JULLIANE LUIZA FUSCALDI
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE SELEÇÃO
GENÔMICA AMPLA PARA CANA-DE-AÇÚCAR –
ANÁLISE EM UM AMBIENTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento de
Plantas, da Universidade Federal de Goiás,
como requisito parcial à obtenção do título
de Magister Scientiae.
Orientador:
Prof. Dr. Alexandre G. S. Coelho
Goiânia, GO – Brasil
2014
JULLIANE LUIZA FUSCALDI
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE SELEÇÃO GENÔMICA
AMPLA PARA CANA-DE-AÇÚCAR – ANÁLISE EM UM AMBIENTE
Dissertação DEFENDIDA E APROVADA em 30 de Setembro de 2014, pela Banca
Examinadora constituída pelos membros:
__________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho
Presidente - EA-UFG
__________________________________________
-
Membro Interno – EA - UFG
__________________________________________
-
Membro Externo – EMBRAPA
DEDICO este trabalho a Deus, que permitiu
que tudo pudesse ser realizado.
Aos meus pais, Odilon e Divina, pelo
exemplo de luta e dedicação diária, pelos
princípios e ensinamentos.
Aos meus irmãos pelo carinho e apoio nesta
caminhada.
Ao meu sobrinho, Eric, pequena joia, que
desperta o que há de melhor em mim.
OFEREÇO.
4
“Plante seu jardim e decore sua alma, ao invés de esperar que alguém lhe traga flores. E
você aprende que realmente pode suportar, que realmente é forte, e que pode ir muito mais
longe depois de pensar que não se pode mais. E que realmente a vida tem valor e que você
tem valor diante da vida!”
WILLIAM SHAKESPEARE
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Goiás, pela oportunidade.
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, por
todo auxílio oferecido.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
pela concessão de bolsa de estudo.
A Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do Setor Sucroenergético
(Ridesa), pela concessão de recursos para realização dos experimentos.
Aos funcionários da Ridesa pelo auxílio na condução do experimento de
campo.
A Centroálcool, por disponibilizar a área para a condução do experimento e
mão-de-obra para auxílio durante o plantio e as avaliações fenotípicas.
Ao Prof. Alexandre Guedes Siqueira Coelho que idealizou o trabalho e
concedeu a mim a oportunidade de realizá-lo.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
de Plantas, pelos conhecimentos compartilhados durante minha formação.
Aos meus pais, Odilon e Divina, que nunca mediram esforços para que este
sonho se concretizasse e sempre estiveram ao meu lado, mesmo estando a quilômetros de
distância. Vocês são a minha vida!
Aos meus irmãos, Kelliane, Polliane e Odilon, que mesmo longe, sempre
estiveram presentes. Obrigada pelo amor, carinho, apoio e momentos de descontração.
Ao meu sobrinho, Eric, por deixar os meus dias mais alegres.
A Quel, pelas orações e carinho.
Aos colegas do Laboratório de Genética e Genômica de Plantas, Clistiane,
Milena, Camila, Isabela, Stela, pelo aprendizado e agradável convivência durante este
período, em especial a Ivone pela ajuda primordial na reta final durante as análises.
Aos amigos que me acompanharam durante a estadia em Goiânia, em especial
Clistiane, Milena, Lênio e Victor. Obrigada pelas farras, pela diversão e compreensão nos
momentos difíceis.
6
Aos amigos de Palmas, em especial Pedro, Nico e Marcelo, que nunca me
deixaram desistir, me incentivando e dando forças para chegar ao fim desta etapa.
Enfim, a Deus, que tornou tudo isso possível.
Meu sincero reconhecimento.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 8 LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 9 RESUMO ...........................................................................................................10 ABSTRACT ....................................................................................................................... 11
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 12 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 14 2.1 A CULTURA DA CANA-DE-AÇÚCAR ............................................................. 14 2.1.1 Importância econômica ....................................................................................... 14 2.1.2 Origem, domesticação e citogenética ................................................................. 15
2.2 MELHORAMENTO GENÉTICO DA CANA-DE-AÇÚCAR ............................. 16 2.2.1 Breve histórico ..................................................................................................... 16
2.2.2 Melhoramento convencional da cana-de-açúcar .............................................. 18
2.2.3 Seleção assistida por marcadores moleculares ................................................. 22 2.2.4 Seleção genômica ampla ..................................................................................... 23 3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 25 3.1 MATERIAL VEGETAL E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .................... 25
3.2 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA ............................................................................... 25 3.3 AVALIAÇÃO GENOTÍPICA .............................................................................. 27
3.3.1 Extração de DNA ................................................................................................. 27 3.3.2 Genotipagem ........................................................................................................ 28 3.4 SELEÇÃO GENÔMICA AMPLA ........................................................................ 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 32 4.1 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA ............................................................................... 32
4.2 SELEÇÃO GENÔMICA AMPLA ........................................................................ 34 5 CONCLUSÕES ................................................................................................... 38
6 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 39
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Área de origem de S. spontaneum, S. sinense e S. Barberi e S. robustum. As
setas indicam a dispersão de S. officinarum pela migração humana (Aitken &
Mcneil, 2010). ..................................................................................................... 15
Figura 2. Etapas de seleção no programa de melhoramento genético da cana-de-açúcar
conduzido pela Ridesa (Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do
Setor Sucroenergético). ....................................................................................... 21
Figura 3. Esquema de aplicação da seleção genômica ampla em um programa de
melhoramento genético (Resende Júnior, 2010). ................................................ 24
Figura 4. Avaliação fenotípica das caracterísicas (A) PESO, (B) NCOLM, (C) DIAM,
(D) COMP, (E) NENT e (F) BRIX. .................................................................... 26
Figura 5. Resumo do primeiro passo da PCR utilizando o método RAPiD-Seq. A reação
é realizada utilizando primers iniciadores que amplificam o loco desejado do
genoma. O primer contém a sequência requerida para o sequenciamento, um
código que identificará os indivíduos que estão sendo genotipados, uma
sequência degenerada que dá estabilidade ao primer na reação e sequência
específica que confere especificidade da reação ................................................. 28
Figura 6. Resumo do Segundo passo do método RAPiD-Seq. O produto da primeira PCR
para as amostras 48-96 é combinado para uma única reação de PCR
multiplex. Essa PCR curta incorpora nos fragmentos a estrutura final para o
sequenciamento. .................................................................................................. 29
Figura 7. Gráficos de dispersão (triangular inferior), histogramas (diagonal) e estimativas
do coeficiente de correlação (triangular superior) entre as diversas variáveis
avaliadas no presente estudo. .............................................................................. 33
Figura 8. Comparação da acurácia seletiva entre o modelo cheio e os dois métodos de
validação cruzada, Tem-fold e LOO, para as seis características estudadas. ..... 35
Figura 9. Gráficos de dispersão dos valores genéticos preditos via RR-BLUP e os valores
de eBLUPs observados para os seis caracteres avaliados. .................................. 37
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estatísticas descritivas das variáveis analisadas no experimento de avaliação
fenotípica .......................................................................................................... 32
Tabela 2. Estimativas obtidas para os parâmetros genéticos das variáveis quantitativas
avaliadas ........................................................................................................... 34
Tabela 3. Herdabilidade, capacidade preditiva e acurácias da seleção genômica ampla
via RR-BLUP para graus Brix, comprimento e diâmetro do colmo, número
de colmos por parcela, número de entrenós e peso da parcela ......................... 36
10
RESUMO
FUSCALDI, J. L. Desenvolvimento de um modelo de seleção genômica ampla para
cana-de-açúcar – análise em um ambiente. 2014. 43 f. Dissertação (Mestrado em
Genética e Melhoramento de Plantas: Genética e Genômica de Plantas) – Escola de
Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.1
Um programa de melhoramento genético da cana-de-açúcar leva em torno de
12 a 15 anos para disponibilizar no mercado genótipos elites previamente testados. Com o
propósito de acelerar esse processo, métodos mais eficientes de seleção vêm sendo
propostos como forma de obter uma seleção mais rápida e objetiva de características
relacionadas com a produção. Neste contexto, a seleção genômica ampla (GWS) foi
proposta objetivando aumentar a eficiência no melhoramento genético, fazendo uso direto
das informações de DNA na seleção, de forma a permitir alta eficiência seletiva, grande
rapidez na obtenção de ganhos genéticos com a seleção e baixo custo, em comparação à
tradicional seleção baseada em dados fenotípicos. Diante do exposto, o objetivo deste
trabalho foi avaliar uma plataforma de genotipagem de alto desempenho para cana-de-
açúcar e calibrar um modelo de seleção genômica ampla com base na análise de dados de
genotipagem de alto desempenho e análise de dados fenotípicos em um único ambiente.
