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ADRIANA MACEDO DA ROCHA

EFICÁCIA DO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA FRENTE A

SUSPENSÕES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM DIFERENTES

LÍQUIDOS BIOLÓGICOS

CANOAS, 2009.





Trabalho de conclusão apresentado ao público e a comunidade acadêmica do UNILASALLE - Centro Universitário La Salle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química, sob a orientação da Prof.º Delmar Bizani.

CANOAS, 2009.

TERMO DE APROVAÇÃO





Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química do Centro Universitário La Salle – UNILASALLE, pelo

avaliador:

Prof. Delmar Bizani

Unilasalle

Canoas, 19 de junho de 2009

“Procuro um lugar

Não sei se é nesse ou noutro mundo

Num mundo onde andei

A vida escondeu

No esquecimento mais profundo

Alguém que hoje sou eu”

Cidadão Quem

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer em primeiro lugar a minha família, que sempre me

incentivou e me deu forças para enfrentar todos os obstáculos encontrados durante

todos os momentos em minha vida.

Agradeço aos professores pelos ensinamentos recebidos.

Agradeço a MaxSane Indústria de Saneantes Ltda. pela confiança, e

flexibilidade em me dispensar em determinados momentos para a realização deste

trabalho.

Ao meu orientador prof. Delmar Bizani, pela disponibilidade, atenção e total

apoio durante toda a realização deste trabalho.

Aos amigos conquistados, ao longo do curso de graduação, muito valiosos que

levo para o resto de minha vida.

A todos que de alguma forma colaboraram para a realização desta importante

etapa de minha vida profissional.

RESUMO

O digluconato de clorexidina, ou somente clorexidina, como é mais conhecido é muito utilizado como anti-séptico. O objetivo deste trabalho foi testar a eficácia do digluconato de clorexidina na concentração de 2% como agente bactericida frente ao Staphylococcus aureus, isolado clínico correspondente e ainda na presença de matéria orgânica: sangue, plasma e urina. Foram realizadas análises microbiológicas em aerobiose que comprovaram que a clorexidina é um excelente agente bactericida frente aos microrganismos testados e também na presença de matéria orgânica. Palavras chave: clorexidina, eficácia, Staphylococcus, bactericida, microrganismos.

ABSTRACT

The chlorhexidine digluconate, chlorhexidine or only, as is known is more widely used as an antiseptic. The objective this work was to test the efficacy of chlorhexidine digluconate in a concentration of 2% as a bactericidal agent against the Staphylococcus aureus, corresponding clinical isolate and in the presence of organic matter: blood, bloodstone and urine. Microbiological tests were performed under aerobic showed that the chlorhexidine is an excellent bactericidal agent against the tested microorganisms and also in the presence of organic matter. Keys words: chlorhexidine, efficacy, Staphylococcus, bactericidal, microorganisms.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Molécula de Gluconato de Clorexidina ................................................ 13

Figura 2 – Staphylococcus aureus ....................................................................... 25

Figura 3 – ATCC 25923 Staphylococcus aureus e Isolado clínico ...................... 29

Figura 4 – Amostras de sangue ............................................................................ 29

Figura 5 – Amostra de urina ................................................................................. 30

Figura 6 – Esquema dos protocolos realizados .................................................... 31

Figura 7 – Placas do protocolo1 ........................................................................... 32

Figura 8 – Protocolo 1: ATCC e IC: urina ............................................................. 33

Figura 9 – Placa do protocolo 2 ............................................................................ 34

Figura 10 – Placas do protocolo 3 ........................................................................ 35

Figura 11 – Placas do protocolo 5 ........................................................................ 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Atividade bacteriana da clorexidina em diferentes pHs ...................... 18

Tabela 2 – MIC de clorexidina para bactérias gram-negativas ............................. 20

Tabela 3 – MIC de clorexidina para bactérias gram-positivas .............................. 21

Tabela 4 – MIC de clorexidina para fungos .......................................................... 22

Tabela 5 – Resultados do protocolo 1 .................................................................. 32




Tabela 9 – Resultados do protocolo 5................................................................. 37

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 10

2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 11

2.1 Objetivo específico ....................................................................................... 11

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................ 12

3.1 Clorexidina .................................................................................................... 12

3.1.1 Propriedades da clorexidina ........................................................................ 16

3.1.2 Mecanismo de ação da clorexidina ............................................................. 16

3.1.3 Toxicologia ................................................................................................... 17

3.1.4 Espectro e atividade .................................................................................... 18

3.1.5 Concentrações inibitórias mínimas(CIM) ..................................................... 19

3.2 Sangue ........................................................................................................... 22

3.2.1 Características fisiológicas do sangue ......................................................... 23

3.3 Plasma ........................................................................................................... 23

3.4 Urina .............................................................................................................. 24

3.4.1 Composição da urina .................................................................................. 24

3.5 ATCC-American Type Culture e collection ................................................ 25

3.5.1 Staphylococcus aureos ATCC 25923 ………………………………………… 25

3.6 Isolado clínico .............................................................................................. 26

4 Parte experimental ......................................................................................... 27

4.1 Materiais e métodos ................................................................................... 27

4.2 Microrganismos ......................................................................................... 28

4.3 Matéria orgânica ........................................................................................ 29

4.4 Teste de eficácia da clorexidina frente as matérias orgânicas e aos

Microrganismos .................................................................................................. 30

