estratégias para identifi cação de falso- positivos no

Estratégias para Identifi cação de Falso-Positivos no Processo de Obtenção

de Duplo-Haploides em Milho

BOLETIM DE PESQUISA E

DESENVOLVIMENTO

171

ISSN 679-0154Novembro/ 2018

HAPLÓIDES DIPLÓIDES INIBIÇÃO

BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

171

Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Milho e Sorgo

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Embrapa Milho e SorgoSete Lagoas, MG

2018

Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção

de Duplo-Haploides em Milho

Isabel Regina Prazeres de SouzaRoberto dos Santos Trindade

Maria José Vilaça de VasconcelosAna Luíza Soares Pereira de Paula

Paulo Evaristo de Oliveira GuimarãesLauro José Moreira Guimarães

Meire de Cássia Alves

ISSN 1679-0154Novembro/2018

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© Embrapa, 2018

Estratégias para identificação de falso-positivos no processo de obtenção de duplo-haploides em Milho/ Isabel Regina Prazeres de Souza ... [et al.]. – Sete Lagoas : Embrapa Milho e Sorgo, 2018. 20 p. : il. -- (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Milho e Sorgo, ISSN 1679-0154; 171).

1. Melhoramento genético vegetal. 2. Genética vegetal. 3. Zea mays. 4. Genótipo. I. Souza, Isabel Regina Prazeres de. II. Trindade, Roberto dos Santos. III. Vasconcelos, Maria José Vilaça de. IV. Paula, Ana Luiza Soares Pereira de. V. Guimarães, Paulo Evaristo de Oliveira. VI. Guimarães, Lauro José Moreira. VII. Alves, Meire de Cássia. VIII. Série. CDD 631.52 (21. ed.)

Comitê Local de Publicações da Unidade Responsável

PresidenteSidney Netto Parentoni

Secretário-ExecutivoElena Charlotte Landau

MembrosAntonio Claudio da Silva Barros, Cynthia Maria Borges Damasceno, Maria Lúcia Ferreira Simeone, Roberto dos Santos Trindade e Rosângela Lacerda de Castro

Revisão de textoAntonio Claudio da Silva Barros

Normalização bibliográficaRosângela Lacerda de Castro (CRB 6/2749)

Tratamento das ilustraçõesTânia Mara Assunção Barbosa

Projeto gráfico da coleçãoCarlos Eduardo Felice Barbeiro

Editoração eletrônicaTânia Mara Assunção Barbosa

Foto da capaDos autores

1ª ediçãoFormato digital (2018)

Rosângela Lacerda de Castro (CRB 6/2749)

Sumário

Resumo ......................................................................................4

Abstract ......................................................................................6

Introdução...................................................................................7

Material e Métodos .....................................................................8

Resultados e Discussão ...........................................................11

Conclusões ...............................................................................18

Agradecimentos........................................................................19

Referências ..............................................................................19

4 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171

Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de Duplo-Haploides em Milho

Isabel Regina Prazeres de Souza*1

Roberto dos Santos Trindade2

Maria José Vilaça de Vasconcelos3

Ana Luíza Soares Pereira de Paula4

Paulo Evaristo de Oliveira Guimarães5

Lauro José Moreira Guimarães6

Meire de Cássia Alves7

*1 Eng.-Agrôn., PhD. Em Plant Science, Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo.*Autor correspondente, E-mail: [email protected]

2 Eng.-Agrôn., Dr. Em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo.

3 Farmácia, PhD. Plant Molecular Biology, Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo.4 Graduanda em Engenharia Química, Centro universitário de Sete Lagoas, UNIFEMM.5 Eng.-Agrôn., Dr. Em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo.6 Eng.-Agrôn., PhD. Em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo.7 Bióloga, MSc em Genética e Melhoramento de Plantas, Analista da Embrapa Milho e Sorgo.

