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  • JULLIANE LUIZA FUSCALDI

    DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE SELEO

    GENMICA AMPLA PARA CANA-DE-ACAR

    ANLISE EM UM AMBIENTE

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

    Graduao em Gentica e Melhoramento de

    Plantas, da Universidade Federal de Gois,

    como requisito parcial obteno do ttulo

    de Magister Scientiae.

    Orientador:

    Prof. Dr. Alexandre G. S. Coelho

    Goinia, GO Brasil

    2014

  • JULLIANE LUIZA FUSCALDI

    DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE SELEO GENMICA

    AMPLA PARA CANA-DE-ACAR ANLISE EM UM AMBIENTE

    Dissertao DEFENDIDA E APROVADA em 30 de Setembro de 2014, pela Banca

    Examinadora constituda pelos membros:

    __________________________________________

    Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

    Presidente - EA-UFG

    __________________________________________

    -

    Membro Interno EA - UFG

    __________________________________________

    -

    Membro Externo EMBRAPA

  • DEDICO este trabalho a Deus, que permitiu

    que tudo pudesse ser realizado.

    Aos meus pais, Odilon e Divina, pelo

    exemplo de luta e dedicao diria, pelos

    princpios e ensinamentos.

    Aos meus irmos pelo carinho e apoio nesta

    caminhada.

    Ao meu sobrinho, Eric, pequena joia, que

    desperta o que h de melhor em mim.

    OFEREO.

  • 4

    Plante seu jardim e decore sua alma, ao invs de esperar que algum lhe traga flores. E

    voc aprende que realmente pode suportar, que realmente forte, e que pode ir muito mais

    longe depois de pensar que no se pode mais. E que realmente a vida tem valor e que voc

    tem valor diante da vida!

    WILLIAM SHAKESPEARE

  • AGRADECIMENTOS

    A Universidade Federal de Gois, pela oportunidade.

    Ao Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento de Plantas, por

    todo auxlio oferecido.

    A Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior CAPES,

    pela concesso de bolsa de estudo.

    A Rede Interuniversitria para o Desenvolvimento do Setor Sucroenergtico

    (Ridesa), pela concesso de recursos para realizao dos experimentos.

    Aos funcionrios da Ridesa pelo auxlio na conduo do experimento de

    campo.

    A Centrolcool, por disponibilizar a rea para a conduo do experimento e

    mo-de-obra para auxlio durante o plantio e as avaliaes fenotpicas.

    Ao Prof. Alexandre Guedes Siqueira Coelho que idealizou o trabalho e

    concedeu a mim a oportunidade de realiz-lo.

    Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento

    de Plantas, pelos conhecimentos compartilhados durante minha formao.

    Aos meus pais, Odilon e Divina, que nunca mediram esforos para que este

    sonho se concretizasse e sempre estiveram ao meu lado, mesmo estando a quilmetros de

    distncia. Vocs so a minha vida!

    Aos meus irmos, Kelliane, Polliane e Odilon, que mesmo longe, sempre

    estiveram presentes. Obrigada pelo amor, carinho, apoio e momentos de descontrao.

    Ao meu sobrinho, Eric, por deixar os meus dias mais alegres.

    A Quel, pelas oraes e carinho.

    Aos colegas do Laboratrio de Gentica e Genmica de Plantas, Clistiane,

    Milena, Camila, Isabela, Stela, pelo aprendizado e agradvel convivncia durante este

    perodo, em especial a Ivone pela ajuda primordial na reta final durante as anlises.

    Aos amigos que me acompanharam durante a estadia em Goinia, em especial

    Clistiane, Milena, Lnio e Victor. Obrigada pelas farras, pela diverso e compreenso nos

    momentos difceis.

  • 6

    Aos amigos de Palmas, em especial Pedro, Nico e Marcelo, que nunca me

    deixaram desistir, me incentivando e dando foras para chegar ao fim desta etapa.

    Enfim, a Deus, que tornou tudo isso possvel.

    Meu sincero reconhecimento.