4.4.1 Protocolo 1 ................................................................................................... 31

4.4.2 Protocolo 2 ................................................................................................... 33

4.4.3 Protocolo 3 ................................................................................................... 35

4.4.4 Protocolo 4 ................................................................................................... 36

4.4.5 Protocolo 5 ................................................................................................... 36

5 CONCLUSÃO ................................................................................................... 38

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 39

ANEXO A – Certificado do digluconato de clorexidina ......................................... 41

ANEXO B – Preparo do meio de cultura BHI ....................................................... 42

1 INTRODUÇÃO

Hoje em dia, a busca por agentes bactericidas eficazes e sobre tudo baratos é

uma constante procura na Indústria de Saneantes. É comprovada a falta de higiene

das pessoas em restaurantes, hospitais e dependências, o que reforça a utilidade de

sabonetes bactericidas nestes estabelecimentos.

Atualmente existem no mercado sabonetes do tipo álcool-gel e também

aqueles a base de triclosan. O primeiro não é muito aceito pelas mulheres

principalmente, devido a ressecação causada nas mãos pelo álcool e o triclosan é

uma matéria-prima importada e certificada com um custo bastante elevado.

Dentre os diversos agentes químicos disponíveis para uso como sanitizantes,

encontramos a clorexidina. O Digluconato de clorexidina é um excelente anti-séptico

e também agente bactericida. O presente trabalho tem como objetivo testar a

eficácia deste agente bactericida através de análise microbiológica na concentração

de 2% frente ao Staphyloccocus aureus, microrganismo encontrado freqüentemente

em frigoríficos, hospitais, cozinhas e dependências, e, além disso, testá-la também

frente a diferentes matérias orgânicas - líquidos biológicos como: sangue, plasma e

urina.

Os resultados deste trabalho servirão de base para a formulação de um

sabonete bactericida para ser utilizado institucionalmente.

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de comprovar a eficácia do digluconato de

clorexidina como agente bactericida.

2.1 Objetivo específico

Testar a eficácia do digluconato de clorexidina frente ao Staphyloccocus aureus

ATCC nº 25923 e isolado clínico, tanto na ausência como na presença e em

diferentes concentrações de diferentes líquidos biológicos como: sangue, plasma e

urina.

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A Microbiologia1 é o estudo dos microrganismos e estes por sua vez são as

formas de vida que originalmente, só poderiam ser vistas com o auxílio do

microscópio óptico e posteriormente com microscópio eletrônico. Elas incluem:

bactérias, fungos, vírus, protozoários, algas unicelulares, viróides e prions.

Este trabalho foi realizado para testar a eficácia de uma agente bactericida:

Digluconato de clorexidina na presença de microrganismos e matérias-orgânicas

através de análises microbiológicas.(Madigan et al.,2004).

3.1 Clorexidina

O gluconato de clorexidina, comercialmente chamado de clorexidina foi

sintetizado no final dos anos 40 por cientistas que procuravam um agente para curar

a malária. Alguns anos mais tarde em 1954, decobriu-se sua verdadeira utilização:

um poderoso anti-séptico é um bactericida de amplo espectro no controle de

bactérias gram-positivos, gram-negativos, e fungos, além ser um excelente

bacteriostático, impedindo que bactérias se proliferem.

Em 1983, foi considerada como substância essencial pelo órgão máximo de

saúde internacional filiado a ONU (Organização das Nações Unidas) o WHO (World

Health Organization) e passou a ser um produto de primeira escolha.

É caracterizado por ser um detergente catiônico, da classe das biguanidas,

disponível nas formas de acetato, hidrocloreto e digluconato, sendo este último, o sal

mais comumente empregado nas formulações. 1

1 A palavra Microbiologia (introduzida em 1899) vem da junção do elemento de composição grego mikrós-, que significa pequeno e é utilizado em inúmeros vocábulos eruditos, principalmente a partir do século XIX, e biologia(grego bíos, vida+ grego logos, estudo, tratado).

13

Figura 1: Molécula de Gluconato de Clorexidina Fonte: wikipédia, 2009.

A clorexidina possui duas principais formas de atuação, proveniente de dois

tipos de sais: como digluconato, é um antimicrobiano de características

desinfetantes e sanitizantes, eficaz contra Salmonella spp., Listeria spp.,Clostridium

spp.,E.coli, Staphylococcus spp. e Pseudomonas spp.

Como Dicloridrato, age por contato na parede do intestino, recuperando e

estabilizando a integridade da flora intestinal, para melhorar a absorção de

nutrientes e proporcionar melhor desempenho produtivo.

Outras facilidades de manipular produtos contendo clorexidina, segundo

(Relatório técnico -Neobrax, 2009) são:

- Não desenvolve resistência bacteriana

- Não é absorvido pelo organismo

- Não agride a pele e as mucosas

- Baixa toxidez

- Não deixa resíduo

- Não é corrosivo

- Não requer enxágüe

- Não exala gases

- Não é volátil

- É de fácil manuseio

- Possui ação rápida e prolongada

Estas características possibilitam que a Clorexidina possa ser utilizada em

diversos segmentos de mercado como:

- Produção de aves

- Produção de suínos

14

- Produção de leite

- Alimentício

- Abatedouro e frigoríficos

- Usinas de açúcar e álcool

- Rações de animais

- Produtos veterinários

- Farmacêutico e cosmético

- Hospitalar e odontológico

- Tratamento de água

- Ar condicionado

- Limpeza

O Quadro 1 mostra os comparativos entre a Clorexidina e outros produtos

encontrados no mercado:

