efeitos do thiodan® em fÍgado e em ovÁrios em …

LUCAS MARCON

EFEITOS DO THIODAN reg EM FIacuteGADO E EM OVAacuteRIOS EM

MATURACcedilAtildeO AVANCcedilADA DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus

Tese apresentada agrave Universidade Federal de Viccedilosa como parte das exigecircncias do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doctor Scientiae

VICcedilOSA MINAS GERAIS ndash BRASIL

2013

i

LUCAS MARCON




APROVADA

____________________________________ ______________________________

Profa Dra Marlene Isabel Vargas Viloria Profa Dra Mary Anne Heidi Dolder

(Coorientadora)

____________________________________ _____________________________

Prof Dr Nilo Bazzoli Prof Dr Joseacute Domingos Guimaratildees

_________________________________

Prof Dr Laeacutercio dos Anjos Benjamin

(Orientador)

ii

AGRADECIMENTOS

A Deus aos meus pais (Carlos e Narcisa) irmatildeos (Luciana e Luacutecio) orientador

(Laeacutercio dos Anjos Benjamin) e minha namorada (Mirlaine Soares) por me

incentivarem acreditarem confiarem e sempre estarem ao meu lado demonstrando

sugestotildees construtivas para a vida e para este trabalho

Aos membros da banca examinadora dessa tese pela disponibilidade e sugestotildees

construtivas para enriquecimento desse trabalho

Agrave CAPES FAPEMIG e Departamento de VeterinaacuteriaUFV pelo apoio financeiro

para o desenvolvimento do presente estudo

Aos professores e funcionaacuterios do Departamento de VeterinaacuteriaUFV e

Departamento de Morfologia - ICBUFMG pelos ensinamentos e paciecircncia para

concretizaccedilatildeo das teacutecnicas utilizadas neste estudo

A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a realizaccedilatildeo deste

estudo e conviveram comigo ao longo desses anos em Viccedilosa-MG

iii

BIOGRAFIA

LUCAS MARCON filho de Carlos Marcon Filho e Narcisa das Dores Marcon

nasceu em 29 de janeiro de 1980 em Campinas-SP

Em fevereiro de 1999 ingressou no curso de Ciecircncias Bioloacutegicas pela Pontifiacutecia

Universidade Catoacutelica de Campinas (PUC-Campinas) onde em janeiro de 2003

graduou-se nesta Instituiccedilatildeo No ano de 2002 foi bolsista de iniciaccedilatildeo cientifica pela

FAPESP no Departamento de Biologia Celular Instituto de BiologiaUNICAMP

Em maio de 2006 ingressou no Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina

Veterinaacuteria na Universidade Federal de Viccedilosa - MG sob orientaccedilatildeo do professor

Laeacutercio dos Anjos Benjamin na linha de pesquisa Morfofisiologia de Animais

Domeacutesticos e Selvagens (Reproduccedilatildeo e Toxicologia de Peixes) defendendo a

dissertaccedilatildeo de mestrado em fevereiro de 2008 e tese de doutorado em dezembro de

2013 obtendo os tiacutetulos de Magister Scientiae e Doctor Scientiae

iv

IacuteNDICE

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO GERAL

11 O uso de agrotoacutexicos

12 Tipos de inseticidas

13 Inseticidas no meio ambiente rotas de entrada

14 Avaliaccedilatildeo de solubilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica

15 Caracterizaccedilatildeo do agrotoacutexico Thiodanreg

16 O uso do endosulfan

17 Toxicidade aguda do endosulfan

18 Efeitos dos inseticidas organoclorados sobre peixes

19 O lambari Astyanax bimaculatus

110 Morfologia hepaacutetica em teleoacutesteos

111 Morfologia ovariana em teleoacutesteos

vi

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2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral

22 Objetivos especiacuteficos

3 MATERIAL E MEacuteTODOS

31 Animais

32 Agrotoacutexicos

33 Teste de toxidade aguda em sistema estaacutetico - CL50

34 Teste de toxidade subletal em sistema estaacutetico

35 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegica

351 Microscopia de luz

352 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos fiacutegados

353 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas dos ovaacuterios

354 Imunoistoquiacutemica

36 Paracircmetros biomeacutetricos

37 Anaacutelises estastiacuteticas

4 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

15

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v

5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

51 CAPIacuteTULO 1 Efeitos do inseticida Thiodanreg sobre a morfologia

hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus

Resumo

1 Introduccedilatildeo

2 Material e meacutetodos

3 Resultados

4 Discussatildeo

5 Referecircncias bibliograacuteficas


do desenvolvimento folicular em lambaris Astyanax bimaculatus

Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


53 CAPIacuteTULO 3 Relaccedilatildeo entre colaacutegeno tipo IV integrina β1 e

caspase 3 durante o desenvolvimento folicular em Astyanax

bimaculatus expostos ao Thiodanreg

Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


6 CONCLUSOtildeES

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RESUMO

MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa dezembro de 2013 Efeitos do Thiodanreg em fiacutegado e em ovaacuterios em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris Astyanax bimaculatus Orientador Laeacutercio dos Anjos Benjamin Coorientadoras Ann Honor Mounteer e Marlene Isabel Vargas Viloria

O agrotoacutexico Thiodanreg (350gL de endosulfan) eacute um inseticida organoclorado utilizado

em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos e afetar a

reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes O fiacutegado eacute um dos principais

oacutergatildeos para a biotransformaccedilatildeo de diversos xenobioacuteticos Quando os peixes satildeo

expostos a uma concentraccedilatildeo elevada de agentes quiacutemicos podem ocorrer danos

hepaacuteticos Os ovaacuterios de peixes apresentam foliacuteculos em diferentes estaacutedios de

desenvolvimento que satildeo envoltos por zona radiata ceacutelulas foliculares membrana basal

e ceacutelulas da teca formando o complexo folicular Agentes estressores podem causar

aumento ou diminuiccedilatildeo do diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos alterar a quantidade de

foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento e aumentar a incidecircncia de atresia

Assim o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodanreg sobre o fiacutegado

e ovaacuterios de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de anaacutelises morfoloacutegica

morfomeacutetrica e imunoistoquiacutemica Os peixes expostos ao toacutexico foram divididos em

quatro experimentos 1) sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo 2) sem aclimataccedilatildeo e

alimentados 3) com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo 4) com aclimataccedilatildeo de

10 dias e alimentados Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees

diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 de 1367microgL preacute-determinada em laboratoacuterio

de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada

experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle livre de toacutexico

com trecircs repeticcedilotildees contento 10 peixes para cada concentraccedilatildeo Apoacutes as 96h seis peixes

de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaiacutena (110000) de acordo

com as Normas da Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de VeterinaacuteriaUFV (protocolo

242009) Os fiacutegados e ovaacuterios foram coletados e processados por teacutecnicas histoloacutegicas

rotineiras As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz Olympus CX31 Foram

obtidas imagens digitais de 10 campos aleatoacuterios por animal em objetiva de 20X e 40X

para avaliaccedilatildeo histoloacutegica As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada nos testes em sistema

estaacutetico foram mantidas de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT

2007) A anaacutelise histoloacutegica dos fiacutegados mostrou no experimento 1 (sem

vii

aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo) na concentraccedilatildeo de 56microgL de Thiodanreg a menor

intensidade (010plusmn00) da reaccedilatildeo ao PAS no citoplasma dos hepatoacutecitos quando

comparada ao grupo controle (133plusmn051) No entanto houve diferenccedila (Plt005) nesse

mesmo experimento quando comparado com as concentraccedilotildees 115microgL (266plusmn081) e

23microgL (300plusmn00) caracterizando depleccedilatildeo de glicogecircnio Aleacutem disso houve

alteraccedilotildees do diacircmetro de nuacutecleos e citoplasma dos hepatoacutecitos nos diferentes

experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos nos grupos expostos ao

Thiodanreg associada com a reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma O Iacutendice de Alteraccedilatildeo

Histoloacutegica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 433 a 833 (para os grupos

controles) 1850 a 2883 (para as concentraccedilotildees de 115microgL) 2033 a 2833 (para as

concentraccedilotildees de 23microgL) e 2366 a 2766 (para as concentraccedilotildees de 56microgL) Os

lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os

grupos controle inferiores (Plt005) aos grupos expostos Estes resultados demonstraram

que o Thiodanreg pode estar influenciando as funccedilotildees hepaacuteticas pela maior mobilizaccedilatildeo

das reservas de glicogecircnio na concentraccedilatildeo 56microgL As alteraccedilotildees observadas nos

fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo alteraccedilotildees de estaacutedio I e II indicando

dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico nos diferentes grupos e experimentos Nos ovaacuterios

percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em niacuteveis subletais natildeo afetou a morfologia dos

diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular Poreacutem os experimentos com

aclimataccedilatildeo demonstraram alteraccedilotildees nas quantidades de foliacuteculos primaacuterios e

secundaacuterios quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimataccedilatildeo

Aleacutem disso houve aumento do nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos e diacircmetro dos foliacuteculos

secundaacuterios nos grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos Estes

resultados sugerem mecanismos compensatoacuterios da perda reprodutiva quando em meio

com condiccedilotildees desfavoraacuteveis As anaacutelises imunoistoquiacutemicas demonstraram marcaccedilatildeo

crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina β1 e

colaacutegeno tipo IV Entretanto a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular

de foliacuteculos secundaacuterios mesmo quando os peixes satildeo expostos a diferentes

concentraccedilotildees de Thiodanreg o que confirma a integridade das ceacutelulas foliculares e da via

apoptoacutetica caspase-3-dependente a qual pode estar sendo ativada para futuros processos

de regressatildeo folicular

viii

ABSTRACT

MARCON Lucas D Sc Universidade Federal de Viccedilosa December 2013 Effects of Thiodanreg in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus Advisor Laeacutercio dos Anjos Benjamin Co-advisors Ann Honor Mounteer and Marlene Isabel Vargas Viloria

The pesticide Thiodanreg (350gL-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used

in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and

the health of fish populations The liver is a major organ for the biotransformation of

many xenobiotics and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of

chemical substances The fish ovaries have oocytes at different stages of development

that are surrounded by zona radiata follicular basal membrane and teca cells to form the

follicular complex Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter

of the secondary follicles vitellogenic depletion a change the number of follicles at

different stages of development and an increase the incidence of atresia The present

study aimed to evaluate the effects of Thiodanreg on the liver and ovaries of Astyanax

bimaculatus through morphological morphometric and immunohistochemistry analysis

The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments

without adaptation and no feeding feeding without adaptation with adaptation and no

feeding with adaptation and feeding All experiments used three different

concentrations of Thiodanreg lower than the LC50 of 1367 microgL-1 previously determined

in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088

(ABNT 2007) The concentrations used in each experiment were 115 23 and 56

microgL-1 and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium After

96h six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine

(110000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary

DepartmentUFV (protocol 242009) Livers and ovaries were collected and processed

by histological techniques The slides were examined under the light microscope

Olympus CX31 Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X

and 40X objective for evaluation The characteristics of the water used in acute tests

were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR

15088 (ABNT 2007) In the experiment 1 (without adaptationno feeding) at the

concentration of 56 mgL-1 of Thiodanreg (010 plusmn 00) the intensity of the PAS reaction

was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (133 plusmn

ix

051) In the same experiment differences in glycogen depletion were (Plt005) when

compared to the concentrations 115 gL-1 (266 plusmn 081) and 23 gL-1 (300 plusmn 00) In

addition changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all

experiments were observed and an increase in the number of hepatocyte nuclei in

groups exposed to Thiodanreg was associated with a reduction in the amount of

cytoplasm However the IHA was maintained between 433 to 833 (control group)

1850 to 2883 (115 mgL-1 group) 2033 to 2833 (23 gL-1 group) and 2366 to 2766

(56 gL-1 group) These results suggest that Thiodanreg may be influencing liver

functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of

exposition The changes observed in the livers of A bimaculatus were not severe

classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all

experiments It was observed in the ovaries that the action of Thiodanreg in sublethal

levels did not affect (Plt005) the morphology of the different stages of follicle

development However the experiments demonstrated an adaptation response in the

number of primary and secondary follicles compared to fish without adaptation In

addition there was a growing incidence of atretic follicles and increased diameter of the

secondary follicles in the groups exposed to Thiodanreg in all experiments These results

suggest an adaptive response to offset reproductive loss where in unfavorable

conditions The immunohistochemical analysis showed increasing and uniform labeling

throughout the follicular development for integrin β1 and collagen type IV However

caspase 3 was observed only in the secondary ovarian follicular complex even when

fish were exposed to different concentrations of Thiodanreg which characterizes the

integrity of follicular cells and the apoptotic pathway-dependent caspase-3 which may

be activated for future follicular regression

1



Agrotoacutexicos satildeo produtos e agentes de processos fiacutesicos quiacutemicos ou bioloacutegicos

destinados ao uso nos setores de produccedilatildeo no armazenamento e beneficiamento de

produtos agriacutecolas nas pastagens na proteccedilatildeo de florestas nativas ou implantadas e de

outros ecossistemas e tambeacutem de ambientes urbanos e industriais cuja finalidade eacute

preservaacute-los da accedilatildeo danosa de seres vivos considerados nocivos (Lei Federal 7802 de

110789) Os agrotoacutexicos satildeo importantes na agricultura todavia exigem precauccedilatildeo no

seu uso visando a proteccedilatildeo dos operaacuterios que os manipulam e aplicam dos

consumidores dos animais de criaccedilatildeo de abelhas peixes de organismos predadores e

parasitas e enfim do meio ambiente

Certas praacuteticas agriacutecolas ligadas ao modelo de produccedilatildeo agriacutecola como o uso

excessivo e inadequado de agrotoacutexicos a destruiccedilatildeo da cobertura vegetal dos solos para

plantio a natildeo preservaccedilatildeo das matas ciliares e das vegetaccedilotildees protetoras de nascentes

dentre outros fatores satildeo responsaacuteveis por grande parte dos problemas com os recursos

hiacutedricos (Matuo 1990)

Os inseticidas constituem importante grupo de praguicidas para o uso agriacutecola

que ano apoacutes ano mostra um aumento progressivo em seu uso na Ameacuterica do Sul

Estes nas uacuteltimas deacutecadas comeccedilaram a substituir inclusive o trabalho mecacircnico e

manual dos agricultores Ruumlegg et al (1987) e Tomita amp Beyruth (2002) relatam que o

modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotoacutexicos Estes

compostos satildeo empregados haacute muito tempo e a partir da 2deg guerra mundial passaram a

ser mais intensamente utilizados

Nos uacuteltimos 40 anos a agricultura brasileira sofreu inuacutemeras e profundas

transformaccedilotildees que alteraram tanto a composiccedilatildeo das culturas como os processos de

produccedilatildeo e padrotildees tecnoloacutegicos ateacute entatildeo em vigor Ruumlegg et al (1987) enfatizam que

o processo de modernizaccedilatildeo entendido como uma seacuterie de transformaccedilotildees tecnoloacutegicas

nos processos produtivos intensificou o emprego de insumos como maacutequinas

fertilizantes e agrotoacutexicos que contam com preccedilos favoraacuteveis e estiacutemulos como creacutedito

farto a juros subsidiados que facilitaram sua ampla adoccedilatildeo no meio rural Assim

agrotoacutexicos tecircm sido amplamente utilizados como uma das principais ferramentas para

um bom programa de controle de plantas daninhas em culturas que tecircm ganhado espaccedilo

na balanccedila comercial agriacutecola brasileira (Rodrigues amp Almeida 2005) O emprego dos

2

agrotoacutexicos tornou-se de uso rotineiro principalmente pelo menor custo e maior

eficiecircncia de controle das plantas daninhas quando comparados aos demais meacutetodos

convencionais de controle Para Rosa (1998) o modelo baseado no uso intensivo de

insumos quiacutemicos de sementes melhoradas e mecanizaccedilatildeo foi denominado ldquoRevoluccedilatildeo

Verderdquo que na deacutecada de 1980 trouxe ao Brasil um novo alento em relaccedilatildeo agrave

produtividade com grandes esperanccedilas de colheitas fartas e novas tecnologias que

propiciaram o domiacutenio de aacutereas pouco exploradas como por exemplo o cerrado da

Regiatildeo Centro-Oeste De fato muitas destas expectativas se realizaram entretanto o

impacto ambiental resultante implicou custos muitas vezes irremediaacuteveis como por

exemplo a perda de biodiversidade e a exaustatildeo de vaacuterios cursos drsquoaacutegua por

assoreamento aleacutem de contaminaccedilatildeo


Os inseticidas satildeo classificados em quatro categorias conforme sua foacutermula

quiacutemica organoclorados carbamatos organofosforados e piretroides Os

organoclorados satildeo produtos sinteacuteticos que possuem carbono cloro e hidrogecircnio em sua

estrutura quiacutemica Satildeo persistentes no meio ambiente por vaacuterios anos e pouco soluacuteveis

em aacutegua Esses inseticidas quando mal administrados tecircm accedilatildeo toacutexica para diversos

mamiacuteferos sendo sua accedilatildeo natildeo sistecircmica neurotoacutexica e mutagecircnica (Guedes 1990

Pereira et al 2012) Os carbamatos satildeo inseticidas considerados menos persistentes e

com degradaccedilatildeo raacutepida no meio ambiente natildeo satildeo bioacumulados pouco lipofiacutelicos

satildeo sistecircmicos em plantas e inibidores da acetilcolinesterase (Guedes 1990 Ware

1994 Chatterjee et al 2001) Os organofosforados satildeo outro grupo de inseticida

amplamente utilizado no mercado mundial representando 355 do uso na uacuteltima

deacutecada Esses inseticidas caracterizam-se por pouca solubilidade em aacutegua (mais

soluacuteveis do que os organoclorados) toxicidade variaacutevel em animais vertebrados em

alguns animais e plantas tecircm atividade sistecircmica baixa persistecircncia no ambiente e

facilmente degradados por enzimas e fatores quiacutemicos A accedilatildeo desses toacutexicos eacute

semelhante ao carbamato agindo nas vias sinaacutepticas dos axocircnios inibindo a

acetilcolinesterase (Ware 1994 Albinati et al 2009) O piretroide tambeacutem eacute um

inseticida amplamente utilizado na agricultura representando 21 do mercado mundial

na uacuteltima deacutecada O fator positivo do uso desse pesticida eacute que ele eacute muito toacutexico para

insetos e apresenta baixa toxicidade para mamiacuteferos satildeo fotoestaacuteveis com degradaccedilatildeo

raacutepida no solo A accedilatildeo toacutexica desse inseticida eacute semelhante aos primeiros inseticidas

3

desenvolvidos como o organoclorado DDT possuindo accedilatildeo neurotoacutexica nos axocircnios

(Naumann 1990 Ware 1994 Haverinen amp Vornanen 2014)

Nos uacuteltimos anos aumentou muito a diversidade de inseticidas visando a morte

de insetos e a persistecircncia do agrotoacutexico por periacuteodos curtos por questotildees de seguranccedila

ao meio ambiente Aleacutem desses inseticidas que foram mencionados acima existem

vaacuterios inseticidas organossinteacuteticos e inseticidas naturais de origem vegetal animal e

microbiana (Casida amp Quistad 1998 Ishaaya amp Horowitz 1998 Drevnick et al 2006)


Os inseticidas podem entrar no meio ambiente acidental ou deliberadamente A

entrada acidental do inseticida origina-se de rejeitos industriais urbanos vazamentos

durante transporte armazenamento e distribuiccedilatildeo enquanto a entrada deliberada ocorre

pela aplicaccedilatildeo de inseticidas no meio rural e urbano As contaminaccedilotildees por agrotoacutexicos

podem contaminar solos e ateacute mesmo a atmosfera Nesse uacuteltimo a movimentaccedilatildeo do

toacutexico se daacute por meio de gotas partiacuteculas soacutelidas e gases que acabam sendo

transportados por longas distacircncias a partir do local de origem da aplicaccedilatildeo (Walker et

al 1996)

O transporte e destino dos agrotoacutexicos no ambiente aquaacutetico eacute ponto de

discussatildeo Murty (1988) descreveu que os agrotoacutexicos entram no ambiente aquaacutetico por

meio da aplicaccedilatildeo intencional implemento aeacutereo escoamento das aplicaccedilotildees ou

liberaccedilatildeo acidental A descarga dos resiacuteduos da manufatura de agrotoacutexicos constitui a

segunda maior fonte de contaminaccedilotildees dos corpos de aacutegua O efeito mais draacutestico eacute

esperado no ponto de liberaccedilatildeo em lagos e pequenos mares internos Os efeitos nos

oceanos eacute pequeno devido ao grande volume de aacutegua e accedilatildeo de correntes (Walker et al

1996)

Na rota de transporte bioloacutegico o sistema natildeo eacute muito importante em termos de

magnitude pela quantidade do xenobioacutetico acumulado quando comparado com fatores

mencionados acima (transporte abioacutetico) mas eacute importante para o homem e vida

silvestre O padratildeo do transporte bioloacutegico dos toacutexicos acumulados nos organismos

segue da seguinte forma herbiacutevoros carniacutevoros e pisciacutevoros (maior eficiecircncia de

acuacutemulo) Nesses uacuteltimos particularmente as espeacutecies de ambientes aquaacuteticos a

acumulaccedilatildeo e magnificaccedilatildeo satildeo maiores do que nas espeacutecies de ambiente terrestre

devido agrave lipofilicidade dos inseticidas particularmente os organoclorados Duas rotas de

entrada podem comprometer a toxicidade dos organismos aquaacuteticos absorccedilatildeo ou

4

ingestatildeo A bioconcentraccedilatildeo vai ser mais intensa no ambiente aquaacutetico pois a difusatildeo

dos poluentes na aacutegua aumenta a eficiecircncia de sua absorccedilatildeo pelo organismo aquaacutetico

devido agrave lipofilicidade dos organoclorados Dessa forma a transferecircncia ao longo de

cadeias alimentares eacute tambeacutem mais eficiente e a bioconcentraccedilatildeo acontece em todas as

suas etapas Devido a isso os efeitos em predadores podem ser seacuterios pois aleacutem de

grande bioconcentraccedilatildeo e transferecircncia pela cadeia alimentar alguns destes organismos

como aves que se alimentam de peixes e animais marinhos como focas e cetaacuteceos satildeo

deficientes no metabolismo de desintoxicaccedilatildeo particularmente devido ao sistema de

monoxigenases pouco desenvolvido comprometendo mais a toxicidade por

biomagnificaccedilatildeo (Barron 1995 Borgaacute et al 2004)

Aleacutem da bioconcentraccedilatildeo os resiacuteduos destas substacircncias presentes nas aacuteguas

podem ser aderidos ao material orgacircnico em suspensatildeo depositar-se no sedimento ou

serem absorvidos pelos organismos Assim peixes e invertebrados podem bioacumular

tais compostos ligados agrave mateacuteria ingerida ser passivamente absorvidos pela superfiacutecie

corporal ou durante as trocas respiratoacuterias (Vasconcellos amp Verani 2000 Henry amp

Kishimba 2006)

14 Avaliaccedilatildeo de sensibilidade e estudos de toxicidade aquaacutetica

A realizaccedilatildeo de testes de sensibilidade eacute recomendada como meacutetodo de

qualidade dos planteis de organismos cultivados Nestes testes satildeo utilizadas

substacircncias de referecircncias que incluem principalmente os sais dicromato de potaacutessio

cloreto de potaacutessio e cloreto de soacutedio Estes dois uacuteltimos satildeo mais recomendados pois

seus efluentes experimentais oferecem baixo risco de contaminaccedilatildeo ambiental Os testes

de sensibilidade geralmente satildeo de curta duraccedilatildeo (24 horas) e devem ser repetidos com

frequumlecircncia principalmente nos laboratoacuterios que mantecircm planteis de organismos-testes

pois estes dados servem como padratildeo na sensibilidade natural dos organismos Esta

teacutecnica vem sendo utilizada para avaliar os resultados de toxicidade pois a accedilatildeo toacutexica

somente poderaacute ser atribuiacuteda agrave substacircncia teste quando a sensibilidade natural dos

organismos natildeo tiver demonstrado qualquer alteraccedilatildeo ao longo do periacuteodo em que

foram testados (Ranzani-Paiva et al 2004)

O estudo dos efeitos de agentes toacutexicos sobre a vida aquaacutetica pode ser realizado

por meio de ensaios bioloacutegicos na natureza ou em condiccedilotildees laboratoriais controladas

sendo este uacuteltimo os mais utilizados por permitirem um controle mais efetivo de fatores

ocasionais como temperatura pH duraccedilatildeo de exposiccedilatildeo meio concentraccedilatildeo Ao se

5

avaliar a toxicidade de agentes toacutexicos ou misturas destes frente a um reativo bioloacutegico

geralmente se utiliza uma populaccedilatildeo homogecircnea possuindo uma sensibilidade definida

determinando-se a concentraccedilatildeo responsaacutevel por um efeito toacutexico (efeito letal subletal

crocircnico imobilizaccedilatildeo ou modificaccedilatildeo do comportamento entre outros) Estes testes

podem ser realizados utilizando-se sistemas de fluxo contiacutenuo semi estaacuteticos ou

estaacuteticos Quanto ao meio pode-se utilizar meio aquaacutetico do tipo aacutegua continental (aacutegua

dura rica em bicarbonatos e sulfatos dissolvidos ou aacutegua mole isenta de iacuteons caacutelcio e

magneacutesio) marinha ou salobra segundo as necessidades dos organismos avaliados

