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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada Universidade de So Paulo
ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS
UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS
Natlia Malavasi Vallejo
Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
So Paulo
2013
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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada Universidade de So Paulo
ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS
UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS
Natlia Malavasi Vallejo
Tese apresentada como parte dos
requisitos para obteno do Grau de
Doutor em Cincias na rea de
Tecnologia Nuclear Aplicaes.
Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
So Paulo
2013
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Dedico este trabalho s pessoas mais
importantes da minha vida: meus pais, Paulo e Beth,
que confiaram no meu potencial para esta conquista.No conquistaria nada se no estivessem ao meu lado.
Obrigada, por estarem sempre presentes a todos os
momentos, me dando carinho, apoio, incentivo,
determinao, f, e principalmente pelo Amor de vocs!
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Agradecimentos
Agradeo principalmente Deus, por ter me dado a vida e estar sempre do
meu lado, permitindo que com o passar do tempo eu possa evoluir principalmente
como ser humano.
Aos meus pais, Pauloe Beth, por dedicarem a vida por mim, por fazer de
mim quem sou hoje, e pelo amor incondicional que sempre me fez seguir no
caminho que escolhi.
Ao meu irmo Diego e a minha tia Eliane, mesmo que de longe,
participaram de mais esta conquista e tenho certeza que torceram todos os dias
pelo meu sucesso. Muito Obrigada, Amo vocs!!
Ao Bruno, pelo apoio em tudo que fao, pela dedicao, pacincia e amor
durante todos esses anos.
minha orientadora Ligia Ely Morganti Ferreira Dias, pela oportunidade
de ser sua aluna, pela confiana depositada em mim e por compartilhar comigo
seus conhecimentos e experincias profissionais.
Ao Prof. Dr. Patrick Jack Spencer, por toda a ajuda e conselhos na
realizao deste trabalho e por dividir comigo seus conhecimentos e experincias
no laboratrio durante todos esses anos.
Ao Dr. Carlos Bonaf, pela colaborao permitindo a utilizao do sistema
de presso do Laboratrio Termodinmica de Protrenas da UNICAMP e a
Julianae Joelmapela ajuda na realizao dos experimentos.
Ao Dr. Geraldo Santana Magalhes, pela doao do gene da eGFP.
Ao Dr. Shaker Chuck Farah, a Cristiane Guzzo, ao Maicone ao Raphael
pela doao dos genes das protenas de Xac e pela ajuda na realizao dos
experimentos de purificao e atividade biolgica destas protenas.
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As amigas de trabalho, Laura, Daniella e Rosa, cada uma com o seu
jeitinho aprendi que a convivncia com as pessoas no fcil, porm
impossvel realizar o trabalho sozinha. Sem vocs o trabalho ficaria muito mais
difcil, a cada uma o meu muito obrigada!!!
s amigas que fiz no IPEN, Danielle, Keli, Larissa, Karina e Renata,
pelas conversas, conselhos, saidinhas, almoos e tardes de risadas que tivemos
durante todos esses anos de amizade. Muito Obrigada!
Aos amigos que fiz no IPEN, Alberto (Troxinha), Mariana, Tamara,
Rodrigo, Vincent, Eliza, Bia, Fernanda, Bruno, Ed Carlos, Allison, Daniele e a
tantos outros.
A todos os funcionrios do Centro de Biotecnologia do IPEN, que cada um
em seu setor fez parte da realizao deste trabalho, Rute, Arlete, Z Maria,
Junqueira, Joo, Sr. Longino, Sandra, Beth, Nia, Marisa, Gislaine, sem
vocs no seria possvel.
s amigas, Renata (Fuba), Flavinha (Florzinha)e Claudinha (Japa)pela
amizade, pelo companheirismo, pelo apoio, pela pacincia, pelas risadas e choros
e por todos esses anos inesquecveis que passamos juntas. Muito Obrigada pela
amizade!!
s amigas, Bianca, Giovanna, Thas, Gabie Thalita, que com o passar do
tempo cada uma tomou um caminho diferente e no importa a distncia e o tempo
que passamos sem nos falar ou nos ver, que a amizade, o carinho e o amor
continuam os mesmos, e tenho certeza que torcem pela minha felicidade. Muito
Obrigada!!!
Ao CNPq e a FAPESPpelo apoio financeiro.
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S depois que o passado passou que a gente descobre o quanto ele foi
bom enquanto durou
Eno Teodoro Wanke
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ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS
UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS
NATLIAMALAVASIVALLEJO
RESUMO
No presente trabalho estudamos a renaturao sob alta presso
hidrosttica de uma forma mutante da protena verde fluorescente (enhanced
GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescncia caracterstica quando enovelada
na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da
bioatividade da protena recombinante, a fluorescncia, como alternativa determinao de solubilidade da protena, fator que no um indicador ideal de
enovelamento proteico adequado. A ao da alta presso na solubilizao dos
corpos de incluso (CI) de eGFP produzidos em bactrias E. colirecombinantes e
no enovelamento da protena foi estudada. A compresso dos CI de eGFP em 2,4
kbar durante 30 minutos promoveu a dissociao dos agregados. No entanto, a
incubao nesta condio no favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo
de renaturao foi avaliado em diversas condies de descompresso aps a
dissociao em 2,4 kbar. Durante a descompresso gradual, o aumento da
fluorescncia foi obtido em presses que variaram entre a presso atmosfrica e
1,38kbar. Os nveis mais elevados de fluorescncia de eGFP foram obtidos por
incubao durante vrias horas a nveis de presso entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta
condio de presso se mostrou favorvel renaturao de eGFP e possvel
que tambm possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras
protenas monomricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que
os CI desta protena produzidos por bactrias cultivadas em menor temperatura
(37C) possuem maior quantidade de protena recombinante apresentando a
fluorescncia caracterstica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os
CI expressos em temperaturas mais elevadas (42C e 47C). A anlise realizada
por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) tambm demonstrou que os CI
produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas
secundrias semelhantes s da protena na sua forma nativa. Alm disso, os CI
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produzidos a 37C tambm so mais facilmente solubilizados pela ao da alta
presso do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a
renaturao da eGFP a partir de CI produzidos a 37C foi 25 vezes mais eficiente
do que a obtida utilizando CI produzidos a 47C. No presente estudo
demonstramos tambm que a dissociao dos agregados exercida pela ao daalta presso (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associao com a
incubao em baixa temperatura (-9C) e que a combinao destas duas
propriedades fsicas eleva a solubilizao dos agregados em CI, com a
consequente elevao dos rendimentos de renaturao de eGFP. Mostramos
ainda no presente estudo que a cintica de renaturao de eGFP em 0,69 kbar
proporcional temperatura de incubao (entre 10C e 50C). O nvel mais
elevado de fluorescncia foi obtido quando a renaturao de eEGP foi realizada a
20C. A taxa de maturao do cromforo da eGFP mais fortemente afetada pelatemperatura do que a taxa de enovelamento da protena. Em concluso, a
temperatura de produo dos CI, a temperatura de dissociao dos agregados e
a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cintica da
renaturao de eGFP em alta presso.
Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para
melhorias no processo de enovelamento de protenas a partir de CI utilizando alta
presso. Tambm neste trabalho descrevemos a renaturao das protenas de
Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na
forma solvel. Os rendimentos de solubilizao destas trs protenas foram muito
altos, entre 75% e 89%. A protena PilB renaturada em alta presso apresentou
atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de
Xac.
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RENATURATIONSTUDIESOFAGGREGATEPROTEINSUSING
HIGHHYDROSTATICPRESSURE
NATLIAMALAVASIVALLEJO
ABSTRACT
In the present work we studied the refolding under high hydrostatic pressure
of a mutant form of the green fluorescent protein (eGFP), which only emits the
green characteristic fluorescence when in the native folded state. The approach of
the present study was focused on controlling the bioactivity of the recombinant
protein, the fluorescence, as an alternative for the determination of proteinsolubility, which is not an ideal indicator of proper protein folding. We studied the
action of high pressure in the solubilization of the inclusion bodies (IB) of eGFP
produced in bacteria E. coliand in the folding of this protein. The compression of a
suspension of eGFP IB at 2.4 kbar for 30 minutes promoted dissociation of
aggregates. However, the eGFP folding, monitored by the fluorescence at 509 nm,
does not occur in this pressure level. The process of eGFP refolding was
evaluated under various decompression conditions after dissociation of the IB at
2.4 kbar. During the gradual decompression, the increase in fluorescence was
achieved at pressures ranging between atmospheric pressure and 1.38 kbar. The
higher levels of eGFP fluorescence were obtained by incubation for several hours
at pressure levels between 0.35 and 0.69 kbar. It is possible that the pressure
condition that proved favorable for refolding of eGFP can also be used to favor the
folding of other monomeric proteins. Using eGFP as a model, we also found that
the IB produced by bacteria grown in a relatively low temperature (37C) is more
fluorescent, presenting a higher amount of recombinant protein with the
characteristic fluorescence at 509 nm, i.e., in its native form, than the IB expressed
at higher temperatures (42C and 47C). The analysis by infrared spectroscopy
(FT-IR) also demonstrated that the IB produced at milder temperatures have a
higher degree of secondary structure similar to the protein in its native form.
Furthermore, the IB produced at 37C are also more readily solubilized by the
action of high pressure than those produced at the higher temperatures. As
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expected, the folding of eGFP from IB produced at 37C was 25 times more
efficient than that obtained using IB produced at 47C. In this study we
demonstrated that the dissociation of aggregates exerted by the action of high
pressure (2.4 kbar) can be amplified by combination with incubation at low
temperature (-9C) and the association of these two physical properties can beused to increase the solubilization of the aggregates in IB, with a consequent
increase in the yield of eGFP refolding. In the present study we also showed that
the kinetics of refolding of eGFP is proportional to temperature (10C 50C). The
higher level of fluorescence was obtained when the refolding of eGFP was
performed at 20C. The rate of maturation of the eGFP chromophore is more
strongly affected by temperature than the rate of folding of the protein. In
conclusion, the temperature of production of IB, the temperature of dissociation of
aggregates and the folding temperature can greatly affect the yield and kinetics ofrefolding of eGFP at high pressure.
