efeito das fibras alimentares de abÓbora na...
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ERIKA SUZUKI
EFEITO DAS FIBRAS ALIMENTARES DE ABÓBORA NA INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA EM RATOS
CAMPINAS
2008
ERIKA SUZUKI
EFEITO DAS FIBRAS ALIMENTARES DE ABÓBORA NA INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA EM RATOS
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas, para a obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
ORIENTADORA: PROFa DRa ALBA REGINA MONTEIRO SOUZA BRITO
CAMPINAS
2008
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044
Título em inglês : Pumpkin dietary fiber effects on induced intestinal inflammation in rats Keywords: • Dietary fiber • Pumpkin • Short-chain fatty acids • Inflammation • Antioxidant • Enzymes • Interleukin-12
Titulação: Mestre em Farmacologia
Banca examinadora:
Profª. Drª. Alba Regina Monteiro Souza Brito Profª. Drª. Ana Beatriz Albino Almeida Prof. Dr. Claúdio Saddy Rodrigues Coy
Data da defesa: 29 - 01 - 2008
Suzuki, Erika Su99e Efeito das fibras alimentares de abóbora na inflamação intestinal
induzida em ratos. / Erika Suzuki. Campinas, SP : [s.n.], 2008. Orientador : Alba Regina Monteiro Souza Brito Dissertação ( Mestrado ) Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Ciências Médicas. 1. Fibra alimentar. 2. Abóbora. 3. Ácidos graxos de cadeia
curta. 4. Inflamação. 5. Enzimas. 6. Antioxidantes. 7. Interleucina-12. I. Souza-Brito, Alba Regina Monteiro. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
iv
Aos meus pais, Carlos e Emiko.
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AGRADECIMENTOS
À Profa Alba, pela acolhida ao laboratório. Sempre me deixou à vontade para
pensar e seguir o que achava ser o certo. Agradeço o apoio e incentivo. O que
ainda me encanta são suas histórias de vida... Obrigada!!
À Dra Elisângela, pelas metodologias novas e a disposição em ajudar.
Ao Prof Lauro Kubota e Jailson C. Dias, do Instituto de Química, pelas análises
dos ácidos graxos de cadeia curta. Etapa fundamental para que os testes
biológicos pudessem ser iniciados.
Ao Léscio e Washington, pelos cuidados diários com os ratos no biotério.
Ao Anderson, pela ajuda durante todo o mestrado; exemplo de bom humor e
disposição. À Aninha, por me ajudar pacientemente com as análises de
antioxidantes.
Ao Laboratório de Produtos Naturais (Ademir, Anderson, Aninha, Bita, Chris,
Cibele, Cinza, Déborah, Demétrio, Dunder, Elis, Felipe, Pati, Silene, Victor) pelo
ambiente de trabalho gostoso, pela ajuda nos experimentos e pela troca de
informações sobre tudo, principalmente sobre pesquisa...
Aos Profs Edson Antunes, Miguel Arcanjo e Cláudio Coy, pelas sugestões e
correções no exame de qualificação.
Aos meus pais, Carlos e Emiko, pelo incentivo nos estudos e a compreensão de
que cada filho tem a sua cabeça, o seu jeito e o seu caminho a seguir...
Ao Leo, Karina e Celso, meus melhores vínculos com o passado e aqueles que no
futuro, provavelmente, nunca me deixarão na mão.
vi
Aos queridíssimos amigos Jú, Fábio, Karina, Edu, Nádia, Cris e Dani pela amizade
e carinho.
Ao meu Fê, por me fazer feliz. Tenho certeza de que a nossa caminhada será
longa.
À Capes e à FAPESP pelo apoio financeiro.
vii
“O ser humano vivencia a si mesmo, seus pensamentos como algo separado do resto do
universo - numa espécie de ilusão de ótica de sua consciência. E essa ilusão é uma
espécie de prisão que nos restringe a nossos desejos pessoais, conceitos e ao afeto por
pessoas mais próximas. Nossa principal tarefa é a de nos livrarmos dessa prisão,
ampliando o nosso círculo de compaixão, para que ele abranja todos os seres vivos e
toda a natureza em sua beleza. Ninguém conseguirá alcançar completamente esse
objetivo, mas lutar pela sua realização já é por si só parte de nossa liberação e o alicerce
de nossa segurança interior.”
Albert Einstein
viii
SUMÁRIO
1. Introdução....................................................................................... 17
1.1. Doenças Inflamatórias Intestinais.............................................. 17
1.1.1. Epidemiologia...............................................................17
1.1.2. Fatores Genéticos........................................................ 18
1.1.3. Fatores Ambientais...................................................... 19
Fumo................................................................. 20
Fármacos.......................................................... 20
Estresse............................................................ 21
Fatores microbianos......................................... 22
Fatores alimentares.......................................... 23
1.2. Terapêutica Atual e Perspectivas.............................................. 24
1.3. Fibras Alimentares..................................................................... 29
1.3.1. Espécie Estudada........................................................ 32
1.4. Cromatografia de Íons............................................................... 32
2. Objetivos......................................................................................... 34
3. Materiais e Métodos....................................................................... 35
3.1. Fibras......................................................................................... 35
3.2. Teste in vitro.............................................................................. 35
3.3. Cromatografia de Íons............................................................... 36
3.4. Animais...................................................................................... 37
3.5. Inflamação Intestinal Induzida por TNBS...................................38
3.6. Drogas Utilizadas.......................................................................39
3.6. Detecção da lesão do cólon...................................................... 39
3.7. Avaliação da Atividade Antioxidante......................................... 39
3.7.1. Dosagem de Proteínas Totais..................................... 39
3.7.2. Grupamentos Sulfidrila.................................................39
3.7.3. Glutationa Peroxidase.................................................. 40
3.7.4. Glutationa Redutase.....................................................40
3.7.5. Peroxidação Lipídica.................................................... 40
3.7.5. Mieloperoxidase........................................................... 40
ix
3.8. Interleucina 12............................................................................41
3.9. Análise Estatística..................................................................... 41
4. Resultados...................................................................................... 42
4.1. Teste in vitro.............................................................................. 42
4.2. Inflamação Intestinal Induzida por TNBS...................................43
4.2.1. Grupamentos Sulfidrila.................................................46
4.2.2. Glutationa Peroxidase.................................................. 47
4.2.3. Glutationa Redutase.....................................................48
4.2.4. Peroxidação Lipídica.................................................... 49
4.2.5. Mieloperoxidase........................................................... 50
4.2.6. Interleucina 12..............................................................51
5. Discussão........................................................................................52
6. Conclusões e Perspectivas........................................................... 57
7. Referências Bibliográficas.............................................................58
x
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Esquema 1 - Efeito das fibras solúveis, insolúveis e a combinação delas no trato
gastrointestinal...................................................................................... 31
Esquema 2 - Cromatógrafo de Exclusão de Íons.................................................. 37
Esquema 3 - Inflamação intestinal induzida por TNBS......................................... 38
Figura 1 - Abóbora (Cucurbita sp)......................................................................... 32
Figura 2 - Processamento da abóbora.................................................................. 35
Figura 3 - Região cólica após inflamação induzida por TNBS.............................. 43
Fluxograma 1 - Teste in vitro................................................................................ 36
Gráfico 1 - Produção média dos Ácidos Graxos de Cadeia Curta (AGCC) no teste
in vitro.................................................................................................... 42
Gráfico 2 - Área da lesão na região cólica............................................................. 43
Gráfico 3 - Peso dos animais durante o experimento............................................ 44
Gráfico 4 - Área sob a curva nos 3 dias após a indução....................................... 45
Gráfico 5 - Área sob a curva nos 7 dias após a indução....................................... 45
Gráfico 6 - Concentração dos Grupamentos Sulfidrila (GSH)............................... 46
Gráfico 7 - Concentração da enzima Glutationa Peroxidase (GPx)...................... 47
Gráfico 8 - Concentração da enzima Glutationa Redutase (GR).......................... 48
Gráfico 9 - Níveis de Peroxidação Lipídica (LPO)................................................. 49
Gráfico 10 - Atividade da Mieloperoxidase (MPO)................................................ 50
Gráfico 11 - Concentração de Interleucina-12....................................................... 51
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGCC = Ácido graxo de cadeia curta
AINE = Antiinflamatório não-esteroidal
AM = Anticorpo monoclonal
5-ASA = Ácido 5-aminosalicílico
BAL = Bactérias ácido lácticas
CARD15 = Caspase recruitment domain 15
CD = Crohn’s disease
CEI = Cromatografia de exclusão de íons
CI = Cromatografia de íons
CLAE = Cromatografia líquida de alta eficiência
COX = Ciclooxigenase
CRF = Fator liberador de corticotrofina
DC = Doença de Crohn
DII = Doenças inflamatórias intestinais
DTNB = ácido 5,5 ditiobis-2-nitrobenzóico
ELAM = Molécula-1 de aderência aos leucócitos endoteliais
ERO = Espécies reativas de oxigênio
FA = Fibras alimentares
FI = Fibras insolúveis
FS = Fibras solúveis
FT = Fibras totais
GPx = Glutationa peroxidase
GSH = Grupamentos sulfidrila
IBD = Inflammatory bowel disease
ICAM = Molécula-1 de aderência intercelular
IFN-γ = Interferon gama
IL = Interleucina
LPO = Lipoperoxidação ou peroxidação lipídica
MHC = Complexo principal de histocompatibilidade
xii
MPO = Mieloperoxidase
NFκB = Fator nuclear κB
NK = Natural killer
NOD2 = Intracellular nucleotide oligomerization domain 2
OCNT = Transportador de cátions orgânicos
RCUI = Retocolite ulcerativa inespecífica
SP = Substância P
SPF = Specific pathogen free
TGI = Trato gastrointestinal
TLR = Toll-like receptor
TNBS = Ácido trinitrobenzenossulfônico
TNFα = Fator de necrose tumoral alfa
UC = Ulcerative colitis
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RESUMO
As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), que englobam a Doença de Crohn (DC)
e a Retocolite Ulcerativa Inespecífica (RCUI), representam um grande problema
para a saúde, uma vez que um único tipo de tratamento com corticosteróides,
imunomoduladores ou anti-TNF-α não é eficaz para manter as remissões. Além
disso, esses medicamentos possuem efeitos colaterais e o custo do tratamento é
elevado. O número de pessoas que desenvolvem as DII está aumentando
substancialmente; isso se deve, principalmente, a fatores genéticos e,
secundariamente, a fatores ambientais como alimentação, fumo, fármacos,
estresse e a flora comensal. As DII são consideradas superexpressões do sistema
imune, que levam ao ataque do trato gastrointestinal do próprio hospedeiro. Nesse
contexto, fibras alimentares (FA) são indicadas como adjuvantes no tratamento
das DII. Esse estudo teve como objetivo investigar o efeito protetor e/ou
terapêutico das FA de abóbora na prevenção da inflamação intestinal induzida por
TNBS em ratos. As fibras solúveis, ao serem fermentadas pelas bactérias
intestinais anaeróbicas, produzem ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) entre
outras substâncias. AGCC são de elevada importância nas DII, principalmente o
butirato, por fornecer energia aos enterócitos, permitindo o crescimento e a rápida
recuperação dos tecidos lesionados. Além disso, as FA de abóbora possuem
efeito antioxidante e antiinflamatório, são de fácil acesso aos consumidores e seu
custo é baixo. Para a escolha da proporção de FA que mais produziu butirato, foi
realizado o teste in vitro, onde diferentes proporções de FA de polpa e semente de
abóbora foram incubadas com bactérias anaeróbicas intestinais; os AGCC foram
quantificados por Cromatografia de Exclusão de Íons. Durante 23 dias os ratos, do
grupo tratado, foram suplementados com FA na proporção 0,1 g de polpa + 0,4 g
de semente de abóbora/kg/dia. No 16º dia foi realizada a indução da inflamação
intestinal por TNBS e no 24º dia, a eutanásia. Os 8 cm finais do intestino grosso
foram coletados para a dosagem de algumas enzimas antioxidantes, atividade da
mieloperoxidase e níveis de interleucina 12. Os dados obtidos neste trabalho
foram: aumento estatisticamente significativo dos níveis de Peroxidação Lipídica
xiv
no grupo não-tratado (2,8 ± 1,2 pmol/mg proteína) comparado ao grupo tratado
com FA (1,8 ± 0,6 pmol/mg proteína); aumento estatisticamente significativo da
infiltração de neutrófilos e macrófagos no grupo não-tratado (35,8 ± 11 U/g
proteína) comparado ao grupo tratado com FA (17,6 ± 2,6 U/g proteína); e
aumento estatisticamente significativo da interleucina 12 no grupo não-tratado
(102,2 ± 42 pg/mL) comparado ao grupo tratado com FA (45,7 ± 9,2 pg/mL).
