ENSAIOS ESTEREOLGICOS E MORFOLOGIA TRIDIMENSIONAL NA FORMAO HIPOCAMPAL DE AVES MIGRATRIAS MARINHAS: Anlise quantitativa da imunomarcao seletiva de neurnios e micrglia em Calidris pusilla e Actitis macularia.

CRISTOVAM GUERREIRO DINIZ

Belm 2013

CRISTOVAM GUERREIRO DINIZ

ENSAIOS ESTEREOLGICOS E MORFOLOGIA TRIDIMENSIONAL NA FORMAO HIPOCAMPAL DE AVES MIGRATRIAS MARINHAS: Anlise quantitativa da imunomarcao seletiva de neurnios e micrglia em Calidris pusilla e Actitis macularia.

Tese de doutoramento apresentada ao Programa de Ps-graduao em Neurocincias e Biologia Celular do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Par, como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em Neurocincias e Biologia Celular. rea de concentrao em Neurocincias Orientador: Prof. Dr. Cristovam Wanderley Picano Diniz. Co-Orientador: Prof. Dr. David Francis Sherry

Belm 2013

ENSAIOS ESTEREOLGICOS E MORFOLOGIA TRIDIMENSIONAL NA FORMAO HIPOCAMPAL DE AVES MIGRATRIAS MARINHAS: Anlise quantitativa da imunomarcao seletiva de neurnios e micrglia em Calidris pusilla e Actitis macularia. Cristovam Guerreiro Diniz. Belm, Par, UFPA/ICB, 2013.

Tese de doutoramento aprovada como

requisito parcial para obteno do grau de Doutor em

Neurocincias, Programa de Ps-graduao em

Neurocincias e Biologia Celular (rea de

concentrao Neurofisiologia), Universidade Federal

do Par, pela Comisso Examinadora formada pelos

professores:

Presidente:

Professor Dr. Cristovam Wanderley Picano Diniz - Orientador

Instituto de Cincias Biolgicas, UFPA

Membros:

Professor Dr. Ruben Carlos Arajo Guedes

Departamento de Nutrio UFPE

Professora Dra. Lucidia Fonseca Santiago Instituto de Cincias Biolgicas, UFPA

Professora Dra. Luciana Negro Frota de Almeida Instituto de Cincias Biolgicas, UFPA

RESUMO

objetivo do presente trabalho implantar como modelos para estudo da formao hipocampal das aves migratrias as espcies de maarico Calidris pusilla e Actitis macularia que abandonam as regies geladas do Canad, fugindo do inverno, em direo costa da Amrica do Sul e do Caribe onde permanecem at a primavera quando ento retornam ao hemisfrio norte. Mais especificamente pretende-se descrever a organizao morfolgica qualitativa e quantitativa da formao hipocampal, empregando citoarquitetonia com cresil violeta e imunomarcao para neurnios e clulas da glia, sucedidas por estimativas estereolgicas do nmero total de clulas identificadas com marcadores seletivos para aquelas clulas, assim como comparar a morfologia tridimensional da micrglia das aves com a dos mamferos. As coletas de campo para a caracterizao da formao hipocampal do Calidris pusilla e Actitis macularia em seus aspectos morfolgicos foram feitas no Brasil na Ilha Canelas (047'21.95"S e 4643'7.34"W) na Costa da Regio Nordeste do Par no municpio de Bragana, e no Canad, na Baia de Fundy perto de Johnson's Mills na cidade de New Brunswick (4550'19.3" N 6431'5.39" W).

A definio dos limites da formao hipocampal foi feita empregando-se as tcnicas de Nissl e de imunomarcao para NeuN. Para a definio dos objetos de interesse das estimativas estereolgicas e das reconstrues tridimensionais empregou-se imunomarcao com anticorpo anti-NeuN para neurnios e anti-IBA-1 para micrglia. As estimativas estereolgicas revelaram em mdia nmero similar de neurnios nas duas espcies enquanto que no hipocampo de Actitis macularia observou-se nmero de micrglias 37% maior do que no de Calidris pusilla. Alm disso, encontrou-se que em mdia o volume da formao hipocampal do Actitis macularia 38% maior do que o encontrado em Calidris pusilla.

Os estudos comparativos da morfologia microglial das duas espcies de aves com a dos mamferos Rattus novergicus e Cebus apella revelaram diferenas morfolgicas significantes que indicam que as micrglias das aves mostram em mdia, menor complexidade (dimenso fractal), tem dimetros e permetros de soma menores e possuem ramos mais finos do que aquelas do rato e do macaco.

Palavras Chave: morfometria, estereologia, hipocampo e aves.

ABSTRACT

The aim of this report is to describe the hippocampal formation of two

migratory birds, Calidris pusilla and Actitis macularia, that leave the cold regions of

the Canadian Tundra, escaping the winter, towards the coast of South America and

the Caribbean Islands where they remain until winter ends returning to the Northern

hemisphere. We intend to describe the qualitative and quantitative morphological

organization of the hippocampal formation, using cytoarchitetonics with cresyl violet

and immunostaining for neurons and microglia, followed by stereological estimates

of the total number of cells identified with selective markers. We intend as well to

compare the three-dimensional morphology of hippocampal microglia of these

species with those of the dentate gyrus of Wistar rats and Capuchin monkey. The

shorebirds used in the characterization were captured in Canela Island, Bragana

City, State of Par, Brazil (047'21.95"S and 4643'7.34"W), as well as in Canada,

in the Bay of Fundy, near Johnson's Mills, New Brunswick (45 50' 19.3" N 64

31' 5.39" W).

The hippocampal formation limits definition was performed employing Nissl

staining and immunostaining for NeuN. For the objects of interest definition of

stereological estimates and three-dimensional reconstructions we used

immunostaining with anti NeuN for neurons and anti-IBA-1 for microglia respectively.

The stereological results revealed similar number of neurons in both species

whereas the number of microglia in Actitis macularia was 37% higher than in Calidris

pusilla. Furthermore, it was found that the hipocampal formation average volume in

Actitis macularia was 38% higher than that found in Calidris pusilla. Comparative

studies of the microglial morphology with mammals (Rattus novergicus and Cebus

apella) revealed significant morphological differences that indicate microglia in birds

shows on average lower complexity (smaller fractal dimension), smaller tree

volumes and areas and thinner branches than rat and monkey microglia.

SUMRIO Sumrio ................................................................................................................... 1 1- INTRODUO .................................................................................................... 8

1.1- Os Modelos Experimentais ........................................................................... 8 1.2- Memria e Formao Hipocampal .............................................................. 14 1.3- Anatomia e Fisiologia Comparadas da Formao Hipocampal em Mamferos e Aves .............................................................................................. 19 1.4- O Hipocampo das Aves, Plasticidade e Memria ....................................... 23 1.5 - Aves Migratrias e o Sistema Neural de Navegao................................. 26 1.6- Estereologia Baseada em Design para Contagem de Clulas: O Fracionador ptico ............................................................................................ 29 1.7- Morfologias das Clulas Gliais em Aves e Mamferos ................................ 31

2- OBJETIVOS ...................................................................................................... 39 2.1- Geral ........................................................................................................... 39 2.2- Especficos ................................................................................................. 39

3- Material e Mtodos ............................................................................................ 40 3.1- Captura com Redes de Neblina .................................................................. 40 3.2- Perfuso, Corte, Colorao e Imunohistoqumica ...................................... 40

3.2.1- Colorao de Nissl ............................................................................... 41 3.2.2- Imunomarcao para GFAP, Neu-N, IBA1, ZENK e C-Fos ................. 41

3.3- Estereologia ................................................................................................ 43 3.4- Anlise Estatstica ...................................................................................... 49 3.5 Morfometria Baseada em Reconstruo Tridimensional ............................. 50

4- RESULTADOS .................................................................................................. 57 4.1- Descrio da Formao Hipocampal em Calidris pusilla e Actitis macularia ........................................................................................................................... 58 4.2 Ensaios Estereolgicos ............................................................................. 61 4.4- Anlise Comparativa da Morfologia da Micrglia da Camada Molecular do Giro Denteado de Mamferos e do Hipocampo Dorsal e Ventral de Aves Marinhas ............................................................................................................ 68

5- DISCUSSO ..................................................................................................... 83 5.1- Limites Arquitetnicos ................................................................................. 84 5.2- Ensaios Estereolgicos na Formao Hipocampal de Aves: Efeitos do ambiente sobre a plasticidade neuronal e glial. ................................................. 86

5.3- Morfologia Tridimensional da Micrglia no Hipocampo Dorsal e Ventral de Maaricos e na Camada Molecular do Giro Denteado de Mamferos. .............. 91 5.4- Limitaes Tcnicas ................................................................................... 93

5.4.1 Ambiguidades no Estereolgicas nas Estimativas ........................... 93 5.4.2 Limitaes nas Reconstrues Tridimensionais ................................... 94

6- CONCLUSES ................................................................................................. 96 7- REFERNCIAS ................................................................................................. 97

8

1- INTRODUO

1.1- Os Modelos Experimentais Englobando os maaricos, baturas, quero-quero, narcejas, pirupirus e

outras, a expresso "aves limcolas" define um grupo de aves que mantm estreitas

relaes com ambientes midos, seja para buscar alimento, reproduo ou

descanso (Rodrigues, 1993).

Com a proximidade do outono boreal, milhes de aves deixam suas reas de

reproduo todos os anos, em busca de locais com temperaturas mais amenas e

com disponibilidade de alimento, rea essa escolhida para passar o perodo do

inverno (da serem referidas como reas de invernada). Dentre as reas de

invernada esto aquelas da Amrica do Sul onde alguns dos exemplares utilizados

neste trabalho foram coletados. Assim a migrao segue a direo Sul sendo a

Amrica do Sul alvo sistemtico dessas aves (Azevedo Jnior et al., 2001),

principalmente ao longo da costa martima do continente onde passam a maior parte

do seu ciclo de vida (Antas, 1983). Durante a primavera e o vero retornam s reas

de origem, (Harrington et al., 1986) havendo muitas delas com migraes sazonais

regulares que retornam aos mesmos locais de invernada, reproduo e stios de

parada durante a migrao, em anos sucessivos, mantendo fidelidade a esses

habitats (Hansson et al., 2002).

O Brasil est na rota de muitas espcies de aves migratrias, tanto de

visitantes meridionais, aves Neotropicais, que se reproduzem em reas do

hemisfrio sul, como setentrionais, aves Nerticas, que se reproduzem no

hemisfrio norte (Azevedo-Jnior, 1998). Dentre os deslocamentos de aves no

Brasil, destacam-se as migraes no inverno do hemisfrio Norte (inverno boreal) e

no inverno do hemisfrio Sul (inverno austral) (Sick, 1997). As migraes em direo

ao Hemisfrio Sul comeam em meados de agosto, logo aps a reproduo,

continuando at meados de novembro com o regresso ao Hemisfrio Norte

abrangendo o perodo de fevereiro at meados de maio (Rodrigues, 2006).