Para isto, foi utilizada uma população constituída por 91 genótipos derivados da
autofecundação do genótipo-elite RB97327, e outra constituída por 81 genótipos oriundos
do cruzamento RB97327 x RB72454. O experimento foi conduzido no campo
experimental da Usina Centroálcool, localizada no município de Inhumas-GO (16°20'50"S,
49°29'2"W), entre novembro de 2010 a julho de 2012, com área total de 978,75 m2. O
delineamento utilizado foi o de blocos aumentados. Os colmos foram colhidos ao final do
ciclo. A partir do material coletado, foram feitas as seguintes avaliações: peso total da
parcela em kg (PESO), número de colmos por parcela (NCOLM), diâmetro médio do
colmo em mm (DIAM), comprimento do colmo em m (COMP), número de entrenós
(NENT) e brix em °Brix (BRIX). Os dados obtidos foram submetidos a análises
estatísticas para obtenção das estimativas dos parâmetros genéticos. O DNA genômico foi
isolado, utilizando o protocolo descrito por Aljanabi et al. (1999), com adaptações para
microtubos de 1,5mL. No total realizou-se a extração de DNA de 179 plântulas mais os
genitores envolvidos no estudo. A genotipagem foi realizada através da técnica RAPiD-
Seq e foram utilizados 153.831 locos SNPs para BRIX e 153.829 para os demais
caracteres. A predição dos valores genéticos genômicos foi obtida via RR-BLUP/GWS. A
acurácia foi calculada através da correlação entre os valores genéticos observados e
preditos via Ten-fold e Leave-one-Out Cross-Validation. As acurácias máximas obtidas
foram de 0,96 para diâmetro de colmo e 0,86 para graus Brix e comprimento de colmo. Os
valores genéticos genômicos preditos na população de validação cruzada aproximam-se
bem dos valores fenotípicos observados, exceto para número de entrenós, que apresentou
baixa acurácia seletiva. Os resultados deste estudo mostra grande oportunidade para o uso
deste método de seleção na cultura da cana-de-açúcar, permitindo estimativas acuradas de
parâmetros genéticos e a predição de valores genéticos genômicos para plantas jovens
ainda não fenotipadas. Com isso, o uso deste método pode reduzir significativamente a
duração dos ciclos de seleção e, consequentemente, otimizar a alocação de recursos e a
sustentabilidade do melhoramento.
Palavras-chave: Melhoramento genético, Seleção genômica ampla, Cana-de-açúcar.
1 Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho. EA-UFG.
ABSTRACT
FUSCALDI, J. L. Development of a model genome wide selection (GWS) cane sugar -
an environmental analysis. 2014. 43 f. Dissertation (Master in Genetics and Plant
Breeding: Genetics and Plant Genomics) – Escola de Agronomia e Engenharia de
Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.1
A sugar cane breeding program takes about 12 to 15 years to deliver into the market elite
genotypes previously tested. With the goal of speeding up this process, more efficient
selection methods have been suggested, as a way of obtain a more objective selection of
characteristics related with yield. IN this context, the genome wide selection (GWS) was
proposed, aiming the increase of efficiency in plant breeding, making a direct use of DNA
information in the selection, allowing a high efficiency and low cost process. The goal of
this project is to evaluate a genotyping platform of high performance for sugar cane and to
calibrate a genome wide selection model based on high performance data analysis of
genotyping and phenotypic data analysis in a single environment. A population composed
of 91 genotypes derived from the self-pollination of the elite genotype RB97327, and
another composed by 81 genotypes as a result of the cross of RB97327 x RB72454. The
experiment was conducted at the experimental field of CentroÁlcool Plant, located in
Inhumas-GO (16°20'50"S, 49°29'2"W), from November 2010 to July 2012, with a total
area of 978.75 m2. The experimental design used was augmented blocks. Stalks were
harvested at the end of the cycle. From each sample of the harvested material, the
following evaluations were performed: Total weight, in Kilograms (PESO), number of
stalks (NCOLM), average diameter of stalks, in millimetres (DIAM), stalk length, in
meters (COMP), internode number (NENT), and brix, in °Brix (BRIX). Data was
submitted to statistical analysis and used to obtain the genetic parameters estimates.
Genomic DNA was isolated through the protocol described by Aljanabi et al. (1999),
adapted to1.5 mL micro tubes. DNA was extracted from 179 seedlings and its parents.
Genotyping was done through the RAPiD-Seq technique and the use of 153 831 SNPs loci
for BRIX and 153,829 for other characters. The prediction of the genomic genetic values
was obtained through RR-BLUP/GWS. The accuracy was calculated through the
correlation between the observed genetic values and the ones predicted Ten-fold and
Leave-one-Out Cross-Validation. The maximum accuracy obtained was of 0.95 for stalk
diameter and of 0.85 for stalk length. The genomic genetic values predicted in the
population of cross validation are close to the observed phenotypic values, except for
internode numbers, that presented low selective accuracy. The results of this study show
great opportunity to use this selection method in sugar cane, allowing accurate estimates of
genetic parameters and the prediction of genomic genetic values for young plants not yet
phenotyped. Therefore, the use of this method can significantly reduce the selection cycle
length, and consequently, optimize the resource allocation and the breeding sustainability.
Key words: Plant breeding, Genome-wide selection, Sugarcane.
1 Adviser: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho. EA-UFG.
1 INTRODUÇÃO
O melhoramento genético vem, há vários anos, proporcionando grande avanço
no setor agrícola do Brasil e do mundo, atuando na melhoria de várias características de
interesse na agricultura e pecuária, e, com isso, apresentando grandes retornos sociais e
econômicos para os clientes dos segmentos público e privado. Com maior conhecimento
da natureza e da informação genética, métodos mais eficientes de seleção vêm sendo
propostos como forma de obter uma seleção mais rápida e objetiva de características
relacionadas com a produção, visando proporcionar o desenvolvimento de materiais
superiores.
Uma primeira proposição realizada para aumentar a eficiência desse
procedimento, baseada em dados fenotípicos, foi descrita por Lande & Thompson (1990).
Nesta foram identificados marcadores genéticos com potencial de aplicação na localização
de regiões genômicas que controlam características de interesse (QTL) (Resende Júnior,
2010). A incorporação de informação desses marcadores na seleção de genótipos
superiores é denominada Seleção Assistida por Marcadores Moleculares (SAM), a qual
utiliza simultaneamente informações genotípicas e características fenotípicas para a
seleção de indivíduos com maior valor genético. Essa técnica requer o estabelecimento
(análise de ligação) de associações marcadores-QTLs para cada família em avaliação; para
ser útil, precisa explicar grande parte da variação genética de uma característica
quantitativa, que é governada por muitos locos de pequenos efeitos, e; só apresenta
superioridade considerável em relação à seleção baseada em dados fenotípicos, quando o
tamanho de família avaliado e genotipado é muito grande (da ordem de 500 ou mais). No
entanto, apesar de ter sido um grande avanço para o melhoramento genético, a
implementação da MAS tem sido limitada e os ganhos em eficiência muito reduzidos
(Resende et al., 2008). Essas limitações motivaram pesquisadores a buscarem alternativas
mais eficientes, de menor custo e maior ganho por unidade de tempo para auxiliar a
seleção.