Assim, as FA de abóbora podem ser consideradas fortes candidatas como
adjuvantes no tratamento das inflamações intestinais por possuírem um forte
potencial antiinflamatório no cólon.
xv
ABSTRACT
Crohn’s Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC) are known as Inflammatory
Bowel Disease (IBD). They are considered a large problem in the health, because
the therapy using corticosteroids, immunomodulators and anti-TNF-α are not totally
efficient to maintain the remission. Also, they offer many side effects and the
treatment cost is high. The number of patients with IBD is increasing. IBD is mainly
due to genetic factors and secondary to environmental factors, such as diet,
smoking, stress, and comensal flora. IBD is the overexpression of immune system,
leading to the gastrointestinal tract injury. In this context, dietary fibers (DF) are
suggested to help IBD therapies. The aim of this work was investigate the potential
protector and/or therapeutic effects of pumpkin DF in TNBS-induced intestinal
inflammation in rats. Soluble fibers are fermented by anaerobical bacteria from
intestine and produce short-chain fatty acids (SCFA) among others substances.
These SCFA have a lead role, mainly butyrate. Butyrate supply energy for the
enterocytes, and helps injured tissues development and recuperation. Pumpkin DF
have antioxidant and anti-inflammatory effects also. Pumpkin is sold almost
everywhere and is cheap. To choose pumpkin DF mixture that produces high
amount of butyrate, an in vitro test was realized. In this test, different pumpkin
pulp/seeds mixture were incubated with anaerobical intestinal bacteria. SCFA were
quantified by Ion Exclusion Chromatography. The rats of the treated group were
supplemented with 0.1 g of pulp + 0.4 g of seeds/kg/day during 23 days. The
intestinal inflammation was induced by TNBS on 16th day and the euthanasia was
realized on 24th day. The colon latest 8 cm were removed from the rats for some
antioxidants enzyme analysis, myeloperoxydase activity and interleukin 12 levels.
The results suggest a good anti-inflammatory and antioxidant effect of this DF in
the colon. The non-treated group (2.8 ± 1.2 pmol/mg protein) had the lipid
peroxidation levels increased significantly compared to treated group (1.8 ± 0.6
pmol/mg protein). The non-treated group (35.8 ± 11 U/g protein) also had the
neutrophils and macrophage infiltration increased significantly compared to treated
group (17.6 ± 2.6 U/g protein). And finally, the non-treated group (102.2 ± 42
xvi
pg/mL) had the interleukin 12 levels increased significantly compared to treated
group (45.7 ± 9.2 pg/mL). Thus, pumpkin DF may considered good to help usual
intestinal inflammation therapies.
17
1. INTRODUÇÃO
1.1. DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS (DII)
Retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI) e Doença de Crohn (DC) representam os dois
principais tipos de doença inflamatória intestinal (DII) (Baumgart e Carding, 2007). A RCUI é uma
doença inflamatória não-transmural, restrita ao cólon. Dependendo da extensão anatômica
afetada, os pacientes podem ser classificados como tendo proctite ou pancolite. Já a DC é uma
doença inflamatória transmural da mucosa gastrointestinal, que pode afetar o trato gastrointestinal
(TGI) inteiro. Apresentações típicas incluem envolvimento descontínuo de várias porções do TGI e
o desenvolvimento de complicações incluindo estreitamento, abscessos ou fístulas (Baumgart e
Sandborn, 2007).
Novas evidências experimentais sugerem interação direta do sistema nervoso com o
sistema imune (Baumgart e Carding, 2007). Eventos adversos, estresse crônico e depressão
parecem aumentar a probabilidade de recidiva em pacientes com a doença (Mawdsley e Rampton,
2005). Estresse psicológico foi relacionado ao aumento da atividade da DII. O fumo está associado
à menor freqüência na exacerbação da RCUI. Em contraste, na DC, o fumo agrava o curso da
doença promovendo formação de fístula e estreitamento do intestino (Cosnes, 2004). Os dados
para fumantes passivos são contraditórios: alguns trabalhos mostram redução no risco de RCUI
enquanto outros demonstram que a exposição aumenta os riscos, tanto de RCUI quanto de DC
(Baumgart e Carding, 2007).
A etiologia das DII ainda não foi claramente elucidada, mas sugere-se que seja devido a
uma complexa relação entre fatores genéticos, ambientais, microbianos e imunes (Podolsky,
2002). Mais especificamente, as DII são uma resposta exacerbada do sistema imune da mucosa
do intestino frente aos antígenos luminais, num hospedeiro geneticamente suscetível (Laroux et al.,
2001).
Entre as descobertas associadas às DII estão: o aumento de certos mediadores
inflamatórios, sinais de estresse oxidativo, desarranjo do ambiente cólico, decréscimo da oxidação
dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e aumento da permeabilidade intestinal (Head e
Jurenka, 2003). 1.1.1. EPIDEMIOLOGIA
Na Europa e nos Estados Unidos são 2,2 milhões de pessoas que sofrem de DC e 1,4
milhões que sofrem de RCUI, apesar da incidência começar a estabilizar (Loftus et al., 2004).
Em geral, as taxas mais altas de incidência e prevalência, tanto para DC quanto para RCUI,
são descritos no norte da Europa, Reino Unido e América do Norte. Entretanto, existe uma
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incidência e prevalência crescentes em outras áreas como o sul e centro da Europa, Ásia, África e
América Latina, indicando que as DII têm um processo dinâmico (Loftus et al., 2004).
No Brasil, os dados epidemiológicos são escassos. Souza et al. (2002) estudaram a
evolução da ocorrência das DII num hospital universitário do sudeste do Brasil. A conclusão é de
que há um aumento na freqüência das DII nesse hospital, com tendência da DC ser mais
prevalente que a RCUI. As características demográficas, clínicas e evolutivas dos pacientes foram,
de modo geral, semelhantes às já descritas. Além disso, confirmou-se que manifestações
sistêmicas e a ocorrência de pancolite associaram-se à maior gravidade da RCUI, enquanto que
idades inferiores a 50 anos e o tabagismo associaram-se à taxas mais altas de complicações da
DC.
A freqüência e o tipo da doença são influenciados por uma série de fatores demográficos,
como o gênero, a idade e a etnia.
Parece existir uma leve diferença entre os gêneros na incidência das DII. Em geral,
encontra-se certo predomínio de DC nas mulheres, ainda que nas áreas de baixa incidência seja
mais freqüente nos homens. Este predomínio, especialmente em mulheres no final da
adolescência e início da idade adulta, sugere que os fatores hormonais podem desempenhar um
papel importante na doença. Por outro lado, se existe algum tipo de influência do sexo na RCUI,
parece afetar o homen (Loftus et al., 2000).
Classicamente, na incidência das DII a idade tem uma distribuição bimodal. Há um primeiro
pico de incidência entre a segunda e terceira décadas, seguido de um segundo pico menor das
décadas posteriores (Bjornsson e Johannsson, 2000).
Levando em conta que deve-se interpretar com muita cautela os dados epidemiológicos,
parece claro que as DII são mais freqüentes em indivíduos da raça branca. As DII são incomuns
em indivíduos da raça negra, nos hispano-americanos e asiáticos. Entretanto, é previsível que com
a progressiva aquisição dos hábitos ocidentais por esses grupos, a incidência se aproxime da raça
branca.
1.1.2. FATORES GENÉTICOS
É evidente a contribuição genética nas DII. Parentes de primeiro grau de indivíduos com DII
possuem de 25-50 vezes e de 10-20 vezes mais probabilidade de desenvolver DC e RCUI,
respectivamente, comparados com a população em geral (Zheng et al., 2003).
Pesquisadores identificaram ao menos 7 loci (inflammatory bowel disease 1-7, IBD 1-7) em
cromossomos que se relacionam com genes de susceptibilidade, centrando-se nas mutações dos
19
genes NOD2/CARD15 (intracellular nucleotide oligomerization domain 2/caspase recruitment
domain 15), de MHC II (complexo principal de histocompatibilidade da classe II), de citocinas, de
receptores de citocinas e de moléculas de adesão (Duerr, 2003; Sartor, 2003; Zheng et al., 2003).
Alguns loci têm mostrado ser específicos para RCUI, como o IBD 2 (Bonen e Cho, 2003) ou para
DC, como o IBD 1 (Cho, 2001; Cho, 2003), enquanto que outros conferem uma susceptibilidade
comum a ambas.
Recentemente, novos genes associados à DC foram identificados. O primeiro deles se
encontra no cromossomo 5 e codifica o transportador de cátions orgânicos (OCTN) onde suas
mutações afetam a capacidade dos transportadores para bombear xenobióticos e aminoácidos
através das membranas celulares (Peltekova et al., 2004). No cromossomo 10 encontra-se o
segundo gene que faz parte da família da guanilato quinase, cuja mutação dificulta a manutenção
da polaridade na célula epitelial (Stoll et al., 2004). Ambos os genes podem ser importantes na
permeabilidade epitelial; uma falha na sua função poderia provocar uma exposição inapropriada do
sistema imunitário da mucosa a produtos bacterianos (Peran, 2007).
1.1.3. FATORES AMBIENTAIS
A influência de fatores ambientais no desenvolvimento das DII tornou-se evidente devido ao
grande aumento das incidências tanto de DC quanto de RCUI durante a segunda metade do
século XX, como conseqüência de profundas mudanças no estilo de vida nos países
desenvolvidos. Esse fato fica mais evidente nos países em desenvolvimento que adotaram hábitos
ocidentais. De acordo com a chamada “hipótese da higiene”, tem ocorrido uma mudança do estilo
de vida “sujo” com uma alta exposição a microorganismos para um estilo de vida “limpo” com uma
baixa exposição a esses (Wills-Karp et al., 2001). Mudanças ambientais tais como melhoria no
modo de vida e na alimentação, alimentos e água mais seguros, melhoria na higiene e na saúde, e
o amplo uso de antibióticos têm levado a uma diminuição progressiva das doenças infecciosas.
Porém, paralelamente, têm levado ao aumento de doenças alérgicas e autoimunes, incluindo a DC
e a RCUI, como resultado de um desenvolvimento reduzido do sistema imunitário nos primeiros
anos de vida (Bach, 2002).
A variação na incidência das DII nas populações de mesma etnia que habitam lugares
distintos, junto com a desarmonia existente entre gêmeos monozigóticos, reforça a importância dos
fatores ambientais na patogenia da DII crônica.
São numerosos os fatores ambientais reconhecidos como de risco para as DII: fumo,
fármacos, estresse, microorganismos e alimentação (Danese et al., 2004).
