Epidemiologia Molecular e Registros de Câncer

Reunião da Associação Brasileira de Registros de Câncer

Porto Alegre, 13-15 de maio de 2002

Sergio Koifman, Escola Nacional de Saúde Pública/ Fiocruz

Publicações sobre risco molecular (MEDLINE)

• ANO n • 1970 16• 1975 29• 1980 47• 1985 131• 1990 375• 1995 1149• 2001 2708

Conteúdos

• Abordagem genético-molecular do câncer

• Conceituação de biomarcador molecular

• Genética de populações /estudo do câncer

• Polimorfismos genéticos no câncer

• Avanços tecnológicos: microarrays

• Desafios para os registros de câncer

Regulação da Proliferação Celular

A proliferação celular pode ser regulada direta ou indiretamente através de etapas ou mecanismos de checagem sucessivos. Os genes que regulam este processo podem ser classificados como aqueles que:

produzem fatores estimulantes a divisão celular.

produzem fatores de inibição do processo.

Controle da Divisão Celular

Existem duas rotas mutacionais envolvidas no controle da proliferação celular e na capacidade invasiva dos tumores:

1. tornar hiperativo um gene estimulador(oncogene) de carater dominante - apenas 1 das 2 copias do gene necessita estar alterada.

2. tornar inativo um gene inibidor de caráter recessivo (antioncogene): as 2 copias estão alteradas.

Resumo

Duas categorias de genes tem um papel crítico na gênese do câncer: os inibidores tumorais e os proto-oncogenes.

A perda de função dos inibidores tumorais libera as células de seus mecanismos de controle.

Mutações nos proto-oncogenes estimulam as células a aumentarem de número quando não deveriam fazê-lo.

Resumo• Mutações nos genes supressores de tumores são

geralmente recessivas: não existe perda de controle até que ambas cópias do gene estejam desativadas.

• As pessoas que herdam 1 cópia defeituosa tem maior predisposição ao câncer.

• Diferentes combinações de mutações são encontradas em diferentes formas de câncer.

• A repetição de lesões genéticas é sugestiva de que existe um número limitado de mecanismos pelos quais o câncer é gerado.

Effects of Heritable and Environmental Factors in Cancers atVarious Sites According to Data from the Swedish, Danish, and

Finnish Twin Registries (Liechtenstein et al., 2000).

Site or Type Proportion of Variance Shared Nonshared

Heritable Factors Environmental Environmental Factors Factors

Stomach 0.28 0.10 0.62

Colorectum 0.35 0.05 0.60

Pancreas 0.36 0 0.64

Lung 0.26 0.12 0.62

Breast 0.27 0.06 0.67

Cervix uteri 0 0.20 0.80

Corpus uteri 0 0.17 0.82

Ovary 0.22 0 0.78

Prostate 0.42 0 0.58

Bladder 0.31 0 0.69

Leukemia 0.21 0.12 0.66

Biomarcadores

Biomarkers (Nat. Research Council, 1987):

“indicators signaling events in biological systems or samples”.

Biomarcadores de exposição

Biomarcadores de efeito

Biomarcadores de susceptibilidade

Biomarcadores

Marcadores de exposição:

Composto exógeno no interior do organismo ou produto interativo entre o composto e um componente endógeno, ou outro evento relacionado a exposição.

Ex: adduts PAH-DNA

Biomarcadores

Marcadores de efeito:

Componente endógeno ou medida da capacidade funcional ou outro indicador do estado ou balanço do organismo ou sistema orgânico afetado pela exposição.

Ex. proteina p53

Biomarcadores

Marcadores de susceptibilidade:

Herdados ou induzidos, atuam como indicadores de que um indivíduo é particularmente sensível ao efeito de um xenobiótico, ou os efeitos de um grupo destas substâncias.

Ex. polimorfismos enzimáticos

Biomarcadores de susceptibilidade

- baseada no fato de que muitas substâncias químicas são alteradas por enzimas, e estas alterações podem modular a capacidade das primeiras de interagirem com o DNA ou RNA.

- baseada nas diferenças genéticas quanto a capacidade das células para reparar o dano no DNA causado por agressões ambientais.

- baseada em alterações genéticas pré-existentes.

