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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA -
UFSC
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB
DEP. DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E
GENÉTICA - BEG
LAB. DE CÉLULAS TRONCO E REGENERAÇÃO
TECIDUAL – LACERT
Adriane Cristina Fagundes
Efeito da radiação ultravioleta B em células tronco
mesenquimais derivadas da pele
Trabalho apresentado como requisito para a
conclusão dadisciplina de Trabalho de
Conclusão de Curso II (BIO7016) do
currículo do Curso de Graduação em
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Santa Catarina.
Orientadora: Dra. Talita da Silva Jeremias.
Co-orientadora: Profa. Dra. Andréa Trentin
Florianópolis
2016
Adriane Cristina Fagundes
Efeito da radiação ultravioleta B em células tronco
mesenquimais derivadas da pele
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado
para obtenção do Título de “Licenciado em Ciências
Biológicas”, e aprovado em sua forma final pelo Curso de
Ciências Biológicas.
Florianópolis, 02 de Dezembro de 2016.
Professora Dra. Maria Risoleta F. Marques
Coordenadora do Curso de Ciências Biológicas
Banca examinadora:
Dra. Talita da Silva Jeremias Orientadora
Universidade Federal de Santa Catarina
Dra. Cláudia Beatriz Nedel
Examinadora
Universidade Federal de Santa Catarina
Msc. Priscilla Delben Barros
Examinadora
Universidade Federal de Santa Catarina
Msc. Diana Heck
Suplente
Universidade Federal de Santa Catarina
Aos meus pais por todo o amor e
todo o esforço que tiveram para que
eu chegasse até aqui e aos meus
irmãos pela amizade e inspiração.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina pela
oportunidade de realizar esse trabalho e concluir meu curso e
ao CNPq pelo apoio financeiro durante minha graduação.
À minha orientadora, Talita Jeremias. Todas as
pessoas no mundo deveriam ter uma Talita na sua vida. Uma
pessoa incrível de todas as formas!
À minha co-orientadora, Profa. Andréa Trentin, por
ter me aceitado e me recebido de braços abertos.
A todos os meus amigos e colegas do LACERT; Prof.
Ricardo Garcez, por todos os ensinamentos. Diana Heck,
Helena Zomer e Priscilla Delben, sempre tão dispostas a
ajudar. À Camila Acordi, Maiara Marques (cafézinhoooo!),
Aruana Hansel, Gabriel Pescador, Alessandra Barauna,
Jaqueline Isoppo, Gisele Varela, Rafaela Grecco, Gabriel
Petry, Patrícia Dillenburg, Juliano Tibbola, Fernanda Lamin,
Ana Júlia Gonçalves e Jéssica Andrade por toda parceria,
vocês são demais!
Aos meus ex-colegas de laboratório e hoje grandes
amigos, Marcelo Falchetti, Gabriel Matos, Amanda Silveira
(amada mãe!), Jaqueline da Rosa, Graziela Vieira, Emily
Justino, Cairé Barreto, Bruno Dominski e Mariana Pilotto.
Sinto saudade de vê-los todos os dias!
Às minhas colegas e amigas de graduação, Amanda
Tuyama, Mahoany Machado, Tamires Gregorio, Nágilla
Alberton, Natani Coser, Joana Weck e Maysa Almeida. Foi
um prazer imenso estar ao lado de vocês por todos esse anos.
A todos os meus amigos queridos, os de infância:
Bianca Brasil, João Fransisco, Gustavo Lemos e Larissa
Lorenzi. E àqueles que adquiri um pouco depois, Camila Reis (a melhor das melhores amigas), Jefferson Corrêa (meu irmão
de coração!), Camila Leal, Henrique Lobo, Diego Feijó, Jhon
(André) Trevisol, Kacilha Macedo, Douglas de Menezes, Joel
Mello e Leonardo Cabral. Obrigada por tantas alegrias
compartilhadas, pessoal!
Ao meu namorado, Luan Gomes, que conheci na
biologia e com quem posso contar desde então. Obrigada por
todo o apoio que você me dá em todos os momentos. Eu não
teria permanecido tão calma (tanto quanto posso ser) se não
fosse por você. E nem tão feliz! Te amo!
Aos meus pais por tudo o que fizeram por mim. Eu
sei o quanto vocês batalham ainda hoje para que eu seja o
melhor que posso. Eu sou imensamene grata por tudo. E amo
vocês. Também agradeço aos meus irmãos e melhores
amigos. Minha irmã, Lisiane, por alegrar todos os dias da
minha vida com sua risada cheia de vida e o seu senso de
humor. Meu irmão, Rodrigo, por ter sido meu ídolo nos
estudos. Tentei até gostar de matemática por sua causa.
Espero sempre ser motivo de orgulho a todos vocês.
“Don't adventures ever have an end? I suppose not.
Someone else always has to carry on on the story.”
J.R.R. Tolkien
RESUMO
FAGUNDES, A. C. Efeito da radiação ultravioleta B em
células tronco mesenquimais derivadas da pele. Trabalho
de Conclusão de Curso – Curso de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Santa Catarina, 2016.
As células tronco mesenquimais (CTMs) são
multipotentes, capazes de se diferenciar em diversas
linhagens celulares e, sugere-se, que estejam presentes em
todos os tecidos e órgãos do corpo. Trabalhos tem mostrado
que em condições adversas como hipóxia, as CTMs
sobrevivem. Por ser um órgão extenso e externo, a pele recebe
a maior parte da carga de radiação UV proveniente do sol. A
radiação ultravioleta do tipo B (UVB: 280-320 nm) é o tipo
de radiação mais energética, a qual atua como mediador de
espécies reativas de oxigênio e a exposição a essa radiação é
altamente mutagênica. Entretanto, também pode estimular a
proliferação, a diferenciação celular e aumentar a secreção de
fatores relacionados ao reparo tecidual. Sendo assim, o
objetivo desse trabalho foi verificar o efeito da radiação UVB
em células tronco mesenquimais derivadas da pele (CTMp).
As CTMp foram isoladas in vitro e expostas à diferentes doses
de radiação UVB (2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²) para
análise de viabilidade, morfologia, dano de DNA, ciclo
celular, morte celular e apoptose. Os resultados obtidos
mostram que altas doses de radiação UVB diminuem a
viabilidade das CTMs ao causar dano no DNA, o que por sua
vez causa parada no ciclo celular e culmina na ativação de
cascatas de sinalização para morte celular. Já em baixas doses
(2,5 mJ/cm²) as CTMp não mostram diferenças signifitavas
em relação ao controle. Sendo as CTMp ativas em processos
de reparo de regiões lesionadas, analisar seu meio
condicionado. (secretoma) por radiação UVB é o próximo
passo para o estudo de uso dessas células como terapia.
Palavras-chave: células tronco, CTM, UVB
ABSTRACT
FAGUNDES, A. C. Effects of Ultraviolet B radiation on
mesenquymal stem cells derived from the skin. Trabalho
de Conclusão de Curso – Curso de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Santa Catarina, 2016.