  • SUMRIO

    LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 8 LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 9 RESUMO ...........................................................................................................10 ABSTRACT ....................................................................................................................... 11

    1 INTRODUO ................................................................................................... 12 2 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................... 14 2.1 A CULTURA DA CANA-DE-ACAR ............................................................. 14 2.1.1 Importncia econmica ....................................................................................... 14 2.1.2 Origem, domesticao e citogentica ................................................................. 15

    2.2 MELHORAMENTO GENTICO DA CANA-DE-ACAR ............................. 16 2.2.1 Breve histrico ..................................................................................................... 16

    2.2.2 Melhoramento convencional da cana-de-acar .............................................. 18

    2.2.3 Seleo assistida por marcadores moleculares ................................................. 22 2.2.4 Seleo genmica ampla ..................................................................................... 23 3 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................... 25 3.1 MATERIAL VEGETAL E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .................... 25

    3.2 AVALIAO FENOTPICA ............................................................................... 25 3.3 AVALIAO GENOTPICA .............................................................................. 27

    3.3.1 Extrao de DNA ................................................................................................. 27 3.3.2 Genotipagem ........................................................................................................ 28 3.4 SELEO GENMICA AMPLA ........................................................................ 29

    4 RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................ 32 4.1 AVALIAO FENOTPICA ............................................................................... 32

    4.2 SELEO GENMICA AMPLA ........................................................................ 34 5 CONCLUSES ................................................................................................... 38

    6 REFERNCIAS .................................................................................................. 39

  • LISTA DE FIGURAS

    Figura 1. rea de origem de S. spontaneum, S. sinense e S. Barberi e S. robustum. As

    setas indicam a disperso de S. officinarum pela migrao humana (Aitken &

    Mcneil, 2010). ..................................................................................................... 15

    Figura 2. Etapas de seleo no programa de melhoramento gentico da cana-de-acar

    conduzido pela Ridesa (Rede Interuniversitria para o Desenvolvimento do

    Setor Sucroenergtico). ....................................................................................... 21

    Figura 3. Esquema de aplicao da seleo genmica ampla em um programa de

    melhoramento gentico (Resende Jnior, 2010). ................................................ 24

    Figura 4. Avaliao fenotpica das caractersicas (A) PESO, (B) NCOLM, (C) DIAM,

    (D) COMP, (E) NENT e (F) BRIX. .................................................................... 26

    Figura 5. Resumo do primeiro passo da PCR utilizando o mtodo RAPiD-Seq. A reao

    realizada utilizando primers iniciadores que amplificam o loco desejado do

    genoma. O primer contm a sequncia requerida para o sequenciamento, um

    cdigo que identificar os indivduos que esto sendo genotipados, uma

    sequncia degenerada que d estabilidade ao primer na reao e sequncia

    especfica que confere especificidade da reao ................................................. 28

    Figura 6. Resumo do Segundo passo do mtodo RAPiD-Seq. O produto da primeira PCR

    para as amostras 48-96 combinado para uma nica reao de PCR

    multiplex. Essa PCR curta incorpora nos fragmentos a estrutura final para o

    sequenciamento. .................................................................................................. 29

    Figura 7. Grficos de disperso (triangular inferior), histogramas (diagonal) e estimativas

    do coeficiente de correlao (triangular superior) entre as diversas variveis

    avaliadas no presente estudo. .............................................................................. 33

    Figura 8. Comparao da acurcia seletiva entre o modelo cheio e os dois mtodos de

    validao cruzada, Tem-fold e LOO, para as seis caractersticas estudadas. ..... 35

    Figura 9. Grficos de disperso dos valores genticos preditos via RR-BLUP e os valores

    de eBLUPs observados para os seis caracteres avaliados. .................................. 37

  • 9

    LISTA DE TABELAS

    Tabela 1. Estatsticas descritivas das variveis analisadas no experimento de avaliao

    fenotpica .......................................................................................................... 32

    Tabela 2. Estimativas obtidas para os parmetros genticos das variveis quantitativas

    avaliadas ........................................................................................................... 34

    Tabela 3. Herdabilidade, capacidade preditiva e acurcias da seleo genmica ampla

    via RR-BLUP para graus Brix, comprimento e dimetro do colmo, nmero

    de colmos por parcela, nmero de entrens e peso da parcela ......................... 36