(CETESB 2008) Com relaccedilatildeo ao organismo-teste por razotildees teacutecnicas e econocircmicas eacute

impossiacutevel testar todas as espeacutecies que fazem parte do ecossistema aquaacutetico Assim

para esses estudos satildeo relacionados normalmente os organismos mais representativos

de cada niacutevel troacutefico na cadeia alimentar como algas microcrustaacuteceos e peixes


O endosulfan inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft na

Alemanha foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de Thiodan

(Goebel et al 1982 e Stumpf amp Abhaver 1986) O Thiodanreg eacute um inseticida acaricida

organoclorado do grupo quiacutemico eacutester do aacutecido sulfuroso de um diol ciacuteclico Esse

agrotoacutexico eacute classificado toxicologicamente como altamente toacutexico (Classe I)

classificaccedilatildeo ambiental como produto altamente perigoso aleacutem de inflamaacutevel e

corrosivo (Engelhardt amp Sarmento 2008)

O ingrediente ativo do Thiodanreg (350 gL de endosulfan) consiste na mistura de

dois isocircmeros sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Entre os produtos

derivados do metabolismo do endosulfan em mamiacuteferos o sulfato de endosulfan eacute o

principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica (Stumpf amp Abhaver 1986)

Os organoclorados como o Thiodanreg atuam nos canais de soacutedio do axocircnio

aumentando o periacuteodo de abertura destes canais O aumento do periacuteodo de abertura dos

canais de soacutedio leva a um aumento do fluxo de soacutedio para o interior da membrana e

acarretando um prolongamento da fase de despolarizaccedilatildeo apoacutes o pico do potencial de

accedilatildeo e devido a isso o inseto morre por hiperexcitaccedilatildeo Consequentemente a

propagaccedilatildeo contiacutenua do impulso nervoso gera tremores convulsotildees prostraccedilatildeo e

posteriormente a morte como observados em insetos Aleacutem disso pode afetar qualquer

tipo de crustaacuteceo peixes e mamiacuteferos inclusive em baixas concentraccedilotildees (Eto 1990

Pereira et al 2012)

6


O endosulfan eacute o uacutenico inseticida organoclorado amplamente utilizado em todo

o mundo (Capkin et al 2006 Chakrabarty et al 2012) Segundo a empresa Bayer

(2010) fabricante do produto o Thiodanreg (endosulfan) eacute um inseticida para o controle

de insetos chupadores e mastigadores com accedilatildeo de contato e ingestatildeo Recomenda-se

seu uso especialmente em cultivos de cafeacute cana hortaliccedilas frutas vinhas e forragens

Adverte tambeacutem que natildeo se devem colher frutos ou vegetais tratados ateacute 21 dias apoacutes a

uacuteltima aplicaccedilatildeo

No Brasil segundo Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) a

importaccedilatildeo do endosulfan estaacute proibida a partir de julho de 2012 e sua utilizaccedilatildeo a partir

de 2013 (Molina 2010) A utilizaccedilatildeo de produtos agrave base de endosulfan no Brasil eacute

estimada em 44 milhotildees de toneladas em uma aacuterea de 22 a 36 milhotildees de hectares

podendo representar cerca de 40 do consumo mundial deste organoclorado segundo

dados do Programa Ambiental das Naccedilotildees Unidas (UNEP 2010) Segundo a Agecircncia

de Proteccedilatildeo Ambiental norte americana (EPA 1980) contaminaccedilotildees humanas por

endosulfan satildeo provenientes em 53 dos casos da ingestatildeo de aacutegua contaminada e em

47 dos casos do consumo de alimentos a base de peixes contaminados A mesma

agecircncia define como CL50 aguda valores de 017microgL-1 para truta arco-iacuteris e 740microgL-1

para Daphnia magna

A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em

consideraccedilatildeo a qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente

Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm 3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo

do referido inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1


O endosulfan apesar de pertencer agrave classe toxicoloacutegica I eacute altamente toacutexico

para animais aquaacuteticos e terrestres (espeacutecies natildeo alvo) e segundo a Agency for Toxic

Substances and Disease Registry - ATSDR (2000) possui de moderado a alto risco e

efeitos agudos e crocircnicos

Pinheiro et al (1998) advertem com veemecircncia sobre o perigo de contaminaccedilatildeo

do Pantanal e da Amazocircnia lugares ricos em recursos hiacutedricos por produtos agrave base de

endosulfan pois este produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos

aquaacuteticos mesmo em doses muito pequenas O endosulfan natildeo dissolve facilmente na

7

aacutegua e adere agraves partiacuteculas do solo levando anos para sua degradaccedilatildeo (Soares et al

2003)


Apesar dos mecanismos de toxicidade do endosulfan serem extensivamente

estudados alguns trabalhos foram conduzidos com o objetivo de se avaliar efeitos

histopatoloacutegicos dos agrotoacutexicos em peixes (Naqvi amp Vaishnavi 1993) especialmente

nas gocircnadas fiacutegados bracircnquias e rins Em um desses estudos Capkin et al (2006)

reportaram uma CL50 de 1978 gL para Oreochromis mikyss para 24 horas de

exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte de 50 dos animais convulsotildees nado

erraacutetico edema e separaccedilatildeo das lacircminas branquiais edema e necrose do fiacutegado dos

tuacutebulos renais e do tecido hematopoieacutetico Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees

similares em bracircnquias do peixe-mosquito Gambusia affinis aleacutem de congestatildeo e

hipertrofia do fiacutegado com o uso do pesticida Thiodanreg Segundo Capkin et al (2006)

alcalinidade e temperatura da aacutegua aleacutem do tamanho dos peixes afetam a toxicidade do

endosulfan Assim peixes pequenos e meacutedios mantidos em temperatura de 131ordmC com

1978 microgL do toacutexico tiveram uma sobrevivecircncia de 25 e 425 respectivamente

enquanto os peixes grandes tiveram 100 de sobrevivecircncia Quando a temperatura da

aacutegua foi aumentada para 16ordmC nenhum dos peixes pequenos e meacutedios sobreviveu

enquanto os sobreviventes de peixes grandes diminuiacuteram para 775 O aumento da

alcalinidade de 198 mgL para 419 mgL ou superior aumentou (Plt0001) a

sobrevivecircncia dos peixes Em relaccedilatildeo agrave dureza entre 357 mgL e 126 mgL a

sobrevivecircncia dos peixes expostos ao endosulfan natildeo foi afetada Histologicamente as

bracircnquias dos peixes tiveram edema lamelar separaccedilatildeo do epiteacutelio das lamelas fusatildeo

lamelar e hipertrofia das ceacutelulas epiteliais Os fiacutegados apresentaram edemas e necroses

graves

Cengiz amp Uumlnluuml (2002) estudaram os efeitos crocircnicos do endosulfan sob as

bracircnquias nas concentraccedilotildees de 05 e 075 microgL ao longo de 30 dias de experimento O

que se comprovou eacute que a dose mais elevada do endosulfan causou mais mudanccedilas

patoloacutegicas que a menor dose Altinok amp Capkin (2007) natildeo verificaram alteraccedilatildeo

morfoloacutegica nas bracircnquias de truta com 21 dias de exposiccedilatildeo de metiocarb entretanto

uma concentraccedilatildeo superior (375 mgL) causou separaccedilatildeo epitelial das bracircnquias No

mesmo trabalho os peixes expostos ao endosulfan com concentraccedilotildees de 06 e 13 microgL

mostraram mudanccedilas morfoloacutegicas nas bracircnquias como desprendimento do epiteacutelio

8

aparecimento de granuloacutecitos nas lamelas fusatildeo e necrose lamelar hipertrofia e nuacutecleos

picnoacuteticos Essas evidecircncias comprovam o efeito do endosulfan com comprometimento

das bracircnquias levando a reduccedilatildeo do consumo de oxigecircnio e desregulaccedilatildeo da funccedilatildeo de

osmorregulaccedilatildeo em organismos aquaacuteticos Aleacutem disso os efeitos toacutexicos do endosulfan

no fiacutegado induziram modificaccedilotildees estruturais como hipertrofia dos hepatoacutecitos nuacutecleos

picnoacuteticos e necroses

No trabalho de Ballesteros et al (2007) que utilizaram peixes adultos da espeacutecie

Jenynsia multidentata os testes de toxicidade foram realizados durante 96 horas a fim

de determinar a concentraccedilatildeo letal (CL50) do endosulfan As alteraccedilotildees histoloacutegicas

foram determinadas nas bracircnquias e nos fiacutegados A CL50-96 horas foi significativamente

diferentes entre machos (0719 μgL) e fecircmeas (1317 μgL) A diferenccedila entre os sexos

foi atribuiacuteda ao dimorfismo no teor de lipiacutedios no sexo feminino (216) e masculino

(179) As alteraccedilotildees histoloacutegicas nas bracircnquias incluiacuteram hipertrofia e levantamento

do epiteacutelio das lamelas secundaacuterias e aneurismas Essas alteraccedilotildees causaram um

aumento significativo da espessura da lamela secundaacuteria no grupo tratado em relaccedilatildeo

aos peixes do grupo-controle Finalmente as alteraccedilotildees histoloacutegicas reversiacuteveis como

degeneraccedilatildeo hidroacutepica e dilataccedilotildees dos sinusoides foram observadas nos fiacutegados dos

peixes expostos bem como mudanccedila irreversiacutevel como necrose nas concentraccedilotildees

mais elevadas O fiacutegado eacute um oacutergatildeo importante na capacidade de degradar compostos

toacutexicos mas os seus mecanismos de regulaccedilatildeo podem ser comprometidos em

concentraccedilotildees elevadas causando mudanccedilas estruturais como observadas nesses

trabalhos

A qualidade da aacutegua eacute um fator importante para o sucesso da reproduccedilatildeo dos

peixes Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a produtos quiacutemicos a estrutura

histoloacutegica das gocircnadas tambeacutem eacute alterada Para Cengiz et al (2001) os efeitos do

Thiodanreg (endosulfan) satildeo tempo e dose dependentes Dutta et al (2006) descreveram

num estudo de toxicidade crocircnica as injuacuterias causadas pelo Thiodanreg sobre os tuacutebulos

seminiacuteferos do peixe ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus e relataram alteraccedilatildeo dos tuacutebulos

seminiacuteferos que mostraram perda dos padrotildees normais de organizaccedilatildeo celular

diminuindo tambeacutem o diacircmetro das espermatogocircnias primaacuterias gradativamente desde as

primeiras 24 horas de exposiccedilatildeo ateacute as duas semanas seguintes Segundo os autores este

tipo de dano pode afetar as espermaacutetides e os espermatozoides apresentando no final

um impacto negativo na espermatogecircnese e fertilidade do macho comprometendo o

nuacutemero da populaccedilatildeo do ldquobluegillrdquo Lepomis macrochirus Em outro trabalho sobre

9

reproduccedilatildeo Hazarika amp Das (1998) identificaram mudanccedilas estruturais nos ovaacuterios de

Heteropneustes fossilis exposto ao organoclorado lindano por 72 horas Os resultados

demonstraram que houve ruptura e diminuiccedilatildeo do tamanho dos foliacuteculos maduros

afetando a fertilidade dos peixes


O lambari Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) eacute conhecido popularmente

pelos nomes de lambari piaba lambari-guaccedilu mojarra pertence agrave famiacutelia Characidae

ordem Characiformes e ateacute entatildeo uma das espeacutecies da subfamiacutelia Tetragonopterinae

(CEMIGCETEC 2000) No entanto revisotildees recentes colocam o gecircnero em ldquoIncertae

sedisrdquo com 88 gecircneros e 620 espeacutecies sendo que 86 espeacutecies pertencem ao gecircnero

Astyanax (Lima et al 2003)

O A bimaculatus eacute um peixe de pequeno porte atingindo aproximadamente 20

cm de comprimento e pesando ateacute 40 gramas Possui corpo irregularmente eliacuteptico com

nadadeiras amarelas quatro a cinco dentes na seacuterie externa e cinco na seacuterie interna do

preacute-maxilar escamas com reflexos prateados mancha umeral ovalada e peduacutenculo

caudal com mancha alongada que se prolonga ateacute a ponta dos raios caudais medianos

(Britiski et al 1988 CEMIGCETEC 2000)

O gecircnero Astyanax possui ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica sendo encontrado

desde o sudoeste dos Estados Unidos ateacute a Bacia do rio da Prata (Moreira Filho 1989

citado por Pereira Filho 2000) Os lambaris satildeo encontrados em cabeceiras de riachos

rios e lagos e vivem sempre em cardumes realizando curtas migraccedilotildees na eacutepoca das

cheias para sua reproduccedilatildeo Em relaccedilatildeo ao periacuteodo reprodutivo dos lambaris este pode

variar conforme a espeacutecie e o habitat sendo normalmente de setembro a marccedilo

(Vazzoler amp Menezes 1992 citados por Pereira Filho 2000)

A biologia reprodutiva do lambari pode ser prejudicada pelo desmatamento

ciliar poluiccedilatildeo industrial e domeacutestica e destruiccedilatildeo de vaacuterzeas e lagoas marginais por

projetos agriacutecolas que tambeacutem constituem ameaccedila em vaacuterias regiotildees (CEMIGCETEC

2000) Esses fatores interferem na dinacircmica da populaccedilatildeo desses peixes

Os lambaris satildeo oniacutevoros se alimentando de algas vegetais sementes larvas e

insetos adultos (CEMIGCETEC 2000) Os lambaris satildeo de extrema importacircncia em

diversos habitats por equilibrarem o ecossistema e a cadeia alimentar constituindo fonte

de alimentos para peixes maiores espeacutecies carniacutevoras e aves Em estudo conduzido com

o lambari da espeacutecie Astyanax janeiroensis verificaram-se que os principais haacutebitos

10

alimentares se baseavam em algas microcrustaacuteceos pequenos invertebrados e esporos

vegetais (Santin et al 2005) Diversos trabalhos relatam na literatura a importacircncia do

lambari na estrutura troacutefica do ecossistema e sua variaccedilatildeo alimentar diante de

modificaccedilotildees ambientais (Motta amp Uieda 1995 Suarez et al 1995 Esteves 1998)

Trabalho conduzido por Loureiro et al (1995) verificando a dieta alimentar na espeacutecie

Hoplias malabaricus (traiacutera) no reservatoacuterio da UHE de Segredo (PR) mostraram a

ingestatildeo alimentar preferencial de lambaris de diversas espeacutecies Em outro estudo

verificou-se a importacircncia do lambari como alimento para as espeacutecies Hoplias

malabaricus Oligosarcus longirostris e Rhamdia branneri apoacutes o represamento do

Reservatoacuterio de Salto Caxias (PR) demonstrando ser o alimento preferido dessas

espeacutecies (Novakoski 2007) Aleacutem disso na regiatildeo sudoeste do estado de Minas Gerais

existem representantes do gecircnero no Reservatoacuterio de Furnas (MG) caracterizando a

reproduccedilatildeo ao longo do ano para o equiliacutebrio da cadeia alimentar tendo importacircncia

econocircmica na alimentaccedilatildeo e tambeacutem na praacutetica de pesca profissional (Bazzoli et al

1998 Carvalho et al 2009) Portanto os lambaris satildeo de grande importacircncia em

diversos habitats como consumidores secundaacuterios (Esteves 1998) A ecologia alimentar

de uma determinada espeacutecie faz parte e interfere diretamente na dinacircmica de sua

populaccedilatildeo sendo primordial para a conservaccedilatildeo do ecossistema como um todo (Vitule

amp Aranha 2002)


O fiacutegado eacute um oacutergatildeo multifuncional responsaacutevel por uma das etapas do

processo de desenvolvimento folicular principalmente no periacuteodo de formaccedilatildeo dos

gloacutebulos de vitelo momento em que ocorre a transferecircncia de vitelogenina para o

ovaacuterio etapa fisioloacutegica que inicia nas ceacutelulas da teca e ceacutelulas foliculares com

produccedilatildeo do estradiol No fiacutegado o estradiol estimula os hepatoacutecitos a produzirem a

vitelogenina e careogenina que satildeo levadas pela corrente sanguiacutenea ateacute o ovaacuterio onde

participam da formaccedilatildeo do vitelo e zona radiata durante a maturaccedilatildeo folicular

(Senthilkumaran et al 2004) A produccedilatildeo de vitelogenina no fiacutegado pode variar entre as

espeacutecies de teleoacutesteos devido agraves diferenccedilas na capacidade de armazenamento de energia

condiccedilatildeo fisioloacutegica haacutebitos alimentares e contaminaccedilatildeo (Peyon et al 1996 Hull amp

Harvey 2001 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al 2014) Aleacutem disso o fiacutegado eacute

responsaacutevel pela conversatildeo do alimento e desintoxicaccedilatildeo de substacircncias estranhas

(Selman amp Walace 1989 Ribeiro et al 2006)

11

O fiacutegado eacute glacircndula digestiva que apresenta superfiacutecie

coberta por uma membrana serosa e o tecido conjuntivo de sua caacutepsula

invagina para o parecircnquima (Takashima amp Hibiya 1995) O fiacutegado de teleoacutesteos eacute

constituiacutedo por hepatoacutecitos ceacutelulas epiteliais dos ductos biliares ceacutelulas endoteliais

ceacutelulas que armazenam gordura (ceacutelulas de Ito) macroacutefagos e ceacutelulas sanguiacuteneas

circulantes (Hinton et al 1984) e em algumas espeacutecies observam-se ceacutelulas do

pacircncreas exoacutecrino (pacircncreas intra-hepaacutetico) distribuiacutedas entre o parecircnquima do oacutergatildeo

assim como descrito para o lambari (Santos et al 2013)

Estruturas lobulares e uma pequena veia central estatildeo presentes em vertebrados

em peixes estas estruturas variam dependendo da espeacutecie e satildeo geralmente obscuras

(Takashima amp Hibyia 1995) Os hepatoacutecitos arranjam-se em fileiras os quais

geralmente apresentam a espessura de duas ceacutelulas O hepatoacutecito possui um nuacutecleo

uacutenico embora ceacutelulas binucleadas possam ser observadas O nuacutecleo se localiza na

regiatildeo central ou no poacutelo celular voltado para o sinusoide e o nucleacuteolo eacute bem evidente

(Arana 1995) A circulaccedilatildeo no fiacutegado eacute realizada pela arteacuteria hepaacutetica veia porta aleacutem

de capilares sinusoides Existem cordotildees de hepatoacutecitos que se arranjam

concentricamente ao redor dos capilares sinusoides (Takashima amp Hibyia 1995)

As vias biliares satildeo formadas por canaliacuteculos biliares preacute-duacutectulo biliar duacutectulo

biliar e ducto biliar O canaliacuteculo biliar eacute formado pela membrana plasmaacutetica dos

hepatoacutecitos e os microvilos dos mesmos preenchem o luacutemen do canaliacuteculo Nos

hepatoacutecitos existem ceacutelulas preacute-ductulares que estabelecem complexos juncionais com

os hepatoacutecitos formando os preacute-duacutectulos biliares A transiccedilatildeo entre preacute-duacutectulo e

duacutectulo ocorre quando o lume biliar estaacute completamente circundado por ceacutelulas

epiteliais biliares O ducto biliar eacute formado por ceacutelulas epiteliais cuacutebicas nos ductos de

menor calibre e ceacutelulas colunares nos grandes ductos sendo a presenccedila de lacircmina basal

o fator diferenciador dos mesmos Nos grandes ductos circundando a lacircmina basal

estatildeo fibroblastos plexo capilar fibras nervosas e ceacutelulas musculares lisas Acredita-se

que estas ceacutelulas musculares promovam os movimentos peristaacutelticos impulsionando a

bile Esse ducto une-se ao ducto ciacutestico dando origem ao ducto coleacutedoco (Arana 1995)

O endoteacutelio eacute fenestrado e a lacircmina basal estaacute ausente No espaccedilo de Disse haacute

ceacutelulas de Ito que em teleoacutesteos se caracterizam por apresentar vesiacuteculas lipiacutedicas

assim como o mesmo tipo celular em mamiacuteferos (Arana 1995) Haacute algumas mudanccedilas

patoloacutegicas que podem ocorrer no fiacutegado de peixes que sofreram exposiccedilatildeo a toacutexicos ou

outras substacircncias irritantes dissolvidas na aacutegua A atrofia eacute caracterizada por

12

diminuiccedilatildeo do tamanho dos hepatoacutecitos com presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos Tambeacutem

podem ocorrer necrose degeneraccedilatildeo vacuolar degeneraccedilatildeo gordurosa estagnaccedilatildeo da

bile inflamaccedilatildeo do parecircnquima hepaacutetico (hepatites) cirrose hepaacutetica e

desenvolvimentos de tumores (Takashima amp Hibyia 1995)


Os ovaacuterios das fecircmeas A bimaculatus seguem os padrotildees descritos para a

maioria dos teleoacutesteos sendo oacutergatildeos pares alongados e foliaacuteceos sofrendo

modificaccedilotildees na espessura volume e coloraccedilatildeo durante as diferentes fases do ciclo

reprodutivo conforme observado tambeacutem em outras espeacutecies do gecircnero (Drummond

1996 Miranda 1996 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues amp Almeida

2005 Carvalho et al 2009 Prado et al 2011) Nesses peixes o ovaacuterio eacute do tipo

cistovariano onde o lume ovariano se estende ateacute o oviduto como na maioria dos

peixes teleoacutesteos (Nagahama 1983 Selman amp Wallace 1986 Connaughton amp Aida

1998)

Nas observaccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio de A bimaculatus verificou-se que os

mesmos satildeo envolvidos externamente por uma serosa peritoneal constituiacuteda por

mesoteacutelio e lacircmina do tecido conjuntivo fibroso Profundamente a essa estrutura

observa-se tuacutenica albugiacutenea de natureza conjuntiva contendo fibroacutecitos e vasos

sanguiacuteneos A tuacutenica albugiacutenea emite septos para o interior do oacutergatildeo formando lamelas

ovuliacutegeras nas quais encontram-se ovogocircnias e foliacuteculos em diferentes fases de

desenvolvimento No lambari o tipo de desenvolvimento folicular eacute assincrocircnico com

a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Miranda 1996

Drummmond 1996 Marcon 2008)

Em peixes o desenvolvimento folicular tem sido descrito por vaacuterios

pesquisadores (Begovac amp Wallace 1988 Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter

1996 Grier 2000 e 2002 Carvalho et al 2009) e como nos animais em geral

compreende os periacuteodos preacute-meioacutetico perinucleolar preacute-vitelogecircnico vitelogecircnico e

maturaccedilatildeo final Os foliacuteculos passam por diversas fases de desenvolvimento

diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo de acordo com o periacuteodo reprodutivo do animal (Wallace amp

Selman 1981) Essas fases ocorrem no interior de foliacuteculos cuja parede constituiacuteda de

zona radiata camada folicular membrana basal e teca (Grier 2000) desempenham um

importante papel durante a ovogecircnese e na fertilizaccedilatildeo

13

A foliculogecircnse eacute regulada hormonalmente pelo eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-

gocircnada Em peixes teleoacutesteos estiacutemulos ambientais satildeo convertidos em informaccedilotildees

sensoriais no ceacuterebro associados com a liberaccedilatildeo de hormocircnios liberadores de

gonadotropinas (GnRH) pelo hipotaacutelamo que via corrente sanguiacutenea chegam agrave

adenohipoacutefise que sintetiza e libera hormocircnios gonodotroacutepicos hormocircnio fociacuteculo

estimulante (FSH) e hormocircnio luteinizante (LH) Os hormocircnios FSH e LH se ligam aos

receptores celulares das ceacutelulas tecais (LH-R) e foliculares (LH-R e FSH-R) para

estimularem a produccedilatildeo 17α-hydroxy-pregnesterona (17α-HP) e testosterona (T) Nas

ceacutelulas foliculares os hormocircnios esteroides 17α-HP e T agem como precursor na

produccedilatildeo do 17β-estradiol (17β-E) e do hormocircnio indutor de maturaccedilatildeo (MIH)

substacircncias importantes nas etapas do desenvolvimento folicular e na ovulaccedilatildeo

respectivamente (Dietrich amp Krieger 2009) (Figura 1)

Figura 1 Ceacutelulas somaacuteticas do ovaacuterio e principais produtos (Adaptado de Dietrich amp Krieger 2009)

Muitas das espeacutecies nativas natildeo desovam espontaneamente em ambientes

lecircnticos Algumas espeacutecies nativas quando mantidas em cativeiro se preparam para a

reproduccedilatildeo mas natildeo desovam naturalmente e sofrem regressatildeo ovariana com

consequente atresia dos foliacuteculos A atresia folicular eacute um processo degenerativo de

ocorrecircncia comum nos ovaacuterios de vertebrados e os foliacuteculos podem sofrer atresia em

diferentes fases do desenvolvimento ou diferenciaccedilatildeo (Guraya 1986 Miranda et al

1999 Santos et al 2008b)

A ovulaccedilatildeo refere-se agrave expulsatildeo do foliacuteculo em desenvolvimento maduro

(Redding amp Patintildeo 1993) Na natureza a ovulaccedilatildeo eacute regulada por dois hormocircnios os

quais estimulam o desenvolvimento gonadal em peixes FSH e LH (Connaughton amp

Aida 1998 Klausen et al 2001) Estes hormocircnios gonadotroacutepicos agem nos oacutergatildeos

reprodutores promovendo o desenvolvimento e maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas O

