável aumento no intervalo de fusão, iniciando a fusão em
uma temperatura mais baixa que a temperatura determinada para a substância pura
(CONSTANTINO et al, 2004).
3.5 Espectroscopia de Infravermelho
A espectroscopia de infravermelho (IV) é uma técnica que utiliza a faixa do
infravermelho do espectro magnético para identificar moléculas através dos
28
grupamentos funcionais. Os grupos funcionais apresentam uma energia de vibração
(pode ser deformação axial ou deformação angular) que ao ser absorvida, gera uma
banda no espectro permitindo a identificação dos grupamentos presentes nessa
molécula (SILVERSTEIN et al, 2005).
Esta técnica como identifica moléculas, serve para analisar a pureza da
amostra, identificar possíveis impurezas e verificar as possíveis interações fármaco-
excipiente (SILVERSTEIN et al, 2005).
A análise por Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR) em estudos de compatibilidade funciona como análise complementar ao DSC
e TG. Pani e colaboradores (2012), afirmam que as técnicas de DSC e FTIR são
rápidas.
3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de
separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos
mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos, em especial na área
farmacêutica. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua
adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a
possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis. O método
desenvolvido para análise deve possibilitar uma separação adequada do composto
selecionado em um tempo razoável. Para tanto, alguns itens relacionados ao sistema
CLAE como bomba, detector e injetores são relevantes para o bom desenvolvimento
do método e favorecendo uma boa separação (COLLINS, 2002).
As bombas com programadores permitem o uso de eluição por gradiente,
geralmente aplicada aos compostos com polaridades diferentes, como impurezas de
síntese do fármaco e compostos relacionados. Na eluição por gradiente, quantidades
crescentes do solvente mais forte são adicionadas a outro, aumentando a força do
eluente para obtenção de uma separação satisfatória. O sistema de bombeamento
não deve gerar no detector ruídos que possam encobrir sinais mais fracos (USP 32,
2009).
O injetor manual, de maneira geral, é composto de uma válvula de injeção que
possui alça de amostragem de volume fixo. Alguns sistemas recentes possuem uma
29
seringa de injeção que mede o volume a ser usado na injeção. Esses sistemas
permitem a injeção de volumes pequenos com boa reprodutibilidade, fato importante
quando se faz necessária a injeção de soluções concentradas de fármaco, sob
condições de degradação, para que os produtos de degradação sejam detectados.
Os injetores produzidos nos últimos anos apresentam a opção de refrigeração do
compartimento de amostras, que pode ser importante para soluções de compostos
termolábeis, evitando degradação da amostra (USP 32, 2009).
O sistema de detecção deve garantir que propriedades do analito sejam
detectadas como a absorção de luz na região do ultravioleta e visível. Os detectores
de absorção no ultravioleta e o arranjo de diodos são os mais utilizados nas
indústrias farmacêuticas, pelo fato de que a maioria dos fármacos apresentam
absorção na região do ultravioleta (STAFIEJ, 2007).
Segundo Collins (2006), na CLAE as espécies que estão sendo avaliadas
sofrem influência da fase estacionária (FE) e, ao mesmo tempo, as propriedades
destas são continuamente influenciadas pela fase móvel (FM). A FM exerce duas
funções principais, a primeira é arrastar os componentes da amostra através do
sistema cromatográfico e a segunda é participar do processo de separação. As
principais características físico-químicas requeridas das FM utilizadas em CLAE são:
- alto grau de pureza e fácil purificação;
- solubilizar a amostra sem decompor os seus componentes;
- não decompor ou dissolver a FE;
- ter baixa viscosidade;
- ser compatível com o tipo de detector utilizado;
- ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos
componentes da amostra.
Uma FM ideal deve também apresentar baixa toxicidade, e ter custo reduzido.
De modo geral, em qualquer tipo de CLAE a FM é de extrema importância, pois
participa do processo de separação. Parâmetros importantes, como seletividade da
separação, tempo de retenção e solubilidade do composto de interesse na FM,
apresentam consideráveis variações em função das mudanças de composição na
FM. A força cromatográfica da FM mede a sua capacidade em interagir com os
componentes da amostra. Essas interações são devido às diferenças forças como as
30
de van der Waals, as dipolo-dipolo, ligação de hidrogênio e iônicas. A retenção de
um componente é controlada pela força do solvente (COLLINS, 2006).
3.7 Estabilidade
A estabilidade é definida como o tempo durante o qual a especialidade
farmacêutica ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente, mantém dentro
dos limites especificados e nas mesmas condições e características que possuía
quando da época de sua fabricação. Pode também ser definida como o período de
tempo compreendido entre o momento no qual o produto está sendo fabricado e sua
potência está reduzida a não mais do que 10%, desde que os produtos de alteração
estejam todos seguramente identificados e previamente reconhecidos seus efeitos
(TABORIANSKI, 2003; VEHABOVIC et al., 2003; STULZER & SILVA, 2006).
A estabilidade dos produtos farmacêuticos depende de fatores ambientais
como temperatura, umidade, luz e de outros fatores relacionados ao próprio produto
como propriedades físicas e químicas, de substâncias ativas e excipientes
farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e
propriedades dos materiais de embalagens (BRASIL, 2005).
Com a finalidade de garantir a integridade química, física, microbiológica,
terapêutica e toxicológica do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites
especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo, são
preconizados estudos de estabilidade (MATTHEWS, 1999; LUCAS et al., 2004;
ANSEL et al., 2007).
O estudo de estabilidade descrito pela RE nº1/2005 (BRASIL, 2005) possui
como principal aplicabilidade a determinação do prazo de validade do produto
farmacêutico. Porém, também determina a quantificação dos produtos de
degradação e o método analítico correspondente, que resultou na publicação de um
Informe Técnico nº 1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos nos casos
em que a impureza ou o padrão do produto de degradação não estão disponíveis.
Estes procedimentos envolvem a realização de testes de estresse sob condições
variadas (BRASIL, 2008).
31
Os estudos na fase de pré-formulação incluem a estabilidade no estado sólido
do fármaco isolado e a estabilidade na presença dos excipientes. Estas etapas são
realizadas para reduzir ou prevenir a ocorrência de deterioração devido à hidrólise,
oxidação, entre outros processos. Por sua vez, o estudo da estabilidade da
formulação tem por finalidade avaliar o comportamento dos medicamentos em
função do tempo e a influência de uma variedade de condições e fatores, sendo
levado em consideração tanto o fármaco, quanto a mistura de excipientes ou
veículos utilizados, assim como a interação entre ambos, face às condições as quais
estão submetidos (BRASIL, 2005; MAMEDE et al., 2006).
É muito importante a análise de estabilidade das misturas binárias preparadas
para o estudo de compatibilidade, pois algumas reações de incompatibilidade podem
não ocorrer instantaneamente. Além disso, a exposição das misturas a um estresse
térmico pode favorecer alterações no estado cristalino do fármaco ou pode favorecer
a transformações de uma forma polimórfica em outra (COSTA, 2005). Estas
alterações podem promover mudanças físico-químicas nas misturas e favorecer uma
possível incompatibilidade entre o fármaco e excipiente e até uma inatividade do
fármaco.
Para a realização desse estudo, as zonas climáticas constituem um dos
importantes fatores a serem considerados. Devido à grande variabilidade climática, o
mundo foi subdividido em zonas com diferentes especificações de temperatura e
umidade, para possibilitar a comercialização dos produtos em outras zonas
climáticas (CARVALHO et al., 2005; BOTT & OLIVEIRA, 2007).
Para o procedimento dos ensaios de estabilidade realizados no Brasil, de
zona climática 4, tropical e úmida, as indústrias farmacêuticas seguem a RE nº
1/2005 da ANVISA que define três estudos:
Estudo de Estabilidade Acelerada: estudo projetado para acelerar a
degradação química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em
condições forçadas de armazenamento. O produto é submetido à temperatura de
40ºC (graus Célsius) e umidade relativa (UR) de 75% durante 3 e 6 meses. Os
dados obtidos, juntamente com aqueles derivados dos estudos de longa duração,
são usados para avaliar efeitos químicos e físicos prolongados em condições não
aceleradas e para avaliar o impacto de curtas exposições a condições fora daquelas
estabelecidas no rótulo do produto, que podem ocorrer durante o transporte.
32
Estudo de Estabilidade de Longa Duração: estudo projetado para verificação
das características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto
farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo de validade esperado. A
temperatura utilizada é de 30ºC e 75% UR por 6, 12, 18, 24 e 36 meses. Os
resultados são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e
recomendar as condições de armazenamento.
Estudo de Estabilidade de Acompanhamento: estudo realizado para verificar
se o produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas, biológicas,
e microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de estabilidade de
longa duração. O período de estudo é de 12, 24 e 36 meses.
Esses estudos são realizados em câmaras climáticas qualificadas de acordo
com normas internacionais, que proporcionam o controle de temperatura e umidade
em seu interior, projetados para serem utilizados continuamente (NUNES et al.,
2007).
Para a avaliação dos estudos, as amostras são retiradas nos tempos
determinados pelo guia. São determinadas as seguintes análises: doseamento,
quantificação de produtos de degradação, dissolução e pH (quando aplicáveis)
(BRASIL, 2005).
O uso de métodos indicadores de estabilidade, seletivos aos princípios ativos
e seus produtos de degradação, são altamente recomendados pela ANVISA para
acompanhamento de resultados provenientes de estudos de estabilidade de
medicamentos (BRASIL, 2003; BRASIL, 2005). No entanto, poucas monografias
existentes em farmacopeias incluem métodos para análise de produtos de
degradação, e poucos fabricantes conhecem e desenvolvem metodologias validadas
para detecção e quantificação desses produtos. Para o desenvolvimento e validação
de métodos indicativos de estabilidade, preconiza-se a realização de testes de
estresse, para obtenção de padrões, para fim de análise (BAKSHI & SINGH, 2002;
BOUDREAU et al., 2004; CARVALHO et al., 2005).
A realização do teste de estresse, assim como o desenvolvimento do método
analítico para a identificação e quantificação dos produtos de degradação é de
extrema importância para as indústrias farmacêuticas, pois no momento do registro,
pós-registro e renovação, o estudo de estresse, acompanhado de sua análise crítica
deverá ser contemplada.
33
3.7.1 Estudo de Degradação Forçada
O teste de estresse é definido como um teste de estabilidade para fármacos e
medicamentos sob condições extremas, mais ainda do que aquelas utilizadas para o
estudo de estabilidade acelerada. (KLICK et al., 2005; SILVA et al., 2009; BRASIL,
2012). Este teste mostra-se como uma tendência dentro do planejamento para o
desenvolvimento de uma forma farmacêutica, pois a investigação da estabilidade
intrínseca do fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de
adjuvantes, aditivos de proteção específicos e de acondicionamento, que
provavelmente melhorarão a integridade do fármaco e do produto. Demonstrando-se
assim, que o conhecimento do comportamento químico pode ser usado para garantir
a estabilidade da forma farmacêutica desejada (REYNOLDS et al., 2002; AULTON,
2005).
Um dos principais objetivos a serem atingidos através desse teste é
demonstrar a especificidade ao desenvolver um método indicativo de estabilidade,
sobretudo quando poucas informações estão disponíveis sobre os possíveis
produtos de degradação. Estes também fornecem informações sobre as rotas de
degradação e dos produtos formados, que poderiam ser produzidos durante o
período de armazenamento (REYNOLDS et al., 2002).
A identificação dos produtos de degradação está relacionado à segurança dos
medicamentos, pois pode ocorrer a formação de produtos tóxicos e/ou a perda
parcial ou total da atividade terapêutica do fármaco, são necessários o isolamento e
a caracterização das propriedades física e química dos produtos de degradação,
assegurando a segurança biológica a partir da determinação dos níveis de
segurança aceitáveis e de seus limites de quantificação, com relação à posologia
diária (MORIWAKI et al., 2001).
A natureza do teste de estresse utilizado para o fármaco depende de suas
características intrínsecas e da forma farmacêutica a ser desenvolvida. Para o
medicamento, o planejamento do estudo deve ser baseado nas propriedades do
fármaco e dos excipientes utilizados na formulação, assim como nas condições de
armazenamento. Neste caso, são utilizadas condições mais severas do que as
34
condições do estudo de estabilidade acelerado, como estratégia para a fase de
desenvolvimento da forma farmacêutica (KLICK et al., 2005).
A Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 53, de 4 de dezembro de 2015,
estabelece parâmetros para a notificação, identificação e qualificação de produtos de
degradação em medicamentos com substâncias ativas sintéticas e semi-sintéticas,
classificados como novos, genéricos e similares. Essa avaliação é fundamental para
garantir a segurança do produto. Nesta norma são definidos parâmetros para estudar
os compostos de degradação formados, de acordo com a quantidade presente no
produto, relacionando com a máxima dose diária. O limite do produto de degradação
está relacionado com sua toxicidade, sendo que compostos desconhecidos são
permitidos em quantidades mínimas, enquanto que compostos conhecidos podem
estar presentes em níveis intermediários e compostos com estudo de toxicidade
realizado, comprovando sua baixa toxicidade, podem estar presentes até níveis
maiores, considerados seguros.
As condições de degradação e os parâmetros do perfil de degradação são
citados no guia 04 de 2015, que dispõe sobre os requisitos para obtenção do perfil
de degradação, e identificação e qualificação de produtos de degradação. O perfil de
degradação é a descrição detalhada dos resultados e das práticas analíticas
utilizadas na detecção, identificação, elucidação estrutural e determinação
quantitativa dos produtos de degradação presentes no insumo farmacêutico ativo e
no medicamento e tem como ponto chave os estudos de degradação forçada.
Os requisitos para os testes de degradação forçada dependerão das
necessidades do projeto e do estágio de desenvolvimento do fármaco ou do
medicamento. Geralmente, são realizados no início do processo de desenvolvimento
de medicamentos, onde o fármaco é submetido a uma série de condições, tais como
hidrólise (ácido-base), fotólise, oxidação por peróxido e temperatura, a fim de avaliar
os subprodutos resultantes e suas possíveis vias de degradação (SILVA et al., 2009;
SINGH; REHMAN, 2012; HOTHA et al., 2013). Para isso, é necessário desenvolver
um método analítico capaz de detectar a perda do fármaco e identificar os produtos
de degradação (HOTHA et al., 2013).
Em resumo, os estudos de degradação forçada são realizados para alcançar
os seguintes objetivos:
35
1. Estabelecer vias de degradação de fármacos e medicamentos (REYNOLDS et al.,
2002; KATS, 2005; HOTHA et al., 2016; BLESSY et al., 2013).
2. Diferenciar os produtos de degradação que estão relacionados com o fármaco
daqueles que são gerados a partir de excipientes e/ou adjuvantes numa formulação
(REYNOLDS et al.,2002; KATS, 2005; BRUMMER, 2011; BLESSY et al., 2013).
3. Elucidar a estrutura dos produtos de degradação (REYNOLDS et al., 2002;
BLESSY et al.,2013).
4. Determinar a estabilidade intrínseca de um fármaco na formulação (BLESSY et al.,
2013).
5. Elucidar os mecanismos de degradação, tais como hidrólise, oxidação, termólise
ou fotólise do fármaco e do medicamento (BLESSY et al., 2013; ICH Q1A(R2), 2003;
REYNOLDS et al., 2002; SINGH; BAKSHI, 2002).
6. Desenvolver um método analítico adequado para indicar a estabilidade (CIONE et
al, 2011).
7. Compreender as propriedades físico-químicas das moléculas do fármaco
(BRUMMER, 2011).
8. Gerar formulações mais estáveis (BLESSY et al.,2013).
9. Produzir um perfil de degradação semelhante ao que seria observado em um
estudo formal de estabilidade, sob as condições preconizadas pelos guias do ICH
(ICH guidelines. 2014).
10. Resolver problemas relacionados à estabilidade (BRUMMER, 2011).
3.8 Desenvolvimento de Métodos
Ao desenvolver um método cromatográfico busca-se primeiramente obter uma
separação completa entre os compostos analisados. O método analítico para
determinação de teor deve sempre buscar a seletividade do analito entre os diversos
componentes da formulação do medicamento. O desempenho cromatográfico é
influenciado pelo equipamento, FM, FE, temperatura e tipo de eluição (NEUE, 2006).
O desenvolvimento de métodos envolve a avaliação e otimização de
condições, incluindo etapas de preparação da amostra, separação cromatográfica,
detecção e quantificação. Outros fatores importantes que devem ser considerados
no desenvolvimento são os problemas relacionados ao cromatograma como picos
36
assimétricos ou alargados, picos artefatos, picos negativos, variação do tempo de
retenção e reações químicas durante a separação, podendo resultar em baixa
resolução e até coeluições indesejadas, comprometendo o método proposto (NETO,
2009).
A partir das características e propriedades da amostra, as demais partes
integrantes para a realização da análise são determinadas para a otimização das
condições analíticas. Alguns questionamentos à respeito da amostra devem ser
feitos. Por exemplo, para o desenvolvimento de métodos para análise de fármacos
na indústria farmacêutica é necessário saber qual solvente ou mistura deles será
utilizado para solubilizar a amostra; qual a estabilidade da amostra; quais os
procedimentos que devem ser usados na extração do composto ativo; quais as
membranas filtrantes que não retêm o ativo; qual a faixa de absorção do composto
de interesse; qual o valor de pKa ou pKb do analito, solubilidade, volatilidade,
polaridade e quais as propriedades do analito que permitem escolher o tipo de
detector a ser usado. Ainda com relação à amostra, a seleção adequada de uma
técnica de preparo de amostra é um fator chave na obtenção de resultados
confiáveis e exatos (JARDIM, 2010).
3.9 Validação de Métodos
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, mediante
sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais
reconhecida e exigida. Dados analíticos não-confiáveis podem conduzir a decisões
desastrosas e a prejuízos financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo
método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele
deve sofrer uma avaliação denominado validação. A validação de um método é um
processo contínuo que começa no planejamento da estratégia analítica e continua
ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferência. Para registro de novos
produtos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a
validação de metodologia analítica e, para isso, a maioria deles tem estabelecido
documentos oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação.
Um processo de validação bem-definido e documentado oferece às agências
37
reguladoras evidências objetivas de que os métodos e os sistemas são adequados
para o uso desejado (WHO, 1992; CODEX, 1995)
A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método
atenda à exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados (BRASIL, 2003).
A validação do método inicia com a criação do protocolo de validação, no qual
é descrito o planejamento da estratégia analítica, etapas de análise e especificações.
Na área farmacêutica, as validações são conduzidas conforme o que preconiza a
Resolução da Anvisa RE nº 899, de 29/05/2003 e os guias ICH Q2A e Q2B (BRASIL,
2003; ICH, 1995).
Os testes são classificados em 4 categorias, de acordo com a sua finalidade:
I - Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos
farmacêuticos ou matérias–primas.
II - Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e
produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas.
III - Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo).
IV – Testes de Identificação.
Para cada categoria será exigido um conjunto de ensaios, conforme a tabela 1
abaixo (BRASIL, 2003).
38
Tabela 1 – Ensaios necessários para a validação
Parâmetro
Analítico Categoria I
CategoriaII
Quantitativo Ensaio Limite Categoria III Categoria IV
Especificidade
Seletividade Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não * Não
Faixa Sim Sim * * Não
Precisão
Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não
Precisão
Intermediária ** ** Não ** Não
Limite de
Detecção Não Não Sim * Não
Limite de
Quantificação Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
*Pode ser necessário dependendo da natureza do teste.
** Se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária comprovação da Precisão
Intermediária.
3.9.1 Especificidade/Seletividade
A especificidade/seletividade de um método demonstra a capacidade de
medir com exatidão o princípio ativo, em presença de outros componentes que
possam estar presentes na matriz da amostra, como por exemplo: impurezas,
produtos de degradação, excipientes, entre outros.
Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, a especificidade pode
ser determinada pela comparação dos resultados obtidos de amostras (fármaco ou
medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou
excipientes e amostras não contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste
não é afetado por esses materiais. Quando a impureza ou o padrão do produto de
degradação não estiverem disponíveis, pode-se comparar os resultados do ensaio
das amostras contendo impurezas ou produtos de degradação com os resultados de
um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia
39
farmacopéica ou outro procedimento validado). Estas comparações devem incluir
amostras armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor umidade,
hidrólise ácida/básica, oxidação)
Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para
garantir a pureza dos picos cromatográficos. A utilização de ferramentas de pureza
de pico (por exemplo, com auxilio de detector de arranjo defotodiodos ou
espectrometria de massas) são interessantes para demonstrar que o pico
cromatográfico é atribuído a um só componente (BRASIL, 2003).
3.9.2 Linearidade
A Linearidade de um método analítico demonstra a capacidade de obter
resultados que são diretamente proporcionais às concentrações do analito dentro de
uma dada faixa. Linearidade é usualmente expressa em termos da variância em
torno da inclinação da reta da linha de regressão linear, calculada de acordo com
uma relação matemática estabelecida (método dos mínimos quadrados) a partir de
resultados obtidos na análise de amostras com diferentes concentrações do princípio
ativo.
Se houver relação linear aparente após exame visual do gráfico, os resultados
dos testes deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para
determinação do coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente
angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão
relativo. Se não houver relação linear, realizar transformação matemática, como a
logarítmica, quadrática, etc.
A linearidade pode ser determinada pela análise de, no mínimo, 5
concentrações diferentes. As concentrações devem seguir intervalos de acordo com
o ensaio utilizado. Para a determinação de impurezas, deve-se partir do nível de
impureza esperado até 120% do limite máximo especificado. Quando apresentarem
importância toxicológica ou efeitos farmacológicos inesperados, os limites de
quantificação e detecção devem ser adequados às quantidades de impurezas a
serem controladas (BRASIL, 2003; ICH, 1995).
40
3.9.3 Exatidão
A exatidão de um método analítico, expressa o grau de concordância entre o
valor médio obtido de uma série de resultados e o valor de referência aceito (valor
exato convencional). Também chamado de grau de recuperação (recovery).
Resultado exato é o resultado ideal sem erro sistemático (BRASIL, 2003; ICH, 1995).
A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da
linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a
partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do
procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três)
réplicas cada.
A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada
experimentalmente e a concentração teórica correspondente, conforme a equação 1:
A exatidão pode ser avaliada para o fármaco, forma farmacêutica e impurezas
seguindo os critérios a seguir (BRASIL, 2003):
3.9.3.1 Fármaco
- Aplicando-se a metodologia analítica proposta na análise de uma substância de
pureza conhecida (padrão de referência);
- Comparação dos resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda
metodologia bem caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida.
41
3.9.3.2 Forma Farmacêutica
- Na análise de uma amostra, na qual quantidade conhecida de fármaco foi
adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo
contaminado);
- Nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento estão
indisponíveis, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual
adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao
medicamento.
3.9.3.3 Impurezas
- Análise pelo método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades
conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação ao medicamento ou ao
fármaco;
- No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos
de degradação, aceita-se a comparação dos resultados obtidos com um segundo
método bem caracterizado (metodologia farmacopéica ou outro procedimento
analítico validado).
3.9.4 Precisão
A precisão de um método analítico expressa o grau de concordância (ou grau
de dispersão) entre resultados obtidos, de uma série de medidas de uma
amostragem múltipla de uma mesma amostra sob condições experimentais pré-
estabelecidas. Este parâmetro depende somente da distribuição de erros aleatórios e
não está relacionado com exatidão (BRASIL, 2003).
A precisão de um método analítico pode ser expressa como o desvio padrão
(DP) ou desvio padrão relativo (DPR) de uma série de medidas, conforme equação
2:
42
Onde: DP = Desvio padrão;
CMD = Concentração média determinada.
De acordo com PAGANO et al (2004), a avaliação estatística da precisão
(n=6) pode ser realizada calculando o coeficiente de variação ou desvio padrão
relativo (DPR) em porcentagem, conforme equação 2, e a avaliação entre os grupos
(n=12) pode ser realizado além do cálculo do DPR (%), é recomendado realizar a
comparação das variâncias empregando o teste F e a comparação das médias
obtidas através do teste t, descritos nas equações 4,5 e 6 respectivamente.
Onde: Cv = Coeficiente de Variação
S = Desvio Padrão amostral (n-1)
= Média das amostras (n).
Onde: SB = maior desvio padrão amostral (n-1)
Sw = menor desvio padrão amostral (n-1)
O valor de F obtido deve ser comparado ao tabelado sendo aceito se F
calculado for menor ou igual ao F tabelado.
43
3.9.4.1 Repetitividade (Precisão Intradia)
É a concordância entre resultados obtidos de medidas independentes - 6
determinações, considerando a concentração média correspondente a 100% do
esperado do mesmo analito ou 3 concentrações (baixa, média e alta), realizado sob
condições de Repetitividade, que são:
- Mesmo analista (mão de obra);
- Mesmo instrumento de medida (equipamento);
- Mesmo local e mesmas condições de uso (laboratório);
- Repetições em curto período de tempo;
3.9.4.2 Precisão Intermediária (Precisão Interdia)
É a concordância entre resultados obtidos por:
- Analistas diferentes (mão de obra);
- E/ ou equipamento de medida diferente;
- Mesmo local e mesmas condições de uso (laboratório);
- Repetições no mínimo de 2 dias diferentes.