20
Fumo
O melhor exemplo de influência do ambiente nas DII é o tabagismo. O tabaco apresenta um
efeito inverso na DC e na RCUI, sustentando a idéia de que são distintos os mecanismos em cada
forma de DII (Thomas et al., 1998). O tabaco é fator de risco importante para a DC, aumentando a
freqüência de recidivas e a necessidade de cirurgia. A interrupção do consumo melhora os
sintomas da doença (Rubin e Hanauer, 2000). Ao contrário, o abandono do cigarro, em pacientes
portadores de RCUI, aumenta o risco de incidência da doença; isto sugere um papel protetor do
tabaco na doença (Bridger et al., 2002).
Os mecanismos de ação do tabaco na DC e na RCUI ainda não são claros, apesar de estar
comprovado que o cigarro afeta tanto a imunidade sistêmica, quanto a da mucosa intestinal,
alterando numerosas funções imunológicas inatas e adaptativas (Sopori, 2002): altera a relação
entre células T helper e T supressoras, reduz a proliferação das células T, modula a apoptose e
diminui significativamente os níveis de imunoglobulinas no soro e mucosas. Além disso, provoca
um aumento na produção cólica de muco (Cope et al., 1986), alteração no fluxo sanguíneo
(Srivastava et al., 1990) e, como a nicotina, uma redução da motilidade cólica (Coulie et al., 2001).
Sabe-se que o consumo do tabaco pode gerar aproximadamente 4000 compostos;
podendo ser qualquer um deles o responsável pela gênese ou manutenção da doença, apesar da
nicotina ser, provavelmente, o agente ativo mais importante. Nesse aspecto, a nicotina
transdérmica mostra um efeito benéfico em pacientes com RCUI (Guslandi e Tittobello, 1996;
Pullan et al., 1994). Em modelos experimentais distintos de colite, a administração de nicotina
melhora o processo inflamatório, coincidindo com a diminuição local das concentrações de várias
citocinas pró-inflamatórias (Agrawal e Rhodes, 2003).
Fármacos
Os contraceptivos orais e os antiinflamatórios não esteroidais (AINE) são os dois principais
grupos de fármacos que têm sido estudados acerca da possível relação uso-desenvolvimento da
doença.
Mulheres que utilizam contraceptivos orais apresentam uma pior evolução clínica nas DII.
Considerando o estado de hipercoagulação presente na DII ativa, o uso concomitante de
contraceptivos orais pode agravar o risco de processos tromboembólicos, ainda que faltem dados
relacionando esses fatores. (Alstead, 1999). Entretanto, não se podem descartar outros
mecanismos imunomoduladores, como os relacionados com o fator de transcrição NFκB (Evans et
al., 2001). Os contraceptivos orais de baixas doses parecem não afetar, significativamente, a
atividade clínica da enfermidade, pelo menos na DC (Alstead, 1999).
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Os AINE estão entre os medicamentos mais prescritos devido às propriedades
antiinflamatória e analgésica. Entretanto, seu uso está associado com o alto risco de lesões na
mucosa gastrointestinal e complicações associadas (Wolfe et al., 1999). A descoberta de que a
enzima ciclooxigenase 2 (COX-2) é a isoforma primária no sítio de inflamação, levou a hipótese de
que a inibição dessa isoforma poderia ser a base terapêutica dos AINE como agentes
antiinflamatórios (Jackson e Hawkey, 2000).
Evidências indicam que a idéia da enzima ciclooxigenase 1 (COX-1) ser constitutiva e a
COX-2 ser induzida é simplista. Na realidade, ambas as COX são constitutivas e também
induzíveis na inflamação e na citoproteção (Halter et al., 2001). Dois estudos com ratos mostram
que, apesar dos inibidores seletivos de COX-1 ou COX-2 não serem ulcerogênicos, a inibição
combinada da COX-1 e da COX-2 induz graves lesões no estômago e no intestino delgado,
sugerindo uma importante contribuição da COX-2 na manutenção da integridade da mucosa
intestinal (Wallace et al., 2000; Tanaka et al., 2002). Além disso, inibidores da COX parecem ser
lesivos durante a cicatrização da úlcera (Halter et al., 2001); a indometacina e o diclofenaco
atrasam a cicatrização da úlcera, tanto na experimentação animal quanto em humanos
(Schmassman, 1998).
Os impactos da inibição da COX-2 em modelos animais são controversos (Cipolla et al.,
2002). Sabendo do papel central dos eicosanóides na manutenção do processo inflamatório,
Karmeli et al. (2000) demonstraram que inibidores da COX-2 têm efeito benéfico na colite
experimental em ratos, agindo na redução da formação de eicosanóides no cólon. Em contraste,
Reuter et al. (1996) demonstraram que a inibição do COX-2 pode resultar na exacerbação da
inflamação do cólon, concordando com o efeito lesivo dos AINE na úlcera gástrica.
Estresse
Na década de 50, as DII eram consideradas doenças psicossomáticas (Engel et al., 1969).
Hoje, sabe-se que estresse crônico e depressão podem causar a recidiva dessas doenças. Assim
como em humanos, alguns animais podem desenvolver DII em condições de estresse crônico. Os
“cotton-top tamarins”, primatas que vivem na América do Sul, podem desenvolver colite quando
submetidos a estresse crônico por estar no cativeiro. A remissão é induzida retornando ao habitat
natural (Wood et al., 2000).
Estresse experimental em animais aumenta a permeabilidade intestinal da mucosa e altera
a interação bactéria-hospedeiro. Essas mudanças parecem contribuir para a inflamação da mucosa
intestinal, além de corroborar a hipótese de que a inflamação é coordenada pela flora da mucosa
(Elson, 2002). O estresse pode ativar o Sistema Nervoso Entérico, que liberará neurotransmissores
como o fator liberador de corticotrofina (CRF) e substância P (SP). Estes liberam mediadores de
22
mastócitos (histamina e interleucina-8) e levam ao aumento da aderência bacteriana, o que pode
sensibilizar as células T; a produção de interferon gama (IFN-γ) e fator alfa de necrose tumoral
(TNF-α) pode desencadear a inflamação (Mawdsley e Rampton 2005). O CRF e a SP podem,
ainda, agravar os sintomas das DII através do aumento da motilidade cólica, secreção de água,
íons e muco. A SP é capaz de afetar linfócitos, macrófagos, neutrófilos e outras células
inflamatórias (Mayer, 2000).
Mittermaier et al. (2004) relataram que pacientes com remissão das DII tinham grandes
chances de ter recidivas nos 18 meses seguintes devido à depressão.
Fatores microbianos
Durante muito tempo procurou-se estabelecer uma relação entre um agente infeccioso
específico e DII, mas sem resultados satisfatórios. Atualmente, a flora intestinal comensal recebe
sua devida importância no desenvolvimento dessas doenças.
Os agentes infecciosos específicos, do tipo microbiano, sugeridos como sendo
responsáveis pela DC e RCUI são muitos: Listeria monocytogenes, Chlamydia tracomatis,
Escherichia coli, Mycobacterium paratuberculosis. O papel etiológico desta última na DC tem sido
de grande controvérsia, já que essa bactéria é o agente causador da Doença de Johne, uma ileíte
granulomatosa crônica em ruminantes que se assemelha à DC (Chiodini et al., 1984).
Antes do nascimento, o TGI do bebê é estéril, mas durante o trabalho de parto natural
ocorre a primeira exposição microbiana pela flora fecal e vaginal da mãe. Durante os meses após o
nascimento, estabelece-se uma flora comensal estável (Fanaro et al., 2003).
A microflora intestinal cria uma relação simbiótica com as células epiteliais da mucosa. No
intestino, as bactérias beneficiam-se do fluxo constante de nutrientes e da temperatura estável. Do
mesmo modo, o hospedeiro beneficia-se das bactérias pela capacidade de sintetizar vitamina K,
obter energia dos nutrientes não absorvidos, sob a forma de AGCC, inibir o crescimento de
patógenos e manter a integridade e a homeostase imunológica da mucosa. Estudos em animais
SPF revelam que a ausência da microflora intestinal provoca alterações significativas na estrutura
e função intestinal, como redução dos vilos e da densidade das placas de Peyer, criptas pouco
profundas (Maeda et al., 2001) e uma estimulação da migração de complexos motores (Husebye et
al., 2001).
Na sua convivência com as bactérias, os vertebrados desenvolvem receptores de
reconhecimento de indicadores específicos de bactérias, fungos e vírus que não se encontram nos
eucariotos. Esses indicadores podem ser o lipopolissacarídeo, o peptideoglicano ou as flagelinas.
Dentre os receptores estão os toll-like receptor (TLR) e os NOD, que são imprescindíveis para o
início da resposta inflamatória inata e cuja ativação gera uma cascata de sinalização que leva a
produção de citocinas pró-inflamatórias. As cascatas de sinalização de TRL proporcionam uma
23
união entre a resposta inflamatória inata e adaptativa, já que a primeira leva à maturação de
células dendríticas, as quais ativam a resposta imunológica adaptativa (Medzhitov, 2001). Apesar
da estimulação desses eventos levar à produção das citocinas pró-inflamatórias, tais eventos são
essenciais na adaptação das bactérias intestinais e na manutenção da homeostase do hospedeiro
(Sansonetti, 2004). Uma das principais características da flora comensal é que ela não atravessa a
barreira epitelial; se por acaso alguma bactéria atravessá-la, ela é rapidamente fagocitada através
da resposta imunológica inata (Macpherson et al., 2000).
Atualmente, sabe-se que as bactérias intestinais influem tanto no início quanto na
perpetuação das DII. A teoria aceita, até o momento, é de que o desenvolvimento das DII envolve
uma resposta imunitária exacerbada pela microflora comensal em indivíduos geneticamente
susceptíveis (Bamias et al., 2005). Essa hipótese é sustentada por observações distintas: a área
de inflamação é maior onde há maior densidade de bactérias intestinais; o uso de antibióticos
melhora a inflamação crônica e a cirurgia que desvia o fluxo fecal pode prevenir a recidiva da DC.
Além disso, observa-se que nas DII há presença de bactérias aderentes com capacidade de
penetrar na mucosa, como Bacteroides sp, Escherichia coli e Enterobacterium (Swidsinski et al.,
2002; Seksik et al., 2003).
Fatores alimentares
Dado que as DII são doenças digestivas, é evidente a possibilidade de haver produtos da
alimentação envolvidos em sua patogenia. Entretanto, os dados objetivos são escassos,
principalmente porque proporcionam apenas uma evidência indireta da possível relação causa-
efeito entre fatores alimentares específicos e DII. Tem-se sugerido que na DC, certos alimentos
poderiam atuar como antígenos, com um efeito desencadeante da sintomatologia. Nesse sentido,
têm-se utilizado, com fins terapêuticos, dietas de exclusão, onde os pacientes excluem os
possíveis desencadeadores. Essa opção terapêutica mostrou efeitos positivos numa pequena
porcentagem dos doentes (Jones et al., 1985); entretanto, não foi comprovado que a reintrodução
destes alimentos leve à remissão da doença. Levando em conta que a maior incidência de DII
possa estar associada com mudanças nos hábitos de vida, incluindo os alimentos, e que o
intestino é a principal localização do processo inflamatório, seria muito provável que alguns
nutrientes presentes na luz intestinal pudessem atuar como antígenos, os quais poderiam interferir
nos processos imunitários e reparadores da mucosa intestinal. Um estudo, no qual determinou-se o
fluxo de sangue retal e a proliferação de linfócitos após a exposição a alimentos específicos,
demonstrou sensibilização a alguns antígenos alimentares em pacientes com DC (Van Den
Bogaerde et al., 2002).
24
1.2. TERAPÊUTICA ATUAL E PERSPECTIVAS
Diversos medicamentos são utilizados de forma limitada no tratamento das DII. Entre as
substâncias mais estudadas, destacam-se os derivados dos salicilatos (Seibold, 2003), os
corticosteróides (Katz, 2004), os imunossupressores (Sandborn e Feagan, 2004) e, mais
recentemente, terapias anti-TNF-α (Van Assche et al., 2005). No entanto, essas drogas
apresentam vários efeitos colaterais, têm custo elevado, além de isoladamente não serem eficazes
para todos os parâmetros da doença até agora estudados (Jafri e Pasricha, 2003).