Biomarcadores de susceptibilidade e metabolismo enzimático

Os mecanismos envolvidos no processo de metabolização de xenobióticos contém dois tipos principais de enzimas:

Fase I - na qual vários compostos são convertidos em metabolitos eletrofílicos reativos por enzimas de oxidação, principalmente pertencentes à família citocromo P 450 (CYPs).

Fase II - enzimas de conjugação atuam usualmente como inativadoras dos metabolitos transformados na fase I ( famílias de enzimas gluthatione-S-transferase (GSTs), N-acetyl-transferase (NATs), glucuronosyltransferases, etc.

Metabolização de XenobióticosDiagrama representando a biotransformação de xenobióticos e as relaçõesentre as enzimas metabolizadoras de xenobióticos (EMXs) da fase I e IIcom câncer, mutação e toxicidade (Nebert e cols. 1996).

1

METABÓLITOSELETROFÍLICOS

DROGASPESTICIDASPOLUENTES

TOXINAS

ESTRESSE OXIDATIVO,TOXICIDADE,

MUTAÇÃO(ADDUCTS DNA),CÂNCER.

PRODUTOSINÓCUOS

CONJUGADOS

FASE I

(P450)

FASE II

(GSTs, NATs)

Algumas alterações genéticas adquiridas são resultado de exposições ambientais (substâncias tóxicas ou carcinogênicas).

A variabilidade na resposta individual frente às exposições ambientais tem sido atribuída aos polimorfismos das enzimas metabolizadoras de xenobióticos.

Frequência de alelos na população

Gametas paternos

A (p) a (q)

Gametas A (p) AA (p2) Aa (pq)

maternos a (q) Aa (pq) aa (q2 )

p2 + 2pq + q2

Frequência de alelos na população

AA(p2) Aa (2pq) aa(q2)

AA(p2) p4 2p3q p2q 2

Aa (2pq) 2p3q 4p2q2 2pq3

aa (q2) p2q2 2pq3 q4

Frequência de alelos na população

Pares Freq AA Aa aa

AA x AA p4 p4 - -

AA x Aa 4p3q 2p3q 2p3q -

Aa x Aa 4p2q2 p2q2 2p2q2 p2q2

AA x aa 2 p2q2 - 2p2q2 -

Aa x aa 4pq3 - 2pq3 2pq3

aa x aa q4 - - q4

total p2(p2+2pq+q2) 2pq(p2+2pq+q2) q2 (p2+2pq+q2)

Equilíbrio de Hardy-Weimberg

População (modelo teórico):

grande tamanho (sem genetic drift)

acasalamento aleatório

ausência de seleção genotípica

ausência de mutações

ausência de migração

Equilíbrio de Hardy-Weimberg: aplicações

Estimação da frequência de portadores

Estimação da frequência de mutações

Estimação das dimensões do gene

Glutathione S-Transferase M1 (GSTM1) and T1 (GSTT1) and Susceptibility to Oral

Cavity and Larynx Cancer Hatagima1 A; Marques1 CFS, Rajoy1 FS; Koifman2 RJ; Capelli2 JS; Kneipp2 MB; Boffetta3 P; Brennan3 P; Munoz3 N; Herrero3 R; Koifman2 S.

Supported by : CNPq, FIOCRUZ /FAPERJ, European Community DG XII

1Dept. Human Population Genetics, Fiocruz,Brazil2Dept. Epidemiology, N. School. P.Health, Fiocruz3Int. Agency for Research on Cancer- IARC/WHO

T GSTM1 genotype frequencies distribution, allelic frequencies and Hardy-Weinbergequilibrium test for oral and larynx cancer cases and controls, Rio de Janeiro, 1999-2000

Control Sample Larynx cancer Oral cancer

Phenotype N 2 N 2 N 2

Obs. Exp. Obs. Exp. Obs. Exp.

GSTM1 0 58 59,630 0,044 56 57,654 0,047 88 94,205 0,409

GSTM1 A 42 40,226 0,078 36 34,231 0,091 67 60,270 0,751

GSTM1 B 24 22,145 0,155 18 16,140 0,214 40 32,969 1,500

GSTM1 AB 4 5,999 0,666 2 3,975 0,981 1 8,556 6,573

Total 128 128,000 0,944 112 112,000 1.334 196 196,000 9,333

p=0.33 p=0.25 p=0.002

Polimorfismos genéticos e leucemias

Krajinovic et al. 1999 - Quebec - os genótipos GSTM1 nulo e CYP1A1*2A fatores prognósticos na LLA. Indivíduos com ambos apresentavam maior risco de desenvolverem leucemia.

