enzimas: funções, nomenclatura e propriedades · pdf filesolomons, g., fryhle,...

FFI0772

ADRIANO D ANDRICOPULOADRIANO D ANDRICOPULOADRIANO D. ANDRICOPULOADRIANO D. ANDRICOPULORAFAEL V. C. GUIDORAFAEL V. C. GUIDO

Objetivos Gerais

� Enzimas: Funções, Nomenclatura e Propriedades� Fundamentos da Cinética Enzimática� Cinética Enzimática: Michaelis-Menten� Cinética Enzimática: Michaelis-Menten� Ensaios Cinéticos: Padronização e Validação� Parâmetros Cinéticos: vo, KM, Vmax, kcat, kcat/KM� Análise Gráfica: Lineweaver-Burk e Regresão Não-Linear� Inibição Enzimática� Tipos e Mecanismos de Inibição� Tipos e Mecanismos de Inibição� Determinação de IC50 e Ki� Exemplos de Inibidores Enzimáticos

BIBLIOGRAFIA

� Material didático das aulas� Bibliografia: livros de cinética enzimática, bioquímica,� Bibliografia: livros de cinética enzimática, bioquímica,

química orgânica e química medicinal

BIBLIOGRAFIA

� WILLIAMS, D.A., LEMKE, T.L. Foye's Priniples of Medicinal Chemistry, 5a edição,

BIBLIOGRAFIA

S, , , oye s p es o ed c a C e st y, 5a ed ção,Philadelphia, EUA: Lippincott Williams & Wilkins, 2002.

� PATRICK, G.L. An Introduction to Medicinal Chemistry, 2a edição, Nova Iorque, EUA: Oxford, 2001.

í ã� BARREIRO, E.J., FRAGA, C.A.M. Química Medicinal. As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos, Porto Alegre: Artmed, 2001.

� SOLOMONS, G., FRYHLE, C.B. Organic Chemistry, 7a edição, Nova Iorque, EUA: John Wiley & Sons 2000John Wiley & Sons, 2000.

� ALLINGER, N.L., CAVA, M.P., JONGH, D.C., C.R. JOHNSON, C.R., LEBEL, N.A., STEVENS, C.L. Química Orgânica, 2a edição, Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1978.

� SILVERMAN, R.B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, San Diego, S , e O ga c C e st y o ug es g a d ug ct o , Sa ego,EUA: Academic Press, 1992.

� LEHNINGER, A.L., Bioquímica, 2.ed., São Paulo, Editora Edgard Blücher, 1976.� STRYER, L., Bioquímica, 3ªed., Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 1992.� JENCKS, W. Catalysis in Chemistry and Enzymology –– Dover Pub.1987.� FERSHT, Enzyme Structure and Mechanism. San Francisco, W. H. Freeman and

Company, 1977.

ENZIMASENZIMASENZIMAS E INIBIDORES ENZIMÁTICOSENZIMAS E INIBIDORES ENZIMÁTICOS

Por Quê?

11

ENZIMAS COMOENZIMAS COMOALVOS BIOLÓGICOS

“Druggable Genome” “Genoma com Potencial de Fármaco”

ALVOS MOLECULARES

As proteínas são fundamentais para a vida

ÍENTIDADES QUÍMICAS

SildenafilSildenafil

O QUE HÁ EM COMUM ENTRE

SÃO INIBIDORES ENZIMÁTICOS

� o fármaco mais vendido

� o fármaco mais consumido

� o fármaco mais “popular”

22� o fármaco mais popular

da indústria farmacêutica em todos os tempos?da indústria farmacêutica em todos os tempos?

O M i V didO Mais Vendido

Atorvastatina

Ato astatinaAtorvastatina

O M i C idO Mais Consumido

Ácido Acetilsalicílico

Ácido AcetilsalicílicoÁcido Acetilsalicílico

Seletividade

ESTRUTURASESTRUTURASCOX-1 e COX-2

Valina(Cox-2)

Isoleucina(Cox-1)

O M i P lO Mais Popular

SildenafilaSildenafila

Sild filSildenafila

ESPAÇO QUÍMICO BIOLÓGICOESPAÇO QUÍMICO-BIOLÓGICO

ENZIMAS

Enzimas são consideradas por muitos laboratóriosEnzimas são consideradas por muitos laboratórios farmacêuticos os alvos moleculares mais atrativos para intervenção de doenças humanas através de moléculas pequenaspequenas