  • 10

    RESUMO

    FUSCALDI, J. L. Desenvolvimento de um modelo de seleo genmica ampla para

    cana-de-acar anlise em um ambiente. 2014. 43 f. Dissertao (Mestrado em

    Gentica e Melhoramento de Plantas: Gentica e Genmica de Plantas) Escola de

    Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Gois, Goinia, 2014.1

    Um programa de melhoramento gentico da cana-de-acar leva em torno de

    12 a 15 anos para disponibilizar no mercado gentipos elites previamente testados. Com o

    propsito de acelerar esse processo, mtodos mais eficientes de seleo vm sendo

    propostos como forma de obter uma seleo mais rpida e objetiva de caractersticas

    relacionadas com a produo. Neste contexto, a seleo genmica ampla (GWS) foi

    proposta objetivando aumentar a eficincia no melhoramento gentico, fazendo uso direto

    das informaes de DNA na seleo, de forma a permitir alta eficincia seletiva, grande

    rapidez na obteno de ganhos genticos com a seleo e baixo custo, em comparao

    tradicional seleo baseada em dados fenotpicos. Diante do exposto, o objetivo deste

    trabalho foi avaliar uma plataforma de genotipagem de alto desempenho para cana-de-

    acar e calibrar um modelo de seleo genmica ampla com base na anlise de dados de

    genotipagem de alto desempenho e anlise de dados fenotpicos em um nico ambiente.

    Para isto, foi utilizada uma populao constituda por 91 gentipos derivados da

    autofecundao do gentipo-elite RB97327, e outra constituda por 81 gentipos oriundos

    do cruzamento RB97327 x RB72454. O experimento foi conduzido no campo

    experimental da Usina Centrolcool, localizada no municpio de Inhumas-GO (1620'50"S,

    4929'2"W), entre novembro de 2010 a julho de 2012, com rea total de 978,75 m2. O

    delineamento utilizado foi o de blocos aumentados. Os colmos foram colhidos ao final do

    ciclo. A partir do material coletado, foram feitas as seguintes avaliaes: peso total da

    parcela em kg (PESO), nmero de colmos por parcela (NCOLM), dimetro mdio do

    colmo em mm (DIAM), comprimento do colmo em m (COMP), nmero de entrens

    (NENT) e brix em Brix (BRIX). Os dados obtidos foram submetidos a anlises

    estatsticas para obteno das estimativas dos parmetros genticos. O DNA genmico foi

    isolado, utilizando o protocolo descrito por Aljanabi et al. (1999), com adaptaes para

    microtubos de 1,5mL. No total realizou-se a extrao de DNA de 179 plntulas mais os

    genitores envolvidos no estudo. A genotipagem foi realizada atravs da tcnica RAPiD-

    Seq e foram utilizados 153.831 locos SNPs para BRIX e 153.829 para os demais

    caracteres. A predio dos valores genticos genmicos foi obtida via RR-BLUP/GWS. A

    acurcia foi calculada atravs da correlao entre os valores genticos observados e

    preditos via Ten-fold e Leave-one-Out Cross-Validation. As acurcias mximas obtidas

    foram de 0,96 para dimetro de colmo e 0,86 para graus Brix e comprimento de colmo. Os

    valores genticos genmicos preditos na populao de validao cruzada aproximam-se

    bem dos valores fenotpicos observados, exceto para nmero de entrens, que apresentou

    baixa acurcia seletiva. Os resultados deste estudo mostra grande oportunidade para o uso

    deste mtodo de seleo na cultura da cana-de-acar, permitindo estimativas acuradas de

    parmetros genticos e a predio de valores genticos genmicos para plantas jovens

    ainda no fenotipadas. Com isso, o uso deste mtodo pode reduzir significativamente a

    durao dos ciclos de seleo e, consequentemente, otimizar a alocao de recursos e a

    sustentabilidade do melhoramento.

    Palavras-chave: Melhoramento gentico, Seleo genmica ampla, Cana-de-acar.

    1 Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho. EA-UFG.