15

Quadro 1: Comparação entre a clorexidina e outros produtos do mercado

PRODUTO AÇÃO ESPECTRO T● C◘ COMENTÁRIOS

Álcool

Precipita proteínas

e desnatura lipídeos

Algumas bactérias

Alguns vírus envelopados

+ +

Ineficiente contra o Parvovírus e

outros não envelopados

Formol

Desagrega grupos

amino, hidroxila e

sulfidrila

Algumas Bactérias Fungos

Alguns vírus

+++ + Risco de

Carcinogenicidade e Mutagenicidade

Compostos Iodados

Reage com grupos

amino e sulfidra e

desagrega membranas

lipídicas

Algumas Bactérias Fungos

Alguns vírus Esporos Fúngicos

+ + Corrosivo em

algumas condições de uso

Cloro

Oxida enzimas e

altera a permeabilidade

da parede celular

Algumas Bactérias Poucos Fungos

Poucos vírus

+++ +++

Rapidamente neutralizado por

matérias orgânicas (urina

e fezes)

Compostos fenólicos (Amônia)

Desnatura proteínas e

altera a

permeabilidade da parede

celular

Algumas bactérias

Alguns vírus envelopados

+++ + Podem ser

Neurotóxicos

Glutaraldeído

Grupos sulfidra e

coagulação do citoplasma

Bactérias Alguns Fungos Esporos

Vírus

+++ + Toxidade

ambiental acima de 0,2 ppm/m³

Ácido peracético

Grupos sulfidra e

amônia, e atua por oxidação

Bactericida Fungicida ++ +++

É altamente inflamável e tem

odor forte

Clorexidina

Desestrutura a função

osmótica da membrana

celular dos organismos

Bactericida Fungicida Algicida Virucida

Não é tóxica

Não é corrosiva

Extremamente eficaz e segura,

pois não é absorvida pelo

organismo

T●: toxicidade; C◘: corrosividade Fonte: “Desinfection in veterinary and Farm animal pratice”- A. H. Linton – Blackwll ScientificPublication, 1988.

16

3.1.1 Propriedades da clorexidina

A Clorexidina é um composto sintético, derivado de uma biguanida que possui

um alto nível de atividade, comum em antimicrobianos de alto padrão, sem ter os

efeitos secundários que a maioria apresenta.

Devido a este alto grau de atividade, pequenas concentrações são suficientes

para inibir o processo reprodutivo ou exterminar a maioria das espécies bacterianas

que além de ser praticamente isenta de toxicidade e efeitos corrosivos proporcionam

alta segurança no ambiente de trabalho.

Suas concentrações mínimas inibitórias (MIC) situam-se bem abaixo de 4% o

que faz da Clorexidina um dos biocidas mais seguros e de melhores rendimentos.

A sua toxicidade conforme DL50 é de 1800mg/kg/dia (peso corpóreo), o que a

torne praticamente atóxica, além de não ser poluente, não exalar gases e não irritar

pele e mucosas.

Atua rapidamente, esterilizando em um tempo médio de 30s a 5 minutos,

dependendo da sua concentração e do tipo de microorganismo que se deseja

exterminar, sendo sua ação bactericida mais eficaz que a de fungicida.

Dispensa a prática de “rodízio”, pois relatos internacionais e nacionais

comprovaram que ela não permite o desenvolvimento de microorganismos de

mecanismos de resistência com aplicações intermitentes.

Devido a sua não volatilidade, permite que as soluções esterilizantes possam

ser preparadas previamente mantendo-se ativas por até 7 dias desde que abrigadas

da luz. (Relatório técnico-Neobrax, 2009).

3.1.2 Mecanismo de ação da Clorexidina

Seu mecanismo de ação está diretamente relacionado com a concentração

utilizada e ao pH da solução (entre 5,5 e 7,0).

O modo de ação da clorexidina se caracteriza por uma rápida absorção por

parte das células bacterianas, resultando numa série de modificações citológicas

que afetam sua permeabilidade e suas propriedades óticas. (Lawrence: Antimicrobial

Activity. In Vitro, of Chlorhexidine, J. Amer. Pharm.,1960).

17

A quantidade da droga absorvida é proporcional as saídas dos constituintes

celulares. As alterações que conduzem a extinção foram observadas, e levaram a

constatação de que os níveis máximos de saída dos constituintes celulares

resultaram da absorção da substância em quantidades elevadas, tanto para

Escherichia Coli, quanto para Staphylococcus aureus. (Lawrence J. Farm. Assoc.

1960).

O digluconato de Clorexidina estabelece ligação com a célula microbiana por

interação iônica. Esta ligação é favorecida pelo pH neutro ou ligeiramente alcalino e

pela disponibilidade de grupos carregados negativamente na superfície da parede

celular. A seguir ocorre lesão primária na menbrana semi permeável com vazamento

de importantes constituintes orgânicos e inorgânicos das células. Os grupos

lipofílicos do Digluconato de Clorexidina são os responsáveis pela desorientação da

membrana lipoprotéica microbiana, obstruindo sua atividade osmótica. (Relatório

técnico Neobrax, 2009).