The results of this study may open new perspectives for improvements in
the process of protein folding from IB using high pressure. In this paper we also
describe the refolding of the proteins ofXac, PilB and the gene products XAC2810
and XAC3272, which have never before been achieved in soluble form. The yields
of solubilization/refolding of these three proteins were very high, between 75% and
89%. The protein PilB refolded at high pressure presented high ATPase activity,
which has never been shown for the PilB ofXac.
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NDICE DE TABELAS
Tabela 1. Exemplos de organismos bioluminescentes (Chalfie 1998). 12
Tabela 2.Antibiticos utilizados para expresso das protenas e genes alvos. 29
Tabela 3.Esquemas de Compresso e Descompresso. 31Tabela 4.Rendimento de renaturao de eGFP em alta presso hidrosttica. 51
Tabela 5.Taxas de aquisio de fluorescncia 62
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NDICE DE FIGURAS
Figura 1.Microscopia eletrnica de varredura (MEV) dos CI do fator estimulador
de colnias granulocitrias humano (G-CSF)......................................................... 2
Figura 2.Etapas para a recuperao de protenas solveis a partir de CI............ 4Figura 3. Efeitos da alta presso hidrosttica ocasionando a dissociao de
protenas oligomricas e a desnaturao das subunidades................................... 8
Figura 4.Aequoria victoria....................................................................................13
Figura 5.Estrutura tridimensional da GFP............................................................15
Figura 6.Mecanismo para a maturao do cromforo. ........................................15
Figura 7.Citros mostrando sintomas de Cancro ctrico........................................19
Figura 8. Vista area da erradicao de rvores de laranja em um raio de 30
metros em relao ao centro do foco da contaminao porXac...........................19
Figura 9.Bomba e vaso de presso.....................................................................31
Figura 10. Espectrofluormetro acoplado a uma clula de presso, gerador de
presso, e banho termostatizado. .........................................................................35
Figura 11.Cubeta de quartzo selada com tampa flexvel de silicone...................35
Figura 12.Efeito da alta presso na dissociao de CI de eGFP (EL e MEV). ....41
Figura 13. Intensidade de Fluorescncia de eGFP renaturada sob diferentes
mtodos de compresso e descompresso..........................................................44
Figura 14. Intensidade de Fluorescncia de eGFP a partir de suspenses de CI
submetidos a 2,4 kbar de presso utilizando diferentes presses intermedirias na
renaturao. ..........................................................................................................45
Figura 15.Renaturao e solubilizao dos CI de eGFP.....................................48
Figura 16.Espectros na regio de amida I das amostras liofilizadas, eGFP nativa
purificada e CI produzidos em diferentes temperaturas. .......................................54
Figura 17.Intensidade de fluorescncia especfica de suspenses de CI de eGFP
produzidos em diferentes temperaturas. ...............................................................55
Figura 18.Dissociao de suspenses de CI de eGFP pela ao de alta presso
e monitorado pelo EL. ...........................................................................................56
Figura 19. Intensidade de fluorescncia da eGFP renaturada a partir de CI
produzidos em diferentes temperaturas. .............................................................. 57
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Figura 20.Efeito de alta presso e baixa temperatura na dissociao dos CI de
eGFP e na renaturao da protena......................................................................59
Figura 21.Cintica de renaturao da eGFP a 0,69 kbar. ...................................62
Figura 22. Cintica de fluorescncia de suspenses de CI e protena nativa,
submetidos a 2,4 kbar, despressurizao para 0,69 kbar e incubao emdiferentes temperaturas. .......................................................................................62
Figura 23.Efeito de diferentes concentraes de Gnd HCl na dissociao dos CI
produzidos em diferentes temperaturas de cultivo. ...............................................64
Figura 24. Rendimentos de solubilizao das suspenses de CI submetidas
renaturao em alta presso. Seleo de proporo de glutationas
reduzida/oxidada...................................................................................................66
Figura 25. Rendimentos de solubilizao das suspenses de CI submetidas
renaturao em alta presso. Seleo de proporo das concentraes de GndHCl. .......................................................................................................................67
Figura 26. Rendimentos de solubilizao das suspenses de CI submetidas
renaturao em alta presso. Presena de diferentes aditivos.............................69
Figura 27. Rendimentos de solubilizao das suspenses de CI submetidas
renaturao em alta presso. Efeito de diferentes mtodos de compresso e
descompresso.....................................................................................................72
Figura 28.Cromatografia em coluna de excluso molecular (Superdex 200) das
protenas solveis deXac. ....................................................................................74
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Lista de Abreviaturas
A Absorbncia
aa Aminocidos
bis-ANS 4,4-dianilino-1,1-binaftil-5,5-sulfonato
BSA Albumina bovina srica
CI Corpos de incluso
D.O. Densidade ptica
Da Daltons
DTT 1,4-ditiotreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA cido etilenodiamino tetra-actico
eGFP Enhanced green fluorescent protein
EL Espalhamento de luz
FT-IR Espectroscopia de infravermelho
g Acelerao da gravidade
Gdn HCl Hidrocloreto de guanidina
GFP Green fluoroscence protein
GSH Glutationa reduzia
GSSG Glutationa oxidada
IPTG Isopropil, -D-tiogalactopiranosdeo
L-Arg L-Arginina
MEV Microscopia eletrnica de varredura
NaCl Cloreto de Sdio
PEG Polietilenoglicol
SDS Dodecil sulfato de sdio
SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida
Tris Tris(hidroximetil)aminometanoTween 20 Polioxietileno sorbitol monolaureato
Xac Xanthomonas axonopodispv citri
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SUMRIO
1. INTRODUO ................................................................................................... 1
1.1. Expresso de protenas recombinantes....................................................... 1
1.2. Processos Clssicos de Renaturao ......................................................... 41.2.1. Renaturao de protenas agregadas em CI utilizando altas presses
hidrostticas ...................................................................................................10
1.3. Protena Verde Fluorescente ......................................................................11
1.3.1. Bioluminescncia .................................................................................11
1.3.2.Aequorea victoria .................................................................................12
1.3.3. Protena verde fluorescente selvagem (GFP) e Enhanced GFP
(eGFP) ...........................................................................................................14
1.4. Protenas de Xanthomonas axonopodis pv citri ..........................................17
1.4.1. Papel do cancro ctrico na economia brasileira....................................17
1.4.2.Xanthomonas axonopodispv citri........................................................20
1.4.3. Genmica Funcional e Protemica ......................................................20
2. OBJETIVOS ......................................................................................................24
3. MATERIAIS E MTODOS.................................................................................25
3.1. Materiais .....................................................................................................25
3.1.1. Equipamentos e acessrios principais .................................................25
3.1.2. Reagentes e solues..........................................................................26
3.1.3. Linhagem celular bacteriana ................................................................27
3.1.4. Vetores plasmdicos.............................................................................28
3.2. Mtodos......................................................................................................28
3.2.1. Transformao e expresso.................................................................28
3.2.2. Lavagem dos CI ...................................................................................29
3.2.3. Solubilizao dos CI.............................................................................30
3.2.4. Pressurizao dos CI ...........................................................................30
3.2.5. Agentes de xido-reduo ...................................................................32
3.2.6. Agente solubilizante .............................................................................32
3.2.7. Aditivos.................................................................................................32
3.2.8. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) ...........................33
3.2.9. Medidas de fluorescncia e de espalhamento de luz (EL) .................. 34
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3.2.10. Dissociao dos CI sob alta presso hidrosttica e temperaturas
negativas........................................................................................................35
3.2.11. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) .......................................36
3.2.12. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)...........................................36
3.2.13. Purificao por cromatografia de afinidade por metais imobilizados..373.2.14. Clculo das taxas de constantes de aquisio de fluorescncia........37
3.2.15. Caracterizao das protenas solveis PilB e produtos dos genes
XAC2810 e XAC3272 por cromatografia de excluso molecular ...................38
3.2.16. Anlise de atividade biolgica das protenas renaturadas sob alta
presso hidrosttica.......................................................................................38
4. RESULTADOS E DISCUSSO.........................................................................40
4.1. Protena verde fluorescente (GFP) .............................................................40
4.1.1. Dissociao dos CI utilizando alta presso hidrosttica.......................404.1.2. Renaturao de CI de eGFP sob alta presso hidrosttica .................42
4.1.3. Estados renaturados e no renaturados permanecem solveis aps a
descompresso..............................................................................................46
4.1.4. A presena de Gdn HCl desfavorece a renaturao de eGFP.............50
4.1.5. Influncia da temperatura de expresso na estrutura secundria da
eGFP nos CI ..................................................................................................51
4.1.6. A fluorescncia dos CI depende da temperatura de cultivo das
bactrias.........................................................................................................54
4.1.7. Efeito de presso e temperatura na dissociao dos agregados e na
renaturao de eGFP sob alta presso hidrosttica ......................................57
4.1.8. Cintica de renaturao da eGFP em diferentes temperaturas sob alta
presso ..........................................................................................................59
4.2. Protenas de Xac ........................................................................................63
4.2.1. Seleo da temperatura de cultivo dos CI............................................63
4.2.2. Efeito das diferentes propores de glutationas reduzida/oxidada na
solubilizao das protenas............................................................................65
4.2.3. Efeito de diferentes concentraes de Gdn HCl na solubilizao dos CI
sob presso....................................................................................................66
4.2.4. Efeito de diferentes aditivos na solubilizao dos CI sob presso .......68
4.2.5. Efeito de diferentes mtodos de compresso e descompresso na
solubilizao e renaturao de CI ................................................................. 71
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4.2.6. Caracterizao das protenas deXacpor cromatografia de excluso
molecular........................................................................................................72
4.2.7. Anlise de atividade biolgica das protenas deXacrenaturadas sob
alta presso hidrosttica ................................................................................75
5. CONCLUSES .................................................................................................776. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................80
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1. INTRODUO
1.1. Expresso de protenas recombinantes
A produo de protenas recombinantes tornou-se uma ferramenta muito
valiosa para a pesquisa e a terapia com protenas de interesse, essencial para a
indstria biotecnolgica, oferecendo suporte para a expanso da pesquisa
biolgica moderna, incluindo a genmica estrutural e a protemica (Ventura and
Villaverde 2006; Fahnert 2012). O sistema de expresso de protenas heterlogas
no glicosiladas mais comumente empregado utiliza a bactria Escherichia coli
como hospedeira. Este sistema amplamente difundido devido facilidade e
baixo custo de cultivo das bactrias em condies laboratoriais, pela alta
reprodutibilidade e em muitos casos pela abundncia de produo das protenas
de interesse. No entanto, ao expressar protenas recombinantes em bactrias, um
dos efeitos secundrios mais comuns a formao de corpos de incluso (CI)
(Baneyx and Mujacic 2004; Liovic, Ozir et al. 2012). A agregao das cadeias
polipeptdicas como CI pode se apresentar como um problema para a
biotecnologia, dificultando a produo e a comercializao de muitas protenas de
interesse (Fahnert, Lilie et al. 2004).