O tratamento deve começar pelo diagnóstico preciso. Este depende do conjunto de dados
obtidos do histórico clínico e dos exames (físico, endoscópico, radiológico, histológico e
laboratorial). O resultado desta investigação permite distinguir a DC de RCUI; entretanto, em
aproximadamente 10% dos pacientes, pelo menos inicialmente, isto não é possível (Podolsky
2002). Marcadores sorológicos podem auxiliar no diagnóstico daqueles doentes para os quais os
critérios habituais não foram suficientes (Biondo-Simões et al., 2003).
O manejo das DII dependerá da gravidade, da extensão e do local envolvido. A dieta
elementar tem sido sugerida como tratamento inicial, porém, a adesão dos pacientes é baixa, além
do que é de alto custo, o que a torna inviável para a maioria dos doentes (Griffiths et al., 1995).
Uma dieta elementar, por definição, contém aminoácidos, glicose e uma pequena quantidade de
ácidos graxos essenciais. Não possui sacarose, maltose, frutose, polissacarídeos, peptídeos, nem
proteínas. Essa dieta surgiu na década de 70, junto com a viagem à Lua. A pessoa se alimenta
somente do elemento mais simples do nutriente e não ficam resíduos; portanto, o bolo fecal não é
produzido (ABCD, 2008). Um grande número de drogas que atuam como antiinflamatórios gerais
ou seletivos têm sido empregados, atingindo-se a remissão das crises, mas não a cura da doença
(Biondo-Simões et al., 2003). O tratamento cirúrgico é reservado para as complicações da DC ou
quando os sintomas graves persistem mesmo após tratamento intensivo com drogas
antiinflamatórias ou imunossupressoras (Biondo-Simões et al., 2003).
Terapia convencional
Ácido 5-aminosalicílico (5-ASA)
Tem boa atividade nos pacientes portadores da doença com atividade moderada de RCUI e
de DC. Estudos demonstraram que o 5-ASA é funcionalmente ativo, bloqueando a produção de
prostaglandinas e leucotrienos, inibindo o peptídeo bacteriano capaz de induzir a quimiotaxia dos
neutrófilos e a secreção de adenosina induzida, que retira os metabólitos reativos do oxigênio e,
talvez, inibindo a ativação do NFκB (Podolsky, 2002).
Nos últimos 15 anos uma variedade de novos compostos de 5-aminosalicilatos tem sido
avaliada. Em geral, compostos de 5-aminosalicilatos podem ser selecionados com base na
25
localização da doença. Para pacientes com doença cólica distal, supositórios ou enemas podem
ser úteis; compostos orais com 5-ASA são apropriados para doença cólica proximal. Estes incluem
sulfasalazina, olsalazina e, mais recentemente, a balsalazida. Formulações tópicas podem ser
usadas sozinhas ou em combinação com formulações orais, quando a doença é limitada ao cólon
descendente. Formulações orais, de liberação lenta ou pH dependentes, podem fornecer
concentrações terapêuticas para o cólon proximal ou íleo distal. Assim, comprimidos, revestidos de
eudragit liberam a mesalamina em pH acima de 7, no íleo ou no ceco (Asacol). Formulações com
revestimento de etilcelulose permitem a absorção da água. A água dissolve o 5-ASA que se
difunde para fora do comprimido e penetra na luz intestinal. A olsalazina é constituída por 2
moléculas de 5-ASA unidas por um elo azo que utiliza o princípio da redutase bacteriana azo para
fracionar a molécula em dois componentes idênticos (Biondo-Simões et al., 2003).
O tratamento de manutenção com 5-ASA pode ser efetivo para manter a remissão da RCUI
(Biondo-Simões et al., 2003).
Corticosteróides
Corticosteróides têm sido empregados quando o 5-ASA não mostra eficácia. Eles,
provavelmente, agem pelas mesmas propriedades funcionais relativas dos processos inflamatórios.
Parecem controlar a doença de uma maneira complexa que pode incluir a modulação da
fosfolipase A, interleucina 1 (IL-1), TNF-α (Bauditz et al., 2002), moléculas-1 de aderência aos
leucócitos endoteliais (ELAM-1) e de aderência intercelular (ICAM-1), além da lise dos linfócitos e
dos eosinófilos. O uso tópico de corticosteróides, como enemas de hidrocortisona, pode ser
indicado como alternativa ao 5-ASA para doentes como proctite ulcerativa ou colite ulcerativa
distal. Prednisona ou prednisolona oral são usadas com moderação em colites severas, 60 a 80
mg/dia, sendo a administração intravenosa reservada para pacientes graves que requerem
hospitalização (Podolsky, 2002). Cuidados especiais devem ser tomados no uso prolongado de
corticosteróides, pois não é infreqüente o aparecimento de hipertensão arterial, diabetes e
osteoporose (Síndrome de Cushing) (Rang et al., 2004).
Agentes imunossupressores e imunorreguladores
O papel dos imunomoduladores no tratamento de pacientes com DII torna-se cada vez mais
importante; são geralmente úteis quando a dose de corticosteróide não pode ser diminuída ou
descontinuada. Estas drogas, da mesma forma que os corticosteróides, expõem os doentes ao
risco de infecção oportunista.
A Azatioprina e seu metabólito ativo 6-mercaptopurina têm sido usados como agentes
imunossupressores para pacientes com DII, apesar dos riscos aumentados para linfoma (Lewis et
al., 2001). Estudos clínicos têm demonstrado que este agente é eficiente para manter a remissão,
mas não é efetivo no controle dos casos agudos. Entre os efeitos colaterais da azatioprina relata-
se a supressão medular; portanto, a contagem dos leucócitos dos pacientes tratados deve ser
26
rigorosamente monitorada. O mecanismo de ação da azatioprina permanece desconhecido, mas
pode-se incluir a supressão da geração específica de células T. O que se sabe é que esta droga é
análoga à purina, e que ela inibe competitivamente a biossíntese dos nucleotídeos da purina.
Fraser et al. (2002 a) concluíram que a azatioprina é um tratamento efetivo tanto para DC quanto
para RCUI e que sua eficácia é razoavelmente bem sustentada por no mínimo cinco anos com
toxicidade mínima, sem óbitos por sepsis devido à neutropenia.
O Metotrexato, antagonista do ácido fólico, tem sido usado para DC, mostrando-se menos
útil para a RCUI. O mecanismo de ação parece ser a inibição da IL-1 através do mimetismo
molecular com diidrofolato redutase. Fraser et al. (2002 b) reviram 70 pacientes, 48 com DC e 22
com RCUI. A duração média do tratamento foi de 17 semanas e a dose média usada foi de 20
mg/semana. A remissão aconteceu em 34 dos 55 pacientes que completaram 3 meses de
tratamento (62%). Após 1 ano do final do tratamento, apenas 12% dos pacientes mostravam-se
assintomáticos.
A Ciclosporina pode ser efetiva no tratamento de RCUI severas, em pacientes
hospitalizados que necessitam de proctocolectomia. Age, provavelmente, pelo bloqueio da
ativação dos linfócitos. O mecanismo de ação parece ser a transcrição inibida de IL-2 e de seu
receptor nos linfócitos T auxiliares e a produção de fatores que ativam as células B e de IFN-γ
pelas células T auxiliares. Altas doses podem controlar da doença. A ciclosporina é indicada
quando a terapia com altas doses de corticosteróides não alcançou resultado; é usualmente
administrada por 7 a 10 dias por via intravenosa, na dose de 4 mg/kg/dia, e depois por via oral
(McCormack et al., 2002). Os efeitos adversos associados à ciclosporina incluem hipertensão,
nefrotoxicidade, tremores, hiperplasia gengival, hirsutismo, disfunção hepática (rara) e crises
convulsivas.
Anticorpos monoclonais (AM) são uma recente e promissora opção terapêutica para as DII.
São anticorpos específicos produzidos por ratos imunizados e derivados de um único clone de
célula B, inicialmente produzido pela fusão de uma célula B com uma célula linfomatosa. Para
reduzir eventuais episódios alérgicos em humanos, esses AM forma submetidos à tecnologia
recombinante, tornando-se menos imunogênicos (Drewe e Powell, 2002). Uma opção terapêutica,
já aprovada por órgãos competentes, é o Infliximab (Remicade®). Apesar dos resultados
encorajadores na DC, seu uso pode ter efeitos colaterais como reações alérgicas agudas às
infusões, reação de hipersensibilidade retardada com mialgia, artralgia, rash cutâneo e febre.
Numa reexposição à droga, após 2-4 anos, aparecem doenças linfoproliferativas, além de uma
suspeita da relação do Infliximab com lupus e tuberculose extrapulmonar. Embora o uso do
Infliximab se mostre interessante para os doentes portadores de DC, seu uso para os portadores
de RCUI permanece incerto. Além do Infliximab, há o Adalimumab, que foi aprovado recentemente
pelo Food and Drug Administration (FDA) por induzir e manter a remissão da DC moderada a
27
severa em adultos, incluindo aqueles intolerantes e com perda de resposta ao Infliximab (Noble et
al., 2008).
Terapias em fase experimental
Citocinas e Anticitocinas
O termo citocina é um termo genérico e abrangente, que se refere, em geral, a mediadores
protéicos ou peptídicos liberados por células do sistema imune. Foram identificadas mais de 100
citocinas; a superfamília das citocinas inclui as interleucinas, as quimiocinas, os interferons, os
fatores de estimulação de colônias, os fatores de crescimento e de necrose tumoral (Rang et al.,
2004). Além das ações diretas sobre as células, algumas citocinas induzem a formação de outras
citocinas (constituindo uma cascata de amplificação), enquanto algumas induzem os receptores de
outras citocinas e outras ainda apresentam interações sinérgicas ou antagônicas com outras
citocinas. As citocinas foram comparadas a uma complexa linguagem de sinalização, sendo a
resposta final de uma célula particular determinada por certo número de mensagens diferentes
recebidas, de modo concomitante, na superfície da célula (Rang et al., 2004).
As citocinas da fase efetora incluem peptídeos pró-inflamatórios e antiinflamatórios.
Citocinas pró-inflamatórias participam de reações inflamatórias agudas e crônicas, bem como nos
processos de reparo. As citocinas pró-inflamatórias primárias incluem o TNF-α e a IL-1. São
liberadas por macrófagos e por outras células, podendo desencadear uma cascata de citocinas
secundárias entre as quais destacam-se as quimiocinas. Vários fatores de crescimento são
importantes no processo de reparo e estão implicados na inflamação crônica. As citocinas
antiinflamatórias, por sua vez, inibem aspectos da reação inflamatória, incluindo TGF-β, IL-4, IL-10
e IL-13. Essas citocinas podem inibir a produção de quimiocinas, e as últimas três têm a
capacidade de inibir respostas mediadas por células Th1, isto é, as células cuja ativação
inapropriada está envolvida em diversas doenças (Rang et al., 2004).
Segundo Biondo-Simões et al. (2003), de modo geral, há quatro meios principais para
reduzir o efeito de uma citocina:
1o) bloqueio da produção → ciclosporina e tacrolimos interferem na transcrição do gene da
IL-2;
2o) inibição do processo intracelular que produz a proteína ativa → peptídeos metilcetonas
que inibem a enzima de conversão da IL-1β/ácido hidroxâmico, inibindo a liberação proteolítica de
TNFα ligado à célula;
3o) neutralização da citocina na circulação → anticorpos; receptores solúveis; e
4o) bloqueio de receptor → anticorpos; receptores antagônicos
As citocinas e outras substâncias mais utilizadas terapeuticamente são: proteína
antagonista do receptor da Interleucina-1 (IL-1ra) (Henderson, 1997), IL-10 (Steidler et al. 2000;
28
Rogler e Andus, 2004), IL-11 (Greenwood-Van et al., 2000), talidomida (Bauditz et al., 2000), IL-18
(Sivakumar et al., 2002) e 1,25-Diidroxicolecalciferol (Cantorna et al., 2000).