44
3.9.4.3 Reprodutibiblidade
É a concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como
em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia
analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias.
3.9.5 Limite de Quantificação
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada
com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
O limite de quantificação é um parâmetro determinado, principalmente, para
ensaios quantitativos de impurezas, produtos de degradação em fármacos e
produtos de degradação em formas farmacêuticas e é expresso como concentração
do analito (por exemplo, porcentagem em massa, porcentagem em volume, partes
por milhão) na amostra. Deve-se preparar soluções contendo concentrações
decrescentes do fármaco até o menor nível determinável com precisão e exatidão
aceitáveis. Pode ser determinado por meio do ruído da linha de base e considera-se
como limite de quantificação aquela concentração que produza relação sinal-ruído
superior a 1:10 (BRASIL, 2003).
3.9.6 Robustez
Robustez de um método analítico demonstra a capacidade do mesmo não
ser afetado por pequenas, mas deliberadas variações nos parâmetros analíticos, e
demonstrando assim, uma indicação de segurança do método durante o seu uso.
Para robustez, considerar a avaliação do parâmetro e constatar a
susceptibilidade do método nas variações analíticas, como:
- Variação do pH da fase móvel ;
- Variação na composição da fase móvel
- Diferentes lotes ou fabricantes de colunas;
- Temperatura do forno da coluna;
45
- Vazão da fase móvel
Tabela 2 – Parâmetros e critérios de aceitação estudados na validação
(BRASIL, 2003)
Parâmetros Critérios de aceitação
Especificidade / Seletividade
Nenhum pico deve eluir no tempo de retenção do
composto em estudo. O picodo composto deverá
ter elevada pureza.
Linearidade Coeficiente de correlação maior que 0,99 para a
curva analítica
Precisão O DPR das seis determinações no mesmo dia
deverá ser menor que 5,0%
Exatidão
A recuperação deverá estar entre 98,0% a
102,0% para cada concentração avaliada (3
níveis)
Robustez
Aceitação dos parâmetros cromatográficos para
as alterações e avaliação do teor entre as
condições alteradas e a controle
46
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Matérias-primas
Foram empregadas as seguintes matérias-primas, de grau farmacêutico de
pureza, nos estudos de pré-formulação e nas formulações de comprimidos:
- Clonazepam - USP, lote G1B175.
- Composto Relacionado A (CR A) [ 3-Amino-4-(2-chlorophenyl)-6-nitrocarbostyril] –
USP, lote R008P0.
- Composto Relacionado B (CR B) (2-Amino-2'-chloro-5-nitrobenzophenone) – lote
I0G326
- O Clonazepam 2mg – comprimido, foi obtido da Medley, lote L163297.
- Amido;
- Celulose microcristalina;
- Croscarmelose sódica;
- Estearato de magnésio;
- Lactose.
Todos os excipientes utilizados foram gentilmente doados pela Farmácia
Magisfarma localizada em Barão Geraldo/Campinas.
4.1.2 Reagentes
Os solventes usados na preparação da fase móvel e solubilização do
clonazepam foram: acetonitrila, marca J.T.Baker e água ultrapurificada.
Durante todos os teste utilizou-se também Hidróxido de Sódio 0,1N, Ácido
Clorídrico 0,1N, Peróxido de Hidrogênio 3%, todos da marca Merck.
47
4.1.3 Consumíveis
Nos experimentos de desenvolvimento do método de separação foram
utilizadas colunas cromatográficas C8 250mm x 4,6mm - 5µm das marcas Perkin
Elmer, Phenomenex – Luna C8 150mm x 4,6mm – 5µm.
4.1.4 Aparelhagem experimental
Os experimentos cromatográficos foram realizados utilizando dois sistemas de
cromatografia líquida de alta eficiência, sistema Waters e Merck.
Foram utilizados os equipamentos:
- Ultrassom, marca Unique;
- Agitador,marca Technal;
- Balança Analítica, marca Mettler Toledo;
- Câmara Climática, marca Etica Nova.
4.2 Métodos
4.2.1 Estudo de interação fármaco + excipiente
O estudo das possíveis incompatibilidades entre fármaco e adjuvantes
tecnológicos foi feito através das análises em DSC, TG. Com o objetivo de verificar
possíveis interações do clonazepam com os adjuvantes selecionados, foram
preparadas misturas binárias para serem submetidas à calorimetria exploratória
diferencial e termogravimetria, utilizando o Clonazepam e os seguintes adjuvantes na
proporção ponderal de 1:1 (MURA e col., 1995): amido; celulose microcristalina;
croscarmelose sódica; estearato de magnésio; lactose.
Na preparação das misturas binárias, foi pesada a massa individual de cada
componente, sendo as mesmas adicionadas separadamente para uma cápsula de
porcelana e trituradas com o fármaco por 2 minutos.
48
Tabela 3 – Misturas Binárias
Mistura Componentes
1 Clonazepam + Lactose
2 Clonazepam + Celulose Microcristalina
3 Clonazepam + Amido
4 Clonazepam + Croscarmelose Sódica
5 Clonazepam + Estearato de Magnésio
Após, foram transferidos para um tubo de ensaio, e levados à um agitador
durante 1 hora.
4.2.2 Infravermelho
A amostra foi analisada em um equipamento infravermelho, marca Agilent
Cary 6300 FT-IR, utilizando módulo de reflectância difusa para a obtenção do
espectro.
Os espectros de absorção foram gerados na região de 4000 a 400 cm-1 , no
total foram 32 espectros.
4.2.3 Termogravimetria
A amostra foi analisada em um equipamento de TG, marca Mettler Toledo,
com Software STARe SW, versão 10.0 e DSC marca Shimadzu, modelo DSC-60.
Para esse teste, os excipientes foram analisados isoladamente e em
combinação com o fármaco. Antes de cada ensaio termogravimétrico foi realizado
um branco com o cadinho da amostra vazio para a condição avaliada.
Condição para o TG:
Faixa de temperatura: 25 a 300 ºC
Gás: N2 a 100 mL/min
Razão de aquecimento: 10°C.min-1
Cadinho: platina
49
4.2.3.1 Calorimetria exploratória diferencial
Quantidade suficiente de Clonazepam foi pesada em cadinho de alumina,
posteriormente tampado. Além do Clonazepam, as outras matérias-primas e
misturas binárias foram submetidas ao teste.
Condição para o DSC:
Faixa de temperatura: 25 a 300 ºC
Gás: N2a 100 mL/min
Razão de aquecimento: 10°C.min-1
Cadinho: alumina
4.2.4 Desenvolvimento do método cromatográfico
A sequência experimental adotada para desenvolver a metodologia de análise
foi realizada de acordo com as seguintes etapas:
A) Avaliação do clonazepam - Estudo da matéria-prima e produto acabado
B) Desenvolvimento do método cromatográfico: Nesta etapa foi otimizada a
determinação de clonazepam em cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso,
foram avaliados a composição da fase móvel, o modo e velocidade de eluição
(isocrático ou gradiente e vazão), tipo de coluna cromatográfica e respectiva
temperatura do forno, visando obter as condições cromatográficas apropriadas.
C) Validação do método: Nesta etapa, o método desenvolvido foi validado conforme
requisitos da Resolução 899/03 da Anvisa, avaliando-se os seguintes parâmetros de
desempenho: especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação
e robustez.
4.2.4.1 Preparo das Soluções
Todas as soluções foram preparadas utilizando como diluente a própria fase
móvel.
Foram preparadas soluções padrão de Clonazepam, Composto Relacionado
A, Composto Relacionado B à diversas concentrações, iniciando com a
concentração 0,1mg/mL.
50
Realizou-se amostra simulada de excipientes, conforme descrito na tabela 4
abaixo.
Tabela 4 – Formulação da amostra simulada
Componentes Quantidade (mg)
Clonazepam 2,00
Lactose 121,50
Celulose microcristalina 18,70
Amido 20,40
Croscarmelose Sódica 5,70
Estearato de Magnésio 1,70
As soluções foram injetadas no cromatógrafo conforme as condições
cromatográficas abaixo.
4.2.4.2 Condições Cromatográficas
Os experimentos em CLAE se iniciaram com base na Farmacopéia
Americana, cuja fase móvel é constituída de uma mistura de tampão
fosfato/metanol/tetraidrofurano na proporção de 600:520:130 v/v/v.
Devido à alta quantidade de tampão, foi desenvolvida nova fase móvel,
constituída de acetonitrila/água na proporção 600:400 v/v.
Foram avaliadas as proporções entre os constituintes da fase móvel, volume
de injeção, vazão da fase móvel e temperatura de análise da coluna.
As condições de análise testadas foram:
- Volumes de injeção: 5µL à 50µL
- Temperaturas da coluna: 25ºC à 40ºC
- Vazões da FM: 0,8 mL/min à 1,5mL/min
- Modos de eluição: isocrático e gradiente
- Comprimento de onda: 254nm
- Colunas analítica: C8 – 125 x 4,6mm - 5µm / C8 - 150 x 4,6mm - 5µm / C8 –
250 x 4,6mm - 5µm
A coluna foi previamente estabilizada com a fase móvel durante 30 minutos
nas respectivas condições pré-estabelecidas.
Antes do início de cada análise, injetou-se uma solução contendo CLZ, CR A,
51
CR B a fim de observar os seguintes parâmetros: N (número de pratos teóricos) ≥
2000; T (assimetria) entre 0,8 - 1,2; R (resolução) ≥ 2 e o coeficiente de variação
entre as injeções ≤ 2 %, a fim de constatar a adequabilidade do sistema.
4.2.5 Validação do Método
A próxima etapa iniciou-se com a validação da metodologia desenvolvida. O
objetivo da validação consistiu em demonstrar que o método analítico desenvolvido é
adequado para o seu propósito e garantir, por meio de estudos experimentais, que
ele atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados.
Para tanto, executou-se os parâmetros de linearidade, especificidade/
seletividade, precisão, exatidão, limite de quantificação e robustez adequados à
análise.
Figura 2 - Fluxograma de validação de métodos analíticos
4.2.5.1 Elaboração do protocolo
O primeiro passo foi elaborar o protocolo de validação. O mesmo teve como
objetivo descrever os procedimentos a serem utilizados para validar o método
analítico, incluindo o cronograma, responsabilidades e os critérios de aceitação para
a aprovação de um método analítico ou parte destes para uso na rotina.
No protocolo foram incluidas as seguintes informações:
- Objetivos do estudo;
- Local/planta onde será conduzido o estudo;
- Responsabilidades;
- Descrição dos procedimentos a serem seguidos;
- Equipamentos a serem usados, padrões e critérios para produtos e processos
Programa de Validação Levantamento da documentação Método
Reagentes/Padrões Protocolo Análise Relatório Método
Validado
52
relevantes;
- Processos e/ou parâmetros;
- Critérios de aceitação.
4.2.5.2 Seletividade/Especificidade
A seletividade e especificidade do método foi estudada com diferentes
registros analíticos obtidos de padrão, amostra e placebo. Essas soluções foram
preparados de modo que a solução final tivesse a concentração de 0,1µg/mL
Injetou-se separadamente cada solução para determinar se havia
interferência de componentes que poderiam estar presentes na matriz da amostra e
demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses materiais.
4.2.5.2.1 Degradação Forçada
A especificidade do método foi verificada também a partir da avaliação dos
possíveis produtos de degradação que poderiam interferir na determinação de CLZ.
Preparou-se uma solução padrão, solução amostra contendo respectivamente
0,1mg/mL de CLZ, 0,1µg/mL de CR A e CR B. Além disso, preparou-se uma
solução placebo e diluente.
A solução da amostra simulada dos excipientes foi preparada da mesma
maneira que a solução obtida com a formulação do CLZ, pesando-se, entretanto,
quantidade da mistura dos excipientes equivalente à massa dos comprimidos que
conteria 2mg de CLZ.
As injeções foram realizadas após exposição da amostra, padrão, placebo e
diluente nas seguintes condições:
Após exposição à luz UV por 24 e 48 horas;
Após a exposição à temperatura de 60 ºC por 24 e 48 horas sob pressão em
banho-maria;
Após hidrólise ácida com HCl 0,1N por 24 e 48 horas;
Após hidrólise básica com NaOH 0,1N por 24 e 48 horas;
Após oxidação com peróxido de hidrogênio 3% por 24 e 48;
53
4.2.5.3 Linearidade
Executou-se a linearidade do método analítico para o Clonazepam, CR A e
CR B, a fim de demonstrar a capacidade de obter resultados que são diretamente
proporcionais às concentrações do analito dentro de uma dada faixa.