  • ABSTRACT

    FUSCALDI, J. L. Development of a model genome wide selection (GWS) cane sugar -

    an environmental analysis. 2014. 43 f. Dissertation (Master in Genetics and Plant

    Breeding: Genetics and Plant Genomics) Escola de Agronomia e Engenharia de

    Alimentos, Universidade Federal de Gois, Goinia, 2014.1

    A sugar cane breeding program takes about 12 to 15 years to deliver into the market elite

    genotypes previously tested. With the goal of speeding up this process, more efficient

    selection methods have been suggested, as a way of obtain a more objective selection of

    characteristics related with yield. IN this context, the genome wide selection (GWS) was

    proposed, aiming the increase of efficiency in plant breeding, making a direct use of DNA

    information in the selection, allowing a high efficiency and low cost process. The goal of

    this project is to evaluate a genotyping platform of high performance for sugar cane and to

    calibrate a genome wide selection model based on high performance data analysis of

    genotyping and phenotypic data analysis in a single environment. A population composed

    of 91 genotypes derived from the self-pollination of the elite genotype RB97327, and

    another composed by 81 genotypes as a result of the cross of RB97327 x RB72454. The

    experiment was conducted at the experimental field of Centrolcool Plant, located in

    Inhumas-GO (1620'50"S, 4929'2"W), from November 2010 to July 2012, with a total

    area of 978.75 m2. The experimental design used was augmented blocks. Stalks were

    harvested at the end of the cycle. From each sample of the harvested material, the

    following evaluations were performed: Total weight, in Kilograms (PESO), number of

    stalks (NCOLM), average diameter of stalks, in millimetres (DIAM), stalk length, in

    meters (COMP), internode number (NENT), and brix, in Brix (BRIX). Data was

    submitted to statistical analysis and used to obtain the genetic parameters estimates.

    Genomic DNA was isolated through the protocol described by Aljanabi et al. (1999),

    adapted to1.5 mL micro tubes. DNA was extracted from 179 seedlings and its parents.

    Genotyping was done through the RAPiD-Seq technique and the use of 153 831 SNPs loci

    for BRIX and 153,829 for other characters. The prediction of the genomic genetic values

    was obtained through RR-BLUP/GWS. The accuracy was calculated through the

    correlation between the observed genetic values and the ones predicted Ten-fold and

    Leave-one-Out Cross-Validation. The maximum accuracy obtained was of 0.95 for stalk

    diameter and of 0.85 for stalk length. The genomic genetic values predicted in the

    population of cross validation are close to the observed phenotypic values, except for

    internode numbers, that presented low selective accuracy. The results of this study show

    great opportunity to use this selection method in sugar cane, allowing accurate estimates of

    genetic parameters and the prediction of genomic genetic values for young plants not yet

    phenotyped. Therefore, the use of this method can significantly reduce the selection cycle

    length, and consequently, optimize the resource allocation and the breeding sustainability.

    Key words: Plant breeding, Genome-wide selection, Sugarcane.

    1 Adviser: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho. EA-UFG.

  • 1 INTRODUO

    O melhoramento gentico vem, h vrios anos, proporcionando grande avano

    no setor agrcola do Brasil e do mundo, atuando na melhoria de vrias caractersticas de

    interesse na agricultura e pecuria, e, com isso, apresentando grandes retornos sociais e

    econmicos para os clientes dos segmentos pblico e privado. Com maior conhecimento

    da natureza e da informao gentica, mtodos mais eficientes de seleo vm sendo

    propostos como forma de obter uma seleo mais rpida e objetiva de caractersticas

    relacionadas com a produo, visando proporcionar o desenvolvimento de materiais

    superiores.

    Uma primeira proposio realizada para aumentar a eficincia desse

    procedimento, baseada em dados fenotpicos, foi descrita por Lande & Thompson (1990).