Antioxidantes
Estudo em humanos analisou a influência de três antioxidantes (hidroxianisol butilado,
tetrahidropapaverolina e ácido nordihidroguaiarético) na inibição de TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8;
Destaca-se que o efeito inibidor de citocinas pelos antioxidantes parece mais pronunciado na RCUI
que na DC (Reimund et al., 1998).
A atividade farmacológica proposta é relevante considerando-se que o oxigênio é essencial
para a vida, mas também pode causar danos celulares graves. Isto é conhecido como “paradoxo
do oxigênio”. A redução do oxigênio nos tecidos biológicos produz um elevado número de radicais
livres, muito reativos, conhecidos como Espécies Reativas de Oxigênio (ERO). As ERO são
resultantes de um metabolismo incompleto do oxigênio molecular (O2), gerando ânion superóxido
(O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (OH•), por possuírem um elétron não pareado
na última camada de valência. Por serem extremamente reativas as ERO atacam moléculas
biológicas levando a danos celulares como peroxidação lipídica, degradação de proteínas, quebra
do DNA e até morte celular. Para controle do processo de ataque oxidativo o organismo possui
sistemas de defesa como as enzimas superóxido dismutase, peroxidases e catalase (Thomas,
2000).
Outra fonte de radicais livres é o processo inflamatório. Quando ocorre uma agressão a um
determinado tecido, há produção de agentes quimiotáxicos como prostaglandinas, leucotrienos,
tromboxanos, produtos bacterianos e virais. Esses agentes quimiotáxicos atraem células
fagocitárias que reduzem O2 a O2-, no processo inflamatório, por ação da NADPH oxidase; o
objetivo é a destruição dos agentes invasores (Conner e Grishan, 1996). Experimentalmente, há
processos inflamatórios típicos que ocorrem no TGI que são geradores de radicais livres (como o
ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxil). Bons exemplos são as colites
experimentais, ulcerações intestinais em geral e danos à mucosa gástrica em modelos de úlcera
experimental como aqueles induzidos por estresse, etanol, AINE, isquemia-reperfusão. Isto foi
comprovado através da administração de superóxido dismutase, catalase, vitamina C ou outros
antioxidantes, causando uma diminuição no Índice de Lesão Ulcerativa (Das e Banerjee, 1993).
Fibras
Estudos mais recentes têm utilizado suplementação de fibras alimentares e polissacarídeos
não-digeríveis, no tratamento e controle das DII como alternativas terapêuticas (Hallert et al.,
2003). Essas substâncias apresentam propriedades e efeitos fisiológicos importantes no TGI, como
produção de AGCC necessários para manutenção da função normal dos colonócitos (Galvez et al.,
2005). Rodríguez-Cabezas et al. (2003) relataram o efeito antiinflamatório das sementes de
Plantago ovata na inflamação intestinal
29
1.3. FIBRAS ALIMENTARES
Fibras alimentares (FA) são substâncias vegetais que resistem à hidrólise pelas enzimas
digestivas do intestino. É um grupo muito complexo de substâncias que incluem polissacarídeos
não amiláceos, amido resistente (que não é digerido no intestino delgado), celulose e
hemicelulose, oligossacarídeos, pectinas, ligninas, gomas e ceras (James et al., 2003). São
indigeríveis no intestino delgado e finalmente alcançam o cólon, onde são utilizadas pela microflora
do intestino como substrato para fermentação (Mortensen e Clausen, 1996; Velázquez et al.,
1997).
O grau de fermentação das FA no intestino grosso varia enormemente. Por exemplo,
pectinas, mucilagens e gomas parecem ser completamente fermentadas, enquanto que a celulose
o é apenas parcialmente. A fermentação é o processo pelo qual a molécula sofre a ação das
enzimas bacterianas, sendo parcial ou completamente degradada no intestino grosso, em
condições anaeróbicas. A ação bacteriana é mais intensa no intestino grosso, que possui cerca de
1011 microorganismos por grama de bolo fecal. Esses microorganismos contribuem para a
formação de gases (H2, O2, CO2, CH4 e NH3), ácidos (lático, acético) e AGCC (Campbell et al.,
1997), principalmente acetato, propionato e butirato. Dentre os AGCC, o butirato é a principal fonte
de energia dos colonócitos, diferentemente de outras células (Ahmad et al., 2000). Desta forma,
uma maior disponibilidade destes ácidos graxos poderia melhorar a integridade da mucosa do
cólon e, com isso, contribuir para a redução da inflamação (Kanauchi et al., 1998).
Os AGCC são formados da seguinte maneira: hexoses são clivadas a piruvato, que é
reduzido, dando origem a propionato ou convertido a acetil-CoA, num processo que gera NADH. A
acetil-CoA pode então, ser reduzida formando butirato ou hidrolizada originando acetato. O acetato
é quantitativamente o mais importante produto endógeno da fermentação de polissacarídeos.
Apesar de todos os polissacarídeos produzirem acetato como principal produto endógeno, há
diferenças na razão propionato/butirato, in vitro.
As FA possuem ainda propriedade de se ligar com a água, aumentando o volume e a
viscosidade do conteúdo intestinal, sendo responsáveis pelo aumento do volume das fezes,
melhora da motilidade intestinal e diminuição do tempo de trânsito (Mortensen e Clausen, 1996;
Velázquez et al., 1997). Essa propriedade é relevante e advém da presença de açúcares com
grupamentos polares livres. As pectinas, as mucilagens e, em menor extensão, as hemiceluloses,
juntas, apresentam uma grande capacidade de retenção hídrica. A hidratação das moléculas
resulta na formação de uma matriz tipo gel, a qual pode conduzir a uma maior viscosidade do
conteúdo do intestino delgado e apresentar, então, efeitos críticos na absorção de nutrientes.
Presumivelmente, esta absorção é retardada pela difusão desses nutrientes hidrossolúveis na
matriz gelatinosa e pelo aumento da viscosidade do conteúdo intestinal (Eastwood e Morris, 1992).
30
Ácidos biliares, colesterol e alguns compostos tóxicos são adsorvidos, especialmente, pelas
pectinas e outros polissacarídeos ácidos. A adsorção de ácidos biliares por polissacarídeos pode
ser medida in vivo através da excreção fecal desses ácidos e de esteróides neutros. Essa
característica está correlacionada ao efeito hipocolesterolemiante de certos polissacarídeos não-
celulósicos, como pectinas e goma guar. A capacidade desses polissacarídeos em captar/adsorver
potenciais agentes carcinogênicos tem sido proposta como um dos mecanismos protetores contra
câncer de cólon e reto (Eastwood e Morris, 1992).
O uso das FA como tratamento e estratégia preventiva nas DII é bastante atrativo por
inúmeros motivos científicos e sociais. Porém, algumas dificuldades enfrentadas são a
heterogeneidade das FA, o desconhecimento da dose ótima e a duração do tratamento. A maioria
dos estudos necessita de parâmetros de comparação entre os tipos de fibras e de métodos para
determinar a contribuição da ingestão dessas fibras (James et al., 2003).
Assim, as fibras alimentares, têm sido sugeridas como moduladoras e positivas na
composição da microflora intestinal através dos AGCC (Steer et al., 2000). Prebióticos são
ingredientes não digestíveis que estimulam crescimento e/ou atividade de um limitado número de
microorganismos capazes de proporcionar um ambiente intestinal saudável ao hospedeiro (Gibson
e Roberfroid, 1995). Os probióticos, por sua vez, são microorganismos vivos que, administrados
em dose adequada, conferem ao hospedeiro benefícios à sua saúde (FAO/WHO-Food and
Agriculture Organization and World Health Organization, 2002).
A dieta proposta é uma combinação de fibras solúveis (FS), que produzem AGCC e
insolúveis (FI), que levam esses ácidos até a região final do intestino, onde se dá a inflamação.
(Figura 1).
31
Esquema 1 - Efeito das fibras solúveis, insolúveis e a combinação delas no trato gastrointestinal (James et
al., 2003).
Fibra solúvel Fibra insolúvel
Fibra solúvel + insolúvel
Diminui o esvaziamento gástrico
Estômago
Intestino Delgado
↓ tempo de trânsito
↓ absorção de nutrientes
↓ reabsorção dos ácidos biliares
Cólon Proximal
fermentação
↑↑ bactérias Fermentação deficiente
↑ absorção da água
↓ tempo de trânsito
efeito “mop and sponge”
↑↑↑↑ VOLUME
GÁS
Cólon Distal
↑↑↑↑ VOLUME ↓↓↓↓ TRÂNSITO
LIMPEZA E ABSORÇÃO
↑ absorção da água
↓ tempo de trânsito
GÁS
fermentação por todo
o cólon
↑↑ bactérias efeito “mop and sponge”
↑↑↑↑VOLUME ↓↓↓↓TRÂNSITO
↓↓↓↓pH, ↑↑↑↑ AGCC ↓↓↓↓FENÓIS
LIMPEZA E ABSORÇÃO
Goma guar, farelo de aveia, pectina, Psyllium, legumes,
mucilagens, amido resistente
Sterculia (goma karaya), lignina, metilcelulose,
farelo de trigo
Fibras na dieta balanceada, farelo de trigo + amido resistente,
farelo de cevada, Psyllium + amido resistente
32
1.3.1. ESPÉCIE ESTUDADA
A Abóbora é pertencente à família das Cucurbitaceae, gênero Cucurbita (Figura 2). Foram
domesticadas pelos povos pré-hispânicos há cerca de 9.000 anos, nas civilizações Inca, Asteca e
Maia. O interessante é que todas as partes da planta são utilizadas para o consumo, incluindo
folhas e flores. Devido ao cruzamento entre as diversas espécies, intencionalmente ou não, a
identificação das espécies não recebe o seu devido valor.
A abóbora utilizada nesse trabalho é conhecida popularmente como abóbora kabotya ou
abóbora japonesa. Ela é um fruto rico em vitamina A, fornece vitaminas do complexo B, cálcio e
fósforo. O fruto cru possui 1,1 g de fibras totais/100 g de abóbora (Spiller, 1993).
Figura 1 - Abóbora (Cucurbita sp).
Polpa, sementes e folhas são indicadas popularmente para erisipela, febres, dores e
inflamações em geral, queimaduras, verminoses, anemia, cegueira noturna, náuseas, vômitos,
seborréia e acne. Possui propriedades anti-helmíntica (Guarrera, 1999), hipoglicêmica (Alarcon-
Aguilar et al., 2002), antiinflamatória e anticâncer (Jayaprakasam et al., 2003).
Nesse tipo de pesquisa o interesse relaciona-se à necessidade da descoberta de novas
substâncias de origem natural com ação comprovada e pouca toxicidade para os humanos. Nesse
sentido, o uso popular de algumas plantas, freqüentemente consolidado por uma longa tradição,
pode fornecer diretrizes e indicações úteis para possíveis aplicações, as quais podem ser
posteriormente confirmadas por testes químicos e farmacológicos (Guarrera, 1999).
1.4. CROMATOGRAFIA DE ÍONS (CI)
A cromatografia de exclusão de íons (CEI) é uma variante da cromatografia de íons (CI), a
qual, por sua vez, é um tipo de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Na CEI, o sinal da
33
carga elétrica dos grupos funcionais dissociados da resina de troca iônica é o mesmo dos
compostos iônicos analisados. Isto significa que analitos carregados negativamente (por exemplo,
compostos ácidos dissociados) são separados usando resinas de troca catiônica, as quais
apresentam grupos trocadores aniônicos (ácidos sulfônicos). Similarmente, analitos carregados
positivamente (bases) são separados usando resinas de troca aniônica, as quais contêm grupos
trocadores catiônicos (tetralquilamônio). As fases estacionárias empregadas em CEI também
podem ser usadas em procedimentos convencionais de cromatografia de troca iônica (Glód, 1997).