- Soluções estoque
Foram preparadas soluções mais concentradas de Clonazepam, CR A e CR B
(1,0mg/mL, 0,1mg/mL e 0,1mg/mL respectivamente). Pesou-se 10,00mg do padrão
de cada ativo, adicionou-se um pouco de diluente e colocou-se as soluções em
ultrassom até total solubilização. Após, completou-se o volume com o diluente.
- Soluções intermediárias
Foram preparadas por diluições sucessivas partindo da solução estoque
preparada previamente.
As concentrações das soluções intermediárias usadas estão descritas
conforme tabela 5. Essas soluções foram empregadas para preparo da curva
analítica (curva de calibração). Cada nível de concentração foi injetado em triplicata
no cromatógrafo.
Tabela 5 – Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de
Linearidade
Concentração
Volume da
solução
estoque de
Clonazepam
(mL)
Volume da
solução estoque
de Composto
Relacionado A
(mL)
Volume da
solução estoque
de Composto
Relacionado B
(mL)
Balão
(mL)
Concentração Teórica (mg/mL)
Clonazepam
Composto
Relacionado
A
Composto
Relacionado
B
120% 6 0,06 0,06 50 0,12 0,00012 0,00012
110% 5,5 0,055 0,055 50 0,11 0,00011 0,00011
100% 5 0,05 0,05 50 0,10 0,00010 0,00010
90% 4,5 0,045 0,045 50 0,09 0,00009 0,00009
80% 4 0,04 0,04 50 0,08 0,00008 0,00008
40% 2 0,02 0,02 50 0,04 0,00004 0,00004
20% 1 0,01 0,01 50 0,02 0,00002 0,00002
O estudo de regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados, foi
empregado para determinação da equação da reta.
54
4.2.5.4 Exatidão
A exatidão foi determinada através do teste de recuperação, sendo expressa
como percentual de recuperação, analisando-se nove soluções contendo CLZ, CR A,
CR B (baixa, média, alta).
- Soluções estoque
Foram preparadas três soluções mais concentradas de cada composto,
Clonazepam, CR A e CR B (1,0mg/mL, 0,1mg/mL e 0,1mg/mL respectivamente).
Pesou-se 10,00mg do padrão de cada ativo, adicionou-se um pouco de diluente ao
balão de 10mL e levou as soluções em ultrassom até total solubilização. Após,
completou-se o volume com o diluente.
- Soluções intermediárias
Foram preparadas por diluições sucessivas partindo das soluções estoque
preparadas previamente conforme tabela abaixo. Cada solução foi injetada em
triplicata.
Tabela 6 - Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de Exatidão
Concentração
Volume da
solução
estoque de
Clonazepam
(mL)
Volume da
solução
estoque de
Composto
Relacionado A
(mL)
Volume da
solução
estoque de
Composto
Relacionado B
(mL)
Balão
(mL)
Concentração Teórica (mg/mL)
Clonazepam
Composto
Relacionado
A
Composto
Relacionado
B
120% 6 0,06 0,06 50 0,12 0,00012 0,00012
100% 5 0,05 0,05 50 0,10 0,00010 0,00010
20% 1 0,01 0,01 50 0,02 0,00002 0,00002
4.2.5.5 Precisão
A precisão foi realizada a partir de seis determinações de Clonazepam em um
mesmo dia e sob as mesmas condições, em uma concentração igual à concentração
de 100% das impurezas.
- Solução padrão Clonazepam
Pesou-se 10,00mg de padrão de Clonazepam e transferiu-se para um balão
de 100,0mL. Adicionou-se aproximadamente 5,0mL de diluente e levou-se ao
55
ultrassom até a completa dissolução. Completou-se o volume com diluente (Cf =
0,1mg/mL).
- Solução amostra estoque Clonazepam
Pesou-se 85,00 mg de amostra de Clonazepam e transferiu-se para um balão
de 10,0mL. Adicionou aproximadamente 5,0mL de diluente e levou-se ao ultrassom
até a completa dissolução. Completou-se o volume com diluente. (Cf = 0,1mg/mL)
- Solução amostra 100%
As soluções foram injetadas uma vez cada preparação, com exceção do
padrão que injetou-se 6 vezes. As áreas dos picos foram determinadas e então
calculou-se o desvio padrão relativo (DPR) entre as áreas obtidas. A precisão
intermediária foi preparada da mesma forma, porém por outro analista e em dias
diferentes.
4.2.5.6 Limite de Quantificação
O LQ foi determinado a partir de diluições sucessivas de uma solução padrão
de CLZ de concentração 0,1mg/mL até a obtenção do menor nível determinável,
através do desvio padrão relativo das injeções. Injetou-se 6 vezes a Solução 20% da
Linearidade.
4.2.5.7 Robustez
Para avaliação da robustez do método, as soluções padrão e amostra foram
preparadas na concentração de 0,1mg/mL e submetidas a pequenas variações,
como:
- Variação da coluna (outro lote, fabricante, coluna similar)
- Vazão da fase móvel - Variação de ± 0,1mL/min;
- Temperatura da forno da coluna - Variação de ± 2°C
- Composição da fase móvel - Variação de ± 2%
- Estabilidade das soluções – As soluções foram avaliadas por 5 dias, armazenadas
a temperatura ambiente.
56
Foram injetadas as soluções nas condições normais e respectivas alterações
realizadas.
4.2.5.8 Estudo de estabilidade
Realizou-se o preparo da amostra simulada de excipientes, conforme descrito
na tabela 4. As amostras foram armazenadas em câmaras climáticas, sob as
seguintes condições de temperatura e umidade: 40ºC ± 2ºC / 75% ± 5% UR e 30ºC ±
2º C/75% ± 5% UR por 30, 60 e 90 dias.
Avaliou-se as soluções preparadas conforme descrito no item 2.2.5.4. As
soluções foram injetadas no cromatógrafo para a observação da possível redução ou
aumento no teor do fármaco e/ou formação de produtos de degradação.
57
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Infravermelho
Os espectros do Clonazepam no infravermelho foram apresentados na Figura
3. Os picos observados estão de acordo com a estrutura química do Clonazepam,
com a identificação dos principais grupos funcionais na Tabela 7 (SILVERTEIN,
2005).
Tabela 7 – Absorção dos principais grupos funcionais para o Clonazepam
Faixa de absorção cm-1
Grupo Funcional
Patente Observadas
1700 1693 Deformação C = O, amida
1614 1614 Deformação C=N
1550 1538 Deformação C=C, aromático
1500 1490 Deformação C=C, aromático
1450 1445 Deformação C=C, aromático
1338 1333 Deformação N-O2
750 752 Deformação anel aromático
Figura 3 – Espectro de Infravermelho do Clonazepam
Na figura 4 é apresentado o espectro do amido, onde são observadas as
bandas em 3294 cm-1 deformação da ligação O-H; 2924 cm-1estiramento da ligação
C-H; 1151 cm-1estiramento da ligação C-O-C, 1080 cm-1, deformação angular de C-
OH. Os dados obtidos estão de acordo com o esperado para identificação do amido,
58
conforme grupos funcionais encontrados (LILTORPA, 2011)
Figura 4 – Espectro de Infravermelho do Amido
No espectro obtido da mistura binária entre a Clonazepam e amido, figura 5,
são observadas as principais bandas de identificação da Clonazepam,1693cm-1,
1614cm-1, 1538cm-1, 1490cm-1, 1445 cm-1,1335cm-1 e 752cm-1. As bandas do amido
estão sobrepostas às bandas do clonazepam, mas é possível observar um
alargamento das bandas próximas à 3200 cm-1da deformação da ligação O-H. Os
dados obtidos por FTIR para mistura Clonazepam com amido não são indicativos de
incompatibilidade.
Figura 5 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Amido
59
Na figura 6 é apresentado o espectro do estearato de magnésio, onde são
observadas as bandas em 2916 e 2851 cm-1 deformação axial da ligação O-H e C-H,
1573 cm-1 deformação axial assimétrica do íon carboxilato; 1460 cm-1 deformação
angular da ligação C-H;1111 cm-1 deformação axial da ligação C-O de éster, 724 cm-
1 deformação angular assimétrica de CH2.
Figura 6 – Espectro de Infravermelho do Estearato de magnésio
No espectro obtido da mistura binária entre a Clonazepam e estearato de
magnésio, figura 7, são observadas as principais bandas de identificação da
Clonazepam, 1693 cm-1, 1614 cm-1, 1542 cm-1, 1491 cm-1, 1434 cm-1, 1337 cm-1 e
724 cm-1. Também são observadas as bandas do estearato de magnésio em 2918
cm-1 e 2851 cm-1,1573 cm-1, 1462 cm-1, C-H; 1102 cm-1, indicando que não há
incompatibilidade entre esses insumos estudados conforme (CHADHA, 2014).
Figura 7 – Espectro de Infravermelho da mistura de CLZ e Estearato de
magnésio
60
Na figura 8 é apresentado o espectro da celulose microcristalina, onde são
observadas as bandas em 3332 cm-1 deformação axial da ligação O-H; 2896 cm-1,
deformação axial da ligação C-H; 1428 cm-1 deformação angular da ligação O-H de
álcoois, 1162 cm-1 deformação axial da ligação C- O de álcoois primários, 899 cm-1
deformação angular de C-H.
Figura 8 – Espectro de Infravermelho da Celulose microcristalina
No espectro obtido da mistura binária entre a Clonazepam e celulose
microcristalina, figura 9, são observados as principais bandas de identificação da
Clonazepam, 1693 cm-1, 1614 cm-1, 1538 cm-1, 1490 cm-1, 1434 cm-1e 1335 cm-1. As
bandas que identificam a celulose estão em regiões de sobreposição com as bandas
do clonazepam, não sendo possível avalia-las individualmente. Os dados obtidos por
FTIR para mistura Clonazepam de sódio com a celulose não são indicativos de
incompatibilidade.
61
Figura 9 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e
Celulose microcristalina
O espectro de FTIR obtido da amostra lactose monohidratada, Figura 10,
apresenta banda fraca em 1657 cm-1 e 1169 cm-1, que correspondem
respectivamente, à deformação angular dos grupos OH da água, e ao estiramento
assimétrico da ligação C-O-C.Além disso, apresentou bandas características entre
3522 cm-1 e 3250 cm-1, correspondentes ao estiramento axial do grupo hidroxila,
sendo que em 3522 cm-1 é visível uma acentuada banda característica da forma
monohidratada (FIGUEIREDO, 2012; RAUT, et al., 2011). É possível observar
também a banda de deformação axial simétrica de C-O-C em 1020 cm-1.
Figura 10 – Espectro de Infravermelho da Lactose monohidratada
62
No espectro da mistura de CLZ com a lactose monohidratada, Figura 11, são
observadas as bandas de identificação do Clonazepam em 1693 cm-1, 1614 cm-1,
1538 cm-1, 1490 cm-1, 1434 cm-1 e 1335 cm-1. As bandas que identificam a lactose
estão em regiões de sobreposição com as bandas do CLZ, não sendo possível
avaliá-las individualmente. Os dados obtidos por FTIR para mistura CLZ com a
lactose não são indicativos de incompatibilidade.
Figura 11 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e
Lactose monohidratada
Na figura 12 é apresentado o espectro de IV da mistura de excipientes é
possível observar algumas bandas de excipientes, 3332 cm-1 banda da lactose, 2918
cm-1, 2851cm-1e 1579 cm-1 proveniente do estearato de magnésio, 1020 cm-1 banda
da celulose. Para os demais excipientes ocorre a sobreposição de bandas não
sendo possível identificá-los com precisão.
Figura 12 – Espectro de Infravermelho da mistura de excipientes
63
No espectro da mistura entre Clonazepam e todos os excipientes, figura 13,
são observadas algumas das principais bandas de identificação da Clonazepam
1691 cm-1, 1616 cm-1, 1542 cm-1, 1491 cm-1, 1434 cm-1 e 1337 cm-1. É possível
também observar algumas bandas de excipientes, 2918 cm-1, 2851 cm-1 proveniente
do estearato de magnésio.
Figura 13 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e excipientes
As principais bandas de Clonazepam e bandas provenientes dos excipientes
são visualizadas com mínimos deslocamentos em comparação com os espectros
individuais. Os dados obtidos por espectroscopia de Infravermelho mostram que os
excipientes apresentam compatibilidade com Clonazepam nas condições testadas, já
que a similaridade das bandas estavam de acordo com a literatura e não houve
formação de outras bandas no espectro.