Meninas com CYP1A1*4 significativamente sub-representadas no grupo LLA - sugerindo papel protetor para este alelo segundo sexo.

Polimorfismos genéticos e leucemias

Sinnett et al. 2000 - associação genótipo GSTM1 nulo com risco de LLA.

Interação gene-gene: a presença combinada de 2 genótipos de alto risco (fenótipo acetilador lento NAT2; GSTM1 nulo; CYP1A1*2) aumenta riscos de LLA. Os três presentes conjuntamente em um mesmo indivíduo amplia mais o risco de LLA.

Genótipos Msph de CYP1A1 e GSTM1 em casos decâncer oral e controles (Sato et al., 2000)

Genótipo Controles Casos OR n (%) n(%)

CYP1A1

A(m1/m1) 62(43.6) 59 (39.5) 1.0

B (m1/m2) 65 (45.8) 55 (38.7) 0.9 (0.6 - 1.7)

C (m2/m2) 15 (10.6) 31 (21.8) 2.3 (1.1-4.7)

GSTM1

(+) 78 (54.9) 50 (35.2) 1.0

(-) 64 (45.1) 92 (64.8) 2.2 (1.4-3.6)

Características imunohistoquímicas, câncer de mamacom/sem metástase para linfonodos, Rio de Janeiro, 1998.

Variável Casos Controles OR

RE +++ 12 17 1.00 ++ 43 38 1.60 + 31 26 1.57

Neg 76 61 1.77

X2 tendência = 1.20 . P = 0.27

Eisenberg & Koifman, 2001

Características imunohistoquímicas, câncer de mama com/sem metástase para linfonodos, Rio de Janeiro, 1998.

Variável Casos Controles OR

C-erb B2

Neg 105 95 1.0+ 15 16 0.85

++ 19 10 1.72

Eisenberg & Koifman, 2001

+++ 23 23 0.90

A expressão A expressão pp(A(AB) significa a probabilidade B) significa a probabilidade condicional de A dada a presença de B, sendo condicional de A dada a presença de B, sendo chamada chamada probabilidade condicionalprobabilidade condicional. A expressão . A expressão pp(A e (A e B) é a B) é a probabilidade conjuntaprobabilidade conjunta, sendo a probabilidade , sendo a probabilidade conjunta de A e B. conjunta de A e B.

Num um exemplo comum na genética de Num um exemplo comum na genética de câncer, câncer, pp(G(GO) corresponde a probabilidade de ser O) corresponde a probabilidade de ser um portador de uma mutação genética condicionado um portador de uma mutação genética condicionado ao fato de também ser um indivíduo não afetado. ao fato de também ser um indivíduo não afetado.

TEOREMA DE BAYESTEOREMA DE BAYES

Determinação de estimativas da probabilidade posterior quanto à condição de portador de mutação genética para BRCA2.

PROBABILIDADEPORTAR

MUTAÇÃO BRCA2NÃO

PORTADORA

Prévia

Condicional (59 anos)*

Conjunta

Posterior

0.50

0.47*

0.24

0.32

0.50

1.00

0.50

0.69

047 x 0.50 = 0.24

0.24 / (0.24 + 0.50) = 0.32

Estimativa de probabilidade posterior quanto à condição de portador de mutação genética para BRCA2.

Empregam a metodologia epidemiológica no desenvolvimento, Empregam a metodologia epidemiológica no desenvolvimento, testagem e validação de biomarcadores.testagem e validação de biomarcadores.

Sensibilidade e especificidadeSensibilidade e especificidade

Variabilidade intra-individualVariabilidade intra-individual

Variabilidade inter-individualVariabilidade inter-individual

Meia-vida em tecidos selecionadosMeia-vida em tecidos selecionados

Valor preditivo positivoValor preditivo positivo

FactibilidadeFactibilidade

Relevância biológica para a doençaRelevância biológica para a doença

Transitional StudiesTransitional Studies

A área de epidemiologia molecular do câncer vem apresentando importante crescimento científico.