3.1.3 Toxicologia

Estudos iniciais foram realizados por D. M. Foulkes (J. Peridont. ,1973) que

determinou a dose letal por vias oral e endovenosa, e a tolerância a administração

crônica, concluindo que a Clorexidina possui nível de toxicidade extremamente

baixo tanto para animais quanto para o homem. Pesquisas suplementares feitas por

Davies e col. (Brit.Pharmacol., 1976) confirmaram as conclusões anteriores e

determinou que para a Clorexidina o LD 50 é de 22mg/kg/dia na aplicação

endovenosa,e o LD 50 de 1800mg/kg/dia na administração oral. Estes resultados

foram obtidos a partir de experimentos levados a efeito com roedores (camundongos

e coelhos) e ruminantes (bovinos). Hubben, em 1977, constatou a ausência de

efeitos nocivos decorrentes da administração oral do Digluconato de Clorexidina.

Quanto ao potencial carcinogênico, foram feitos testes com 4 grupos de 224

ratos cada, que receberam doses de 5, 25 ou 50mg/kg de peso corporal, cada um

durante dois anos. Os piques de níveis ao término da posologia caíram pela metade

dentro de uma a duas semanas. Os níveis de Clorexidina no cérebro, pulmão,

fígado, rins, nódulos mesentéricos e outros linfáticos, bem como no sangue, foram

18

determinados em intervalos regulares durante a experimentação e nas três, seis e

nove semanas seguintes ao término da administração e nenhuma modificação

histológica foi encontrada. A concentração no fígado foi alta na fase final, mas caiu

pela metade após uma e duas semanas. Não foram constatadas incidências de

neoplasia nos grupos de controle e nos tratados. A toxidade oral aguda

extremamente baixa em animais de laboratório tem sido confirmada no homem nos

últimos 30 anos de experiência e uso irrestrito Malibach em 1977, efetuou teste de

fotolexidade ( potencial causador de dermatite alérgica ) e de fotosensibilidade,

concluindo pela inteira segurança no emprego da Clorexidina para com os humanos.

Nuno Álvares Pereira em 1985, pesquisando a toxidade aguda e crônica do

Digluconato de Clorexidina administrado por via oral em camundongos constatou:

- Incremento no ganho de peso em relação ao grupo controle;

- redução significativa no número de mortes atribuível a inibição de infecções

intercorrentes nos grupos tratados;

- ausência de efeitos teratogênicos. Case (Chemotherapy,1976) e Rushton

(1974) concluíram que a absorção percutânea é praticamente nula.

3.1.4 Espectro e atividade

A atividade bactericida é mais rápida que a fungicida e esta é fortemente

dependente do pH, sendo sua atividade máxima alcançada com pH 8, conforme

demonstra a tabela abaixo:

Tabela 1 – Atividades bactericidas da Clorexidina em diferentes pHs

pH Número de bactérias por mL após

0 min. 5min. 15 min.

5,25 4.000.000 >1.000.000 >1.000.000

6,22 4.000.000 2.300.000 50.000

7,08 4.000.000 90.000 5.000

7,97 4.000.000 17.000 900

Fonte: Davies, 1954.

19

3.1.5 Concentrações inibitórias mínimas (CIM)

Concentração inibitória mínima é a determinação da concentração mínima

necessária para que um composto seja capaz de inibir o crescimento de um dado

microrganismo. Esse valor chamado MIC ("Minimum Inhibitory Concentration") ou,

CIM (Concentração Inibitória Mínima) quantifica a atividade antimicrobiana do

composto. Consiste na diluição sucessiva de um determinado agente antibacteriano

e a posterior inoculação das diluições com uma suspensão de bactérias. Após um

certo período de incubação observa-se se houve o crescimento. A partir daí

determina-se a concentração mínima de agente antibacteriano necessária para

exterminar uma certa quantidade de bactérias. (Relatório técnico Neobrax, 2009).

A tabela 2 apresenta as concentrações inibitórias mínimas da Clorexidina

segundo NIELSEN (1977) para bactérias gram negativas;

20

Tabela 2 – MIC de clorexidina para bactérias gram-negativas

Microrganismos MIC (mcg/ml) de Clorexidina

Aeromonas aerogenes 12.5

Enterobacter cloacae 2.5 a 3.2

Escherichia coli 1.0 a 5.0

Klebsiella aerogenes 1.5 a 2.5

Klebsiella pneumoniae 6.2

Neisseria spp. 1.5 a 4.0

Salmonella Dublin 2.6

Salmonella typhi 1.6

Salmonella typhosa 2.5

Salmonella pullorum 7.0

Salmonella typhimurium 14.0

Salmonella gallinarum 1.6

Proteus marcescens 3.2 a 5.0

Proteus mirabilis 25.0 a 100.0

Proteus morgani 25.0 a 43.0

Proteus rettgeri 3.0 a 10.0

Proteus vulgaris 7.0 a 25.0

Pseudomonas aeruginosa 5.0 a 15.0

Pseudomonas fluorescens 5.0 a 15.0

Serratia marcescens (não pigmentado) 25.0

Serratia marcescens 50.0 a 75.0

Shigella flexneri 1.5

Shigella sonnei 1.6

Vibrio cholerae 7.0

Pasteurella multocida 5.0

Fonte: Nielsen, 1977.