Visando a tais objetivos, Meuwissen et al. (2001) propuseram um novo método
de seleção. Esse método foi denominado Seleção Genômica Ampla (Genome Wide
13
Selection – GWS). Consiste na predição (sem o uso de testes de significância para
selecionar marcadores) dos valores genéticos dos indivíduos com base na análise de grande
número de marcadores genéticos dispersos em todo o genoma do organismo, de forma a
capturar os efeitos de todos os locos, pequenos e grandes, e explicar grande parte da
variação genética do caráter quantitativo (modificado Fritsche Neto, 2011). Através desta
técnica é possível predizer valores genotípicos, maximizando o ganho genético e
acelerando, portanto, o melhoramento genético.
Essa nova abordagem para a seleção de genótipos já vem sendo utilizada em
programas de melhoramento animal (Goddard & Hayes, 2007; Legarra & Misztal, 2008;
Rocha, 2011) e vegetal (Crossa et al. 2010; Crossa et al., 2011; Denis and Bouvet, 2013;
Fritsche Neto, 2011; Grattapaglia et al. 2011; Guo et al. 2012; Heslot et al. 2012; Lorenz et
al. 2011; Lorenzana and Bernardo 2009; Resende et al. 2012a; Resende et al. 2012b;
Resende Júnior, 2010; Rutkoski et al. 2012; Zhong et al. 2009), com resultados otimistas.
No melhoramento de animais domésticos a seleção genômica tem sido considerada uma
revolução, e seus conceitos têm sido facilmente aplicados ao melhoramento de plantas
(Grattplagia et al., 2011).
Na cultura da cana-de-açúcar, apesar dos programas de melhoramento genético
serem antigos, ainda não existe exemplos na literatura de seleção baseada neste método
para a cultura. Porém, com o desenvolvimento e baixo custo dos marcadores tipo SNP
(single nucleotide polymorphism), a GWS tem se apresentado como uma estratégia atrativa
e promissora ao melhoramento genético da cana-de-açúcar. Esse método permite avaliação
de maior número de clones e, com isso, exploração de maior variabilidade gerada. A
predição e seleção poderão ser realizadas em fases muito juvenis, acelerando, assim, o
processo de melhoramento e permitindo o desenvolvimento e lançamento de variedades
em períodos de tempo mais curtos, contribuindo fortemente para a expansão e crescimento
do setor sucroalcooleiro do país.
Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos avaliar uma
plataforma de genotipagem de alto desempenho para cana-de-açúcar e calibrar um modelo
de seleção genômica ampla com base na análise de dados de genotipagem de alto
desempenho e análise de dados fenotípicos em um único ambiente.
14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A CULTURA DA CANA-DE-AÇÚCAR
2.1.1 Importância econômica
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) ocupa lugar de destaque na agricultura
estando entre as espécies vegetais mais cultivadas no mundo, alcançando mais de oitenta
países (Teixeira, 2006). É cultivada no Brasil desde 1532, trazida por Martim Afonso, o
primeiro colonizador português, com o propósito de implantar engenhos de açúcar
(BNDES & CGCE, 2008). Portanto, a cultura sempre teve papel importante na economia
brasileira, desde o período dos engenhos coloniais.
Atualmente, a cultura da cana-de-açúcar alcança quase todos os estados
brasileiros e ocupa cerca de 9% da superfície agrícola do país, sendo o terceiro cultivo
mais importante em superfície ocupada, depois da soja e do milho. A região produtora de
maior destaque é a Centro-Sul, com mais de 85% da produção, com destaque para o estado
de São Paulo, maior produtor nacional (BNDES & CGCE, 2008).
Da safra de 1990/1991 até a safra de 2011/2012, a produção brasileira de cana-
de-açúcar avançou de 222,4 para 588,4 milhões de toneladas (Unica, 2013). Isso significa
grande crescimento e expansão do setor, proveniente da modernização do agronegócio
brasileiro, tornando-o cada vez mais competitivo. De acordo com o MAPA (2013), o país é
responsável por mais da metade do açúcar comercializado no mundo e deve alcançar taxa
média de aumento da produção de 3,25% até 2018/19, atingindo um volume previsto para
exportação, em 2019, de 32,6 milhões de toneladas. Além disso, o etanol produzido no
Brasil a partir da cana-de-açúcar também conta com projeções positivas para os próximos
anos, devido principalmente ao crescimento do consumo interno, alimentado em quase
totalidade pelo aumento da compra de veículos tipo flex e a diminuição das vendas de
carros monocombustíveis desde 2003.
O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de cana-de-açúcar (Mapa,
2013), o que coloca o país na liderança mundial em tecnologia de produção de etanol e
15
açúcar a partir da cana. Além da importância para a produção de açúcar e álcool, a cana-
de-açúcar é matéria-prima para diversos outros produtos, como bebidas e doces, e os seus
subprodutos e resíduos são utilizados para cogeração de energia elétrica, fabricação de
ração animal e fertilizantes para lavouras, sendo, portanto, inteiramente aproveitada.
2.1.2 Origem, domesticação e citogenética
Alguns autores acreditam que a cana-de-açúcar teve origem nas regiões de
Assam e Bengala, na Índia. Outros creditam sua procedência a Nova Guiné e as Ilhas do
Arquipélago da Polinésia. Embora existam divergências quanto ao centro de origem exato
da cana-de-açúcar, acredita-se que ela seja originária do sudeste da Ásia (Figura 1). Há
relatos de que a domesticação dessa planta ocorreu em seu centro de origem cerca de 8.000
a. C.
Figura 1. Área de origem de S. spontaneum, S. sinense e S. Barberi e S. robustum. As setas indicam a
dispersão de S. officinarum pela migração humana (Aitken & Mcneil, 2010).
A cana-de-açúcar é uma planta alógama, pertencente à família Poaceae, tribo
Andropogoneae e ao gênero Saccharum, o qual abrange várias espécies, dentre elas S.
officinarum (2n=80), S. spontaneum (2n = 40-128), S. robustum (2n = 60-205), S. sinense
(2n = 111-120), S. barberi (2n = 81-124) e S. edule (2n = 60-80) (Figueiredo, 2008). Essas
seis espécies pertencem ao “Complexo Saccharum”, que compreende cruzamentos entre as
espécies do gênero Saccharum.
Acredita-se que S. sinense e S. barberi são duas espécies derivadas a partir de
hibridações naturais entre S. officinarum e S. spontaneum (D’Hont et. al, 1996). Dados
moleculares mostram que as populações de S. robustum são geneticamente mais próximas
16
de S. spontaneum, admitindo-se a evolução desta a partir daquela. Apesar da baixa
disponibilidade de dados moleculares para rastrear a origem de S. edule, aqueles existentes
suportam a hipótese de que a espécie corresponde a uma série de clones mutantes que
foram identificadas em populações de S. robustum (D’Hont et al., 2008).
As variedades modernas são, em sua maioria, híbrido derivado de um processo
denominado “nobilização”. Esse processo, descrito por Bremer (1961), consistiu na
hibridação entre S. officinarum e a espécie selvagem S. spontaneum, seguido de
retrocruzamento com S. officinarum, para recuperar a maioria dos genes favoráveis para
elevados teores de sacarose do parental recorrente. Esses cruzamentos foram bem
sucedidos e contribuíram para introgressão de genes de resistência a doenças, vigor e
capacidade de adaptação, e o processo levou a genomas interespecíficos, cuja
complexidade provavelmente excede a de qualquer outra cultura importante poliploide
(D’Hont, 2005). Isto torna o genoma da cana-de-açúcar um dos mais difíceis de ser
estudado.
Análises citogenéticas de diversas variedades de cana-de-açúcar revelam que o
genoma das cultivares modernas é constituído por cerca de 100 a 130 cromossomos, com a
contribuição de S. officinarum variando de 70-80% e de S. spontaneum variando de 10-
20%. O restante é proveniente de rearranjos cromossômicos entre as duas espécies
(D´Hont, 2005).