14

processo de transporte dos hormocircnios para as ceacutelulas reprodutoras eacute lento em ambientes

naturais mas na reproduccedilatildeo artificial com a teacutecnica de hipofisaccedilatildeo esse processo

torna-se mais raacutepido em relaccedilatildeo ao processo natural (Woynarovich amp Horvath 1980)

Nos ovaacuterios de peixes teleoacutesteos com fertilizaccedilatildeo externa os foliacuteculos poacutes-

ovulatoacuterios estruturas remanescentes da desova satildeo frequentes Um aspecto

interessante eacute saber a duraccedilatildeo da reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios nos

procedimentos de desova induzida para as espeacutecies em criaccedilatildeo Drummond (1996) e

Marcon (2008) estudaram a reabsorccedilatildeo dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios no estroma

ovariano em maturaccedilatildeo avanccedilada de lambaris (A bimaculatus lacustris) e observaram

que cinco dias apoacutes a desova os foliacuteculos haviam sido reabsorvidos Durante esse

processo figuras de apoptose satildeo observadas em fecircmeas submetidas agrave hipofisaccedilatildeo

(Drummond et al 2000) o mesmo ocorrendo em Leporinus taeniatus (Anostomidae)

(Santos et al 2003) Santos et al (2008a) registraram por meio das teacutecnicas de TUNEL

e de imunoistoquiacutemica o iacutendice apoptoacutetico em ceacutelulas foliculares dos foliacuteculos poacutes-

ovulatoacuterios em Prochilodus argenteus notando que o maior iacutendice de ceacutelulas

foliculares apoptoacuteticas coincidiu com menores valores de integrinas e colaacutegeno tipo IV

no terceiro dia apoacutes a desova induzida Esses achados demonstram a importacircncia dessas

proteiacutenas na integridade das ceacutelulas foliculares nos foliacuteculos

15

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral

Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do inseticida organoclorado

endosulfan em sua apresentaccedilatildeo comercial Thiodanreg sobre as caracteriacutesticas

morfoloacutegicas dos ovaacuterios e fiacutegado de fecircmeas adultas de lambaris A bimaculatus apoacutes

exposiccedilatildeo subletal a esse agrotoacutexico durante a maturaccedilatildeo avanccedilada


Estimar a CL50 para fecircmeas adultas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada

expostas ao inseticida organoclorado Thiodanreg

Avaliar histopatologicamente o fiacutegado dos animais dos grupos controles e tratados

Analisar por morfometria os principais constituintes celulares do fiacutegado nos grupos

controles e tratados

Avaliar diferenccedilas nos valores dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e

hepatossomaacutetico (IHS) de animais dos grupos controles e expostos ao toacutexico

Verificar provaacuteveis alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos diferentes estaacutedios de

desenvolvimento de foliacuteculos ovarianos nos grupos submetidos aos efeitos do

toacutexico utilizando-se microscopia de luz

Quantificar os diferentes tipos de foliacuteculos e avaliar por morfometria os diacircmetros

dos foliacuteculos vitelogecircnicos nos grupos controles e tratados

Avaliar e quantificar o processo de atresia folicular nos grupos controles

comparando-os com os grupos tratados

Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica as proteiacutenas de adesatildeo celular

(integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV) nas ceacutelulas foliculares ao longo do

desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e tratados e

16

Analisar qualitativamente por imunoistoquiacutemica a proteiacutena caspase 3 nas ceacutelulas

foliculares ao longo do desenvolvimento folicular nos peixes dos grupos controles e

tratados

17


O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade Federal

de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de

Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal quanto

as atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados As etapas de

microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e

morfomeacutetricas foram realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do

Departamento de Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)

31 Animais

Foram utilizadas fecircmeas do lambari A bimaculatus mantidas em tanques de terra

na Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas

fecircmeas em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso (g) de 1152 plusmn 201 e comprimento total (cm)

de 912 plusmn 064 As caracteriacutesticas para a escolha dos animais se basearam em aspectos

corporais como ventre abaulado poro genital dilatado e vascularizado

Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV Os

aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuem capacidade de 50 litros numa

densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro

temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam

um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua de aacutegua para garantir o bem-estar

dos peixes (Figura 2) Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina

contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura

As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas de

acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de 255

plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza total

2815 plusmn 594 mgL-1 (CaCO3)

Este projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica do Departamento de

VeterinaacuteriaUFV (protocolo 242009) O meacutedico veterinaacuterio responsaacutevel foi o Doutor

Laeacutercio dos Anjos Benjamin (CRMV-MG 3387)

18

Figura 2 Principais componentes estruturais dos grupos experimentais (Adaptado de Oliveira Ribeiro et al 2002)

A Bomba para oxigenaccedilatildeo da aacutegua B Termostato para controle da temperatura D Filtro interno L Material contra isolamento de ruiacutedo H-J Trecircs aquaacuterios para cada grupo experimental (Controle e e cada uma das concentraccedilotildees de Thiodanreg )

Os lotes de peixes (120 peixes em cada lote) foram destinados agrave accedilatildeo do toacutexico em

quatro tratamentos diferentes

Experimentos Tratamentos Experimento 1 sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo Experimento 2 sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo Experimento 3 com aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo

Experimento 4 com aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo

O periacuteodo de 10 dias para aclimataccedilatildeo dos peixes foi para permitir que as

caracteriacutesticas ovarianas sejam comparadas com os grupos que natildeo foram aclimatados

Dessa forma mostraraacute quais as melhores condiccedilotildees que esses peixes podem ter na

reproduccedilatildeo quando expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico

32 Agrotoacutexico

Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente experimento foi utilizado o inseticida

organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo com 350gL de endosulfan

33 Teste de toxicidade aguda em sistema estaacutetico ndash CL50

A definiccedilatildeo das concentraccedilotildees toacutexicas a serem testadas nem sempre ocorre de

maneira simples Muitas vezes faz-se necessaacuterio uma anaacutelise preliminar para a

definiccedilatildeo da melhor faixa de concentraccedilatildeo a ser considerada nos testes definitivos

Dessa forma a primeira providecircncia desse estudo de toxidade aguda eacute a realizaccedilatildeo de

testes preliminares que devem ser conduzidos com concentraccedilotildees toacutexicas relacionadas

entre si por progressotildees geomeacutetricas de razatildeo 10 calculadas com base em informaccedilotildees

19

obtidas por meio de testes jaacute realizados com outros organismos que mais se assemelham

filogeneticamente ao grupo em questatildeo (Ranzani-Paiva 2004) A partir dos resultados

obtidos nessa fase eacute possiacutevel estabelecer a faixa ideal de concentraccedilatildeo para conduccedilatildeo

dos testes definitivos com o lambari

O teste de concentraccedilatildeo letal (CL50) que avalia a concentraccedilatildeo responsaacutevel pela

mortalidade de metade dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo

NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos sob restriccedilatildeo alimentar que se

iniciou 24 horas antes do iniacutecio e perdurou durante o teste Essa restriccedilatildeo alimentar foi

realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica que poderia interferir na accedilatildeo do

agrotoacutexico

Para o teste foram selecionados 120 lambaris fecircmeas adultas em maturaccedilatildeo

avanccedilada com aproximadamente 7cm de comprimento O agrotoacutexico utilizado foi o

Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com

cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de Thiodanreg adotada sendo os grupos assim

classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1 30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-

1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos

com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios (Figura 3) Para obter as diferentes

concentraccedilotildees o Thiodanreg foi diluiacutedo uma primeira vez 1100 (Soluccedilatildeo Padratildeo

Intermediaacuteria contendo 3500mgL-1 de endosulfan) e uma segunda vez 1100 (Soluccedilatildeo

Padratildeo Final contendo 35000microgL-1 de endosulfan) viabilizando a observaccedilatildeo da

toxicidade total do agrotoacutexico e natildeo apenas do princiacutepio ativo (Figura 4)

Figura 3 Recipiente utilizado e distribuiccedilatildeo das concentraccedilotildees

20

Figura 4 Preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo padratildeo final do Thiodanreg

Foram feitas as verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas (zero 6 12 18 24

30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se os animais mortos o

que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos peixes gerando maior

confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da toxicidade do princiacutepio ativo

endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais compostos do inseticida Para

acompanhamento da temperatura foi adicionado 15L de aacutegua do mesmo aquaacuterio em

um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo na temperatura pudesse ser

medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O teste teve iniacutecio no dia

16012010 agraves 1000 horas com teacutermino agraves 1000 horas do dia 20012010 O programa

utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e o intervalo de

confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)

34 Teste de toxicidade subletal em sistema estaacutetico

Depois de estimar a CL50 pelos testes preliminares foi realizada aclimataccedilatildeo de

novos lambaris como descrito no item 31 (Figura 2) onde os peixes se acostumaram

ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como alimentaccedilatildeo e limpeza

dos aquaacuterios O teste de toxicidade aguda com o endosulfan foi realizado baseando-se

principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com a

NBR 15088 (ABNT 2007)

O teste de toxicidade subletal foi feito com trecircs diferentes dosagens do toacutexico

inferiores agrave CL50 e para fins estatiacutesticos cada concentraccedilatildeo incluindo-se o grupo

controle teve trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para depois se avaliar e

Thiodanreg

Soluccedilatildeo padratildeo

intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)

3500mgL de soluccedilatildeo padratildeo

intermediaacuteria 35000 microgL de

soluccedilatildeo padratildeo

final

21

quantificar a mortalidade se for o caso observar o comportamento dos animais que

sobreviveram agrave intoxicaccedilatildeo e os efeitos morfoloacutegicos nos fiacutegados e ovaacuterios dos peixes

expostos Assim como foram trecircs repeticcedilotildees usando-se trecircs diferentes concentraccedilotildees do

toacutexico e um grupo controle para a realizaccedilatildeo do presente experimento foram

necessaacuterias 120 fecircmeas de lambari para cada experimento (Tabela 1)

Tabela 1 Distribuiccedilatildeo das fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus em cada grupo experimental

Repeticcedilatildeo Controle 115microgl 23microgl 56microgl A 10 10 10 10 B 10 10 10 10 C 10 10 10 10

Para cada peixe que sobreviveu agrave intoxicaccedilatildeo pelo periacuteodo de 96 horas (teste de

toxicidade subletal) foram obtidos dados biomeacutetricos como peso corporal comprimento

total e comprimento-padratildeo peso do fiacutegado e peso do ovaacuterio Os ovaacuterios e fiacutegados na

sequecircncia foram fixados para posterior anaacutelise histoloacutegica



Apoacutes 96 horas de experimento seis animais de cada grupo foram coletados

anestesiados com benzocaiacutena e eutanasiados para coleta dos ovaacuterios e fiacutegados Para o

estudo das caracteriacutesticas morfoloacutegicas de ovaacuterios e fiacutegados os fragmentos foram

fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01M pH 72 O material foi

fixado por um periacuteodo miacutenimo de 24 horas e preservado em aacutelcool 70 Em seguida os

fragmentos foram transferidos para soluccedilatildeo de aacutelcool 95 por quatro horas Apoacutes isso

os fragmentos de ovaacuterios e fiacutegados foram imersos em soluccedilatildeo de aacutelcool 95 e resina

glicolmetacrilato (Leica Historesin) na proporccedilatildeo de 11 por 12 horas seguida de resina

pura por 24 horas e posterior emblocamento Os fragmentos foram seccionados em

cortes com 3microm de espessura em microacutetomo rotativo com navalha de vidro Foi

preparada uma lacircmina por animal com quatro cortes em cada e em padratildeo semi-seriado

ou seja a cada corte aproveitado eram descartados cinco cortes seguintes para evitar que

a mesma ceacutelula fosse contada duas vezes no momento da anaacutelise baseando-se no

diacircmetro nuclear previamente estabelecido para cada tipo celular em questatildeo

22

As coloraccedilotildees utilizadas foram azul de toluidina e hematoxilinaeosina para

anaacutelises histotoloacutegicas e para morfometria Tambeacutem foi utilizada a reaccedilatildeo histoquiacutemica

com PAS contracorados com hematoxilina para os cortes de fiacutegados As lacircminas foram

montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e

as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis

GETIT Olympus


Os estudos morfoloacutegicos foram conduzidos em seis animais por concentraccedilatildeo

As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e fotografadas (ocular

de 10X e objetiva de 40X) em 10 campos ao acaso para anaacutelises morfoloacutegicas e

morfomeacutetricas que pudessem ser representativas dos efeitos do Thiodanreg no tecido

hepaacutetico Estas alteraccedilotildees foram comparadas com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos fiacutegados

das lacircminas do grupo controle

As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente em duas

formas 1) por meio do caacutelculo do Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) com base na

incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada animal

conforme a escala grau 1 (ausecircncia de alteraccedilatildeo histoloacutegica) grau 2 (ocorrecircncia de

lesotildees pontualmente localizadas) e grau 3 (lesotildees amplamente distribuiacutedas pelo oacutergatildeo)

em 10 campos fotografados e 2) por meio do caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo

Histopatoloacutegica (IAH) com base na severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger

et al (1997) Para tanto as alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos

quanto ao comprometimento das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo

comprometem o funcionamento do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam

o funcionamento normal do oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis

adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) (Tabela 2) O valor de IAH foi

calculado para cada animal utilizando a foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII

sendo I II e III correspondentes ao nuacutemero de alteraccedilotildees de estaacutedio I II e III

respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em cinco categorias seguindo

metodologia de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic (1994) 0-10= funcionamento normal do

tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50= dano moderado a severo do

tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100= dano irreparaacutevel do tecido Este

iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees hepaacuteticas entre os peixes

expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico

23

Tabela 2 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp MitrovicndashTutundzic1994)

Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas dez mediccedilotildees dos diacircmetros de

nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos para cada animal As medidas foram obtidas por

meio do programa Image-Pro Plus traccedilando duas linhas perpendiculares respeitando-se

os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise (Figura 5) Aleacutem disso

foram quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo citoplasma capilar sinusoides e

macroacutefagos em 10 campos (gradiacutecula com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2)

totalizando 4410 pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica (Figura

6) Estas avaliaccedilotildees foram conduzidas nos grupos controles e grupos de peixes expostos

ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees

A quantidade de glicogecircnio nos hepatoacutecitos foi avaliada em toda extensatildeo da

lacircmina de forma semiquantitativa sendo evidenciada pela reaccedilatildeo histoquiacutemica de

Periodic Acid Schiff (PAS) segundo Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos

resultados as marcaccedilotildees foram determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de

glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2- quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito

glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos

hepatoacutecitos nos grupos controles e grupos expostos ao toacutexico nas diferentes

concentraccedilotildees

ALTERACcedilOtildeES HISTOPATOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteGIO1 Alteraccedilatildeo nos hepatoacutecitosAtrofia nuclear I

Atorfia nuclear I

Deformaccedilatildeo do contorno celular I

Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I

Hipertrofia celular I

Hipertrofia nuclear I

Nuacutecleo na periferia da ceacutelula II

Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica II

Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II


Degeneraccedilatildeo nuclear II

Nuacutecleos picnoacuteticos II

Rompimento celular II

2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos

Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24

Figura 5 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de nuacutecleo e citoplasma de hepatoacutecitos por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Azul de toluidina Barra 5microm

Figura 6 Gradiacutecula utilizada para contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos capilares e macroacutefagos (4410 pontosanimal) Coloraccedilatildeo Azul de toluidina

25

353 Anaacutelises morfomeacutetri cas e morfoloacutegicas dos ovaacuterios

Os estudos foram conduzidos em seis animais de cada grupo em cada

experimento As lacircminas histoloacutegicas foram analisadsas em toda sua extensatildeo em busca

de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 3) que pudessem ser representativas dos

efeitos do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o

padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios das lacircminas dos grupos controles

Para a avaliaccedilatildeo morfomeacutetrica foram realizadas contagens dos diferentes

estaacutegios de desenvolvimento folicular Para isto foram utilizadas fotografias obtidas a

partir de 10 campos escolhidos ao acaso em objetiva de 10X (campo com 5094microm de

largura por 68120microm de comprimento totalizando uma aacuterea de 1863 mmsup2) Aleacutem

disso foi realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos

associados aos foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X

avaliando-se 10 foliacuteculos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro

experimentos Tambeacutem foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos

vitelogecircnicos para cada animal Estas medidas foram obtidas pelo programa Image-Pro

Plus traccedilando-se duas linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e central e respeitando-se os

limites do foliacuteculo As mensuraccedilotildees foram realizadas em imagens obtidas com objetiva

de 4X (Figura 7) Em todas as contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores

meacutedios e desvios-padratildeo para cada concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento

folicular nos diferentes experimentos

Tabela 3 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do ovaacuterio quanto ao comprometimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)

ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULAR ES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos

Descolamento do revestimento folicular

Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica

Retraccedilatildeo nuclear

Atresia folicular

Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica

Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica

Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo

Foliacuteculos vazios

Granuloacutecitos envolvendo foliacuteculos

26

Figura 7 Metodologia para obtenccedilatildeo de medidas de diacircmetro de ovoacutecitos vitelogecircnicos avanccedilados por meio do programa Image-Pro Plus Coloraccedilatildeo Hematoxilina eosina


Para detectar a possiacutevel imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e

caspase 3 no tecido conjuntivo ovaacuterios do lambari foram fixados em paraformaldeido a

4 A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada em forno microndas por 10 minutos com os

cortes nas lacircminas sendo imersos em tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram

incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em

temperatura ambiente para inativar peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a

2 por 45 minutos para bloquear marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos

primaacuterios anti-colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz

Biotechnology Calif USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100

(integrina e colaacutegeno tipo IV) e 1200 (Caspase 3) segundo o fabricante ldquoovernightrdquo

Os cortes foram lavados em PBS e incubados por 45 minutos com diluiccedilatildeo de 1200

com anticorpo secundaacuterio IgG anti-coelho (LSAB 2 sistema HRP da Dako Cytomation

kit Dako Cytomation Carpinteria Calif USA) e tratado com peroxidase conjugada

com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi realizada com diaminobenzidina

(DAB) e as lacircminas foram contracoradas com hematoxilina (Santos et al 2008a)

27


Para analisar quantitativamente a atividade reprodutiva do A bimaculatus foram

registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso corporal (em g)

peso dos ovaacuterios (em g) e peso do fiacutegado (em g) Os valores meacutedios e desvios-padratildeo

dos iacutendices gonadossomaacutetico e hepatossomaacutetico foram calculados para cada animal em

cada um dos grupos propostos no presente estudo

a) Iacutendice gonadossomaacutetico (IGS)

IGS=PG x100 PG= peso dos ovaacuterios

PC PC= peso corporal

b) Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)

IHS= PF x100 PF= peso do fiacutegado


37 Anaacutelises estatiacutesticas

As variaacuteveis quantitativas foram submetidas aos testes de homocedasticidade

(Levenes) e normalidade (Shapiro-Wilk) e posteriormente agrave anaacutelise de variacircncia para

testar as variaccedilotildees nos valores meacutedios dos iacutendices calculados no momento da coleta (96

horas) entre os grupos controles e os grupos tratados Foi analisado o coeficiente de

variaccedilatildeo para se evitar erros estatiacutesticos tipo I e tipo II e logo apoacutes foi realizado o teste

parameacutetrico de Duncan ou Tukey (Plt005) para comparar os valores meacutedios Quando

natildeo atenderam agraves premissas de normalidade e homocedasticidade mesmo apoacutes as

transformaccedilotildees apropriadas os dados foram submetidos aos testes natildeo-parameacutetricos de

Kruskal-Wallis (ANOVA) Para as variaacuteveis qualititativas quantificadas foi utilizado o

teste de Kruskal-Wallis (ANOVA) Os graacuteficos foram produzidos usando o software

Microsoft Excel 2010

28


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51 CAPIacuteTULO 1

EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA HEPAacuteTICA

DE FEcircMEAS DE LAMBARIS Astyanax bimaculatus

RESUMO

O Thiodanreg eacute um toacutexico que pode causar alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos tecidos de peixes

expostos a ele dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees

este estudo avaliou a morfologia hepaacutetica de fecircmeas de lambaris Astyanax bimaculatus

expostas ao Thiodanreg por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs

concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56 microgL de Thiodanreg aleacutem de um grupo

controle livre de toacutexico As fecircmeas foram divididas em quatro experimentos sem

aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e

sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados Foi observado que a accedilatildeo do

Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a estrutura morfoloacutegica do fiacutegado

como um todo mas foram observadas alteraccedilotildees em locais isolados do parecircnquima

hepaacutetico Houve depleccedilatildeo de glicogecircnio deformaccedilatildeo nuclear e citoplasmaacutetica

hipertrofia nuclear e citoplasmaacutetica hiperemia e degeneraccedilatildeo celular nos hepatoacutecitos

nas diferentes concentraccedilotildees No entanto o Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histoloacutegica (IHA) e o

Valor Meacutedio de Alteraccedilatildeo (VMA) demonstraram que as alteraccedilotildees observadas nos

fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas sendo na maioria alteraccedilotildees de estaacutedio I e II

de forma leve a moderada com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico em todas as

concentraccedilotildees Aleacutem disso houve alteraccedilatildeo do diacircmetro do nuacutecleo e citoplasma dos

hepatoacutecitos nos diferentes experimentos e maior quantidade de nuacutecleos de hepatoacutecitos

nos grupos expostos ao Thiodanreg associada agrave reduccedilatildeo na quantidade de citoplasma

Conclui-se que o Thiodanreg influenciou o metabolismo hepaacutetico como resposta

adaptativa celular A incidecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas no fiacutegado dos lambaris

coletados nos diferentes experimentos indica o comprometimento da sauacutede destes

peixes e mostra que os paracircmetros analisados podem ser empregados como

biomarcadores da contaminaccedilatildeo ambiental nesta espeacutecie

Palavras-chave histopatologia fiacutegado peixe endosulfan ecotoxicologia

36

1 INTRODUCcedilAtildeO

O Thiodanreg eacute um inseticida de uso comercial que consiste na mistura de dois

isocircmeros ativos sendo 70 α-endosulfan e 30 β-endosulfan Endosulfan eacute um

hidrocarboneto clorado usado como inseticida de amplo espectro que controla insetos

por accedilatildeo de contato e ingestatildeo (Stumpf amp abhaver 1986 Chakrabarty et al 2012)

Atualmente foi banido em vaacuterios paiacuteses pela sua alta toxicidade (Molina 2010) O

toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo a

partir da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em risco os organismos que ali

residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al 2007)

Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos como jaacute

observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus A

Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em gordura o valor de

005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980) A Legislaccedilatildeo

Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a qualidade da

aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo CONAMA - nordm

3572007 estabelece o valor limite de 0056 gL de resiacuteduo do referido inseticida e

seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1

A sensibilidade ao endosulfan pelos organismos aquaacuteticos tem sido bem descrita

na literatura (Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O

produto eacute extremamente toacutexico para peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em

concentraccedilotildees muito pequenas (Cengiz et al 2001) No entanto a sensibilidade pode

variar entre os sexos assim como foi observado nos peixes adultos da espeacutecie Jenynsia

multidentata sob efeito do endosulfan por 96 horas (Ballesteros et al 2007) Neste

trabalho a CL50 em peixes machos foi de 072 μgL-1 enquanto nas fecircmeas foi de

131μgL-1 valores atribuiacutedos agraves diferenccedilas de maior reserva de lipiacutedeos nas fecircmeas que

nos machos Em outros estudos Capkin et al (2006) utilizaram 1978gL-1 em

Oreochromis mikyss por 24 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico o que causou aleacutem da morte

de 50 dos peixes convulsotildees nado erraacutetico separaccedilatildeo das lacircminas bracircnquiais e

necrose do fiacutegado e como Cengiz et al (2001) reportaram lesotildees similares no peixe-

mosquito Gambusia affinis

O sulfato de endosulfan eacute um dos produtos derivados do metabolismo do

endosulfan sendo considerado o principal metaboacutelito devido agrave sua importacircncia

toxicoloacutegica (Stumpf amp abhaver 1986) e por ser mais estaacutevel no meio ambiente do que

37

quando estaacute em sua foacutermula original (Ali et al 1984) Decorrente disto os peixes

quando expostos a este inseticida podem apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas

significativas no fiacutegado (Capkin et al 2006 Coimbra et al 2007 Glover et al 2007)

Estas alteraccedilotildees morfoloacutegicas podem ser o surgimento de vacuolizaccedilatildeo dos hepatoacutecitos

depleccedilatildeo de glicogecircnio alteraccedilatildeo dos vasos sinusoides alteraccedilatildeo do tamanho dos

hepatoacutecitos e necroses o que de acordo com alguns autores pode influenciar a siacutentese

de vitelogenina no fiacutegado para formaccedilatildeo dos foliacuteculos vitelogecircnicos em periacuteodo

reprodutivo (Senthilkumaran et al 2004 Al-Ghais 2013 Silva Barni et al 2014 )

Aleacutem disso as funccedilotildees hepaacuteticas podem ser influenciadas pelas diferenccedilas na

capacidade de exposiccedilatildeo a contaminantes condiccedilatildeo fisioloacutegica armazenamento de

energia e haacutebitos alimentares (Ribeiro et al 2006 Al -Ghais 2013 Silva Barni et al

2014)

O lambari Astyanax bimaculatus foi escolhido como organismo experimental

pois eacute muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o Nordeste

brasileiro ateacute a bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de

pequeno porte e de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio

Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees histoloacutegicas

no fiacutegado de fecircmeas de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada e avaliar a intensidade

de alteraccedilatildeo deste orgatildeo em peixes alimentados e desprovidos de alimento durante

ensaios subletais agudos com o toacutexico Thiodanreg


O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria da Universidade

Federal de Viccedilosa Os peixes foram mantidos no Bioteacuterio de Peixes do Departamento de