    Nesta foram identificados marcadores genticos com potencial de aplicao na localizao

    de regies genmicas que controlam caractersticas de interesse (QTL) (Resende Jnior,

    2010). A incorporao de informao desses marcadores na seleo de gentipos

    superiores denominada Seleo Assistida por Marcadores Moleculares (SAM), a qual

    utiliza simultaneamente informaes genotpicas e caractersticas fenotpicas para a

    seleo de indivduos com maior valor gentico. Essa tcnica requer o estabelecimento

    (anlise de ligao) de associaes marcadores-QTLs para cada famlia em avaliao; para

    ser til, precisa explicar grande parte da variao gentica de uma caracterstica

    quantitativa, que governada por muitos locos de pequenos efeitos, e; s apresenta

    superioridade considervel em relao seleo baseada em dados fenotpicos, quando o

    tamanho de famlia avaliado e genotipado muito grande (da ordem de 500 ou mais). No

    entanto, apesar de ter sido um grande avano para o melhoramento gentico, a

    implementao da MAS tem sido limitada e os ganhos em eficincia muito reduzidos

    (Resende et al., 2008). Essas limitaes motivaram pesquisadores a buscarem alternativas

    mais eficientes, de menor custo e maior ganho por unidade de tempo para auxiliar a

    seleo.

    Visando a tais objetivos, Meuwissen et al. (2001) propuseram um novo mtodo

    de seleo. Esse mtodo foi denominado Seleo Genmica Ampla (Genome Wide

  • 13

    Selection GWS). Consiste na predio (sem o uso de testes de significncia para

    selecionar marcadores) dos valores genticos dos indivduos com base na anlise de grande

    nmero de marcadores genticos dispersos em todo o genoma do organismo, de forma a

    capturar os efeitos de todos os locos, pequenos e grandes, e explicar grande parte da

    variao gentica do carter quantitativo (modificado Fritsche Neto, 2011). Atravs desta

    tcnica possvel predizer valores genotpicos, maximizando o ganho gentico e

    acelerando, portanto, o melhoramento gentico.

    Essa nova abordagem para a seleo de gentipos j vem sendo utilizada em

    programas de melhoramento animal (Goddard & Hayes, 2007; Legarra & Misztal, 2008;

    Rocha, 2011) e vegetal (Crossa et al. 2010; Crossa et al., 2011; Denis and Bouvet, 2013;

    Fritsche Neto, 2011; Grattapaglia et al. 2011; Guo et al. 2012; Heslot et al. 2012; Lorenz et

    al. 2011; Lorenzana and Bernardo 2009; Resende et al. 2012a; Resende et al. 2012b;

    Resende Jnior, 2010; Rutkoski et al. 2012; Zhong et al. 2009), com resultados otimistas.

    No melhoramento de animais domsticos a seleo genmica tem sido considerada uma

    revoluo, e seus conceitos tm sido facilmente aplicados ao melhoramento de plantas

    (Grattplagia et al., 2011).

    Na cultura da cana-de-acar, apesar dos programas de melhoramento gentico

    serem antigos, ainda no existe exemplos na literatura de seleo baseada neste mtodo

    para a cultura. Porm, com o desenvolvimento e baixo custo dos marcadores tipo SNP

    (single nucleotide polymorphism), a GWS tem se apresentado como uma estratgia atrativa

    e promissora ao melhoramento gentico da cana-de-acar. Esse mtodo permite avaliao

    de maior nmero de clones e, com isso, explorao de maior variabilidade gerada. A

    predio e seleo podero ser realizadas em fases muito juvenis, acelerando, assim, o

    processo de melhoramento e permitindo o desenvolvimento e lanamento de variedades

    em perodos de tempo mais curtos, contribuindo fortemente para a expanso e crescimento

    do setor sucroalcooleiro do pas.

    Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos avaliar uma

    plataforma de genotipagem de alto desempenho para cana-de-acar e calibrar um modelo

    de seleo genmica ampla com base na anlise de dados de genotipagem de alto

    desempenho e anlise de dados fenotpicos em um nico ambiente.

  • 14

    2 REVISO BIBLIOGRFICA

    2.1 A CULTURA DA CANA-DE-ACAR

    2.1.1 Importncia econmica

    A cana-de-acar (Saccharum spp.) ocupa lugar de destaque na agricultura

    estando entre as espcies vegetais mais cultivadas no mundo, alcanando mais de oitenta

    pases (Teixeira, 2006). cultivada no Brasil desde 1532, trazida por Martim Afonso, o

    primeiro colonizador portugus, com o propsito de implantar engenhos de acar

    (BNDES & CGCE, 2008). Portanto, a cultura sempre teve papel importante na economia

    brasileira, desde o perodo dos engenhos coloniais.