5.2 Calorimetria Exploratória Diferencial e Termogravimetria
5.2.1 Clonazepam e Amido
5.2.1.1 DSC Clonazepam e Amido
O CLZ apresenta apenas um evento endotérmico, relacionados à fusão, com
faixas de temperatura de Tonset = 237,38°C e Tpeak = 237,36°C, figura 14, seguida
da decomposição conforme evento exotérmico próximo a 300 °C.
64
Figura 14 – Curva de DSC do Clonazepam
A curva de DSC do Amido apresenta faixa da temperatura ambiente à 63 °C
um evento endotérmico devido à perda de água, figura 15.
Figura 15- Curva de DSC do Amido
A curva de DSC para mistura de Clonazepam e amido, figura 16, apresenta
eventos similares aos observados na curva de DSC para o CLZ e amido (USP,
2009).
65
Figura 16 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Amido
Na Figura 17 é apresentado um comparativo entre as curvas individuais e a
mistura, onde a similaridade das curvas pode ser observada.
Figura 17 – Curva de DSC comparativa de Clonazepam e Amido
Na tabela 8 é apresentado um resumos dos dados obtidos para as curvas
individuais e mistura. Observa-se na curva da mistura que as entalpias para a perda
de umidade do amido e fusão do clonazepam são proporcionais à curvas individuais.
Os dados indicam que o amido e o clonazepam são compatíveis, nas condições
avaliadas (TOMASSETTIA, 2005).
66
Tabela 8 – Discussão de resultados para o ensaio de DSC para Clonazepam e
Amido
Amostra Temperatura (ºC)
(On set – Peak) Entalpia (J/g) Evento
Clonazepam 237,38 – 238,36 - 113,01 Fusão
Amido 22,8 – 63,29 - 286,43 Perda de água
Clonazepam
+
Amido
24,6 – 55,83 - 110,63 Perda de água
237,49 – 238,96 - 53,51 Fusão
5.2.1.2 TG Clonazepam e Amido
A curva de TG e DTG do Clonazepam, figura 18A (a), apresenta apenas um
evento na faixa de 272,8°C a 324.54°C devido a decomposição com ponto médio em
292,37°C. A curva de TG e DTG para o amido apresenta dois eventos de perda de
massa o primeiro na faixa de 35,5 °C a 96,38°C referente à perda de água de
adsorção, 9,4%. A segunda perda de massa corresponde à degradação do amido,
na faixa de 294,5°C a 322,5°C, com ponto médio em 305,47ºC, com perda de massa
de 82,6%. A literatura descreve (SHIN et al., 2008) valores de perda de massa de
80% a 82% devido a decomposição.
A curva TG para a mistura de Clonazepam e amido, figura 18B (c), apresenta
o perfil de perda em faixas de temperaturas de acordo com as curvas individuais.
Perda de massa de 5,6% na faixa de 28,9 a 85,11°C, devido referente à perda de
água de adsorção, esse valor considerando a mistura binária de 1:1 está próxima ao
valor obtido para curva individual do amido. Para a perda de massa na faixa maior de
temperatura observa-se uma sobreposição de eventos do Clonazepam e amido,
entretanto, similares aos eventos isolados com perda de massa proporcionais.
67
(a)
Figura 18A - Curva de TG e DTG para Clonazepam
(b)
(c)
Step -19,0699 %-1,9037 mg
Residue 70,0223 %6,9902 mg
Onset 272,83 °CEndset 324,54 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN, 9,9828 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
70
75
80
85
90
95
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 288,98 °CPeak Value -38,55e-03 mg°C^-1Peak 292,37 °C
1/°C
-0,0040
-0,0035
-0,0030
-0,0025
-0,0020
-0,0015
-0,0010
-0,0005
0,0000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N 01. 06. 2015 15: 14: 16
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
? Step -82,6116 %-8,2694 mg
Residue 17,2534 %1,7271 mg
Step -63,3824 %-6,3446 mg
Residue 19,3372 %1,9357 mg
Onset 294,55 °CEndset 322,55 °C
? Step -9,4027 %-0,9412 mg
Residue 89,5748 %8,9664 mg
Onset 35,53 °CEndset 96,38 °C
Sample: 209_15_AMIDO, 10,0100 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 305,67 °CPeak Value -0,19 mg°C^-1Peak 305,47 °C
1/°C
-0,020
-0,018
-0,016
-0,014
-0,012
-0,010
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
-0,000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ A M I DO 01. 06. 2015 15: 19: 59
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
? Step -50,6270 %-5,3766 mg
Residue 49,2728 %5,2328 mg
Step -32,2750 %-3,4276 mg
Residue 49,3703 %5,2431 mg
Onset 283,82 °CEndset 300,21 °C
? Step -5,6660 %-0,6017 mg
Residue 94,1077 %9,9942 mg
Onset 28,87 °CEndset 85,11 °C
Sample: 209_15_clonazepam_amido, 10,6200 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
50
60
70
80
90
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 289,95 °CPeak Value -0,17 mg°C^-1Peak 292,00 °C
1/°C
-0,016
-0,014
-0,012
-0,010
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0,000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ c lonaz epam _ am ido 01. 06. 2015 15: 27: 29
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
68
(d)
Figura 18B - Curva de TG e DTG do Amido (b), mistura de Clonazepam
com Amido (c) e comparativo (d)
5.2.2 Clonazepam e Estearato de magnésio
5.2.2.1 DSC Clonazepam e Estearato de magnésio
A curva DSC do estearato de magnésio, figura 19, apresentou dois eventos
endotérmicos principais nas temperaturas (peak) de 105,82ºC e 128,90ºC,
caracterizando a desidratação do mesmo. Um evento foi observado na curva de TG
com uma perda de massa de 2,47% para temperatura máxima de 108,44ºC.
Há uma extensa faixa de fusão aceita para o estearato de magnésio, podendo
variar para as amostras comerciais de 117°C a 150°C e para as amostras com
elevada pureza de 126°C a 130°C (ROWE et. al., 2009; FIGUEIREDO 2012). Após
isso, há o início da decomposição térmica do excipiente, que de acordo com as
curvas TG/DTG ocorre em duas etapas – a primeira, apresenta uma curva mais
acentuada em Tmáx = 360°C, e a segunda, ocorre em Tmáx = 460°C.
100 200 300 400 500
20
40
60
80
100
% M
assa
Temperatura (C)
Clonazepam
Amido
Clonaz-amido
69
Figura 19 – Curva de DSC do Estearato de magnésio
A curva de DSC para a mistura binária de Clonazepam com o estearato de
magnésio, figura 20, mostra um pequeno deslocamento do pico de fusão
característico do Clonazepam, entretanto, isto não caracteriza uma
incompatibilidade, uma vez que o pico continua dentro da faixa de fusão do CLZ.
Uma possível explicação pode ser devido à fusão do estearato de magnésio que
possibilita a solubilização de uma parte do clonazepam, tendo impacto também na
energia de fusão do mesmo. Os eventos térmicos individuais são visualizados na
curva da mistura conforme os eventos individuais.
Figura 20 – Curva de DSC da mistura de CLZ e Estearato de magnésio
70
Na Figura 21 é apresentado um comparativo entre as curvas individuais e a
mistura de CLZ e Estearato de magnésio, onde a similaridade das curvas pode ser
observada.
Figura 21 – Curva de DSC Comparativa de CLZ e Estearato de magnésio
Tabela 9 – Discussão de resultados para o ensaio de DSC para Clonazepam e
Estearato de magnésio
Amostra Temperatura (ºC)
(On set – Peak) Entalpia (J/g) Evento
Clonazepam 237,38 – 238,36 - 113,01 Fusão
Estearato de
magnésio
88,77 - 105,82 -97,97 Perda de água
125,35 - 128,90 -42,12 Fusão
Clonazepam +
Estearato de
magnésio
85,55 – 97,97 -57,87 Perda de água
126,92 – 128,93 -25,05 Fusão
231,45 – 234,43 -21,42 Fusão (Clonazepam)
5.2.2.2 TG Clonazepam e Estearato de Magnésio
Na curva de TG para a mistura de Clonazepam com o estearato de magnésio,
figura 22, é possível observar os eventos de perda de massa individuais dos
insumos, perda de massa devido
71
à desidratação do estearato próximo a 100 °C, decomposição do clonazepam
próximo a 300°C e decomposição do estearato de magnésio próximo a 370°C.
As curvas de TG apresentam similaridade com as curvas individuais não
indicando incompatibilidade.
(a)
(b)
(c)
Step -19,0699 %-1,9037 mg
Residue 70,0223 %6,9902 mg
Onset 272,83 °CEndset 324,54 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN, 9,9828 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
70
75
80
85
90
95
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 288,98 °CPeak Value -38,55e-03 mg°C^-1Peak 292,37 °C
1/°C
-0,0040
-0,0035
-0,0030
-0,0025
-0,0020
-0,0015
-0,0010
-0,0005
0,0000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N 01. 06. 2015 15: 14: 16
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
Step -81,2513 %-7,2106 mg
Residue 7,0940 %0,6296 mg
Onset 343,09 °CStep -2,4752 %-0,2197 mg
Residue 95,9566 %8,5156 mg
Onset 99,71 °C
Sample: 209_15_ESTEARATO_Mg, 8,8744 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
0
20
40
60
80
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 346,73 °CPeak Value -0,21 mg°C^-1Peak 361,68 °C
Extrapol. Peak 90,99 °CPeak Value -11,67e-03 mg°C^-1Peak 108,44 °C
1/°C
-0,025
-0,020
-0,015
-0,010
-0,005
-0,000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ E S T E A RA T O _ M g 19. 05. 2015 12: 51: 20
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
Step -59,2316 %-5,7943 mg
Residue 40,6493 %3,9765 mg
Step -26,7428 %-2,6161 mg
Residue 41,0906 %4,0197 mg
Onset 353,82 °CEndset 415,85 °C
Step -8,6441 %-0,8456 mg
Residue 84,7618 %8,2918 mg
Onset 268,26 °CEndset 297,64 °CStep -1,3949 %
-0,1365 mgResidue 98,2892 %
9,6151 mgOnset 93,73 °CEndset 109,49 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN_ESTEARATO_Mg, 9,7824 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
40
50
60
70
80
90
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 371,97 °CPeak Value -41,19e-03 mg°C^-1Peak 376,32 °C
Extrapol. Peak 327,28 °CPeak Value -19,41e-03 mg°C^-1Peak 328,32 °C
Extrapol. Peak 282,99 °CPeak Value -26,76e-03 mg°C^-1Peak 287,76 °C
Extrapol. Peak 105,06 °CPeak Value -6,13e-03 mg°C^-1Peak 102,62 °C
1/°C
-0,0045
-0,0040
-0,0035
-0,0030
-0,0025
-0,0020
-0,0015
-0,0010
-0,0005
-0,0000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N_ E S T E A RA T O _ M g 01. 06. 2015 16: 34: 23
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
72
(d)
Figura 22 - Curva de TG e DTG do CLZ (a), Estearato de magnésio (b), mistura
de Clonazepam com Estearato de magnésio (c) e comparativo (d)
Tabela 10 - Dados dos ensaio de TG para Clonazepam , Estearato de magnésio
e mistura de Clonazepam com Estearato de magnésio.
Amostra Evento
Faixa de Temperatura (ºC)
Onset - Endset
% Perda
de Massa Evento PeakºC
Clonazepam 272,83 – 324,54 19,07 Decomposição 292,37
Estearato de
Magnésio
99,71 – 146,0 2,48 Desidratação 108,44
343,09 –440,0 22,89 Decomposição 361,68
449,08 – 492,046 0,51 Decomposição 468,51
Clonazepam
+
Estearato de
Magnésio
93,73 – 109,49 1,39 Desidratação 102,62
268,26 – 297,64 8,65 Decomposição 287,76
353,82 – 415,85 33,46 Decomposição 376,32
5.2.3 Clonazepam e Celulose microcristalina
5.2.3.1 DSC Clonazepam e Celulose microcristalina
Na avaliação da estabilidade térmica da celulose, normalmente se observa, a
100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
% M
assa
Temperatura (C)
Clonazepam
Estearato_mg
Clonazepam_Estearato_Mg
73
temperaturas relativamente baixas, perda de água superficial. Este evento pode ser
observado através das curvas de DSC para a amostra celulose microcristalina
mostrada na Figura 23, a qual apresenta um pico endotérmico largo que corresponde
à eliminação da água superficial destes excipientes.
Figura 23 – Curva de DSC da Celulose microcristalina
A curva DSC da mistura binária Clonazepam com a Celulose microcristalina,
Figura 24, apresenta uma similaridade em temperatura e entalpia do pico
endotérmico, referente à fusão da Clonazepam, sem deslocamento ou alargamento
de pico. É possível observar a concordância com eventos observados para as curvas
de DSC individuais, perda de água da celulose e fusão do Clonazepam, seguida da
decomposição, sem indícios de interação ou sinais de incompatibilidade.