9

A Regio Norte do Brasil a porta de entrada dos migrantes setentrionais no

pas (Azevedo-Jnior, 1998); so centenas e at milhares de indivduos que chegam

e utilizam essas reas para pouso e alimentao, logo aps o perodo reprodutivo

(Sick, 1997). Dessa forma, a Amaznia e as zonas costeiras da Regio Norte e

Nordeste so locais com muitos registros de espcies migratrias do hemisfrio

norte. Foram registradas cerca de 40 espcies pertencentes s famlias Jacanidae,

Rostratulidae, Haematopodidae, Charadriidae, Scolopacidae, Recurvirostridae,

Burhinidae e Laridae, que vm procura de locais de invernada onde encontram

alimentao farta, propiciando a garantia de engorda, adquirindo, dessa forma,

energia suficiente para efetuar as mudas e retornar ao seu stio de reproduo no

hemisfrio norte (Azevedo Jnior et al., 2001)

Os habitats selecionados pelas aves migratrias ao longo de suas rotas so

diversos e esto relacionados aos hbitos alimentares, disponibilidade de recursos

e tticas de forrageamento. Devido distribuio descontnua desses recursos, as

espcies migrantes geralmente se concentram em reas especficas. Esses locais

tm importncia fundamental para conservao dessas espcies, uma vez que, ao

realizarem grandes migraes, elas necessitam de reas chave para trocarem as

penas, se alimentarem e adquirir as reservas energticas necessrias

continuao das longas viagens (Myers et al., 1985; Morrison e Ross, 1989).

No Brasil destacam-se: ao Norte - o salgado paraense, a costa do Amap e

reentrncias maranhenses; no Nordeste a costa do Rio Grande do Norte,

Pernambuco, Sergipe e Bahia; e ao Sul a regio do Parque Nacional da Lagoa do

PeixeRS.

As famlias Charadriidae e Scolopacidae correspondem ao grupo de aves

com a maior representatividade de espcies migrantes setentrionais, que se

caracterizam pela reunio em grandes agrupamentos e realizao de longas

jornadas continentais, algumas vezes deslocando-se para pontos extremos do

continente americano. Em sua maioria, deslocam-se acompanhando regies

costeiras, onde so encontrados stios com grandes concentraes de indivduos.

(Sick, 1983; Antas, 1989; Sick, 1997; Azevedo-Jnior, 1998; Rodrigues, 2000;

10

Larrazbal et al., 2002; Telino-Jnior et al., 2003; Lyra-Neves et al., 2004;

Rodrigues, A. a. F., 2006). Estudos anteriores indicaram que as populaes de

maaricos que chegam a costa Norte tendem a se distribuir em uma faixa litornea

que se estende desde a Venezuela at o Brasil (Mcneil, 1970; Spaans, 1978;

Rodrigues, 1996).

Anualmente vrias espcies de pssaros migrantes setentrionais ocupam a

pennsula Bragantina ao Nordeste do Par, onde so encontradas principalmente

em reas de manguezal, dentre as quais o maarico do peito pintado Actitis

macularia. Essa espcie pertencente famlia Scolopacidae uma ave limcola de

pequeno porte, 18-20 cm de comprimento e pesando de 19-64 g, que juntamente

com a sua espcie-irm, a Actitis hypoleucos compem o gnero Actitis (Figura 01).

Seu habitat de reproduo perto de gua doce na maior parte do Canad e dos

Estados Unidos. Eles migram para o sul dos Estados Unidos e Amrica do Sul, e

raramente para a Europa Ocidental. Esta ltima espcie no gregria e raramente

vista em bandos.

Os adultos da espcie Actitis macularia possuem pernas curtas e amareladas

e um bico laranja com a ponta escura. Apresenta duas plumagens, de descanso

reprodutivo ou eclipse: manto castanho-acinzentado e ventre branco; e reprodutiva:

castanho no dorso salpicado de preto no ventre. Seu ninho encontrado no cho.

Figura 01: Maarico pintado (Actitis macularia) Parque Bluffer em Toronto, Canada, 2005. A esquerda plumagem no reprodutiva e a direita plumagem reprodutiva (Wikipedia, 2005).

11

As fmeas podem copular com mais de um macho, deixando a incubao para eles

e aumentando, assim, o nmero de ovos a eclodir em uma nica temporada

reprodutiva.

Essas aves forrageiam no solo ou gua atrs de crustceos e outros

invertebrados, mas tambm podem apanhar insetos em pleno voo. Ao alimentarem-

se, elas podem ser reconhecidas pelo balano corporal e por movimento de

elevao da cauda enquanto anda a procura de suas presas na praia (Del Hoyo et

al., 1992). Para encontrar alimento, refgio, parceiros sexuais ou locais de

nidificao os pssaros convivem com diversas mudanas ambientais e de

sazonalidade.

Aparentemente o padro de migrao dessa espcie em direo Norte para

o perodo de reproduo diferente do da direo Sul para o perodo de invernada.

De fato as rotas transocenica (da Nova Inglaterra para Amrica do Sul) e

continental atravs dos EUA so adotadas alternativamente para o perodo de

invernada enquanto que a migrao em direo Norte para o perodo de reproduo

evita a rota transocenica sendo realizada integralmente atravs do Continente

Americano (Del Hoyo et al., 1992).

Figura 02. Maariquinho rasteiro (Calidris pusila) em Cobourg, Ontario, Canada, Agosto de 2006 (Wikipedia, 2006).

12

O maarico-rasteirinho (Calidris pusilla) uma espcie de ave pequena, porm

robusta, de bico grosso, negro e de ponta alargada (Figura 02), semelhana de

vrios congneres, excetuando-se a espcie Calidris canutus (Sick, 1997).

Pertencem famlia Scolopacidae que possui um total de 89 espcies, encontradas

em reas costeiras e alagadas, espalhadas por todo o globo (Figura 03). A famlia

Scolopacidae parece ter um ancestral bioqumico comum de onde derivou-se de

evoluo explosiva durante o perodo tercirio, aps uma grande onda de extino

acontecida no final do perodo Cretceo (Piersma, 1996).

Maaricos reproduzem apenas na Tundra rtica superior, mas se deslocam

ao sul de sua rea de reproduo na disjuno circumpolar para reas no

reprodutivas (de invernada) em todos os continentes (menos o Antrtico), entre as

latitudes 58 N e 53 S (Figura 03). Maaricos geralmente se alimentam em reas

costeiras que sofrem influncias de mars (do ingls intertidal areas), de substrato

mole. Como consequncia as reas de alimentao so pouco numerosas e muito

distantes umas das outras, obrigando-os a realizar voos de muitos milhares de

quilmetros rotineiramente. As maiores taxas de forrageamento ocorrem nos locais

mais ao norte antes do voo definitivo para a reproduo na tundra (Piersma et al.,

2005).

Figura 03. Legenda Distribuio pontos amarelos ocorrncia Scolopacidae (G.B.I.F., 2008).

13

Fortemente territorialistas, os machos defendem ativamente seus territrios

por exibio em voos, nos quais planam vocalizando em alturas variveis

frequentemente por vrios minutos (Pitelka et al., 1974).

Com relao ao sistema de pareamento, durante o perodo reprodutivo,

machos e fmeas formam pares monogmicos que se mantm durante todo o

perodo de incubao dos ovos e que realizada por ambos os sexos (Ashkenazie

e Safriel, 1979).

Observa-se somente um leve dimorfismo sexual nesta espcie, sendo as

fmeas maiores do que os machos, sem diferena de colorao significante e sem

a presena de caracteres sexuais secundrios conspcuos (Prater, 1977).

Diferente do Actitis macularia, o Calidris pusilla um pssaro migratrio de

longa distncia percorrendo s vezes, em voos ininterruptos cerca de 4000 km, em

busca de seus stios preferenciais de invernada (Morrison, 1984).

Orientao espacial e memria so, portanto, habilidades essenciais para

lidar com essas demandas dos pssaros migratrios e estudos anteriores indicam

um papel crucial do hipocampo na consolidao da memria espacial de aves e

mamferos e.g. (O'keefe e Dostrovsky, 1971; Sherry, 2011). Presume-se que o

hipocampo das aves possa conter como nos mamferos, um 'mapa cognitivo', que

fornece uma representao do animal em relao ao ambiente (Sallaz et al., 2000).

Muito poucas espcies migratrias foram objeto de investigao

neurobiolgica detalhada e muitos aspectos dos mecanismos envolvidos com o

processo migratrio permanecem obscuros. Essa jornada anual que essas espcies

empreendem depende de orientao precisa, reconhecimento de pistas visuo-

espaciais e avaliao de distncias ao longo da viagem intercontinental que esto

longe de serem compreendidas em suas bases neurobiolgicas.

De fato, quando se constata que sequer foram descritas em detalhe as

estruturas relacionadas formao e recuperao de memrias em muitas das

espcies migratrias, torna-se importante empreender esforos para o

preenchimento dessa lacuna. No que concerne formao hipocampal, uma das

reas de cuja integridade depende a consolidao de memrias relacionadas

14

navegao em grande e pequena escala, tanto em aves (Bingman et al., 2006;

Sherry, 2011), quanto em mamferos (Leuner et al., 2010; Buzski e Moser, 2013),

nada foi anteriormente descrito em maaricos migradores, motivo pelo qual se

empreendeu o presente projeto.

1.2- Memria e Formao Hipocampal

A memria entendida como a capacidade de adquirir, armazenar e

recuperar informaes que permitem responder a pelo menos trs das perguntas

essenciais para sobrevivncia adaptada ao meio ambiente que partilham. Assim, as

tarefas relacionadas reproduo, busca de alimento e o reconhecimento de

predadores depende da habilidade de se identificar o que ? Onde est? E quando?

Para que isso seja possvel, a formao hipocampal e o cerebelo precisam ser

preservados ntegros garantindo a formao das memrias declarativa e procedural

respectivamente (Okano et al., 2000).

Quando nos referimos memria declarativa episdica humana falamos da

capacidade de lembrarmos conscientemente, empregando a linguagem como

instrumento, e falamos de memria semelhante episdica quando se tratam de

outras espcies que no desenvolveram a linguagem, sendo a consolidao desta

lembrana tarefa que envolve o lobo temporal medial (a includos o hipocampo, o

giro denteado, o complexo subicular e os crtices perirrinal e parahipocampal)

(Squire et al., 2007).