Mesenquymal stem cells (MSC) are multipotent cells
capable of differentiating in various cell lineages and it is
suggested that they are present in all the bodys tissues and
organs. Research has shown that MSC survive in adverse
conditions such as hypoxia. Because the skin is an extense and
exposed organ, it recieves most of the radiation coming from
the sun. Ultraviolet B radiation (UVB: 280-320 nm) is the
most energetic type of radiation and exposure to it is highly
mutagenic. However, it can also estimulate cell proliferation
and differentiation and increase secretion of tissue repair
related factors. Therefore, our objective was to evaluate the
effect of UVB radiation on mesenquymal stem cells derived
from the skin (MSCd). MSCd were isolated in vitro and
exposed to different UVB radiation doses (2,5, 5, 10, 20, 30,
40 and 50 mJ/cm²) to investigate cell viability, morphology,
DNA damage, cell cicle, cell death and apoptosis. Our results
show that high doses of UVB radiation decrease MSCd
viability by causing DNA damage and cell cicle arrest, which
ends in activation of cell death signaling pathways. However,
MSCd did not show significative differences compared to the
control group, when exposed to low dose radiation (2,5
mJ/cm²). Since MSCd participate in repairing wounded
regions, studying the MSCd conditionated medium
(secretome) by UVB radiation is the next step towards the use
of these cells as therapy.
Keywords: Stem cells, MSC, UVB
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática da pele
............................................................................................. 22
Figura 2 – Localização de nichos de CTs na pele
............................................................................................. 23
Figura 3 – Representação da penetração da luz ultravioleta na
pele ..................................................................................... 27
Figura 4 – Esquema da cascata de sinalização de apoptose
............................................................................................. 30
Figura 5 – Viabilidade das CTMp após exposição a radiação
UVB ................................................................................... 44
Figura 6 – Morfologia das CTMp após a irradiação por luz
UVB ................................................................................... 45
Figura 7 – Expressão de γH2AX nas CTMp irradiadas UVB
............................................................................................. 47
Figura 8 – Dados referentes à porcentagem de células nas
diferentes fases do ciclo celular ......................................... 49
Figura 9 – Efeito da irradiação UVB na quantidade de
CTMps viáveis e inviáveis dos diferentes grupos .............. 51
Figura 10 – Análise da apoptose após irradiação UVB das
CTMps ............................................................................... 53
Figura 11 – Representação esquemática dos resultados
obtidos ................................................................................ 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CT – Célula tronco
CTM – Célula tronco mesenquimal
CTMp – Células tronco mesenquimais derivadas da pele
DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMEM – F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium Ham’s
F12
DMSO – Dimetilsulfóxido
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra- acético
ERO – Espécies reativas de oxigênio
MTT – (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo
tetrazólico)
IP – Iodeto de proídeo
PBS – Tampão Fosfato Salina
PS – Penicilina e Estreptomicina
RUV – Radiação ultravioleta
SBF – Soro Bovino Fetal
UV – Ultravioleta
UVA – Ultravioleta do tipo A
UVB – Ultravioleta do tipo B
UVC – Ultravioleta do tipo C
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................... 21
1.1 Pele ................................................................. 21
1.1.1Nicho de células tronco na pele ................... 22
1.2 Radiação ultravioleta ............................................ 26
1.2.1 Danos no DNA.............................................. 28
1.2.2 Morte celular ................................................ 29
2 JUSTIFICATIVA ...................................................... 33
3 OBJETIVOS .............................................................. 35
2.1 Geral ..................................................................... 35
2.2 Específicos ............................................................ 35
4 METODOLOGIA ..................................................... 37
4.1 Obtenção das amostras de tecido humano ............ 37
4.2 Cultura de células tronco mesenquimais (CTM)
derivadas da pele humana (CTMp) ............................ 37
4.3 Irradição das CTMp com ultravioleta B (UVB) ... 38
4.4 Ensaio de MTT ..................................................... 39
4.4 Análise da morfologia .......................................... 40
4.6 Análise de ciclo celular ........................................ 40
4.7 Imunocitoquímica ................................................. 41
4.8 Ensaio de viabilidade celular (vida/morte) ........... 42
5 RESULTADOS .......................................................... 43
5.1 Análise de viabilidade celular das CTMp ............. 43
5.2 Análise da morfologia celular ............................... 44
5.3 Análise de dano de DNA ...................................... 46
5.4 Análise de ciclo celular por citometria de fluxo ... 48
5.3 Análise de morte celular ....................................... 50
6 DISCUSSÃO ............................................................... 55
7 CONCLUSÃO ............................................................ 59
REFERÊCIAS ............................................................... 61
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 Pele
A pele é um órgão multifuncional que recobre toda a
superfície do corpo, protegendo-o contra a perda de água,
microorganismos, ações mecânicas e químicas e radiações
solares (ALONSO & FUCHS, 2003). A estrutura da pele é
composta de duas porções: a epiderme e a derme, sendo a
primeira a camada mais externa. A epiderme, originada da
ectoderme, é constituída por uma fina camada epitelial
estratificada pavimentosa, que por sua vez é composta
principalmente por queratinócitos. Ela também possui
melanócitos, células de Langerhans e de Merkel
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004). Nesta camada, estão
presentes também os anexos epidérmicos: folículos pilosos,
glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas.
Já a derme, de origem mesodérmica, está localizada
adjacente à epiderme e apresenta uma camada de espessura
variável, muito resistente e rica em colágeno,
glicosaminoglicanos e elastina. Essa região da pele é
subdividida em derme papilar e derme fibrilar. A primeira está
localizada abaixo da epiderme e possui sistema circulatório
associado, enquanto a segunda é localizada mais abaixo,
próxima do tecido subcutâneo, e sua matriz extracelular é
mais densa. A derme é composta majoritariamente por
fibroblastos, porém também são encontradas células imunes e
do endotélio vascular. Abaixo da derme encontra-se um tecido
distinto composto por camadas de células adiposas. Esse
tecido é responsável por propocionar isolamento térmico e
pelo deslizamento da pele sobre suas estruturas de apoio
(Figura 1) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
22
Figura 1. Representação esquemática da pele
Adaptado de:
http://www.ccsb.org/Cancer/Summary/CDR0000258037/.
1.1.1 Nicho de células tronco na pele
As células tronco (CT) são caracterizadas por sua alta
taxa de proliferação in vitro, sua capacidade de
autorrenovação e diferenciação em tipos celulares
especializados. Essa capacidade de diferenciação é
estabelecida dependendo da origem e potencialidade das CT.
Em tecidos embrionários e fetais, as CT são totipotentes e
pluripotentes. CT totipotentes são capazes de se diferenciar
em todos os tipos celulares de um organismo, incluindo os
anexos embrionários, enquanto as CT pluripotentes são
localizadas na massa interna do embrião, sendo capazes de
originar células dos três folhetos embrionários. Já em tecidos
adultos, estão presente CT multipotentes, que apresentam um
potencial menos abrangente, sendo capazes de se diferenciar
em apenas algumas linhagens celulares (ALISON et al.,
2009).
23
Atualmente, têm-se levantado a hipótese de que todos
os tecidos adultos possuem um “compartimento tronco” ou
nicho onde estão localizadas as CTs. Esses nichos são
responsáveis pela reposição celular e pelo reparo de lesões.