2.2 MELHORAMENTO GENÉTICO DA CANA-DE-AÇÚCAR
2.2.1 Breve histórico
De acordo com Matsuoka (1996), em meados do século XIX os canaviais do
mundo todo passaram a apresentar graves problemas fitossanitários, com elevadas perdas
de produção e, com isso, muitas indústrias foram à falência. Em virtude disso e do
conhecimento das leis da genética, aliada à descoberta de que a cana-de-açúcar produzia
sementes, começaram os esforços para o seu melhoramento genético.
O primeiro cruzamento em cana-de-açúcar do mundo foi realizado em Java, em
1887, por Soltweld. Ele cruzou a cultivar Glagah com a Loethers e seu recíproco, obtendo
sementes férteis somente da Glagah. Era demonstrada a viabilidade do melhoramento
genético da cana-de-açúcar, por intermédio de cruzamentos controlados. Dois anos mais
17
tarde, em Barbados, também Harrison & Bowell obtiveram seedlings de sementes
originárias de cruzamentos. Criavam-se, assim, os primeiros programas de melhoramento
genético (Cesnik, 2004).
O Brasil importou, por muito tempo, variedades de cana-de-açúcar de outros
países. Porém, como não havia quarentenário e nem controle fitossanitário dessas
importações, com o passar dos anos foram identificadas várias doenças, como o mosaico e
o carvão, o que afetou drasticamente a produção. O país, então, precisava contornar esses
problemas e voltar à missão de manter seus canaviais em padrões elevados de
produtividade, em toneladas de cana-de-açúcar por hectare, e nas melhores porcentagens
de sacarose, com índices razoáveis de resistências a pragas e doenças. Com isso, no início
do século XX, surgiu a grande necessidade de criar uma experimentação canavieira no
Brasil.
Ao longo dos anos foram criadas várias instituições de pesquisas espalhadas
pelo país, e estas obtiveram grande sucesso na obtenção e desenvolvimento de genótipos
superiores. Inicialmente, objetivou-se a resistência às principais doenças conhecidas,
utilizando-se como “ferramenta” o cruzamento interespecífico, envolvendo Saccharum
officinarum, S. spontaneum, S. barberi e S. sinense. Isto proporcionou significativa
alteração no ideótipo varietal.
Em 1970 foi criado o Programa Nacional de Melhoramento da Cana-de-açúcar
(Planalsucar), vinculado ao Instituto do Açúcar e do Álcool (IAA), com a finalidade de
desenvolver e transmitir resultados de pesquisas com melhoramento da cana-de-açúcar,
para o campo e para a indústria. A ideia principal foi dar apoio às regiões com potencial de
desenvolvimento do Programa Nacional do Álcool, que buscava respostas rápidas em
termo de produção de álcool, levando em conta as características regionais.
Com a extinção do Planalsucar, em 1990, houve momentos de grande incerteza
sobre os destinos do seu patrimônio. Porém, um ano depois, grande parte desse patrimônio
foi absorvida por sete universidades federais: Universidade Federal de Alagoas (UFAL),
Universidade Federal de Sergipe (UFS), Universidade Federal Rural de Pernambuco
(UFRPE), Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Universidade Federal
de Viçosa (UFV), Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) e Universidade Federal
do Paraná (UFPr) (Matsuoka et al., 1999). Estas universidades assumiram os trabalhos
daquele órgão, instituindo a Rede Interuniversitária para Desenvolvimento do Setor
Sucroenergético – RIDESA. Em 2004, a Universidade Federal de Goiás (UFG) foi
18
agregada à Rede. Em 2008, as Universidades Federais de Mato Grosso (UFMT) e Piauí
(UFPI) também foram incluídas (Barbosa & Silveira, 2011).
Outro programa de melhoramento que tem tido significativa contribuição ao
setor é o do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Este programa tem a finalidade de
estabelecer pesquisa e desenvolvimento agrícola, passada por crises e reformas e mantida
até hoje com objetivo de gerar inovações significativas para a área agrícola, desde o
melhoramento genético, sistema de produção, colheita, transporte, área industrial e
comercialização (Figueiredo, 2008). O programa de melhoramento genético do IAC é o
mais antigo em atividade no Brasil.
Também em São Paulo, a Cooperativa dos Usineiros do Oeste do Estado de
São Paulo (Copereste) criou, em 1953, no município de Dumont, região de Ribeirão Preto,
uma estação experimental importante àquela região do Estado. Em 1968, a Cooperativa
Central dos Produtores de Açúcar e Álcool do Estado de São Paulo (Copersucar) deu início
a outro importante programa de melhoramento genético, incorporando a Copereste e sua
estação experimental. Esse programa foi substituído pelo Centro de Tecnologia Canavieira
(CTC), cujas pesquisas estão nas mesmas instalações que eram ocupadas pela Copersucar.
Atualmente existem no Brasil quatro programas de melhoramento que possuem
variedades comerciais lançadas aos produtores, o programa da Ridesa, do CTC, do IAC e
da Monsanto. Graças ao alto potencial produtivo desses programas, o grande número de
variedades de cana-de-açúcar permite a disponibilidade de materiais adaptados às
condições específicas de solo, clima, época de colheita e manejo agronômico (Landell &
Bressiani, 2008).
2.2.2 Melhoramento convencional da cana-de-açúcar
O sucesso de um programa de melhoramento genético está condicionado à
utilização e ao manejo corretos dos recursos genéticos ao longo dos ciclos seletivos
(Resende, 2002). Segundo Landell et al. (2005), o progresso genético eficaz decorre da
habilidade do melhorista em conduzir eficientemente todas as etapas desse longo processo,
desde o planejamento da hibridação até os ensaios de competição em diferentes locais e
épocas de colheita, passando por etapas de seleção em que o componente tático é bastante
exercitado.
19
O planejamento dos cruzamentos é realizado adotando-se como critérios
principais: grau de endogamia entre genitores, teor de açúcar, produtividade agrícola,
resistência às principais doenças (carvão, mosaico, ferrugem, amarelinho e escaldadura),
capacidade de brotação em soqueira e hábito ereto de crescimento da touceira nos
genitores (Landell et al., 2005).
O tamanho efetivo populacional é, também, um parâmetro muito importante a
ser considerado nos programas de melhoramento genético. Porém, o que se observa é um
elevado estreitamento genético em busca de genótipos cada vez mais produtivos,
proveniente de pequeno tamanho efetivo populacional e, consequentemente, da
variabilidade genética disponível para ciclos posteriores de melhoramento. É importante
salientar que quanto maior a variabilidade genética, maior a possibilidade de ganho de
seleção para o caráter desejado.
2.2.2.1 Hibridação e produção de seedlings
Os cruzamentos em cana-de-açúcar são realizados a partir do planejamento
prévio estabelecido por meio de métodos específicos. Os melhoristas buscam materiais
elite com ampla variabilidade genética para geração de populações segregantes. Porém,
esses materiais devem ser escolhidos com cautela, de modo a não ocorrer cruzamento entre
indivíduos aparentados, a fim de evitar os efeitos da endogamia, visto que a cana-de-açúcar
é uma espécie alógama.
Através da seleção de parentais, buscam-se progênies mais resistentes a pragas
e doenças, e adaptadas ao ambiente local, gerando ganhos de produtividade. Isso pode ser
obtido, convencionalmente, pelos seguintes tipos de hibridação:
a) Cruzamentos bi-parentais: cruzamento simples que são utilizados apenas dois
genitores conhecidos;
b) Policruzamentos: cruzamento no qual é intercruzado um grupo de genitores
selecionados. Este tipo de cruzamento impede a identificação da fonte de pólen,
sendo conhecido apenas o genitor feminino, de onde serão coletadas as panículas
fecundadas.
Para o êxito nos cruzamentos, são necessárias condições climáticas favoráveis
ao florescimento e viabilidade dos grãos de pólen. No Brasil, a hibridação é feita em
regiões litorâneas do Nordeste, onde o fotoperíodo e temperatura são adequados para tal
20
atividade. Muitos programas de melhoramento de cana-de-açúcar no mundo utilizam-se de
“Casa de Fotoperíodo”, ou seja, aplicam condições artificiais para induzir o florescimento
da cana (Landell et al., 2005).