    Atualmente, a cultura da cana-de-acar alcana quase todos os estados

    brasileiros e ocupa cerca de 9% da superfcie agrcola do pas, sendo o terceiro cultivo

    mais importante em superfcie ocupada, depois da soja e do milho. A regio produtora de

    maior destaque a Centro-Sul, com mais de 85% da produo, com destaque para o estado

    de So Paulo, maior produtor nacional (BNDES & CGCE, 2008).

    Da safra de 1990/1991 at a safra de 2011/2012, a produo brasileira de cana-

    de-acar avanou de 222,4 para 588,4 milhes de toneladas (Unica, 2013). Isso significa

    grande crescimento e expanso do setor, proveniente da modernizao do agronegcio

    brasileiro, tornando-o cada vez mais competitivo. De acordo com o MAPA (2013), o pas

    responsvel por mais da metade do acar comercializado no mundo e deve alcanar taxa

    mdia de aumento da produo de 3,25% at 2018/19, atingindo um volume previsto para

    exportao, em 2019, de 32,6 milhes de toneladas. Alm disso, o etanol produzido no

    Brasil a partir da cana-de-acar tambm conta com projees positivas para os prximos

    anos, devido principalmente ao crescimento do consumo interno, alimentado em quase

    totalidade pelo aumento da compra de veculos tipo flex e a diminuio das vendas de

    carros monocombustveis desde 2003.

    O Brasil o maior produtor e exportador mundial de cana-de-acar (Mapa,

    2013), o que coloca o pas na liderana mundial em tecnologia de produo de etanol e

  • 15

    acar a partir da cana. Alm da importncia para a produo de acar e lcool, a cana-

    de-acar matria-prima para diversos outros produtos, como bebidas e doces, e os seus

    subprodutos e resduos so utilizados para cogerao de energia eltrica, fabricao de

    rao animal e fertilizantes para lavouras, sendo, portanto, inteiramente aproveitada.

    2.1.2 Origem, domesticao e citogentica

    Alguns autores acreditam que a cana-de-acar teve origem nas regies de

    Assam e Bengala, na ndia. Outros creditam sua procedncia a Nova Guin e as Ilhas do

    Arquiplago da Polinsia. Embora existam divergncias quanto ao centro de origem exato

    da cana-de-acar, acredita-se que ela seja originria do sudeste da sia (Figura 1). H

    relatos de que a domesticao dessa planta ocorreu em seu centro de origem cerca de 8.000

    a. C.

    Figura 1. rea de origem de S. spontaneum, S. sinense e S. Barberi e S. robustum. As setas indicam a

    disperso de S. officinarum pela migrao humana (Aitken & Mcneil, 2010).

    A cana-de-acar uma planta algama, pertencente famlia Poaceae, tribo

    Andropogoneae e ao gnero Saccharum, o qual abrange vrias espcies, dentre elas S.

    officinarum (2n=80), S. spontaneum (2n = 40-128), S. robustum (2n = 60-205), S. sinense

    (2n = 111-120), S. barberi (2n = 81-124) e S. edule (2n = 60-80) (Figueiredo, 2008). Essas

    seis espcies pertencem ao Complexo Saccharum, que compreende cruzamentos entre as

    espcies do gnero Saccharum.

    Acredita-se que S. sinense e S. barberi so duas espcies derivadas a partir de

    hibridaes naturais entre S. officinarum e S. spontaneum (DHont et. al, 1996). Dados

    moleculares mostram que as populaes de S. robustum so geneticamente mais prximas

  • 16

    de S. spontaneum, admitindo-se a evoluo desta a partir daquela. Apesar da baixa

    disponibilidade de dados moleculares para rastrear a origem de S. edule, aqueles existentes

    suportam a hiptese de que a espcie corresponde a uma srie de clones mutantes que

    foram identificadas em populaes de S. robustum (DHont et al., 2008).