Sendo assim, cada tecido tem uma taxa diferenciada de
capacidade de renovação. A pele, por exemplo, possui uma
alta taxa de proliferação celular, sendo que a epiderme
apresenta capacidade de se regenerar a cada duas semanas
como resultado da atividade de CTs adultas (ADOLPHE &
WAINWRIGHT, 2005). Já foram identificadas populações de
CTs em diversos nichos da pele, incluindo epiderme, folículo
piloso, glândula sebácea, derme e hipoderme (tecido adiposo)
(Figura 2) (WONG et al., 2012).
Figura 2. Localização de nichos de CTs na pele
Esquema ilustrando os diferentes nichos de CTs (em verde) na pele:
na camada basal da epiderme, no bulge e papila dermal do folículo
piloso, na derme e hipoderme. Quando há uma lesão no tecido, essas
24
células são recrutadas e auxiliam no processo de reparo. Adaptado
de: (WONG et al., 2012).
A existência de CTs dermais na pele de mamíferos
ainda é pouco compreendida, entretanto, sabe-se que as CTs
obtidas da derme e epiderme possuem diferentes
características fenotípicas e potencialidades. Mas, em geral
permanecem capazes de se diferenciar in vitro em algumas
linhagens celulares e possuem marcadores de superfície
semelhantes às CTs mesenquimais da medula óssea
(VISHNUBALAJI et al., 2012; WONG et al., 2012).
As células tronco mesenquimais (CTM) se
caracterizam por serem aderentes ao plástico e positivas para
os marcadores de células tronco mesenquimais CD29, CD44,
CD71, CD73, CD105, CD90 e CD166 e negativas para CD45,
CD14, CD34, CD133 e HLA-DR, de acordo com o Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the
International Society for Cellular Therapy. As CTMs são
multipotentes e, portanto, capazes de se diferenciar em
diversas linhagens celulares derivadas do mesoderma, como
osteoblastos, adipócitos e condrócitos (BIANCO et al., 2001).
Inicialmente, essas células foram isoladas da medula óssea e
caracterizadas por Friedestein e colaboradores em 1968, e,
atualmente sugere-se que as CTMs estejam presentes em
todos os tecidos adultos, já que vem sendo isoladas de outros
órgãos e tecidos, como gordura, sangue do cordão umbilical,
líquido amniótico, placenta, polpa dentária, tendões e
músculo esquelético (MEIRELLES et al., 2008). No nosso
grupo de pesquisa, foi isolada e caracterizada uma população
de células mesenquimais derivadas da derme humana, com
características imunofenotipicas semelhantes as células da
medula óssea, e com capacidade de diferenciação para
fenótipos mesodermais e ectodermais (JEREMIAS et al.,
2013).
De fato, estudos sugerem que as CTMs podem
possuir uma plasticidade celular mais abrangente, sendo
25
capazes de se diferenciar em células de origem endodérmica
(SATO et al, 2005) e ectodérmica (KOPEN et al, 1999). Uma
pesquisa realizada por Kopen e colaboradores (1999)
demonstrou que ao injetar CTMs de camundongos em
ventrículos laterais de camundongos neonatos, é observada a
diferenciação dessas células tronco em células neurais.
Também já foi descrito que o uso de CTMs é eficaz em
diversas estratégias de terapia celular como tratamento de
crianças com osteogênse imperfeita (HORWITZ et al., 2002),
recuperação hematopoiética (KOC et al., 2000) e estratégias
de regeneração tecidual (PETITE et al., 2000). Para a
medicina regenerativa, essa versatilidade celular é mais uma
característica em potencial a ser explorada, já que as CTMs já
vem sendo estudadas como possibilidade para tratamentos de
tecidos lesionados (ALDAHMASH et al., 2012).
Atualmente tem-se associado a presença destas
células em diferentes tecidos com a manutenção da
homeostase tecidual e recrutamento após lesões, e que o seu
efeito reparatório ocorre não só a partir da habilidade de
diferenciação das CTMs, mas também pelo seu efeito
parácrino, ou seja, os fatores secretados por essas células
(Figura 2). Análises do meio condicionado de CTMs
mostram a produção de diversos mediadores do processo de
reparo, como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento,
e moléculas de matriz extracelular (CHEN et al., 2008;
PHINNEY, 2007). Além disso, trabalhos tem mostrado que
em condições adversas, como hipóxia e radiação ultravioleta,
as CTMs são capazes de sobreviver e secretar uma quantidade
maior desses mediadores do processo de reparo
(RAJENDRANNAIR et al., 2016; JEONG et al., 2013).
26
1.2 Radiação ultravioleta
A nossa superfície terrestre recebe diversos tipos de
energia radioativa da nossa estrela local, o sol. Essas energias
são classificadas como radiação eletromagnética não
ionizada, o que inclui: infravermelho (780 – 3000 nm), luz
visível (400 – 780 nm) e ultravioleta (100 – 400 nm). A luz
infravermelha representa 54% da radiação solar, enquanto que
a ultravioleta representa apenas 7% (KOCHEVAR et al., 2008).
A exposição à radiação ultravioleta (RUV)
desencadeia diversas mudanças na pele, como hiperemia,
hiperalgesia e inflamação. Todas essas mudanças podem ser
observadas após a exposição à luz ultravioleta de diferentes
comprimentos de onda. Essa radiação pode ser classificada
em UVA (320 – 400 nm), UVB (280 - 320 nm) e UVC (100
– 290 nm) (EUBANKS et al., 2006). A radiação UVC é
eficientemente absorvida pela camada de ozônio e não chega
a superfície terrestre, já a UVB não é totalmente absorvida,
sendo que cerca de 0,1% atinge a superfície da Terra no verão
(região do Equador – 12:00hrs). Quanto à radiação UVA,
cerca de 5% atinge a superfície terrestre (HOLICK, 2016).
Por ser um órgão extenso e externo, a pele recebe a
maior parte da carga de RUV, porém, das três formas apenas
duas conseguem penetrar na pele, em diferentes níveis. A
radiação UVB é majoritariamente absorvida pela epiderme,
mas penetra também na camada superior da derme, enquanto
a UVA penetra mais profundamente, chegando até a camada
reticular da derme (Figura 3). De maneira geral, quando em
contato com a pele, a radiação UV pode prejudicar as funções
celulares direta e indiretamente ao gerar danos do DNA e
induzir assim, à parada no ciclo celular e apoptose (CHA et
al., 2014).
27
Figura 3. Representação esquemática da penetração da
radiação ultravioleta na pele
Adaptado de: (HUSSEIN, 2005)
A radiação ultravioleta do tipo B (UVB: 280-320
nm) é o tipo de radiação mais energética, a qual atua como
mediador de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a
exposição a essa radiação é altamente mutagênica, o que
possibilita o aparecimento de doenças, além de ocasionar
queimaduras e câncer de pele (JEONG et al., 2013).
Entretanto, a radiação do tipo UVB é essencial na indução da
produção de vitamina D e tem sido utilizada no tratamento de doenças, como vitiligo e psoríase (NJOO et al., 2000; GREEN
et al., 1988).