Obtidas as sementes, estas são submetidas a condições adequadas para
germinação. Após a germinação e crescimento parcial, os seedlings são individualizados
para o enraizamento total, mantendo, durante este tempo, podas frequentes para evitar o
estiolamento, até serem levadas para ensaios em campo.
2.2.2.2 Seleção, obtenção e avaliação de clones
A primeira fase de seleção em progênies de melhoramento de cana-de-açúcar é
denominada T1. O transplantio pode ser feito agrupado ou individual. A cana-planta
normalmente é cortada, sem seleção, um ano após o transplantio, e a seleção é feita em
soca aos doze meses de idade. Opta-se pela seleção da soca porque, segundo Matsuoka et
al. (1999), em cana-planta não se permite avaliação segura da capacidade de brotação,
aspecto crucial em climas subtropicais e temperados, com frio e seca.
Na seleção de T1 em geral é avaliado, além da brotação da soca, apenas o vigor
da planta, pois o elevado número de plantas, na casa de 1,5 milhões, inviabiliza outros
tipos de avaliação. A seleção nesta etapa inicial é a que apresenta a menor eficiência,
quando comparada as demais.
A próxima fase é denominada T2. Nesta fase, é feita a avaliação tanto em cana-
planta quanto em cana-soca. São feitas as seguintes avaliações: teor de sólidos solúveis,
teor de sacarose, altura da planta, diâmetro do colmo, número de colmos, peso médio de
colmos, produção estimada de colmos, tonelada de colmos por hectare, tonelada de sólidos
solúveis por hectare, teores de fibra.
Na terceira fase, denominada T3, o número de genótipos sob avaliação é menor
e permite que sejam realizados experimentos em mais de um local. Assim busca-se
minimizar o efeito do ambiente na seleção. São feitas as mesmas avaliações descritas em
T2.
Por fim, a última etapa consiste na fase experimental (FE). Nesta etapa o
número de genótipos diminui de modo a possibilitar, ao longo das fases de seleção,
aumento nos locais de avaliação, no número de repetições por experimento e no tamanho
das parcelas. Assim, é possível obter elevada precisão experimental.
21
Os experimentos são conduzidos por vários ciclos, colhendo-se, pelo menos,
três safras, e procedendo-se as avaliações em três épocas diferentes de corte com objetivo
de prever qual a época adequada para o cultivo da nova variedade. Além das avaliações
descritas anteriormente, é feita a curva de maturação separadamente para cada nova
variedade possível.
As etapas de seleção dos diversos programas de melhoramentos de cana-de-
açúcar diferem de uma instituição para outra. Na Figura 2 é apresentado o cronograma das
fases de seleção no programa de melhoramento de cana-de-açúcar da Ridesa.
Figura 2. Etapas de seleção no programa de melhoramento genético da cana-de-açúcar conduzido pela
Ridesa (Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do Setor Sucroenergético).
2.2.2.3 Liberação de cultivares
Após doze a quinze anos de pesquisas e avaliações, os melhores genótipos são
selecionados e, então, liberados para comercialização como nova variedade. Logo, o tempo
gasto e, consequentemente os custos, para o desenvolvimento de uma nova variedade de
cana-de-açúcar são elevados.
Assim, as ferramentas moleculares constituem-se em técnicas valiosas para
esses programas de melhoramento, principalmente por oferecerem a possibilidade de
reduzir o tempo e os custos gastos na obtenção de novas variedades com características
agronômicas desejáveis. Segundo Heerdt (2008), o sequenciamento do genoma da cana-de-
açúcar tem facilitado e acelerado a identificação de genes responsáveis por caracteres
22
desejáveis, possibilitando a manipulação subsequente de genes de interesse através de
técnicas de genética molecular. Com as tecnologias de nova geração de sequenciamento,
espera-se melhorar os estudos sobre a estrutura deste genoma, a genômica comparativa e a
identificação de marcadores associados a características agronômicas de interesse.
2.2.3 Seleção assistida por marcadores moleculares
O desenvolvimento de marcadores moleculares para aplicações no
melhoramento de plantas foi popularizado no início dos anos 1980, quando os marcadores
isoenzimáticos foram usados para acelerar a introgressão de características monogênicas de
germoplasma exótico em um cultivar (Xu & Crouch, 2008). Os marcadores moleculares
vieram como ferramenta para auxiliar os melhoristas na seleção de genótipos superiores,
tornando o processo de seleção mais rápido, podendo, de forma mais eficaz, identificar,
quantificar e caracterizar a variação genética dentro de uma população segregante.
Com o desenvolvimento dos marcadores moleculares e o avanço em técnicas
de biologia molecular, criou-se a expectativa de que as informações genotípicas dos
marcadores moleculares, uma vez correlacionadas com características fenotípicas de
interesse, pudessem ser amplamente utilizadas na obtenção e seleção de indivíduos com
maior valor genético. Esta técnica ficou conhecida como seleção assistida por marcadores
moleculares (MAS - Marker Assisted Selection).
A seleção baseada em MAS apresenta as seguintes características: (i) requer o
estabelecimento de associações marcadores-QTLs, via análise de ligação, para cada família
em avaliação; (ii) para ser útil, precisa explicar grande parte da variação genética de uma
caracter quantitativo, que seja governado por muitos locos de pequenos efeito; e (iii) só
apresenta superioridade considerável em relação à seleção baseada em dados fenotípicos,
quando o tamanho da família avaliada e genotipada é muito grande. E, em função desses
aspectos, a implementação da MAS tem sido limitada e os ganhos em eficiência muito
reduzidos (Resende et al., 2008). Em razão disso, o uso desta estratégia tem se justificado,
principalmente, em retrocruzamentos, visando a obtenção de maior eficiência na
transferência de fatores genéticos, e em seleção recorrente, para melhoramento de
populações envolvendo cruzamento de indivíduos com combinação alélica favorável.
23
2.2.4 Seleção genômica ampla
O grande atrativo da genética molecular, em benefício do melhoramento
genético aplicado, é a utilização direta das informações de DNA na seleção, de forma a
permitir alta eficiência seletiva, grande rapidez na obtenção de ganhos genéticos com a
seleção e baixo custo, em comparação à tradicional seleção baseada em dados fenotípicos
(Resende et al., 2008). Baseado nestas premissas, Meuwissen et al. (2001) propuseram um
novo método de seleção como forma de predizer o fenótipo futuro de uma população,
baseado em informações de marcadores moleculares. Este método envolve a utilização de
métodos estatísticos de estimação/predição dos valores genotípicos (Resende, 2007;
Resende et al., 2008), baseado na genotipagem em larga escala utilizando marcadores
moleculares, sendo denominada seleção genômica ampla (GWS – Genome Wide
Selection).
Essa técnica permite a seleção precoce de indivíduos, gerando rapidez ao
processo e aumentando a sua eficiência, objetivando maximizar a acurácia e,
consequentemente, o ganho de seleção. De acordo com Resende et al. (2008), a técnica
pode ser aplicada em todas as famílias sob avaliação nos programas de melhoramento de
espécies alógamas; apresenta alta acurácia para seleção baseada exclusivamente em
marcadores; e não exige prévio conhecimento das posições dos QTL, característica
necessária ao seu uso em seleção assistida por marcadores (MAS).
A GWS consiste na predição simultânea dos efeitos genéticos de grande
número de marcadores de DNA dispersos em todo o genoma do organismo. Essa predição
é realizada de forma a capturar os pequenos e grandes efeitos de todos os locos e explicar
grande parte da variação genética do caráter quantitativo (Fristsche Neto, 2011).
Através de dados fenotípicos da população de estimação, equações de predição
de valores genéticos genômicos são obtidas para cada caráter de interesse. Nessa
população são descobertos, via marcadores, os marcadores que explicam os locos que
controlam os caracteres, bem como são estimados os seus efeitos (Resende et al., 2010).
De posse do modelo obtido na população de estimação, uma população de validação é
utilizada para avaliar suas acurácias. Com base nestas acurácias, os modelos são então
escolhidos e incorporados à seleção nos programas de melhoramento, sendo usados na
predição dos valores genotípicos dos indivíduos candidatos à seleção (Figura 3).