Isso se deve ao seu papel catalítico essencial em muitos fi i ló i f di d dprocessos fisiológicos que afetam diretamente estados de

desordens, disfunções ou doenças

ENZIMAS

Os fatores determinantes para a catálise enzimática se aplicam apropriadamente na inibição através de moléculas pequenas (candidatas a novos fármacos)

O estudo da inibição enzimática passa essencialmente pelo entendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvoentendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvo

ENZIMAS

Projetos de descoberta de fármacos, comumente, se beneficiam da avaliação in vitro de moléculas contra enzimas-alvo

Parâmetros como afinidade, potência e seletividade podem ser quantificados a partir de ensaios in vitroquantificados a partir de ensaios in vitro

ENZIMAS

A i â i d i bi ló i d l d lid d éA importância de ensaios biológicos de elevada qualidade é evidente neste processo

Fase farmacodinâmica X fase farmacocinética X Atividade Biológica X Efeito Terapêutico

ENZIMAS

Transformações metabólicas de xenobióticos, incluindo a maioria dos fármacos, são catalisadas por enzimas

Interações com enzimas metabólicas da família do citocromoInterações com enzimas metabólicas da família do citocromo P450 (CYP) – otimização de propriedades farmacocinéticas essenciais

ENZIMAS

D t f é i t t i d t hDesta forma, é importante que o pesquisador tenha um conhecimento sólido da atividade enzimática e das maneiras apropriadas de avaliar as interações entre enzimas e inibidores

ENZIMAS

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAReações Catalíticas

Esquema de reação química catalisada por uma enzima


As enzimas não alteram a energia livre de Gibbs (�G) das reações e exercem seu poder catalítico através da diminuição da energia de ativação dos sistemas (�G‡)

CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAProximidade e Orientação

ENZIMAENZIMA

� As moléculas devem se aproximar, estar na orientação correta, e alcançar o patamar mínimo de energia para iniciar a reação

� As enzimas catalisam reações, eliminando o caráter randômico dasreações

CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAProximidade e Orientação

ENZIMA

PRODUTO

ENZIMAENZIMAENZIMA

PROXIMIDADE: as enzimas se ligam aos substratos de forma que seus grupos reativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer Estereativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer. Este processo elimina a natureza randômica das colisões em soluções livres

ORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de formaORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de forma randômica, seus grupos reativos podem não estar necessariamente na orientação correta que permita a reação ocorrer

ENZIMASENZIMASAtividade Catalítica

COFATORES

ENZIMASENZIMASAtividade Catalítica

A atividade catalítica depende muitas vezes da presença de moléculas pequenas denominadas cofatores

Apoenzima + cofator = holoenzima

Sem Cofatorou Ligante

MoléculasOrgânicas

Coenzimas

GruposProstéticosProstéticos

CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações

A cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas porA cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas por enzimas

As reações enzimáticas diferem das outras reações químicas em vários aspectos


(i) As velocidades de reação são mais elevadas: uma reação catalisada por um enzima pode ser 106 a 1017 vezes mais rápida que uma reação não catalisada, e á d d d á d ã l dvárias ordens de grandeza mais rápida que uma reação catalisada por um

catalisador inorgânico.

(ii) Condições de reação mais suaves: as reações catalisadas por enzimas ocorrem em condições relativamente suaves – temperaturas baixas, pressão atmosférica, e pH próximos da neutralidadee pH próximos da neutralidade.

(iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações(iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações catalisadas.


Muitas reações nos sistemas biológicos não ocorreriam em proporções mensuráveis naç g p p çausência de enzimas. As enzimas aceleram as reações por fatores na ordem dos milhões


Catálise Química

Exemplo: hidrogenação com catalisador de carvão-paládio

CH3H3C+ H2

CH3CH3

H3CH3CPd/C

CH3H3C 2HH


Ação do catalisador de paládio sobre carvãoAção do catalisador de paládio sobre carvão