O mecanismo de retenção, que ocorre no processo de exclusão de íons, foi descrito por
Haddad e Jackson (1990) e por Glód (1994). Moléculas neutras e não dissociadas penetram na
resina, enquanto os co-íons são repelidos pela presença de grupos funcionais dissociados
imobilizados na fase estacionária. Por analogia ao equilíbrio da membrana de Donnan, a resina
hidratada se comporta como uma membrana semi-permeável entre as fases móvel e estacionária.
Com exceção dos grupos funcionais ligados covalentemente, todas as outras espécies são
livremente trocadas através dessa membrana hipotética.
A exclusão de íons, raramente, é o único mecanismo de retenção, mesmo em resinas de
exclusão iônica. A CEI, assim como outros métodos cromatográficos, é classificada de acordo com
os mecanismos primários de retenção do soluto. Além disso, a exclusão de íons permite a
adsorção hidrofóbica na resina (assim como na cromatografia de fase reversa), exclusão por
tamanho, efeito da seleção do grupo funcional na amostra analisada, retenção da fase normal,
interação de van der Waals e interações polares dos compostos da amostra com o suporte (Glód,
1997).
Nadkarni e Brewer (1987) relataram o uso do detector condutimétrico, quimicamente
suprimido na CEI, para determinar ácidos graxos voláteis e não voláteis, em amostras aquosas
com limite de detecção abaixo de 1 ppm.
A CEI, com supressão química e detecção condutimétrica, foi o método escolhido para a
quantificação dos AGCC neste trabalho. Tal escolha deve-se ao caráter aquoso das amostras, já
que este é um inconveniente para o uso de cromatografia gasosa, por exemplo.
34
2. OBJETIVOS
Geral
Desenvolver uma combinação de fibras alimentares de abóbora e avaliá-la na inflamação
intestinal induzida por TNBS.
Específicos
a) Quantificar a produção dos AGCC produzidos in vitro, principalmente butirato, a partir de
diferentes combinações de polpa e semente de abóbora;
b) Suplementar ratos com a mistura que mais produziu butirato para observar seu possível
efeito protetor na inflamação intestinal induzida por TNBS;
c) Analisar as lesões, algumas enzimas antioxidantes (GSH, GPx e GR), atividade da
mieloperoxidase, peroxidação lipídica e interleucina-12 das porções cólicas dos animais
submetidos à inflamação por TNBS.
35
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. FIBRAS
A abóbora, proveniente de cultivo orgânico, foi lavada e descascada. A polpa e as
sementes foram secas em estufa à 40oC e trituradas no moinho de facas (Figura 3).
Figura 2 - Processamento da abóbora.
3.2. TESTE IN VITRO
Na etapa in vitro, as proporções de polpa/semente utilizadas foram: 0,5 g polpa; 0,4 g polpa
+ 0,1 g semente; 0,3 g polpa + 0,2 g semente; 0,25 g polpa + 0,25 g semente; 0,2 g polpa + 0,3 g
semente; 0,1 g polpa + 0,4 g semente e 0,5 g semente. Cada mistura foi colocada em garrafa de
plástico e hidratada com PBS pH 7,4 e Oxyrase por 12 a 16 horas à 4°C. O Oxyrase é uma
enzima que retira o oxigênio do ambiente onde se encontra para permitir o crescimento das
bactérias anaeróbicas intestinais. Após a hidratação das fibras, 10 mL de suspensão fecal de rato
(suspendido em PBS pH 7,4 acrescido de Oxyrase na proporção de 1:6) foram adicionados a
essas fibras e incubadas por 24 horas, à 37°C, sob suave agitação. Durante essas 24 horas foram
retiradas alíquotas de 2 mL nos tempos 0 (momento da incubação), 2, 4, 8, 12 e 24 horas. Foi
adicionado 1 mL de solução de sulfato de cobre (10 g/L) em cada alíquota para inibir o crescimento
Polpa Semente
Abóbora
Estufa à 40 oC
Moinho de facas
36
microbiano. Essas amostras foram armazenadas em freezer a -20°C para posterior quantificação
dos AGCC (Velázquez et al., 2000) (Figura 4).
Os AGCC foram analisados por CEI no Laboratório do Prof. Dr. Lauro Kubota, no Instituto
de Química da UNICAMP, com a finalidade de determinar qual mistura produziu mais butirato.
Fluxograma 1 - Teste in vitro
3.3. CROMATOGRAFIA DE ÍONS
Os AGCC foram quantificados no cromatógrafo de íons modular da marca Metrohm®
usando uma coluna de exclusão de íons (Metrosep Organic Acids 100 x 7,8 mm, com partículas de
10 µm à base de um copolímero de poliestireno-divinilbenzeno funcionalizado com grupos
sulfônicos), e um volume de amostragem de 10 µL, sob eluição isocrática com uma solução de
H2SO4 0,5 mmol/L a uma vazão de 0,6 mL/min, seguida por supressão inversa usando uma
solução regenerante de LiCl 50 mmol/L (Figura 5).
Banho-maria 2 h a 37 oC
GARRAFA
0,5 g fibra (abóbora polpa/semente)
Incubar por 12 - 16 h a 4 oC (hidratação)
40 mL PBS + Oxyrase® (5 mL PBS : 0,1mL
Oxyrase®)
Centrifugação (12.000 rpm, 15 min a 4 oC)
1 g fezes: 6 mL PBS + Oxyrase®
10 mL suspensão fecal
2 mL amostra (no momento da incubação) 2 mL amostra (2 h após o início da incubação) 2 mL amostra (4 h após o início da incubação) 2 mL amostra (8 h após o início da incubação) 2 mL amostra (12 h após o início da incubação) 2 mL amostra (24 h após o início da incubação)
Freezer (-20oC)
ANÁLISE DO SOBRENADANTE NO CEI
Banho-maria 24 h a 37 oC
37
Esquema 2 - Cromatógrafo de Exclusão de Íons
3.4. ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 180 e 250 g, provenientes do Centro
Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP. Os animais foram aclimatados às
condições do biotério local, por cerca de 15 dias, antes dos ensaios experimentais, sob
temperatura de 23 ± 2oC e ciclo claro-escuro controlado de 12 h, alimentados com ração Nuvital
(Nuvilab) e água ad libitum.
Composição da ração: milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato de
cálcio, fosfato bicálcico, cloreto de sódio, premix vitamínico mineral e aminoácidos.
Níveis de garantia por kg do produto:
Umidade (máx) 12,50 %
Proteína bruta (mín) 22,00 %
Extrato etéreo (min) 4,5 %
Matéria mineral (máx) 10,00 %
Matéria fibrosa (máx) 8,00 %
Cálcio (máx) 1,40 %
Fósforo (mín) 0,80 %
RReesseerrvvaattóórriioo
ddee EElluueennttee
BBoommbbaa
PPrréé--ccoolluunnaa
CCoolluunnaa AAnnaallííttiiccaa
SSiisstteemmaa
SSuupprreessssoorr
CCéélluullaa ddee
CCoonndduuttiivviiddaaddee
EEssttaaççããoo ddee
TTrraabbaallhhoo ddee
CCrroommaattooggrraaffiiaa
EElluueennttee
SSeeppaarraaççããoo
AAnnaallííttiiccaa
DDeetteeccççããoo
CCoonnttrroollee
IInnssttrruummeennttaall ee
AAqquuiissiiççããoo ddee
DDaaddooss
IInnjjeeççããoo ddaa
AAmmoossttrraa
38
Os protocolos experimentais dos testes utilizados nesse trabalho foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UNICAMP (Protocolo no 861-1).
3.5. INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA POR TNBS
A indução da inflamação foi baseada no método de Morris et al. (1989). Os animais foram
deixados de jejum durante 24 horas, sedados com halotano e, através de sonda retal inserida 8 cm
no reto do animal (cânula de Teflon de diâmetro exterior de 2 mm), foi administrada uma dose
única de 10 mg de TNBS (ácido 2, 4, 6-trinitrobenzeno sulfônico) dissolvido em 0,25 mL de etanol
50% v/v. Os animais foram mantidos de cabeça para baixo até a recuperação total da anestesia.
Foram utilizados 10 animais para cada grupo. Os grupos foram: controle (solução salina, 9
g/L), não-tratado (solução salina + indução por TNBS) e tratado (mistura 0,1 g de polpa + 0,4 g de
semente de abóbora/kg + indução por TNBS).
Durante os 15 dias que antecederam a indução da inflamação e 7 dias após a indução, os
grupos controle e não-tratado receberam, além da alimentação habitual, solução salina por
gavagem (10 mL/kg). O grupo tratado recebeu a mistura de fibras que mais produziu butirato, isto
é, 0,1 g de polpa e 0,4 g de semente de abóbora/kg em solução salina (Figura 6).
Durante todo o experimento, o peso dos animais foi registrado e a presença ou não de
diarréia (dado qualitativo) após a indução da inflamação por TNBS foi verificada. A eutanásia foi
realizada no 24o dia.
Controle Salina Não Salina
Não-Tratado Salina Não Salina
Tratado Fibra suspendida em salina Sim Fibra suspendida em salina
Esquema 3 - Inflamação intestinal induzida por TNBS.
24o dia 16o dia
Indução por TNBS
Eutanásia
15 dias 7 dias
39
3.6. DROGAS UTILIZADAS
As drogas utilizadas para a colite induzida por TNBS foram: TNBS (solução de ácido
pricrilsulfônico, 5% (w/v) – (SIGMA Chemical Co, St. Louis, USA), halotano (CRISTÁLIA, Itapira,
Brasil).
3.7. DETECÇÃO DA LESÃO DO CÓLON
Após a eutanásia dos animais, a porção cólica (8 cm a partir do ânus) foi retirada e
colocada rapidamente em placas de vidro resfriadas, removendo-se o mesentério e as gorduras
aderidas. O colón foi aberto em seu sentido longitudinal, lavado, fotografado, dividido em 3 partes e
congeladas a -80 ºC, para determinações das enzimas antioxidantes (dosagem de grupamentos
sulfidrila, glutationa peroxidase e redutase) da atividade da mieloperoxidase e determinação do
índice de peroxidação lipídica.
A lesão do cólon foi medida utilizando-se o programa AVSoft Bioview 4 Spectra Module,
utilizando imagens das porções cólicas.
3.8. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Porções cólicas foram homogeneizadas com tampão Fosfato de Sódio 0,1 M, pH 7,4
usando o Polytron (PT - 1035 Kinematica, AG – Switzerland). Em seguida, os homogenatos foram
centrifugados a 12.000 rpm a 4 oC por 15 minutos e o sobrenadante analisado.
3.8.1. DOSAGEM DE PROTEÍNAS TOTAIS
Foi baseado no método de Bradford (1976). A absorbância foi lida no espectrofotômetro
VersaMax microplate reader (Molecular Devices, USA) com o programa SoftMax® Pro a 600 nm.
3.8.2. QUANTIFICAÇÃO DOS GRUPAMENTOS SULFIDRILA (GSH)
Esse método foi descrito por Faure e Lafond (1995), e sofreu algumas modificações. Em
100 µl de meio constituído de Tris 1 mM e EDTA 2 mM, com pH 8,2, foi adicionado 100 µL de
homogenato. A absorbância da solução inicial (A1) foi determinada em espectrofotômetro a 412
nm. À mistura foram adicionados 20 µL de ácido 5,5 ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB), 10 mM
(diluído em metanol). Após 15 minutos foi feita a segunda leitura (A2). Para zerar o aparelho, o
meio de reação (Tris-EDTA) foi utilizado e, como branco, o DTNB diluído no mesmo tampão (B).