24
Figura 3. Esquema de aplicação da seleção genômica ampla em um programa de melhoramento genético
(Resende Júnior, 2010).
A obtenção de valores genômicos pode ser efetuada com uso de estimadores de
quadrados mínimos (LS), por preditores BLUP/GWS (Best Linear Unbiased Prediction),
utilizando uma abordagem Bayesiana – BayesA e BayesB (Meuwinsen et al., 2001;
Bernardo & Yu, 2007; Lorenzana & Bernardo, 2009), ou por aprendizado de máquina
(Long et al., 2007). Essas abordagens diferem na suposição sobre o modelo genético
associado ao caráter quantitativo (Resende et al., 2008).
A abordagem da predição de valor genômico proposta por Meuwissen et al.
(2001) considera a predição dos efeitos BLUP pela solução das equações de modelos
mistos de Henderson (Resende, 2007; Resende et al., 2008). Nesse contexto, podem ser
considerados, por exemplo, todos os marcadores SNPs identificados, para posterior
predição do valor genotípico dos indivíduos avaliados, conforme prescrevem Meuwissem
et al. (2001), Bernardo & Yu (2007) e Lorenzana & Bernardo (2009).
Outra alternativa é a utilização da metodologia conhecida como Regressão
Aleatória (Random Regression) do tipo BLUP (RR-BLUP), aplicada à Seleção Genômica
Ampla (RR-BLUP/GWS), sendo esta um tipo especial da regressão de cumeeira (Ridge
Regression) (Resende et al., 2010). O procedimento RR-BLUP/GWS visa identificar os
marcadores com maiores efeitos, objetivando processar análises com subgrupos menores
de marcadores e determinar quantos e quais marcadores maximizam a acurácia seletiva.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAL VEGETAL E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Para a condução do experimento foram utilizados clones desenvolvidos no
Programa de Melhoramento Genético de Cana-de-Açúcar da Universidade Federal de
Goiás (PMGCA-UFG), provenientes de cruzamentos realizados na Estação de
Cruzamentos de Serra do Ouro, em Murici-AL.
Foi utilizada uma população constituída por 91 genótipos, oriunda da
autofecundação de um genótipo-elite da Ridesa RB97327 e outra, constituída por 81
genótipos, proveniente do cruzamento entre RB97327 e a variedade comercial RB72454.
Os genótipos foram plantados em novembro de 2010, no campo experimental da Usina
Centroálcool, localizada no município de Inhumas-GO (16°20'50"S, 49°29'2"W),
vinculada ao PMGCA-UFG.
O experimento apresentou área total de 978,75 m2 e o delineamento utilizado
foi o de blocos aumentados (Federer, 1956). O experimento foi constituído por nove linhas
de 67,5 m cada, tendo sido cada uma destas subdividida em 15 blocos. Cada bloco foi
constituído por oito parcelas (touceiras), das quais duas eram testemunhas comuns a todos
os blocos. As variedades comerciais utilizadas como testemunhas foram a RB99395 e
RB98710. O espaçamento de cada parcela, bem como o utilizado entre as plantas na linha
foi de 0,5m, apresentando, portanto, cada bloco, 4,5 m de comprimento.
O experimento foi conduzido utilizando-se os tratos culturais tradicionalmente
recomendados para a cultura da cana-de-açúcar.
3.2 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA
Em julho de 2012, os colmos de todos os genótipos foram identificados,
coletados, amarrados em feixes e transportados para a Escola de Agronomia da
Universidade Federal de Goiás, onde foi realizada a avaliação fenotípica dos seguintes
26
caracteres: peso total da parcela em kg (PESO), número de colmos por parcela (NCOLM),
diâmetro médio do colmo em mm (DIAM), comprimento do colmo em m (COMP),
número de entrenós (NENT) e brix em °Brix (BRIX) (Figura 4). Com exceção dos dois
primeiros caracteres, os demais foram avaliados tomando-se seis colmos ao acaso em cada
touceira.
Figura 4. Avaliação fenotípica das caracterísicas (A) PESO, (B) NCOLM, (C) DIAM, (D) COMP, (E)
NENT e (F) BRIX.
Para a obtenção do peso total da parcela, os colmos cortados foram amarrados
em feixes e pesados em balança digital. NCOL foi obtido pela contagem direta do número
de colmos presentes em cada feixe; DIAM foi obtido por paquímetro, tendo sido a medição
realizada no centro do entrenó localizado na porção mediana do colmo; COMP foi obtido
com trena, considerando-se a medida da base do colmo até o último entrenó; e NENT pela
contagem direta do número de entrenós existentes desde a base do colmo até à altura da
emissão das últimas folhas. Para a avaliação do teor de sólidos solúveis totais presentes nos
colmos (°BRIX), estes foram cortados em sua porção mediana, no centro de um entrenó, e
esmagados para obtenção de uma amostra de “suco”. A leitura do valor referente ao brix,
27
diretamente relacionada à quantidade de sacarose nos colmos, foi realizada em
refratômetro analógico portátil.
3.3 AVALIAÇÃO GENOTÍPICA
3.3.1 Extração de DNA
O DNA genômico foi isolado, utilizando o protocolo descrito por Aljanabi et
al. (1999), com adaptações para microtubos de 1,5mL. No total realizou-se a extração de
DNA de 179 plântulas mais os genitores envolvidos no estudo. A quantificação do DNA
extraído foi realizada através do espectrofotômetro Qubit (Invitrogen®).
Duas gemas frescas foram coletadas e colocadas em microtubos do tipo
eppendorf, contendo 300 µL de tampão de homogeinização, em pH 8,0, constituído por
Tris-HCl 200mM, EDTA 50 mM, CTAB 2% e 0,06% de Sulfito de Sódio, juntamente com
três beads de tungstênio. Isto foi conduzido ao Laboratório de Genética e Genômica de
Plantas, da Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, da Universidade Federal de
Goiás, para continuação da extração. Posteriormente, em cada microtubo foram
adicionados 150 µL de solução de PVP (Polivinilpirrolidona) 10%, 150 µL de solução de
CTAB 20% e 150 µL solução de N-Lauril Sarcosina 5%.
As amostras foram maceradas durante 3’ em equipamento Tissulyser
(Qiagen®), e, posteriormente, colocadas em banho-maria a 65ºC, por sessenta minutos.
Após retirar os microtubos do banho-maria, foi adicionado 750 µL de clorofórmio: álcool
isoamílico (24:1), em cada tubo, os quais foram homogeneizados por 10’. Em seguida, as
amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10’ e, aproximadamente 400 µL do
sobrenadante foram transferidos para tubos contendo 500 µL de isopropanol, acrescido de
150 µL de solução de NaCl 6M.
As amostras foram homogeneizadas e submetidas a -20ºC por 40’, para
promover a precipitação do DNA. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm
por 10’, para ocorrer a formação do pellet. O sobrenadante foi novamente descartado e o
pellet formado foi lavado duas vezes com 500 µL de etanol 70% e colocados para secar à
temperatura ambiente. Após completamente secos, os pellets foram ressuspendidos em 100
µL de TE (Tris-EDTA).
28
Após a extração, a quantificação de DNA foi realizada utilizando-se
espectrofotômetro Quibit (Invitrogen®).
3.3.2 Genotipagem
Na genotipagem foram utilizados 153.831 locos SNPs para BRIX e 153.829
para os demais caracteres, que foram escolhidos pelo seu conteúdo informativo, pela
localização nos cromossomos e por apresentarem associação com caracteres de interesse
agronômico.
Estes dados foram gerados através da tecnologia denominada RAPiD-Seq
(Rapid Genomics, 2014) a qual foi desenvolvida visando alto rendimento, baixo custo e
uma plataforma flexível para genotipagem de DNA de qualquer espécie. Para isso, o
método faz uso de duas sequências de reações em cadeia de polimerase (PCR) para gerar
uma representação reduzida do genoma que pode ser sequenciada em qualquer plataforma
de sequenciamento de nova geração (NGS).