Veterinaacuteria onde foram realizados o teste de toxicidade aguda e o teste subletal As

atividades de coleta fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos fiacutegados microtomia

coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram

realizadas nos Laboratoacuterios de Peixes e de Histopatologia do Departamento de

Veterinaacuteria da UFV (DVTUFV)

21 Animais

Foram utilizadas fecircmeas de A bimaculatus obtidas de tanques de terra na

Piscicultura da Prata EugenoacutepolisMG Para o presente estudo foram selecionadas

38

fecircmeas de lambari em maturaccedilatildeo avanccedilada com peso de 1152 plusmn 20 g e comprimento

total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos animais em maturaccedilatildeo

avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado poro genital

dilatado e vascularizado





sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo contiacutenua da aacutegua para garantir o bem-estar dos

peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de

proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da piscicultura

As caracteriacutesticas da aacutegua utilizada no teste em sistema estaacutetico foram mantidas

de acordo com as recomendaccedilotildees da NBR 15088 (ABNT 2007) com temperaturas de

255 plusmn 10 ordmC livre de cloro pH 72 plusmn 03 oxigecircnio dissolvido 69 plusmn 06 mgL-1 e dureza

total (CaCO3) 2815 plusmn 594 mgL-1




22 Agrotoacutexico

Para a avaliaccedilatildeo proposta no presente trabalho foi utilizado o inseticida

organoclorado Thiodanreg (Bayer) em sua apresentaccedilatildeo comercial com 350gL-1 de

endosulfan

23 Teste da toxicidade aguda em sistema estaacutetico - CL 50


mortalidade de 50 dos animais foi realizado em sistema de aacutegua estaacutetico de acordo

com a NBR 15088 (ABNT 2007) com os animais mantidos em restriccedilatildeo alimentar que

se iniciou 24 horas antes do iniacutecio do experimento e perdurou durante todo o teste (96

horas) Essa restriccedilatildeo alimentar foi realizada para evitar acuacutemulo de mateacuteria orgacircnica

que poderia interferir na accedilatildeo do agrotoacutexico

Para o teste foram selecionadas 120 fecircmeas adultas de lambari em maturaccedilatildeo

avanccedilada O agrotoacutexico utilizado foi o Thiodanreg (Bayer) com 350gL-1 de endosulfan

Foram utilizadas trecircs repeticcedilotildees com cinco peixes cada para cada concentraccedilatildeo de

39

Thiodanreg adotada sendo os grupos assim classificados controle (0microgL-1) 15microgL-1

30microgL-1 60microgL-1 120microgL-1 240microgL-1 480microgL-1 e 960microgL-1 As concentraccedilotildees

foram distribuiacutedas em recipientes plaacutesticos com 15L de aacutegua dos proacuteprios aquaacuterios

Foram realizadas verificaccedilotildees de mortalidade a cada seis horas ateacute 96 horas

(zero 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 e 96 horas) removendo-se

os animais mortos o que proporcionou menores interferecircncias pela decomposiccedilatildeo dos

peixes gerando maior confianccedila da mortalidade apresentada ser em funccedilatildeo da

toxicidade do princiacutepio ativo endosulfan sinergicamente agrave accedilatildeo dos solventes e demais

compostos do inseticida Para acompanhamento da temperatura foi acondicionado 15L

de aacutegua do mesmo aquaacuterio em um recipiente idecircntico de forma que qualquer variaccedilatildeo

na temperatura pudesse ser medida sem provocar estresse adicional a nenhum grupo O

programa utilizado para o caacutelculo da CL50 foi o TOXCALC determinando o valor e

intervalo de confianccedila pelo meacutetodo PROBITUS (Plt005)

24 Teste da toxicidade subletal em sistema estaacutetico

O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado baseando-se

principalmente nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo a NBR

15088 (ABNT 2007)

As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL-1) por 96 horas em

quatro tratamentos diferentes 1) experimento sem aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem

alimentaccedilatildeo 2) experimento sem aclimataccedilatildeo e com alimentaccedilatildeo 3) experimento com

aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e 4) experimento com aclimataccedilatildeo de 10 dias

e com alimentaccedilatildeo Todos os experimentos foram constituiacutedos por trecircs concentraccedilotildees

diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 preacute-determinada em laboratoacuterio de acordo com

a NBR 15088 (ABNT 2007) e um grupo controle sem toacutexico As concentraccedilotildees

utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL-1 com trecircs repeticcedilotildees sob

as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo

25 Anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas

Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais

em cada grupo nos diferentes experimentos Logo em seguida os fiacutegados foram

coletados apoacutes os peixes terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e

eutanasiados pela secccedilatildeo transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo

40

Para a histologia todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em

tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato

(Leica Historesinreg) Em seguida secccedilotildees com 3microm de espessura foram coradas

utilizando azul de toluidina para as anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas

foram montadas com Entellan (Merckreg) analisadas em microscoacutepio de luz CX31

Olympus e as imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software

Analysis GETIT Olympus

As lacircminas histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo e foram

fotografados 10 campos ao acaso em objetiva de 40X para anaacutelises morfoloacutegicas e

morfomeacutetricas que pudessem ser representativas do efeito do Thiodanreg no tecido


dos grupos controles

As alteraccedilotildees histoloacutegicas foram avaliadas semiquantitativamente de duas


incidecircncia de lesotildees Para tanto atribuiu-se um valor numeacuterico para cada oacutergatildeo


lesotildees pontuais) e grau 3 (lesotildees amplamente difusas pelo oacutergatildeo) em 10 campos

fotografados e 2) pelo caacutelculo do Iacutendice de Alteraccedilatildeo Histotoloacutegica (IAH) com base na

severidade de cada lesatildeo de acordo com Schwaiger et al (1997) Para tanto as

alteraccedilotildees foram classificadas em estaacutedios progressivos quanto ao comprometimento

das funccedilotildees do oacutergatildeo alteraccedilotildees de estaacutedio I que natildeo comprometem o funcionamento

do oacutergatildeo de estaacutedio II mais severas e que prejudicam o funcionamento normal do

oacutergatildeo e de estaacutedio III muito severas e irreversiacuteveis (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-

Tutundzic 1994) (Tabela 1) O valor de IAH foi calculado para cada animal utilizando a

foacutermula IAH =10ordm sumI + 10ˡ sumII + 10sup2 sumIII sendo I II e III correspondentes agraves

alteraccedilotildees de estaacutedios I II e III respectivamente O valor meacutedio de IAH foi dividido em

cinco categorias que seguiu metodologia de Poleksic amp Mitrovic- Tutundzic (1994) 0-

10= funcionamento normal do tecido 11-20= dano leve a moderado do tecido 21-50=

dano moderado a severo do tecido 51-100= dano severo do tecido maior que 100=

dano irreparaacutevel do tecido Este iacutendice permitiu a comparaccedilatildeo da severidade das lesotildees

hepaacuteticas entre os peixes expostos agraves diferentes concentraccedilotildees do toacutexico

Para as anaacutelises morfomeacutetricas foram realizadas mediccedilotildees dos diacircmetros de dez



41

os limites do nuacutecleo e do citoplasma do hepatoacutecito em anaacutelise Aleacutem disso foram

quantificados pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleo de hepatoacutecito citoplasma de hepatoacutecito

capilares sinusoides e macroacutefagos em 10 campos utilizando-se gradiacutecula com 441

pontos de interseccedilatildeo com 100microm de lado e uma aacuterea de 10000micromsup2 totalizando 4410

pontosanimal para o caacutelculo da constituiccedilatildeo tecidual hepaacutetica

Tabela 1 Classificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histoloacutegicas do fiacutegado quanto ao estaacutegio de comprometimento das funccedilotildees teciduais (adaptado de Poleksic amp Mitrovic-Tutundzic 1994)

ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS HEPAacuteTICAS ESTAacuteDIO 1 Alteraccedilotildees nos hepatoacutecitos I Atrofia nuclear I Deformaccedilatildeo do contorno celular I Deformaccedilatildeo do contorno nuclear I Hipertorfia celular I Hipertorfia nuclear I Nuacutecleo na periferia da ceacutelula I Vacuolizaccedilatildeo citoplasmaacutetica I Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica II Degeneraccedilatildeo nuclear II Nuacutecleo picnoacuteticos II Rompimento celular II 2 Alteraccedilotildees nos vasos sanguiacuteneos Hiperemia II Ruptura de vasos II 3 Necrose Necrose focal III



Periodic Acid Schiff (PAS) seguida de contracoloraccedilatildeo com hematoxilina segundo

Michalany (1980) Para melhor compreensatildeo dos resultados as marcaccedilotildees foram

determinadas na seguinte escala 0- ausecircncia de glicogecircnio 1- pouco glicogecircnio 2-

quantidade moderada de glicogecircnio 3- muito glicogecircnio Apoacutes esta anaacutelise foi

calculada uma meacutedia do conteuacutedo de glicogecircnio dos hepatoacutecitos nos grupos controles e

grupos expostos ao toacutexico nas diferentes concentraccedilotildees

42

26 Iacutendice hepatossomaacutetico (IHS)

Para o caacutelculo do IHS foram registrados para cada exemplar os dados

biomeacutetricos de peso corporal (PC em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os valores meacutedios

e os desvios padratildeo do iacutendice hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados

para cada animal em cada um dos grupos nos diferentes experimentos nas diferentes



Os dados estatildeo apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo

Os dados foram avaliados pelo Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados

entre os grupos controle e grupos expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia

one-way seguida pelo teste de Tukey ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram

uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis

Plt005 foi utilizado como criteacuterio de significacircncia

3 RESULTADOS

31 Determinaccedilatildeo da CL50-96h

Nas primeiras seis horas de experimento observou-se mortalidade de 100 de

peixes na concentraccedilatildeo de 96microgL-1 944 de mortalidade em 48microgL-1 733 de

mortalidade em 24microgL-1 266 de mortalidade em 12microgL-1 e 20 de mortalidade em

6microgL-1 sendo um total de 447 dos peixes que morreram nas diferentes

concentraccedilotildees do Thiodanreg nas primeiras seis horas Na concentraccedilatildeo de 3microgL-1

morreu apenas um peixe no final das 96 horas Foi observado 100 de mortalidade na

concentraccedilatildeo de 48microgL-1 em ateacute 12 horas de exposiccedilatildeo ao toacutexico As menores

mortalidades foram registradas nas concentraccedilotildees de Thiodanreg de 3microgL-1 e 6microgL-1

sendo respectivamente 944 e 80 de sobrevivecircncias A concentraccedilatildeo de 15microgL-1

de Thiodanreg e o grupo controle natildeo tiveram mortalidade A temperatura da aacutegua

apresentou variaccedilatildeo entre 220ordmC e 245 ordmC com meacutedia de 233plusmn072 ordmC

Os valores registrados determinaram CL50-96hs de 1367microgL-1para as fecircmeas de

A bimaculatus com intervalo de confianccedila de 101 a 184microgL-1 (Plt005)

43


Durante a exposiccedilatildeo ao Thiodanreg por 96 horas foi observado comportamento

anormal dos peixes com nado erraacutetico tentativa de fuga dos aquaacuterios demonstraccedilatildeo de

agressividade com os demais peixes busca de oxigecircnio na superfiacutecie e respiraccedilatildeo

branquial acelerada Apoacutes 24 horas do iacutenicio os animais apresentavam comportamento

normal e procuravam pelo alimento Estas mudanccedilas comportamentais ocorreram em

todas as concentraccedilotildees do agrotoacutexico utilizadas com maior intensidade na concentraccedilatildeo

de 56microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo cuja temperatura meacutedia

foi superior agrave dos demais experimentos (Tabela 2)

33 Morfologia e frequecircncia das alteraccedilotildees histoloacutegicas nos fiacutegados

Morfologicamente o fiacutegado dos lambaris apresentou hepatoacutecitos hexagonais

com citoplasma de aspecto granular e vacuolizado nuacutecleo arredondado central nucleacuteolo

evidente e presenccedila de hepatopacircncreas Os hepatoacutecitos estavam dispostos em cordotildees

margeando os sinusoides (Figura 1 A)

Os infiltrados leucocitaacuterios foram observados nos grupos controles e nos grupos

expostos ao Thiodanreg (Figura 1 B)

A vacuolizaccedilatildeo foi evidente nos hepatoacutecitos das fecircmeas analisadas (Figura 1 A)

No fiacutegado das fecircmeas do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de lipiacutedios nos

hepatoacutecitos com a presenccedila de vesiacuteculas claras grandes e envolvidas por glicogecircnio

marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS (Figura 1 C) Aleacutem disso foram observados

nuacutecleos deslocados para a periferia celular No experimento sem aclimataccedilatildeosem

alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve reaccedilatildeo negativa pelo PAS no

citoplasma dos hepatoacutecitos (Figura 1 D)

As alteraccedilotildees de estaacutedio I como deformaccedilatildeo do contorno nuclear nuacutecleo na

periferia da ceacutelula atrofia nuclear desarranjo dos cordotildees hepaacuteticos hipertrofia celular

e nuclear (Figuras 1 E-G Figuras 2 A-B) foram observadas nos grupos controles e

naqueles expostos ao Thiodanreg sendo que nos grupos tratados houve maior frequecircncia

O deslocamento do nuacutecleo para a periferia do hepatoacutecito foi observado nas fecircmeas do

experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 56microgL-1

Quanto agraves alteraccedilotildees de estaacutedio II a degeneraccedilatildeo nuclear (Figura 2 C) foi

raramente presente na maioria das concentraccedilotildees nos diferentes experimentos A

degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Figura 2 D) foi pouco frequente em todos os experimentos

44

assim como a hiperemia (Figura 2 E) A presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (Figura 2 F) foi

mais frequente no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento

com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo

Os VMAs variaram entre 125 e 228 nas fecircmeas analisadas sendo a menor

meacutedia observada nos grupos controles e as maiores nos grupos expostos ao Thiodanreg o

que mostra incidecircncia maior de alteraccedilotildees pontuais no fiacutegado nos animais dos grupos

tratados Os VMAs do fiacutegado na espeacutecie estudada foram superiores (Plt005) nos peixes

expostos ao agrotoacutexico quando comparado aos peixes dos grupos controles (Tabela 3)

O IAH das fecircmeas nos diferentes experimentos apresentaram valores superiores

(Plt005) nos grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados como os grupos

controles (Tabela 4) com exceccedilatildeo do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de 115microgL-1 de endosulfan que natildeo houve diferenccedila (Pgt005)

34 Diacircmetro dos nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos

Os resultados demonstraram aumento (Plt005) no diacircmetro dos nuacutecleos de

hepatoacutecitos dos peixes expostos ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees de 115microgL-1 e

23microgL-1 quando comparados ao grupo controle no experimento sem aclimataccedilatildeosem

alimentaccedilatildeo Por outro lado foi registrada diminuiccedilatildeo (Plt005) do diacircmetro dos nuacutecleos

de hepatoacutecitos no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo quando comparados

aos peixes expostos ao Thiodanreg na concentraccedilatildeo 115 e 23microgL-1 em relaccedilatildeo ao grupo

controle (Tabela 5)

O diacircmetro do citoplasma apresentou aumento no experimento sem

aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo com

diferenccedila (Plt005) registrada entre os peixes do grupos controles e expostos ao

agrotoacutexico com exceccedilatildeo do experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de 23microgL-1 (Tabela 6) Entretanto houve diminuiccedilatildeo nos citoplasmas de

hepatoacutecitos nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao grupos controles (Plt005)

nos experimentos sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e no experimento com

aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Tabela 6)

35 Quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos macroacutefagos e capilares

sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico

Nas contagens de pontos de interseccedilatildeo sobre nuacutecleos de hepatoacutecitos (Tabela 7)

foram observadas quantidades superiores nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo

45

aos grupos controles (Plt005) Na quantificaccedilatildeo dos citoplasmas de hepatoacutecitos foram

registradas contagens inferiores (Plt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo

aos grupos controles exceto no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela

8)

Na contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre macroacutefagos natildeo houve aumento

significativo (Pgt005) nos peixes expostos ao agrotoacutexico em relaccedilatildeo ao controle (Tabela

9) Em relaccedilatildeo agrave contagem de pontos de interseccedilatildeo sobre capilares sinusoides a

contagem foi igual na maioria dos peixes expostos ao agrotoacutexico quando comparados

com os controles apresentando diferenccedila significativa (Plt005) entre os grupos

expostos do experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo nas concentraccedilotildees de 115 e

56microgL-1 (Tabela 10)

36 Quantificaccedilatildeo do glicogecircnio hepaacutetico

Em todos os grupos controles e tratados nos diferentes experimentos foram

registrados valores meacutedios para o glicogecircnio variando entre 010 e 300 No

experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo no grupo tratado da concentraccedilatildeo de

56microgL-1 de Thiodanreg foi registrada a menor meacutedia (Tabela 11) No entanto houve

diferenccedila (Plt005) do glicogecircnio hepaacutetico na concentraccedilatildeo de 56microgL quando

comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 (Tabela 11 e Figura 1 D)

37 Iacutendice hepatossomaacutetico

As fecircmeas dos grupos experimentais expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram

diferenccedilas (Pgt005) nos valores do IHS quando comparados com os grupos controles

(Tabelas 12) Entretanto houve diferenccedila (Plt005) do IHS na concentraccedilatildeo de 56microgL-1

quando comparada com as concentraccedilotildees de 115 e 23microgL-1 no experimento sem

aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Tabela 12)

4 DISCUSSAtildeO

No presente estudo o lambari apesar de ser de pequeno porte apresentou uma

CL50 de 1367microgL-1 em 96 horas sendo mais resistente que adultos de tilaacutepia niloacutetica

Musanhi (1987) determinou a CL50 96 48 e 24 horas de exposiccedilatildeo ao endosulfan para

tilaacutepia niloacutetica adulta encontrando valores de 142 380 e 103 microgL-1 Nas primeiras 24

horas de accedilatildeo do Thiodanreg nas concentraccedilotildees subletais de 115 23 e 56microgL-1 as

fecircmeas do presente estudo apresentaram comportamentos alterados assim como foi

46

observado na espeacutecie Danio rerio exposta ao endosulfan por 96 horas na concentraccedilatildeo

de 24microgL-1 aleacutem desta espeacutecie ter apresentado uma diminuiccedilatildeo do niacutevel de

acetilcolinesterase (AChE) (Pereira et al 2012) Por outro lado em estudo realizado

por Hernan da Cuntildea et al (2011) com a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao

endosulfan por 96 horas nas concentraccedilotildees de 025 1 2 3 4 e 16microgL-1 os peixes

exibiram comportamento indicativo de neurotoxicidade mas natildeo foram encontradas

diferenccedilas na atividade da AChE Estes estudos fornecem evidecircncias adicionais de

efeitos deleteacuterios da exposiccedilatildeo ao endosulfan sobre o sistema nervoso o que contribui

para as observaccedilotildees obtidas no presente estudo

As descriccedilotildees histoloacutegicas hepaacuteticas nas fecircmeas do presente estudo foram

semelhantes ao que foi caracterizado em outros peixes onde os hepatoacutecitos organizam-

se em fileiras ou cordotildees duplos em formato de placas representando um sistema de

fundo-cego anastomosado e de tuacutebulos ramificados (Metcalfe 1998 Hinton et al

2001)

A histologia e a fisiologia do fiacutegado satildeo similares nos vertebrados Ferguson

(1989) e Gingerich (1982) descrevem que existem algumas diferenccedilas estruturais

marcadas no parecircnquima hepaacutetico de peixes em especial pela ausecircncia de lobulaccedilatildeo

espaccedilo porta claacutessico e ausecircncia de zonaccedilatildeo no parecircnquima hepaacutetico o que permite

fluxo lento de sangue nos sinusoides com penetraccedilatildeo diminuiacuteda de quiacutemicos nos

hepatoacutecitos

A presenccedila de porccedilotildees pancreaacuteticas dentro do fiacutegado do lambari eacute descrita na

literatura (Santos et al 2013) Uma das funccedilotildees das ceacutelulas pancreaacuteticas distribuiacutedas

pelo fiacutegado eacute a produccedilatildeo da enzima de biotransformaccedilatildeo citocromo P450 diferente do

que eacute observado para mamiacuteferos onde esta enzima eacute ausente (Hahn et al 1994

Stegeman 1991) A presenccedila de ceacutelulas pancreaacuteticas em estruturas do tecido hepaacutetico

de A bimaculatus sugere a provaacutevel funccedilatildeo dessas ceacutelulas em auxiliar na

desintoxicaccedilatildeo Outra importante estrutura na detoxificaccedilatildeo eacute a presenccedila das ceacutelulas dos

endoteacutelios capilares nas quais tem sido confirmada e identificada a presenccedila de enzimas

citocromo P450 por meio de teacutecnicas de imunomarcaccedilatildeo (Lorenzana et al 1986)

Sendo assim a integridade estrutural dos capilares permanece intacta e sem

comprometimento das possiacuteveis funccedilotildees celulares que estas estruturas podem

desempenhar no tecido hepaacutetico de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg

A ausecircncia de estagnaccedilatildeo biliar nos fiacutegados das fecircmeas de A bimaculatus eacute um

fator importante de que o Thiodanreg natildeo interferiu na fisiologia de excreccedilatildeo biliar nos

47

diferentes experimentos Histopatologicamente este tipo de alteraccedilatildeo eacute observado nos

citoplasmas dos hepatoacutecitos com a presenccedila de gracircnulos castanho-amarelados Esta

alteraccedilatildeo consiste na manifestaccedilatildeo fisiopatoloacutegica de uma condiccedilatildeo causada pela falta

de metabolismo e excreccedilatildeo biliar (Pacheco amp Santos 2002) uma vez que a bile

sintetizada pelos hepatoacutecitos permanece no interior das ceacutelulas natildeo sendo liberada para

o tubo digestivo (Simonato et al 2008) Este tipo de alteraccedilatildeo pode ser encontrado em

peixes expostos a toacutexicos (Pacheco amp Santos 2002) e tambeacutem em peixes que

apresentam algum problema nutricional quando satildeo mantidos em cativeiros (Langiano

amp Martinez 2008) No entanto no presente estudo natildeo foram registradas essas

evidecircncias o que sugere que a alimentaccedilatildeo nos grupos tratados com raccedilatildeo comercial de

todos os experimentos natildeo interferiu nas funccedilotildees biliares

Os agregados macrofaacutegicos estatildeo relacionados agrave quebra de eritroacutecitos (Herraez

amp Zapata 1986) apresentaccedilatildeo de antiacutegeno (Ellis 1980) armazenamento de ferro e

detoxicaccedilatildeo de substacircncias endoacutegenas e exoacutegenas (Herraez amp Zapata 1986) Hartley et

al (1996) propuseram a utilizaccedilatildeo do agregado macrofaacutegico como biomarcador de

poluiccedilatildeo aquaacutetica a partir da quantificaccedilatildeo destas estruturas Existem alguns estudos

comparativos em diferentes espeacutecies que tecircm demonstrado variaccedilotildees no nuacutemero

tamanho e pigmentaccedilatildeo destas estruturas em relaccedilatildeo agrave idade nutriccedilatildeo e estado de sauacutede

(Blazer et al 1987 Ferguson 1989 Agius et al 2003) Nos agregados podem ser

observados pigmentos do tipo lipofuscina ceroide hemossiderina e melanina (Wolke

1992 Wolf amp Wolfe 2005) mas no presente estudo natildeo foram evidenciadas nenhuma

destas estruturas

No fiacutegado das fecircmeas do grupo experimental sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo

na maior concentraccedilatildeo de 56microgL-1 houve a presenccedila caracteriacutestica de acuacutemulos de

lipiacutedios nos hepatoacutecitos de dois peixes No entanto existem vaacuterias condiccedilotildees de

acuacutemulos de lipiacutedios nos hepatoacutecitos associados com a exposiccedilatildeo aos toacutexicos

(Thiyagarajah et al 1985 Biagianti-Risbourg et al 1995 Lumbertdacha et al 1995

Handy et al 1999 Fanta et al 2003) Glover et al (2007) submeteram o peixe salmatildeo

do Atlacircntico a dieta de 4microgkg de endosulfan por 14 e 35 dias sendo observadas

evidecircncias de lipidoses nos hepatoacutecitos O aparecimento destas estruturas nas fecircmeas de

A bimaculatus foi insignificante nos tecidos hepaacuteticos mas foram contabilizadas como

respostas individuais sugerindo uma disfunccedilatildeo hepaacutetica causada pelo Thiodanreg que

pode comprometer a fisiologia hepaacutetica destas fecircmeas

48

No presente estudo as frequecircncias de alteraccedilotildees morfoloacutegicas indicam que a

accedilatildeo toacutexica do Thiodanreg provocou uma distribuiccedilatildeo de lesotildees de incidecircncia leve a

moderada no tecido hepaacutetico nos diferentes experimentos sendo que nas maiores

concentraccedilotildees do toacutexico houve mais incidecircncias de alteraccedilotildees As alteraccedilotildees observadas

nos fiacutegados dos lambaris natildeo foram severas isto eacute natildeo apresentaram necrose sendo que

a maioria das alteraccedilotildees satildeo de estaacutedios I e II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico

As alteraccedilotildees histoloacutegicas tecircm sido relatadas em peixes expostos a ambientes poluiacutedos

(Braunbeck et al 1990 Takashima et al 1995 Schwaiger et al 1997) Da mesma

forma a frequecircncia das alteraccedilotildees pode indicar disfunccedilotildees induzidas por agentes

toacutexicos uma vez que aacutereas metabolicamente ativas do fiacutegado ficam reduzidas levando a

uma possiacutevel reduccedilatildeo geral nas funccedilotildees desempenhadas por este oacutergatildeo (Hinton amp

Laureacuten 1990 Oliveira Ribeiro et al 2002 Pacheco amp Santos 2002 Langiano amp

Martinez 2008) Este resultado sugere que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees

hepaacuteticas mesmo em concentraccedilotildees muito baixas nos diferentes experimentos

independentemente do peixe estar sendo alimentado ou natildeo

As alteraccedilotildees dos diacircmetros de nuacutecleos de hepatoacutecitos podem ser consideradas

resposta ao agente estressor sendo indicativo da ativaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica em

decorrecircncia do aumento da atividade metaboacutelica contra as condiccedilotildees adversas (Stephen

et al 1993 Takashima amp Hibyia 1995 Langiano amp Martinez 2008) Por outro lado a

diminuiccedilatildeo nuclear pode estar relacionada possivelmente com a multiplicaccedilatildeo de

hepatoacutecitos na reposiccedilatildeo de ceacutelulas lesadas em funccedilatildeo da multiplicaccedilatildeo celular (Gul et

al 2004) No trabalho realizado por Oliveira Ribeiro et al (2002) observaccedilotildees

qualitativas por microscopia de luz demonstraram diminuiccedilatildeo no diacircmetro dos nuacutecleos

de hepatoacutecitos na espeacutecie A bimaculatus com alimentaccedilatildeo controlada associada agrave

exposiccedilatildeo ao toacutexico tributiltin Este tipo de alteraccedilatildeo eacute um indicativo de processo

degenerativo celular uma vez que inicia com a condensaccedilatildeo e reduccedilatildeo do diacircmetro do

nuacutecleo (Oliveira Ribeiro et al 2002) No presente estudo as alteraccedilotildees nos diacircmetros

de nuacutecleo de hepatoacutecitos demostraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees

hepaacuteticas das fecircmeas

A hipertrofia dos hepatoacutecitos tambeacutem pode ser causada por contaminantes

(Arnold et al 1985) por mudanccedilas estruturais do hepatoacutecito relacionadas ao

funcionamento da ceacutelula (Hinton et al 1992) condiccedilotildees fisioloacutegicas ligadas agrave

reproduccedilatildeo (Wester et al 2003) e pela maior atividade metaboacutelica (Takashima amp

Hibyia 1995) Portanto o aumento do diacircmetro citoplasmaacutetico nos experimentos sem

49

adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e no experimento com adaptaccedilatildeosem alimentaccedilatildeo mesmo

natildeo apresentando caracteriacutestica de hipertrofia morfoloacutegica evidente mas morfomeacutetrica

sugere indiacutecios de maior metabolizaccedilatildeo pelos hepatoacutecitos nestes grupos experimentais

As alteraccedilotildees dos diacircmetros de citoplasmas dos hepatoacutecitos nos experimentos

demonstraram que o Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas

Na quantificaccedilatildeo de nuacutecleos e citoplasmas de hepatoacutecitos nos diferentes

experimentos foram observados indiacutecios de proliferaccedilatildeo de hepatoacutecitos que pode ser

indicativo da accedilatildeo toacutexica dos hepatoacutecitos contra detoxificaccedilatildeo do Thiodanreg assim como

observado no trabalho por Gul et al (2004) O percentual do tecido hepaacutetico ocupado

por ceacutelulas do tipo hepatoacutecito variou entre 8742 a 9088 na constituiccedilatildeo do

parecircnquima hepaacutetico de A bimaculatus Poucos trabalhos citam a constituiccedilatildeo celular

em fiacutegados de peixes sendo 845 a 873 de hepatoacutecitos ocupando o parecircnquima

hepaacutetico na truta (Hampton et al 1989) e 899 no peixe Golden (Rocha et al 1997)

Estes valores demonstram que a maior parte das ceacutelulas dos fiacutegados nas fecircmeas de A

bimaculatus satildeo hepatoacutecitos como descrito em outras espeacutecies de peixes

O aumento da quantidade de macroacutefagos na concentraccedilatildeo 115microgL-1 dos

experimentos foi superior quando comparado aos demais grupos sugerindo que essa

mobilizaccedilatildeo pode estar ajudando na detoxicaccedilatildeo do fiacutegado (Herraez et al 1986)

Assim a presenccedila de maior quantidade de macroacutefagos e sinusoides podem ser

consideradas indicadoras de estresse em peixes decorrentes da presenccedila de agentes

quiacutemicos (Anderson amp Zeeman 1995 Rabitto et al 2005) Essas ceacutelulas satildeo

observadas frequentemente nas regiotildees proacuteximas aos sinusoides e desprovidas de

pigmentaccedilatildeo Foram observados macroacutefagos em trutas Oncorhynchus mykiss e Salmo

trutta fario na proporccedilatildeo de 02 e 07 respectivamente (Hampton et al 1985

Rocha et al 1997) enquanto no presente estudo variou entre 021 a 029 Meseguer

et al (1994) observaram macroacutefagos livres abundantes no parecircnquima do fiacutegado

sugerindo que estes se movem livremente dentro do parecircnquima formando os

agregados macrofaacutegicos quando haacute um aumento na atividade fagociacutetica como resposta

imune a lesotildees em indiviacuteduos expostos a contaminantes Entretanto no presente estudo

natildeo foram observadas estas caracteriacutesticas

Ainda vale ressaltar que esse toacutexico potencializa sua accedilatildeo em temperaturas mais

elevadas como aquelas observadas no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo

Estudando o efeito dos ciclodienos Correa et al (2001) Coutinho et al (2005) e

Capkin et al (2006) relataram que as alteraccedilotildees satildeo diretamente proporcionais agrave

50

temperatura da aacutegua ou seja quanto mais alta a temperatura mais toacutexicos os produtos

se tornam O experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

56microgL-1 registrou temperatura meacutedia da aacutegua em 269ordmC superior aos demais

experimentos Devido a isso uma resposta comum na intoxicaccedilatildeo em fiacutegados de peixes

eacute a diminuiccedilatildeo das reservas de glicogecircnio hepaacutetico (Seinen et al 1981 Ferguson 1989

Cyrino et al 2000) e iacutendice hepatossomaacutetico (Wester et al 1987 Wester et al 1988

Wester et al 2003 Glover et al 2007) evidenciada no presente estudo

No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees

subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo mas na forma de focos no parecircnquima

hepaacutetico nos diferentes experimentos Este tipo de lesatildeo pode estar associado agrave

concentraccedilatildeo do toacutexico utilizado tempo de exposiccedilatildeo e a via de contaminaccedilatildeo A

ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24 horas

observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via branquial

foi a causa mais direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico para corrente sanguiacutenea ateacute

chegar ao fiacutegado No entanto a via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de

entrada do toacutexico para os tecidos (Mckim et al 1999)

As alteraccedilotildees observadas nos fiacutegados podem afetar diretamente o metabolismo

das fecircmeas causando diminuiccedilatildeo da capacidade fisica e tornar os peixes uma presa faacutecil

para seus predadores Neste sentido os peixes poderatildeo ter menor sucesso reprodutivo e

se tornarem menos competitivos pelo alimento Do ponto de vista ecoloacutegico isso pode

acarretar alteraccedilotildees na populaccedilatildeo e na cadeia alimentar (Rodrigues amp Fanta 1998)

Nas condiccedilotildees que o estudo foi realizado como as concentraccedilotildees do inseticida

Thiodanreg que foram utilizadas o periacuteodo de exposiccedilatildeo e a espeacutecie de estudo conclui-se

que as fecircmeas podem estar em um processo inicial de intoxicaccedilatildeo um processo

patoloacutegico de recuperaccedilatildeo reversiacutevel

51

Figura 1 A Organizaccedilatildeo histoloacutegica do tecido hepaacutetico normal de A bimaculatus B Infiltrado leucocitaacuterio (IL) no tecido hepaacutetico de A bimaculatus C Hepatoacutecito com vesiacutecula clara (Vc) envolvida por glicogecircnio (G) marcado positivamente pela reaccedilatildeo de PAS e nuacutecleo (seta) deslocado na periferia da ceacutelula no experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 D Hepatoacutecito com ausecircncia de glicogecircnio evidenciada pela reaccedilatildeo negativa de PAS no experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo na concentraccedilatildeo 56microgL-1 Alteraccedilotildees de estaacutedio I - E Hepatoacutecito com nuacutecleo (seta) na perifieria F Atrofia nuclear (an) G Deformaccedilatildeo nuclear (dn) Nuacutecleo (N) e citoplasma (C) do hepatoacutecito sinusoacuteide (S) capilar (P) com hemaacutecias no interior acuacutemulo de glicogecircnio (G) no citoplasma e macroacutefagos (M) Barras A (30) B (65 microm) C e D (20 microm) E F e G (28 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina em A-B e E-G e PAS em C e D

G S G

N

C

M

M

an

F E

Vc

IL G

B

C

A

D

G

dn

N

C

G

52

Dn

A

E

B

F

Figura 2 Alteraccedilotildees histoloacutegicas do tecido hepaacutetico de A bimaculatus Alteraccedilotildees de estaacutedio I-A Hipertrofia celular (seta) B Hipertrofia nuclear (seta) Alteraccedilotildees de estaacutedio II - C Degeneraccedilatildeo nuclear (Dn) D Degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica (Dc) E Hiperemia () F Presenccedila de nuacutecleos picnoacuteticos (setas) Barras A B e E (30 microm) C D e F (25 microm) Coloraccedilatildeo Azul de toluiacutedina

C

A

Dc

D

53

Tabela 2 Valores meacutedios das temperaturas durante a realizaccedilatildeo dos experimentos

Tratamento Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Controle 268plusmn105 254plusmn049 248plusmn069 250plusmn049

115mgL-1 271plusmn104 256plusmn059 247plusmn045 245plusmn040 23mgL-1 269plusmn117 255plusmn048 244plusmn062 247plusmn043 56mgL-1 269plusmn118 254plusmn048 244plusmn063 247plusmn038

Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Legenda Experimento 1 - sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 2 - sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Experimento 3 - com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo Experimento 4 ndash com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo

Tabela 3 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa das alteraccedilotildees

histoloacutegicas (VMA) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 130 plusmn 020a 210 plusmn 030b 215 plusmn 019b 216 plusmn 011b

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 012a 190 plusmn 020b 190 plusmn 008aᵇ 228 plusmn 056b

com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 125 plusmn 012a 210 plusmn 021b 206 plusmn 017b 218 plusmn 027b

com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 130 plusmn 014a 200 plusmn 025b 221 plusmn 035b 228 plusmn 021b

Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Tukey

Tabela 4 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquantitativa dos iacutendices das

alteraccedilotildees histoloacutegicas (IAH) em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 883plusmn1034a 1850plusmn1009aᵇ 2883plusmn832b 2566plusmn550aᵇ

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 433plusmn557a 2883plusmn 810b 2780plusmn1388b 2766plusmn571b

com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 566plusmn 585a 2600plusmn773b 2550plusmn1078b 2733plusmn920b

com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 750plusmn512a 2217plusmn780b 2033plusmn875b 2366plusmn880b

Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan

54

Tabela 5 Diacircmetro meacutedio (microm) de nuacutecleos de hepatoacutecitos em fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 461 plusmn 040aᶜ 498 plusmn 020b 487 plusmn 028b 439 plusmn 027c

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 516 plusmn 071a 501plusmn 040a 502 plusmn 020a 515plusmn025a

com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 494 plusmn 019a 496 plusmn 036a 492 plusmn 082a 508 plusmn 033a

com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 561 plusmn 044aᶜ 524 plusmn 040b ᶜ 509 plusmn 028b 533 plusmn 019c


Tabela 6 Diacircmetro meacutedio (microm) de citoplasmas de hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 885 plusmn 099a 1022 plusmn 109b 974 plusmn 080b 1005plusmn129b

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1084 plusmn 136a 987 plusmn 153b 975 plusmn 081b 931 plusmn 080b

com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 960 plusmn 095a 1022 plusmn 094b 1003plusmn120aᵇ 1033 plusmn 108b

com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1086plusmn130aᵇ 104 plusmn 135b ᶜ 1022 plusmn 138c 1022 plusmn 106c


Tabela 7 Quantificaccedilatildeo meacutedia de nuacutecleos de hepatoacutecitos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos




com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 2770 plusmn 594a 314 plusmn 1028b 347 plusmn 664b ᶜ 322 plusmn 654c

Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis

55

Tabela 8 Quantificaccedilatildeo meacutedia de citoplasmas no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento Controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39551 plusmn 1056a 39666 plusmn 877a 39360 plusmn 1526a 40080 plusmn 727a

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39996 plusmn 1307a 39830 plusmn 722a 39618 plusmn 1143ab 38865 plusmn 1954b

com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 39603 plusmn 1755a 39011 plusmn 1620b 39445 plusmn 1388aᵇ 39205 plusmn 2212aᵇ

com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 39381 plusmn 3025a 38555 plusmn 2723b 39036 plusmn 2275aᵇ 39136 plusmn 1892b


Tabela 9 Quantificaccedilatildeo meacutedia de macroacutefagos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2

de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 120 plusmn 113a 125 plusmn 089a 101 plusmn 100a 106 plusmn 094a

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 101a 124 plusmn 079a 102 plusmn 084a 131 plusmn 092a


com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 101 plusmn 094a 128 plusmn 109a 086 plusmn 079a 101 plusmn 079a


Tabela 10 Quantificaccedilatildeo meacutedia de vasos sanguiacuteneos no tecido hepaacutetico em 100micromsup2 de aacuterea para fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos


sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo 1603 plusmn 784aᵇ 1260 plusmn 532a 1409 plusmn 631aᵇ 2203 plusmn 685b




56

Tabela 11 Quantificaccedilatildeo meacutedia semiquatitativa de glicogecircnio nos hepatoacutecitos de fecircmeas de lambaris A bimaculatus dos grupos controles e expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 133 plusmn 051aᵇ 266 plusmn 081a 300 plusmn 000a 010plusmn 010b




Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Tabela 12 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de lambaris A bimaculatus nos grupos

controles e grupos expostos ao Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo 070 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b




Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila (Plt005) entre os grupos do mesmo experimento Teste parameacutetrico de Duncan


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52 CAPIacuteTULO 2

EFEITOS DO INSETICIDA THIODAN reg SOBRE A MORFOLOGIA DO

DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM LAMBARIS Astyanax bimaculatus

RESUMO


expostos dependendo da concentraccedilatildeo A fim de investigar possiacuteveis alteraccedilotildees este

estudo avaliou a morfologia ovariana de lambaris Astyanax bimaculatus expostos ao

Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em quatro diferentes experimentos com trecircs

concentraccedilotildees subletais 115 23 e 56 microgL As fecircmeas expostas ao Thiodanreg foram

divididas em quatro experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem

aclimataccedilatildeo e alimentados com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com

aclimataccedilatildeo de 10 dias e alimentados No presente estudo percebeu-se que a accedilatildeo do

Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou a morfologia do desenvolvimento

folicular Poreacutem os experimentos com aclimataccedilatildeo demonstraram quantidades

inferiores de foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparados aos peixes dos

experimentos sem aclimataccedilatildeo Houve maior quantidade de foliacuteculos atreacutesicos nos

grupos expostos ao Thiodanreg em relaccedilatildeo ao grupo controle O diacircmetro folicular nos

foliacuteculos secundaacuterios dos peixes expostos ao Thiodanreg no experimento com

adaptaccedilatildeocom alimentaccedilatildeo foi maior em relaccedilatildeo ao grupo controle Aleacutem disso as

meacutedias dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS) e hepatossomaacutetico (IHS) dos experimentos

com aclimataccedilatildeo foram inferiores aos experimentos sem aclimataccedilatildeo Esses dados

sugerem que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo afetado pelo ambiente

ao qual o peixe foi submetido podendo causar comprometimento na fisiologia do

desenvolvimento folicular

Palavras-chave histopatologia ovaacuterio peixe contaminaccedilatildeo aquaacutetica

63







toacutexico pode chegar ao meio aquaacutetico pelo escoamento superficial e infiltraccedilatildeo no solo

por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos os organismos que ali



observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis niloticus

No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan em

gordura valores de 005mgkg-1 (EPA 2002) e para aacutegua doce 022microgL-1 (EPA 1980)

A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em consideraccedilatildeo a

qualidade da aacutegua definida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluccedilatildeo

CONAMA - nordm 3572005 estabelece o valor limite de 0056gL de resiacuteduo do referido

inseticida e seus metaboacutelitos nas aacuteguas doces de classe 1

Muitos inseticidas apresentam baixa toxicidade antes de serem transformados

em substacircncias toacutexicas metabolicamente ativas O sulfato de endosulfan eacute um dos

produtos derivados do metabolismo do endosulfan sendo considerado o principal

metaboacutelito devido agrave sua importacircncia toxicoloacutegica por ser mais estaacutevel no meio

ambiente do que em sua foacutermula original (Ali et al 1984) A sensibilidade ao

endosulfan em organismos aquaacuteticos tem sido descrita na literatura (Capkin et al 2006

Ballesteros et al 2007 Pereira et al 2012) O produto eacute extremamente toacutexico para os

peixes e outros organismos aquaacuteticos mesmo em concentraccedilotildees muito pequenas

(Cengiz et al 2001) como verificado tambeacutem por Ballesteros et al (2007) com peixes

adultos da espeacutecie Jenynsia multidentata sob o efeito do endosulfan por 96 horas

utilizando concentraccedilotildees de 072 μgL e 131 μgL em machos e fecircmeas

respectivamente



1996 Grier 2000 2002 e 2007) e como nos animais em geral compreende os periacuteodos

preacute-meioacutetico perinucleolar vitelogecircnico e maturaccedilatildeo final Estas fases ocorrem no

64

interior de foliacuteculos cuja parede eacute constituiacuteda por zona radiata camada folicular

membrana basal e teca (Grier 2000) e que desempenham importante papel durante a

ovogecircnese e fertilizaccedilatildeo Quando a qualidade da aacutegua eacute alterada devido a xenobioacuteticos

a gametogecircnese pode ser alterada comprometendo a fertilizaccedilatildeo e a qualidade do ovo

(Chatterjee et al 1997) Assim os peixes quando expostos a inseticidas podem

apresentar alteraccedilotildees morfoloacutegicas significativas no ovaacuterio

Alguns trabalhos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos por

contaminantes como por exemplo retraccedilatildeo citoplasmaacutetica degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica

adesatildeo folicular aparecimento de foliacuteculos anucleados necrose e alteraccedilatildeo no diacircmetro

dos foliacuteculos (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta 2005) Aleacutem

disso pode ocorrer a atresia folicular que eacute um processo frequentemente observado nos

ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978) sendo causada por diversos fatores como

agrotoacutexicos temperatura luz alimentaccedilatildeo inadequada e confinamento (Nagahama

1983 Guraya 1986) Outro fator importante eacute a concentraccedilatildeo hormonal que pode

interferir na siacutentese de vitelogenina e causar efeitos negativos associados com a

quantidade de foliacuteculos preacute-vitelogecircnicos e vitelogecircnicos durante o desenvolvimento

folicular (Chatterjee et al 1997) No entanto alteraccedilotildees no estado de sauacutede provocadas

por concentraccedilotildees de contaminamtes que natildeo matam os peixes em curto prazo e que

podem ser consideradas seguras podem sugerir consequecircncias na reproduccedilatildeo e

interferecircncia na cadeia alimentar Esse tipo de estudo eacute de grande importacircncia para se

avaliar impactos provocados por diferentes tratamentos sobre o desenvolvimento de

foliacuteculos que poderiam interferir na reproduccedilatildeo de peixes


pois eacute representativo no ecossistema sendo encontrado desde Nordeste brasileiro ateacute a

bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Eacute um peixe de pequeno porte e

de faacutecil manutenccedilatildeo em laboratoacuterio

Este estudo teve como objetivo analisar as alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos

diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em ensaios subletais com o toacutexico

Thiodanreg

65




Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta As etapas

de fixaccedilatildeo e inclusatildeo dos fragmentos dos ovaacuterios microtomia coloraccedilatildeo de lacircminas

histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas e morfomeacutetricas foram realizadas nos

Laboratoacuterios de Biologia de Peixes e de Histopatologia do Departamento de Veterinaacuteria

da UFV

21 Animais





avanccedilada se basearam em aspectos corporais como ventre abaulado e poro genital


Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV e

mantidos em aquaacuterios com capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por

litro de aacutegua Foi utilizada aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento

duas vezes ao dia Todos os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e

aeraccedilatildeo continua de aacutegua para garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram

alimentados com raccedilatildeo comercial Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia

de acordo com o manejo da piscicultura








66

22 Agrotoacutexico



endosulfan


O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi realizado utilizando-se 120

lambaris tendo por base as normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico (NBR 15088

- ABNT 2007)

As fecircmeas foram expostas ao Thiodanreg (endosulfan 350gL) por 96 horas em

quatro diferentes experimentos sem aclimataccedilatildeo e sem alimentaccedilatildeo sem aclimataccedilatildeo e

com alimentaccedilatildeo com aclimataccedilatildeo de 10 dias e sem alimentaccedilatildeo e com aclimataccedilatildeo de

10 dias e com alimentaccedilatildeo Foram utilizadas trecircs concentraccedilotildees do Thiodanreg inferiores

agrave CL50 preacute-determinada (137microgL) em laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088

(ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas em cada experimento foram de 115 23 e

56microgL-1 aleacutem de um grupo controle sem toacutexico com trecircs repeticcedilotildees nas mesmas

condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo


Apoacutes 96 horas de experimento foram coletados 96 peixes sendo seis animais de

cada grupo nos diferentes experimentos Os ovaacuterios foram coletados apoacutes os peixes

terem sido anestesiados com benzocaiacutena (110000) e eutanasiados pela secccedilatildeo

transversal da coluna vertebral na regiatildeo do opeacuterculo

Para a histologia os ovaacuterios foram fixados em paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo

fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedos em resina glicolmetacrilato (Leica

Historesin) Em seguida secccedilotildees 3microm de espessura foram coradas utilizando

hematoxilinaeosina para anaacutelises morfoloacutegicas e morfomeacutetricas As lacircminas foram



GETIT Olympus

Para os estudos morfoloacutegicos foram analisadas lacircminas de seis animais por

concentraccedilatildeo As secccedilotildees histoloacutegicas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca

de alteraccedilotildees morfoloacutegicas foliculares (Tabela 1) que pudessem ser representativas da

67

accedilatildeo do Thiodanreg no tecido ovariano sempre comparando estas alteraccedilotildees com o



estaacutedios de desenvolvimento folicular Para isto foram fotografados ao acaso 10

campos com objetiva de 10X (cada campo com 5094 microm de largura por 6812 microm de

comprimento totalizando uma aacuterea de 347 mmsup2) As contagens foram realizadas em 10

campos escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro experimentos Aleacutem disso foi

realizada a contagem de foliacuteculos atreacutesicos e observados eosinoacutefilos associados aos

foliacuteculos vitelogecircnicos utilizando o microscoacutepio com objetiva de 40X em 10 foliacuteculos

escolhidos ao acaso para cada animal nos quatro tratamentos experimentais Tambeacutem

foram realizadas mediccedilotildees de diacircmetros em 10 foliacuteculos vitelogecircnicos para cada animal

Foram escolhidos foliacuteculos o mais esfeacutericos possiacutevel com corte passando pelo nuacutecleo

Estas medidas foram obtidas por meio do programa Image-Pro Plus traccedilando-se duas

linhas perpendiculares sobre nuacutecleo e respeitando-se os limites do foliacuteculo Em todas as

contagens e mediccedilotildees foram calculados os valores meacutedios e desvios-padratildeo para cada

concentraccedilatildeo para se avaliar o desenvolvimento folicular nos diferentes experimentos

Tabela 1 Alteraccedilotildees histoloacutegicas quanto ao comprometimento do desenvolvimento folicular (adaptado de Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008)

ALTERACcedilOtildeES HISTOLOacuteGICAS FOLICULARES Alteraccedilatildeo nos foliacuteculos Descolamento do revestimento folicular Retraccedilatildeo citoplasmaacutetica Retraccedilatildeo nuclear Atresia folicular Aglutinaccedilatildeo nucleoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo citoplasmaacutetica Aglutinaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo Foliacuteculos com ausecircncia de citoplasma e nuacutecleo Granuloacutecitos envolvendo foliculos


Foram registrados para cada exemplar os seguintes dados biomeacutetricos peso

corporal (PC em g) peso dos ovaacuterios (PO em g) e peso do fiacutegado (PF em g) Os

valores meacutedios e os desvios padratildeo dos iacutendices gonadossomaacutetico (IGS=POx100PC) e

68

hepatossomaacutetico (IHS=PFx100PC) foram calculados para cada animal em cada um

dos grupos nos diferentes experimentos


Os dados foram apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo e avaliados pelo