Para calcular a concentração de grupamentos sulfidrila, a seguinte equação foi aplicada: (A1-A2-B)
x 1,57 mM.
40
3.8.3. ATIVIDADE DA GLUTATIONA PEROXIDASE (GPx)
A atividade da GPx foi determinada de acordo com o método de Yoshikawa et al. (1993).
Aos sobrenadantes foram adicionados 25 mM de H2O2, 10 mM de Glutationa Reduzida, 0,8 mM de
NADPH e 1 U de enzima glutationa redutase em PBS, pH 7,4. A absorbância foi lida em
espectrofotômetro a 365 nm, dentro de 3 a 10 minutos. Os resultados foram expressos em
nmol/min por mg de proteína.
3.8.4. ATIVIDADE DA GLUTATIONA REDUTASE (GR)
Seguiu-se o método de Carlberg e Mannervik (1985). A reação enzimática foi constituída
de: 0,1 M de tampão fosfato, pH 7,4, 0,2 mM de EDTA, 1 mM de GSSG e 0,1 mM de NADPH. A
absorbância foi medida em espectrofotômetro à 365 nm. A atividade da enzima foi definida como
nmol NADPH consumido/min/mg. O coeficiente de extinção para o NADPH utilizado foi 6,22 M-1
cm-1.
3.8.5. DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA (LPO)
O sobrenadante foi diluído em KCl 0,15M (relação 1:10). Em seguida, a 0,5 mL deste
homogenato foram adicionados 0,2 mL do dodecil sulfato de sódio (8,1%); 1,5 mL de ácido acético
(20%, solução ajustada com NaOH a pH 3,5); 1,5 mL de ácido tiobarbitúrico (0,8% p/v) e 0,3 mL de
água destilada. Todas as amostras foram colocadas em banho-maria, com termostato ajustado
para 95ºC por 1 hora. Após este período, as amostras foram retiradas do banho-maria. Uma vez
frias, foram adicionados 1 mL de água destilada e 5 mL de n-butanol às amostras. Os tubos foram
agitados por 1 minuto e centrifugados a 1400 G por 15 minutos. A absorbância da capa orgânica
foi determinada, a 532 nm em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos como nmol de
TBARS por mg de proteínas (nmol TBARS/ mg de proteínas) (Ohkawa et al., 1979).
3.8.6. ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)
Determinada de acordo com o método de Krawisz et al., (1984). À 6,7 µL da amostra
diluída 10 vezes foram adicionados 193,3 µL de tampão Fosfato de Sódio 0,05 M, pH 6,8 contendo
dihidrocloreto de o-dianisidina e 0,0005% de peróxido de hidrogênio. A absorbância foi medida em
espectrofotômetro a 460 nm entre 0 e 10 minutos. Os resultados foram expressos em U/mg de
proteína.
41
3.9. INTERLEUCINA 12 (IL-12)
A determinação da interleucina 12 foi realizada utilizando-se o kit imunoenzimático Duoset
DY 419 para IL-12 (p70) bioativa, da R & D Systems.
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A avaliação estatística dos resultados foi realizada empregando-se análise de variância
(ANOVA) de uma via, com nível crítico igual ou menor a 0,05 para rejeição da hipótese de
nulidade. Na presença de significância na ANOVA, foi procedida a análise de contraste entre as
médias aplicando-se o teste a posteriori de Dunnett com nível de significância igual ou menor a
0,05.
42
5. RESULTADOS
5.1. TESTE IN VITRO
No teste in vitro, a mistura que mais produziu AGCC (acetato, propionato e butirato) em 24
horas de fermentação foi: 0,5 g de semente de abóbora com 16,3 % de AGCC (8,7 % acetato, 3,5
% propionato e 4,1 % butirato), seguida da mistura 0,1 g de polpa de abóbora + 0,4 g de semente
de abóbora com 15,2 % de AGCC (8,8% acetato, 2,7 % propionato e 3,7 % de butirato) (Figura 7).
Gráfico 1 - Produção média dos Ácidos Graxos de Cadeia Curta (AGCC) no teste in vitro. Acetato,
propionato e butirato produzidos durante 24 horas de fermentação de fibras alimentares pelas bactérias
intestinais de rato a partir de diferentes proporções de polpa (P) e semente (S) de abóbora.
43
5.2. INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA POR TNBS
Na avaliação macroscópica o grupo tratado, que recebeu a mistura 0,1 g de polpa de
abóbora + 0,4 g de semente/kg, apresentou o cólon bem menos inflamado que o grupo não-
tratado, praticamente igualando-se ao controle (Figura 8). Metade dos 10 ratos do grupo tratado
não apresentou diarréia. O grupo tratado teve a média da área de lesão de 54 ± 18,29 mm2
enquanto o grupo não-tratado teve essa média de 128 ± 25,19 mm2 (Figura 9).
Figura 3 - Região cólica após inflamação induzida por TNBS. Durante os 15 dias que antecederam a
indução da inflamação e 7 dias após a indução, os grupos controle e não-tratado receberam, além da
alimentação habitual, solução salina por gavagem (10 mL/kg). O grupo tratado recebeu uma mistura de fibras
contendo 0,1 g de polpa + 0,4 g de semente de abóbora/kg em solução salina (n=10 para cada grupo).
Gráfico 2 - Área da lesão na região cólica. Grupo que recebeu suplementação com a mistura de abóbora
comparado ao grupo que não recebeu suplementação. Dados expressos em média ± d.p.. Teste t não-
pareado (** p<0,05 comparado ao grupo não-tratado).
Controle Tratado Não-Tratado
44
Gráfico 3 - Peso dos animais durante o experimento. A inflamação intestinal induzida por TNBS foi realizada
no 15º dia. Dados expressos em média ± d.p.. ANOVA com teste a posteriori de Dunnett (p>0,05
comparados ao grupo controle).
Não houve diferença estatisticamente significativa para o peso (Figura 10).
O peso dos animais foi também avaliado em relação a área sob a curva. Nota-se que nos 3
dias após a indução da inflamação, a perda de peso dos grupos não-tratado e tratado com a
mistura de abóbora foi acentuada (Figura 11). Porém, 7 dias após a indução o peso já é o mesmo
nos 3 grupos (Figura 12).
45
Gráfico 4 - Área sob a curva nos 3 dias após a indução. Dados expressos em média ± d.p.. ANOVA com
teste a posteriori de Dunnett (p>0,05 comparados ao grupo controle).
Gráfico 5 - Área sob a curva nos 7 dias após a indução. Dados expressos em média ± d.p.. ANOVA com
teste a posteriori de Dunnett (p>0,05 comparados ao grupo controle).
46
5.2.1. GRUPAMENTOS SULFIDRILA (GSH)
Não houve diferença estatisticamente significativa na concentração de GSH entre os grupos
não-tratado (2,4 ± 0,5 nmol/mg proteína), tratado com a mistura de abóbora (3,5 ± 2 nmol/mg
proteína) e o controle (4,3 ± 2,1 nmol/mg proteína) (Figura 13).
Gráfico 6 - Concentração dos Grupamentos Sulfidrila (GSH). Dados expressos em média ± e.p.m.. ANOVA
com teste a posteriori de Dunnett (p>0,05 comparados ao grupo controle).
47
5.2.2. ATIVIDADE DA GLUTATIONA PEROXIDASE (GPx)
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado com a mistura de
abóbora (46,7 ± 11,3 nmol/min/mg proteína), não-tratado e o controle (61 ± 24 nmol/min/mg
proteína). (Figura 14).
Gráfico 7 - Concentração da enzima Glutationa Peroxidase (GPx). Dados expressos em média ± e.p.m..
ANOVA com teste a posteriori de Dunnett (p>0,05 comparado ao grupo controle).
48
5.2.3. ATIVIDADE DA GLUTATIONA REDUTASE (GR)
Assim como em GSH e GPx, não houve diferença estatisticamente significativa entre os
grupos controle (14,1 ± 5,7 nmol/min/mg proteína), não-tratado (10,1 ± 2 nmol/min/mg proteína) e
tratado com a mistura de abóbora (13 ± 3,4 nmol/min/mg proteína) (Figura 15).
Gráfico 8 - Concentração da enzima Glutationa Redutase (GR). Dados expressos em média ± e.p.m..
ANOVA com teste a posteriori de Dunnett (p>0,05 comparados ao grupo controle).
49
5.2.4. DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA (LPO)
O nível de LPO teve aumento significativo no grupo não-tratado (2,8 ± 1,2 pmol/mg
proteína), enquanto que o grupo tratado com a mistura de abóbora (1,8 ± 0,6 pmol/mg proteína)
manteve-se no mesmo nível que o controle (1,4 ± 0,9 pmol/mg proteína) (Figura 16).
Gráfico 9 - Níveis de Peroxidação Lipídica (LPO). Dados expressos em média ± e.p.m.. ANOVA com teste a
posteriori de Dunnett (** p<0,05 comparado ao grupo controle).
50
5.2.5. ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)
A MPO teve aumento significativo tanto no grupo tratado com a mistura de abóbora (17,6 ±
2,6 U/g proteína) quanto no não-tratado (35,8 ± 11 U/g proteína) em relação ao controle (8,3 ± 2,3
U/g proteína). Além disso, há diferença estatisticamente significativa entre os grupos não-tratado e
tratado (Figura 17).
Gráfico 10 - Atividade da Mieloperoxidase (MPO). Dados expressos em média ± e.p.m.. ANOVA com teste a
posteriori de Dunnet (*p<0,05 e **p<0,01 comparados ao grupo controle).
51
5.2.6. INTERLEUCINA 12 (IL-12)
No grupo não-tratado (102,2 ± 42 pg/mL) o nível de IL-12 foi significativamente maior,
comparado ao controle (52,4 ± 12,1 pg/mL). Os níveis de IL-12 entre os grupos controle e tratado
com a mistura de abóbora (45,7 ± 9,2 pg/mL) não se mostraram estatisticamente diferentes (Figura
18).
Gráfico 11 – Concentração de Interleucina-12. Dados expressos em média ± e.p.m.. ANOVA com teste a
posteriori de Dunnett (** p<0,05 comparado ao grupo controle).
52
6. DISCUSSÃO
Carboidratos que chegam ao intestino grosso alteram a fisiologia cólica de duas maneiras:
fisicamente (ao aumentar o volume das fezes, promovendo um efeito laxativo e diminuindo o tempo
de trânsito intestinal) e quimicamente através da fermentação (Cummings, 1997). A fermentação
gera energia - para o crescimento e manutenção microbiana - e produtos finais como: AGCC,
gases (CO2, CH4 e H2) e um pouco de calor (Topping e Clifton, 2001). No cólon proximal, onde os
substratos são abundantes, o número de bactérias benéficas (como Lactobacillus e Bifidobacteria),
a proliferação bacteriana e o grau de fermentação dos carboidratos são elevados; esses substratos
são depletados no decorrer do trânsito intestinal, refletindo em uma menor produção de AGCC no
cólon transversal e distal (MacFarlane e Gibson, 1995).
Os AGCC contribuem para o funcionamento normal do intestino grosso, prevenindo
doenças através de suas ações no lúmen, na musculatura cólica e vascular e através de seu
metabolismo pelos colonócitos. Acredita-se que o butirato, em particular, mantenha equilibrada a
regeneração dos colonócitos (Topping e Clifton, 2001).
Dentre as técnicas existentes para quantificar os AGCC, apenas a fermentação in vitro
oferece uma estimativa confiável da produção desses ácidos (Topping e Clifton, 2001).
No presente trabalho realizou-se o teste in vitro para a quantificação dos AGCC. Dentre as
diferentes misturas de polpa e semente de abóbora fermentadas pelas bactérias anaeróbicas
intestinais, a semente de abóbora sozinha foi a que mais produziu AGCC. Spiller (1993) afirma que
100 g de polpa de abóbora contêm 1 g de fibras totais (FT), sendo 0,6 g de fibras insolúveis (FI) e
0,4 g de fibras solúveis (FS). Já 100 g de sementes de abóbora contêm 6,8 g de FT, sendo 4,9 g
de FI e 1,9 g de FS.