28
1.2.1 Danos no DNA
Os danos ao DNA podem ser causados de forma
indireta e direta por diversos agentes exógenos, como a
radiação ultravioleta. Os danos indiretos são aqueles causados
a longo prazo, consequência da produção de EROs. Ao
produzir EROs, a radiação UVB causa, indiretamente, dano
oxidativo no DNA, RNA, proteínas e lipídios (SWALWELL
et al, 2012; GODAR et al, 1993). Já danos diretos são aqueles
que ocorrem no momento da exposição. No caso da luz UVB,
os danos ocorrem devido ao fato de as bases nitrogenadas que
compõe o DNA absorverem diretamente os fótons da luz
UVB (RAVANANT et al., 2001). Como consequência dessa
absorção, ocorre um rearranjo de nucleotídeos nessas
macromoléculas que induzem a formação de dímeros de
piramidina ciclobutano (CPDs) e pirimidina (6-4) pirimidona.
Tais danos podem afetar as células a curto e longo prazo.
Como consequência de lesões não reparadas, danos podem se
estabelecer e alterações permanentes podem ocorrer
ocasionando mutações, além de interferências nos processos
de transcrição e replicação. Essas alterações no DNA
acarretam bloqueios da replicação e indução da fosforilação
da histona H2AX na serina 139 (γH2AX) (ROGAKOU et al.,
1998; ROGAKOU et al.,1999), também responsável pela
sinalização de moléculas de reparo de DNA.
Durante o sistema de checagem do ciclo celular, as
lesões de DNA são reconhecidas por proteínas, o que induz
uma parada no ciclo celular para que haja o reconhecimento
de lesão (PIETENPOL & STEWART, 2002). Esse
reconhecimento se dá no período de intérfase do ciclo, o qual
é subdividido em três etapas: G0/G1, fase de crescimento
celular e que possui duração variável, além de poder
permanecer em estado quiescente (G0) por tempo
indeterminado como resposta à estímulos; S, fase em que há
duplicação do material genético; G2, fase que possui alguns
pontos de checagem e é o período que a célula permanece até
29
que todo o material genética tenha sido duplicado para só
então passar à fase mitótica (JUNQUEIRA & CARNEIRO,
2004).
Caso o reparo não seja eficiente, pode haver sinalização para
que se inicie o processo de apoptose (PEI & STRAUSS,
2013).
1.2.2 Morte celular
A morte celular é o principal mecanismo de
eliminação celular nos metazoários e suas formas mais
conhecidas são a necrose e apoptose. A necrose é
caracterizada pela formação de vacúolos citoplasmáticos,
desestabilização da membrana plasmática e inflamação ao
redor das células necróticas (EDINGER & THOMPSON,
2004). Já a morte por apoptose tem como característica a
degradação de componentes celulares, a fragmentação do
DNA e a formação de corpos apoptóticos (HAIL et al, 2006).
Entretanto, não há rompimento da membrana plasmática e não
há presença de processo inflamatório (EDINGER &
THOMPSON, 2004). Essas características morfológicas da
apoptose são consequência da ativação de caspases, as quais
são ativadas devido a secreção de mediadores da mitocôndria
ou por receptores de morte (Figura 4) (EDINGER &
THOMPSON, 2004). Há muitos eventos que podem
desencadear a apoptose, sendo um deles, o dano de DNA, que
por sua vez, pode ser induzido por fatores exógenos como a
radiação ultravioleta. (GRIVICICH et al., 2007; SUZANNE
& STELLER, 2013).
30
Figura 4. Esquema da cascata de sinalização de
apoptose
Representação da cascata de sinalização da caspase, que resulta em
apoptose. Caspases são altamente expressas na maioria das células
na forma de proenzimas inativas. Quando há dano de DNA,
proteínas, como a p53, são acumuladas no núcleo celular e, quando
não há sucesso no reparo, ativa as vias de caspase, inicializando
assim a cascata de sinalização apoptótica (PEI & STRAUSS, 2013;
ELMORE, 2007).
Diferentes tipos celulares podem ter reações distintas
à exposição a luz ultravioleta. Em queratinócitos e linfócitos
há a indução de apoptose, mas é interessante observar que os
linfócitos são mais sensíveis à radiação, sendo necessárias
menores doses de luz ultravioleta para que essas células
sinalizem para a apoptose (SCHINDL et al., 1998; AUFIERO
et al., 2006). Já em melanócitos, por exemplo, há o aumento
da densidade celular quando a pele é exposta a radiação solar
(TAYLOR, 2005).
31
Trabalhos recentes têm mostrado a influência da
radiação UVB em CTs de diferentes tecidos. Estudos com
CTs do folículo piloso mostram que a exposição à RUV, além
de desestabilizar o microambiente dessas células reduz seu
potencial de formação de colônias, bem como sua viabilidade
(AOKI et al, 2013). Em relação a CT derivadas do tecido
adiposo, foi descrito que em baixas doses, a radiação UVB
aumenta a sobrevivência e a migração celular. Além disso, as
CT derivadas do tecido adiposo secretam mais fatores de
crescimento envolvidos com o reparo tecidual, como bFGF,
KGF, HGF e VEGF (JEONG et al., 2013). Neste contexto, as
CTMs encontradas na derme também podem ser afetadas pela
radiação UVB. Entretanto, ainda não existem estudos acerca
do pefil celular que essas células apresentam quando expostas
a essa radiação.
32
33
2 JUSTIFICATIVA
As CTMs estão presentes em diversos tecidos, sendo
sugerido que estejam presentes em todos os tecidos adultos
(MEIRELLES, 2008). Essas células possuem a capacidade de
manter a manutenção tecidual e de auxiliar no processo de
reparo após lesão. Atualmente, discute-se que o efeito
reparatório ocorre não só a partir da habilidade de
diferenciação das CTMs, mas também pelo seu efeito
parácrino (VISHNUBALAJI et al., 2012). Entretanto,
diversos aspectos do microambiente, como diferentes
substratos, contato célula-célula e a exposição à ambientes
estressores, como hipóxia e radiação UV, podem afetar a
sobrevivência e a secreção de fatores parácrinos.
A luz UVB, quando em contato com a pele, pode
afetar as células e desestabiliziar o microambiente,
ocasionado morte celular. Entretanto, por estarem tão sujeitas
a exposição a agentes danosos, as células tronco da pele são
altamente resistentes ao processo de envelhecimento e ao
dano de DNA, possuindo mecanismos de reparo altamente
eficientes (RACILA & BICKENBACH, 2009; STERN &
BICKENBACH, 2007; GIANGRECO et al., 2008)
Assim, o efeito da irradiação UVB pode nem sempre
ser negativo e resultar em morte celular. Ao contrário, pode
estimular a proliferação, a diferenciação celular e aumentar a
secreção de fatores relacionados ao reparo tecidual (JEONG
et al., 2013). Recentemente, estudos vem sendo realizados a
fim de elucidar os efeitos da radiação UVB em diferentes
tipos celulares derivados da pele, incluindo as CTs epidermais
do folículo piloso e da papila dérmica. Entretanto, não há
dados na literatura em relação as CTMs da pele (CTMp).
34
Dessa forma, faz-se necessário adquirir
conhecimentos acerca dos efeitos da radiação UVB em
células tronco mesenquimais derivadas da pele, visto que
essas células são importantes para a renovação do tecido e são
ativadas no reparo tecidual. Além disso, a possível
modificação dessas células após a irradiação pode aumentar
as possibilidades de uso das CTMp para terapias celulares
através do estímulo de secreção de biomoléculas que atuam
no processo de reparo.