Recentemente, a regio anloga ao hipocampo de mamferos, (Nadel, 1978;

Amaral, 1993) vem recebendo muita ateno em aves, havendo um volume

crescente de evidncias de que a parte medial do crtex dorsal das aves

homloga ao hipocampo de mamferos tendo em conta seu desenvolvimento, sua

topografia e seu papel funcional(Ariens-Kappers et al., 1936; Kallen, 1962;

Campbell e Hodos, 1970; Benowitz e Karten, 1976). Essa rea est implicada em

diversos processos de memria incluindo aqueles necessrios navegao

15

(Bingman e Yates, 1992; Bingman et al., 1988) e ao armazenamento de alimento

(Krebs et al., 1989; Sherry e Vaccarino, 1989).

Vrios outros autores tem tentado comparar o hipocampo das aves com o

dos mamferos usando critrios citoarquitetnicos e neuroqumicos, mas pouca

concordncia tem sido alcanada com o emprego desses critrios (Craigie, 1930;

Ariens-Kappers et al., 1936; Benowitz e Karten, 1976; Casini et al., 1986). A parte

dorsomedial do crebro de pssaros tradicionalmente dividida em duas grandes

reas, a ventral chamada de hipocampo prprio (Hp) e a posicionada

dorsolateralmente, denominada de rea parahipocampal (APH), com dois padres

de projees distintos (Figura 04) . A formao hipocampal (FH) das aves (Hp +

APH) faz parte do sistema lmbico, uma rede de mltiplas conexes dos centros

telenceflicos e subtelenceflicos, que responsvel pelo aprendizado associado

s emoes e motivao em geral.

O hipocampo no um centro cerebral voltado apenas ao processamento de

informao espacial, ele tambm parece estar envolvido em outros tipos de

formao de memria e aprendizado, pelo menos em galinceos jovens (Sandi et

al., 1992). As estruturas do prosencfalo implicadas nesse tipo de formao de

memria so conectadas umas com as outras sugerindo a presena de um circuito

prosenceflico de memria que influenciado pelos centros monoaminrgicos do

mesencfalo (Szekely, 1999).

16

No existe acordo no que diz respeito extenso da APH: de fato ainda

permanece a controvrsia de se apenas uma faixa de crtex que separa o Hp das

estruturas do palio lateral e que repousa medialmente no ventrculo lateral, ou se

tambm incorpora grupos de clulas homogneas entre as duas placas celulares

do hipocampo. A linha de separao entre as reas dorsolaterais no est

claramente definida; a APH parece ser contnua com o hiperestriado acessrio (HA)

e tambm contnua em sua poro caudal com o crtex dorsolateral (Szekely,

1999). Em seces coradas com Nissl, a APH e o Hp so homogneos e

representadas como continuaes da rea cortical adjacente e com uma laminao

relativamente distinta em sua parte posterior ventral.

Figura 04: Uma seco coronal do complexo hipocampal e reas adjacentes do teleencefalo do pssaro Parus palustris. A seco faz parte da coordenada 0.3 da extenso rostro-caudaldo hipocampo. Siglas: H, hipocampo (area de clulas densas em forma de V); APH, rea parahippocampal ; L, limite lateral (caracterizado por uma aguda mudana da densidade das clulas; V, ventrculo; M, linha mdia; HA, Hiperestriado acessrio; e S, estriado.(Harsanyi e Friedlander, 1997)

17

Assim, o maior desafio tem sido encontrar uma forma de se definir um limite

entre o hipocampo e o palium lateral (LP). Em pombos, o neuropeptdio designado

substncia P faz o delineamento de alguns campos circunscritos dentro desse

complexo, independente de sua localizao em relao ao Hp e a APH (Erichsen et

al., 1991).

O uso de tcnicas imunohistoqumicas viabilizou a reviso do sistema de

parcelamento do palium dorsomedial, uma vez que novas estruturas compostas por

clulas de natureza qumica semelhante foram encontradas no palium dorsomedial

de pombos (Figura 05) (Erichsen et al., 1991). Um achado importante desse estudo

foi o aparecimento do ncleo reativo para substncia P (SPF) de disposio

alongada rostrocaudalmente, provendo resposta direta para a definio do limite

lateral. Nesse sistema de diviso o SPF localiza-se externamente ao Hp e tambm

claramente separado do hiperpalium acessrio. De acordo com sua posio o SPF

um possvel candidato ao correspondente do crtex entorrinal de mamferos.

O resultado de diferentes tcnicas e diferentes espcies empregadas em

estudos das subdivises do HP (Figura 05) no nos leva a uma concluso final

sobre o nmero ou a localizao das subdivises hipocampais. A conectividade do

HP exige estudos adicionais para se avaliar melhor se a similaridade topogrfica, a

morfologia e a especificidade dos neurotransmissores envolvidos na

imunomarcao so suficientes para definir o parcelamento da formao

hipocampal (Szekely, 1999).

18

Figura 05: Desenhos esquematicos das subdivises hipocampais como descrito anteriormante (esquerda) e como revistas em Szekely 1999 (direita). (A) As subdivises do HP, redesenhadas como no Atlas de Karten e Hodos (Karten Hj, 1967). Coordenada anteroposterior: 6,00. Estes autores no definiram uma fronteira lateral do complexo em relao a HA nem a separao exata entre HP e APH. (B) As subdivises do HP do pombo foram estabelecidas com base na distribuio de neurotransmissores e neuropeptdeos (Erichsen et al., 1991). Coordenada Antero posterior 7,05. (C) As subdivises do HP de um Zebra Finch (Montagnese et al., 1996). O desenho representa uma seco coronal da parte central do hipocampo. (D) As trs subdivises do hipocampo do Zebra Finch (Szekely e Krebs, 1996) seguidos de iontoforese de PHAL. O desenho representa a parte central do HP 1 mm anterior ao lambda (Szekely, 1999).

19

1.3- Anatomia e Fisiologia Comparadas da Formao Hipocampal em Mamferos e Aves

Nos mamferos a distribuio topogrfica das estruturas que compem a

formao hipocampal segue a ordem: giro denteado, Corno de Amon, subculo e

crtex entorrinal. A mesma distribuio espacial encontrada em rpteis squamata

e tartarugas (Peichl, 1991). Em aves, a organizao inverte-se aparecendo em

primeiro lugar a rea em forma de V que corresponderia ao Corno de Amon, seguida

da juno da rea medial e rea dorsomedial correspondendo ao giro denteado, em

seguida a rea lateral correspondendo ao subculo e por fim, a rea SPf

correspondendo ao crtex entorrinal .

Propostas de parcelamento comparativas entre hipocampos de aves e

mamferos foram obtidas atravs de imunomarcaes (Hoffmann et al., 2002).

Esses parcelamentos possibilitaram a gerao de sugestes para limites do

hipocampo em pombos, baseados na forte imunorreatividade para o anticorpo

contra a substncia P definindo o limite lateral do hipocampo (Hoffmann et al.,

2002). Em sua borda lateral aparece uma densa marcao da neurpila

imunorreativa para substncia P em posio rostral rea em forma de V da regio

hipocampal que penetra em direo ao plido lateral, destacando-o das demais

regies a sua volta. Embora exista ainda muita controvrsia a respeito, essa

configurao de fronteira parece delimitar com clareza a regio extra hipocampal

(Schwassmann, 1990).

Assim, poderia relacionar-se essa rea em forma de V no pombo ao corno

de Amon dos mamferos em funo da presena das clulas piramidais circundadas

pelas clulas em cesto que so imunorreativas para a colecistocinina em ambas as

classes (Antal et al., 2006). Alm disso, outras clulas morfologicamente

semelhantes imunorreativas para somatostatina e neuropeptdeo Y so

encontradas na rea medial do hipocampo das aves e na regio hilar dos

mamferos, (Atoji e Wild, 2004).

20

A imunomarcao para peptdeo intestinal vasoativo (VIP) nas camadas do

giro denteado nos mamferos pode ser relacionada rea das clulas

imunomarcadas para VIP no pombo. Outros resultados tambm permitiram associar

a camada alvear e fmbria-frnix do mamfero rea das fibras do trato medial, em

funo da presena de aferentes colinrgicos, serotonrgicos e catecolaminrgicos

que formam os tratos ali existentes em ambas as regies e esses aferentes

contribuem para os circuitos neuroqumicos que modulam as respostas

hipocampais em roedores (Bausch, 2006; Hauser et al., 2006) descreveram a

presena marcante de fibras serotonrgicas na poro imediatamente inferior

regio dorsomedial, o que repete o padro encontrado em mamferos onde as

camadas granulares relacionam-se intimamente ao giro denteado.

Alm das comparaes de ordem morfolgica entre a formao hipocampal

de aves e mamferos, possvel encontrar associao funcional entre seus vrios

sistemas neurais. Segundo alguns pesquisadores (Donascimento et al., 1991; Rosa

et al., 1991) possvel correlacionar a estrutura hipocampal nessas classes com a

aprendizagem e o processamento dos vrios tipos de memria, tais como, a

contextual e a espacial.

Em aves, as conexes telenceflicas que relacionam o hipocampo ao lobo

paraolfatrio, ao plido lateral e parte lmbica do estriado, permitem inferir a

participao dessas regies na formao da memria, e isso foi feito com a

utilizao de tcnicas de esquiva inibitria principalmente em galinceos jovens

(Obrebowski et al., 2000). Experimentos realizados em labirinto aqutico (Morris

water-maze) com roedores mostraram que o dano hipocampal, interrompe a

orientao espacial a partir de pistas visuais fora do labirinto (extra-maze cues),

embora tenha sido verificado que a leso no afeta a orientao com pistas dentro

do labirinto (intra-maze cues) (Kleinrok et al., 2000).

Os mamferos possuem um circuito trissinptico no hipocampo que est

envolvido no processamento do aprendizado e memria, e que sensvel

facilitao sinptica (Wylie e Frost, 1990). Os estudos das eferncias e aferncias

dessa regio em aves (Buttery et al., 1990; Curcio e Allen, 1990; Oswaldocruz et

21

al., 1990) no permitiram at a presente data, estabelecer com segurana a

equivalncia dos circuitos hipocampais, tal como, observado em mamferos, porm

algum consenso foi obtido nessas aproximaes.

Em mamferos, a formao hipocampal contm uma rede de neurnios que

se comunicam atravs de um circuito trissinptico bem definido funcionalmente

como do tipo feed-forward. A chegada de informaes sensoriais converge para o

crtex entorrinal o qual projeta, via circuito perfurante, para o giro denteado. Do giro

denteado saem projees, via fibras musgosas, para a regio de CA3, de onde,

atravs das fibras colaterais de Schaeffer, projetam-se ipsilateralmente e

contralateralmente para a regio de CA1. De CA1 saem fibras para o subculo e da

para fora do hipocampo (Simas e Dasilva, 1989).