Software Statistica 70 por meio da anaacutelise de variacircncia (ANOVA) Apoacutes o teste de

distribuiccedilatildeo normal os dados foram comparados entres os grupos controle e grupos

expostos ao Thiodanreg usando anaacutelise de variacircncia one-way seguida do teste de Tukey

ou Duncan Quando os dados natildeo apresentaram uma distribuiccedilatildeo normal foi utilizado o

teste natildeo parameacutetrico de Kruskal-Wallis Plt005 foi utilizado como criteacuterio de

significacircncia

3 RESULTADOS

31 Desenvolvimento folicular

O desenvolvimento folicular de A bimaculatus do presente estudo foi dividido em

duas etapas desenvolvimento primaacuterio e desenvolvimento secundaacuterio

Para facilitar a compreensatildeo o desenvolvimento primaacuterio em A bimaculatus foi

subdividido em dois estaacutedios desenvolvimento primaacuterio inicial e desenvolvimento

primaacuterio avanccedilado (Figuras 1 A e B) No desenvolvimento primaacuterio inicial os foliacuteculos

apresentaram citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos

dispersos pelo nucleoplasma e estavam envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas

(Figura 1 A) Durante o desenvolvimento primaacuterio avanccedilado o citoplasma do foliacuteculo

torna-se menos basoacutefilo que a etapa anterior o nuacutecleo eacute esfeacuterico um ou mais nucleacuteolos

dispersos que estatildeo associados ao envoltoacuterio nuclear (Figura 1 B) A camada de ceacutelulas

foliculares eacute pavimentosa com o nuacutecleo alongado Entre as ceacutelulas foliculares e o

citoplasma do foliacuteculo aparece a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 B) Na

regiatildeo mais externa do foliacuteculo aparecem associadas ao mesmo as ceacutelulas da teca

O desenvolvimento secundaacuterio em A bimaculatus foi subdividido em trecircs

estaacutedios desenvolvimento secundaacuterio inicial desenvolvimento intermediaacuterio e

desenvolvimento avanccedilado No desenvolvimento secundaacuterio inicial o volume

citoplasmaacutetico aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo e o foliacuteculo neste estaacutedio

apresentou um diacircmetro maior que o estaacutedio anterior O nuacutecleo eacute central ligeiramente

acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma O citoplasma eacute

69

granular e fracamente basoacutefilo com a presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras

na periferia do citoplasma (Figura 1 C) Em seguida ocorre um aumento no diacircmetro do

foliacuteculo e inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica o que permitiu

classificar esse estaacutedio como desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio (Figura 1 D)

No estaacutedio de desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado o volume citoplasmaacutetico

aumentou mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo tendo o foliacuteculo neste estaacutedio um diacircmetro maior

quando comparado aos estaacutedios anteriores Nessa etapa do desenvolvimento o

citoplasma do foliacuteculo estaacute preenchido com gloacutebulos de vitelo (Figura 1 D) A

maturaccedilatildeo final eacute caracterizada pela formaccedilatildeo do aparelho micropilar zona radiata

espessa e nuacutecleo deslocado em direccedilatildeo ao aparelho micropilar

Os foliacuteculos ovarianos dos lambaris apresentaram morfologia normal nas

diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg (Figuras 1 A-D)

32 Atresia folicular

A atresia folicular foi caracterizada em trecircs diferentes etapas nos ovaacuterios de A

bimaculatus atresia inicial intermediaacuteria e avanccedilada A atresia folicular inicial eacute

caracterizada pela descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das ceacutelulas foliculares

(Figura 2 A) Nesse momento da atresia folicular foram evidenciadas ceacutelulas do tipo

granuloacutecito entre a membrana basal e ceacutelulas da teca na maioria dos foliacuteculos

observados (Figura 2 B) Na sequecircncia do processo atresia folicular intermediaacuteria

ocorre o iniacutecio da fusatildeo e liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo desintegraccedilatildeo e

fragmentaccedilatildeo da zona radiata hipertrofia das ceacutelulas foliculares que se tornam

vacuolizadas e contecircm material granular de aspecto similar aos gloacutebulos de vitelo e

invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares (Figura 2 C) Na atresia avanccedilada as

ceacutelulas foliculares absorvem os resiacuteduos finais do foliacuteculo levando a uma diminuiccedilatildeo

do tamanho do foliacuteculo atreacutesico (Figura 2 D)

33 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos ovarianos

A quantidade de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial entre as fecircmeas

do mesmo experimento natildeo mostrou diferenccedilas entre si (Pgt005) (Figura 3) Quando

foram comparados os diferentes experimentos nos mesmos grupos foi registrada maior

quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais nas fecircmeas do grupo controle do experimento

com aclimataccedilatildeoalimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos grupos controle dos

70

experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 3) Aleacutem disso foi observada maior quantidade

de foliacuteculos primaacuterios iniciais na concentraccedilatildeo de 23microgL do experimento com

aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem aclimataccedilatildeocom

alimentaccedilatildeo (Plt005) (Figura 3)

Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado entre fecircmeas

do mesmo experimento natildeo houve diferenccedilas nas meacutedias obtidas (Figura 4) No entanto

quando comparados os mesmos grupos entre os diferentes experimentos verificou-se

que no estaacutedio de desenvolvimento primaacuterio avanccedilado houve maior quantidade de

foliacuteculos no grupo controle do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Plt005)

em relaccedilatildeo ao experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo assim como no

experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Figura 4) Quando comparados os

grupos da concentraccedilatildeo 115microgL registrou-se maior quantidade de foliacuteculos no

experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo ao experimento

sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura 4) Entre as fecircmeas dos grupos da

concentraccedilatildeo 23microgL foi registrada maior quantidade de foliacuteculos nos experimentos

com aclimataccedilatildeo (Plt005) em relaccedilatildeo agraves fecircmeas dos experimentos sem aclimataccedilatildeo

(Figura 4)

Na contagem de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio inicial nas fecircmeas do

experimento sem aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo houve maior quantidade de foliacuteculos na

concentraccedilatildeo 56microgL (Plt005) em relaccedilatildeo agrave concentraccedilatildeo de 115microgL (Figura 5) mas

natildeo com o controle Ao comparar as fecircmeas dos diferentes experimentos dos mesmos

grupos houve maior quantidade de foliacuteculos secundaacuterios iniciais (Plt005) na

concentraccedilatildeo 115microgL do experimento sem aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo e

experimento com aclimataccedilatildeosem alimentaccedilatildeo em relaccedilatildeo ao experimento sem

aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo e experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo (Figura

5)

Em relaccedilatildeo as contagens de foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio

intermediaacuterio e avanccedilado natildeo houve diferenccedilas entre as fecircmeas (Pgt005) (Figuras 6 e 7)

34 Quantificaccedilatildeo dos foliacuteculos atreacutesicos

Nas contagens de foliacuteculos atreacutesicos iniciais nas fecircmeas de A bimaculatus dos

diferentes experimentos natildeo foram constatadas diferenccedilas (Pgt005) (Figura 8) As

contagens de atresia total representaram as somas das contagens de atresias inicial

intermediaacuteria e avanccedilada As contagens de atresia total natildeo mostraram diferenccedilas nos

71

experimentos embora o nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos mostrasse tendecircncia crescente

nos grupos tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos (Figura 9) Entretanto

foi observado maior nuacutemero de foliacuteculos atreacutesicos nas fecircmeas dos experimentos com

aclimataccedilatildeo de 10 dias em relaccedilatildeo aos experimentos sem aclimataccedilatildeo (Figura 9)

35 Diacircmetro dos foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado

Os valores meacutedios nos diacircmetros dos foliacuteculos secundaacuterio avanccedilado nas fecircmeas

do experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo demonstraram aumento (Plt005) nas

concentraccedilotildees 115microgL (57837plusmn5977microm) e 56microgL (57311plusmn6178microm) de Thiodanreg

em relaccedilatildeo agraves fecircmeas do grupo controle (51606plusmn5757 microm) Nos demais experimentos

natildeo foram registradas diferenccedilas entre os foliacuteculos (Pgt005) apesar de ter sido

observado na maioria dos grupos essa mesma tendecircncia de aumento do diacircmetro dos

foliacuteculos (Tabela 2)


As fecircmeas de A bimaculatus dos grupos expostos ao Thiodanreg natildeo apresentaram

diferenccedilas (Pgt005) nos valores dos IGS e IHS quando comparados com os grupos

controles (Tabelas 3 e 4) No entanto as fecircmeas dos experimentos com aclimataccedilatildeo

apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores dos IGS e IHS quando comparados aos

experimentos sem aclimataccedilatildeo (Tabelas 3 e 4)

4 DISCUSSAtildeO

Em peixes teleoacutesteos o tipo de desenvolvimento folicular pode ser assincrocircnico

com a presenccedila de foliacuteculos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento (Nagahama

1983 Connaughton et al 1998 Selman et al 1986) assim como na presente espeacutecie

deste estudo Os ovaacuterios das fecircmeas de A bimaculatus submetidas ao efeito do

Thiodanreg apresentaram foliacuteculos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento com

variaccedilotildees na estrutura do foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas

envoltoacuterias composiccedilatildeo e distribuiccedilatildeo do vitelo conforme observado em outras

espeacutecies do gecircnero (Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et

al 2005 Rodrigues et al 2005 Hernan Da Cuntildea et al 2011)

Ao contraacuterio do presente estudo Dutta et al (2008) ao submeterem as fecircmeas da

espeacutecie Lepomis macrochirus a trecircs concentraccedilotildees diferentes (025 075 e 1 microgL) de

endosulfan observaram comprometimento do desenvolvimento folicular com retraccedilatildeo

72

nuclear e citoplasmaacutetica na menor concentraccedilatildeo enquanto nos foliacuteculos em maturaccedilatildeo

avanccedilada foi observado um aspecto vazio sem conteuacutedo citoplasmaacutetico na

concentraccedilatildeo de 075 microgL Aleacutem disso na concentraccedilatildeo de 1microgL os autores

encontraram maior grau de deformaccedilotildees com foliacuteculos vazios sem a presenccedila de

foliacuteculos ou alteraccedilotildees do nuacutecleo e perda do material nuclear que eacute relatado como

necrose nuclear No trabalho conduzido por Chartterjee et al (1997) foi avaliada a accedilatildeo

do carbofuram no desenvolvimento folicular na espeacutecie Heteropneustes fossilis

encontrando-se degeneraccedilatildeo citoplasmaacutetica e na camada folicular de foliacuteculos em

desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio Entretanto Hernan Da Cuntildea et al (2011) natildeo

observaram alteraccedilotildees nos ovaacuterios em peixes expostos ao endosulfan No estudo

realizado por Ballesteros et al (2007) utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie

Jenynsia multidentata foi verificado que o maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas eacute um fator

importante para esclarecer a maior resistecircncia contra o endosulfan ao contraacuterio dos

machos que satildeo mais suceptiacuteveis neste caso De acordo com este resultado descrito na

literatura pode-se inferir que este fator poder ter interferido na maior resistecircncia das

fecircmeas de A bimaculatus em periacuteodo reprodutivo agraves concentraccedilotildees de Thiodanreg

testadas

Alguns estudos tecircm esclarecido a interferecircncia de poluentes na quantidade de

foliacuteculos nos diferentes estaacutedios do desenvolvimento folicular em peixes Os trabalhos

de Chartterjee et al (1997) Jensen et al (2004) Dutta amp Dalal (2008) e Chakrabarty et

al (2012) avaliaram os efeitos de pesticidas encontrando maior quantidade de foliacuteculos

primaacuterios no grupo tratado em relaccedilatildeo ao grupo controle assim como em peixes

mantidos em cativeiros (Honji et al 2009) Em outro estudo (Chatterjee et al 2001) os

pesquisadores encontraram por meio de anaacutelises histoloacutegicas da hipoacutefise a

possibilidade do carbofuran afetar as ceacutelulas produtoras de GnRH do hipotaacutelamo

prejudicando o eixo hipoacutefise-gocircnada e comprometendo a viabilidade no

desenvolvimento folicular jaacute Chakrabarty et al (2012) verificaram em peixes tratados

com endosulfan concentraccedilatildeo inferior de GnRH e superior da aromatase quando

comparados com o gurupo controle caracterizando que o endosulfan pode atuar como

disruptor endoacutecrino (Lemaire et al 2006) que pode aumentar a biossiacutentese do estradiol

para promover um raacutepido desenvolvimento folicular (Chakrabarty et al 2012) Estes

resultados podem ajudar a esclarecer os resultados do presente trabalho onde se

observou maior quantidade de foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados nos

experimentos com aclimataccedilatildeo quando comparados com os experimentos sem

73

aclimataccedilatildeo sugerindo uma possiacutevel desregulaccedilatildeo endoacutecrina no eixo hipoacutefise-gocircnada

nos peixes aclimatados em aquaacuterios por 10 dias Aleacutem disso as concetraccedilotildees hormonais

e enzimaacuteticas relacionadas ao desenvolvimento folicular podem estar supostamente

alteradas em A bimaculatus mas satildeo necessaacuterios estudos fisioloacutegicos para essa

provaacutevel confirmaccedilatildeo

O processo de atresia folicular no lambari A bimaculatus foi semelhante ao

descrito por Miranda et al (1999) Munoz et al (2002) Melo et al (2005) e Santos et

al (2005) O processo da atresia que ocorre nos foliacuteculos secundaacuterios eacute do tipo

hipertroacutefico devido agrave hipertrofia e hiperplasia das ceacutelulas foliculares (Vizziano amp

Berois 1990) No trabalho realizado por Coward amp Bromage (1998) na espeacutecie Tilapia

zilli foi verificado aumento de foliacuteculos atreacutesicos em experimento com duraccedilatildeo entre 18

e 26 dias assim como verificado no trabalho de Jensen et al (2004) quando utilizaram a

substacircncia flutamida De acordo com estes autores isto pode reduzir a fecundidade e

tambeacutem influenciar na qualidade do foliacuteculo Linares-Casenave et al (2002) explicam

que o processo de atresia estaacute associado com desregulaccedilatildeo das concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de estradiol testosterona e vitelogenina Portanto o aumento da quantidade

dos foliacuteculos atreacutesicos nos grupos expostos ao Thiodanreg e a maior quantidade de atresia

nos experimentos com aclimataccedilatildeo mesmo natildeo apresentando diferenccedilas estatiacutesticas

sugerem que pode estar iniciando desregulaccedilatildeo hormonal nestes peixes

A presenccedila de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados em

lambari A bimaculatus nos diferentes experimentos pode ser associada agrave reaccedilatildeo

imunoloacutegica em conjunto com as ceacutelulas foliculares assim como observado por alguns

autores (Drummond et al 2000 Santos et al 2005 Santos et al 2008) Aleacutem disso no

trabalho realizado por Santos et al (2008) foi detectada a presenccedila de proliferaccedilatildeo

celular (PCNA) nas ceacutelulas da teca de foliacuteculos em processo de atresia confirmando

que estas ceacutelulas podem estar se preparando para o processo de remodelaccedilatildeo ovariana

No entanto essas evidecircncias de granuloacutecitos associados aos foliacuteculos estatildeo de acordo

com o que jaacute foi observado em outros trabalhos caracterizando um processo fisioloacutegico

importante na regressatildeo folicular das fecircmeas de A bimaculatus expostas ao Thiodanreg

O diacircmetro dos foliacuteculos vitelogecircnicos eacute espeacutecie-especiacutefico poreacutem o Thiodanreg

alterou o diacircmetro folicular no experimento com aclimataccedilatildeocom alimentaccedilatildeo Esta

alteraccedilatildeo do diacircmetro que leva os foliacuteculos vitelogecircnicos a atingirem a maturaccedilatildeo pode

ser causada pelas diferenccedilas nas concentraccedilotildees de vitelogenina estradiol e aromatase

(Jensen et al 2004 Corriero et al 2007 Chakrabarty et al 2012) ou a mesma sendo

74

ligada aos receptores especiacuteficos nos foliacuteculos (Patintildeo amp Sullivan 2002 Bugel et al

2010) Bugel et al (2010) relataram a diminuiccedilatildeo da expressatildeo da vitelogenina no peixe

Fundulus heteroclitus em rio contaminado com pesticidas orgacircnicos persistentes o que

resultou na diminuiccedilatildeo da quantidade de foliacuteculos vitelogecircnicos enquanto Honji et al

(2009) relataram a baixa fecundidade e aumento do diacircmetro dos foliacuteculos nos peixes

Salminus hilari mantidos em cativeiro quando comparados com peixes de ambientes

naturais Contudo eacute necessaacuterio estudar as vias que conduzem a esta alteraccedilatildeo Estes

resultados mostram que diferentes vias podem afetar a reproduccedilatildeo dos peixes e que o

Thiodanreg pode estar agindo como desregulador endoacutecrino nos foliacuteculos secundaacuterios

avanccedilados de A bimaculatus

O IGS e IHS podem variar entre os peixes devido agraves diferenccedilas na sensibilidade

frente agrave exposiccedilatildeo a contaminantes periacuteodo reprodutivo e peixes mantidos em cativeiro

(Chatterjee et al 1997 Cyrino et al 2000 Jensen et al 2004 Honji et al 2009) No

entanto o fato das meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos com aclimataccedilatildeo terem sido

menores quando comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugere associaccedilatildeo

entre quantidade inferior de foliacuteculos secundaacuterios e quantidade superior de atresia nos

experimentos com aclimataccedilatildeo assim como no trabalho de Chatterjee et al (1997) e

Bugel et al (2010) que verificaram diminuiccedilatildeo na taxa de foliacuteculos vitelogecircnicos e

IGS

A ventilaccedilatildeo branquial acelerada e a natildeo procura por alimentos nas primeiras 24

horas observadas nos diferentes experimentos sugere que a entrada de aacutegua pela via

branquial foi causa direta da absorccedilatildeo e difusatildeo do toacutexico no organismo No entanto a

via epideacutermica tambeacutem poder ser considerada via de entrada do toacutexico para os tecidos

(Mckim et al 1999) Portanto a exposiccedilatildeo dos peixes ao Thiodanreg e a aclimataccedilatildeo

foram fatores mais que afetaram o diacircmetro e a quantidade de foliacuteculos em A

bimaculatus Conforme as condiccedilotildees em que o estudo foi realizado levando-se em

consideraccedilatildeo as concentraccedilotildees do inseticida Thiodanreg utilizadas periacuteodo de exposiccedilatildeo e

espeacutecie de estudo demonstram que as fecircmeas analisadas podem estar em processo

inicial de intoxicaccedilatildeo com possiacutevel alteraccedilatildeo fisioloacutegica

75

A

opa

opi opa

vs

D

osint

osa

osa

gv gv

gv

osi

C

B

opa

opa

zr

vc

Figura 1 Desenvolvimento folicular ovariano de Astyanax bimaculatus A Estroma ovariano com foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio inicial (opi) e primaacuterio avanccedilado (opa) B Foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (opa) com ceacutelulas foliculares pavimentosas e zona radiata delgada (zr) C Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio inicial (osi) possuindo ceacutelulas foliculares pavimentosas com zona radiata espessa (zr) e vesiacuteculas corticais claras (vc) na periferia do foliacuteculo D Foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio intermediaacuterio iniciando deposiccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (osint) e foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (osa) com gloacutebulos de vitelo (gv) por todo o citoplasma vs vaso sanguiacuteneo Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A e B (50 m) C (30 m) D (100 m)

zr

76

ai

gr gr

zr

h

av

A

ait

Figura 2 Foliacuteculos ovarianos de Astyanax bimaculatus em atresia A Atresia folicular inicial (ai) caracterizada pela quebra da zona radiata (zr) hipertrofia de ceacutelulas foliculares (cf) e presenccedila de granuloacutecitos (gr) B Detalhe de granuloacutecito (gr) sobre a regiatildeo de ceacutelulas foliculares C Atresia folicular intermediaacuteria (ait) caracterizada pela liquefaccedilatildeo dos gloacutebulos de vitelo (gv) desintegraccedilatildeo da zona radiata e invasatildeo do citoplasma pelas ceacutelulas foliculares D Atresia folicular avanccedilada (av) caracterizada pela ausecircncia de gloacutebulos de vitelo Ceacutelulas da teca (t) hemaacutecias (h) Coloraccedilatildeo Hematoxilina-eosina Barra A (25 m) B (10 m) C (150 m) D (100 m)

gv

ai

B

C D

t

gv

77

Figura 3 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e expostos ao Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas

As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dentro dos grupos (Plt005) pelo teste de Duncan Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005)

0

5

10

15

20

25

controle 115microgL 23microgL 56microgL

Qu

an

tid

ad

e m

eacuted

ia d

e o

voacuteci

tos

Sem aclimataccedilatildeo

Sem alimentaccedilatildeo


Com alimentaccedilatildeo

Com aclimataccedilatildeo




A A

AB

B

AB

A

AB

B

0

1

2

3

4

5

6

7

8


Qu

an

tid

ad

e m

eacuted

ia d

e o

voacuteci

tos









Figura 4 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos primaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas


A

BC AC

BD

AC

BC

AB A A

B

B

A

78

0

02

04

06

08

1

12

14

16


Qu

an

tid

ad

e m

eacuted

ia d

e o

voacuteci

tos









As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedilas entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) letras maiuacutesculas indicam diferenccedilas dos grupos com as mesmas concentraccedilotildees nos diferentes experimentos (Plt005) ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) Teste de Duncan

A

B

A

B

ab b

a ab

Figura 5 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios iniciais por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas

0

01

02

03

04

05

06

07

08

09


Qu

an

tid

ad

e d

e o

voacuteci

tos Sem aclimataccedilatildeo








Figura 6 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas

As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Plt005) pelo teste de Duncan

79

0

05

1

15

2

25

3

35

4


Qu

an

tid

ad

e m

eacuted

ia d

e o

voacuteci

tos









Figura 7 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados por aacuterea ovariana (347 mmsup2) de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas

As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Duncan

Figura 8 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos iniciais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas

As barras verticais na coluna indicam desvio padratildeo (n=6) Ausecircncia de letra natildeo houve diferenccedila (Pgt005) pelo teste de Kruskall Wallis

0

005

01

015

02

025

03


Qu

an

tid

ad

e m

eacuted

ia d

e a

tre

sia









80

Figura 9 Nuacutemero meacutedio de foliacuteculos atreacutesicos totais em ovaacuterios de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg dos diferentes experimentos durante 96 horas

0

005

01

015

02

025

03

035

04

045


Qu

an

tid

ad

e m

eacuted

ia d

e a

tre

sia










81

Tabela 2 Diacircmetro meacutedio (microm) de foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados de lambaris A bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos

Experimento controle 115microgL 23microgL 56microgL

sem aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo

53443 plusmn 7414a 53796 plusmn 7746a 53273 plusmn 8300a 50046 plusmn 5610a

sem aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo


com aclimataccedilatildeo sem alimentaccedilatildeo


com aclimataccedilatildeo com alimentaccedilatildeo

51606 plusmn 5757a 57837 plusmn 5977b 55774 plusmn 7870aᵇ 57311 plusmn 6178b

Valores expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Letras minuacutesculas diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Tukey

Tabela 3 Iacutendice gonadossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos










Valores expressos como meacutedia plusmndesvio padratildeo Letras diferentes indicam diferenccedila entre os grupos do mesmo experimento (Plt005) pelo teste de Duncan

Tabela 4 Iacutendice hepatossomaacutetico de fecircmeas de Astyanax bimaculatus nos grupos controles e tratados com Thiodanreg nos diferentes experimentos



07 plusmn 014aᵇ 088 plusmn 03a 084 plusmn 038a 038 plusmn 031b








82





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86

53 CAPIacuteTULO 3

RELACcedilAtildeO ENTRE COLAacuteGENO TIPO IV INTEGRINA β1 E CASPASE 3

DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM Astyanax bimaculatus

EXPOSTOS AO THIODAN reg

RESUMO


em diversas monoculturas e pode chegar aos ecossistemas aquaacuteticos afetando a

reproduccedilatildeo e a integridade das populaccedilotildees de peixes Ovaacuterios de peixes apresentam

ovoacutecitos em diferentes estaacutedios de desenvolvimento os quais satildeo envoltos por zona

radiata ceacutelulas foliculares membrana basal e ceacutelulas da teca formando o complexo

folicular A integridade do complexo folicular estaacute associada com a presenccedila de

colaacutegeno tipo IV e integrina β1 enquanto a caspase 3 eacute uma protease importante na via

apoptoacutetica participando ativamente nos processos de regressatildeo ovariana Pela carecircncia

de estudos que avaliam tais proteiacutenas no complexo folicular este estudo teve por

objetivo avaliar por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica a expressatildeo das proteiacutenas

colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspases 3 durante o desenvolvimento folicular do

lambari Astyanax bimaculatus exposto ao Thiodanreg Os peixes foram aclimatados

durante 10 dias em aquaacuterios de 50L com aeraccedilatildeo contiacutenua aacutegua sem cloro filtro

mecacircnico fotoperiacuteodo (12h) e temperatura (26plusmn1ordmC) controlados Para a exposiccedilatildeo ao