Resumo – A tecnologia de duplo-haploides reduz o tempo para obtenção de linhagens homozigotas de milho. Entretanto, um dos fatores que afetam o processo são as plantas diploides (falso-positivos) não eliminadas nas fases iniciais e que permanecem nas etapas subsequentes, consumindo tempo e recursos até a sua correta identificação e eliminação. Nesse estudo, foram analisadas as características morfoanatômicas das células-guarda do estômato, o número de estômatos e a microgametogênese do grão de pólen em genótipos haploides, duplo-haploides e diploides de milho, visando verificar a existência de variabilidade dessas características entre esses tipos de genótipos que pudesse ser utilizada na fase inicial de seleção na obtenção de duplo-haploides. Os resultados desse trabalho mostram importantes informações que permitem distinguir as três classes de plântulas em estádios iniciais, por meio do número de estômatos no limbo foliar e comprimento das células-guarda do estômato. Verificou-se que diploides podem ser distinguidos

5Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de Duplo-Haploides em Milho

dos duplo-haploides e haploides por meio do número de estômatos e do comprimento da célula-guarda do estômato. Para número de estômatos, os diploides apresentaram valores intermediários entre os haploides e duplo-haploides, média de 8 estômatos/1.000 μm². Para comprimento da célula-guarda, os diploides apresentaram o maior valor, média de 39,18 μm. Por meio do acompanhamento do desenvolvimento da microgametogenese do grão de pólen foi possível distinguir genótipos haploides dos diploides e duplo-haploides. Para distinção de diploides (falso-positivos), em fase inicial da obtenção de duplo-haploides, a contagem do número de estomatos/área e a medida do comprimento das celulas-guarda do estômato constituem técnicas não destrutivas e de fácil uso em laboratório, sendo que a sua implementação aumentará a eficiência do processo de produção de duplo-haploides em milho.

Termos para Indexação: Zea mays L., estômato, célula-guarda, microgametogenese, carmin propiônico


Strategies for Identification of False Positives in the Production of Double-Haploides in Maize

Abstract - The doubled haploid technology allows obtaining maize inbred lines in a relatively quickly way. However, one of the factors that affect the process is the presence of diploid (false positive) plants not eliminated in the initial stages of duplication remaining in the subsequent stages, consuming time and resources until their correct identification. In this study, the morpho-anatomical characteristics of the stomatal guard cells, the number of stomates and the microgametogenesis of the pollen grain were analyzed in haploid, double-haploid and diploid maize genotypes to verify the existence of variability for these characteristics among these genotypes, that could be used in the initial selection phase of double-haploids process. The results obtained provide important information that allows distinguishing the three classes of seedlings at an early stage by means of the number of stomata in the leaf and the length of the guard cells. For the number of stomates, the diploids presented intermediate values between haploids and double-haploids, mean of the 8 stomata/1.000 μm². For the length of the guard cells, the diploids had the highest value, mean of the 39.18 μm2. Through the microgametogenesis of the maize pollen grain was possible to distinguish haploid genotypes from diploids and double-haploids. In order to distinguish diploids (false positives), in the initial phase of the double-haploids process, counting the number of stomates/area and measuring the guard cells length are non-destructive techniques and easy to use in the laboratory, and its implementation will increase the efficiency of the maize double-haploid production process.

Index Terms: Zea mays L., stomates, guard cells, microgametogenesis, propionic carmine


Introdução

Um duplo-haploide (DH) é um genótipo 100% homozigoto obtido pela duplicação do genoma de indivíduos haploides de forma espontânea ou artificial (Prigge; Melchinger, 2012). No sistema de produção de linhagens duplo-haploides a homozigosidade é obtida em apenas uma geração, eliminando a necessidade de várias gerações de autofecundações (Murovec; Bohanec, 2012). Desta forma, esta tecnologia tem sido cada vez mais utilizada em programas de melhoramento de milho para acelerar o desenvolvimento de linhagens.

A produção de duplo-haploides em milho passa por quatro etapas (Prigge; Melchinger, 2012): i) indução de haploidia; ii) identificação de possíveis haploides com base em marcadores fenotípicos; iii) duplicação cromossômica; e iv) a autofecundação das linhagens obtidas. Para seleção de sementes haploides, Nanda e Chase (1966) desenvolveram um sistema baseado no marcador fenotípico expresso pelo gene R1-navajo, com alelos dominantes presentes apenas no indutor de haploidia. Neste sistema, sementes cujo endosperma possui pigmentação púrpura, mas com embrião de coloração branca, indicando presença de genes provenientes apenas do genótipo-fonte, são selecionados para obtenção de linhagens duplo-haploides.