Em trabalhos eletrofisiolgicos associados ao uso de traadores sugeriu-se

a ocorrncia de similaridades na circuitaria interna da formao hipocampal de

pombos e ratos (Inan et al., 2006). Assim, as informaes sensoriais chegam, no

pombo, atravs da rea dorsolateral que projeta para a rea dorsomedial. Da rea

dorsomedial saem projees para as duas pores do V hipocampal, na rea

ventromedial das aves. O brao medial do V projeta-se ipsi- e contralateralmente

para a poro lateral do V, que por sua vez projeta-se para a regio dorsomedial de

onde saem os circuitos eferentes em direo s demais reas palidais.

Substncias traadoras sugeriram similaridades entre os padres de

conexes extrnsecas da formao hipocampal de aves e mamferos,

principalmente as septo-hipocampais (Clarkson, 1993; Zanoli et al., 2001; Vicente

et al., 2004). O septo medial no rato a maior via de envio de informaes

formao hipocampal, com projees ipsilaterais importantes para o giro dentado

CA1, CA2, subculo e projees bilaterais para o crtex entorrinal. O septo medial

recebe, de volta, aferncias das regies CA1, CA2 e CA3 do hipocampo do rato. No

pombo, a regio dorsomedial recebe a maior parte das vias que chegam do septo

medial e as clulas presentes na rea ventromedial, principalmente as pores

medial e lateral do V hipocampal projetam de volta para o septo medial. As regies

CA1 e CA3 do rato podem ser similares s pores laterais e mediais do V

22

hipocampal das aves, respectivamente, porque existem conexes intrnsecas entre

as duas reas que do suporte a essa relao (Bruckner et al., 2000).

Entretanto a anatomia hipocampal de aves e mamferos to diferente que

se torna difcil comparar suas subdivises. Da mesma forma, a localizao de

funo nessas estruturas parece ser difcil, mas isto igualmente verdadeiro em

ambas as classes. Por outro lado certo que a contribuio dessas reas quase

idntica em quase todos os aspectos com a exceo do papel do hipocampo na

memria episdica. Mesmo que os aspectos funcionais no possam ser usados

para estabelecer homologias, a imensa similaridade observada aqui subsidia

fortemente a homologia determinada por outros aspectos (Beason-Held et al.,

1999).

Durante a embriognese, os hipocampos de mamferos e aves emergem da

mesma regio do telencfalo (Kallen, 1962), compartilham os mesmos tipos

celulares, incluindo as clulas piramidais (Ben Bederson, 2005), e parecem contar

com os mesmos tipos de neurotransmissores e enzimas relacionadas a estes

(Erichsen et al., 1991; Krebs et al., 1991). As conexes para reas do crebro como

o septum, hipotlamo, ncleos da base e reas de processamento sensorial so

similares mas no idnticas (Casini et al., 1986). muito provvel que as estruturas

hipocampais observadas em aves e mamferos sejam ambas descendentes de uma

nica e antiga estrutura (Beason-Held et al., 1999).

At em peixes dourados (Carassius auratus), foi demonstrado aprendizado

espacial utilizando tarefas de labirinto utilizando 4 pontos de oferta de comida

(Rodriguez et al., 2002). Leses nessa espcie no palium lateral, que um potencial

homlogo do hipocampo de mamferos afetou dramaticamente o aprendizado

espacial enquanto o aprendizado dependente de pistas visuais permaneceu

inalterado. No mesmo estudo experimentos com tartarugas revelaram o mesmo

efeito depois de leso no crtex medial. Outros estudos com mtodos diferentes

confirmaram a analogia funcional entre o hipocampo dos mamferos e o palium

lateral do peixinho dourado (Buhusi e Meck, 2006), enquanto outros (Crockett and

Eisenberg, 1987 ; Coull et al., 1995) chegaram a concluso diferente.

23

1.4- O Hipocampo das Aves, Plasticidade e Memria Muitas pesquisas sobre a relao entre o meio ambiente, a memria e o

hipocampo tem sido focadas em aves que utilizam a memria para recuperar

alimentos escondidos (food-cache) em numerosos stios de armazenagem (Sherry

et al., 1989); (Krebs et al., 1991); Hampton, Sherry et al., 1995; Pravosudov e

Clayton, 2002). Ainda que haja controvrsias sobre os mecanismos subjacentes

(Bolhuis e Macphail, 2001; Macphail e Bolhuis, 2001) parece que a especializao

dedicada a esconder a comida e lembrar-se do stio de armazenagem resultou em

uma memria espacial bem desenvolvida e um hipocampo ampliado em aves e

mamferos (Krebs, Sherry et al., 1989; Sherry, D. F. e Vaccarino, A. L., 1989; Krebs,

Clayton et al., 1995).

A aprendizagem e a memria espacial assim como, a atividade de estocagem

de comida esto relacionadas ao hipocampo e tm sido muito bem estudadas em

pombos e outros pssaros (Clayton, 1998; Colombo, Broadbent et al., 2000b; Sherry

e Hoshooley, 2010). A regio hipocampal em pombos definida como a rea entre

o ventrculo lateral e a fissura interhemisfrica sendo lateralmente separado da rea

parahipocampal por uma regio imunorreativa aos anticorpos contra SP (substncia

P), LENK (leucina-encefalina) e TH (tirosina hidroxilase). Definida dessa forma essa

rea coincide com a estabelecida por trabalhos citoarquitetnicos com a colorao

de Nissl (Krebs, Sherry et al., 1989) dedicados a outras espcies de aves,

principalmente Zebra finch, onde tambm se discute os limites entre o hipocampo e

demais regies vizinhas (Montagnese, Krebs et al., 1996)

As primeiras pesquisas sobre o papel do hipocampo na memria para a

localizao espacial dos locais onde os pssaros armazenam alimentos mostraram

que esses tipos de aves, recuperam o alimento por lembrarem onde os haviam

colocado (Cowie, 1981 ; Sherry, D. F. e Vaccarino, A. L., 1989). Ao lembrarem-se

da localizao onde armazenaram os alimentos utilizam as marcas espaciais perto

desses locais, utilizam-se das relaes geomtricas entre os stios e dos pontos de

24

referncia existentes na rea. Alm disso, utilizam a bssola solar para obter

informaes e se orientar na jornada em direo aos stios de armazenamento

(Balda, 1989; Wiltschko W., 1989; Balda R. P. , 1991; Duff Sj, Brownlie La et al.,

1998).

A memria utilizada para lembrar-se dos stios de armazenamento pode ser

de longa durao (Hitchcock C. L, 1990; Balda R. P, 1992), e o comportamento de

recuperao indica que a ave se lembra de qual o tipo de alimento armazenado em

um stio especfico (Sherry, 1984; Clayton N.S E Dickinson, 1998). Alm disso,

parece que as aves integram a informao espacial, o tipo de alimento e o momento

em que a comida foi estocada e nesse sentido sugere-se que reproduzem o que se

tem denominado episodic-like memory em mamferos (Dere, Huston et al., 2005).

Embora trabalho subsequente tenha questionado a alegao de Clayton e

Dickinson de 1998 de que a memria para stios espaciais se assemelha memria

episdica humana (Hampton R. R. E Schwartz, 2004; Hampton, Hampstead et al.,

2005.), parece provvel que as aves que armazenam alimentos retm algumas

informaes de diferentes formas sobre os tipos de stios de armazenagem. Dentre

essas informaes incluem-se as relacionadas ao risco de perda do alimento (e.g.

alimentos perecveis versus no perecveis) (Hampton e Sherry) e se ou no a ave

j recuperou outras vezes os alimentos l armazenados (Sherry, 1984).

Leses no hipocampo das aves que escondem e recuperam alimentos

perturbam essa capacidade de (Sherry, D.F e Vaccarino, A.L. , 1989) e produzem

um dficit seletivo na memria para localizao espacial (Hampton e Shettleworth,

1996a; Hampton, 1996b; Shiflett, Smulders et al., 2003 ; Broadbent e Colombo,

2000). Portanto, o hipocampo essencial para a recuperao precisa do local onde

o alimento foi armazenado, pois sua leso reduz a preciso da recuperao dos

esconderijos, sem afetar a tendncia para esconder ou procur-los (Sherry, D.F e

Vaccarino, A.L. , 1989).

As leses do hipocampo tm efeitos seletivos semelhantes sobre os

componentes de orientao em pombos-correio (Bingman, Jones et al., 1995),

comprometendo seu desempenho em outras tarefas espaciais, sem interromper a

25

capacidade de formar associaes espaciais simples (Sherry, D. F. e Vaccarino, A.

L., 1989; Hampton e Shettleworth, 1996a).

O hipocampo de aves que armazenam alimentos e das que no armazenam

so diferentes em vrios aspectos. Em nvel taxonmico a comparao de famlias

e subfamlias mostrou que as aves que armazenam alimentos tm, em mdia, um

hipocampo maior do que as aves que no armazenam alimento (Krebs, Sherry et

al., 1989; Sherry, Vaccarino et al., 1989). Dentro das famlias de aves que

armazenam alimentos, tambm h evidncias de que as espcies que armazenam

mais tm um hipocampo maior do que as espcies que armazenam menos (Healy

e Krebs, 1992; Hampton, Sherry et al., 1995).

J est demonstrado que existe uma diferena no tamanho do hipocampo,

entre espcies semelhantes da Eursia (que possuem hipocampo maior) do que o

de espcies da Amrica do Norte (com hipocampo menor), sendo isso verdadeiro

tanto para aves que armazenam como para as que no armazenam (Garamszegi e

Lucas, 2005). Entretanto, confirmou-se posteriormente que as aves que armazenam

alimentos tm hipocampo consistentemente maior do que as espcies que no

armazenam independente das diferenas continentais (Lucas et al., 2004). Em um

estudo similar em grande escala utilizando diferenas filogenticas, Garamszegi e

Eens, (2004) encontraram uma relao positiva entre o comportamento de

estocagem de alimentos e o tamanho relativo do hipocampo (Odum, 1942; Haftorn,

1956; Ludescher, 1980.; Nakamura e Wako, 1988).

Uma verso seca do labirinto aqutico de Morris, que consiste em achar a

posio de um reservatrio de comida escondido em um campo aberto onde os

animais so soltos em diferentes pontos, foi empregada em pombos. O

comportamento de pombos foi examinado utilizando-se esse procedimento e

demonstrou-se que o aprendizado espacial comprometido quando o hipocampo

lesado. Os animais com leso hipocampal foram capazes de encontrar a comida

escondida, entretanto o tempo de latncia foi muito maior quando comparado ao

dos animais controle com hipocampo ntegro (Fremouw et al., 1997).