A primeira PCR é realizada de forma independente para cada amostra a ser
genotipada. Os primers utilizados nesta reação contém uma sequência específica que
determina o número e a distribuição dos locais de anelamento do genoma. Portanto, o
número de locos que são genotipados pode ser ajustado pela seleção de diferentes primers,
de acordo com a densidade de cobertura do genoma e a espécie (Figura 5).
Figura 5. Resumo do primeiro passo da PCR utilizando o método RAPiD-Seq. A reação é realizada
utilizando primers iniciadores que amplificam o loco desejado do genoma. O primer contém a
sequência requerida para o sequenciamento, um código que identificará os indivíduos que estão
sendo genotipados, uma sequência degenerada que dá estabilidade ao primer na reação e
sequência específica que confere especificidade da reação.
29
A segunda PCR é realizada com um pool de amostras derivadas da primeira
PCR, combinando indivíduos que serão sequenciados juntos para aumentar o rendimento
do processo. Após essa reação, as amostras são lidas em um sequenciador de nova geração.
Os dados da sequência são analisados usando algoritmos customizados e informação
genotípica obtida (Figura 6).
Figura 6. Resumo do Segundo passo do método RAPiD-Seq. O produto da primeira PCR para as amostras
48-96 é combinado para uma única reação de PCR multiplex. Essa PCR curta incorpora nos
fragmentos a estrutura final para o sequenciamento.
3.4 SELEÇÃO GENÔMICA AMPLA
Nesta etapa, foi empregado o método da regressão aleatória para realização das
análises. Este método utiliza preditores do tipo BLUP, mas os efeitos de marcadores não
são ajustados como variáveis classificatórias, mas sim como variáveis explicativas ou
explanatórias. Assim são variáveis regressoras e são ajustadas com base nessas
covariáveis. O nome apropriado ao método é Regressão Aleatória (Random Regression) do
tipo BLUP (RR-BLUP) aplicado à seleção genômica ampla (RR-BLUP/GWS), sendo esta
um tipo especial da regressão de cumeeira (Ridge Regression) (Resende et al., 2010). Este
30
método estima simultaneamente os efeitos de todas as marcas, sendo estas consideradas
efeitos aleatórios com variância comum, ou seja, assumem que todos os marcadores
contribuem igualmente para a variação genética (ausência de genes de efeitos maiores).
A predição via RR-BLUP/GWS é descrita a seguir com base em Resende
(2007; 2008). O seguinte modelo linear misto geral é ajustado para estimar os efeitos dos
marcadores:
eZaXby ,
em que: y é o vetor de médias fenotípicas de cada clone, b é o vetor de efeitos fixos de
blocos, a é o vetor dos efeitos aleatórios de marcadores, e e refere-se ao vetor de resíduos
aleatórios. X e Z são as matrizes de incidência dos efeitos b e a. A matriz de incidência X
contém os valores para o número de alelos do marcador.
A estrutura das médias e das variâncias pode ser definida como:
)G,(N~a 0
)R,(N~e 0
Xb)y(E
R'ZGZV)y(Var
As equações de modelo misto genômicas para a predição de m via o método
RR-BLUP equivalem a:
y'Z
y'X
a
b
n/Z'ZX'Z
Z'XX'X
A
e
2
2
em que, 2
A se refere à variância genética aditiva total do caráter, 2
e é a variância residual
e n o númeto total de marcadores ponderados.
O valor genético genômico global do indivíduo j é dado por:
i
ii aZyVGG
31
Primeiramente foi realizada a análise com o “modelo cheio” (full), ou seja,
considerando as informações de todos os indivíduos para o cálculo dos VGG, e
posteriormente foram realizadas validações por dois diferentes métodos, k-Fold Cross-
Validation e Leave One Out Cross-Validation (LOO), ambos por jack-knife. O primeiro
método de validação cruzada consiste em particionar aleatoriamente a população em k
subconjuntos. Destes k subconjuntos, um é retido para ser utilizado na validação do
modelo e os k-1 subconjuntos restantes são utilizados para predição. O processo de
validação cruzada é, então, repetido k vezes, de forma que todos os subgrupos foram
utilizados para predição e validação. Neste estudo, foi utilizado k igual a 10, sendo
denominada como Tem Fold Cross-Validation (10-Fold).
O segundo método possui a mesma definição da técnica anterior, a diferença
está no número do subconjunto k. O método Leave-One-Out define o número de
subconjunto igual ao número de exemplos pertencentes ao conjunto de treinamento.
Em ambos os procedimentos, em cada subgrupo analisado a GWS foi avaliada
ao calcular a correlação entre o valor genético predito por esse método e o valor fenotípico
observado nos indivíduos. Essa correlação é conhecida como capacidade preditiva ( ),
sendo dada teoricamente pela acurácia de seleção ( ) multiplicada pela raiz quadrada da
herdabilidade individual no sentido restrito ( ) (Resende et al., 2010).
=
As análises foram realizadas empregando o software R versão 3.1.0 (R Core
Team, 2014), utilizando o pacote rrBLUP (Endelman , 2011).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA
A Tabela 1 apresenta um resumo das estimativas obtidas para os parâmetros
descritivos relativos a cada um os seis caracteres avaliados. Foram estimados os valores
mínimos (mín.) e máximos (máx.) para cada variável, os três quartis (Q.25, Q.50 e Q.75),
sendo o segundo a própria mediana, a média aritmética, a variância, o desvio padrão e o
coeficiente de variação. Através destes dados é possível que tenhamos uma visão global da
variação desses valores.
Tabela 1. Estatísticas descritivas das variáveis analisadas no experimento de avaliação fenotípica
Variável mín. Q.25 Q.50 Q.75 máx. média σ2 σ CV%
BRIX 4,00 20,13 21,64 22,83 26,33 21,17 6,58 2,57 12,12
COMP 0,48 1,37 1,62 1,84 2,84 1,60 0,13 0,37 22,86
DIAM 9,48 18,95 22,33 25,31 30,39 21,73 19,80 4,45 20,47
NCOL 1,00 4,00 6,00 8,00 2,001 6,46 12,18 3,49 54,02
NENT 10,00 23,2 26,75 31,6 45,00 27,05 44,98 6,71 24,80
PESO 0,10 1,80 3,80 6,80 31,40 4,75 16,80 4,10 86,21
A partir do coeficiente de variação pode-se avaliar a homogeneidade do
conjunto de dados e, consequentemente, se a média é uma boa medida para representar
estes dados. Um coeficiente de variação superior a 50% sugere alta dispersão o que indica
heterogeneidade dos dados. Quanto maior for este valor, menos representativa será a
média. Quanto mais próximo de zero, mais homogêneo é o conjunto de dados e mais
representativa será sua média. Além disso, com CV<50%, podemos afirmar que a média é
uma medida descritiva representativa para todas as características estudadas, exceto para
NCOL e PESO.
Na Figura 1 são apresentados os histogramas obtidos para todas as variáveis
avaliadas, além da análise de correlação entre todas as variáveis e os gráficos de dispersão
entre elas. Do total de 15 correlações avaliadas, nenhuma delas apresentou correlação
perfeita (r = 1,0), 2 apresentaram correlação forte (0,6 < r < 0,9), 4 apresentaram
33
correlação média (0,3 < r < 0,6) e 7 apresentaram correlação fraca (0,0 < r < 0,3) e 2
apresentaram correlação negativa, indicando associação negativa entre os caracteres.
Figura 7. Gráficos de dispersão (triangular inferior), histogramas (diagonal) e estimativas do coeficiente de
correlação (triangular superior) entre as diversas variáveis avaliadas no presente estudo.
Na Tabela 2 estão apresentados os parâmetros genéticos dos diversos
caracteres avaliados estimados via REML. As variâncias genotípicas foram maiores que as
variâncias ambientais para os caracteres BRIX, DIAM, NCOL e PESO. Os coeficientes de
variação genética (CVg) e coeficientes de variação ambiental (CVe) também foram estimados.