74
Figura 24 – Curva de DSC da mistura de CLZ e Celulose microcristalina
Na Figura 25 é apresentado um comparativo entre as curvas individuais e a
mistura de clonazepam e Celulose microcristalina, onde a similaridade das curvas
pode ser observada.
Figura 25 – Curva de DSC Comparativa de Clonazepam e Celulose
microcristalina
75
Tabela 11 – Discussão de resultados para o ensaio de DSC para Clonazepam e
Celulose microcristalina.
Amostra Temperatura (ºC)
(On set – Peak) Entalpia (J/g) Evento
Clonazepam 237,38 – 238,36 - 113,01 Fusão
Celulose
Microcristalina 27,68 – 45,19 - 84,38 Perda de água
Clonazepam +
Celulose
microcristalina
31,09 – 57,84 -2,36 Perda de água
237,27 – 238,73 -53,48 Fusão (Clonazepam)
De acordo com Rowe (2015), a celulose apresenta estabilidade, apesar de ser
um material higroscópico, que deve ser armazenado em recipientes perfeitamente
fechados. A única incompatibilidade relatada é com agentes oxidantes.
5.2.3.2 TG Clonazepam e Celulose microcristalina
A partir da curva de TG/DTG, figura 26 e tabela 12, observa-se a perda para a
amostra de celulose microcristalina de 5,8% seguida da decomposição com tmáx
360 ºC, em uma única etapa, uma vez que foi verificado apenas um pico na curva de
Termogravimetria Derivada (DTG).
Tabela 12 - Dados dos ensaios de TG para Clonazepam, Celulose
microcristalina e mistura de Clonazepam com Celulose microcristalina.
Amostra
Evento
Faixa de Temperatura (ºC)
Onset – Endset
% Perda de
Massa Evento PeakºC
Clonazepam 272,83 – 324,54 19,07 Decomposição 292,37
Celulose
microcristalina
28,78 – 71,84 5,80 Desidratação 108,44
337,24 – 371,17 85,58 Decomposição 360,47
Clonazepam +
Celulose
microcristalina
37,7 – 96,02 1,81 Desidratação 52,21
291,42 – 322,31 48,96 Decomposição 287,76
76
(a)
(b)
(c)
Step -19,0699 %-1,9037 mg
Residue 70,0223 %6,9902 mg
Onset 272,83 °CEndset 324,54 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN, 9,9828 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
70
75
80
85
90
95
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 288,98 °CPeak Value -38,55e-03 mg°C^-1Peak 292,37 °C
1/°C
-0,0040
-0,0035
-0,0030
-0,0025
-0,0020
-0,0015
-0,0010
-0,0005
0,0000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N 01. 06. 2015 15: 14: 16
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
? Step -85,5863 %-8,8858 mg
Residue 14,3624 %1,4911 mg
Step -74,7678 %-7,7626 mg
Residue 16,6172 %1,7253 mg
Onset 337,24 °CEndset 371,17 °C
? Step -5,8024 %-0,6024 mg
Residue 93,8251 %9,7412 mg
Onset 28,47 °CEndset 71,84 °C
Sample: 209_15_CELULOSE_MICROCRISTALINA, 10,3823 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 364,54 °CPeak Value -0,21 mg°C^-1Peak 360,47 °C
1/°C
-0,020
-0,015
-0,010
-0,005
0,000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CE LULO S E _ M I CRO CRI S T A LI NA 01. 06. 2015 16: 42: 09
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
? Step -48,9653 %-4,9110 mg
Residue 51,0378 %5,1189 mg
Step -32,6617 %-3,2758 mg
Residue 58,0760 %5,8248 mg
Onset 291,42 °CEndset 322,31 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN_CELULOSE, 10,0296 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
50
60
70
80
90
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 300,04 °CPeak Value -96,77e-03 mg°C^-1Peak 308,66 °C
1/°C
-0,010
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
-0,000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N_ CE LULO S E 01. 06. 2015 16: 48: 08
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
77
(d)
Figura 26 - Curva de TG e DTG do Clonazepam (a), Celulose microcristalina (b),
mistura de Clonazepam com Celulose microcristalina (c), Comparativo (d)
Conforme se observa, as curvas termoanalíticas das misturas físicas
representam o somatório das substâncias isoladas evidenciando a ausência de
incompatibilidade entre a Clonazepam e a celulose microcristalina. Observa-se na
curva da mistura entre clonazepam e celulose uma perda de massa com faixa de
temperatura intermediária às curvas individuais, observando-se também a perda de
massa na faixa de 30 a 70°C devido à desidratação da celulose.
5.2.4 Clonazepam e Lactose monoidratada
5.2.4.1 DSC Clonazepam e Lactose monoidratada
A figura 27 apresenta a curva de DSC para a lactose monohidratada. O
primeiro pico endotérmico relaciona-se ao processo de desidratação deste excipiente
que ocorreu em (Tonset = 143,3 °C e Tpeak = 146,9 °C), também verificado nas
curvas TG/DTG, faixa de temperatura de 140 – 150 °C. Este evento causou uma
perda de massa (Δm1 = 4,53%) e permite confirmar que este excipiente se trata da
lactose monohidratada, a qual apresenta estequiometricamente 5% de água. A partir
do momento que ocorre a fusão Tonset = 211,6 °C; Tpeak = 215,8 °C; inicia-se o
processo de decomposição térmica do excipiente. Os resultados obtidos por DSC
são confirmados pelas curvas TG/DTG, e evidenciam a fusão do excipiente (Tpeak =
100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
% M
assa
Temperatura (C)
Clonazepam
Celulose
Clonazepam_Celulose
78
237,0 °C), seguida pela decomposição térmica.
Figura 27 – Curva de DSC da Lactose
A curva DSC da mistura binária Clonazepam com a Lactose, Figura 28,
apresenta uma similaridade em temperatura do pico endotérmico referente à fusão
da Clonazepam. É possível observar a concordância com eventos observados para
as curvas de DSC individuais, perda de água da Lactose e fusão da Clonazepam
seguida da decomposição, sem indícios de interação e incompatibilidade. Na curva
de DSC observa-se um pequeno deslocamento do pico de fusão característico do
Clonazepam, entretanto, isto não caracteriza uma incompatibilidade, uma vez que o
pico continua dentro da faixa de fusão da Clonazepam. Uma possível explicação
pode ser devido à fusão da lactose que possibilita a solubilização de uma parte do
clonazepam, tendo impacto também na energia de fusão do mesmo. Os eventos
térmicos individuais são visualizados na curva da mistura conforme os eventos
individuais.
79
Figura 28 – Curva de DSC para a mistura de Clonazepam e Lactose
Na Figura 29 é apresentado um comparativo entre as curvas individuais e a
mistura de clonazepam e lactose, onde a similaridade das curvas pode ser
observada.
Figura 29 – Curva de DSC comparativa para Clonazepam e Lactose
80
Tabela 13 – Discussão de resultados para o ensaio de DSC para Clonazepam e
Lactose
Amostra Temperatura (ºC)
(On set – Peak) Entalpia (J/g) Evento
Clonazepam 237,38 – 238,36 - 113,01 Fusão
Lactose
143,31 – 146,99 - 130,39 Perda de água
211,62 – 215,88 - 128,12 Fusão
222,27 – 237,07 - 101,20 Decomposição
Clonazepam +
Lactose
142,08 – 145,39 - 51,42 Perda de água
211,37 – 216,49 - 54,17 Fusão /decomposição
(Lactose) 228,96 – 232,61 -40,71 Fusão (clonazepam)
5.2.4.2 TG Clonazepam e Lactose monoidratada
A curva TG para mistura de Clonazepam e Lactose apresenta o perfil de
perda em faixas de temperaturas de acordo com as curvas individuais, figura 30. Os
eventos em mistura são similares aos isolados com perda de massa proporcionais,
desta forma, pode concluir que a Lactose não apresenta incompatibilidade com o
Clonazepam nas condições de realização do ensaio.
(a)
Step -19,0699 %-1,9037 mg
Residue 70,0223 %6,9902 mg
Onset 272,83 °CEndset 324,54 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN, 9,9828 mg
Method: TGA_009dt 1,00 s[1] 25,0..500,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
70
75
80
85
90
95
100
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Extrapol. Peak 288,98 °CPeak Value -38,55e-03 mg°C^-1Peak 292,37 °C
1/°C
-0,0040
-0,0035
-0,0030
-0,0025
-0,0020
-0,0015
-0,0010
-0,0005
0,0000
°C40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N 01. 06. 2015 15: 14: 16
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
81
(b)
Figura 30A – Curva de TG e DTG do Clonazepam (a) e Lactose (b)
(c)
(d)
Figura 30B – Curva de TG e DTG da mistura de CLZ com Lactose (c) e
comparativo (d)
Step -81,4453 %-8,2544 mg
Residue 18,7352 %1,8988 mg
Step -51,9982 %-5,2700 mg
Residue 22,2573 %2,2558 mg
Onset 295,06 °CEndset 332,51 °C
Step -6,7794 %-0,6871 mg
Residue 85,8500 %8,7008 mg
Onset 229,60 °CEndset 252,59 °C
Step -4,5313 %-0,4592 mg
Residue 95,8323 %9,7125 mg
Onset 140,95 °CEndset 151,24 °C
Sample: 209_15_LACTOSE, 10,1349 mg
Method: TGA_021dt 1,00 s[1] 25,0..600,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
20
30
40
50
60
70
80
90
100
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Extrapol. Peak 305,19 °CPeak Value -0,13 mg°C^-1Peak 309,24 °C
Extrapol. Peak 251,77 °CPeak Value -28,18e-03 mg°C^-1Peak 243,78 °CExtrapol. Peak 149,57 °C
Peak Value -25,10e-03 mg°C^-1Peak 146,62 °C
1/°C
-0,014
-0,012
-0,010
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0,000
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
^ ex o 209_ 15_ LA CT O SE 01. 06. 2015 16: 53: 40
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
Step -51,6667 %-4,9253 mg
Residue 48,5636 %4,6295 mg
Step -15,3944 %-1,4675 mg
Residue 61,8519 %5,8963 mg
Onset 268,71 °CEndset 291,95 °C
Step -9,4136 %-0,8974 mg
Residue 86,3484 %8,2315 mg
Onset 233,38 °CEndset 253,03 °C
Step -1,7143 %-0,1634 mg
Residue 98,3947 %9,3799 mg
Onset 142,75 °CEndset 150,39 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN_LACTOSE, 9,5329 mg
Method: TGA_021dt 1,00 s[1] 25,0..600,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
50
60
70
80
90
100
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Extrapol. Peak 275,90 °CPeak Value -59,25e-03 mg°C^-1Peak 276,88 °C
Extrapol. Peak 247,57 °CPeak Value -44,04e-03 mg°C^-1Peak 249,85 °C
Extrapol. Peak 134,25 °CPeak Value -11,60e-03 mg°C^-1Peak 146,56 °C
1/°C
-0,006
-0,005
-0,004
-0,003
-0,002
-0,001
0,000
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N_ LA CT O S E 01. 06. 2015 16: 58: 28
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
100 200 300 400 500
20
40
60
80
100
% M
assa
Temperatura (C)
Clonazepam
Lactose
Clonazepam-Lactose
82
Tabela 14 - Dados dos ensaio de TG do Clonazepam, Lactose e mistura de
Clonazepam com Lactose
Amostra
Evento
Faixa de Temperatura
(ºC)
Onset - Endset
% Perda de
Massa Evento PeakºC
Clonazepam 272,83 – 324,54 19,07 Decomposição 292,37
Lactose
140,95 – 151,24 5,80 Desidratação 108,44
229,60 – 252,59 6,78 Decomposição 243,78
295,06 – 332,51 52,00 Decomposição 309,24
Clonazepam +
Lactose
142,75 – 150,39 1,71 Desidratação 146,56
233,380- 253,03 9,41 Decomposição 249,85
268,95 – 291,95 15,39 Decomposição 276,88
5.2.5 Excipientes e Clonazepam com excipientes
5.2.5.1 DSC Excipientes e Clonazepam com excipientes
Tabela 15 – Discussão de resultados para o ensaio de DSC para mistura de
Excipientes
Amostra Temperatura (ºC)
(On set – Peak) Entalpia (J/g) Evento
Clonazepam 237,38 – 238,36 - 113,01 Fusão
Excipientes
37,54 – 51,82 - 7,20 Perda de água
88,98 - 97,36 - 103,02 Perda de água
127,16 - 129,38 - 3,35 Fusão
144,58 – 148,11 -28,28 Fusão Decomposição
163,38 – 170,33 -2,83 Fusão Decomposição
204,24 – 210,76 - 30,40 Fusão Decomposição
Clonazepam e
Excipientes
26,76 – 46,57 -75,44 Perda de água
105,66 – 110,15 - 18,91 Fusão
122,26 – 125,02 -5,45 Fusão Decomposição
143,70 – 147,04 -11,43 Fusão Decomposição
202,98 – 209,42 -14,45 Fusão Decomposição
Na curva de DSC para os excipientes, figura 31, são observados alguns
eventos dos excipientes na mistura, como por exemplo, evento endotérmico na faixa
de 25°C a 50°C possivelmente devido a desidratação do amido, lactose e/ou
celulose. Os eventos endotérmicos entre 144,45°C – 148,11°C e 204,24 °C – 210,76
83
°C relacionados à lactose e os observados em 88,98 °C - 97,36°C e em 127,16 °C -
129,38°C relacionados ao estearato de magnésio.