Tomando como base essas informações, observou-se que 0,5 g de semente foi a maior
fornecedora de fibras totais, seguida da mistura 0,1 g de polpa + 0,4 g de semente. Verificou-se
que há uma correlação entre as quantidades de FS e a produção de AGCC (Gráfico 1).
Sabe-se que, de modo geral, as FS produzem AGCC e as FI levam esses ácidos até a
região final do intestino, onde se dá a inflamação. Uma vez que as quantidades de butirato
produzidas tanto em 0,5 g de semente como na mistura 0,1 g de polpa + 0,4 g de semente foram
elevadas, optou-se pela utilização da mistura, de tal modo que os ácidos produzidos no cólon
ascendente fossem conduzidos até o cólon distal.
Para investigar a imunopatogênese das DII, modelos murinos de colite experimental têm
sido desenvolvidos, sendo freqüentemente usados para avaliar novas estratégias antiinflamatórias
(Bouma e Strober, 2003; Pizarro et al., 2003; Andreakos et al., 2004). Um dos modelos mais
53
utilizados é o da colite induzida pelo TNBS (Te Velde et al., 2006). O etanol utilizado para a
diluição do TNBS tem a função de desestruturar a mucosa, expondo o sistema imune à microflora
intestinal (Te Velde et al., 2006).
A avaliação macroscópica e a área de lesão (Figura 3 e Gráfico 2) do grupo tratado foram
muito próximas ao grupo controle, mostrando uma forte proteção das FA de abóbora na inflamação
intestinal induzida por TNBS. Esse efeito antiinflamatório observado deve-se, provavelmente, ao
butirato, que pode inibir a ativação da transcrição do NF-kB, reduzindo a formação de citocinas pró-
inflamatórias (Segain et al., 2000; Luhrs et al., 2001)
Os Gráficos 3, 4 e 5 mostram uma rápida recuperação do peso corporal nos grupos com
lesão induzida por TNBS, indicando que o agente lesivo não foi tóxico para os ratos. A perda de
peso é o principal e mais importante índício de toxicidade de determinada substância (Souza Brito,
1994).
Na tentativa de compreender o mecanismo protetor das FA de abóbora na inflamação
intestinal induzida por TNBS, analisou-se a participação da IL-12 e de algumas enzimas do sistema
antioxidante. Acredita-se que os radicais de oxigênio sejam fatores patogênicos nas DII.
Evidências experimentais sugerem que os efeitos mediados por ERO sejam importantes, tanto
primária quanto secundariamente, nos mecanismos patofisiológicos das inflamações intestinais
(Kruidenier e Verspaget, 2002).
Assim como em artrite reumatóide, nas DII a associação entre o tecido lesionado e
inflamação envolve um grande recrutamento e ativação de neutrófilos, monócitos, linfócitos e a
superprodução de citocinas como TNFα, eicosanóides, proteinases e espécies reativas, incluindo
HOCl e ONOO-. Peróxido de hidrogênio, HOCl e cloraminas são capazes de aumentar a
permeabilidade da parede intestinal e promover secreção de eletrólitos, provavelmente
contribuindo para a diarréia. É comum haver sangramento na mucosa inflamada, fornecendo fonte
de ferro pela geração de OH• (Keshavarzian et al., 2003).
Em humanos com DII, os níveis de GSH são baixos, sendo esse tripeptídeo o mais
abundante antioxidante sintetizado pelas células animais; ele apresenta um papel essencial na
modulação da resposta celular das mudanças redox associadas às ERO, além de ser importante
para a integridade funcional do intestino (Oz et al., 2005). Animais deficientes em GSH
demonstraram degradação severa da mucosa cólica, perda de peso e diarréia (Martensson et al.,
1990). A administração de N-acetilcisteína no modelo de colite induzida por TNBS diminui os danos
produzidos na mucosa (Ardite et al., 2000), sugerindo que precursores de GSH possam ser
benéficos no tratamento das DII. S-adenosilmetionina, outro precursor de GSH, é necessário ao
metabolismo dos ácidos nucléicos, reações de metilação, produção de poliamina e manutenção da
54
estrutura e funções de membranas (Lu, 2000). O GSH pode ser consumido por uma reação
indireta com compostos ativados pelo TNBS, conhecidos como mecanismo de inativação
xenobiótica (Nieto et al., 2000). Entretanto, no experimento realizado no laboratório, não houve
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (Gráfico 6).
É descrito que o cólon humano tem pequenas quantidades de enzimas antioxidantes como
catalase, superóxido dismutase e GPx. O desequilíbrio entre essas enzimas seqüestradoras de
radicais livres e a produção de ERO pode levar a danos no tecido (Nieto et al., 2000).
Um aumento da GPx, enzima que metaboliza peróxidos no epitélio cólico (Drew et al.,
2005), foi observado em ratos com colite induzida por TNBS (Nieto et al, 2000). Porém, os dados
obtidos no laboratório não tiveram diferença estatisticamente significativa (Gráfico 7).
A GR utiliza o cofator NADPH e converte GSH à sua forma reduzida, uma vez que a enzima
GPx converte H2O2 em H2O a partir da glutationa (Kwiecien et al., 2002). Os dados obtidos indicam
que não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (Gráfico 8).
ERO podem atacar componentes celulares e extracelulares. Sabe-se que os ácidos graxos
poliinsaturados das membranas celulares da bicamada lipídica são os principais alvos das ERO
(Gutteridge, 1995). Uma vez que o processo de LPO é iniciado, normalmente pelo OH, ele continua
numa reação em cadeia gerando hidroperóxidos lipídeos e aldeídos. O acúmulo de hidroperóxidos
na membrana celular tem um profundo efeito na sua fluidez e na atividade das enzimas
transmembranas, transportadores, receptores e outras proteínas de membrana (Jourd´Heuil et al.,
1993). Como conseqüência, a LPO pode causar mudanças na seletividade e permeabilidade da
membrana, levando a alterações no volume e no metabolismo celular (Chen et al., 1995). Além
disso, hidroperóxidos e aldeídos são tóxicos para as células e suas organelas (Aw, 1998),
possuem propriedades quimiotáxicas de neutrófilos e podem regular a produção de citocinas
(Jayatilleke e Shaw, 1998). O processo de LPO acelera quando o sistema de detoxificação celular
falhou na remoção dos precursores de OH, em particular os hidroperóxidos. Uma vez iniciada, a
LPO pode ser interrompida por antioxidantes lipossolúveis, como o α-tocoferol (vitamina E), e mais
recentemente, o NO, que também mostrou ser um antioxidante capaz de interromper esse
processo (Hogg e Kalyanaraman, 1999).
Nesse trabalho determinou-se o nível de LPO (Gráfico 9) e observou-se que esse nível nos
animais suplementados com a mistura 0,1 g de polpa + 0,4 g de semente retomou o nível do grupo
controle.
A atividade da MPO é uma medida indireta do nível de inflamação através da infiltração de
neutrófilos. De acordo com Lührs et al. (2002), o butirato inibiu a ativação do NFκB e reduziu o
número de neutrófilos nas criptas e superfície do epitélio em pacientes com RCUI. A atividade da
55
MPO, no grupo não-tratado, foi extremamente elevada em relação ao grupo suplementado com a
mistura 0,1 g de polpa + 0,4 g de semente (Gráfico 10). Desse modo, a diminuição da atividade da
MPO no grupo tratado indica, indiretamente, menor grau de inflamação e pode ser atribuído ao
butirato.
Citocinas são mediadores locais produzidos por células da linhagem linfóide e dos
macrófagos, bem como por células epiteliais e mesenquimais. Esses mediadores estão envolvidos
em processos biológicos como ativação celular, crescimento e diferenciação, sendo importantes no
processo inflamatório (Sartor, 1994; Elson, 1996). Células do sistema imune inato, como
macrófagos e monócitos, são capazes de promover uma rápida resposta frente a um sinal de
perigo, por exemplo, um agente infeccioso, secretando inúmeras citocinas proinflamatórias (Rang
et al., 2004).
Na última década, pesquisas com ratos e camundongos têm fornecido ferramentas para
identificar citocinas envolvidas nas respostas inflamatórias em DII. Dentre as interleucinas, a IL-12
é apontada como uma das principais no desenvolvimento e perpetuação da colite, promovendo
respostas Th1 (Bouma e Strober, 2003). No presente trabalho, a IL-12 (Gráfico 11) ficou
extremamente aumentada no grupo não-tratado com FA de abóbora. Descobertas mais recentes
sugerem que a IL-12 possa ser mediada pela IL-23. Alguns estudos afirmam que a IL-23 é a
responsável por orquestrar toda a cascata de citocinas inflamatórias, aumentando o nível de TNFα,
IL-6, IFN-γ e IL-17 no intestino (McGovern e Powrie, 2007).
Muitas plantas usadas na medicina popular para tratar inflamações contêm triterpenóides.
Estes desempenham importante função antiinflamatória, tanto in vivo quanto in vitro, incluindo
supressões de prostanóides e da produção de citocinas, bem como inibição da peroxidação lipídica
(Safayhi e Sailer, 1997).
A abóbora, da família das Cucurbitaceae, contém muitas cucurbitacinas, que são
triterpenóides tetracíclicos altamente oxigenados. A ação antiinflamatória também pode ser
explicada por essas cucurbitacinas (Escandell et al., 2007). As sementes da abóbora, por sua vez,
são ricas em ácidos graxos essenciais, incluindo os ácidos linoleico e linolênico, β-carotenos,
luteína, gama e β-tocoferóis, fitoesteróis e selênio (Zambo, 1988), que possuem propriedades
antioxidantes prevenindo a depleção de GSH e GR. Tocoferóis e selênio agem sinergisticamente
em tecidos animais sendo um importante mecanismo de defesa antioxidante contra a peroxidação
lipídica da membrana celular mediada por radicais livres. O selênio age reduzindo hidroperóxidos
semiestáveis para álcoois menos reativos. Além disso, tocoferóis e glutationa peroxidase-selênio
podem exercer um papel mais específico modulando oxidações enzimáticas do ácido araquidônico
através da inibição das vias da ciclooxigenase e lipooxigenase, que sintetizam PGE2 e LTB4
(Reddanna et al., 1980).
56
Portanto, a atividade antiinflamatória das FA de abóbora talvez possa ser atribuída, mais
especificamente, às cucurbitacinas, à alteração do equilíbrio bactérias benéficas/potencialmente
patógenas no intestino, ao aumento na produção do butirato e às substâncias antioxidantes das
sementes.
57
7. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
• A suplementação de fibras alimentares de abóbora na proporção 0,1 g de polpa + 0,4 g
de semente/kg por 15 dias antes e 7 dias após a inflamação intestinal induzida por
TNBS atenuou a inflamação;
• Sugere-se um forte potencial antiinflamatório, onde os ratos suplementados com essa
mistura tiveram a área de lesão, níveis de mieloperoxidase e interleucina-12 muito
próximos daqueles do grupo controle;
• O efeito antioxidante foi observado apenas em relação à peroxidação lipídica; os
grupamentos sulfidrila, glutationa redutase e glutationa peroxidase, do ponto de vista
estatístico, mantiveram os mesmos níveis em todos os grupos.
• As fibras alimentares de abóbora podem ser fortes aliadas na prevenção das
inflamações intestinais;
• Novas investigações deverão ser feitas para a elucidação do mecanismo de ação das
fibras alimentares de abóbora na inflamação. Isso poderá ser realizado através da
quantificação de outras interleucinas, como a IL-6, IL-10 e IL-23 e fatores pró-
inflamatórios como o TNF-α e o NFkB.
58
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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