Quando a indução de haploidia é realizada em populações-fonte de origem tropical, a pigmentação da semente por antocianina pode variar em extensão e intensidade, havendo redução ou ausência da marcação de sementes, o que dificulta ou impede a identificação de haploides putativos (Chaikam et al., 2015). Este fato possibilita a presença de falsos-positivos na produção de DHs em campo, demandando a identificação de duplo-haploides putativos com base em avaliações visuais após estabelecimento no campo, considerando que as plantas que passam pelo processo de duplicação cromossômica são frágeis, de baixa estatura e pouca produção de pólen e sementes. Desta forma, torna-se importante a avaliação de processos que reduzam a margem de erro implicada na identificação visual pelo sistema R1-nj, e a identificação de diploides (falsos-positivos) no campo após o processo de duplicação cromossômica, para maior efetividade no processo de desenvolvimento de linhagens duplo-haploides de milho, bem como redução de gastos com insumos, mão de obra e espaço.


Alguns estudos visam identificar características das plantas que possam servir como um indicador na seleção de genótipos haploides. Dentre esses, Shrestha e Kang (2016) verificaram em pimenta doce (Capsicum annuum L.) que o comprimento médio do estômato foi maior em diploides, 35.2±2.5μm, quando comparados aos haploides, 26.4±2.4μm, e essa diferença foi significativa, permitindo utilizá-la como um indicador do nível de ploidia nessa espécie.

Przywara et al. (1988) verificaram associação entre o comprimento das células-guarda dos estômatos na distinção entre plantas haploides e diploides de Actinidia deliciosa, respectivamente, com 24±1.7μm e 33±2.4μm. Em milho subtropical, Choe et al. (2012) verificaram que a característica comprimento médio das células-guarda dos estômatos mostrou-se como um possível método promissor na identificação de plantas haploides e diploides. Entretanto, não avaliaram a densidade estomatal no limbo foliar, dada pelo número de estômatos/área. Estes parâmetros podem ser ferramentas importantes dentro do processo de produção de DHs para determinar o nível de eficiência dos indutores de haploidia utilizados e do processo de duplicação cromossômica.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o uso de características ligadas à anatomia foliar, como número de estômatos e comprimento da célula-guarda, e a microgametogênese de grãos de pólen como parâmetros para distinção entre plantas haploides, diploides e duplo-haploides de milho, durante o processo de produção de linhagens duplo-haploides.

Material e Métodos

Experimentação e genótipos avaliados

Os experimentos foram realizados na Embrapa Milho e Sorgo, entre março e setembro de 2017. Foram avaliados três tipos de genótipos de milho: dois diploides (D), 91500214 e 91500216, dois haploides (H) derivados do cruzamento dessas mesmas populações com o indutor de haploidia TAIL P1 x TAIL P2 (91501821 e 91501832), e duas linhagens duplo-haploides (DH) (91501947 e 91501977), obtidas por tratamento de plântulas haploides


derivadas das populações anteriormente citadas com inibidores de mitose, utilizando-se o protocolo preconizado por Prasanna et al. (2012).

Estes genótipos foram semeados na mesma época em casa de vegetação com controle de temperatura e umidade, para avaliação da anatomia foliar e desenvolvimento do grão de pólen durante a microgametogênese. Cada tratamento foi semeado em oito vasos contendo 25 litros de solos devidamente adubados, sendo mantidas 3 plantas/vaso, totalizando 24 plantas para cada tratamento como repetição. A adubação de cobertura e o manejo de irrigação seguiram todas as recomendações preconizadas para a cultura do milho.

Coleta de amostras de tecido foliar

Para a avaliação da anatomia foliar em diploides, haploides e duplo-haploides de milho, de cada planta no estádio de V6 coletou-se uma amostra da quarta folha expandida. A amostra consistiu de uma lâmina de 1 cm de largura, cortada no sentido transversal, da parte mediana do limbo da quarta folha da planta de milho, contada de baixo para cima. As amostras, 10 por tipo (haploide, duplo-haploide e diploide) foram imersas e mantidas em solução de etanol 70%, com troca diária da solução, durante três dias, sendo mantidas nessa solução sob refrigeração, até análise.