35
3 OBJETIVOS
2.1 Geral
Analisar o efeito da radiação ultravioleta B em células tronco
mesenquimais derivadas da pele humana, in vitro.
2.2 Específicos
- Avaliar a viabilidade das CTMp após a irradiação com
diferentes doses de UVB.
- Analisar a morfologia das CTMp após serem expostas à
radiação UVB.
- Verificar o dano no DNA causado nas CTMp após irradiação
UVB
- Analisar o ciclo celular das CTMp após a irradiação UVB.
- Estudar o processo de apoptose das células CTMp após a
irradiação UVB.
36
37
4 METODOLOGIA
4.1 Obtenção das amostras de tecido humano
As amostras de pele humana foram obtidas através de
uma colaboração com o Hospital Universitário – HU
(Florianópolis) onde pacientes submetidos a cirurgias
plásticas de “lifting facial” (ritidoplastias) doaram os
fragmentos de pele, retirados durante o procedimento
cirúrgico, após a apresentação e assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido. O fragmento de pele foi
coletado e armazenado a 4ºC em recipiente estéril, contendo
DMEM-F12 acrescido de antibióticos (penicilina e
estreptomicina - PS) (1U/μg) e encaminhado para o
Laboratório de Células Tronco e Regeneração Tecidual, onde
foram realizados os procedimentos de cultura celular.
4.2 Cultura de células tronco mesenquimais (CTM)
derivadas da pele humana (CTMp)
Os fragmentos de pele foram cortados em pedaços de
aproximadamente 1,0 cm² e incubados com 12,5 U/mL de
dispase durante 15 horas, a 4°C. Após este período, a
epiderme e a hipoderme foram removidas do tecido e a derme
incubada com 0,25% de tripsina a e 0,02% EDTA (Gibco)
durante 45 minutos, a 37°C. Após o bloqueio da reação
enzimática com DMEM acrescido de 10% de soro bovino
fetal (SBF), a suspensão de células foi filtrada com cell
strainer de 70 μm (BD) e centrifugada durante 7 minutos a
392 g. As células foram então ressuspensas em DMEM
suplementado com 10% de SBF e antibióticos (PS) e mantidas em garrafas de cultura de 25cm² a 37ºC, em 5% de CO2 e 95%
de umidade. Após 4 dias, o meio de cultivo foi trocado e as
células não aderentes descartadas. As células que
38
permaneceram aderidas passaram a ser chamadas de células
tronco mesenquimais derivadas da pele (CTMp). As CTMp
foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de SBF
e antibióticos (PS), em garrafas de cultura de 25 cm2 a 37ºC,
em 5% de CO2 e 95% de umidade. Quando atingiram
confluência de 80% foram repicadas e consideradas em
passagem 1. As células foram utilizadas entre 1 e 5 passagens.
4.3 Irradição das CTMp com ultravioleta B (UVB)
Para a irradiação das CTMp com a luz UVB foi
utilizado um aparato totalmente fechado, a fim de eliminar a
incisão de outras radiações. A lâmpada ultravioleta (marca)
foi posicionada a uma altura definida neste aparato, na qual a
intensidade da radiação UVB (312 nm) incidente é de 34
μW/cm2. Para a definição das doses, as CTMp foram expostas
a essa intensidade, em períodos de tempos diferentes,
conforme tabela 1. Foi utilizado um mesmo grupo controle
para todas as doses, que foi mantido por 4 minutos em PBS
1X.
Para realizar o procedimento de irradiação, o meio de
cultivo foi retirado e as células foram mantidas em 3 mL de
PBS 1X durante a exposição às diferentes doses de radiação
UVB. Em seguida, foram incubadas com DMEM
suplementado com 10% de SBF a 37ºC, 5% CO2 e 95% de
umidade.
39
Tabela 1. Tempo de exposição das CTMs à radiação UVB
na intensidade de 34 uW/cm2 e suas respectivas doses.
Dose Tempo
2,5 mJ/cm² 1 min. 15s
5 mJ/cm² 2 min. 30s
10 mJ/cm² 4 min. 54s
20 mJ/cm² 9 min. 48s
30 mJ/cm² 14 min. 42s
40 mJ/cm² 19 min. 36s
50 mJ/cm² 24 min. 30s
4.4 Ensaio de MTT
Para a análise da viabilidade celular foi realizada uma
curva dose-resposta da sobrevida das CTMp irradiadas com
UVB, através do ensaio colorimétrico de MTT (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazólico). Esse ensaio
consiste na medição de atividade da redutase mitocondrial em
células vivas, baseando-se na clivagem do sal amarelo
tetrazólio para cristais de formazan azuis por células
metabolicamente ativas.
Para a realização do ensaio, 1x104 células foram
cultivadas em placas de 96 poços, e após atingirem
confluência de aproximadamente 70%-80% foram irradiadas
com 0, 2.5, 5, 10, 20, 30, 50 mJ/cm² de UVB, conforme o item
40
4.3. Após 24, 48 e 72 horas, as CTMp foram incubadas com
MTT (2,5 mg/mL) dissolvido em DMEM acrescido de 10%
de SBF, por 3 horas a 37ºC, em 5% de CO2 e 95% de umidade.
Após este período, o meio foi removido e 100μL de DMSO
(dimetilsulfóxido) foi acrescentado à amostra. A coloração
obtida a partir dessa solubilização com DMSO foi
quantificada por leitura de absorbância (470 nm) em leitor de
microplacas Tecan Infinite M200.
4.4 Análise da morfologia
Para avaliar a morfologia celular das CTMp após a
irradiação UVB nas doses de 2,5 e 5 mJ/cm², as células foram
irradiadas em suas respectivas doses conforme a tabela 1 e
então mantidas com meio DMEM suplementado com 10% de
SBF. As CTMp foram fotografadas imediatamente após
serem expostas à radiação UVB e 48h após o tratamento.
4.6 Análise de ciclo celular
As CTMp foram cultivadas 1x105 em placas de
100mm e, ao atingir a confluência de 70 a 80% foram
irradiadas com UVB (0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²), e após
48 horas foram incubadas com 0,05% de tripsina/EDTA
0,02% durante 5 minutos, a 37ºC. Após, foram ressuspensas
em PBS 1X acrescido de 10% de SBF, para bloqueio da
reação enzimática, e a concentração ajustada para 100.000
células/mL. A suspensão celular foi centrifugada por 5
minutos, a 392 g e, posteriormente, fixadas com 100 μl de
etanol 70% gelado, a -20ºC, durante 30 minutos. Em seguida,
as células foram lavadas com PBS 1X, novamente
centrifugadas, e incubadas com 100 μL de PBS Triton 0,1%,
100 μg/mL de RNAase e 14 μg/mL de iodeto de propídio, por
41
uma hora em temperatura ambiente. A leitura foi feita através
de um Citômetro de fluxo FACS Calibur da BD®, e os
resultados foram analisados pelo programa Flowing onde foi
possível verificar em qual período do ciclo celular as células
se encontravam, G0/G1, S ou G2. Os dados foram
apresentados em porcentagem.