O CVg fornece informações à respeito da magnitude relativa da variabilidade genética presente
na população para uma dada variável de interesse. Valores elevados (superiores a 20%) foram
observados para os caracteres relacionados diretamente com a produtividade de cana na
34
população deste trabalho. Este resultado evidencia a existência de variabilidade genética
suficiente para condução do trabalho de melhoramento.
Tabela 2. Estimativas obtidas para os parâmetros genéticos das variáveis quantitativas avaliadas
Variável s2g s2
e CVg (%) CVe (%) CVg/CVe 2CVg (%)
BRIX 6,73 2,25 12,26 7,09 1,73 24,51
COMP 0,12 0,06 21,38 15,81 1,35 42,76
DIAM 14,51 10,14 17,53 14,65 1,20 35,06
NCOL 14,06 5,15 58,04 35,13 1,65 116,08
NENT 7,01 24,90 9,79 18,45 0,53 19,58
PESO 19,06 8,82 91,92 62,52 1,47 183,84
Conforme salientam Vencovsky & Barriga (1992), a razão CVg/CVe
representa uma relação importante por sugerir se o ambiente foi favorável ou desfavorável
para realização de seleção para os caracteres avaliados. Segundo estes autores quando a
razão CVg/CVe é maior do que 1,0, as condições podem ser consideradas favoráveis para
se fazer seleção para a determinada característica. Com base neste critério, as condições
ambientais em que o experimento foi conduzido foram favoráveis para prática da seleção
sobre os seguintes todos os caracteres, exceto NENT. Esta variável, devido à
preponderância dos efeitos residuais ambientais sobre os genéticos, não estão em
condições favoráveis para se fazer a seleção de genótipos superiores.
Na Tabela 2 são também apresentados os valores correspondentes ao dobro do
CVg (2CVg). Este parâmetro permite a avaliação da magnitude dos limites teóricos
alcançáveis sob seleção na população. Para a variável PESO, por exemplo, com média
igual a 4,75 kg/parcela, a prática da seleção pode acarretar um aumento aproximado de até
183,84%, ou seja, explorando a variabilidade existente na população a média deste caráter
poderia chegar até o limite de 13,48 kg/parcela. Observações análogas podem ser feitas
para as demais variáveis.
4.2 SELEÇÃO GENÔMICA AMPLA
Foi obtido um modelo de GWS, via RR-BLUP, para 179 indivíduos com uso
de informação de 153.831 locos SNPs para BRIX e 153.829 para os demais caracteres.
Com base nos modelos obtivemos os valores genéticos genômicos (VGG) de cada
indivíduo, para todos os caracteres avaliados. Além disso, foram calculados valores de
35
acurácia para cada um dos caracteres e construídos gráficos de dispersão evidenciando a
relação entre os VGG preditos para os indivíduos e os valores por eles apresentados
durante a fenotipagem (eBLUPs).
Durante as análises, foi realizada uma comparação entre a acurácia obtida entre
a avaliação do modelo cheio e os dois métodos de validação cruzada utilizados para definir
qual melhor método (Figura 8). Os dois métodos de validação tiveram grande diferença
apenas para as características BRIX e NENT, para as demais não houve diferença
significativa. Para BRIX, o método LOO apresentou maior acurácia, ao contrário de
NENT. Sendo assim, para inferência sobre os valores obtidos foram considerados os
valores obtidos pela validação LOO, visto que esta gera valores mais consistentes.
Figura 8. Comparação da acurácia seletiva entre o modelo cheio e os dois métodos de validação cruzada,
Tem-fold e LOO, para as seis características estudadas.
A herdabilidade de cada caráter, no sentido restrito, foi estimada através da
variância dos caracteres. Esse valor variou de 0,22 a 0,80 entre os diferentes caracteres e
foi observados o maior valor de herdabilidade para brix (Tabela 3). Com exceção do
número de entrenós, no geral, observou-se valores relativamente altos de herdabilidade
indicando a existência de efeitos aditivos na expressão genética desses caracteres.
Verifica-se também que a herdabilidade relacionada ao caractere brix
maximiza a capacidade preditiva na validação cruzada (Tabela 3). O ponto de máximo da
capacidade preditiva reflete a coerência interna e intrínseca dos dados em informar sobre o
fenótipo. As maiores capacidades preditivas foram obtidos para brix seguido por diâmetro
e comprimento do colmo. Através do estudo da precisão genômica em cana de açúcar,
Gouy et al. (2013), obtiveram capacidade preditiva de 0,13 para resistência à ferrugem e
36
0,55 para brix; e afirmam que este nível de correlação é promissor para futuras
implementações do método para cana de açúcar.
Tabela 3. Herdabilidade, capacidade preditiva e acurácias da seleção genômica ampla via RR-BLUP para
graus Brix, comprimento e diâmetro do colmo, número de colmos por parcela, número de entrenós
e peso da parcela
Trait Tamanho da
população Herdabilidade (h2)
Capacidade
preditiva Acurácia
BRIX 176 0,80 0,77 0,86
COMP 179 0,67 0,70 0,86
DIAM 179 0,59 0,73 0,96
NCOL 179 0,73 0,65 0,76
NENT 179 0,22 0,03 0,06
PESO 179 0,68 0,66 0,80
A acurácia da GWS, em geral, segui a tendência observada para capacidade
preditiva; os valores máximos obtidos foram de 0,96 para diâmetro de colmo e 0,86 para
graus Brix e comprimento de colmo, respectivamente (Tabela 3). Em simulações feitas
por Meuwissen et al. (2001) o RR-BLUP apresentou uma acurácia de 0,732. Muir (2007)
simulou 512 genótipos para um caráter com uma baixa herdabilidade (h2 = 0,1) que
resultou numa acurácia ainda maior, de 0,83; Cavalcanti et al. (2012), em estudo de 74
indivíduos de uma família de irmãos completos de caju, obteve acurácia de 86% para peso
de amêndoas, na análise com 70 marcadores de maiores efeitos. No melhoramento animal,
VanRaden et al. (2009) avaliando uma população de 3500 touros, genotipados com 38416
SNPs através de dois métodos diferentes, RR-BLUP e Bayes B, obtiveram acurácias de
0,44 a 0,79 para características com herdabilidades entre 0,04 e 0,50.
Além disso, Fritsche Neto (2011), estimando dois componentes da eficiência
no uso de nitrogênio e de fósforo (eficiência de absorção e de utilização) em 41
combinações híbridas, em dois experimentos, sob baixa e alta disponibilidades de N e P,
através do mesmo método utilizado neste estudo, RR-BLUP, obtiveram altos valores de
acurácia e concluíram que, com o uso da GWS, houve aumento significativo na acurácia
seletiva e nos ganhos genéticos por unidade de tempo.
Gráficos de dispersão entre os valores genéticos preditos via RR-BLUP e os
valores de eBLUPs observados para os seis caracteres avaliados podem ser observados na
Figura 9. Eles ilustram, visualmente, a capacidade de predição genômica obtida para as
diferentes características.
37
Nestes gráficos, para os caracteres COMP, DIAM, NCOL e PESO, observa-se
a formação de dois diferentes aglomerados de pontos. Verificou-se que quanto maior a
acurácia mais concisos e determinados estes grupos se encontravam. Os demais caracteres
apresentaram este efeito tão menos evidenciado quanto menor a acurácia do modelo.
Figura 9. Gráficos de dispersão dos valores genéticos preditos via RR-BLUP e os valores de eBLUPs
observados para os seis caracteres avaliados.
5 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, constataram-se, com uso da GWS, altos
valores de acurácia seletiva para todos os caracteres estudados, exceto para NENT. Além
disso, no geral, os valores genéticos genômicos preditos na população de validação cruzada
apresentam alta correlação com os valores fenotípicos observados e, portanto, a seleção
genômica ampla pode ser usada com eficiência no melhoramento de cana de açúcar.
Dessa forma, os resultados obtidos neste estudo apontam grande potencial
deste método como forma de acelerar a seleção para características complexas em cana de
açúcar, podendo reduzir significativamente a duração dos ciclos de seleção e,
consequentemente, otimizando a alocação de recursos e a sustentabilidade do
melhoramento.
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