Vrios sistemas de expresso e condies de cultivo foram aprimoradoscom o objetivo de evitar a formao de CI. Contudo, a formao destes
agregados proteicos ainda muito comum e muitas vezes inevitvel (Hartley and
Kane 1988). Apesar da produo dos CI ser considerada, de modo geral,
indesejada, sua formao pode ser vantajosa. Os principais benefcios
associados aos CI so: produo de elevados nveis de protenas, baixo custo,
homogeneidade da protena alvo, resistncia protelise e como resultado,
baixos nveis de degradao da protena expressa e fcil isolamento e
purificao. No caso da protena de interesse ser txica para as clulashospedeiras, a produo em CI se torna praticamente a nica opo vivel de
expresso (Clark 2001; Singh and Panda 2005).
A formao de CI um processo complexo e depende das condies de
cultivo e do tipo de expresso das protenas. Alguns fatores envolvidos no
processo de agregao incluem: alta concentrao local de protena sintetizada;
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acmulo de protenas com a conformao completa ou parcialmente incorreta;
processo de renaturao proteica incorreto; ausncia de modificaes ps-
traducionais necessrias para obter a solubilidade de algumas protenas
eucariticas e inibio da formao de pontes dissulfeto nativas no ambiente
redutor da bactria (Fahnert, Lilie et al. 2004; Upadhyay, Murmu et al. 2012). OsCI citoplasmticos (figura 1) so estruturas ovides ou cilndricas com dimetros
que variam de 0,5 a 1,3 m e maior densidade (~1,3 mg/ml) do que muitos
componentes celulares. O fato de os CI serem insolveis facilita a sua separao
dos outros componentes celulares por centrifugao e lavagens aps o
rompimento celular. Estas estruturas so altamente hidratadas, possuem uma
arquitetura porosa e em geral so relativamente puras (Carrio, Cubarsi et al.
2000; Singh and Panda 2005). O tamanho dos agregados bem como as suas
outras propriedades fsicas e estruturais depende das condies de cultura e deinduo da expresso nas bactrias hospedeiras (Margreiter, Messner et al. 2008;
Margreiter, Schwanninger et al. 2008).
Figura 1. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) dos CI do fator estimulador de colniasgranulocitrias humano (G-CSF). Retirado de(Peternel, Grdadolnik et al. 2008.)
At recentemente as protenas dos CI eram consideradas como totalmenteinativas. No entanto, o conhecimento atual sobre CI evoluiu e hoje em dia se
reconhece que protenas agregadas em CI no so necessariamente inativas (de
Groot and Ventura 2006). Por meio de espectroscopia de infravermelho (FT-IR) se
demonstrou que as protenas nos CI possuem estruturas secundrias
semelhantes quelas das protenas em seu estado nativo (Ami, Natalello et al.
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2006). Alm disso, dados recentes indicam a presena de certa porcentagem de
protenas apresentando estruturas tercirias com conformao nativa em CI, fato
de grande importncia para a produo de protenas recombinantes, pois sugere
que as protenas podem ser liberadas dos CI em um estado funcional, desde que
se utilizem condies que desarranjem a rede de contatos intermoleculares semdesnaturarem as estruturas nativas que esto embebidas nestes agregados (de
Groot and Ventura 2006).
O fato de a atividade biolgica das protenas nos CI poder chegar a quase
100% possibilitou inclusive a utilizao dessas protenas estruturadas e
biologicamente ativas como uma fonte adequada de enzimas para o uso direto
em biocatlise (Tokatlidis, Dhurjati et al. 1991; Nahalka and Patoprsty 2009).
A estratgia geral para recuperar protenas nativas a partir de CI envolve
trs etapas: isolamento e lavagem dos CI, solubilizao dos agregados proteicose enovelamento das protenas solubilizadas (figura 2). As clulas contendo os CI
so geralmente rompidas atravs de uma combinao de mtodos qumicos,
mecnicos e enzimticos. A suspenso restante ento centrifugada para o
isolamento das protenas solveis da frao insolvel e alguns passos de
lavagens so realizados para a remoo de protenas de membrana e outros
contaminantes dos CI. Uma variedade de mtodos pode ser utilizada para a
solubilizao e renaturao dos CI, contudo no h um mtodo universal para a
renaturao de todas as protenas. A renaturao de protenas a partir de CI
frequentemente requer um extensivo processo de tentativa e erro (Clark 2001).
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Figura 2. Etapas para a recuperao de protenas solveis a partir de CI. Modificado de(Clark2001.)
1.2. Processos Clssicos de Renaturao
O processo de renaturao de protenas a partir de CI requer a
solubilizao das protenas e sua posterior renaturao para a obteno de
conformao e atividade biolgica nativas. Os processos clssicos de renaturao
de protenas a partir de agregados em CI requerem o uso de agentes
desnaturantes qumicos fortes em altas concentraes. Comumente, agregados
de protenas so solubilizados em agentes caotrpicos fortes como, por exemplo,
6 M de hidrocloreto de guanidina (Gdn HCl) ou 8 M de uria (Clark 2001; St John,
Carpenter et al. 2002). Estes agentes solubilizam as protenas nos CI
promovendo sua desnaturao atravs de uma combinao de aes. A estrutura
da gua perturbada e desta forma as molculas hidrofbicas se tornam mais
solveis neste solvente. Os agentes desnaturantes ligam-se aos grupos polares
das protenas, rompendo as interaes eletrostticas e pontes de hidrognio que
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mantm a estrutura proteica, resultando na desnaturao das molculas de
protena (Caballero-Herrera, Nordstrand et al. 2005).
Uma vez solveis e desnaturadas, as protenas so primeiramente diludas
e ento enoveladas pela remoo do agente caotrpico por dilise, diluio
adicional ou mtodos de fase slida. Contudo, estes mtodos convencionais derenaturao, frequentemente geram novos agregados de protenas durante o
processo de remoo do agente caotrpico, o que resulta na necessidade de
utilizao de concentraes proticas muito baixas (10 a 50 g/mL) a fim de evitar
a reagregao (Clark 2001). Com a finalidade de minimizar a reagregao
proteica durante a renaturao, certos aditivos qumicos podem ser utilizados. Os
surfactantes ligam-se nas regies hidrofbicas expostas, protegendo a protena
da agregao, enquanto alguns acares e sais auxiliam na estabilizao dos
estados de conformao intermediria (Cowan, Davies et al. 2008).Nos casos de protenas que possuem pontes dissulfeto o processo de
renaturao em geral realizado na presena de agentes redutores que auxiliam
na quebra de pontes dissulfeto no nativas e solubilizao dos agregados e de
agentes oxidantes que auxiliam na formao de pontes dissulfeto nativas. A
oxidao da protena pode ser realizada atravs da adio de uma mistura em
propores e concentrao adequados de reagentes oxidantes e redutores, como
as glutationas, cistenas e cistaminas. A renaturao utilizando glutationas
envolve a quebra das pontes no nativas e formao de pontes dissulfeto entre a
glutationa e a protena, seguida de renaturao na presena de uma quantidade
de glutationa reduzida. A utilizao destes reagentes aumenta a solubilidade da
protena durante a renaturao, desfavorecendo a formao de pontes dissulfeto
no nativas (Clark 2001; Singh and Panda 2005).
Portanto, o passo de renaturao nos mtodos clssicos difcil e depende
fortemente das condies de renaturao. Por exemplo, condies de redox, pH,
taxas de dilise e concentrao proteica devem ser empiricamente otimizados
para cada protena. Encontrar as condies que levem a rendimentos aceitveis
de renaturao, quando possvel, geralmente requer a seleo de um grande
nmero de condies de renaturao (Clark 1998; Vincentelli, Canaan et al.
2004). Frequentemente, aps pesquisa extensiva, os rendimentos de renaturao
continuam muito baixos. Alm disso, baixas concentraes de protena
necessrias para rendimentos de renaturao aceitveis, levam a grandes
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volumes de processamento e requerem grandes quantidades de agentes
caotrpicos corrosivos e txicos (Fischer, Sumner et al. 1993).
A presso um parmetro fsico que modula as interaes protena-
solvente atravs da mudana de volume do sistema (Silva and Weber 1993; Kim,
Randolph et al. 2006). Os efeitos da presso na interao entre segmentos desubunidades de uma protena ou entre ligaes intramoleculares so ditados por
reaes similares, que produzem essencialmente o desvio do equilbrio em favor
dos reagentes que ocupam o menor volume (princpio de Le Chatelier). A
perturbao na estrutura terciria de protenas mediada por alta presso, ocorre
devido s mudanas de volume associadas com a alterao de acessibilidade do
solvente nos diferentes estados conformacionais de uma protena, ou seja,
quando em solues aquosas e em altas presses, as protenas so infiltradas
por gua. As conformaes parcialmente enoveladas de protenas sob ao dealta presso ligam uma quantidade substancial de gua (Silva and Weber 1993).
Por esta razo a desnaturao por altas presses no ocorre na ausncia de
gua (Mozhaev, Heremans et al. 1996).