21

Tabela 3 – MIC de clorexidina para bactérias gram-positivas

Microrganismos MIC (mcg/ml) de Clorexidina

Bacillus cereus 3.0

Bacilllus megaherim 1.0

Bacillus subtilis 1.4 a 3.0

Clostridium botulinum 3.5

Clostridium novyi 1.8

Clostridium perfringens 14.0

Clostridium tetani 7.0

Clostridium welchii 70.0

Corybacterim acnes 10.0 a 5.0

Corynebacterim diphitheriae 8.0

Corynebacterim xerosis 7.5 a 6.0

Micrococcus spp. 1.5 a 6.0

Mycobacterim balnei 5.0

Mycobacterim smegmatis 0.5

Mycobacterim tuberculosis 0.7 a 6.0

Sarcina lútea 2.0

Staphylococcus álbuns 0.5 a 2.0

Staphylococcus aureus 1.0 a 2.5

Staphylococcus epidermidis 0.25 a 6.0

Streptococcus faecalis 1.5 a 3.0

Streptococcus lactis 1.4

Streptococcus mutans 0.1

Streptococcus pneumoniae 7.0

Streptococcus pyogenes 0.6 a 5.0

Fonte: Nielsen, 1977.

22

Tabela 4 – MIC de clorexidina para Fungos

Microorganismos MIC (mcg/ml) de Clorexidina

Aspergillus Níger 200.0

Aspergillus vesicolor 75.0

Blastomuces dermatitidis 25.0

Candida albicans 6.0 – 12.5

Candida parasilosis 30.0

Cladoporium espécies 75.0

Crytococcus espécies 20.0

Debariomyces espécies 10.0

Microsporum audonini 14.0

Microsporum canis 18.5

Micrsoporum gypseum 14.0

Mucos plubeus 125.0

Penicillium notatum 200.0

Penicillium roqueforti 150.0

Rhizopus nigricans 175.0

Saccharomyces cerevisias 50.0

Saccharomyces ellipsoideus 50.0

Sporendonemina espécies 50.0

Trichoderma viride 125.0

Trichophiton abdonini 14.0

Fonte:Nielsen, 1977.

3.2 Sangue

Líquido orgânico de importância vital para o homem e para muitos animais.

Este por sua vez é um líquido biológico de alta complexidade no qual ocorrem

diversos processos bioquímicos e fisiológicos, como o transporte de oxigênio, as

reações imunológicas e a circulação dos nutrientes pelo sistema vascular.

É um tecido líquido do organismo, caracterizado pela presença de elementos

celulares próprios pela fluidez que possibilita sua circulação por todo o corpo. Sua

coloração em geral é vermelha, devido a hemoglobina, pigmento responsável pela

23

fixação do oxigênio necessário a respiração ; em alguns vertebrados , pode ser

esverdeado ou azulado, por causa de outros pigmentos. (Webciência,2009).

3.2.1 Características fisiológicas do sangue

O sangue mais complexo é o dos vertebrados, porque Possi uma infinidade de

componentes celulares, pela variedade de biomoléculas que abriga e também pela

perfeição dos mecanismos bioquímicos e fisiológicos intermediados por ele. Nos

animais com sistema circulatório diferenciado e fechado, líquido sanguíneo circula

por todo o organismo através do sistema vascular, impulsionado pelas contrações

do coração. O sangue serve como meio de fixação do oxigênio externo, graças a

presença de pigmentos oxidáveis como a hemoglobina; é veículo para transporte de

nutrientes até os tecidos do organismo e para a remoção dos produtos da excreção

celular; conduz o excesso de calor gerado nos órgãos mais profundos e ativos para

a superfície do corpo, onde é dissipado; intermedeia as reações imunológicas, que

defendem o organismo da agressão de agentes patogênicos; e abriga todos os tipos

de biomoléculas, como os hormônios , autênticos mensageiros celulares que

estimulam ou inibem a atividade de órgãos e tecidos distantes das glândulas que os

sintetizam. (Kerr,2000).

3.3 Plasma

Em essência, o plasma é uma solução aquosa com aproximadamente 91 a

92% de água, diversos íons metabólicos, nutrientes (glicose, gorduras e

aminoácidos), hormônios, etc. No organismo serve de meio de transporte aos

nutrientes, as células sanguíneas e aos produtos de excreção resultantes do

metabolismo celular; ajuda a manter a pressão sanguínea, distribui de maneira

uniforme o calor do corpo, preserva o equilíbrio básico do organismo e é vital para o

funcionamento de todos os órgãos.

As proteínas plasmáticas como as albuminas, betaglobulinas (transportadoras

de lipídios, como o colesterol, açúcares, esteróides ou íons), o fibrinogênio (que

intervém na coagulação) e as chamadas imunoglobinas (gamaglobulinas,

responsáveis pelas reações antígeno-anticorpo) contribuem de forma decisiva para

24

a manutenção do pH e da pressão osmótica do sangue. As proteínas plasmáticas

impedem a perda excessiva de líquidos capilares: a água e a maioria das

substâncias dissolvidas no plasma podem atravessar com facilidade as paredes dos

capilares, o que não ocorrem com as moléculas de proteína. Isso cria uma pressão

osmótica que assegura a manutenção, dentro de certos limites, do nível de líquido

nas vias circulatórias. Esta função reguladora é resultado, em grande parte, da

presença da albumina. (Webciência,2009).

3.4 Urina

Nos mamíferos, a urina é um fluído excretório, resultante da filtragem do

sangue nos rins. Nas aves e nos répteis é uma excreção sólida ou semi-sólida. a

urina é formada na filtração, no qual é feita nos néfrons, que obtém uma parede, um

tubo, que é chamado de túbulo no qual é revestido de vasos sanguíneos, que sugam

os nutrientes que o organismo precisa, para depois ir para ureteres, que vai para

bexiga ser armazenado, e depois passado para a uretra, sendo expelida.A urina é

um liquido excretado pelos rins através das vias urinárias, pelo qual são eliminadas

substâncias desnecessárias ao organismo.