4.7 Imunocitoquímica
As análises de dano de DNA e apoptose, foram
realizadas através do ensaio de imunocitoquímica. Para
avaliar o dano de DNA foi verificada a expressão da
fosfohistona H2aX fosforilada (-H2aX), e a apoptose pela
expressão de caspase-3.
Para isso, as CTMp foram fixadas com
paraformaldeído 4% durante 30 minutos, a temperatura
ambiente, e permeabilizadas com PBS-Triton X-100 (0,25%)
durante 30 minutos. Os sítios inespecíficos foram bloqueados
com 5% de SBF durante 40 minutos e em seguida, incubadas
com os anticorpos primários anti--H2aX (Millipore) e anti-
caspase-3 (Abcam AB13847). A incubação com o anticorpo
primário foi realizada por um período de 14 horas, a 4°C e,
após este período, foram realizadas 3 lavagens com PBS-
Tween 20 (0,05%). Em seguida foi realizada incubação com
o anticorpo secundário do tipo IgG2a e IgG conjugado ao
fluorocromo Alexa 488 ou 594 respectivamente, durante 1
hora, a temperatura ambiente, e posteriormente lavadas com
PBS Tween 20 (0,05%). Para a observação dos núcleos totais,
as células foram coradas com 4',6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI) (Sigma) durante 30 segundos, a temperatura
ambiente.
As marcações fluorescentes para os diferentes
marcadores analisados foram visualizadas em microscópio
42
epifluorescente Olympus IX71 e as imagens capturadas com
a câmera Olympus DP71. Para a quantificação das células foi
utilizado o programa Flowing Software.
4.8 Ensaio de viabilidade celular (vida/morte)
Para a distinção de células vivas de células mortas,
foi utilizado o Kit de viabilidade/citotoxidade
“LIVE/DEAD” (invitrogem). Esse kit utiliza dois
marcadores fluorescentes: a calceína (verde) para indicar a
atividade da esterase intracelular, e o etídio (vermelho) para
indicar perda da integridade da membrana. Assim, as células
marcadas em verde são consideradas vivas, e as vermelhas
células mortas.
As CTMp foram cultivadas em placas de 100mm e,
ao atingir a confluência de 70 a 80% foram irradiadas com
UVB (0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²) e após 48 horas foram
submetidas ao ensaio de vida/morte. Para isso, foram
incubadas com 0,05% de tripsina/EDTA 0,02% durante 5
minutos, a 37ºC. Após, foram ressuspensas em PBS 1X
acrescido de 10% de SBF, para bloqueio da reação
enzimática, e a concentração ajustada para 1x105 células/mL.
As células foram então centrifugadas por 5 minutos, a 392 g,
e posteriormente, incubadas com 2 μL de calceína e 4 μL de
iodeto de propídeo, de 15 a 20 minutos, a temperatura
ambiente, e protegido da luz.
A leitura foi feita através de um Citômetro de fluxo
FACS Calibur da BD®, e os resultados foram analisados pelo
programa Flowing. Os dados foram apresentados em
porcentagem.
43
5 RESULTADOS
5.1 Análise de viabilidade celular das CTMp
Para avaliar o efeito da radiação UVB sobre a
viabilidade das CTMp, estas foram expostas à diferentes
doses de UVB e, após 24, 48 e 72 horas foi realizado o ensaio
de MTT. Como resultado, foi observado que, quando
submetidas à dose de 2,5 mJ/cm² a viabilidade das CTMps foi
de aproximadamente 80%, mostrando uma redução em todos
os tempos analisados (Figura 5). Já na dose de 5 mJ/cm², a
viabilidade foi de cerca de 56% em 24 horas e 48 horas,
apresentando um aumento após 72 horas (67%). Em doses
mais altas (10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²) foram observadas
porcentagens de cerca de 50% após 24 horas e de cerca de
30% após 48 e 72 horas de cultivo.
Em resumo estes resultados mostram que a exposição
a baixas doses de UVB já é capaz de reduzir a viabilidade das
CTMp.
44
Figura 5. Viabilidade das CTMp após exposição a radiação
UVB.
Representação gráfica da viabilidade celular realizada através dos
ensaios de MTT . Os dados mostram a viabilidade das células
irradiadas com diferentes doses (2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm2)
de luz ultravioleta B em relação ao grupo controle (100%). Os
valores representam as médias ± desvio padrão de triplicata de 3
experimentos independentes. ***P<0,001 por ANOVA uma via
seguido de teste de Bonferroni em relação ao controle.
5.2 Análise da morfologia celular
As CTMp são caracterizadas por possuírem adesão
ao plástico e morfologia semelhante a fibroblastos (Figura
6). Assim, após a irradiação das CTMp com diferentes doses
de UVB, foi avaliada a morfologia das CTMp através de
microscopia de contraste de fase. Após 48 horas de cultivo
não foram observadas alterações morfológicas nas células
irradiadas com as doses de 2,5 e 5,0 mJ/cm2. Já nas doses de
10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm2 foram observadas várias células
em suspensão, além de debris celulares (dados não
mostrados).
45
Figura 6. Morfologia das CTMp após a irradiação por luz
UVB.
Imagens representativas do grupo controle e dos grupos de doses 2,5
mJ/cm2 e 5 mJ/cm2 em 0 horas e 48 horas após a irradiação. As
imagens foram adquiridas por microscopia de contraste de fase.
46
5.3 Análise de dano de DNA
Para avaliar os danos no DNA das CTMp submetidas
a irradiação UVB, foi analisada a expressão da histona γH2Ax
fosforilada. Sabe-se que após radiação ionizante ocorre
quebras duplas de DNA, levando a um bloqueio da replicação
e indução da fosforilação da histona H2AX na serina 139
(γH2AX). Assim, a γH2AX é um marcador característico em
resposta a quebras duplas de DNA, indicando dano. Foram
consideradas células positivas para γH2AX as que
apresentaram focis de marcação maior que 5 e as com
marcação pan-nuclear (núcleo completamente marcado)
(Figura 7A).
Foi observado que no grupo controle a maioria das
células apresentaram apenas um foci de γH2AX sendo
consideradas como nível basal de acordo com os critérios
estabelecidos (Figura 7B e C). Os dados obtidos mostram que
a porcentagem de dano de DNA é de 100% a partir da dose de
30mJ/cm² e que em doses baixas (2,5 e 5 mJ/cm²) o dano é
significativamente menor do que em doses superiores (Figura
7B e C). Nas CTMps expostas, as doses de 2,5 e 5 mJ/cm²,
4% e 6% das células expressam mais que 5 focis de γH2AX,
respectivamente. Já a exposição a doses superiores (10 – 50
mJ/cm²) induziu um aumento significativo na expressão de
γH2AX em relação ao grupo controle e as doses de 2,5 e 5
mJ/cm². As células irradiadas com doses de 30, 40 e 50
mJ/cm² apresentavam uma maior quantidade de núcleos com
marcação pan-nuclear.
47
Figura 7. Expressão de γH2AX nas CTMp irradiadas UVB.