26

1.5 - Aves Migratrias e o Sistema Neural de Navegao

As espcies migratrias so reconhecidas por suas habilidades de

navegao ao redor do mundo. Essas aves so capazes de navegar por distncias

muito longas at seus stios de invernada, no hemisfrio sul, e de volta na primavera

a seus habitats onde nasceram e foram criados no hemisfrio norte. Pssaros que

escondem comida para recuperao posterior so capazes de encontrar os lugares

onde esconderam comida com acurcia impressionante e os pombos em particular,

acham sua casa mesmo quando soltos em territrios desconhecidos (Krebs, 1990).

Para orientao do processo de migrao envolvendo longas distncias a

informao direcional pode ser extrada do campo magntico terrestre ou de pistas

visuais como o sol e as estrela. A primeira chamada de orientao por bussola

tem sido amplamente estudada em diferentes espcies de pssaros nas ltimas

dcadas (Wiltschko et al., 2000; Wiltschko e Wiltschko, 2002; Mouritsen e Ritz,

2005; Wiltschko e Wiltschko, 2005; Muheim et al., 2006; Hein et al., 2011; Wiltschko

e Wiltschko, 2012). Como outros mecanismos de orientao global, a orientao

atravs de campo magntico tambm pode ser usada para localizao de alvos em

curtas distncias (Voss et al., 2007; Keary et al., 2009). Entretanto, porque as

bssolas de campo magntico, solar ou estelar somente disponibilizam informao

sobre direo e no sobre distncia elas no so suficientes para a localizao de

um determinado lugar. Isto pode ser alcanado usando o arranjo espacial de pistas

visuais e a geometria do espao circundante para orientao, uma habilidade

denominada de orientao espacial. Para analisar a posio de um destino

pretendido em relao as pistas visuais, os animais precisam de um mapa cognitivo

que proporciona uma representao detalhada do ambiente (O'keefe e Nadel,

1978).

Tem sido sugerido que as aves migratrias possuem necessidade de usar

um complexo sistema de navegao em que a aprendizagem e a memria devem

ser importantes componentes (Mettke-Hofmann, C. e Gwinner, E., 2003). Para

migrar longas distncias necessrio lembrar a rota de migrao e os locais de

27

paragem necessrios ao reabastecimento das reservas de energia (Healy et al.,

1996; Mettke-Hofmann, C. e Gwinner, E., 2003), bem como, os detalhes de ambos

os habitats de reproduo e invernada, j que ambos os habitats parecem ser

reutilizados (Chilton, 1995).

A memria dependente do hipocampo tambm parece ser importante para

aperfeioar a volta para casa (homing) (Strasser et al., 1998). Tem sido sugerido

que enquanto as aves migratrias so jovens utilizam um sistema de navegao

"simples" e inato, j os pssaros mais velhos usam um sistema de orientao mais

complexo baseado na memria e aprendizado (Mettke-Hofmann, C. e Gwinner, E.,

2003). Se as espcies migratrias, de fato, possuem maiores exigncias para a

memria, seria de se esperar que tenham uma memria melhor com um hipocampo

ampliado, em comparao s espcies no migratrias (Healy et al., 1996).

As diferenas potenciais na memria e tamanho do hipocampo entre aves

migratrias e no migratrias, podem ser, devidas experincia migratria, que por

si s provocam essas mudanas (Healy et al., 1996) e se isso for verdade, os

indivduos das espcies migratrias que migram pela primeira vez devem ser

semelhantes espcies no migratrias em suas habilidades de lembrar possuindo

volumes hipocampais equivalentes. Alternativamente, as aves migratrias podem

ter evoludo para uma memria aumentada e um hipocampo ampliado como

resultado do aumento da presso de seleo onde indivduos e seus descendentes

com sistema de memria necessria e suficiente ao sucesso da migrao teriam

mais chance de sobreviver do que os outros. Nesse caso, no haveria diferenas

entre os indivduos inexperientes e os experientes no desempenho da memria e

tamanho do hipocampo (Cristol et al., 2003).

Pouca informao est disponvel sobre a memria e o hipocampo de aves

migratrias e no migratrias e os poucos estudos disponveis apoiam hiptese

de que os hbitos migratrios podem afetar a memria e o hipocampo (Healy et al.,

1996; Cristol et al., 2003; Mettke-Hofmann e Gwinner, 2003).

A experincia migratria provoca um aumento relativo no volume do

hipocampo e no nmero total de neurnios de Sylvia borin, mas permanece

28

desconhecido se a memria afetada pela experincia migratria e se as espcies

migratrias tem memria melhor e um hipocampo maior do que as espcies no

migratrias (Healy et al., 1996). Entretanto foram encontradas diferenas na

memria e na densidade de neurnios do hipocampo, mas no no volume do

hipocampo entre espcies migratrias e no migratrias de Junco hyemalis (Cristol

et al., 2003). Posteriormente confirmou-se a ocorrncia de diferenas na memria

de longo prazo entre as espcies migratrias (Sylvia borin) e no migratrias (Sylvia

melanocephala), mas no ficou claro se essas diferenas foram relacionadas s

diferenas no hipocampo e que tipo de memria foi afetada pelo comportamento

migratrio (Mettke-Hofmann e Gwinner, 2003).

A espcie migratria Zonotrichia leucophrys gambelii, possui memria

espacial melhor e mais neurnios no hipocampo em relao aos seus co-

especficos que no realizam migrao (Zonotrichia leucophrys nutalli), o que

sugere que a migrao pode envolver memria espacial. Alm disso, esses autores

sugerem que especificamente o hipocampo direito, parece codificar pistas espaciais

globais, que podem estar envolvidos no comportamento migratrio (Pravosudov et

al., 2006).

No entanto, existem outros fatores no relacionados ao comportamento

migratrio, que produziram diferenas registradas na memria e no hipocampo

entre subespcies migratrias e no migratrias do pardal. Esse ltimo resultado

interessante porque o hipocampo direito foi especificamente implicado no

processamento de informaes espaciais globais, enquanto que o hipocampo

esquerdo parece estar envolvido na codificao de informaes espaciais sobre o

local, pistas, objetos especficos (Kahn e Bingman, 2004). Isso sugere que ambos

os hipocampos direito e esquerdo esto envolvidos, no processamento da memria

espacial, mas sua importncia relativa para a funo de memria no est

totalmente clara (Kahn e Bingman, 2004).

As diferenas na memria espacial e do hipocampo entre aves migratrias e

no migratrias poderiam potencialmente ser experincia-dependente ou ser

resultado tal como mencionado antes, da crescente presso de seleo para uma

29

memria espacial mais eficiente em aves migratrias. O sistema detector do campo

magntico terrestre presente nas aves migratrias talvez gere adaptaes nicas

que podem no estar presentes nos mamferos (Lohmann, 2007).

No presente trabalho descrevemos a morfologia da formao hipocampal e

estimamos o nmero de neurnios e micrglias na formao hipocampal de duas

espcies de maaricos migratrios com padro de migrao bastante distintos com

a expectativa de detectar possveis diferenas em seus hipocampos.

Entretanto, para a deteco precisa de possveis correlaes entre estratgia

de migrao e alteraes hipocampais crtica a utilizao de metodologias

estereolgicas sem vis e no h na literatura at ento nenhum trabalho na

formao hipocampal em aves marinhas utilizando tais metodologias.

1.6- Estereologia Baseada em Design para Contagem de Clulas: O Fracionador ptico

A regra geral em anlises qualitativas encontrar palavras descritivas tais

como: menores, maiores, mais largas, menos frequentes, mais frequentes,

diferente, similar, ausncia ou presena que em geral so suficientes para os

propsitos investigados (Schmitz e Hof, 2005). A anlise microscpica, entretanto

uma ferramenta analtica poderosa para se descrever formas normais e anormais

de tecidos biolgicos, particularmente se for possvel gerar nmeros a partir de

seces histolgicas. Entretanto necessrio considerar que se um microscpio

utilizado para analisar a estrutura de interesse inevitvel, na maioria dos

experimentos, que apenas uma pequena frao da rea de interesse original ser

de fato analisada em detalhe (Howard e Reed, 2005). Esta uma questo chave

em neuromorfologia, assim como, em muitas outras reas onde necessria a

distino de diferenas entre condies fisiolgicas e patolgicas (Schmitz e Hof,

2005).

Entretanto, outros estudos que geram anlises quantitativas e expressam

valores numricos sobre contagem de clulas, densidades, reas e volumes,

30

apresentam resultados controversos que se devem suposies prvias acerca do

tecido e da geometria das clulas e suas distribuies no plano da seco

(Geinisman et al., 1995; Mayhew e Gundersen, 1996). Muitos dos estudos

quantitativos introduzem vieses de amostragem e/ou erros sistemticos cuja

magnitude impossvel de ser apreciada, qualquer que seja a resoluo da anlise:

ptica (Mayhew e Gundersen, 1996; Gardella et al., 2003; Mandarim-De-Lacerda,

2003; Howard e Reed, 2005), confocal (Peterson, 1999; Kubinova e Janacek, 2001)

ou eletrnica (Fiala e Harris, 2001; Nyengaard e Gundersen, 2006).

A estereologia um ramo da cincia que lida com a reconstruo das

caractersticas de estruturas tridimensionais de objetos, a partir da reconstruo

serial de estruturas bidimensionais (Weibel, 1989). O termo baseado em design

utilizado para definir sistemas de amostragem que so independentes das

propriedades do tecido (Glaser e Glaser, 2000).

De fato a sonda e os parmetros de amostragem so definidos a priori em

estereologia, de forma que no necessria a coleta de dados de tamanho, forma

e orientao espacial da rea a ser investigada (West, 2002). Os nmeros

estimados a partir da amostragem podem ser expressos em valores relativos ou

absolutos indicando volume, nmero, conectividade, distribuio espacial e

tamanho das estruturas biolgicas sem conhecimento prvio da geometria das

clulas ou do tecido a ser investigado (Glaser e Glaser, 2000; Schmitz e Hof, 2005).

As anlises estereolgicas do hipocampo das aves migratrias em

comparao com aves que no migram, utilizando marcadores especficos, se

resumem a estimativa do nmero de neurnios em duas subespcies do gnero

Zonotrichia (Pravosudov et al., 2006) e a estimativa de clulas da glia em Poecile

atricapillus empregando o cresil violeta um marcador no seletivo que cora o DNA

celular indistintamente (Roth et al., 2013). Esses autores demonstraram que a

espcie migratria apresenta melhor desempenho em testes de memria espacial

de uma nica tentativa do que a subespcie que no migra. As aves migratrias

precisam lembrar-se da rota e dos locais de parada para alimentao e reposio

de suas reservas energticas, assim como, de detalhes dos locais de reproduo

31

para onde parecem retornar (Chilton, 1995; Mettke-Hofmann, Claudia e Gwinner,

Eberhard, 2003). Entretanto, estimativas estereolgicas ou ensaios morfomtricos

dedicados s clulas da glia ainda no esto disponveis na literatura relacionada

s aves marinhas migratrias. Por essa razo relevante empreender esforos

nessa direo.