Desempenha um papel importante na regulação do balanço de líquidos e no

equilíbrio entre ácidos e bases. Nas pessoas sadias possui coloração clara

(amarelada).

A quantidade de urina produzida diariamente é de 1 a 1,5 litro, contudo, esta

referência pode aumentar ou diminuir dependendo da quantidade de liquido

ingerido.(Todabiologia,2009).

3.4.1Composição da urina

A urina é composta aproximadamente por 95% de água e 2 % de uréia. Nos

3% restantes, podemos encontrar fosfato, sulfato, amônia, magnésio, cálcio, ácido

úrico, creatina, sódio, potássio e outros elementos.

25

3.5 ATCC - American Type Culture e Collection

Os microrganismos representam uma imensa diversidade genética e

desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, como

cadeias de alimentos e ciclos geoquímicos e ainda podem causar epidemias e

pandemias.

Hoje, as chamadas coleções de culturas desempenham um papel fundamental

em estudos e conservação dos recursos genéticos microbianos. Entre as coleções

privadas e governamentais, podemos destacar a American Type Culture Collection

(ATCC) uilizada para a realização deste trabalho, que são conhecidas

internacionalmente e trabalham com materiais certificados.

3.5.1 Staphylococcus aureus ATCC 25923

O Staphylococcus aureus, também conhecido como estafilococo dourado é

uma espécie de estafilococo coagulase-positivos. È uma das espécies patogênicas

mais comuns e a mais virulenta espécie do seu gênero. O Staphylococcus aureus é

comum em ambientes como cozinhas, banheiros, hospitais, áreas e outras

dependências. (Wickpédia,2009).

Figura 2- Staphylococcus aureus Fonte: http://www.physorg.com/newman/gfx/news/saureusbacte, 2009.

26

3.6 Isolado Clínico

O isolado clínico é derivado de um processo clínico infeccioso em humanos

sem mais características identificáveis. Suas características fenotípicas e

genotípicas apresentam uma diversidade, muitas vezes adaptadas aos fatores

ambientais (Trabulsi et all, 2008).

4 Parte Experimental

A parte experimental deste trabalho iniciou no dia 30/03/2009 e terminou no dia

30/04/2009.

As análises microbiológicas necessitam de um preparo prévio do material antes

da análise propriamente dita. Todo o material utilizado, tais como ponteiras, placas

de petri, água destilada, tubos de ensaio foram esterilizados sempre antes dos dias

de execução dos ensaios. O caldo BHI (Brain Infusion Broth) foi devidamente

preparado, conforme anexo B deste trabalho.

Todas as análises foram efetuadas em aerobiose em estufa a 37ºC.

4.1 Materiais e métodos

Os materiais e equipamentos utilizados no desenvolvimento do trabalho estão

descritos abaixo:

§ Tubos de ensaio com tampa rosca

§ Erlenmeyers

§ Hastes para tubos

§ Placas de petri

§ Tubos eppendorfs

§ Pipetadores automáticos com ajuste monocanal marca Kacil : 10/100µL e

200/1000µL

§ Ponteiras

§ Bico de bunsen

§ Estufa bacteriológica marca De Leo

§ Capela de exaustão fixa

28

§ Cabine de fluxo laminar vertical CFLV-09 Veco

§ Auto clave vertical marca: Bio Eng Mod A30 – 30 litros

§ Centrífuga clínica Macro 3660 RPM

§ Espátula de Drigalsky

§ Digluconato de Clorexidina 20% marca: Alpha Química conforme certificado

de análise em anexo A

§ Caldo BHI (Brain Infusion Broth) marca: Himedia Laboratories PV.T Limited

lote: WA 187 validade: 02/2011

§ Ágar BHI marca: Himedia Laboratories PV.T Limited lote: WA 187 validade:

02/2011

§ Amostras de sangue

§ Amostras de urina

§ ATCC 25923 Staphylococcus aureus

§ IC

§ Câmera Digital- Digitron 6s marca Tron

4.2 Microrganismos

Foram utilizados como microrganismos teste Staphylococcus aureus ATCC

25923 e Isolado clínico correspondente. Os pré inóculos citados foram

desenvolvidos em meio líquido, em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas para

facilitar o manuseio durante os experimentos.

29

Figura 3 – ATCC 25923 Staphylococcus aureus e Isolado clínico Fonte: Autoria própria, 2009.

4.3 Matéria orgânica

Para a realização deste trabalho, foram utilizados líquidos biológicos coletados

de animais de laboratório em condições padrão, nos dias dos experimentos. As

amostras de sangue foram centrifugadas por 10 minutos para que pudéssemos

separar o plasma que também foi utilizado nos testes.

Figura 4 – Amostras de sangue Fonte: autoria própria, 2009.

30

Figura 5 – Amostra de urina Fonte: autoria própria, 2009.

4.4 Teste de eficácia da Clorexidina frente às matérias orgânicas e aos

microrganismos

Como o as concentrações mínimas inibitórias (MIC) da Clorexidina ficam

abaixo de 4%, este trabalho fixou a concentração de uso de clorexidina em 2% e

variamos as concentrações de matéria orgânica e de microrganismos. Esta

concentração é coerente com as soluções de clorexidina encontradas no mercado

que são de 20%, bastando fazer diluições para utilizar as concentrações desejadas.