Comprimento das células-guarda e número de estômatos

A medida e a contagem de estômatos foram realizadas na parte abaxial da folha, iniciando-se imediatamente abaixo da nervura central. Para a tomada dos dados dessas duas características empregou-se o microscópio estereoscópico modelo ZEISS Axio Zoom V16 na magnificação máxima (112x), empregando escala de medida do equipamento (Figura 1). A área delimitada pelo aumento de 112x, 0,459 mm2, foi utilizada para a contagem de estômatos e o comprimento médio das células-guarda foi obtido de 10 desses estômatos.


Desenvolvimento do grão de pólen (microgametogênese)

Os pendões foram coletados antes da emergência, quando ainda se apresentavam encartuchados, e foram imersos em solução de etanol 70%, com troca diária da solução, durante três dias, sendo mantidos nessa solução na geladeira até as análises. Foi empregado o microscópio ótico Zeiss Axioplan para fotodocumentar, em diferentes magnificações, a microgametogênese nos genótipos haploides, duplo-haploides e diploides. Para as análises, as anteras foram individualmente colocadas sobre a lâmina, cortadas ao meio com bisturi e ligeiramente pressionadas para liberação do conteúdo. Foi utilizado o corante carmin propiônico 0,6% (m/v) para coloração e visualização dos núcleos (Jahier et al., 1996). A lamínula foi disposta sobre a amostra e selada com esmalte transparente de secagem rápida. As lâminas foram observadas em diferentes magnificações, sendo a máxima de 1.000X. As fotomicrografias foram feitas em microscópio ótico Zeiss, empregando-se câmera digital.

Análises estatísticas

Foram realizadas análises de variância para os dados de número e comprimento de estômatos, considerando-se as classes de genótipos avaliados: diploides, haploides e duplo-haploides e os genótipos dentro de cada classe, em um modelo inteiramente casualizado. Em seguida, efetuou-

Figura 1. Foto da parte abaxial do limbo foliar demonstrando a medição do compri-mento, em micrometro, das células-guarda do estômato de planta haploide.


se o ranqueamento de médias entre materiais e tipos de genótipos avaliados pelo teste t (LSD). Todas as análises foram realizadas com o auxílio do programa SISVAR (Ferreira, 2011).

Resultados e Discussão

Número de estômatos e comprimento das células-guarda

Os coeficientes de variação (dados não mostrados) da análise de variância do tratamento classes de genótipos foram de 10,84% e 12,86% para as características densidade de estômatos (número de estômatos/área) e comprimento das células-guarda, respectivamente. Considerando-se os genótipos como tratamentos, os coeficientes de variação foram de 12,33% e 10,41% para as características densidade de estômatos e comprimento da célula-guarda, respectivamente. Em ambas as análises esses valores dos coeficientes refletem boa precisão experimental nas medições tanto para as diferentes classes de genótipos avaliados (haploides, DHs e diploides) como para os diferentes genótipos em estudo.

Para classes de genótipos, a média do número de estômatos/área variou de 5,3 a 12,4 estômatos/1.000 μm2 (Tabela 1, Figura 2), respectivamente, para duplo-haploides e haploides. A classe diploide apresentou valor intermediário entre o duplo-haploide e o haploide (8,0 estômatos/1.000 μm2). Para essa característica, o teste de médias separou os três grupos distintamente.

A mesma tendência foi apresentada na análise por genótipos (Tabela 2, Figura 3), com o número de estômatos/área de 5,2 estômatos/1.000 μm2 (9150177-DH) e 5,3 estômatos/1.000 μm2 (91501947-DH) para os duplo-haploides, 12,3 estômatos/1.000 μm2 (91501821-H) e 12,6 estômatos/1.000 μm2 (91501832-H) para os haploides e valores intermediários 7,5 estômatos/1.000 μm2 (9150216-D) e 8,5 estômatos/1.000 μm2 (9150214-D) para os diploides. Verifica-se que, nas duas análises, por classe ou por genótipo, os diploides formaram um grupo distinto dos haploides e duplo-haploides, apresentando os valores intermediários para densidade de estômatos (número de estômatos/área).