(A) Imagens representativas da marcação de γH2aX. A primeira
coluna mostra a marcação da fosfohistona γH2aX, em que núcleos
celulares que apresentam focis abaixo de 3 são consideradas
marcações a nível basal para dano. Acima de 3 focis são
consideradas positivas, bem como as que apresentam marcação pan-
nuclear. A segunda coluna mostra a marcação nuclear por DAPI e
na terceira coluna está representada a sobreposição das imagens
anteriores. (B) O gráfico mostra a proporção de células positivas
para fosforilação da fosfohistona H2aX. Os valores representam as
médias ± desvio padrão de triplicata de 3 experimentos
independentes. ***P<0,001 por ANOVA uma via seguido de teste
de Bonferroni em relação ao controle. (C) O grupo controle e as
doses de 2,5, 5, 10 e 50 mJ/cm2 estão representadas por imagens
adquiridas por microscopia de fluorescência.
48
5.4 Análise de ciclo celular por citometria de fluxo
Células com danos de DNA são reconhecidas por
proteínas presentes no sistema de checagem do ciclo celular.
Durante esse reconhecimento, ocorre uma parada no ciclo
celular, o que proporciona mais tempo para que ocorra o
reparo do DNA para que o dano não se perpetue após a síntese
de DNA e a segregação cromossômica. Em caso de
persistência do dano, é ativada a cascata de sinalização para a
morte celular. Assim, foi avaliada a progressão no ciclo
celular das CTMp irradiadas com UVB por citometria de
fluxo (Figura 8).
A partir dos resultados anteriores, foram selecionadas
as três doses mais baixas para análise do ciclo celular (2,5, 5
e 10 mJ/cm²). Nos resultados obtidos, os picos observados no
histograma (Figura 8A) representam uma população de
células em diferentes fases do ciclo celular. As células que não
estão dentro das regiões prédeterminadas são células não
viáveis.
O grupo controle (não irradiado) apresentou cerca de
92% de células em G0/G1, 1% em fase S e 7% em G2.
Quando irradiadas há uma diminuição de células em fase
G0/G1 de aproximadamente 9%, 12% e 7% nas doses de 2,5,
5 e 10 mJ/cm², respectivamente. Nas fases S e G2 há um
aumento de cerca de 5% no número de células de todos os
grupos irradiados em relação ao grupo controle. (Figura 8B).
Estas diferenças não tiveram significância estatística.
Com essa análise foi observado que a radiação por luz
ultravioleta B parece afetar o ciclo celular das CTMp,
indicando uma parada no ciclo celular na fase S e G2.
49
Figura 8. Dados referentes à porcentagem de células nas
diferentes fases do ciclo celular.
Histograma representativo da população de células dos grupos
controle e irradiados nas fases G1, S e G2 do ciclo celular (A).
Gráfico que mostra a porcentagem de células nas fases do ciclo
celular entre os diferentes grupos irradiados e o grupo controle (B).
Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o número de
células dos grupos controle e irradiados.
50
5.3 Análise de morte celular
Os resultados obtidos até o momento indicam que a
radiação UVB, na doses mais baixas, causam danos no DNA
e que isto provoca parada no ciclo celular das CTMps. Assim,
para avaliar se o processo de morte celular é ativado,
primeiramente foi avaliada a quantidade de células viáveis e
inviáveis no grupo controle e nos grupos irradiados com luz
UVB, através do ensaio de morte/vida (Figura 9). As células
não-viáveis correspondem a células necróticas e apoptóticas.
Os dados obtidos através de citometria de fluxo
mostra que o número de células viáveis foi reduzido de
maneira dose dependente após a exposição à radiação UVB.
No grupo controle observa-se 95% de células viávies. Em
células irradiadas há uma redução no número de CTMp
viáveis de aproximadamente 10%, 20% e 45% nas doses de
2,5, 5 e 10 mJ/cm2, respectivamente. Não houve diferença
significativa na dose de 2,5 mJ/cm2 em relação ao grupo
controle.
Da mesma forma, o número de células não viáveis
aumenta também de forma dose depentente após a irradiação
por UVB. O aumento de quantidade é de cerca de 15% e 45%
nas doses de 5 e 10 mJ/cm², respectivamente. A dose de 2,5
mJ/cm² não apresentou diferença significativa em relação ao
grupo controle.
51
Figura 9. Efeito da irradiação UVB na quantidade de
CTMps viáveis e inviáveis dos diferentes grupos (controle e
irradiados).
Gráfico que demonstra a quantidade, em porcentagem, de células
viáveis e inviáveis nos grupos controle e irradiados. ***P<0,001 por
ANOVA uma via seguido de teste de Bonferroni em relação ao
controle.
Os resultados obtidos até então indicam que dentre as
células não viáveis, existe uma população de células
apoptóticas. Então, para analisar se a cascata de sinalização
de apoptose foi desencadeada após a irradiação UVB, foi
avaliada a expressão de caspase-3 por imunocitoquímica. Os dados mostram um aumento de células positivas para caspase-
3 após a irradiação UVB. As células irradiadas com 2,5, 5 e
52
10 mJ/cm2 apresentaram um aumento de cerca de 1, 6 e 16
vezes na expressão de caspase-3, respectivamente. Entretanto,
as células irradiadas com 2,5 e 5 mJ/cm2 não apresentaram
diferenças significativas em relação ao controle (Figura
10A). Foi observado também que as células positivas para
caspase-3 possuem morfologia alterada, apresentando
vesículas citoplasmáticas e menos pontos de adesão ao
substrato (Figura 10B).
53
Figura 10. Análise da apoptose após irradiação UVB das
CTMps.
O gráfico mostra a porcentagem de células com marcação positiva
para anti-caspase 3+. **P<0,001 por ANOVA uma via seguido de
54
teste de Bonferroni em relação ao controle (A). Imagens
representativas obtidas por microscopia de florescência de todos os
grupos foram dispostas para mostrar as marcações de DAPI e
caspase 3 (B).
55
6 DISCUSSÃO
A pele é o maior órgão humano, sendo continuamente
renovado para que sua viabilidade e integridade sejam
mantidas e, assim, possa prover proteção para o corpo. A
homeostase do tecido é mantida por CTs epidermais presentes
na camada externa da epiderme e pelas CTM nas camada
interna da derme. Essas células são frequentemente afetadas
pelo ambiente, principalmente em áreas do corpo que estão
continuamente expostas à diferentes agentes estressores que
podem danificar direta e indiretamente o DNA celular, como
a RUV. A radiação UV é um dos maiores responsáveis por
danos de DNA em CT e a diminuição dessas células na pele
pode prejudicar a homeostase tecidual (PANICH et al., 2016).
Sendo assim, nosso objetivo foi avaliar o efeito da radiação
UVB em CTMp a fim de verificar o perfil que as CTMp
apresentam após a irradiação por UVB. Assim, foi analisado
neste trabalho a viabilidade, dano de DNA, morfologia, ciclo
celular e morte das CTMp, após a irradiação com diferentes
doses de UVB.
Os resultados obtidos mostram que a viabilidade das
CTMp irradiadas com UVB foi reduzida de forma dose
dependente. Mesmo em doses consideradas baixas na
literatura (2,5 e 5,0 mJ/cm2), foi observada uma diminuição
significativa de 20% em relação ao grupo controle. Com base
nos resultados obtidos no trabalho de Jeong e colaboradores,
o qual avaliou a habilidade de baixas doses de luz UVB em
estimular a sobrevivência, migração e atividade de formação
de tubos de CTM do tecido adiposo, os resultados do nosso
estudo foram discrepantes. Enquanto no trabalho de Jeong o
tratamento com radiação UVB aumentou a sobrevivência de
células tronco mesenquimais do tecido adiposo, no presente
trabalho não foi observado aumento de viabilidade celular.
