MONITORIABIOQUIMICA

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EnzimasUniversidade Federal do Maranhão

Introdução

A manutenção da vida celular depende de um complexo conjunto de reações químicas, que:

Devem ocorrer em velocidades adequadas;

Precisam de ser altamente específicas.

A presença de enzimas dirigindo as reações celulares atende a esses quesitos.

Introdução

As enzimas são catalisadores biológicos e como tal aumentam de várias ordens de grandeza a velocidade das reações que catalisam.

Até recentemente admitia-se que todos os catalisadores biológicos fossem proteicos, mas a revelação das ribozimas, constituídas de moléculas específicas de RNA, desfez esse conceito.

Introdução

O aumento na velocidade da reação de 3 fatores principais:

Aumento na concentração de reagentes;

Aumento da temperatura do meio;

Diminuição da energia livre de ativação.

Catalisadores biológicosPodem ser potencialmente

tóxicos às células

Introdução

A eficiência dos catalisadores biológicos de muito deriva de sua especificidade, graças à:

Forma do sítio ativo ou centro ativo;

Cadeia lateral dos aminoácidos desse sítio ativo ou centro ativo.

Introdução

A relação substrato-enzima é explicada por várias teorias:

Teoria de Fischer, que propõe o modelo chave-fechadura, onde enzima e substrato seriam complementares num modelo extático.

Teoria de Koshland, que propõe o modelo de encaixe induzido, onde o substrato se encaixa na enzima durante a catálise num modelo dinâmico.

Introdução

Assim, existem 4 vantagens dos catalisadores biológicos sobre os catalisadores inorgânicos:

Diminuição da energia de ativação e indução de altas velocidades de reação;

Alta especificidade;

Sintetizados pelas próprias células;

Concentração e atividade moduláveis.

Caracterização da Urease

A urease é o catalisador biológico responsável pela conversão da ureia em amônia e dióxido de carbono:

Essa enzima é encontrada em bactérias, fungos e plantas.

Caracterização da UreaseReação de Biureto

A reação de biureto serve para a demonstração da natureza proteica da urease, conforme se espera da maioria dos catalisadores biológicos.

Reagente de biureto: volumes iguais de NaOH a 12M e solução de CuSO4 a 0,5% gota a gota.

❖ Fundamento teórico: quando a urease - que é proteína - é colocada na presença de reagente de biureto, obtém-se um composto de coloração violeta pela interação dos átomos de nitrogênio dos resíduos de aminoácidos da urease com íons Cu2+ disponibilizados pelo CuSO4 do reagente de biureto.

Caracterização da UreaseReação de Heller

A reação de Heller serve para a demonstração da natureza proteica da urease, conforme se espera da maioria dos catalisadores biológicos.

Ácido nítrico

❖ Fundamento teórico: o ácido nítrico é um bom fornecedor de ânions, de forma que suas interações com a urease, que é uma proteína, a provocam a formação de um sal onde a urease atua como cátions.

Reação de Biureto

Procedimentos Práticos

2mL de águadestilada

2 gotas desolução de

urease

2mL de reagentede biureto

2mL de águadestilada2mL de reagente

de biureto

Procedimentos PráticosReação de Biureto

❖ No tubo de ensaio com solução de urease espera-se a formação de coloração violeta.

❖ No tubo de ensaio com água destilada espera-se a não mudança de cor.

A reação de biureto deverá ser positiva para a solução de urease, que é uma proteína; em contrapartida, não deve haver reação com água destilada (controle negativo).

Procedimentos PráticosReação de Heller

❖ Ao colocar o acido nítrico, cuidar para que ele escorra lentamente pela parede do tubo.

1mL de ácidonítrico

4 gotas desolução de

urease

2mL de águadestilada

Procedimentos PráticosReação de Heller

❖ Espera-se o surgimento de um anel branco entre a soluão de urease e o ácido nítrico.

A formação nativa de uma proteínas é estável apenas numa faixa estreita de valores de pH, uma vez que em determinados valores de pH onde há excesso de cargas positivas, as repulsões coulombianas correspondentes concorrem para desestabilizar a estrutura compacta da proteína. Assim, na reação de Heller, a partir de tratamento com ácido nítrico, induz-se alteração na carga líquida de proteínas e consequente precipitação, onde o ácido nítrico atua como fornecedor de ânions e as proteínas atuam como fornecedor de cátion.

PolifenoloxidaseA polifenoloxidase ou monofenol monoxigenase é um catalisador biológico pertencente ao grupo das oxirredutases, responsáveis por reações de oxirredução em sistemas biológicos.

A polifenoloxidase é responsável pelo escurecimento enzimá-tico de frutas e demais vegetais quando cortados e expostos.

TEMPO

Cada espécime de plantas, fungos, bactérias e animais pode possuir pequenas variações em suas polifenoloxidases.

A polifenoloxidase é o único catalisador biológico necessário para a conversão do aminoácido tirosina em melanina, susbtância de coloração preta; as demais etapas são espontâ-neas.

Polifenoloxidase

Estrutura 3D dapolifenoloxidaseda batata-doce

Polifenoloxidase

Tirosina

Devagar

Polifenoloxidase

DOPA-quinonaDOPA

Devagar Rápido

Relativamentedevagar

Leuco--composto

DOPAcromo5,6-dihidroxindol

Melanina

Indol-5,6-quinona

Escurecimento Enzimático de Alimentos

O escurecimento enzimático de alimentos serve para a demonstração da ação de polifenoloxidases presentes em diversos frutos, notadamente os de polpa de coloração mais clara.

❖ Fundamento teórico: frutas e vegetais, que contêmm compostos polifenólicos, quando cortados e expostos ao ar atmosférico, sofrem escurecimento, causado pela ação da polifenoloxidase sobre esses compostos polifenólicos, que são então oxidados a ortoquinonas. Por sua vez, essas ortoquinonas polimerizam-se com facilidade, formando compostos escuros, como a melanina.

Procedimentos PráticosCortar em vários pedaços

(longe do miolo)

1 PEDAÇO NO REFRIGERADOR

AOS DEMAIS, 2 GOTAS DE LIMÃO

EM TEMPERATURA AMBIENTE

1 PEDAÇO À TEMPERATURA AMBIENTE

hora

❖ Espera-se que os pedaços de maçã e batata-doce que permaneceram à temperatura ambiente tenham a polpa mais escurecida.

❖ Os pedaços de maçã e batata-doce que permaneceram no refrigerado e à temperatura ambiente com adição de duas gotas de limão devem ter escassa ou nenhuma polpa escurecida, permanecendo aproximadamente como dantes.

Os pedaços de maçã e batata doce que permaneceram à temperatura ambiente tiveram melhor cinética das suas polifenoloxidases, com conversão de tirosina em melanina e consequente aquisição de coloração mais escura em polpa. Já aqueles pedaços encaminhados ao refrigerador e expostos ao limão tiveram cinética comprometida pelo menor temperatura e pelo contato com vitamina C, respectivamente - dois retardadores dos processos de oxidação.

Procedimentos Práticos

Referências

HIRANO, ZMB et al. Bioquímica - Manual Prático. 1 ed. Blumenau: Edifurb, 2008.

DOS SANTOS, APSA et al. Bioquímica Prática. Disponível em: <http://www.repositorio.ufma.br:8080/jspui/handle/1/445>. Acesso em: 3 set 2013.