Em relação ao comprimento das células-guarda do estômato, a classe de haploides apresentou o menor valor, 28,11 μm, seguido por duplo-haploides, 35,61 μm e diploides, 39,18 μm (Tabela 1, Figura 4). A mesma tendência foi observada na análise por genótipos, com os haploides apresentando os menores valores, 27,7 μm (91501821-H) e (91501832-H), seguido por duplo-haploides 33,9 μm (9150177-DH) e 36,7 μm (91501947-DH) e diploides 35,0 μm (9150214-D) e 43,4 μm (9150216-D) (Tabela 2, Figura 5). Para essa característica, comprimento das células-guarda do estômato, tanto por classe de ploidia como por genótipos, os diploides apresentaram os maiores valores formando um grupo distinto.

O menor comprimento das células-guarda nos genótipos haploides está em concordância com Magoon e Khanna (1963), que mencionam que os haploides, na grande maioria dos casos, apresentam baixo vigor em relação ao genitor do qual derivaram, isto é evidente a partir da aparência geral da planta, bem como do tamanho reduzido de órgãos e de células. Entretanto, considerando os valores de comprimento das células-guarda do estomato, para as diferentes classes de genótipos, nossos dados estão em concordância com os obtidos por Choe et al. (2012).

Os dados obtidos e as análises para a característica densidade de estômatos nos permitem inferir que, tanto pela classe de ploidia como por genótipos, os haploides podem ser identificados a partir de valores iguais ou acima de 9 estômatos/1.000 μm2 (Tabelas 1 e 2 e Figuras 2 e 3). Para a característica comprimento da celula-guarda, tanto pela classe de ploidia como por genótipos, os haploides podem ser identificados a partir de valores iguais ou abaixo de 30 μm (Tabelas 1 e 2 e Figuras 4 e 5).


TratamentosDensidade de estômatos(No de estômatos/1.000μm2)

Comprimento de células-guarda (μm)

9150214-D 8,5 b 35,0 c

9150216-D 7,5 bc 43,4 a

91501821-H 12,3 a 27,7 d

91501832-H 12,6 a 28,5 d

91501947-DH 5,3 c 36,7 b

9150177-DH 5,2 c 33,9 c

Tabela 1. Médias de número de estômatos/área e do comprimento de células-guar-da de estômatos, medidos na quarta folha, das classes haploides, duplo-haploides e diploides, de milho tropical.

Tratamentos

Densidade de estômatos

(No. de estômatos/1.000 μm2)

Comprimento de células-guarda

(μm)

Haploide 12,4 c 28,11 c

Duplo-Haploide 5,3 b 35,61 b

Diploide 8,0 a 39,18 a

Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste t (LSD) a 5% de probabilidade.

Tabela 2. Médias de número de estômatos e do comprimento de células-guarda de estômatos, obtidas na quarta folha, dos genótipos diploides (-D), haploides (-H) e duplo-haploides (-DH).

Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste t (LSD) a 5% de probabilidade.


Figura 2. Médias do número de estômatos/área no tratamento classes de ploidia (haploide, diploide e duplo-haploide).

Figura 3. Média de número de estômatos/área para cada genótipo avaliado.


Figura 4. Comprimento médio de células-guarda de estômatos no tratamento classes de ploidia (diploide, duplo-haploide e haploide).

Figura 5. Comprimento médio de células-guarda de estômatos para cada genótipo avaliado.


Desenvolvimento de grãos de pólen em genótipos haploides, duplo-haploides e diploides

Neste trabalho, os genótipos haploides foram derivados de cruzamentos de populações-fonte com o indutor de haploidia TAIL P1 x TAIL P2. E os genótipos duplo-haploides foram provenientes da duplicação cromossômica de parte desses haploides por meio do tratamento com colchicina. O desenvolvimento da microgametogênese foi observado nesses dois tipos de genótipos e em plantas diploides, isto é, plantas derivadas da população original.