Os volumes especficos nas protenas agregadas e em protenas com
estrutura quaternria so maiores do que nos estados nativos devido presena
de cavidades intermoleculares no expostas gua. Em solues aquosas de
protenas sob altas presses hidrostticas, o decrscimo no volume especfico de
protenas quando do desenovelamento parcial ou total causado por uma
combinao de vrios efeitos: 1) rompimento de pontes salinas, seguido por
hidratao e decrscimo de volume correspondente devido eletroestrio; 2)
hidratao de resduos polares e no polares recm-expostos; 3) perda de
volume livre que aparece de defeitos no empacotamento de cavidades livres de
gua. A magnitude da diminuio do volume pequena, 0,5 a 1% do volume total
especfico da protena e as mudanas de volume para a populao de estados
intermedirios tendem a ser ainda menores. Desta forma, a aplicao de alta
presso favorece estados proteicos contendo cavidades mnimas, estados com
maior exposio de grupos hidrofbicos e estados mais altamente ionizados
(Silva and Weber 1993; Mozhaev, Heremans et al. 1996; Randolph, Seefeldt et al.
2002; Seefeldt, Ouyang et al. 2004). O esquema mostrado na figura 3 demonstra
o fenmeno de dissociao de uma protena dimrica promovida pela alta
presso (Boonyaratanakornkit, Park et al. 2002).
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A alta presso hidrosttica tambm tem sido utilizada como uma
ferramenta importante para o estudo do enovelamento de protenas e da dinmica
e estrutura de estados intermedirios do caminho de enovelamento, pois
possibilita sua estabilizao, tornando possvel a caracterizao da estrutura e
dinmica destes estados. O estudo da ao de altas presses sobre as protenastem possibilitado o melhor entendimento de como os polipeptdeos se enovelam
em conformaes altamente estruturadas (Silva, Foguel et al. 2001).
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subunidade subunidade
cavidade
1 bar
Presena de cavidadesdentro da protena
subunidade
subunidade
1~3 kbar
Dissociao de CI
Eletroestrio Formao de clatratos ao
redor dos resduos
hidrofbicos
subunidade
~5 kbar
subunidade
Flutuaes
conformacionais
fornecem vias para a
penetrao da gua nas
cavidades
Inchao do ncleo
hidrofbico
5~10 kbar
Ruptura da estrutura
terciria
Perda de cavidades
dentro da protena
Figura 3. Efeitos da alta presso hidrosttica ocasionando a dissociao de protenasoligomricas e a desnaturao das subunidades. Modificado de(Boonyaratanakornkit, Park et al.2002.)
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Estudos tm demostrado que altas presses hidrostticas so uma
alternativa atrativa s tcnicas tradicionais de desnaturao e diluio para a
renaturao de protenas em termos de concentrao proteica, simplicidade no
processo, custo e potencial para aumentar rendimentos de protenas com
conformao nativa e atividade biolgica a partir de agregados (Seefeldt, Ouyanget al. 2004).
Altas presses hidrostticas foram descritas como capazes de solubilizar
os agregados e possibilitar a renaturao de protenas (Foguel, Robinson et al.
1999; St John, Carpenter et al. 1999; Randolph, Seefeldt et al. 2002). Como
exemplo citamos os estudos que utilizaram agregados do hormnio de
crescimento recombinante, da lisozima e da -lactamase, nos quais o processo
de renaturao em alta presso hidrosttica levou a altos rendimentos (> 90%) de
protenas nativas, mesmo na presena de altas concentraes proteicas (St John,Carpenter et al. 1999; St John, Carpenter et al. 2001; St John, Carpenter et al.
2002).
Sob altas presses ocorre a entrada de gua nas estruturas proteicas.
Presses da ordem de 1 a 3 kbar desfavorecem interaes intermoleculares
hidrofbicas e eletrostticas, levando dissociao de agregados. Os mesmos
tipos de interao so tambm responsveis pelas estruturas proteicas nos
estados nativos. No entanto, normalmente as protenas no so desnaturadas at
presses de 5 kbar em temperatura ambiente. Ento, a dissociao de complexos
macromoleculares pela aplicao de presso de at 2 a 3 kbar no
acompanhada de perda de estruturas secundrias e tercirias existentes nos
estados dissociados (Silva and Weber 1993; Silva, Foguel et al. 2001). Em
contraste, as pontes de hidrognio no so sensveis alta presso hidrosttica
devido desprezvel mudana de volume associada quebra dessas pontes
(Randolph, Seefeldt et al. 2002). Alteraes de temperatura e/ou baixas
concentraes (no desnaturantes) de agentes desnaturantes como Gdn HCl e
uria, foram descritas como teis para facilitar a quebra das pontes de hidrognio
entre protenas nos agregados promovida pela alta presso (St John, Carpenter et
al. 2002).
A alta presso tambm no quebra pontes dissulfeto que fazem ligaes
cruzadas covalentes entre agregados de protenas. Nos casos de polipeptdeos
contendo pontes dissulfeto, um par xido-redutor pode ser includo nas solues
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durante a compresso de modo a facilitar a quebra das pontes dissulfeto
intermoleculares e formao de pontes dissulfeto nativas (St John, Carpenter et
al. 2002; Chura-Chambi, Genova et al. 2008). Aps a desagregao induzida por
presso, a quebra de ligaes no nativas e formao de pontes dissulfeto
nativas so necessrias para permitir a formao de molculas nativas, as quaisapresentam as menores energias livres (St John, Carpenter et al. 2002).
Estas propriedades claramente diferenciam a alta presso hidrosttica dos
mtodos tradicionais que utilizam altas concentraes de agentes caotrpicos. As
principais vantagens associadas utilizao da alta presso para dissociao de
CI e renaturao de protenas recombinantes so: a solubilizao das protenas
agregadas e sua renaturao ocorrem nas mesmas condies de tampo, o uso
de altas concentraes de agentes caotrpicos no necessrio, o que pode
possibilitar a manuteno da estrutura secundria e terciria semelhantes nativaexistentes, e a desagregao dos CI ocorre rapidamente. Deste modo, a alta
presso uma ferramenta til para dissociao de agregados proticos em
protenas nativas e sua renaturao, facilitando a preparao de protenas para
estudos estruturais e funcionais e tambm para aplicaes em indstria
biotecnolgica (Kim, Randolph et al. 2006).
1.2.1. Renaturao de protenas agregadas em CI utilizando altas
presses hidrostticas
Os primeiros dois artigos sobre a renaturao de protenas utilizando altas
presses foram publicados no mesmo ano, 1999 (Foguel, Robinson et al. 1999; St
John, Carpenter et al. 1999). Alguns artigos foram publicados aps essa data
descrevendo a otimizao do processo de renaturao para diferentes protenas
utilizando altas presses. A literatura ainda pouco representativa, porm os
trabalhos publicados mostram sua eficincia, sugerindo que o processo pode ter
alta aplicabilidade. Algumas publicaes j descreveram o desenvolvimento de
processo de renaturao de protenas a partir de CI: a enzima flavina redutase
(Okai, Ohtsuka et al. 2012), o fator de crescimento vascular endotelial humano
(VEGF) (Cothran, St John et al. 2011), o hormnio de crescimento murino
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(Fradkin, Boand et al. 2010), as protenas de Drosophila melanogaster Gram-
negative bacteria binding proteins (GNBP 1, GNBP 2 e GNBP 3), duas fosfatases
humanas (PTPRS e DUSP7) (Lee, Carpenter et al. 2006), membros da famlia de
receptores nucleares (Schoner, Bramlett et al. 2005) e a -lactamase (St John,
Carpenter et al. 1999). O mais recente trabalho descreve a renaturao daprotena quimiotaxina leucocitria 2 (LECT2), com a obteno de um alto
rendimento de renaturao (10 mg/L) (Okai, Ohtsuka et al. 2012; Zheng,
Miyakawa et al. 2013). Dentre estas publicaes esto algumas do nosso grupo
em que foram obtidas a renaturao da protena antiangiognica endostatina
(Chura-Chambi, Genova et al. 2008), da bothropstoxina 1 de Bothrops
jararacussu (Balduino, Spencer et al. 2011) e da protena OmpA de Leptospira
interrogans(Fraga, Chura-Chambi et al. 2010).
No entanto, pelo que de nosso conhecimento, no haviam sidopublicados artigos com o objetivo de estudar a ao da alta presso sobre
dissociao dos CI ou sobre as estruturas proteicas com a finalidade de aprimorar
este processo utilizando como modelo uma protena fluorescente.
No presente trabalho foram utilizadas quatro protenas: uma monomrica
(GFP de Aequorea Victoria) e trs oligomricas (PilB e produtos dos genes
XAC2810 e XAC3272 deXanthomonas axonopodispv citri -Xac) para os estudos
de renaturao de protenas agregadas em CI utilizando altas presses
hidrostticas.
1.3. Protena Verde Fluorescente
1.3.1. Bioluminescncia
A bioluminescncia um fenmeno natural observado em diversas
espcies de organismos marinhos e terrestres (tabela 1). No ambiente terrestre o
vagalume o representante mais conhecido. Os animais marinhos utilizam-se da
bioluminescncia para afastar predadores, para camuflagem mimetizando outras
espcies, para atrair suas presas e seus parceiros no perodo reprodutivo e como
fonte alternativa de energia (Barnes 1991). O mecanismo qumico de produo de
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luz por organismos marinhos difere para cada espcie. A maioria apresenta
somente quimioluminescncia ou bioluminescncia resultante de reao qumica
mediada por fotoprotenas. O exemplo mais bem elucidado a reao de
oxidao da luciferina a oxiluciferina catalisada pela enzima luciferase, produzindo
luz. Outros mecanismos de luminescncia so independentes de substrato eapresentam sistemas prprios. A fluorescncia ocorre quando um eltron excitado
deslocado para uma rbita de maior energia e ao retornar para o estado de
menor energia, emite um fton.
Tabela 1. Exemplos de organismos bioluminescentes. Retirado de(Chalfie 1998.)
Tipo deorganismo
Gnerorepresentativo
Mecanismos / Componentesde emisso de fluorescncia
Caracterstica /Funo
Bactria PhotobacteriumFlavina reduzida e aldedo da
cadeia longa de luciferaseEmisso constante
Dinoflagelados NoctilucaCintilao atravs de
organelas celulares (=470nm)
Brilho em flashesrpidos para afugentar
predadores
CnidriosMedusasHidrides
Aequorea victoria
Ca2+, coelenterazina /aequorina ncleos
imidazlicos-piraznicos(=470 - 509nm), emisso:
GFP
Brilho em flashesrpidos para afugentar
predadores.