Segundo o The Nactional Commitee for Clinical Laboratory Standards para

determinações em Agar o MIC recomendado para os pré inóculos é de 10 -4. Então

iniciamos os trabalhos nestas concentrações.

Os protocolos analisados compreenderam: o prévio preparo das placas de petri

com o Agar BHI e o preparo das amostras.

As amostras foram preparadas, adicionando as matérias orgânicas, os

microrganismos (ATCC e IC) e por último a Clorexidina em tubos de ensaio com

tampa rosca e incubados em estufa de cultivo bacteriológica a 37ºC por 10minutos.

Em seguida foram efetuadas diluições das concentrações de 10-1 a 10 -6.

31

De cada diluição, transferimos 0,1mL para as placas de petri contendo o Agar

BHI e espalhamos por toda a superfície da placa com o auxílio da alça de Drigalsky,

incubando as placas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24horas.

A leitura dos resultados foi realizada através de observação das placas quanto

a presença ou ausência de crescimento microbiano.

Figura 6 – Esquema dos protocolos realizados Fonte: Microbiologia de Brock, p.136, 2004.

4.4.1 Protocolo 1

No primeiro protocolo foi testada a eficácia da clorexidina, frente aos dois

microrganismos: ATCC e Isolado Clínico, com os três tipos de matéria orgânica:

sangue, plasma e urina, na concentração 10-2 e realizado em duplicata.

A tabela 5 mostra os resultados encontrados no protocolo 1;

32

Tabela 5 – Resultados do protocolo 1

Placas

Agente bactericida – clorexidina 2%

Matéria

orgânica Microrganismos Resultados

1

Plasma

ATCC NC

2 ATCC NC

1 Isolado Clínico NC


1

Sangue

ATCC NC

2 ATCC NC



1

Urina

ATCC NC

2 ATCC NC



NC: Não houve crescimento bacteriano Fonte: autoria própria, 2009.

Figura 7 – Placas do protocolo 1 Fonte: autoria própria, 2009.

33

Figura 8 – Protocolo 1: ATCC e IC da Urina Fonte: autoria própria, 2009.

4.4.2 Protocolo 2

No segundo protocolo foram adicionados os dois tipos de microrganismos e os

três tipos de matéria orgânica na concentração 10-2 e não foi adicionado o agente

bactericida - controle negativo do trabalho.

A tabela 6 mostra os resultados encontrados no protocolo 2:

34


Placas Matéria

orgânica Microrganismos Resultados

1

Plasma

ATCC Ufc inc.

2 ATCC Ufc inc. 1 Isolado Clínico Ufc inc. 2 Isolado Clínico Ufc inc. 1

Sangue

ATCC Ufc inc. 2 ATCC Ufc inc. 1 Isolado Clínico Ufc inc. 2 Isolado Clínico Ufc inc. 1

Urina

ATCC Ufc inc. 2 ATCC Ufc inc. 1 Isolado Clínico Ufc inc. 2 Isolado Clínico Ufc inc.

Ufc inc.: unidades formadoras de colônias incontáveis Fonte: autoria própria, 2009.

Figura 9 – Placa do protocolo 2; ufc – unidades formadoras de colônias incontáveis. Fonte: autoria própria, 2009.

35

4.4.3 Protocolo 3

No terceiro protocolo foram adicionados somente os microrganismos e o

agente bactericida, a fim de verificar algum interferente proveniente nas matérias

orgânicas.


Placas Microrganismos

Agente

bactericida Resultado

1 ATCC

Clorexidina

2%

NC

2 NC

1 Isolado clínico

NC

2 NC

NC: não houve crescimento bacteriano. Fonte: autoria própria, 2009.

Figura 10 – Placas do protocolo 3: não houve crescimento bacteriano. Fonte: autoria própria, 2009.

36

4.4.4 Protocolo 4

No protocolo 4 foi aumentado em 5% a concentração inicial de matéria

orgânica e de ATCC, permanecendo a concentração de clorexidina em 2% . Foram

feitas diluições de 10-1 a 10-6. Realizamos as análises em duplicatas em placas com

as diluições de 10 -3 a 10 -6.


Placas


Matéria orgânica Microrganismo Diluições

10-3 10-4 10-5 10-6

1 Plasma

ATCC

NC NC NC NC

2 NC NC NC NC

1 Sangue

NC NC NC NC

2 NC NC NC NC

1 Urina

NC NC NC NC

2 NC NC NC NC NC: Não houve crescimento bacteriano Fonte: autoria própria,2009.

4.4.5 Protocolo 5

No protocolo 5 foi aumentado em 10% a concentração inicial de matéria

orgânica e de ATCC, permanecendo a concentração de clorexidina em 2% . Foram

feitas diluições de 10-1 a 10-6. Realizamos as análises em duplicatas em placas com

as diluições de 10 -3 a 10 -6.

A tabela 9 mostra os resultados do protocolo 5:

37


Placas


Matéria orgânica Microrganismo Diluições

10-3 10-4 10-5 10-6

1 Plasma

ATCC

NC NC NC NC

2 NC NC NC NC

1 Sangue

Ufc inc. NC NC NC

2 NC NC NC NC

1 Urina

NC NC NC NC

2 NC NC NC NC NC: não houve crescimento bacteriano; Ufc. Inc. unidades formadoras de colônias incontáveis. Fonte: autoria própria, 2009.