Na Figura 6 (A e B) verifica-se elevado número de grãos de pólen pequenos e degenerados em plantas haploides. As setas indicam micrósporos uninucleados que apresentam tamanho dentro da normalidade e núcleo corado. A primeira etapa da formação de gametas masculinos no milho corresponde à fase de micrósporo uninucleado, onde a região central é ocupada por vacúolo grande e o núcleo e o citoplasma são empurrados para a periferia (Hu, 2005). Os haploides têm somente metade do número de cromossomos do diploide, apresentam comportamento citológico peculiar e grau variável de esterilidade das partes reprodutivas, cuja meiose altamente anormal resulta em gametas estéreis (Magoon; Khanna, 1963). Entretanto, esses autores também mencionam que, ocasionalmente, pode ocorrer uma restituição do núcleo em razão da falha em uma das divisões meióticas. A duplicação do número cromossômico do haploide, de forma espontânea ou induzida pela aplicação de agentes antimitóticos, como a colchicina, por exemplo, recupera a condição diploide restaurando a fertilidade. Esta planta, chamada de duplo-haploide, será homozigota, isto é, cada cromossomo terá sua cópia (Santos; Zanettini, 2001; Trindade et al., 2017).

Os genótipos duplo-haploides, obtidos da duplicação cromossômica dos haploides, apresentaram produção normal de grãos de pólen. Na Figura 7 verifica-se que em ambas as fotos os grãos de pólen apresentam dois núcleos bem corados resultantes da primeira mitose (cariocinese), sendo um vegetativo e o outro da célula germinativa.

Em milho, o grão de pólen é liberado no estádio trinucleado, pois o núcleo da célula generativa se divide mais uma vez, isto é, passa pela segunda mitose (cariocinese) formando dois gametas masculinos, enquanto o


núcleo vegetativo permance indiviso (Mahendru; Sarkar, 2000). Nessa fase (Figuras 8 e 9), dificilmente se visualizam núcleos, pois o grão de pólen está todo preenchido com amido, a não ser que se utilize técnica específica de coloração. Couto et al. (2015) empregaram teste colorimétrico para estimar a viabilidade dos grãos de pólen, incluindo o carmin propiônico, e consideraram viáveis quando estes se coravam de vermelho e os não corados foram considerados inviáveis. O desenvolvimento do grão de pólen dos genótipos duplo-haploides foi o mesmo apresentado pelos indivíduos diploides, e pelo tipo de coloração que apresentaram demonstram a prevalência de grãos de pólen viáveis. Entre os genótipos haploides verificou-se elevado número de micrósporos degenerados e um número extremamente escasso de micrósporos apresentando desenvolvimento aparentemente normal.

A B V

Figura 6. Setas indicam micrósporos uninucleados corados com carmin propiônico 0,6% (m/v) de plantas haploides dos genótipos 91501832 (A - 200x) e 91501821 (B - 100x) e os demais micrósporos de tamanho menor são degenerados. V= vacúolo.

CG CG

NV

NV

Figura 7. Grãos de pólen de plantas duplo haploides, do genótipo 91501977, após primeira mitose (cariocinese) apresentando-se binucleados, magnificação de 1.000x. NV= núcleo vegetativo e CG = célula germinativa.


ConclusõesNo processo de obtenção de linhagens duplo-haploides de milho,

considerando-se as classes de genótipos haploides, duplo-haploides e diploides, foi possível identificar os diploides (falso-positivos), em fase inicial do processo, por meio da densidade de estômatos e do comprimento das células-guarda de estômatos. Foi possível também distinguir os haploides por meio do desenvolvimento da microgametogenese.

Entretanto, a medida do comprimento de células-guarda de estomatos e de densidade de estômatos é uma técnica mais eficiente, fácil, não destrutiva e, sendo implementada, aumentará a eficiência na produção de duplo-

A C

B Figura 8. Grãos de pólen apresentando preenchimento total com amido corado com carmin propiônico 0,6% (m/v) (A - 400x e B - 200x) e antera seccionada ao meio apresentando liberação de grãos de pólen (C - 100x) de plantas duplo-haploides do genótipo 91501947.

A B

Figura 9. Grãos de pólen do genótipo diploide 91501947 nas magnificações de 400x (A) e 200x (B).


haploides permitindo distinguir os diploides (falsos-positivos) de plantas haploides e duplo-haploides num estádio mais inicial.

AgradecimentosAgradecemos ao assistente Célio Ramos das Neves pelo apoio nos

trabalhos em casa de vegetação e laboratório.

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