Ctenforos BeroeCa2+, coelenterazina
(=460nm )
Brilho em flashesrpidos para afugentar
predadores
Crustceos Cypridina ncleos imidazolcos-iraznicos (=465nm) Liberar enzimas emsubstratos
Insetos, vaga-lume
Photinus, Photurisncleo benzotiazlico, ATP,
Mg2+(=550-580nm)
Flashes, afastarpredadores,
acasalamento
1.3.2.Aequorea victoria
A Aequorea victoria um cnidrio de corpo totalmente transparente em
forma de guarda-chuva, com dimetro entre 7 e 10 cm que apresenta grnulosbioluminescentes ao redor de seu corpo, formando um crculo (figura 4).
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Figura 4.Aequoria Victoria. Restirado de(http://cienciaemdia.folha.blog.uol.com.br/arch2008-10-05_2008-10-11.html.)
A produo da luminescncia ocorre por meio de uma reao qumica
altamente exotrmica em que a oxidao de uma molcula orgnica,
genericamente chamada de luciferina, libera energia preferencialmente na forma
de luz visvel. Essa reao catalisada por enzimas chamadas de luciferases. A
natureza qumica das luciferinas, cofatores e a seqncia e estrutura destas
protenas variam de um grupo taxonmico a outro, levando a concluso que a
bioluminescncia se originou vrias vezes e independentemente durante a
evoluo (de Farias 2009).
No caso das guas-vivas do gnero Aequorea, a bioluminescncia em
geral verde. Curiosamente, os primeiros estudos bioqumicos, que tentavam
caracterizar o sistema bioluminescente dessas guas-vivas, mostraram que a
ruptura da estrutura celular dos grnulos presentes nas medusas resultava no
isolamento de uma luciferase e luciferina que produziam luz azul, em vez deverde, como observado no animal vivo. Havia um terceiro componente que
produzia luminescncia verde (Shimomura, Johnson et al. 1962). Foi essa
observao que levou Osamu Shimomura a isolar a protena verde fluorescente
em 1962 e como consequncia deste importante achado, receber o prmio Nobel
de Qumica em 2008. Essa protena, embora no seja luminescente por si s, ao
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ser irradiada com luz visvel na faixa azul do espectro, produz uma luminescncia
verde intensa, devido fluorescncia. O grupo de Shimomura verificou que, no
sistema bioluminescente intacto das medusas, quem transfere a energia para a
GFP a prpria reao bioluminescente da luciferase e luciferina. Quando o
complexo luciferase-luciferina e a GFP esto suficientemente prximos, a energiade excitao do complexo luciferase-oxiluciferina eficientemente transferida
para a GFP, que fluoresce na regio do verde. Essa modalidade de transferncia
de energia chamada de transferncia por ressonncia e depende da
proximidade e sobreposio dos espectros de emisso do doador de energia (o
complexo luciferase-oxiluciferina excitada) e de absoro do aceptor de energia (a
GFP) (Shimomura, Johnson et al. 1962; de Farias 2009).
1.3.3. Protena verde fluorescente selvagem (GFP) e Enhanced GFP
(eGFP)
O mesmo grupo de Shimomura publicou o espectro de emisso da GFP,
com o pico de excitao em 395 - 397 nm e de emisso em 504 nm (Tsien 1998).
A GFP uma protena monomrica com 238 resduos, cadeia nica de
polipeptdeos com massa molecular de 27 kDa. A protena GFP consiste de 11
folhas em forma de barril com uma -hlice contendo o fluorforo ao centro
(figura 5) (Ormo, Cubitt et al. 1996).
O cromforo uma p-hidroxibenzilideno imidazolinona formada pelos
resduos 65 - 67 (Ser-Tyr-Gly) na protena nativa. Para a formao do cromforo,
a GFP se enovela numa conformao quase nativa e ento a imidazolinona
formada pelo ataque nucleoflico da amida da Gly67na carbonila do resduo Ser65,
seguido de oxidao (figura 6). Finalmente, ocorre a etapa de desidratao que
envolve a perda de um dos hidrognios do C do resduo Tyr66. Somente neste
estgio que o cromforo adquire absorbncia e fluorescncia visvel (Heim,
Prasher et al. 1994; Cubitt, Heim et al. 1995; Reid and Flynn 1997). A formao
do cromforo na forma madura da GFP autocataltica e oxignio fundamental
para o desenvolvimento da fluorescncia.
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Figura 5.Estrutura tridimensional da GFP. A estrutura em barril se enovela com o cromforo aocentro, mostrado como esferas. tomos de carbono so mostrados em cinza, nitrognio em azul e
oxignio em vermelho. Retirado de(de Farias 2009.)
Figura 6. Mecanismo para a maturao do cromforo. Aps o enovelamento da GFP, ocorre aciclizao que formada pelo ataque nucleoflico do nitrognio da amida da Gly67no carbono dacarbonila da Ser65, formando o anel imidazolona. A molcula intermediria oxidada esubsequentemente ocorre a desidratao gerando o cromforo maduro. Modificado de(Craggs2009.)
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A GFP se mostra estvel mesmo em altas temperaturas. Esta estabilidade
parece ser conseqncia da sua estrutura tridimensional nica. As onze folhas
rodeiam e protegem o cromforo que posicionado perto do centro geomtrico da
estrutura em barril. Regies de pequenas dobras e -hlices distorcidas tampam
ambas as extremidades do barril. A proteo to completa que agentesclssicos que extinguem a fluorescncia no possuem quase efeito sobre a
fluorescncia da GFP (Yang, Moss et al. 1996).
A desnaturao da GFP por cidos, bases ou Gdn HCl resulta em perda de
fluorescncia, no entanto, a GFP desnaturada recupera a fluorescncia aps o
retorno a um pH neutro ou diluio da Gdn HCl (Bokman and Ward 1981; Ward
and Bokman 1982).
O comportamento de uma forma mutante de GFP (red-shifted GFP, rsGFP)
sob altssimas presses foi descrito, tendo sido demonstrado que este mutantesofre alterao de estrutura em presses da ordem de 4 kbar, presso na qual
ocorrem pequenas mudanas na regio do cromforo, que so acompanhadas
pela penetrao de gua na estrutura de -barril, com decrscimo de emisso de
fluorescncia. A desnaturao da rsGFP ocorre por colapso da estrutura de -
barril em presses bem mais altas, da ordem de 9 kbar (Herberhold, Marchal et al.
2003). A GFP selvagem e alguns mutantes (entre eles a enhanced GFP, eGFP)
se mostraram mais estveis do que a rsGFP sob altas presses hidrostticas.
Sob presses de at 600 MPa (6 kbar) no houve decrscimo de fluorescncia
dos mutantes testados, com exceo da rsGFP (Ehrmann, Scheyhing et al. 2001).
Foi demonstrado que as estruturas secundrias da GFP e tambm da eGFP,
monitoradas por meio de estudos de espectroscopia de infravermelho (FT-IR),
so mantidas em presses de at 13 - 14 kbar (Scheyhing, Meersman et al.
2002), confirmando que as GFPs so altamente resistentes desnaturao pela
aplicao de presso.
A necessidade da estrutura nativa da protena para a emisso de
fluorescncia foi demonstrada pelas informaes que foram obtidas com a
estrutura cristalogrfica das GFPs (Ormo, Cubitt et al. 1996; Yang, Moss et al.
1996), na qual se demonstrou que o fluorforo interage com vrios resduos
distantes na sequncia primria. Conseqentemente a GFP possui uma grande
vantagem para o estudo de enovelamento de protena, que a facilidade de
monitoramento do enovelamento em tempo real, sob altas presses e utilizando a
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fluorescncia como marcador de recuperao da estrutura nativa. De fato, a
renaturao da GFP j foi bem descrita (Weissman, Rye et al. 1996; Makino,
Amada et al. 1997; Fukuda, Arai et al. 2000; Wielgus-Kutrowska, Narczyk et al.
2007), mas a sua renaturao utilizando altas presses ainda no. O fato de que
a estrutura nativa deve estar presente para a emisso de sua fluorescnciacaracterstica (Ormo, Cubitt et al. 1996) e a simplicidade de monitoramento da
bioatividade da GFP tornam esta protena um excelente sistema modelo para
estudos de renaturao sob presso. Ns consideramos que o estudo das
condies de desagregao e renaturao de eGFP agregada em CI sob altas
presses seria muito til como modelo de renaturao de outras protenas nessas
condies.
No presente estudo utilizamos a enhanced GFP (eGFP), um mutante com
as mutaes F64L e S65T, que apresenta fluorescncia mais elevada do que aforma selvagem, excitao em 488 nm e pico de fluorescncia entre 507 - 509 nm
(Tsien 1998).
1.4. Protenas deXanthomonas axonopodispv citri
1.4.1. Papel do cancro ctrico na economia brasileira
Na dcada de 80 o Brasil se tornou o maior produtor mundial de laranja,
sendo destinada a produo de suco concentrado (Hasse 1987; Bevan 2000). O
Brasil tem mais de 1 milho de hectares de terra com cutlivo de plantas ctricas e
produz, aproximadamente, um tero dos frutos ctricos mundiais, respondendo por
80% de suco de laranja concentrado negociado mundialmente, os quais
absorveram mais de US$ 1,2 bilho para o Brasil, fato este, explica a relevncia
da cadeia agroindustrial citrcola na economia brasileira, no agronegcio e na
balana comercial do pas (Hasse 1987; Bevan 2000).
O Estado de So Paulo o principal polo produtor brasileiro,
correspondendo a 87,7% da produo anual nacional e 30% da mundial. O
volume de recursos movimentados pelo agronegcio citrcola supera R$ 5 bilhes
por ano, gerando cerca de 400 mil empregos diretos com 3 mil frentes de trabalho
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na colheita e cerca de 3 milhes de empregos indiretos, somente no Estado de
So Paulo (Pruvost, Boher et al. 2002; Moreira, Almeida et al. 2010).
