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BIEM – 2005
Estratégias de Seqüenciamento
Felipe R. da Silva BIEM – Estratégias 2005
Estratégia de seqüenciamento
• Pequena escala– Leitura única
– Subclonagem
– Deleções sucessivas
– Primer walking
– shotgun
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Felipe R. da Silva BIEM – Estratégias 2005
Pequena escala
Leitura Única
Felipe R. da Silva BIEM – Estratégias 2005
Pequena escala
Leituras Únicas
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Pequena escala
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Pequena escalaA
B
A BDeleção Unidirecional
B = 3’ prot.
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Shotgun• Amostrar fragmentos da seqüência-alvo da maneira
mais aleatória possível.
• Determinar a maior porção possível das seqüências das extremidades destes fragmentos
Sanger F, Coulson AR, Hong GF, Hill DF, Petersen GB. (1982) Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol 162(4): 729-73.
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Montagem shotgunDNA original
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Sonicaçãosonicador
1 - ladder 1Kb2 - DNA genômico de milho3 - sonicado 1segundo4 - sonicado 1 + 4=5s5 - sonicado 1 + 4 + 5=10s6 - sonicado 1 + 4 + 5 + 5=15s7 - sonicado 1 + 4 + 5 + 5 + 5=20s8 - sonicado 1 + 4 + 5 + 5 + 5 + 10=30s9 - sonicado 1 + 4 + 5 + 5 + 5 + 30=1min
1
0,5
1,0
1,62,0
3,04,05,0
2 3 4 5 6 7 8 9Kb
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NebulizaçãoTIBS 22:273-274, 1997
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Estratégia de seqüenciamento
• Média escala– determinação do mapa físico de clones
– estratégias de pequena escala em cada clone
– resolução dos gaps entre clones
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Seqüenciamento Completo
...ATGTTGGGCCACAGTTGACCATTGAAACTG
Biblioteca de BACs
Mapa físico
BAC escolhido
Clones de shotgun
GTTGACCATTGAAACTGACCTTGACGTAACGTGGTA.... Seqüência
...ATGTTGGGCCACAGTTGACCATTGAAACTGACCTTGACGTAACGTGGTA... Montagem
DNA Genômico
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Hibridização
DNA marcado (sonda)
TACTCGACAGGCTAG
CTGATGGTCATGAGCTGTCCGATCGATCAT
DNA spotado
TACTCGACAGGCTAG
Hybridização
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HibridizaçãoDNA original
sonda A
sonda B
sonda C
A
A
A
A
A
AA
A
A
A
A
AAB
B
BB
BBB
B
BB
B
B
B
B
C
C
C
C
CC
C
C
CC
CC
C
C
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Felipe R. da Silva BIEM – Estratégias 2005
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 54 6 87 9 10 11 12
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= placa 01
= placa 02
= placa 03
= placa 04
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Mapa de hibridização
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Estratégia de seqüenciamento
• escala Genômica– mapa físico -> seqüenciamento
– shotgun total
– “conectores” seqüencia-dirigidos
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Montagem
• Trimming (corte)– fixo
– por ambiguidade
– por qualidade
• Consenso– inclusivo (código de ambiguidades)
– por freqüencia
– por qualidade
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Montagem com phrap
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Montagem com phrap
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Montagem com phrap
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Análise
• Reads– sem dados
– ruins
– errados
– vetor
– hospedeiro
• Montagem– gaps
– conflitos
– quimeras/deleções
• Checagem de co-linearidade