Figura 31 – Curva de DSC mistura de excipientes
Os eventos para a mistura de excipientes são novamente observados na
curva de DSC da mistura de todos os excipientes e o clonazepam, entretanto,
observa-se uma sobreposição de eventos na faixa de temperatura de fusão do
clonazepam não sendo possível a visualização do seu evento de fusão
separadamente. Os dados obtidos por DSC não mostram indícios de
incompatibilidade entre os excipientes estudados e o Clonazepam.
84
Figura 32 – Curva de DSC Clonazepam e mistura de excipientes
5.2.5.2 TG Excipientes e Clonazepam com excipientes
As curvas de TG para a mistura de excipientes e clonazepam com
excipientes, figura 33, apresentam o mesmo perfil de curva perdas de massa em
temperatura semelhantes. Na curva com clonazepam e excipientes as perdas de
massa devidas aos eventos dos excipientes são menores em porcentagem de perda,
mas apresentam o mesmo perfil.
Os dados obtidos por TG mostram que os excipientes avaliados e clonazepam
não apresentam indícios de incompatibilidade.
85
Figura 33 – Curva de TG da mistura de Clonazepam e excipientes
5.3 Desenvolvimento de métodos
Durante o desenvolvimento do método por CLAE foram testados diferentes
condições cromatográficas, partindo-se das condições mais simples, aprimorando-as
conforme a necessidade da análise.
A alta quantidade de tampão descrita na fase móvel na metodologia
farmacopeica pode aumentar o risco da formação de cristais em solução, os quais
podem ser abrasivos para os constituintes mecânicos do HPLC. Sendo assim, foi
desenvolvida nova fase móvel, constituída de acetonitrila/água na proporção de
600:400 v/v, para evitar o risco da cristalização dos sais na fase móvel, além do seu
preparo ser bem mais simples que a descrita na farmacopeica.
? Step -69,6196 %-6,9048 mg
Residue 30,2285 %2,9980 mg
Step -42,4881 %-4,2139 mg
Residue 44,0238 %4,3662 mg
Onset 266,81 °CEndset 325,28 °C
? Step -4,2632 %-0,4228 mg
Residue 95,1528 %9,4371 mg
Onset 28,27 °CEndset 63,86 °C
Sample: 209_15_CLONAZEPAN_GR, 9,9179 mg
Method: TGA_021dt 1,00 s[1] 25,0..600,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
30
40
50
60
70
80
90
100
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Extrapol. Peak 240,63 °CPeak Value -19,57e-03 mg°C^-1Peak 245,23 °C
Extrapol. Peak 303,08 °CPeak Value -69,24e-03 mg°C^-1Peak 300,61 °C
Extrapol. Peak 147,73 °CPeak Value -3,27e-03 mg°C^-1Peak 146,62 °C
Extrapol. Peak 101,38 °CPeak Value -2,61e-03 mg°C^-1Peak 97,96 °C
1/°C
-0,007
-0,006
-0,005
-0,004
-0,003
-0,002
-0,001
0,000
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
^ ex o 209_ 15_ CLO NA Z E P A N_ G R 02. 06. 2015 16: 55: 04
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
? Step -80,8952 %-7,7859 mg
Residue 18,9850 %1,8273 mg
Step -37,6710 %-3,6257 mg
Residue 26,9588 %2,5947 mg
Onset 294,18 °CEndset 345,09 °C
Step -13,4345 %-1,2930 mg
Residue 76,3693 %7,3503 mg
Onset 220,49 °CEndset 251,80 °C
Step -1,1873 %-0,1143 mg
Residue 93,6649 %9,0150 mg
Onset 143,85 °CEndset 151,44 °C
Sample: 209_15_EXCIPIENTES, 9,6247 mg
Method: TGA_021dt 1,00 s[1] 25,0..600,0 °C, 10,00 K/min, N2 50,0 ml/minSynchronization enabled
%
20
30
40
50
60
70
80
90
100
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Extrapol. Peak 304,83 °CPeak Value -69,42e-03 mg°C^-1Peak 312,26 °C
Extrapol. Peak 235,35 °CPeak Value -39,16e-03 mg°C^-1Peak 241,06 °C
Extrapol. Peak 135,64 °CPeak Value -7,95e-03 mg°C^-1Peak 147,19 °C
1/°C
-0,007
-0,006
-0,005
-0,004
-0,003
-0,002
-0,001
0,000
°C50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
^ ex o 209_ 15_ E X CI P I ENT E S 02. 06. 2015 17: 06: 17
S T A Re S W 10. 00Lab: M E T T LE R
86
Primeiramente, foi testada uma proporção de fase móvel contendo 50% de
água e 50% de acetonitrila. Nessas condições, os picos de CLZ, CR A e CR B
apresentaram-se abertos e com ondulações. A constituição de fase móvel foi
modificada, utilizando-se 40% de água e 60% de acetonitrila. Com base nesta
alteração, observou-se um melhor perfil cromatográfico.
Como fase móvel estacionária testou-se colunas C8 de diferentes dimensões
e marcas até melhor obtenção de separação entre os picos CLZ, CR A e CR B.
Através de estudos envolvendo o fluxo, concentração de solvente na fase
móvel e temperatura, determinou-se a melhor condição de separação para o
clonazepam e seus compostos relacionados, foi:
- Volumes de injeção: 30µL
- Temperaturas da coluna: 25ºC
- Vazões da FM: 1,0mL/min
- Modos de eluição: isocrático
- Comprimento de onda: 254nm
- Coluna analítica: C8 – 250 x 4,6mm
A otimização e a validação do método, foram realizadas nestas condições.
Figura 34 – Cromatograma da solução de padrões de CLZ, CR A, CR B
87
Optou-se pela concentração de 0,1 mg/mL de CLZ, pois esta se mostrou ideal
para obter o equilíbrio entre a facilidade do modo de preparo das soluções e um bom
desempenho cromatográfico como demonstrado na figura abaixo.
Figura 35 – Cromatograma da solução amostra de CLZ à 0,1mg/mL
5.4 Validação de métodos
5.4.1 Adequação do Sistema
Resumo dos dias em que foram realizadas as análises:
Dia 1: Seletividade sem degradação
Dia 2: Seletividade com degradação forçada
Dia 3: Linearidade – Limite de Quantificação
Dia 4: Precisão
Dia 5: Exatidão
Dia 6: Robustez - Estabilidade
88
Tabela 161 – Adequação do sistema
Parâmetros
Critérios
de
Aceitação
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
Dia 5
Dia 6
DPR Áreas * 2% 0,3% 0,1% 0,4% 0,2% 0,3% 0,2%
Assimetria 0,8 – 1,2 1,00 0,99 0,99 0,98 0,96 0,92
Pratos Teóricos (N’) ≥ 2000 10214 10009 9954 9887 9830 9631
Resolução entre CLZ e CRB ≥ 2 3 3 3 2 2 2
*DPR das áreas 6 injeções obtidas no Padrão de Calibração. Na linearidade foi utilizado o DPR das 3
injeções do nível 100%.
Segundo a análise dos resultados obtidos no teste Adequação do Sistema,
conforme tabela 16 e em comparação com os critérios de aceitação, o sistema
encontra-se hábil para início das análises e prosseguir com o teste de teor e
impurezas nas condições laboratoriais.
5.4.2 Especificidade/Seletividade
Através da análise dos cromatogramas das soluções padões, amostra e
placebo observou-se que o método proposto apresenta especificidade, já que não
sofre interferência dos excipientes junto ao sinal de CLZ. Além disso, a pureza de
pico do CLZ observada é 0,99.
Os cálculos de pureza de pico foram realizados comparando o espectro do
ápice do pico (espectro de referência, ponto que apresenta a maior concentração do
analito e o espectro mais bem definido), com diversos espectros amostrados do
início ao fim do pico de CLZ, sendo coletado um espectro a cada 400 milissegundos.
Desse total de espectros, foi realizada uma avaliação, contando todos os
espectros que apresentaram pelo menos 95 % de semelhança com o espectro de
referência e também calculando os que apresentaram menos de 95% de
similaridade.
89
Tabela 172 – Seletividade / Especificidade
Parâmetros Resultados
Obtidos
Avaliação visual dos picos cromatográficos De acordo
Resolução De acordo
Identificação De acordo
Pureza de Pico De acordo
Quando submetidas à degradação forçada, os cromatogramas apresentaram
redução no teor de CLZ e foi observado formação de picos de degradação em todos
tipos de hidrólises. Já quando submetido a degradação térmica e fotolítica, houve
pequena variação no teor tanto para o padrão, quanto para amostra.
Tabela 183 – Degradação Forçada Padrão
Tratamento no Padrão
%
Recuperação
24 horas
%
Degradação
24 horas
%
Recuperação
48 horas
%
Degradação
48 horas
Amostra Controle 100,0 0,0 100,0 0,0
Degradação Ácida (HCl 0,1N) 89,5 10,5 79,7 20,3
Degradação Básica (NaOH 0,1N) 65,3 34,7 48,6 51,4
Degradação Oxidativa (H2O2 3%) 94,8 5,2 93,8 6,2
Degradação Térmica (60°C) 102,3 2,3 88,9 11,1
Degradação Fotolítica (UV) 99,0 1,0 99,6 0,4
Tabela 194 – Degradação Forçada Amostra
Tratamento na Amostra
%
Recuperação
24 horas
%
Degradação
24 horas
%
Recuperação
48 horas
%
Degradação
48 horas
Amostra Controle 100,0 0,0 100,0 0,0
Degradação Ácida (HCl 0,1N) 91,6 8,4 79,9 20,1
Degradação Básica (NaOH 0,1N) 64,8 35,2 48,6 51,4
Degradação Oxidativa (H2O2 3%) 97,9 2,1 93,8 6,2
Degradação Térmica (60°C) 103,0 3,0 98,1 1,9
Degradação Fotolítica (UV) 99,7 0,3 98,9 1,1
90
Na solução estressada por hidrólise básica, usando NaOH 0,1N, obteve-se a
maior degradação de cerca de 35,2% em 24 horas e 48,6% em 48 horas, com maior
formação de picos desconhecidos (Tabela 20).
Tabela 20: Produtos de degradação encontrados no teste de degradação
Forçada
Produtos de
Degradação
Condição
24 horas 48 horas
Ácida Básic Oxid Térm Fotol Ácida Básic Oxid Térm Fotol
CR A
(RRT≈ 1,20) x x x x x x x x x x
CR B
(RRT≈1,81) x x x x x x x x x x
Imp. Desc. 1
(RRT≈0,45) x x - x x x x - x -
Imp. Desc. 5
(RRT≈0,57) - x - - - - x - - -
Imp. Desc. 2
(RRT≈065) - x - x - - x - - -
Imp. Desc. 3
(RRT≈0,76) - - - x - - x - x x
Imp. Desc. 4
(RRT≈0,80) - x x x - - x x x -
Imp. Desc. 5
(RRT≈0,88) x x x x - x - x x -
Imp. Desc. 5
(RRT≈0,93) x x x - - x x - x x
Imp. Desc. 5
(RRT≈1,06) - - - - - x x - - -
Imp. Desc. 5
(RRT≈1,76) - - x x x - - x - -
Imp. Desc. 5
(RRT≈2,13) - - x - - - - x - -
O placebo não apresentou interferência no tempo de retenção e comprimento
de onda do Clonazepam em nenhuma das condições analisadas. O pico de CLZ na
91
amostra apresentou-se puro em todas as condições avaliadas e a pureza de pico do
CLZ observada foi maior que 0,99.
Apesar de observada a degradação do ativo em determinadas condições de
estresse, não foi detectado nenhum interferente originário destas degradações no
tempo de retenção do ativo em nenhuma das condições avaliadas.