Apesar do grande potencial da citricultura Brasileira, o pas vem perdendo
um espao significatico no comrcio internacional, devido a problemas
fitossanitrios. A citricultura brasileira alvo de uma grande variedade dedoenas, entre elas o cancro ctrico, causando grandes prejuzos s lavouras de
citros no pas, pondo em risco benefcios econmicos e sociais gerados pela
agricultura. O cancro ctrico foi constatado pela primeira vez no Brasil em 1957,
encontrado inicialmente em pomares na regio de Presidente Prudente em So
Paulo, trazida em mudas importadas por imigrantes japoneses. A doena foi
posteriormente detectada em regies dos Estados de So Paulo, Mato Grosso do
Sul, Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Bitancourt 1957; Namekata
1996). A doena se alastrou rapidamente pela regio produtora e, atualmente, citada como um dos principais fatores responsveis pela retrao na
produtividade de citros do pas e tambm sendo a causadora de prejuzos da
ordem de centenas de milhes de Reais por ano em nosso pas.
Segundo Leite (1990) e Rossetti (2001) so conhecidos cinco tipos de
cancro ctrico, os quais podem ser distinguidos de acordo com a diferena em
patogenicidade e sintomas apresentados, em funo de espcies de Citrus e
outros gneros afins infectados. Os genes das protenas utilizados no presente
trabalho foram isolados da bactriaXac (Leite JR 1990; Rossetti 2001).
Xanthomonas um gnero de fitopatgeno bacteriano responsvel por
doenas em algumas variedades de hospedeiros, incluindo citros, arroz, uva,
feijo e algodo (Swings 1993). O grande problema do cancro ctrico a sua
difcil erradicao e a sua fcil e rpida disseminao, podendo ocorrer atravs do
vento, da chuva e do prprio homem. A Xac, invade seu hospedeiro (Citrus spp)
atravs dos estmatos e lenticelas (Gottwald 2009). Desse modo, todos os
tecidos areos como ramos, folhas e frutos so susceptveis ao ataque (figura 7)
(Schubert 2003). Os primeiros sintomas do cancro ctrico se manifestam nas
folhas, como leses necrticas arredondadas, salientes e de colorao
amarronzada ao centro e amarelada ao redor, nos dois lados das folhas.
Posteriormente estas leses aparecem nas frutas e nos ramos diminuindo a
quantidade e a qualidade das frutas e, portanto inviabilizando comercialmente a
planta (http://www.fundecitrus.com.br; Brunings and Gabriel 2003; Gottwald 2009).
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Figura 7. Citros mostrando sintomas de Cancro ctrico. Folhas e frutos infectados em estadoavanado da doena. Retirado de(http://www.caripestnetwork.org.)
Embora o cancro ctrico seja responsvel por grandes perdas econmicasna produo das frutas ctricas, no foi descoberta nenhuma forma eficaz para
sua erradicao e o procedimento adotado para evitar uma possvel epidemia em
toda lavoura a deteco precoce da doena e a erradicao de plantas
contaminadas a um raio de 30 metros do foco de contaminao (figura 8) (Timmer
2006; Lowe 2009).
Figura 8. Vista area da erradicao de rvores de laranja em um raio de 30 metros em relaoao centro do foco da contaminao por Xac. Retirado de(http://www.redetec.org.br/inventabrasil/xanto.htm.)
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1.4.2.Xanthomonas axonopodispv citri
A agricultura brasileira e mundial bastante afetada por vrias doenas
ocasionadas por espcies do gnero Xanthomonas, provocando assim, perdas
substanciais em vrias culturas de grande importncia econmica. Esse gnerocontm uma ampla variedade de espcies, linhagens, e hospedeiros (124
monocotiledneas e 286 dicotiledneas) (Leyns 1984) e representa o maior grupo
de bactrias fitopatognicas, o qual apresenta uma extraordinria diversidade
patognica e importncia econmica (http://www.fundecitrus.com.br; Chan and
Goodwin 1999; Vauterin 2000; Vicente 2001; Brunings and Gabriel 2003; Buttner
and Bonas 2009; Gottwald 2009). Alm disso, a Xac, agente etiolgico do cancro
ctrico, est entre as Xanthomonas que causam maior impacto na agricultura
mundial (Schubert 2003).
Bactrias do gnero Xanthomonas so cosmopolitas, com duas
caractersticas morfolgicas comumentes presentes: 1) produo de goma
xantana (exopolissacardeo que auxilia na disperso e sobrevivncia do
patgeno, alm de ser uma importante matria prima nas indstrias de alimentos),
que leva as suas colnias a possuirem um aspecto mucide e 2) possuem cor
amarela devido produo de pigmentos, principalmente xantomonadina, quando
cultivadas em meio Nutriente gar, aps 2 ou 3 dias de incubao a 28C
(Bebendo 1995; Vauterin 1996). AXacse adapta bem em temperatura de 20C -
30C, condio que adicionada ao elevado teor de umidade excelente para o
crescimento e desenvolvimento da infeco (Peltier 1920; Bebendo 1995).
1.4.3. Genmica Funcional e Protemica
A protemica, entendida como a anlise em larga escala da expresso
proteica, atualmente considerada uma das reas centrais da genmica
funcional. De fato, os avanos tcnicos que permitem resolver e identificar
centenas ou milhares de protenas a partir de extratos proteicos complexos,
atravs de tecnologia protemica envolvendo separao eletrofortica ou
cromatografia aliada espectrometria de massas, possibilita a aquisio em larga
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escala de informaes sobre o repertrio de protenas envolvidas diretamente
com diferentes situaes metablicas e fisiolgicas de um dado organismo, e
ainda detectar modificaes ps-traducionais (Anderson 1997). Alm disso, o
grande nmero de sequncias disponibilizadas pelos projetos de sequenciamento
de genomas tem favorecido o interesse em anlises de proteomas, visto que,atravs de informaes do sequenciamento de um organismo pode-se deduzir
protenas codificadas num genoma, o que de fundamental auxlio no processo
de identificao das protenas detectadas pela anlise protemica, bem como da
regulao da expresso destas (Jungblut 1995). Utilizar a alta presso como
ferramenta para a obteno de protenas solveis e biologicamente ativas a partir
de CI particularmente interessante para possibilitar a continuidade de projetos
como o do genoma daXac,ao qual se seguiu o projeto de genoma estrutural. Isto
se deve ao fato de que a estrutura e atividade biolgica de muitas das protenasque foram expressas como CI em E. coli no foram estudadas devido s
dificuldades encontradas para sua renaturao. A produo de protenas
envolvidas com a motilidade e virulncia bacterianas apresentando a
conformao nativa e biologicamente ativas pode ser um passo inicial para a
compreenso dos processos relacionados patogenicidade de bactrias
economicamente importantes como aXac.
O sequenciamento completo e anotao do genoma da bactria Xac (Da
Silva 2002), revelaram um cromossomo circular com 5.175.554 pares de bases
(pb) e dois plasmdeos o pXAC64 (64.920 pb) e o pXAC33 (33.699 pb). Essa
constituio gentica responsvel por codificar 4.428 protenas, sendo que,
deste total 2.770 (62,6%) protenas tiveram suas respectivas funes associadas
s protenas com funes conhecidas descritas na literatura, e 1.653 (37,4%)
correspondem s protenas hipotticas sem funo descrita at ento (Da Silva
2002). As protenas utilizadas no presente trabalho so: PilB codificada pelo gene
XAC3239, e produtos dos genes XAC2810 e XAC3272.
A protena PilB de Xac possui 578 aminocidos, 62 kDa e possui alta
identidade de sequncia primria (92%) com outras protenas PilB de outros
organismos. Est envolvida na biognese do pilus tipo IV (T4P), um filamento fino
encontrado na superfcie de clulas bacterianas que est envolvido na
patogenicidade bacteriana, incluindo, por exemplo, movimento involuntrio,
adeso em superfcies, transformao natural, formao de biofilme, secreo de
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protenas e quimiotaxia (Mattick 2002; Craig, Pique et al. 2004; Han, Kennan et al.
2007; Craig and Li 2008). A biognese do T4P um processo complexo que
envolve uma grande quantidade de protenas, no qual PilB, via consumo de ATP,
forma uma estrutura hexamrica na face citoslica da membrana interna
bacteriana que compem o funcionamento geral do T4P em vrios processosbiolgicos, como por exemplo, no processo de autotransformao e no processo
de adeso superfcie. As protenas PilB possuem atividade ATPsica, porm
somente havia sido determinada a atividade da protena PilB de Myxococcus
xanthuse de Pseudomonas aeruginosa. No entanto, sua estrutura ainda no foi
descrita (Chiang, Sampaleanu et al. 2008; Jakovljevic, Leonardy et al. 2008).
As protenas produtos dos genes XAC2810 e XAC3272, possuem 356 e
307 aa e massa molecular de 42,2 e 34,5 kDa, respectivamente. Pelo fato de
possurem alta identidade de sequncia primria com outras protenas de outrosorganismos, possuindo em suas sequncias os domnios GAF e GGDEF
conservados, forte a possibilidade de que sejam enzimas diguanilato ciclases,
envolvidas na sntese do segundo mensageiro diguanilato cclico, bis-(3, 5)-di-
guanosina monofosfato cclico (c-di-GMP). A estrutura secundria e a atividade
biolgica das protenas ainda no foram descritas, mas por homologia acredita-se
que seus domnios GGDEF poderiam possuir atividade de diguanilatos ciclase, a
qual convertem 2 molculas de GTP e liberam fosfato inorgnico e somente
sejam ativas na forma de dmeros (Drenkard and Ausubel 2002; Chiang,
Sampaleanu et al. 2008; Jakovljevic, Leonardy et al. 2008).
O c-di-GMP uma molcula de sinalizao intracelular universalmente
encontrada em bactrias. Trabalhos recentes em diferentes organismos mostram
que altos nveis de c-di-GMP promovem o estado sssil das clulas, associado ao
aumento da produo de componentes extracelulares de adeso como
polissacardeos e fimbrias. Inversamente, baixos nveis de c-di-GMP promovem a
motilidade celular e virulncia (Simm, Morr et al. 2004).As protenas codificadas
pelos genes XAC2810 e XAC3272 so constitudas por dois domnios, um
domnio GAF no N-terminal e um domnio GGDEF no C-terminal. O domnio
GGDEF de XAC2810 possui o motivo conservado GGEEF o que sugere ser um
domnio ativo, j o domnio GGDEF do gene XAC3272 possui um motivo
degenerado (AEGEF) e provavelmente no seja capaz de sintetizar c-di-GMP,
mas talvez seja capaz de ligar ao c-di-GMP.