1.7- Morfologias das Clulas Gliais em Aves e Mamferos

Nos anos sessenta j era sabido que pelo menos quatro classes de clulas

gliais eram partilhadas por aves, rpteis e mamferos com base em uma variedade

de critrios morfolgicos: astrcitos, oligodendrcitos, micrglia e ependimcitos

(Stensaas e Stensaas, 1968). poca, a morfologia celular comparada era

construda com base em reconstrues bidimensionais com alguma contribuio de

estudos ultraestruturais. A Figura 06 um exemplo desses ensaios morfolgicos

empregando a tcnica de Golgi em seces da medula espinhal de pombos. No que

concerne aos objetivos do presente trabalho interessou-nos particularmente

comparar a morfologia da micrglia e o nmero, tanto de micrglia como de

neurnios, em aves e mamferos. O objetivo desse ensaio foi o de reunir achados

morfolgicos que possibilitassem a comparao da morfologia fina da micrglia do

giro denteado dos mamferos com as do hipocampo ventral das aves em funo de

sua possvel homologia. Infelizmente no foi possvel encontrar reconstrues

tridimensionais detalhadas para a micrglia em aves, e isso nos impediu de

comparar nosso ensaio com a literatura especializada em aves.

32

Por conta dessa lacuna decidimos comparar nossos ensaios morfolgicos

com aqueles de ratos adultos (Rattus novergicus) da variedade Wistar, e com os de

um primata do Novo Mundo com notveis habilidades cognitivas, o Cebus apella.

Para isso reconstrumos a morfologia tridimensional da micrglia da camada

molecular do giro denteado de tais espcies e comparamos esses resultados

queles do hipocampo ventral e dorsal das aves migratrias Calidris pusilla e Acititis

macularia.

Reconstrues bidimensionais encontradas anteriormente em aves serviram

como ponto de partida para esse ensaio morfolgico microglial comparativo. A

Figura 07 um exemplo nessa direo no teto ptico das aves.

Figura 06. Desenho em cmara clara de clulas da glia a partir de seco longitudinal da medula espinhal do pombo. A-D, F-K e M, correspondem a astrcitos protoplasmticos; G um astrcito fibroso; E e L so oligodendrcitos; N-P so astrcitos ependimrios; Q-U so ependimcitos (Stensaas e Stensaas, 1968).

33

Mais recentemente com a utilizao de anticorpo monoclonal especfico para

marcao de micrglia e macrfagos (HIS C7) que reconhece a forma aviria do

CD45 foi possvel caracterizar morfologicamente a micrglia de galinceos em

desenvolvimento e na vida adulta (Cuadros, Santos, Martin-Oliva, et al., 2006). O

CD45 um antgeno que colocaliza sua imunomarcao com aquela dirigida contra

a protena de membrana IBA-1 (Ver Figura 08). Esses resultados obtidos por

Figura 07. Morfologia microglial no teto ptico da galinha. A-P - Micrglias durante o desenvolvimento cerebral ps-natal imediato; Q-BB Micrglias no crebro adulto. Adaptada de (Stensaas e Stensaas, 1968).

34

imunomarcao contra esse antgeno se assemelham no que concerne

morfologia, queles obtidos com anticorpo anti-IBA-1, igualmente capaz de

identificar clulas CD45 positivas, um marcador seletivo para micrglia e

macrfagos em mamferos (Ito et al., 1998).

Da mesma forma, esses resultados se assemelham queles obtidos por

histoqumica com NDPase e histoqumica para lectina RCA 1 no teto ptico das

aves (Shin et al., 2003; Cuadros, Santos, Martin-Oliva, et al., 2006). Usando HIS C7

em seces do teto ptico de galinhas, esses autores encontraram morfologias

celulares compatveis com o padro at ento descrito para micrglias. A

histoqumica para NDPase por sua vez foi igualmente utilizada para caracterizar a

morfologia microglial em vrias espcies incluindo aves (Fujimoto et al., 1987) e

mamferos (Murabe e Sano, 1982) tendo sido encontrado processos celulares com

morfologia semelhante. No h, entretanto estudos detalhados empregando

microscopia tridimensional em aves que permitam comparao detalhada com os

estudos disponveis em mamferos. Assim, o presente trabalho pretende contribuir

para reduzir a lacuna de estudos morfolgicos comparativos detalhados e para tanto

escolhemos trabalhar com anticorpo reativo para a protena IBA-1 que tem

reatividade simultnea para macrfagos e micrglias tanto em aves quanto em

mamferos (Cuadros, Santos, Martin-Oliva, et al., 2006).

Figura 08. Microscopia confocal de clulas imunomarcadas no teto tico da galinha no oitavo dia ps-natal,

ilustrando que todas as micrglias dessa regio esto imunomarcadas pelo anticorpo anti-IBA1 (em

vermelho) enquanto que outras clulas CD45 positivas distintas da micrglia, esto marcadas pelo

anticorpo anti-CD45 (em verde). A colorao amarela corresponde dupla marcao. Escala=25m

(Cuadros, Santos, Martin-Oliva, et al., 2006).

35

A morfologia microglial em mamferos por outro lado tem sido objeto de

anlises mais detalhadas desde 1913 quando Cajal a denominou como o terceiro

elemento para distingui-las dos astrcitos e dos neurnios; ver (Kettenmann et al.,

2011; Eyo e Dailey, 2013) para revises recentes.

Outros estudos sistemticos subsequentes revelaram desde ento grande

heterogeneidade na distribuio e morfologia da micrglia e.g. (Lawson et al.,

1990). Como um exemplo dessa heterogeneidade, no crebro do camundongo a

variao na distribuio da micrglia de pelo menos 5 vezes entre uma regio e

outra, havendo maior concentrao dessas clulas no hipocampo, no telencfalo

olfatrio, nos ncleos da base e na substncia negra, sendo sua morfologia em

situao normal igualmente varivel, tendo sido classificadas em pelo menos trs

categorias distintas (Lawson et al., 1990).

No se sabe ainda que fatores locais determinam essa variao numrica e

morfolgica ou se essas pequenas variaes refletem contribuies funcionais

diferentes, apesar de haver variaes regionais de magnitude semelhante na

expresso de receptores imunolgicos (De Haas et al., 2008); ver (Ransohoff e

Perry, 2009) para reviso.

As micrglias em situao normal se apresentam em todas as regies do

SNC de forma organizada com ramificaes em todas as direes e sem

sobreposio, definindo domnios ou territrios circunscritos. No crebro adulto, a

micrglia pode responder a mudanas na atividade neural influenciando-a tanto no

curto, quanto no longo prazo monitorando igualmente a funo sinptica (Wake,

Hiroaki et al., 2011).

Essas clulas, portanto, normalmente tm suas funes inflamatrias

reguladas para baixo por conta de numerosas influncias inibitrias no

microambiente que as circunda e que so produzidas em sua maioria por neurnios

(ver figura 09) (Ransohoff e Perry, 2009). A despeito desse fentipo regulado para

baixo, no crebro normal, estudos que coletaram imagens micrgliais in vivo

revelaram que elas costumam deslocar seus processos de forma dinmica, ao

longo do territrio que ocupam para monitorar o microambiente local (Davalos et

36

al., 2005; Nimmerjahn, Axel et al., 2005). Essa motilidade e eventuais mudanas

em sua forma alteram a distribuio de seus ramos no territrio cerebral objeto do

monitoramento tornando difcil a anlise de sua morfologia utilizando mtodos

descritivos tradicionais. Para contornar essa dificuldade mais recentemente tem

sido proposta a anlise quantitativa da complexidade do padro de ramificao da

micrglia como instrumento til para caracterizar sua morfologia (Karperien, Audrey

et al., 2013).

Nesse trabalho, a forma e as funes micrgliais so consideradas

intrinsecamente ligadas e proposto que se adote a anlise fractal como

instrumento quantitativo dos fentipos morfolgicos que parecem variar ao longo

de um gradiente. A posio relativa da morfologia da micrglia nesse gradiente

pode ser expressa em graus de complexidade distintos que se refletem no valor da

dimenso fractal (K-dim) de cada clula reconstruda (Karperien, Audrey et al.,

2013).

Figura 09. Morfologia de micrglias (em verde) e neurnios piramidais (em alaranjado) durante o

desenvolvimento do neocortex do camundongo. Imagens de microscopia confocal ilustrando micrglias

expressando a protena fluorescente verde (GFP-expressing micrglia) e neurnios piramidais

expressando a protena fluorescente amarela (YFP-expressing pyramidal neurons). Note as delgadas

ramificaes das micrglias em meio aos dendritos e somas neuronais [Figura adaptada de (Eyo e Dailey,

2013)].

37

Alm das mudanas associadas ao monitoramento, essas clulas podem

mudar rapidamente seus fentipos em resposta a qualquer distrbio da homeostase

do sistema nervoso passando a ser referidas como micrglias ativadas com base

na mudana de sua morfologia ou na expresso de antgenos em sua superfcie

(Ransohoff e Perry, 2009). A retrao dos processos micrgliais aparente durante

a neurodegenerao e neuroinflamao e est fortemente correlacionada com sua

transformao funcional para o estado pr-inflamatrio ou ativado (Kettenmann et

al., 2011). As alteraes morfolgicas associadas ativao consistem em:

processos citoplasmticos encurtados e mais espessos e um corpo celular

arredondado representando um contnuo de estgios de ativao que para fins

didticos podem ser classificados em inicial, intermedirio e avanado e so

acompanhadas pelo aumento da expresso de genes envolvidos em respostas

imunes (Zielasek e Hartung, 1996).

fato que alm da mudana morfolgica injria, a ativao microglial

tambm caracterizada pela induo da liberao de vrias molculas, tais como

marcadores mielides, citocinas, radicais livres e xido ntrico (Streit e Kreutzberg,

1988; Bechmann e Nitsch, 1997; Raivich et al., 1999; Streit et al., 1999). A ativao

da clula microglial pode ocorrer em resposta a variados estmulos, tais como

leses, isquemia e processos inflamatrios, levando a micrglia a assumir um

fentipo ativado associado proliferao, migrao para o local da leso,

fagocitose das clulas infectadas e em processo de morte celular e liberao de

fatores neurotxicos e neurotrficos (Power e Proudfoot, 2001). Essa variao

fenotpica inflamatria igualmente observada em aves (Yang et al., 2007) e em

um de nossos animais removido de nossas anlises comparativas pudemos

confirmar a ocorrncia de alteraes morfolgicas compatveis com descries

anteriores dedicadas a processos inflamatrios em aves (Zelinka et al., 2012).