Thiodanreg os peixes foram divididos em quatro grupos controle 115 23 e 56 microgL

com trecircs repeticcedilotildees em cada concentraccedilatildeo Apoacutes 96 h seis peixes de cada grupo foram

anestesiados (benzocaiacutena110000) eutanasiados e seus ovaacuterios coletados para detecccedilatildeo

de colaacutegeno de tipo IV integrina β1 e caspase 3 Fragmentos dos ovaacuterios foram fixados

em paraformaldeiacutedo a 4 e incluiacutedos em parafina Os procedimentos de

imunomarcaccedilatildeo seguiram protocolos jaacute padronizados para os anticorpos empregados A

reaccedilatildeo foi revelada com diaminobenzidina e os cortes foram contracorados com

hematoxilina para avaliaccedilatildeo qualitativa em microscoacutepio de luz Os foliacuteculos primordiais

natildeo apresentaram marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 Nos foliacuteculos em

desenvolvimento primaacuterio observou-se reaccedilatildeo fracamente positiva no citoplasma das

ceacutelulas foliculares enquanto foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio foram mais

intensamente marcados para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV A imunomarcaccedilatildeo para

caspase 3 foi evidenciada nas ceacutelulas foliculares durante o desenvolvimento secundaacuterio

sendo mais intensa no estaacutedio avanccedilado Qualitativamente essas anaacutelises demonstraram

87

marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular mesmo com os

peixes expostos a diferentes concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade

das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo

ativada para futuros processos de regressatildeo folicular

Palavras-chave ecotoxicologia aquaacutetica ovaacuterio peixes e reproduccedilatildeo



isocircmeros ativos sendo 70 de α-endosulfan e 30 de β-endosulfan Endosulfan eacute um





por meio da irrigaccedilatildeo agriacutecola e das chuvas colocando em riscos toxicoloacutegicos os

organismos que ali residem (Walker et al 1996 Capkin et al 2006 Glover et al

2007) Consequentemente o endosulfan pode acumular nos tecidos destes organismos

como jaacute observado por Henry amp Kishimba (2006) na espeacutecie de peixe Oreochromis

niloticus No entanto a Uniatildeo Europeacuteia estabelece como limite maacuteximo de endosulfan

em gordura o valor de 005mgkg-1 (EPA 2002) e em aacutegua doce 022microgL-1 (EPA

1980) A Legislaccedilatildeo Brasileira de Resiacuteduos de Pesticidas vigente levando em








ambiente em relaccedilatildeo a sua formula original (Ali et al 1984) A sensibilidade dos

organismos aquaacuteticos ao endosulfan eacute baixa e tem sido bem descrita na literatura por

alguns autores (Cengiz et al 2001 Capkin et al 2006 Ballesteros et al 2007 Pereira

et al 2012) sendo os machos geralmente mais sensiacuteveis que as fecircmeas pelo

armazenamento de lipiacutedeos para produccedilatildeo do vitelo e fornecimento de energia e pelo

tamanho maior da fecircmea em relaccedilatildeo ao macho (Ballesteros et al 2007)

88

O desenvolvimento folicular em peixes tem sido descrito por vaacuterios

pesquisadores (Bazzoli amp Rizzo 1990 Tyler amp Sumpter 1996 Begovac amp Wallace



interior de foliacuteculos cujo complexo folicular eacute constituiacutedo por zona radiata camada

folicular membrana basal e teca (Grier 2000) as quais desempenham importante papel

durante a foliculogecircnese e fertilizaccedilatildeo

Entretanto os peixes quando satildeo expostos aos poluentes podem sofrer influecircncia

na foliculogecircnese e assim acarretar prejuiacutezos reprodutivos para as espeacutecies expostas aos

contaminantes Alguns estudos mostram diversas alteraccedilotildees provocadas nos foliacuteculos de

peixes por contaminantes (Hazarika amp Das 1998 Dutta et al 2003 Maxwell amp Dutta

2005 Chakrabarty et al 2012) inclusive a atresia folicular que eacute um processo

frequentemente observado nos ovaacuterios dos vertebrados (Saidapur 1978 Santos et al

2008a Santos et al 2008b) e que pode ser causada por diversos fatores dentre os

quais os agrotoacutexicos (Nagahama 1983 Guraya 1986 Chatterjee et al 1997 e 2001

Dutta amp Dalal 2008)

No desenvolvimento folicular a formaccedilatildeo do complexo folicular eacute importante

no suporte e na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares No entanto jaacute foram identificadas

vaacuterias proteiacutenas que contribuem para a integridade do complexo folicular como

laminina integrina β1 fibronectina colaacutegeno tipo IV e de metaloproteinases (MMM-P)

em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e atreacutesicos (Rodgers et al 1998 Grier 2002 Le Bellego

et al 2002 Berkholtz et al 2006 Santos et al 2008a Thomeacute et al 2010) O colaacutegeno

tipo IV eacute uma proteiacutena especializada da matrix extracelular e membrana basal assim

como a laminina Essas proteacuteinas estatildeo envolvidas em favorecer um microambiente para

sobrevivecircncia das ceacutelulas do epiteacutelio (Rodgers et al 2003) As integrinas compreendem

uma grande famiacutelia de recepetores celulares composto de subnidades α e β que tem

funccedilatildeo importante na adesatildeo e transmissatildeo de sinais na ceacutelula Aleacutem disso as integrinas

estatildeo envolvidas na proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e morte celular

A caspase 3 eacute uma moleacutecula efetora de grande importacircncia no processo de

apoptose na ativaccedilatildeo de endonucleases e na clivagem das proteiacutenas celulares causando

mudanccedilas morfoloacutegicas celulares (Huettenbrenner et al 2003) Este processo de

apoptose envolve uma cascata de eventos bioquiacutemicos com a liberaccedilatildeo de fatores

mitocondriais de morte celular ativaccedilatildeo caspases e mudanccedila na caracteriacutestica

morfoloacutegica no nuacutecleo da ceacutelula assim como fragmentaccedilatildeo do DNA (Huettenbrenner et

89

al 2003) No entanto alguns trabalho citam a importacircncia da integridade do complexo

folicular com a presenccedila de integrina β1 e colaacutegeno tipo IV que em caso de atresia

folicular e ovulaccedilatildeo na formaccedilatildeo de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios culminam em processo

da ativaccedilatildeo das caspases nas ceacutelulas foliculares Sendo assim a incidecircncia de apoptose

nas ceacutelulas foliculares aumenta nas etapas de regressatildeo ovariana (Drummond et al

2000 Santos et al 2003 2005 2008)

O lambari A bimaculatus foi escolhido como organismo experimental pois eacute

muito representativo no ecossistema sendo encontrado desde o nordeste brasileiro ateacute a

Bacia do rio da Prata na Argentina (Barbieri et al 1982) Tambeacutem eacute um peixe de

pequeno porte e faacutecil de manter em laboratoacuterio O complexo folicular associado agrave

siacutentese dessas proteiacutenas ao longo do desenvolvimento folicular eacute algo a ser discutido

Poreacutem nenhum trabalho relata estas proteiacutenas em peixes expostos ao Thiodanreg Devido

agrave carecircncia de estudos que avaliem tais proteiacutenas no complexo folicular o presente

trabalho tem como objetivo avaliar as proteiacutenas colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase

3 durante o desenvolvimento folicular do lambari A bimaculatus exposto ou natildeo ao

Thiodanreg por meio de anaacutelise imunoistoquiacutemica


O estudo foi conduzido no Departamento de Veterinaacuteria (DVT) da Universidade


Veterinaacuteria onde foram realizados o teste subletal e as atividades de coleta fixaccedilatildeo e

inclusatildeo dos fragmentos de ovaacuterios As etapas de microtomia imunoistoquiacutemica

coloraccedilatildeo de lacircminas histoloacutegicas e as anaacutelises histoloacutegicas foram realizadas no

DVTUFV e no Laboratoacuterio de Ictiohistologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas (ICB)

da Universidade Federal de Minas Gerais

21 Animais




total de 912 plusmn 064 cm As caracteriacutesticas para a escolha dos peixes em maturaccedilatildeo



90

Os peixes foram transportados para o Bioteacuterio de Peixes do DVTUFV onde

foram aclimatados por 10 dias Os aquaacuterios onde os animais foram mantidos possuiacuteam

capacidade de 50 litros numa densidade de 05g de peixe por litro de aacutegua Foi utilizada

aacutegua livre de cloro temperatura controlada e monitoramento duas vezes ao dia Todos

os aquaacuterios possuiacuteam um sistema de filtraccedilatildeo (250Lh) e aeraccedilatildeo continua da aacutegua para

garantir o bem-estar dos peixes Os peixes foram alimentados com raccedilatildeo comercial

Purina contendo 35 de proteiacutena duas vezes ao dia de acordo com o manejo da

piscicultura








22 Agrotoacutexico



endosulfan


Foram aclimatados 96 lambaris como descrito no item 21 onde os peixes se

acostumaram ao seu novo meio e agraves atividades normais de manutenccedilatildeo como

alimentaccedilatildeo e limpeza dos aquaacuterios O teste de toxicidade subletal com o endosulfan foi

realizado baseando-se nas normas teacutecnicas para teste em sistema estaacutetico de acordo com

a NBR 15088 (ABNT 2007)

Logo apoacutes aclimataccedilatildeo os peixes foram submetidos ao toacutexico Thiodanreg

(endosulfan 350gL) por 96 horas Em todos os experimentos foram utilizadas trecircs

concentraccedilotildees diferentes do Thiodanreg inferiores agrave CL50 (137microgL) preacute-determinada em

laboratoacuterio de acordo com a NBR 15088 (ABNT 2007) As concentraccedilotildees utilizadas

em cada experimento foram de 115 23 e 56microgL aleacutem de um grupo controle sem

toacutexico com trecircs repeticcedilotildees sob as mesmas condiccedilotildees para cada concentraccedilatildeo

91

24 Anaacutelises histoloacutegicas e imunoistoquiacutemicas

Apoacutes 96 horas de experimento seis fecircmeas de cada grupo foram coletadas

anestesiadas com benzocaiacutena (110000) e eutanasiadas para coleta dos ovaacuterios Para a

descriccedilatildeo histoloacutegica todas as amostras foram fixadas em paraformaldeiacutedo a 4 em

tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas e incluiacutedas em parafina Em seguida

secccedilotildees com 5 microm de espessura foram coradas utilizando hematoxilinaeosina para

anaacutelises morfoloacutegicas do desenvolvimento folicular

Para detectar a imunorreatividade para colaacutegeno tipo IV integrinas β1 e caspase

3 nos ovaacuterios do lambari trecircs espeacutecimes de cada grupo foram fixados em

paraformaldeiacutedo a 4 em tampatildeo fosfato 01 M pH 72 por 24 horas incluiacutedas em

parafina e seccionadas com 5 microm de espessura A recuperaccedilatildeo antigecircnica foi realizada

em forno de microondas por 10 minutos com os cortes nas lacircminas sendo imersos em

tampatildeo citrato 10mM pH 60 As lacircminas foram incubadas com peroacutexido de hidrogecircnio

a 3 em tampatildeo fosfato por 15 minutos em temperatura ambiente para inativar

peroxidase endoacutegena e com soro albumina bovina a 2 por 45 minutos para bloquear

marcador antigecircnico inespeciacutefico Anticorpos primaacuterios (policlonais de coelho) anti-

colaacutegeno tipo IV anti-integrina β1 e anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology Calif

USA) foram aplicados nas secccedilotildees a 4degC na diluiccedilatildeo 1100 (integrina β1 e colaacutegeno tipo

IV) e 1200 (caspase 3) segundo o fabricante por 12 horas Os cortes foram lavados

em PBS e incubados por 45 minutos com anticorpo secundaacuterio na diluiccedilatildeo de 1200

anti-IgG de coelho (LSAB 2 sistema HRP DakoCymation Carpinteria Calif USA) e

tratados com peroxidase conjugada com estreptavidina por 45 minutos A revelaccedilatildeo foi

realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lacircminas foram contracoradas com

hematoxilina (Santos et al 2008)

As lacircminas foram analisadas em toda sua extensatildeo em busca de alteraccedilotildees na

imunomarcaccedilatildeo no complexo folicular que pudessem ser representativas do efeito do

Thiodanreg sempre comparando com o padratildeo de organizaccedilatildeo dos ovaacuterios do grupo

controle As lacircminas foram analisadas em microscoacutepio de luz CX31 Olympus e as

imagens foram obtidas com cacircmera digital SC 020 por meio do software Analysis

GETIT Olympus

92

3 RESULTADOS


O desenvolvimento folicular de A bimaculatus foi dividido em desenvolvimento

primaacuterio inicial e avanccedilado O desenvolvimento secundaacuterio foi dividido em

desenvolvimento secundaacuterio inicial intermediaacuterio e avanccedilado (Tabela 1) A regressatildeo

ovariana tambeacutem foi caracterizada (Tabela 1)

Tabela 1 Aspectos morfoloacutegicos do desenvolvimento folicular e da regressatildeo ovariana de Astyanax bimaculatus

Foliacuteculos primordiais Estaacutedio que antecede o desenvolvimento de foliacuteculos primaacuterios Satildeo ceacutelulas menores apresentando citoplasma volumoso nuacutecleo esfeacuterico e grande e ceacutelulas preacute-foliculares (Figura 1 B) Foliacuteculos primaacuterios iniciais e primaacuterios avanccedilados (perinucleolares) No desenvolvimento primaacuterio inicial os ovoacutecitos apresentam citoplasma fortemente basoacutefilo nuacutecleo esfeacuterico e nucleacuteolos dispersos pelo nucleoplasma Estatildeo envoltos por ceacutelulas foliculares pavimentosas (Figuras 1 C-encarte) No foliacuteculo primaacuterio avanccedilado a camada de ceacutelulas foliculares eacute pavimentosa e com o nuacutecleo eliacuteptico Entre as ceacutelulas foliculares e o ooplasma surge a zona radiata como uma fina camada (Figura 1 E-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios iniciais O citoplasma ovocitaacuterio eacute granular e fracamente basoacutefilo com presenccedila de vesiacuteculas corticais pequenas e claras na periferia do citoplasma O nuacutecleo eacute central ligeiramente acidoacutefilo com nucleacuteolos pequenos e dispersos pelo nucleoplasma (Figura 1 G-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios Assim como na etapa anterior os foliacuteculos secundaacuterios intermediaacuterios possuem ovoacutecito com nuacutecleo central e acidoacutefilo No citoplasma inicia-se a deposiccedilatildeo de vitelo a partir da regiatildeo perifeacuterica (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos secundaacuterios avanccedilados (vitelogecircnicos) No foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado o diacircmetro e o volume citoplasmaacutetico aumentam mais em relaccedilatildeo ao nuacutecleo apresentando os foliacuteculos neste estaacutedio vesiacuteculas corticais na periferia e gloacutebulos de vitelo disperso por todo citoplasma No complexo folicular a membrana basal eacute delgada e a zona radiada mais espessa que nas fases anteriores com ceacutelulas foliculares pavimentosas e cuacutebicas (Figura 1 H-encarte) Foliacuteculos atreacutesicos Apresenta formato irregular com estruturas descontiacutenuas ou desorganizadas com aspecto de grumos devido agrave liquefaccedilatildeo dos gracircnulos de vitelo ou com perda da conectividade entre suas partes fragmentaccedilatildeo da zona radiata (atresia inicial) e absorccedilatildeo total do conteuacutedo ovocitaacuterio pelas ceacutelulas foliculares (atresia avanccedilada) (Figuras 3 A e B-encarte) Foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios O foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio possue lume amplo irregular e contiacutenuo com o lume do ovaacuterio Apresenta parede constituiacuteda por camada uacutenica de ceacutelulas foliculares membrana basal e teca (Figuras 3 E e F)

93

32 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 no desenvolvimento

folicular de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg

Os foliacuteculos nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento apresentaram diferentes

graus de marcaccedilatildeo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV Em foliacuteculo primordial natildeo se

observou marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figura 1 B) Nos foliacuteculos em

desenvolvimento primaacuterio inicial foram evidenciadas reaccedilotildees positivas com marcaccedilatildeo

fraca para colaacutegeno e integrina (Figuras 1 C e D) enquanto nos foliacuteculos em

desenvolvimento primaacuterio avanccedilado as marcaccedilotildees foram mais niacutetidas (Figuras 1 E e F)

Nos desenvolvimento secundaacuterio foram evidenciadas marcaccedilotildees positivas para integrina

β1 e colaacutegeno tipo IV no citoplasma das ceacutelulas foliculares com mais intensidade que

nos estaacutedios anteriores (Figuras 1 G e H) Estas marcaccedilotildees natildeo mostraram diferenccedilas

entre os grupos expostos ao Thiodanreg quando comparados com os mesmos estaacutedios de

desenvolvimento folicular dos grupos controle A marcaccedilatildeo para caspase 3 foi

evidenciada no citoplasma e nuacutecleos de ceacutelulas foliculares de foliacuteculos com

desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado apresentando maior intensidade nos estaacutedios de

desenvolvimento secundaacuterio inicial A marcaccedilatildeo foi ausente nos estaacutedios de

desenvolvimento primaacuterio (Figuras 2 A-D) Quando comparadas estas marcaccedilotildees entre

os grupos controle e expostos ao Thiodanreg natildeo houve diferenccedilas nas marcaccedilotildees entre

os mesmos estaacutedios de desenvolvimento folicular

33 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 na atresia folicular de

A bimaculatus expostos ao Thiodanreg

A marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 foi evidente nos foliacuteculos

atreacutesicos iniciais poreacutem menos intensa em relaccedilatildeo aos foliacuteculos normais (Figuras 3 A e

C) As fases mais avanccediladas da atresia folicular satildeo caracterizadas pela desorganizaccedilatildeo

espalhamento das proteiacutenas no ooplasma com reaccedilatildeo mais fraca da imunomarcaccedilatildeo

para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 (Figuras 3 B e D) Para a caspase 3 foi observada a

marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em foliacuteculos atreacutesicos iniciais e avanccedilados

(Figuras 4 A e B)

94

34 Expressatildeo de colaacutegeno tipo IV integrina β1 e caspase 3 em foliacuteculos poacutes-

ovulatoacuterios de A bimaculatus expostos ao Thiodanreg

Foram evidenciados desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV e

integrina β1 entre as ceacutelulas foliculares com marcaccedilatildeo positiva (Figuras 3 E e F) Em

foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios tambeacutem foi observada marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 nas

ceacutelulas foliculares (Figuras 4 C e D)

4 DISCUSSAtildeO

As fecircmeas de A bimaculatus submetidas agrave accedilatildeo do toacutexico apresentaram ovaacuterios

com padrotildees normais do desenvolvimento folicular sendo as variaccedilotildees na estrutura do

foliacuteculo como diacircmetro caracteriacutesticas do nuacutecleo camadas envoltoacuterias composiccedilatildeo e

distribuiccedilatildeo do vitelo observadas em outras espeacutecies do gecircnero do presente estudo

(Miranda 1996 Miranda et al 1999 Melo et al 2005 Mazzoni et al 2005 Rodrigues

et al 2005) Em outros trabalhos (Chatterjee et al 1997 Dutta amp Dalal 2008) satildeo

demonstrados que pequena concentraccedilatildeo de contaminantes pode ser suficiente para

causar alteraccedilotildees na morfologia dos foliacuteculos Entretanto Ballesteros et al (2007)

utilizando peixes machos e fecircmeas da espeacutecie Jenynsia multidentata verificaram que o

maior teor de lipiacutedeos nas fecircmeas foi importante para conferir maior resistecircncia contra o

endosulfan ao contraacuterio dos machos que satildeo mais suceptiacuteveis Estudo realizado por

Hernan Da Cuntildea et al (2011) mostrou que a espeacutecie Cichlasoma dimerus exposta ao

endosulfan nas concentraccedilotildees de zero 025 1 2 3 4 e 16μgL natildeo apresentou

alteraccedilotildees morfoloacutegicas nos foliacuteculos assim como no presente trabalho com A

bimaculatus

No presente estudo a ausecircncia de marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos

primordiais pode ter ocorrido em funccedilatildeo da quantidade reduzida de ceacutelulas foliculares e

pela pequena espessura da membrana basal nesta fase de desenvolvimento folicular Na

literatura eacute mencionado que a espessura da membrana basal em foliacuteculos secundaacuterios

avanccedilados de A bimaculatus eacute de aproximadamente 03 microm caracterizada por ser uma

estrutura muito mais delgada quando comparada a outras espeacutecies de teleoacutesteos

(Drummond et al 2000) Outros autores no entanto observaram positividade para

colaacutegeno tipo IV na membrana basal envolvendo ovogocircnias no estroma ovariano de

peixes (Grier 2002 Thomeacute et al 2010) fase que antecede o ovoacutecito primordial

95

A siacutentese de membrana basal tem sido atribuiacuteda agraves ceacutelulas foliculares (Le Mim

et al 2007) mas ainda faltam investigaccedilotildees que evidenciem esta funccedilatildeo A anaacutelise por

hibridizaccedilatildeo in situ na cadeia α1 do colaacutegeno tipo IV revelou a presenccedila de mRNA

localizada na camada folicular de todos os foliacuteculos em crescimento no peixe medaka

Oryzias latipes (Kato et al 2010) enquanto para integrinas Itami et al (2011) natildeo

identificaram marcaccedilatildeo em foliacuteculos primordiais em ratos Estes estudos confirmam que

durante o desenvolvimento do foliacuteculo primordial poderia estar ocorrendo o inicio da

organizaccedilatildeo e siacutentese do colaacutegeno tipo IV para as fecircmeas do presente estudo

Logo em seguida o desenvolvimento folicular primaacuterio inicial e avanccedilado foi

caracterizado por alteraccedilotildees no complexo folicular com marcaccedilatildeo positiva para

integrina β1 e colaacutegeno tipo IV foi positiva Em outro estudo realizado para marcaccedilatildeo

de vaacuterias subunidades do colaacutegeno tipo IV em foliacuteculos de bovinos a expressatildeo das

cadeias α3 e α6 diminuiacuteram durante o desenvolvimento folicular enquanto as cadeias

α1 e α2 continuaram a ser expressas ao longo do desenvolvimento (Rodgers et al

1998) Em estudo com ratos foi verificado o decliacutenio de colaacutegeno tipo IV α3 ao longo

do desenvolvimento folicular mas foi possiacutevel detectar o colaacutegeno tipo IV α4 e α5 em

foliacuteculos desenvolvidos (Frojdman et al 1998) Entretanto Berkholtz (2006) observou

aumento da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV ao longo do desenvolvimento folicular em

ratos Aleacutem disso outra caracteriacutestica importante eacute presenccedila de perlecan e nidogen que

fazem parte das ligaccedilotildees cruzadas em foliacuteculos em desenvolvimento secundaacuterio mas

natildeo em foliacuteculos em desenvolvimento primaacuterio (McArthur et al 2000) Poreacutem as

diferentes ligaccedilotildees cruzadas entre os colaacutegenos e lamininas nas membranas basais

tambeacutem garantem maior expansatildeo no alargamento do foliacuteculo (Rodgers et al 2003)

Portanto eacute de grande importacircncia nesta etapa de desenvolvimento folicular a evidecircncia

do colaacutegeno tipo IV e integrinas o que pode contribuir na organizaccedilatildeo coordenada no

desenvolvimento folicular de A bimaculatus com estas proteiacutenas da matriz extracelular

Em relaccedilatildeo agraves fases de desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio foram observadas

marcaccedilotildees positivas para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 o que parece caracterizar

maior siacutentese destas proteiacutenas nestes estaacutedios do desenvolvimento folicular Entretanto

deve-se considerar que nas fases mais avanccediladas a quantidade de ceacutelulas foliculares e

ceacutelulas da teca satildeo mais numerosas sendo assim exercem funccedilatildeo importante na

integridade folicular No presente estudo a marcaccedilatildeo contiacutenua de colaacutegeno tipo IV e

integrina β1 nos diferentes estaacutedios de desenvolvimento folicular em 96 horas de

experimento indicou que natildeo houve desorganizaccedilatildeo na membrana basal e nas ceacutelulas

96

foliculares Thomeacute et al (2010) identificaram por teacutecnicas de imonoistoquiacutemica e

imunofluorescecircncia a presenccedila de laminina β2 integrinas e colaacutegeno tipo IV na

membrana basal demonstrando a importacircncia destes constituintes na integridade da

membrana basal ao longo do desenvolvimento folicular resultados observados tambeacutem

em foliacuteculos de mamiacuteferos (Le Bellego et al 2002 Berkholtz et al 2006)

Em foliacuteculos de ratos tambeacutem foi evidenciada a presenccedila de integrinas ao longo

do desenvolvimento folicular apresentando marcaccedilatildeo positiva no desenvolvimento

primaacuterio e marcaccedilatildeo mais intensa no desenvolvimento secundaacuterio (Itami et al 2011)

Portanto a marcaccedilatildeo positiva nas ceacutelulas foliculares em lambaris A bimaculatus nos

grupos controle e expostos ao Thiodanreg mostrou que a integridade dos foliacuteculos em

desenvolvimento primaacuterio e secundaacuterio natildeo foi afetada pelas concentraccedilotildees de

Thiodanreg utilizadas

Em relaccedilatildeo agrave caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular foi possiacutevel

evidenciar sua expressatildeo nos estaacutedios de desenvolvimento secundaacuterio mas natildeo a

presenccedila de condensaccedilatildeo de nuacutecleos e corpos apoptoacuteticos nas ceacutelulas foliculares No

entanto a presenccedila de caspase 3 nas ceacutelulas foliculares de A bimaculatus indica que

estas ceacutelulas podem estar em via apoptoacutetica poreacutem outros trabalhos demonstram que a

via para caspase 3 eacute observada em foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios atresias iniciais e

principalmente nas atresias avanccediladas com a presenccedila de fragmentaccedilatildeo de DNA

condensaccedilatildeo nuclear e formaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos (Hsueh et al 1994 Santos et

al 2008) A ausecircncia destas caracteriacutesticas morfoloacutegicas nos foliacuteculos de A

bimaculatus do presente estudo pode ser explicada por inibidores de apoptose (Salvesen

amp Duckett 2002) que podem estar ativos e protegendo as ceacutelulas contra apoptose