H H H H HH

CH3H3CCH3H3C

H H H H HH

Superfície de paládio Superfície de paládio Superfície de paládio

CH3H3CCH3

CH3

H3CH3C

HHCH3H3C

HH

Superfície de paládioSuperfície de paládio


Produtos

Catálise Enzimática

Produtos

Sítio ativo

Ligação do substrato nosítio ativo da enzimaSubstrato

Sítio ativo

ENZIMA E • S E • P E + PENZIMA E S E P E + P


O sítio ativo de uma enzima

Aminoácidos presentes no sítio ativo podem ter dois papéis principais:

Ligação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação doLigação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação do substrato ao sítio ativo

Catalítico (catalytic): o aminoácido está envolvido diretamente no mecanismo de reação

Lei de Beer-Lambert:

constanteabsorbância

(��fixo)

=

(para um ��fixo)

A� ��c.l distância percorridapelo feixe luminoso

concentraçãoda solução

patravés da amostra

da solução absorvente

A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendoconstantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso econstantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso edemais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica econcentração

Onde: � = absorbtividade molar ou coeficiente de extinção molar, uma constante característica para uma dada substância absorvente.Para o NADH a 340 nm, � = 6200 L mol-1 cm-1 (ou M-1 cm-1)

c = concentração de NADH em mol/Ll = comprimento da amostra em cm (usual 1 cm para cubetas padrões)

A intensidade I do feixe diminui a medida que passa pela amostra

Amostra emsolução

MonocromadorFonte de luz com comprimento de onda

1 cm Detectorcomprimento de ondaselecionável

IIo Io

ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICADefinições e Fundamentos

1,0 unidade de atividade enzimática (enzyme unit, U ou EU) é definidacomo a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6

M) de substrato por minuto (250C, condições padrões de ensaio) (U = μmolmin-1). A atividade se refere ao total de unidades de enzima em solução.

A atividade específica é o número de unidades de enzima por mg total dep p gproteína. A atividade específica é uma medida da pureza da enzima, eaumenta de acordo com a evolução do processo de purificação de umaenzima e torna-se máximo e constante quando a enzima estáenzima e torna se máximo e constante quando a enzima estácompletamente pura.

ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICADefinições e Fundamentos

d d á d d d / l d l ã� Atividade enzimática = unidades de enzima / volume de solução (e.g., units / mL)

� Ati id d E ífi id d d i / t t l d t í� Atividade Específica = unidades de enzima / mg total de proteína

� A atividade específica de uma solução de enzima depende diretamente da sua purezasua pureza

A atividade específica aumenta durante o processo de purificação alcançando umA atividade específica aumenta durante o processo de purificação, alcançando um máximo quando a enzima estiver totalmente pura e ativa

ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICAAtividade Enzimática versus Atividade Específica

Mesma atividade total da enzima (em vermelho)

Maior especificidade (em vermelho)

Atividade Específica = atividade enzimática / total de proteína. Ou seja, mols convertidos por unidade de tempo por massa de proteína.

A ti id d ífi t d t d ifi ã l d á i

Atividade enzimática = mols convertidos por unidade de tempo

A atividade específica aumenta durante o processo de purificação, alcançando seu máximo quando E = 100% pura e ativa

É a própria atividade catalítica da enzima, em geral expressa em unidades de velocidade, ou seja, massa transformada por unidade de tempo (μmol min-1)

ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICAAtividade Enzimática versus Atividade Específica

66 KDa

45 KDa

30 KDa

22 KDa

Proteína Pura

13 KDa

Sucessivas etapas de purificação geralmente diminuem o total de proteína. Uma proteína pode ser considerada pura quando etapas adicionais de purificação não p p p q p p çmelhoram a atividade específica e quando somente uma espécie de proteína pura pode ser detectada.

ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICADefinições

A atividade enzimática é uma função da quantidade de enzimaá(unidade prática, 1 EU = 1 μmol min-1) (SI, 1 katal = mol s-1)

Atividade Específica = atividade enzimática / massa total de enzima presente(unidade prática μmol mg-1 min-1 ou μmol μg-1 min-1)(unidade prática, μmol mg 1 min 1 ou μmol μg 1 min 1)

A atividade enzimática é uma medida da eficiência, usualmente constante para um enzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostraenzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostra impura da enzima deverá apresentar atividade específica menor, permitindo o cálculo da pureza

í í% pureza = 100% x atividade específica da amostra de enzima / atividade específica da enzima pura

enzimas: funções, nomenclatura e propriedades · pdf filesolomons, g., fryhle,...

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