Segundo a análise dos resultados obtidos no teste
Seletividade/Especificidade, e em comparação com os critérios de aceitação, é
possível observar que houve degradação do ativo Clonazepam nas condições de
degradação: hidrólise ácida, hidrólise básica, hidrólise oxidativa, fotolítica, térmica e
não houve interferentes no tempo de retenção do ativo.
5.4.3 Linearidade
A linearidade foi avaliada através da construção de três curvas de calibração
desenvolvidas, CLZ, CR A, CR B respectivamente, contendo sete níveis de
concentração cada uma delas, avaliando a correlação linear.
A partir das áreas médias obtidas na faixa de concentração estudada, as
equações das retas foram calculadas e os coeficientes de correlação determinados.
Tabela 21: Linearidade Clonazepam
92
Figura 36 – Curva Analítica - Área x Concentração Clonazepam
Figura 37 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica
Clonazepam
O valor de coeficiente de correlação demonstrou a qualidade da curva obtida,
indicando menor dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor incerteza
dos parâmetros de regressão linear.
93
Figura 38 – Gráfico de Resíduos Clonazepam
Figura 39 – Gráfico de Resíduos Padronizados Clonazepam
Todo intervalo estudado entre 0,02 e 0,12 mg/mL de CLZ mostrou-se linear
sob a investigação do gráfico de resíduos acima.
94
Tabela 22: Linearidade CR A
O estudo da faixa linear de trabalho para cada composto relacionado foi
realizado visando a definição do intervalo de concentração no qual fosse possível
quantificar de forma segura os analitos. Para isto, foram construídos os gráficos
mostrados nas figuras 40 e 44. Considerou-se como faixa linear de trabalho, os
intervalos nos quais os pontos estavam inseridos entre os limites inferiores e
superiores do gráfico. Para cada composto relacionado foram avaliados 7 níveis de
concentração.
Figura 40 – Curva Analítica - Área x Concentração CR A
95
Figura 41 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica CR
A
Figura 42 – Gráfico de Resíduos CR A
96
Figura 43 – Gráfico de Resíduos Padronizados CR A
A análise dos gráficos de resíduos gerados a partir de ajustes de modelos
lineares aos dados de calibração revela que os resíduos gerados são pequenos e
não há nenhuma tendência que demonstre a falta de ajuste dos modelos,
confirmando sua adequação às respostas obtidas.
Tabela 23: Linearidade CR B
97
Figura 44 – Curva Analítica - Área x Concentração CR B
Figura 45 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica CR
B
Os perfis dos gráficos de resíduos apresentados nas Figuras 46 e 47
demonstraram que não houve tendências óbvias que demonstrassem
heteroscedasticidade ou desvios de linearidade.
98
Figura 46 – Gráfico de Resíduos CR B
Figura 47 – Gráfico de Resíduos Padronizados CR B
Analisando-se as equações das curvas obtidas, pode-se perceber que o
método foi linear para CLZ, CR A, CR B, já que os coeficientes de correlação de
todos foram todos maiores que 0,99. O gráfico de resíduos do ajuste linear
apresentou resultados indicativos e o valor máximo de resíduos padronizados esteve
compreendido entre ± 3.
99
5.4.4 Limite de Quantificação
Conforme as tabelas abaixo, a recuperação do limite de quantificação
esteve entre 90 e 110%, calculados com base na linearidade e o desvio padrão
relativo foi menor que 10%.
Tabela 24: Limite de Quantificação de Clonazepam
Tabela 25: Limite de Quantificação de CR A
Tabela 26: Limite de Quantificação de CR B
5.4.5 Precisão
Nas tabelas que seguem estão demonstrados os resultados obtidos através
das áreas de sucessivas determinações realizadas para análise da precisão do
método. A precisão foi estudada com 12 amostras, sendo avaliada a repetibilidade
100
do método no primeiro grupo (6 preparações) e a precisão intermediária no segundo
grupo (6 preparações).
Tabela 27: Padrão CLZ – Precisão Intradia
Tabela 28: Padrão CLZ – Precisão Interdia
Os dados dos desvios obtidos foram tratados estatisticamente empregando-se
o teste F, sendo considerados os DPRs resultantes dos dois grupos de dados (n=6),
inserindo no numerador o valor do maior desvio e no denominador o valor do menor
desvio. Dessa forma obteve-se o valor de 0,79, sendo que o f tabelado para o
intervalo de confiança de 0,025 e n = 12 é de 3,89. Portanto, sendo o valor
encontrado menor que o valor tabelado, podemos afirmar que os dois grupos de
dados apresentam variância similar, atendendo ao teste F.
A partir dos resultados obtidos, o método proposto apresentou precisão
intradia e interdia, com médias de DPR% em todas as amostras, abaixo dos 2%,
indicando elevada precisão do método.
101
5.4.6 Exatidão
A partir das áreas dos picos dos analitos, calculou-se as concentrações. Os
resultados foram expressos como percentual de recuperação da concentração
medida em relação à concentração real percentagem de recuperação. As tabelas
abaixo apresentam os resultados de recuperação de CLZ, CR A, CR B.
Tabela 29: Exatidão do Clonazepam
*Concentração Teórica da Solução: calculada com base na massa do padrão adicionado e fator de diluição.
Tabela 30: Exatidão do CR A
*Concentração Teórica da Solução: calculada com base na massa do padrão adicionado e fator de diluição.
102
Tabela 31: Exatidão CR B
*Concentração Teórica da Solução: calculada com base na massa do padrão adicionado e fator de diluição.
Todos os valores obtidos apresentaram-se dentro do intervalo e, portanto, o
método está de acordo com os parâmentros exigidos.
5.4.7 Robustez
Na avaliação da robustez, os resultados mostram que o método não se
revelou robusto frente às alterações de vazão e composição da fase móvel (Tabela
31, 32 e 33), já que para essas condições avaliadas não obteve-se boa percentagem
de recuperação. No restante das modificações efetuadas, o método analítico
mostrou-se robusto frente às pequenas e deliberadas modificações na temperatura
do forno e alteração de coluna, determinando que se houver variações, ainda assim
os resultados serão fidedignos.
103
Tabela 32: Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CLZ
Tabela 33: Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CR A
Tabela 34: Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CR B
Recuperação CLZ
Condições Testadas % Tempo de retenção (min)
Temperatura 23°C x Condição Normal 101 4,9
Temperatura 27°C x Condição Normal 101 4,9
Vazão 0,9 x Condição Normal 113 4,5
Vazão 1,1 x Condição Normal 93 5,5
Alteração FM (+1 – 61:39) 107 2,7
Alteração FM (-1% - 59:41) 110 7,4
Troca de Coluna x Condição Normal 96 4,6
Recuperação CR A
Condições Testadas % Tempo de retenção (min)
Temperatura 23°C x Condição Normal 99 5,9
Temperatura 27°C x Condição Normal 100 5,8
Vazão 0,9 x Condição Normal 108 6,6
Vazão 1,1 x Condição Normal 97 5,5
Alteração FM (+1 – 61:39) 103 4,6
Alteração FM (-1% - 59:41) 107 7,1
Troca de Coluna x Condição Normal 98 6,0
Recuperação CR B
Condições Testadas % Tempo de retenção (min)
Temperatura 23°C x Condição Normal 101 8,9
Temperatura 27°C x Condição Normal 98 8,8
Vazão 0,9 x Condição Normal 111 10,0
Vazão 1,1 x Condição Normal 94 7,7
Alteração FM (+1 – 61:39) 103 6,9
Alteração FM (-1% - 59:41) 110 11,1
Troca de Coluna x Condição Normal 98 9,0
104
As soluções de padrão e amostra são estáveis por um período de 72 horas
em temperatura ambiente, pois nesse período não ocorreu aumento de impurezas e
a formulação mostrou-se estável, o teor se manteve.
5.4.8 Estabilidade
Nos estudos realizados, foram comparados os dados obtidos da análise
térmica com os resultados de teor e substâncias relacionadas por HPLC,
possibilitando maior segurança na interpretação dos dados e também enriquecendo
o trabalho com um comparativo que desafia a eficiência da análise térmica.
As amostras submetidas às temperaturas de 30ºC e 40º não apresentaram
alterações nas suas características organolépticas e físicas, quando observadas
macroscopicamente. Os teores percentuais obtidos na temperatura de 30ºC tiveram
mínimas variações nos três períodos testados. A observação dos produtos de
degradação nesta mesma condição só foram observadas no período final de 90 dias.
Nas amostras submetidas à temperatura de 40ºC, observou-se valores
menores de teor quando comparados aos valores obtidos na temperatura de 30ºC,
mas sem variações significativas. Os produtos de degradação podem ser
observados no segundo período avaliado, de 60 dias.
Os produtos de degradação observados no estudo de estabilidade acelerada
conforme tabela 36, foram também observados no estudo de degradação forçada,
sem aumento considerável dos mesmos.
Não houve nenhuma alteração ou variação nos resultados de teor
(doseamento) acima de 5% quando comparados ao resultado inicial tanto no estudo
a 30°C/75%U.R. quanto no estudo a 40°C/75%U.R. conforme preconizado na RE
nº.01, de 29/07/2005.
105
Tabela 35: Estudo de Estabilidade
Tabela 36: Produtos de degradação encontrados no teste de estabilidade
Produtos de Degradação
Condição
30ºC 40ºC
90 dias 60 dias 90 dias
CR A (RRT≈ 1,20) x x x
CR B (RRT≈1,81) x x x
Imp. Desc. 1 (RRT≈0,45) x
Imp. Desc. 5 (RRT≈0,88) x x
Imp. Desc. 5 (RRT≈0,93) x x
A análise de estabilidade das misturas binárias preparadas e também da
mistura no estudo de compatibilidade não demonstraram alterações no estado
cristalino do fármaco, consequentemente não houve mudanças físico-químicas nas
misturas de modo a favorecer uma possível incompatibilidade entre o fármaco e
excipiente e até uma inatividade do fármaco.
Estabilidade
Condições Testadas
30°C / 75% U.R. 40°C / 75% U.R. Formação de Produtos de Degradação
30°C / 75% U.R. 40°C / 75% U.R.
30 dias 99 98
60 dias 99 97 x
90 dias 98 95 x x
106
6 CONCLUSÃO
Baseado no conjunto de dados analisados, a compatibilidade fármaco-
excipiente realizada através das técnicas de DSC e TG pode ser considerada como
técnica de primeira escolha para avaliação de compatibilidades, devido a sua rapidez
e versatilidade. Porém, deve-se associar com a CLAE e IR, uma vez que estes
forneceram informações quantitativas e qualitativas sobre o princípio ativo
respectivamente. A análise térmica forneceram resultados rápidos, porém de difícil
interpretação. Por esse motivo, as técnicas complementares (IR, CLAE) foram
válidas para confirmar os resultados obtidos pela análise térmica e assim gerar
resultados mais confiáveis.
Segundo os resultados obtidos por DSC, TG, IR e CLAE foi possível identificar
que não houve alterações significativas no fármaco isolado e nas misturas binárias
1:1 fármaco/excipiente, indicando que não há interação entre os excipientes testados
e CLZ.
O método de CLAE desenvolvido foi otimizado em busca das melhores
condições para identificação e quantificação do CLZ, ofereceu grandes vantagens
em termos de simplicidade, visto que a fase móvel empregada é de fácil e rápido
preparo, o que permite ser usada rotineiramente nas análises de controle de
qualidade. Outra vantagem é o fato de não apresentar sais em sua composição, que
poderiam ocasionar danos à coluna e ao sistema cromatográfico, além de permitir a
identificação e reprodutível análise quantitativa de CLZ com confiabilidade analítica.
Os resultados de validação foram correspondentes com os critérios de
aceitação utilizados, atestando que o método é linear no intervalo de trabalho
sugerido, apresenta boa precisão, além de possuir limites de quantificação
adequados para a análise a que se destina. Além disso, o método demonstrou
robustez quando exposto a variações deliberadas nas condições experimentais
estabelecidas, com exceção das alterações de vazão e composição da fase móvel. A
partir da análise dos cromatogramas, nos estudos de degradação do padrão e da
amostra, pode-se verificar que o método proposto teve êxito na separação do
Clonazepam e dos produtos de degradação formados. Além disso, permitiu a análise
107
quantitativa de CLZ na presença dos produtos de degradação e constituintes da
matriz, portanto, pode-se afirmar que o método pode ser empregado como indicativo
da estabilidade. O método foi validado e considerado preciso, seletivo, específico,
exato e linear para a determinação de compostos de degradação de Clonazepam
Comprimidos.
Através deste estudo foi possível unificar as informações sobre
compatibilidade entre CLZ e excipientes, realçando a importância desses estudos
para o desenvolvimento farmacotécnico.
108
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Anexo 1: Declarações de autoria e de bioética e segurança
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