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Utilizar a alta presso como ferramenta para a obteno de protenas
solveis e biologicamente ativas a partir de CI particularmente interessante para
possibilitar a continuidade de projetos como o do genoma daXac. Isto se deve ao
fato de que a estrutura e atividade biolgica de muitas das protenas que foram
expressas como CI em E. coli no foram estudadas devido s dificuldadesencontradas para a obteno de protenas solveis ou renaturadas. A produo
de protenas envolvidas com a patogenicidade bacterianas apresentando a
conformao nativa e biologicamente ativas pode ser um passo inicial para a
compreenso dos processos relacionados infeco porXac.
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2. OBJETIVOS
Utilizando como modelo a protena eGFP, estudar e otimizar o processo de
solubilizao dos CIs e renaturao desta protena utilizando alta presso
hidrosttica. Com base na otimizao da metodologia utilizada, produzir as
protenas de Xac solveis e com atividade biolgica a partir de agregados
expressos em Escherichia coli.
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3. MATERIAIS E MTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Equipamentos e acessrios principais
Agitador, modelo Ts-2000, Vertex.
Aparelho Mili-Q Plus, purificador de gua, Milipore.
Autoclave, modelo 12 LI/LA, Kavo.
Autoclave, modelo 415, Fanem.
Balana analtica, modelo AW 220, Shimadzu. Balana de preciso, modelo P1200, Mettler.
Banho-maria, modelo 100, Fanem.
Banho-maria, modelo Type 16500 Dry-Bath, Thermolyne.
Banho-maria, modelo Cool Tech 320, Thermo Scientific.
Bomba peristltica, modelo P1TM, GE Healthcare.
Cmera fotogrfica, modelo DMC-FX100, Lumix Panasonic.
Centrfuga refrigeradora automtica, modelo 5810R, Eppendorf.
Centrfuga refrigeradora automtica, modelo RC2-B, Sorvall Speed.
Coluna de afinidade, modelo His Trap HP, GE Healthcare.
Coluna de excluso molecular, modelo Superdex 75 10/30 GL, GE
Healthcare.
Coluna de excluso molecular, modelo Superdex 200 10/300 GL, GE
Healthcare.
Eletroporador, modelo II, Invitrogen.
Espectrofluormetro, modelo Cary Eclipse, Varian.
Espectrofotmetro, modelo Genesys 6, Thermo Scientific.
Espectrometro de infravermelho, Nicolet 6700, Thermo Corp., USA
Estufa para cultura bacteriana, modelo Q-316B, Quimis.
Forno de microondas, LG.
Freezer -20 C, Bosch.
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Freezer -80 C, modelo AL880 E, American Lab.
Incubadora refrigerada com agitao, modelo TE421, Tecnal.
Kit de Ensaio de Fosfato EnzChek, Molecular Probes, Invitrogen.
Leitor de D.O., modelo Ultrospec 10, Amersham Bioscience.
Microscpio eletrnico de varredura, modelo XL200, Phillips.
Seladora a vcuo, modelo TM 150, TecMaq.
Sistema de Eletroforese vertical, modelo Tetra System, Bio-Rad.
Sonicador, modelo 3000, Biologics.
Transiluminador, modelo Mocrouve, Hoefer.
Vaso de alta presso, modelo R4-6-40 e bomba, modelo P40, High
Pressure Equipment.
3.1.2. Reagentes e solues
cido Actico Glacial, Merck.
cido Clordrico, Merck.
Acrilamida, Reagen.
gar, Difco.
Agarose, BioAgency. Ampicilina, Bayer.
Bis-acrilamida, BioAgency.
Bis-ANS, Sigma-Aldrich.
BSA, Sigma-Aldrich.
Casaminocidos, BD.
Cloreto de clcio, Sigma-Aldrich.
Cloreto de sdio, Synth.
Comassie brilliant Blue G-250, Sigma-Aldrich.
Deoxicolato de sdio, Sigma-Aldrich.
Ditiotreitol, Sigma-Aldrich.
Dodecil Sulfato de Sdio, xodo Cientfica.
Extrato de levedura, BD.
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Glicerol, Serva.
Glicina, Sigma-Aldrich.
Glicose, Casa Americana.
Glutationas reduzida e oxidada, Sigma-Aldrich.
Hidrocloreto de Guanidina, Sigma-Aldrich.
Imidazol, Sigma-Aldrich.
Isopropil, -D-tiogalactopiranosde, Fermentas.
Kanamicina, Invitrogen.
L-Arginina, Sigma-Aldrich.
Lisozima, Sigma-Aldrich.
Membrana de dilise, Sigma-Aldrich.
Padro de Massa molecular, GE Healthcare.
PEG 600, Sigma-Aldrich.
Persulfato de amnio, BioAgency.
Sacarose, In Lab.
Soroalbumina bovina, Sigma-Aldrich.
Sulfato de Magnsio, Synth.
Sulfato de Nquel, GE Healthcare.
Sulfato de Potssio, Synth.
Triptona, Difco. Tris base, Vetec.
Triton X-100, Sigma-Aldrich.
Tween-20, Merck.
Uria, Poliscience.
Verde Malaquita, Synth.
3.1.3. Linhagem celular bacteriana
A cepa de E. coliutilizada para a expresso das protenas eGFP, PilB e os
produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 foi a BL-21 (DE3) pLysS: [F -, ampT,
hsdSb (rB-mB
-), gal, dcm (DE3)] (Novagen EMD Biosciences, Inc.).
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3.1.4. Vetores plasmdicos
- pAE: vetor de expresso que contm clonado o gene codificador da protena
eGFP, doado pelo Dr. Geraldo Santana Magalhes do Laboratrio de
Imunopatologia do Instituto Butantan. A protena expressa a enhanced greenfluorescent protein (eGFP), que apresenta fluorescncia aumentada em relao
cepa selvagem, devido s mutaes F64L e S65T (Tsien 1998).
- pET28a: vetor de expresso que contm clonado o gene XAC3239 (codificador
da protena PilB), e o gene XAC3272, ambos doados pelo Dr. Shaker Chuck
Farah do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo.
- pProExHTb: vetor de expresso que contm clonado o gene XAC2810, doado
pelo Dr. Shaker Chuck Farah do Instituto de Qumica da Universidade de So
Paulo.
3.2. Mtodos
3.2.1. Transformao e expresso
As cepas BL21(DE3) de E. coli foram transformadas por eletroporao,
seguindo protocolo descrito pelo fabricante do eletroporador (Invitrogen) e em
seguida plaqueadas em meio gar LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de
levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de gar), contendo o antibitico adequado
(Tabela 2). As culturas foram mantidas em estufa por 16 horas a 37C. As
colnias transformantes foram escolhidas aleatoriamente e repicadas em 15 mL
de meio rico 2HKII (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de triptona, 4 g/L decasamincidos, 0,8 g/L de sulfato de magnsio, 0,08 g/L de cloreto de clcio, 3,1
g/L de sulfato de potssio e 320 l/L de soluo trao de metais) (Jensen and
Carlsen 1990) na presena do antibitico especfico e mantidas em incubadora a
37C com agitao de 200 rpm. Este volume foi ento diludo em 250 mL do
mesmo meio de cultura, em erlenmeyer de 1000 mL, contendo o antibitico
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especfico e mantidas a 200 rpm a 37C at atingirem a densidade ptica (D.O. 600
nm) de 3,0. As culturas foram ento induzidas expresso pela adio de
isopropil--D-tiogalactopiranosideo (IPTG) em concentrao final de 0,5 mM e
incubadas s temperaturas de 37C, 42C e 47C para a protena eGFP e 20C,
25C, 30C e 37C para as protenas PilB e produto do gene XAC2810 eXAC3272 e foram mantidas a 200 rpm por mais 16 horas.
Tabela 2. Antibiticos utilizados para expresso das protenas e genes alvos.
Protenas e Genes Antibiticos
eGFP Ampicilina (100 g/mL)
PilB Kanamicina (30 g/mL)
Gene XAC2810 Ampicilina (100 g/mL)Gene XAC3272 Kanamicina (30 g/mL)
3.2.2. Lavagem dos CI
As suspenses contendo as bactrias foram centrifugadas a 10.000 g por
10 minutos a 4C e o sobrenadante foi descartado. Os botes celular foram
ressuspendidos em tampo A (Tris HCl 0,1 M, pH 7,5 e 5 mM EDTA) e 50 g/mL
de lisozima foi adicionada s solues. As suspenses foram ento incubadas em
temperatura ambiente por 15 minutos e em seguida foram sonicadas na presena
de 0,1% de deoxicolato de sdio por 30 segundos com intervalos de 30 segundos
a 60 Hz em banho de gelo. As suspenses foram novamente centrifugadas a
10.000 g por 10 minutos a 4C, os sobrenadantes foram descartados e os
precipitados insolveis foram ressuspendidos em tampo B (Tris HCl 0,1 M, pH
7,5, 5 mM de EDTA e 0,1% de deoxicolato de sdio). As suspenses foram
novamente sonicadas e centrifugadas nas mesmas condies descritas
anteriormente. O procedimento de lavagem dos CI foi repetido mais uma vez.
Aps a lavagem, os CI foram ressuspedidos em tampo de renaturao (Tris HCl
50 mM, pH 7,5 e 1 mM EDTA). A suspenso foi sonicada e centrifugada. Este
procedimento foi repetido por mais duas vezes, os CI foram ressuspedidos em 10
mL de tampo de renaturao e armazenados a -20C.
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3.2.3. Solubilizao dos CI
As suspenses dos CI das protenas estudadas, produzidas em diferentes
temperaturas (eGFP: 37C, 42C e 47C; PilB, gene XAC2810 e gene XAC3272:
20C, 25C, 30C e 37C), foram ajustadas para uma D.O. de 0,5 (A 350nm) ediludas em tampo de renaturao contendo concentraes de Gdn HCl de 0 a 6
M. As reaes foram mantidas sob agitao constante durante 72 horas em
temperatura ambiente. O efeito do agente desnaturante na solubilizao dos CI foi
monitorado pelas mudanas de absorbncia a 350 nm (turbidez) em um
espectrofotmetro.