Com o advento de tecnologias cada vez mais poderosas, grandes avanços em relação à etiologia, suscetibilidade e terapia poderão ser alcançados, com possível aplicação na área clínica. Essas conquistas poderão trazer benefícios importantes para o diagnóstico precoce, tratamento e para a qualidade de vida dos pacientes.

Além disso, têm um potencial considerável na determinação do risco para o câncer, identificando grupos de indivíduos com alto risco, auxiliando no estabelecimento futuro de políticas de prevenção.

Uma das técnicas mais avançadas e atualmente utilizadas com grandes perspectivas de resultados é a dos micro-ordenamentos (microarrays).

Amostra de células 1 Amostra de células 2

Isolamento do RNA

Cy5Cy3Tintura fluorescente

Mistura do cDNA e aplicação no microarray

Chip de DNA

Hibridizaçãosob lamínula

Leitura em microscópio

DNA Microarray

- princípio é o mesmo da sonda de DNA, mas em forma miniaturizada e com uma potencial de detectar fragmentos específicos muito maior, da ordem de milhares ou dezenas de milhares de sequências de DNA ou RNA sobre uma pequena lâmina de 1 a 2 cm2 .

A figura mostra 50 genes que distinguem melhor a Leucemia Linfóide Aguda (LLA) da Leucemia Mielóide Aguda (LMA).

O painel superior mostra genes que se expressam mais na LLA e o painel inferior mostra os genes mais expressos na LMA.

Cada linha corresponde a um gene e as colunas os níveis de de expressão destes genes em diferentes amostras de pacientes.

Níveis maiores de expressão que a média são vermelhos e abaixo são azuis. As escalas indicam os desvios padrão acima e abaixo da média.

Aitman, 2001

Ex.- Diagnóstico da Leucemia Aguda - Perfil Expressão de 6817 genes

Aplicações dos microarrays

• Perfis de expressão gênica

• Genotipagem

• Sequenciamento de DNA

PCR

Extração do DNA de Leucócitos

Genotipagem do DNA

• O DNA genômico extraído de amostras biológicas (sangue, saliva) é amplificado por PCR e aplicado em microarray, sendo determinado o nível de expressão de milhares de biomarcadores.

• Apresenta grande potencial na determinação de risco, seja na pesquisa ou na prática clínica.

Sequenciamento do DNA

• O DNA extraído de amostras de sangue é amplificado e aplicado a microarrays específicos . Assim, bases de pares de DNA podem ser rastreadas para identificar mutações em genes específicos com sequencia normal já conhecida.

Determinação do perfil individual de expressão gênica

• O RNA extraído de amostras biológicas (sangue, saliva) é aplicado em microarray sendo determinado o nível de expressão individual de dezenas de milhares de genes (expressão ou assinatura gênica).

Registros de câncer hoje

• Coleta de dados clínicos

• Coleta de dados demográficos

• Coleta de dados epidemiológicos

Registros de câncer amanhã

• Coleta de dados clínicos

• Coleta de dados demográficos

• Coleta de dados epidemiológicos

• Planejamento e organização da coleta de amostras biológicas (sangue, saliva, amostras tumorais, etc.).

Parcerias interinstitucionais

• INCA, Universidades, Hospitais Câncer

• Centros de pesquisa básica (genética e biologia molecular).

• Centros de pesquisa clínica oncológica

• Centros de Anatomia Patológica

• Departamentos de Toxicologia

• Departamentos de Farmacologia

Atividades conjuntas• Participação conjunta na identificação, coleta,

processamento, armazenamento e posterior análise das amostras biológicas, a médio e longo prazo, em:

• estudos clinico-epidemiológicos

• estudos de sobrevida

• estudos geradores de hipóteses

• estudos etiológicos observacionais

• ensaios clínicos

Colaborações Científicas

• Sociedade Brasileira de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental

• Sociedade Brasileira de Genética

Perspectivas

• Ampliação da base científica atual de atuação dos registros de câncer de base hospitalar e de base populacional.

• Esta base será construída através do fortalecimento de uma cultura voltada para a integração e o estabelecimento de parcerias com as demais áreas envolvidas na pesquisa básica, clínica e epidemiológica do câncer no país.