No presente trabalho nosso interesse concentra-se, entretanto, em comparar

micrglias cujas morfologias tridimensionais se enquadram em perfis no ativados,

em animais adultos, sem quaisquer sinais clnicos aparentes de doena ou de

resposta inflamatria evidente no SNC. A quantificao de suas sutilezas

38

morfolgicas ser usada aqui para investigar possveis distines adaptativas no

sistema imune entre espcies que so separadas entre si por distncias evolutivas

contrastantes.

Baseados na ausncia de estudos sistemticos empregando anlises

estereolgicas em aves, o alvo do presente trabalho estimar o nmero de

neurnios e micrglias, assim como, analisar a morfologia tridimensional dessas

ltimas na formao hipocampal de duas das espcies de maaricos, usando

estereologia e reconstruo tridimensional computadorizada. O processo de

anlise quantitativa utilizar o mtodo do fracionador ptico, que permite estimar o

nmero de objetos de interesse de uma determinada estrutura cujos limites e

objetos de interesse se reconhecem sem ambiguidades. Da mesma forma,

empregar-se- reconstruo tridimensional por microscopia automtica para

garantir melhor resoluo a anlise comparativa da morfologia microglial.

39

2- OBJETIVOS

2.1- Geral

Implantar como modelo para estudo da formao hipocampal das aves

migratrias as espcies Calidris pusilla, (Bausch e Mcnamara, 2000) e Actitis

macularia, (Blackstad, 1956) apud (Silveira et al., 1989).

2.2- Especficos 1) Descrever a morfologia da formao hipocampal de exemplares adultos

dessas espcies estabelecendo seus limites arquitetnicos com diferentes

marcadores visando a definio da rea e dos objetos interesse dos estudos

estereolgicos e morfomtricos.

2) Estimar o nmero de micrglias e de neurnios da formao hipocampal

de Actitis macularia e Calidris pusilla com marcadores seletivos para

neurnios e micrglia utilizando o mtodo do fracionador ptico.

3) Reconstruir e realizar anlise comparativa da morfologia da micrglia do

hipocampo dorsal e ventral das aves estudadas com aquelas da camada

molecular do giro denteado do rato (Rattus novergicus da variedade Wistar)

e do macaco (Cebus apella).

40

3- MATERIAL E MTODOS

3.1- Captura com Redes de Neblina

Em cada ponto de coleta, uma linha composta por nove redes de 12m x 2m

e malha de 36mm ser aberta at o momento de captura do nmero desejado de

animais. As redes eram vistoriadas a cada trinta minutos, quando as aves

capturadas so retiradas, obtendo-se informaes referentes identificao da

espcie, horrio de captura, peso, comprimento do bico, presena de muda e

presena de gordura.

3.2- Perfuso, Corte, Colorao e Imunohistoqumica

Aps a captura os animais foram perfundidos por via transcardaca com

soluo salina 0,9% heparinizada por 10 minutos, seguida de paraformaldedo 4%

pH 7.2-7.4 por 10 minutos. O incio do fluxo de soluo salina foi iniciado aps o

corte da veia jugular com inciso no lado direito do pescoo permitindo assim que

o crebro fosse melhor permeado pelas solues salina e de paraformaldedo.

Aps craniotomia o encfalo foi cortado no plano coronal, axial e sagital em

busca do melhor plano para os estudos estereolgicos. Aps a retirada do encfalo,

com as regies enceflicas de interesse, fatias de 70m foram obtidas em um

vibrtomo (Vibratome Sectioning System, Pelco 120) ou em criostato aps

crioproteo com soluo de sacarose a 30% ou de sacarose a 30% mais glicerol

a 10%. As colees cortadas no plano coronal foram coradas pelas tcnicas de

Nissl, assim como foram reagidas por imunohistoqumica para Neu-N (marcador de

neurnios), GFAP (marcador de astrcito), IBA1(marcador par micrglia), Zenk

(produto de gene de ativao imediata), C-Fos (produto de gene de ativao

imediata) e DCX (dupla cortina).

41

3.2.1- Colorao de Nissl

A colorao de Nissl utiliza o cresil violeta e cora em violeta ncleos e

nuclolos. Neurnios e glia so corados indistintamente pela tcnica de Nissl.

Para preparar a soluo de colorao preciso aquecer o cresil violeta em

banho-maria a 40C, agitando-a por 5 minutos; filtrar a soluo final em papel filtro;

e acrescentar o cido actico at que o pH da soluo esteja entre 3 e 3,5. As fatias

devem ser mergulhadas nas solues e sequncia indicadas no quadro 03. Tabela 01: Etapas da Colorao de Nissl com Tempo de Imerso em Cada Reagente

SOLUO TEMPO DE IMERSO (minutos) lcool 100% 05 lcool 100% + Clorofrmio (1:1) 10 lcool 95% 03 lcool 75% 03 H2O destilada 0 01 Cresil violeta 01 04 H2O destilada 0 01 lcool 80% 03 lcool 90% 10 lcool 100% + Clorofrmio (1:1) 03 lcool 95% +cido actico (15 gotas/100 ml) 03 lcool 95% 06 lcool 100% +cido butlico (1:1) 03 Xileno I 05 Xileno II 05

3.2.2- Imunomarcao para GFAP, Neu-N, IBA1, ZENK e C-Fos

Aps a realizao da perfuso, dissecao, e corte, as sees do tecido

cerebral so armazenadas em paraformoldeido 4% a 4C. As seces selecionadas

so lavadas com Tris 0,1 M pH 7.2-7.4 antes da incubao em cido brico 0.2M

pH 9,0 a 70C como descrito na Tabela 2, que mostra cada passo da

imunohistoqumica. Os stios de ligao no especficos so bloqueados pela

incubao dos cortes em casena a 10% durante 60 minutos. A incubao das

42

seces nos anticorpos primrios (anticorpos primrios Neu-N, C-Fos, Zenk, GFAP,

IBA1 e DCX), especfico para cada imunomarcao (Tabela 3), ocorreu durante trs

dias a 4C com agitao suave. Tabela 02: Passos das Reaes de Imunohistoqumica com os tempos de Imerso e Enxagues em cada Reagente

SOLUO TEMPO DE IMERSO OU ENXGUES cido brico 60 minutos

Tris salina Triton 5% 3x5 minutos Tris salina 3x2 minutos Casena 60 minutos

Tris salina 3x2 minutos Anticorpo primrio 3 dias

Tris salina 3x2 minutos Anticorpo secundrio 12 horas

Perxido de hidrognio 15 minutos Tris salina 3x 2 minutos

ABC 60 minutos Tris 0,1 M 3x 2 minutos

Revelao com GND mx 30 minutos Tris 0,1 M 3x 2 minutos

A peroxidase endgena inativada atravs de incubao com perxido de

hidrognio (H2O2) a 0,3% dissolvido em tris salina, durante 15 minutos. Aps

lavagem os cortes so incubados durante 60 minutos no complexo avidina-biotina-

peroxidase (Vector ABC kit Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA, 1:200).

A atividade da enzima peroxidase detectada usando reao 33-diaminobenzidine

(DAB, Sigma) e -D-glucose/glucose-oxidase empregando o protocolo descrito em

(Shu, Ju et al., 1988). Depois que o produto da reao formado gera-se um

precipitado azul-acinzentado nos locais de interao antgeno-anticorpo e as

reaes quando ento so interrompidas as reaes em tris salina 0,1 M. Os cortes

so montados em lminas de vidro gelatinizadas e desidratados em sries de etanol

(70, 80,90, 100,100%) seguido de xilol I e II. Tabela 03: Informaes de Diluio e Fabricantes dos Anticorpos utilizados.

ANTICORPO DILUIO FABRICANTE / N de REFERENCIA Primrio NeuN 1:2000 Milipore / MAB 377 Primrio Iba -1 1:2500 Wako / 019-19741

43

Primrio c-Fos 1:1000 Santa Cruz / SC-253G Primrio GFAP 1:1000 Santa Cruz / SC-6170 Primrio Zenk 1:1000 Santa Cruz / SC-189 Primrio DCX 1:1000 Santa Cruz / SC-8066 Secundrio Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L) 1:250 Vector Laboratories / BA-9200 Secundrio Biotinylated Anti-Goat IgG Reagent (H+L) 1:250 Vector Laboratories / BA-9500

Secundrio Biotinylated Anti-Rabbit IgG Reagent (H+L) 1:250 Vector Laboratories / BA-1000

3.3- Estereologia Um dos mais recentes avanos envolvendo o dissector ptico a

combinao do dissector ptico com o fracionador de amostras. Esta combinao

conhecida na literatura como fracionador ptico (West, 2002), tem numerosas

vantagens prticas, sendo a principal o fato de no ser afetado pela retrao do

tecido e no requerer definies rigorosas de fronteiras estruturais que podem ser

feitas em objetivas de baixo aumento. O fracionador ptico envolve contagem de

objetos (neurnios e glia no presente trabalho), com sondas de dissectores pticos,

em uma amostra sistemtica uniforme que constitui uma frao conhecida do

volume da regio sendo analisada. Na prtica, isto feito atravs de amostragem

sistemtica de uma frao conhecida da espessura da seco, de uma frao

conhecida da rea seccional e de uma frao conhecida do nmero de seces que

incluem a regio de interesse.

Tabela 04: Relao entre Magnificao de Objetivas Acromticas. (Dorph-Petersen et al., 2001)

Magnificao Abertura Numrica Profundidade Focal (m)

4 0,1 172,5

10 0,25 27,6

40 0,65 3

100 1,3 0,7

Cada anlise estereolgica comea com o delineamento das fronteiras da

regio de interesse em uma srie de seces randmicas e sistemticas (Howard

e Reed, 2005). Em nosso caso as fronteiras das regies de interesse podem ser

facilmente reconhecidas em seces coradas com Nissl e os limites do hipocampo

44

podem ser traados em imagens de vdeo em um computador acoplado a um

microscpio utilizando objetivas de baixo aumento (e.g. 3.2x).

Para analisar sistematicamente a rea delimitada em baixo aumento

necessrio mudar para uma objetiva de grande aumento (100x) com elevada

abertura numrica e reduzida profundidade de foco (Schmitz e Hof, 2005). A Tabela

04 ilustra a relao entre o aumento de objetivas acromticas, abertura numrica e

profundidade de foco.