3.2.4. Pressurizao dos CI
Suspenses de CI de eGFP foram ressuspendidos em tampo de
renaturao, ajustando-se as densidades pticas em espectrofotmetro em
comprimento de onda de 350 nm para uma D.O. = 0,5. A amostra foi colocada em
bulbos de pipetas Pasteur de 5 mL, para garantir que um volume fixo de ar (2 mL)
estivesse presente nas amostras da suspenso dos CI, para promover a
oxigenao, importante para a formao do cromforo responsvel pela emisso
da luz fluorescente. Os bulbos foram selados a quente e colocados em um nico
saco plstico, que foi selado vcuo.
CI de PilB e de produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 foram
resuspendidos em tampo de renaturao com uma D.O.350 nm= 2,0. As amostras
foram colocadas em saquinhos plsticos que foram selados. Os saquinhos foram
introduzidos em um nico saco plstico maior, o qual foi selado a vcuo. Os sacos
plsticos foram ento colocados no vaso de presso (Figura 9) e submersos em
uma mistura de gua e leo. O vaso foi fechado e pressurizado a 2,4 kbar
utilizando um compressor de ar ligado a uma bomba capaz de injetar leo sob alta
presso no vaso de presso. As amostras foram submetidas a diversas condies
de compresso/descompresso (Tabela 3). Aps a descompresso, as amostras
foram retiradas dos recipientes plsticos e centrifugadas a 12.000 g por 15
minutos para a remoo de agregados insolveis. Os sobrenadantes foram
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dialisados contra tampo Tris HCl 50 mM, pH7,5 e centrifugados novamente para
a remoo de agregados. As fraes solveis foram estocadas a -20C para
posterior anlise.
Figura 9. Bomba e vaso de presso.
Tabela 3. Esquemas de Compresso e Descompresso.
Condio Esquema de Presso/Descompresso
A 2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso direta eincubao em presso atmosfrica por 16 horas
B 2,4 kbar por 16 horas e descompresso direta
C2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso em degraus e
incubao em presso atmosfrica por 16 horas
D2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso para 0,8 kbar por
16 horas e descompresso direta
E2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso para 0,4 kbar por
16 horas e descompresso direta
F2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso para 0,2 kbar por
16 horas e descompresso direta.
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3.2.5. Agentes de xido-reduo
O agente redutor Ditiotreitol (DTT) foi adicionado s suspenses de CI de
eGFP (1 mM). Em suspenses de CI das protenas PilB e produto dos genes
XAC2810 e XAC3272 foi adicionado um par xido-redutor no tampo derenaturao. Os reagentes glutationas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) em uma
concentrao total de 10 mM foram utilizados como par xido-redutor e as
propores de cada uma das glutationas foram variadas e na presena de 1,5 M
de Gdn HCl. As propores de GSH e GSSG testadas foram respectivamente:
1:9; 1:4; 1:2; 2:3; 1:1; 3:2; 2:1; 4:1 e 9:1. Como controles utilizaram-se
suspenses na ausncia das glutationas e Gdn HCl, amostra na ausncia de
glutationas e amostra com os agentes de xido-reduo e Gdn HCl na qual no
foi aplicada alta presso. Os sobrenadantes das amostras pressurizadas na
presena de glutationas e Gdn HCl foram dialisados contra tampo Tris HCl 50
mM, pH 7,5 e 50 mM de NaCl, para a remoo destes reagentes, centrifugados e
congelados para posterior anlise.
3.2.6. Agente solubilizante
Com a prvia seleo dos agentes de xido-reduo, suspenses de CI
das protenas PilB e produto dos genes XAC2810 e XAC3272 foram submetidas
alta presso na presena de concentraes diferentes de Gdn HCl (0, 0,5, 1,0 e
1,5 M) e a amostra controle na qual no foi aplicada alta presso tambm foi
utilizada. Os sobrenadantes das amostras foram submetidos dilise contra
tampo Tris HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 mM de NaCl, novamente centrifugados e
congelados para posterior anlise.
3.2.7. Aditivos
A utilidade da presena de aditivos para elevar o rendimento de
renaturao das protenas PilB e produto dos genes XAC2810 e XAC3272 foi
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testada, submetendo amostras de CI alta presso hidrosttica na presena de
diferentes aditivos. Os aditivos testados foram os que so descritos como teis
para elevar os rendimentos de renaturao em presso atmosfrica (Jensen and
Carlsen 1990; Tsien 1998): NaCl (0,15 M), L-Arginina (0,5 M), L-Arginina com
GdnHCl (1,5 M), Glicose (1 M), Sacarose (1 M), PEG-6000 (0,1%), Glicerol (2,5M), Tween 20 (1 mM), Tritron X-100 (0,5 mM) e Bis-ANS (10 vezes a
concentrao molar de cada protena). Como controle foi utilizada a suspenso de
CI na ausncia destes aditivos e tambm uma amostra na qual no foi aplicada
alta presso hidrosttica. Os sobrenadantes das amostras foram dialisados contra
tampo Tris HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 mM de NaCl, centrifugados e congelados
para posterior anlise.
3.2.8. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
As anlises das amostras solubilizadas pelo tratamento sob presso e
suspenses de CI foram realizadas utilizando eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) em condies redutoras. As corridas eletroforticas
foram realizadas seguindo o protocolo de Laemmli (1970), utilizando gis de
eletroforese de 12% de concentrao. Nas amostras foram adicionados o tampo
de amostra e DTT na concentrao de 0,1 M, as amostras ento foram aquecidas
a 75C durante 5 minutos, e aplicadas no gel de eletroforese. A corrida foi
realizada no tampo de corrida 1 X (14,4 g de Glicina, 3 g de Tris e 1 g de SDS e
gua destilada at o volume de 1000 mL) e fixando-se a voltagem em 90 V, com a
corrente livre.
Finalizada a corrida, os gis foram corados com Comassie Blue G-250 e as
bandas puderam ser visualizadas e fotografadas. A anlise das bandas nas
fotografias dos gis de eletroforese foi realizada utilizando-se o programa Image
J. A quantificao das protenas de interesse foi realizada pela comparao com
uma curva padro de soroalbumina bovina pura. A determinao da porcentagem
de solubilizao de cada amostra foi realizada pela comparao da banda obtida
com a banda referente suspenso de CI.
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3.2.9. Medidas de fluorescncia e de espalhamento de luz (EL)
As medidas de EL e de fluorescncia foram realizadas em um
espectrofotmetro Cary Eclipse (Varian). A determinao da fluorescncia
caracterstica de eGFP foi realizada com um comprimento de excitao de 470nm e leituras em 509 nm. O comprimento de onda utilizado para a anlise da
fluorescncia dos CI foi menor (440 nm) de maneira a diminuir a alta interferncia
exercida pelos CI no espectro devido ao alto grau de espalhamento da luz de
excitao. O espectro de emisso foi coletado entre 450 e 600 nm em um ngulo
de 90 relativo luz incidente, utilizando um tempo de resposta de 1s e uma
velocidade de leitura de 240 nm/minuto. Para o EL, as amostras foram excitadas
em 320 nm e as leituras foram de 315 a 325 nm em um ngulo de 90 relativo
luz incidente.
Os dados em presso atmosfrica foram coletados utilizando uma cubeta
com 1 cm de caminho ptico. Para o monitoramento sob presso, uma clula de
alta presso equipada com janelas de safira (ISS) foi conectada por tubo de ao
resistente presso a um gerador de presso (High Pressure Equipment) e
etanol foi utilizado como lquido para a transmisso de presso (figura 10). Neste
caso, cubetas redondas preenchidas com as amostras e seladas com tampas
flexveis de polietileno (figura 11) foram colocadas na clula de alta presso e
submetidas presso.
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Figura 10. Espectrofluormetro acoplado a uma clula de presso, gerador de presso, e banhotermostatizado.
Figura 11. Cubeta de quartzo selada com tampa flexvel de silicone.
3.2.10. Dissociao dos CI sob alta presso hidrosttica e
temperaturas negativas
A dissociao dos CI sob alta presso hidrosttica associada aplicao
de baixas temperaturas foi avaliada pela queda nos valores de EL. Estas medidas
foram obtidas em espectrofluormetro acoplado a um gerador de presso e a uma
clula de presso acoplada a um banho-maria termostatizado (Figura 10). As
suspenses de CI foram submetidas a 2,4 kbar de presso com intervalos de 0,4
kbar a 20C, sendo que em cada intervalo de presso as amostras foram
mantidas durante 15 minutos (tempo suficiente para que a leitura de EL estivesse
estabilizada). Aps a chegada a 2,4 kbar de presso, a temperatura foi
gradualmente diminuda de 20C at -9C tambm sendo mantidas nas
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temperaturas selecionadas durante 15 minutos, e por fim a temperatura foi
elevada a 20C e foi realizada a descompresso at a presso atmosfrica. As
leituras de EL foram realizadas em cada intervalo tanto de presso, quanto de
temperatura.
3.2.11. Microscopia eletrnica de varredura (MEV)
A magnitude de desagregao e possveis mudanas no tamanho e
morfologia dos CI ao da presso (2,4 kbar) foram visualizadas por MEV. Para tal
anlise, suspenses de CI no submetidas alta presso e tambm as fraes
insolveis de amostras j submetidas alta presso foram lavados com gua
destilada para a retirada do Tris HCl da soluo tampo. Aps a lavagem, os
precipitados foram aplicados em porta-amostras e secos em dessecador durante 16
horas. As amostras receberam um banho de ouro a 38 mA por 120 segundos e
foram visualizadas e fotografadas em microscpio eletrnico de varredura Philips
XL-200 operando a 15 kV. Os tamanhos dos CI foram analisados utilizando o
software Image Tools.
3.2.12. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)
Espectros de infravermelho com transformada de Fourier (Fourier
Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR), com reflectncia total atenuada (ATR)
foram obtidos de amostras secas depo