Essas diferenças podem ter ocorrido pelo fato de as CTM de
diferentes tecidos responderem de maneira distinta frente a
exposição a UVB.
56
Outro fator que pode ter influência são as doses de
UVB utilizadas, pois, apesar de iguais, podem não
corresponder a mesma intensidade. Durante o estudo da
literatura foi visto que os trabalhos não descrevem claramente
a intensidade e o tempo utilizados em seus experimentos de
irradiação. Assim, mesmo que a dosagem de radiação UVB
seja a mesma, a diferença em intensidade e o tempo de
exposição fazem com que os efeitos sejam diferentes. Em
trabalho recente foi demonstrado que efeitos biológicos
opostos ocorrem in vivo quando a dosagem permanece
constante, mas é exposto a diferentes tempos e intensidades
de radiação UVB. Os autores sugerem que os trabalhos devem
informar a intensidade (mW/cm2) e o tempo de exposição
(segundos) utilizados nos experimentos, além da dosagem
(mJ/cm2) para que os dados sejam mostrados corretamente
(LIDA et al., 2016).
Pelo fato da pele estar mais exposta a condições que
danificam o DNA celular, trabalhos sugerem que as CT sejam
altamente resistentes ao envelhecimento e dano de DNA e
possuam diversos processos ativos de mecanismos de reparo
(RACILA & BICKENBACH, 2009; STERN &
BICKENBACH, 2007; GIANGRECO et al., 2008). Nossos
resultados mostram que conforme o aumento da dose de
irradiação UVB, há um aumento na quantidade de células
positivas para γ-H2AX e na quantidade de focis nucleares.
Sabe-se que a expressão deste marcador está associada a uma
resposta à lesão no DNA, sendo então, amplamente utilizado
na literatura como um indicador de dano. Foi observado que
nas doses mais baixas, o número de células positivas para este
marcador foi estatisticamente semelhante ao das CTMp não
irradiadas, indicando que estas doses de radiação não são
suficientes para afetar o DNA das CTMp. Entretanto, não
foram encontrados dados na literatura sobre a expressão de
danos ao DNA em CTMp.
Em resposta à lesão no DNA, são ativados
mecanismos de reparo que afetam a progressão no ciclo
57
celular. Sabe-se que células expostas a UV, ao sofrer dano
direto no seu DNA, acumulam proteínas responsáveis por
iniciar o processo de checagem e reparo e assim, é ativada a
transcrição de genes de reparo de DNA (PEI & STRAUSS,
2013). Dependendo das proteínas que forem ativadas nessa
etapa, e se o erro persistir ao longo do ciclo celular, a radiação
UV pode induzir a parada em G1, S e G2 (LIMA, 2014). Os
resultados do nosso estudo mostram um aumento de células
nas fases S e G2, indicando parada no ciclo nestas fases,
apesar de não ter sido encontrada diferença estatística entre os
grupos. Entretanto, isso se deve ao fato de o número amostral
para este experimento ser pequeno (n=2). Acredita-se que
aumentando o número de análises, haverá significância
estatística. Além disso, sugere-se análises mais especificas de
proteínas envolvidas com a checagem do ciclo celular, como
p53, Chk1 e Chk2 para melhor avaliar as alterações na
progressão do ciclo celular das CTMps irradiadas com UVB.
Com a parada no ciclo celular, proporciona-se mais
tempo para que o reparo ocorra. Havendo reparo, a célula
sobrevive e continua seu ciclo e, caso o reparo não seja
efetivo, pode levar à morte celular. Assim, com base nos
resultados anteriores foi avaliada a morte celular das CTMps
expostas a radiação UVB, e foi observado um aumento no
número de células não viáveis e, mais especificamente, em
células apoptóticas. Na dose mais baixa de radiação UVB (2,5
mJ/cm2) o número de células viáveis é semelhante a do
controle (diminuição de 10%). As doses de 5 e 10 mJ/cm2
apresentam diminuição no número de células viáveis e
aumento das inviáveis. Considerando que a radiação UVB é
um agente estressor, espera-se que hajam mais células em
processo de apoptose em grupos irradiados. Entretanto, alguns
trabalhos vem mostrando que pode haver aumento de
proliferação celular em células expostas à radiação UVB
(JEONG et al., 2013).
O presente estudo é o primeiro a mostrar o efeito da
radiação UVB em CTM derivadas da pele. Os nossos
58
resultados mostram que as CTMps mostram-se sensíveis à
exposição UVB, mesmo nas baixas doses utilizadas neste
estudo. Assim, acreditamos que no organismo, essas células
possam ser afetadas negativamente pela radiação UVB e
acometer a homeostase tecidual, provocando envelhecimento
precoce e reparo menos eficiente do tecido. Entretanto, para
confirmar esta hipótese, análises in vivo devem ser realizadas.
Sugerimos ainda, que apenas as doses de 2,5 e 5
mJ/cm2 podem ser utilizadas para o pré-condicionamento das
CTMp. Outras formas de pré-condicionamento já foram
utilizadas com o objetivo de aumentar o potencial
regenerativo de diversas células tronco (REHMAN et al., 2004; SAMPAT et al., 2011; PETERSON et al., 2011). Sendo
assim, analisar o potencial regenerativo das CTMp pré-
condicionadas com radiação UVB, além do seu meio
condicionado (secretoma) é uma das perspectivas desse
estudo.
59
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados desse trabalho, sugere-se
que altas doses de radiação UVB diminuem a viabilidade das
CTMp ao causar dano no DNA dessas células de forma dose
dependente. Ao reconhecer a lesão, as células ativam vias de
resposta que promovem parada no ciclo celular, culminando
então, na ativação da cascata de sinalização para morte
celular. Porém, quando expostas à baixas doses de radiação
UVB, as CTMp não apresentam diferenças na quantidade de
células positivas para dano de DNA e morte celular em
relação ao controle, apesar de haver diminuição da viabilidade
celular. Também não foram observadas diferenças
morfológicas entre os grupos irradiados e controle em baixas
doses.
Figura 11. Representação esquemática dos possíveis
efeitos da radiação UVB nas CTMp
1. Quando expostas à baixas doses de radiação UVB (2,5 e 5
mJ/cm2) não há diferenças na morfologia entre os grupos irradiados
e o grupo controle. Também não são observados aumento de lesão
no DNA e células em processo de apoptose. Entretanto, há
diminuição da viabilidade celular. 2. A radiação UVB, nas doses
consideradas altas, causam lesão no DNA nas CTMp, as quais
ativam vias de resposta para que haja parada no ciclo celular e então,
60
não obtendo sucesso no reparo de DNA, sinaliza para que ocorra o
processo de morte celular, assim, diminuindo a viabilidade das
CTMp. Esse processo ocorre de maneira dose-dependente, havendo
uma maior quantidade de células mortas quanto mais elevada a dose
de radiação UVB. Fonte: Elaborado pela autora.
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