Figura 11 – Placas do protocolo 5 Fonte: autoria própria, 2009.

5 CONCLUSÃO

As análises microbiológicas nos fornecem uma ampla noção da verdadeira

eficácia dos agentes bactericidas. Todos nós estamos rodeados de microrganismos

e convivemos com eles diariamente, nas nossas casas, nos restaurantes, na

universidade, enfim em todos os lugares eles estão presentes e muitas vezes são

causadores de doenças.

Este trabalho comprovou e forneceu dados para que o digluconato de

clorexidina na concentração de 2% possui propriedades microbianas satisfatórias,

capazes de inibir o Staphylococcus aureus, na presença de interferentes como

líquidos biológicos.

No último protocolo, ocorreu o crescimento microbiano, apenas nas placas

contendo, sangue, devido as suas características diferenciadas das outras matérias

orgânicas testadas, pois o sangue é o responsável pelo transporte de nutrientes,

oxigênio, neurotransmissores, hormônios e imunoglobulinas, além de substâncias

tóxicas para serem eliminadas, enquanto o plasma é composto de 92% de água e

7% proteínas e a urina 95% de água, 2% uréia e outros elementos.

É possível concluir, por meio de suas características desinfetantes e nas

condições testadas neste trabalho, que o digluconato de clorexidina, além de mais

acessível em questões financeiras e na sua aplicabilidade, pode ser uma opção de

escolha como principio ativo de compostos bactericidas existentes atualmente no

mercado.

REFERÊNCIAS

ANDRADE, Tânia Sueli de et al.Seção de coleção de culturas do Instituto Adolfo Lutz- 68 anos de história dedicados a saúde pública. Bepa, São Paulo,v.5,n.59,p.10-15, nov.2008. BAMBACE, Andréa Moreira Jacolucci et al. Eficácia de soluções aquosas de clorexidina para desinfecção de superfícies.Revista Biociências, Taubaté, v.9,n.2,p.73-81,abr.2003. CAVALIERI, Stephen J.; SANDERS, Christine C.; NEW,Charles. Influence of β-lactamase inhibitors on the potency of their companion drug with organisms possessing class I enzymes. Antimicrobial agents and chemotherapy, Nebraska,v.35,n.7, p.1343-1347, jul.1991. CLOREXIDINA – Relatório técnico. 2009. Disponível em < http://www.neobrax.com.br > Acesso em: 15 mar.2009. SANGUE, plaquetas, glóbulos brancos e vermelhos, doenças sanguíneas. 2009. Disponível em <http://www.webciencia.com/11_20sangue.htm> Acesso em 15 mar..2009. KERR, Jeffrey B. Atlas de histologia funcional. Ed. Artes médicas. São Paulo,2000. MADIGAN, Michel T; MARTINKO,John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de Brock. Ed.10. São Paulo:Prentice Hall,2004. MERK. Manual de medios de cultivo.Copyright. Darmstadt: 1994. NEDER, Rahme Neely. Microbiologia- manual de laboratório. ed. 5. São Paulo: Nobel,1992. SALVARANI, Felipe Masiero et al.Concentração inibitória mínima (CIM) de antimicrobianos frente a isolados de Streptococcus suis. Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v.45, n.1, p.41-47, jan.2008. SANTOS, Andréa Machado dos.; MOURA, Alexandre Carvalho de.;Perfil de resistência microbiana aos principais sanitizantes utilizados em frigoríficos da cidade de Cascavel, Paraná. TRABULSI, L.R.; ALTETHUN, F.; CANDEIAS NETO, J.A.;& FISCHMANN, O. (eds. ) Microbiologia. 5a edição. Livraria Atheneu Editora, Rio de Janeiro, 2008.

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URINA saiba mais sobre ela. 2009. Disponível em <http://www.todabiologia.com/dicionario/urina.htm> Acesso em 26 mar.2009. UTILIZAÇÃO do digluconato de clorexidina em maças.2009. Disponível em < http://www.neobrax.com.br > Acesso em 15 mar.2009. ZANATTA, Fabrício Batistin; RÖSING, Cassiano Kuchenbecker. Clorexidina: mecanismo de ação e evidências atuais de sua eficácia no contexto do biofilme supragengival.Scientific-p.35-43, 2007. Wickpedia,2009.Disponível<htemp://pt.wickpedia.org/wiki/gluconato_de_clorexidina> Acesso em 10 jan.2009. Wickpedia, 2009.Disponível<htemp://pt.wickpedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus> Acesso em 16 mar. 2009.

41

ANEXO A – Certificado do digluconato de clorexidina 20%

42

ANEXO B – Preparo do meio de cultura : Caldo BHI (Brain heart infusion broth):

infusão de cérebro e coração

Dados:

Fabricante: Himedia Laboratories P.V.T limited

Origem: Índia

Nº. do registro no MS/ANVISA: 10200510078

Lote: WA 187

Validade: 02/2011

Preparação:

Pesar 52g/L de (Agar-cérebro-coração) e 37g/L de caldo de cérebro e coração,

dissolver em água destilada e esterilizar em autoclave a 121ºC por 15 minutos.

pH: 7,4 +/- 0,2

eficÁcia do digluconato de clorexidina frente a … · adriana macedo da rocha eficÁcia do...

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