Outros exemplos citados satildeo os fatores hormonais como as gonadotropinas 17β

estradiol e fator de crescimento epideacutermico que agem como fatores de sobrevivecircncia

para suprimir a morte celular por apoptose em foliacuteculos ovarianos de ratos em cultura

(Chun et al 1994) e tambeacutem no peixe truta arco-iacuteris Oncorhynchus mykiss (Janz amp Van

Der Kraak 1997) Segundo Salvesen amp Duckett (2002) poucos estudos tecircm tentado

esclarecer se uma determinada ceacutelula consegue se recuperar de um efeito fisioloacutegico de

caspases quando estatildeo sendo processadas e ativadas

Um grupo de proteiacutenas estruturalmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da apoptose eacute o

inibidor de apoptose (IAP) (Deveraux amp Reed 1999) Satildeo descritos pelo menos oito

IAPs em humanos localizados no citoplasma e que se ligam na forma ativa da caspase

3 ou na forma zimogecircnio das caspases para inibir a sua funccedilatildeo (Salvesen amp Duckett

97

2002) Janz et al (1997) mencionam forte relaccedilatildeo com o aumento da apoptose e

expressatildeo de proteiacutena do choque teacutermico HSP70 em peixes expostos agrave celulose

afetando o tamanho do ovaacuterio provocanado queda da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

testosterona e induccedilatildeo nas concentraccedilotildees plasmaacuteticas de 17β estradiol Em relaccedilatildeo agrave

HSP70 ela pode estar relacionada com a proteccedilatildeo das ceacutelulas foliculares antes da

reabsorccedilatildeo do vitelo em foliacuteculos atreacutesicos (Santos et al 2008) A relaccedilatildeo mais

consistente da viabilidade dos foliacuteculos de A bimaculatus no presente estudo segundo a

literatura pode ser a relaccedilatildeo dos inibidores de apoptose associado com os fatores

hormonais agindo como prevenccedilatildeo na sobrevivecircncia das ceacutelulas foliculares no

desenvolvimento folicular secundaacuterio

Nas fecircmeas do lambari A bimaculatus o processo de atresia foi semelhante ao


al (2005) A maior frequecircncia de atresia foi observada em foliacuteculos secundaacuterios

Observaccedilotildees semelhantes foram feitas por Drummond (1996) em A bimaculatus

lacustris e Melo et al (2005) em A scabripinnis Em relaccedilatildeo aos foliacuteculos poacutes-

ovulatoacuterios ocorre perda de contato entre as membranas das ceacutelulas foliculares

adjacentes evento observado por Santos et al (2005) entre 48 e 72 horas poacutes-desova em

Leporinus taeniatus Essas estruturas foram raramente encontradas no presente estudo

indicando que o grau de contaminaccedilatildeo pelo Thiodanreg natildeo interferiu na eliminaccedilatildeo dos

foliacuteculos de A bimaculatus em maturaccedilatildeo avanccedilada

Nos processos de atresias e nos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios ocorreram a

desorganizaccedilatildeo e a perda da positividade da imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e

integrinas nas fases avanccediladas quando comparadas com as fases iniciais da regressatildeo

ovariana sendo esta caracteriacutestica tambeacutem observada por outros autores (Santos et al

2008 Thomeacute et al 2010) Relatos importantes sobre a integridade dos foliacuteculos estatildeo

na diminuiccedilatildeo da integrina β1 e colaacutegeno do tipo IV contribuindo para o aumento da

apoptose em ceacutelulas foliculares de foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios e nas atresias avanccediladas

(Santos et al 2008) Aleacutem disso outros fatores contribuem para o aumento da

apoptose como a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 17β estradiol logo apoacutes a desova

favorecendo a regressatildeo ovariana dos foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios (Kaptaner amp Ural 2006)

Portanto o presente estudo com as fecircmeas de A bimaculatus evidencia a caspase 3 e a

diminuiccedilatildeo da marcaccedilatildeo com integrina β1 e colaacutegeno tipo IV nas ceacutelulas foliculares nos

foliacuteculos atreacutesicos e poacutes-ovulatoacuterios o que sugere a provaacutevel accedilatildeo destas proteiacutenas na

regressatildeo folicular em lambaris expostos ao Thiodanreg

98

De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que os ovaacuterios A

bimaculatus foram resistentes ao Thiodanreg nas concentraccedilotildees testadas e no periacuteodo

experimental proposto pois tais concentraccedilotildees natildeo interferiram de modo significativo

na estrutura do complexo folicular e no desenvolvimento folicular Qualitativamente

essas anaacutelises demonstraram a marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do

desenvolvimento folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes

concentraccedilotildees de Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da

via apoptoacutetica caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros

processos de regressatildeo folicular

99

A

DC

B

fsa fp

fpi

fpi

mc

mi

fpa

fpa

fsa

fsa

zr

zr

zr zr

H

E

G

F

mc

m

mi

mc

fsa

fpi

fpa

fsi

vc fsa

fst

v

v

Figura 1 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Controle negativo para integrina β1 e colaacutegeno tipo IV B Foliacuteculo primordial (fp) sem marcaccedilatildeo para colaacutegeno (setas) C e D Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) respectivamente em folliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) E e F Marcaccedilatildeo positiva para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) Encarte-C Foliacuteculo primaacuterio inicial (fpi) G e H Marcaccedilatildeo para colaacutegeno (mc) e integrina (mi) mais fortemente evidenciada em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) Encartes-G e H Foliacuteculo secundaacuterio inicial (fsi) foliacuteculo secundaacuterio intermediaacuterio (fst) foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado (fsa) vesiacuteculas corticais (vc) vitelo (v) zona radiata (zr) Encartes C E G e H corados com hematoxilinaeosina Barras 20 m encartes C e E (80 m) G (100m) e H (200m)

A B

C D

E F

G H

100

fpi

fpa

fsa

fsa

fsa

zr

zr

zr zr

D

A

C

B

Figura 2 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 ao longo do desenvolvimento folicular em A bimaculatus A Imagem do controle negativo para caspase 3 (setas) B Ausecircncia de marcaccedilatildeo para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento primaacuterio inicial (fpi) C e D Marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) em foliacuteculo em desenvolvimento secundaacuterio avanccedilado (fsa) e ausente (setas) em foliacuteculo desenvolvimento primaacuterio avanccedilado (fpa) zr zona radiata fsa foliacuteculo secundaacuterio avanccedilado Barras 20 m

101

A

mc

mi

mc

mi

mi mc

fpo fpo

ai av

av

B

C D

E F

Figura 3 Imunomarcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV e integrina β1 de atresia e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterio em A bimaculatus A e C Foliacuteculo secundaacuterio em atresia inicial (ai) caracterizando a presenccedila da zona radiata (zr) e iniacutecio da desorganizaccedilatildeo da marcaccedilatildeo para colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no complexo folicular (setas) B e D Imunomarcaccedilatildeo menos intensa do que na etapa anterior em atresia avanccedilada caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) no citoplasma (setas) E e F Foliacuteculo poacutes-ovulatoacuterio (fpo) caracterizando a desorganizaccedilatildeo e espalhamento do colaacutegeno tipo IV (mc) e integrina β1 (mi) entre as ceacutelulas

foliculares (setas) Encartes A e B Atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) ceacutelula folicular (cf) zona radiata (zr) Encartes A e B corados com hematoxilinaeosina Barras A B C E e F

(20 m) D (200 m) encartes A (25 m) e B (100 m)

ai av zr cf cf

102

A

ai av

fpo fpo

B

C D

Figura 4 Imunomarcaccedilatildeo para caspase 3 em atresia folicular e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios em A bimaculatus A e B Imunomarcaccedilatildeo em atresia inicial (ai) e atresia avanccedilada (av) caracterizando a presenccedila de marcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) C e D Imunomarcaccedilatildeo positiva para caspase 3 (setas) nas ceacutelulas dos foliacuteculos poacutes-ovulatorios (fpo) Barras A B e D (20 m) C (200 m)

103





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MCARTHUR M E IRVINGndashRODGERS H F I BYERS S RODGERS R J Identification and immunolocalisation of decorin versican perlecan nidogen and chondroitin sulfate proteoglycans in bovine small-antral ovarian follicles Biology of Reproduction 63913-924 2000






106



RODGERS H F IRVINE C M VAN WEZEL I L LAVRANOS T C LUCK M L SADO Y NINOMIYA Y RODGERS R J Distribution of the α1 to α6 chains of type IV collagen in bovine follicles Biology of Reproduction 591334-1341 1998

RODGERS R J IRVING-RODGERS H F RUSSELL D L Extracellular matrix of the developing ovarian follicle Reproduction 126415-4242003



SANTOS H B SATO Y MORO L BAZZOLI N RIZZO E Relationship among follicular apoptosis integrin β1 and collagen type IV during early ovarian regression in the teleost Procholodus argenteus after induced spawning Cell Tissue Reserch 332159-170 2008a

SANTOS H B THOME R G ARANTES F P SATO Y BAZZOLI N RIZZO E Ovarian follicular atresia is mediated by heterophagy autophagy and apoptosis in Prochilodus argenteus and Leporinus taeniatus (Teleostei Characiformes) Theriogenology 701449ndash1460 2008b


SANTOS H B RIZZO E SATO Y BAZZOLI N Apoptosis in the involution of postovulatory follicles of Leporinus taeniatus LUumlTKEN 1874 (Pisces Anostomidae) submitted to the induced spawning In XIX Congress of the Brazilian Society of Microscopy and Microanalysis Proceedings Caxambu MG 2003

SALVESEN G S DUCKETT C S AP proteins blocking the road to deaths door Nature Reviews Molecular Cell Biology 3(6)401-10 2002


THOME R SANTOS H B SATO Y RIZZO E BAZZOLI N Distribution of laminin b2 collagen type IV fibronectin and MMP-9 in ovaries of the teleost fish Journal of Molecular Histology 41215-224 2010


WALKER C H HOPKIN S P SIBLY R M PEAKALL D B The fate organic pollutants in individuals and in ecosystems In Principles of Ecotoxicology (CH Walker et al) 1996 London Taylor amp Francis p 67-76

107

6 CONCLUSOtildeES A CL50 estimada para fecircmeas adultas de Astyanax bimaculatus em maturaccedilatildeo

avanccedilada expostas ao Thiodanreg eacute de 136microgL com intervalo de confianccedila de 101 a

184 microgL

A accedilatildeo do Thiodanreg em concentraccedilotildees subletais natildeo afetou o fiacutegado como um todo

mas locais isolados do parecircnquima hepaacutetico sendo a maioria alteraccedilotildees de estaacutegio I e

II com dano reparaacutevel do tecido hepaacutetico

As alteraccedilotildees na quantidade de glicogecircnio hepaacutetico no experimento sem aclimataccedilatildeo

sem alimentaccedilatildeo demonstraram que o Thiodanreg influenciou na maior mobilizaccedilatildeo

das reservas de glicogecircnio em funccedilatildeo das condiccedilotildees ambientais oferecidas aos

animais

As alteraccedilotildees ocorridas no nuacutecleo e citoplasma dos hepatoacutecitos demonstram que o

Thiodanreg pode comprometer as funccedilotildees hepaacuteticas confirmando que o Thiodanreg

influenciou no metabolismo celular como resposta adaptativa celular

Natildeo foram observadas diferenccedilas morfoloacutegicas que comprometessem diretamente os

estaacutedios de desenvolvimento folicular ovariano seja no grupo controle ou nos grupos

tratados com Thiodanreg

Os experimentos com aclimataccedilatildeo apresentaram alteraccedilotildees na quantidade de

foliacuteculos primaacuterios e secundaacuterios quando comparadas com os peixes sem

aclimataccedilatildeo sugerindo que o eixo hipotaacutelamo-hipoacutefise-ovaacuterio pode estar sendo

afetado

Houve maior diacircmetro nos foliacuteculos vitelogecircnicos e maior frequecircncia de atresia

folicular no experimento com aclimataccedilatildeo seguida de exposiccedilatildeo ao Thiodanreg o que

sugere mecanismo adaptativo com maiores diacircmetros de foliacuteculos no meio

impactado

108

As meacutedias dos IGS e IHS nos experimentos aclimatados foram menores quando

comparadas com os experimentos sem aclimataccedilatildeo sugerindo que a espeacutecie A

bimaculatus previamente aclimatada em aquaacuterios pode sofrer comprometimento da

reproduccedilatildeo

As reaccedilotildees imunohistoquiacutemicas para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 em

foliacuteculos atreacutesicos e foliacuteculos poacutes-ovulatoacuterios sugerem possiacutevel relaccedilatildeo com a

regressatildeo ovariana poacutes-desova

As anaacutelises por imunohistoquiacutemica para integrina β1 colaacutegeno IV e caspase-3 nas

ceacutelulas foliculares ao longo do desenvolvimento folicular demonstraram

qualitativamente marcaccedilatildeo crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento

folicular mesmo quando os peixes foram expostos a diferentes concentraccedilotildees de

Thiodanreg o que caracteriza a integridade das ceacutelulas foliculares e da via apoptoacutetica

caspase-3-dependente que pode estar sendo ativada para futuros processos de

regressatildeo folicular

i

LUCAS MARCON




APROVADA

____________________________________ ______________________________

Profa Dra Marlene Isabel Vargas Viloria Profa Dra Mary Anne Heidi Dolder

(Coorientadora)

____________________________________ _____________________________

Prof Dr Nilo Bazzoli Prof Dr Joseacute Domingos Guimaratildees

_________________________________

Prof Dr Laeacutercio dos Anjos Benjamin

(Orientador)

ii

AGRADECIMENTOS














iii

BIOGRAFIA













iv

IacuteNDICE

RESUMO

ABSTRACT













vi

viii

1

1

2

3

4

5

6

6

7

9

10

12

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral



31 Animais

32 Agrotoacutexicos











15

15

15

17

17

18

18

20

21

21

22

25

26

27

27

28

v




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo





Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


6 CONCLUSOtildeES

35

35

35

36

37

42

45

56

62

62

63

65

68

71

82

86

86

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103

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vi

RESUMO






























vii
































viii

ABSTRACT






























ix

























1


































2


































3
















al 1996)








1996)










4
















Kishimba 2006)


















5

































Pereira et al 2012)

6



















para Daphnia magna














7


2003)























graves









8






















trabalhos













9


































10



















amp Aranha 2002)















11



































12














1998)



















13


























14



















15

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral























16



tratados

17









31 Animais




















18











32 Agrotoacutexico










19










agrotoacutexico













20



















NBR 15088 (ABNT 2007)




Thiodanreg


intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)




final

21




























22






GETIT Olympus




























23




















Atorfia nuclear I













Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24



25


























Atresia folicular






26


















27

























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29

















30

















31
















32
















33
















34







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51 CAPIacuteTULO 1



RESUMO


























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2014)

















21 Animais



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22 Agrotoacutexico



endosulfan











39

















15088 (ABNT 2007)















40



































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3 RESULTADOS















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controle (Tabela 5)













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8)





















4 DISCUSSAtildeO







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2001)






hepatoacutecitos















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destas estruturas












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50


























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G S G

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60
















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52 CAPIacuteTULO 2



RESUMO






















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respectivamente





64





























Thiodanreg

65








da UFV

21 Animais





















66

22 Agrotoacutexico



endosulfan




- ABNT 2007)




















GETIT Olympus




67























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significacircncia

3 RESULTADOS





















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70

















(Figura 4)









5)








71



















4 DISCUSSAtildeO













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testadas


















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74



















IGS











75

A

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vs

D

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C

B

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0

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Qu

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53 CAPIacuteTULO 3




RESUMO





























87

































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89






2000 Santos et al 2003 2005 2008)



















21 Animais







90








piscicultura








22 Agrotoacutexico



endosulfan






a NBR 15088 (ABNT 2007)







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GETIT Olympus

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3 RESULTADOS








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(Figuras 4 A e B)

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4 DISCUSSAtildeO















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A

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B

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A

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106
















107



184 microgL







animais










afetado




impactado

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ii

AGRADECIMENTOS














iii

BIOGRAFIA













iv

IacuteNDICE

RESUMO

ABSTRACT













vi

viii

1

1

2

3

4

5

6

6

7

9

10

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2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral



31 Animais

32 Agrotoacutexicos











15

15

15

17

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18

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20

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v




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo





Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


6 CONCLUSOtildeES

35

35

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45

56

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103

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vi

RESUMO






























vii
































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1


































2


































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al 1996)








1996)










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Kishimba 2006)


















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Pereira et al 2012)

6



















para Daphnia magna














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2003)























graves









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trabalhos













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amp Aranha 2002)















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1998)



















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2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral























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tratados

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31 Animais




















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32 Agrotoacutexico










19










agrotoacutexico













20



















NBR 15088 (ABNT 2007)




Thiodanreg


intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)




final

21




























22






GETIT Olympus




























23




















Atorfia nuclear I













Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24



25


























Atresia folicular






26


















27

























28


















29

















30

















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51 CAPIacuteTULO 1



RESUMO


























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2014)

















21 Animais



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22 Agrotoacutexico



endosulfan











39

















15088 (ABNT 2007)















40



































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3 RESULTADOS















43


































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controle (Tabela 5)













45




8)





















4 DISCUSSAtildeO







46














2001)






hepatoacutecitos















47






















destas estruturas












48



































49



































50


























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G S G

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52 CAPIacuteTULO 2



RESUMO






















63





























respectivamente





64





























Thiodanreg

65








da UFV

21 Animais





















66

22 Agrotoacutexico



endosulfan




- ABNT 2007)




















GETIT Olympus




67























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significacircncia

3 RESULTADOS





















69
































70

















(Figura 4)









5)








71



















4 DISCUSSAtildeO













72

















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IGS











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A

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78

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53 CAPIacuteTULO 3




RESUMO





























87

































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2000 Santos et al 2003 2005 2008)



















21 Animais







90








piscicultura








22 Agrotoacutexico



endosulfan






a NBR 15088 (ABNT 2007)







91






























GETIT Olympus

92

3 RESULTADOS








93




























(Figuras 4 A e B)

94







4 DISCUSSAtildeO















bimaculatus










95



































96



































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99

A

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B

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101

A

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B

C D

E F




ai av zr cf cf

102

A

ai av

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B

C D


103

















104

















105
















106
















107



184 microgL







animais










afetado




impactado

108















iii

BIOGRAFIA













iv

IacuteNDICE

RESUMO

ABSTRACT













vi

viii

1

1

2

3

4

5

6

6

7

9

10

12

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral



31 Animais

32 Agrotoacutexicos











15

15

15

17

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18

18

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21

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v




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo





Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


6 CONCLUSOtildeES

35

35

35

36

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45

56

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65

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86

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103

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vi

RESUMO






























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viii

ABSTRACT






























ix

























1


































2


































3
















al 1996)








1996)










4
















Kishimba 2006)


















5

































Pereira et al 2012)

6



















para Daphnia magna














7


2003)























graves









8






















trabalhos













9


































10



















amp Aranha 2002)















11



































12














1998)



















13


























14



















15

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral























16



tratados

17









31 Animais




















18











32 Agrotoacutexico










19










agrotoacutexico













20



















NBR 15088 (ABNT 2007)




Thiodanreg


intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)




final

21




























22






GETIT Olympus




























23




















Atorfia nuclear I













Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24



25


























Atresia folicular






26


















27

























28


















29

















30

















31
















32
















33
















34







35


51 CAPIacuteTULO 1



RESUMO


























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2014)

















21 Animais



38



















22 Agrotoacutexico



endosulfan











39

















15088 (ABNT 2007)















40



































41
















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3 RESULTADOS















43


































44




















controle (Tabela 5)













45




8)





















4 DISCUSSAtildeO







46














2001)






hepatoacutecitos















47






















destas estruturas












48



































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50


























51


G S G

N

C

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B

C

A

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52

Dn

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B

F


C

A

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53



















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55




















56



















57
















58
















59
















60
















61







62

52 CAPIacuteTULO 2



RESUMO






















63





























respectivamente





64





























Thiodanreg

65








da UFV

21 Animais





















66

22 Agrotoacutexico



endosulfan




- ABNT 2007)




















GETIT Olympus




67























68










significacircncia

3 RESULTADOS





















69
































70

















(Figura 4)









5)








71



















4 DISCUSSAtildeO













72

















testadas


















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74



















IGS











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A

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83
















84
















85











86

53 CAPIacuteTULO 3




RESUMO





























87

































88



































89






2000 Santos et al 2003 2005 2008)



















21 Animais







90








piscicultura








22 Agrotoacutexico



endosulfan






a NBR 15088 (ABNT 2007)







91






























GETIT Olympus

92

3 RESULTADOS








93




























(Figuras 4 A e B)

94







4 DISCUSSAtildeO















bimaculatus










95



































96



































97



































98










99

A

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106
















107



184 microgL







animais










afetado




impactado

108















iv

IacuteNDICE

RESUMO

ABSTRACT













vi

viii

1

1

2

3

4

5

6

6

7

9

10

12

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral



31 Animais

32 Agrotoacutexicos











15

15

15

17

17

18

18

20

21

21

22

25

26

27

27

28

v




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo





Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


6 CONCLUSOtildeES

35

35

35

36

37

42

45

56

62

62

63

65

68

71

82

86

86

87

89

92

94

103

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vi

RESUMO






























vii
































viii

ABSTRACT






























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1


































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10



















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12














1998)



















13


























14



















15

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral























16



tratados

17









31 Animais




















18











32 Agrotoacutexico










19










agrotoacutexico













20



















NBR 15088 (ABNT 2007)




Thiodanreg


intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)




final

21




























22






GETIT Olympus




























23




















Atorfia nuclear I













Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24



25


























Atresia folicular






26


















27

























28


















29

















30

















31
















32
















33
















34







35


51 CAPIacuteTULO 1



RESUMO


























36


































37












2014)

















21 Animais



38



















22 Agrotoacutexico



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39

















15088 (ABNT 2007)















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41
















42















3 RESULTADOS















43


































44




















controle (Tabela 5)













45




8)





















4 DISCUSSAtildeO







46














2001)






hepatoacutecitos















47






















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50


























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61







62

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RESUMO






















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64





























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65








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21 Animais





















66

22 Agrotoacutexico



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3 RESULTADOS





















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70

















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53 CAPIacuteTULO 3




RESUMO





























87

































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89






2000 Santos et al 2003 2005 2008)



















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90








piscicultura








22 Agrotoacutexico



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a NBR 15088 (ABNT 2007)







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GETIT Olympus

92

3 RESULTADOS








93




























(Figuras 4 A e B)

94







4 DISCUSSAtildeO















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95



































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v




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo




Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo





Resumo



3 Resultados

4 Discussatildeo


6 CONCLUSOtildeES

35

35

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45

56

62

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65

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vi

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17









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18











32 Agrotoacutexico










19










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20



















NBR 15088 (ABNT 2007)




Thiodanreg


intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)




final

21




























22






GETIT Olympus




























23




















Atorfia nuclear I













Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24



25


























Atresia folicular






26


















27

























28


















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30

















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32
















33
















34







35


51 CAPIacuteTULO 1



RESUMO


























36


































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3 RESULTADOS















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3 RESULTADOS





















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RESUMO





























87

































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89






2000 Santos et al 2003 2005 2008)



















21 Animais







90








piscicultura








22 Agrotoacutexico



endosulfan






a NBR 15088 (ABNT 2007)







91






























GETIT Olympus

92

3 RESULTADOS








93




























(Figuras 4 A e B)

94







4 DISCUSSAtildeO















bimaculatus










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vi

RESUMO






























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viii

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1


































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5

































Pereira et al 2012)

6



















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11



































12














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13


























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15

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21 Objetivo geral























16



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17









31 Animais




















18











32 Agrotoacutexico










19










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20



















NBR 15088 (ABNT 2007)




Thiodanreg


intermediaacuteria

(1100)

Soluccedilatildeo

padratildeo final

(1100)




final

21




























22






GETIT Olympus




























23




















Atorfia nuclear I













Hiperemia II

Ruptura de vasos II

3 Necrose

Necrose focal III

24



25


























Atresia folicular






26


















27

























28


















29

















30

















31
















32
















33
















34







35


51 CAPIacuteTULO 1



RESUMO


























36


































37












2014)

















21 Animais



38



















22 Agrotoacutexico



endosulfan











39

















15088 (ABNT 2007)















40



































41
















42















3 RESULTADOS















43


































44




















controle (Tabela 5)













45




8)





















4 DISCUSSAtildeO







46














2001)






hepatoacutecitos















47






















destas estruturas












48



































49



































50


























51


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61







62

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RESUMO






















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64





























Thiodanreg

65








da UFV

21 Animais





















66

22 Agrotoacutexico



endosulfan




- ABNT 2007)




















GETIT Olympus




67























68










significacircncia

3 RESULTADOS





















69
































70

















(Figura 4)









5)








71



















4 DISCUSSAtildeO













72

















testadas


















73



































74



















IGS











75

A

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2000 Santos et al 2003 2005 2008)



















21 Animais







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piscicultura








22 Agrotoacutexico



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a NBR 15088 (ABNT 2007)







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GETIT Olympus

92

3 RESULTADOS








93




























(Figuras 4 A e B)

94







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102

A

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B

C D


103

















104

















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108















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