Nos trabalhos empregando microscopia ptica onde apenas uma frao

mnima do nmero de objetos de interesse contada, s possvel falar de

estimativas acerca do nmero deles dentro da regio de interesse. Para obter

estimativas confiveis (que se aproximam do real) a partir de uma diminuta frao

amostral, necessria a utilizao de coleta sistemtica e aleatria de dados

incluindo a terceira dimenso. Essa alternativa assegura a estimativa adequada do

nmero total de clulas dentro da rea de interesse a partir do nmero de clulas

detectadas em cada caixa de contagem da amostra e da probabilidade amostral

(Schmitz e Hof, 2005).

Entretanto mesmo com todos esses cuidados a incerteza nas estimativas

ainda permanece e decorrente de outras fontes de erro possveis como aqueles

introduzidos pelos pressupostos do operador acerca dos grupos experimentais,

pelas alteraes induzidas nas seces pelo processamento do tecido, pela

ambiguidade no reconhecimento de reas ou dos objetos de interesse. Para

minimizar esse tipo de incerteza necessrio executar uma srie de procedimentos

controle como ensaio duplo cego, escolhas adequadas no processamento tecidual

incluindo fixao, plano de corte, imunohistoqumicas seletivas, garantindo a cada

passo que todas as regies da estrutura tenham a mesma probabilidade de

contribuir para a amostra reduzindo a ambiguidade no reconhecimento dos limites

da regio assim como nos objetos da contagem.

O processo inteiro consiste, em resumo, em dois passos:

45

1 Passo Amostragem: que exige acesso estrutura inteira com todas as

regies de interesse com chances similares de contribuio para a amostra assim

como, o reconhecimento dos objetos de interesse sem ambiguidade.

2 Passo Medidas: que exige o uso de mtodos baseados em design

(medidas tridimensionais) ao invs de mtodos baseados em suposies (medidas

bidimensionais).

As anlises estereolgicas para contagem neuronal e microglial foram

realizadas atravs do programa StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT,

USA) integrado a um microscpio ptico Nikon com platina motorizada para os eixos

X, Y e Z e um computador, onde os dados das coordenadas tridimensionais eram

registrados, o controle da platina e a execuo do programa era feito.

Ao iniciarmos o procedimento de contagem, caixas de contagem so geradas

automaticamente pelo programa em cada um dos pontos de interseco da sonda

estereolgica com o plano onde est situada a fatia (Figura 10). Para isso o

experimentador alimenta o programa definindo as dimenses da caixa, da matriz de

contagem e da frao amostral de seces.

46

A escolha dessas dimenses e da frao amostral feita em ensaio

preliminar (por tentativa e erro) at que o coeficiente de erro de uma fatia individual

seja adequado para obter resultados mdios para o conjunto de seces com baixo

Figura 10. Contorno da formao hipocampal mostrando as caixas de contagem (50 x 50 m) geradas pelo programa em cada ponto de interseco do contorno da seco com a sonda estereolgica (grid de 350 x 350 m).

47

coeficiente de erro. Em cada caixa de contagem so marcados os objetos de

interesse (neurnios e glia). Os neurnios marcados em cada caixa geram

informaes para o programa acerca do nmero e da posio das clulas contidas

em cada caixa. A partir dessas informaes colhidas sistematicamente na frao de

seces eleitas para contagem, o programa estima o nmero esperado de objetos

de interesse (neurnios e micrglia) na estrutura inteira.

A figura 11 mostra um bloco de 8m de altura em planos de foco situados a

cada 2m ao longo do eixo Z. As linhas brancas do bloco so linhas de incluso, ou

seja, qualquer clula que cruze essa linha ou que esteja contida integralmente na

caixa deve ser contada, enquanto que as clulas que interceptam as linhas negras

no so contadas.

Em nosso protocolo, o corpo celular ser utilizado como unidade de

contagem e o foco escolhido para posicionar o marcador, a cromatina nuclear das

clulas da glia e o nuclolo do neurnio. No caso da micrglia o local do registro de

contagem ser feito quando seu soma estiver em foco. Cuidado especial ser

tomado para evitar contagens repetidas do mesmo objeto nos diferentes planos de

Figura 11. Contagem do nmero de micrglias em uma caixa de contagem de 10um de altura. A figura mostra uma sequncia de 6 fotomicrografias distanciadas de 2m entre dois planos de foco consecutivos. A primeira fotomicrografia representa 2um de zona de guarda onde clulas no so contadas. Em azul, clulas da glia e neurnios corados por Nissl e em preto micrglias coradas por IBA-1. Seta branca indica a nica clula que foi contada nesta caixa de contagem. Magnificao: 100x. Escala: 25um.

48

foco. Para isso o procedimento de focalizao repetido avanando e recuando o

micrmetro do microscpio para obter os diferentes planos de foco ao longo do eixo

Z, particularmente quando coexistiam muitas clulas na mesma caixa.

A estimativa do nmero total de neurnios dentro da regio de interesse ser

obtida atravs do mtodo do fracionador ptico, multiplicando-se o nmero de

neurnios contados dentro de cada bloco pelos valores de probabilidade da

amostra. Esses valores dependem: 1) do nmero de seces investigadas

comparadas com o nmero total de seces que contm a regio de interesse

section sampling fraction; 2) da rea dos blocos de contagem comparada com a

rea da matriz de contagem area sampling fraction; e 3) da altura do bloco de

contagem comparada com a mdia da espessura da seco aps os procedimentos

histolgicos thickness sampling fraction, (Howard e Reed, 2005).

1 1 1 Onde,

N nmero total de neurnios

Q nmero de neurnios contados

ssf section sampling fraction = frao amostral das seces de interesse =

seces contadas/total de seces

asf area sampling fraction = frao amostral da rea de interesse = rea da caixa

de contagem/rea da matriz (x,y)

tsf thickness sampling fraction = frao amostral da espessura da seco

contada = espessura da caixa de contagem/espessura da seco

49

3.4- Anlise Estatstica

Por razes metodolgicas no se pode contar o nmero total de neurnios

existentes numa dada regio do encfalo muito menos no crebro como um todo.

Assim, o mximo que se pode pretender realizar estimativas que se aproximem

ao mximo do que seria esperado (Cruz-Orive, 1994; Schmitz, 1998). Existem dois

mtodos estereolgicos desenvolvidos para estimar o nmero total de objetos de

interesse: o fracionador ptico j descrito e o mtodo que estima o nmero total de

clulas multiplicando a densidade mdia de clulas pelo volume da regio de

interesse. A densidade mdia obtida a partir de amostragem aleatria e

sistemtica da regio inteira que se pretende analisar (Schmitz e Hof, 2000). Para

contornar o problema da impossibilidade de calcular o erro verdadeiro em

experimentao biolgica por conta de no se poder contar tudo, recentemente foi

feita avaliao computacional simulando grande quantidades amostrais.

Esse estudo demonstrou que as estimativas do nmero total de objetos de

interesse (neurnios e/ou glia no caso presente), obtidas a partir do fracionador

ptico, so do ponto de vista estatstico e do ponto de vista do esforo empreendido

mais eficientes do que as estimativas a partir da densidade e volume (Schmitz e

Hof, 2000). Alm disso, vrias maneiras de se estimar o erro foram testadas em

amostras simuladas por computador de modo a encontrar um modo de calcular o

coeficiente de erro que se aproximasse o mais possvel do erro verdadeiro.

Comparando o coeficiente de erro verdadeiro pra grandes amostras com o

calculado por diferentes mtodos, encontrou-se que o coeficiente de Scheaffer o

que mais se aproxima do erro verdadeiro (Glaser e Wilson, 1998). Assim, no

presente trabalho deu-se preferncia ao fracionador ptico como mtodo

estereolgico e ao coeficiente de Scheaffer como instrumentos de medida.

Utilizando esse coeficiente para estimar o erro, definiu-se que a grade e as

dimenses da caixa de contagem seriam adequadas quando o coeficiente de

Scheaffer fosse menor do que 0,05.

50

Assim, a preciso de estimativas individuais expressa pelo coeficiente de

erro que para amostras sistemticas declina muito mais rpido do que para

observaes independentes (Gundersen et al., 1999). Por conta do fato de que o

coeficiente de erro representa a variao devido incerteza metodolgica

intrnseca, associada com a estimativa estereolgica, ele sempre contribui menos

para o coeficiente de variao total do que a variao biolgica.

A anlise de varincia (ANOVA um critrio) ser aplicada para estimar

possveis diferenas entre o nmero de clulas das vrias regies e diferenas

morfolgicas em todas as comparaes envolvendo mais de dois grupos e o teste

de Tukey ser escolhido para detectar tais diferenas.

O Teste-T de Student ser utilizado para detectar as diferenas quando a

anlise envolver apenas dois grupos. Quando o teste t bicaudal indicar valor de p

menor que 0,05 os grupos sero considerados significativamente distintos.

3.5 Morfometria Baseada em Reconstruo Tridimensional

Para a reconstruo tridimensional das micrglias utilizamos o microscpio

ptico (Eclipse 80i, NIKON) com platina motorizada e conversores anlogo-digitais

(MAC6000 System, Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY, USA) para converso

digital da informao relativa s coordenadas espaciais (X, Y, Z) de cada ponto

digitalizado. Esse sistema acoplado a microprocessador que controla os

movimentos da platina com auxlio de programa especializado (Neurolucida,

Microbrightfield, Williston, VT, USA) e estoca as coordenadas dos pontos de

interesse. No sentido de se evitar ambiguidades na identificao dos objetos de

interesse e garantir maior preciso nas reconstrues, a objetiva de 4,0x era

substituda por outra PLANFLUOR, 100X (NA 1.3; DF = 0.2 m; Nikon, Japan)

utilizada para as reconstrues tridimensionais realizadas.

O estudo morfolgico fornece dados para uma anlise qualitativa e

quantitativa e permite tambm a determinao da distribuio dos objetos de

interesse reconstrudos (Acsdy et al., 1998).

51

Parmetros de medida para caratersticas individuais geralmente podem ser

divididos em quatro classes: medidas de tamanho, forma, posio e brilho. Medidas

de tamanho como rea projetada, permetro e comprimento so razoavelmente

familiares experincia a humana. Ao contrrio do tamanho que se pode estimar

quantitativamente com certa facilidade, a forma um conceito mais abstrato onde

necessrio muitas vezes utilizar comparaes para caracterizao dos contornos

de um objeto. A maioria das medidas de forma so combinaes adimensionais de

medidas de tamanho. Um parmetro de forma que relativamente familiar

experincia humana a excentricidade, que calculado como

.

O recproco deste parmetro tem sido empregado por muitos anos em

trabalhos antropomtricos designado como ndice ceflico.