    As variedades modernas so, em sua maioria, hbrido derivado de um processo

    denominado nobilizao. Esse processo, descrito por Bremer (1961), consistiu na

    hibridao entre S. officinarum e a espcie selvagem S. spontaneum, seguido de

    retrocruzamento com S. officinarum, para recuperar a maioria dos genes favorveis para

    elevados teores de sacarose do parental recorrente. Esses cruzamentos foram bem

    sucedidos e contriburam para introgresso de genes de resistncia a doenas, vigor e

    capacidade de adaptao, e o processo levou a genomas interespecficos, cuja

    complexidade provavelmente excede a de qualquer outra cultura importante poliploide

    (DHont, 2005). Isto torna o genoma da cana-de-acar um dos mais difceis de ser

    estudado.

    Anlises citogenticas de diversas variedades de cana-de-acar revelam que o

    genoma das cultivares modernas constitudo por cerca de 100 a 130 cromossomos, com a

    contribuio de S. officinarum variando de 70-80% e de S. spontaneum variando de 10-

    20%. O restante proveniente de rearranjos cromossmicos entre as duas espcies

    (DHont, 2005).

    2.2 MELHORAMENTO GENTICO DA CANA-DE-ACAR

    2.2.1 Breve histrico

    De acordo com Matsuoka (1996), em meados do sculo XIX os canaviais do

    mundo todo passaram a apresentar graves problemas fitossanitrios, com elevadas perdas

    de produo e, com isso, muitas indstrias foram falncia. Em virtude disso e do

    conhecimento das leis da gentica, aliada descoberta de que a cana-de-acar produzia

    sementes, comearam os esforos para o seu melhoramento gentico.

    O primeiro cruzamento em cana-de-acar do mundo foi realizado em Java, em

    1887, por Soltweld. Ele cruzou a cultivar Glagah com a Loethers e seu recproco, obtendo

    sementes frteis somente da Glagah. Era demonstrada a viabilidade do melhoramento

    gentico da cana-de-acar, por intermdio de cruzamentos controlados. Dois anos mais

  • 17

    tarde, em Barbados, tambm Harrison & Bowell obtiveram seedlings de sementes

    originrias de cruzamentos. Criavam-se, assim, os primeiros programas de melhoramento

    gentico (Cesnik, 2004).

    O Brasil importou, por muito tempo, variedades de cana-de-acar de outros

    pases. Porm, como no havia quarentenrio e nem controle fitossanitrio dessas

    importaes, com o passar dos anos foram identificadas vrias doenas, como o mosaico e

    o carvo, o que afetou drasticamente a produo. O pas, ento, precisava contornar esses

    problemas e voltar misso de manter seus canaviais em padres elevados de

    produtividade, em toneladas de cana-de-acar por hectare, e nas melhores porcentagens

    de sacarose, com ndices razoveis de resistncias a pragas e doenas. Com isso, no incio

    do sculo XX, surgiu a grande necessidade de criar uma experimentao canavieira no

    Brasil.

    Ao longo dos anos foram criadas vrias instituies de pesquisas espalhadas

    pelo pas, e estas obtiveram grande sucesso na obteno e desenvolvimento de gentipos

    superiores. Inicialmente, objetivou-se a resistncia s principais doenas conhecidas,

    utilizando-se como ferramenta o cruzamento interespecfico, envolvendo Saccharum

    officinarum, S. spontaneum, S. barberi e S. sinense. Isto proporcionou significativa

    alterao no idetipo varietal.

    Em 1970 foi criado o Programa Nacional de Melhoramento da Cana-de-acar

    (Planalsucar), vinculado ao Instituto do Acar e do lcool (IAA), com a finalidade de

    desenvolver e transmitir resultados de pesquisas com melhoramento da cana-de-acar,

    para o campo e para a indstria. A ideia principal foi dar apoio s regies com potencial de

    desenvolvimento do Programa Nacional do lcool, que buscava respostas rpidas em

    termo de produo de lcool, levando em conta as caractersticas regionais.

    Com a extino do Planalsucar, em 1990, houve momentos de grande incerteza

    sobre os destinos do seu patrimnio. Porm, um ano depois, grande parte desse patrimnio

    foi absorvida por sete universidades federais: Universidade Federal de Alagoas (UFAL),

    Universidade Federal de Sergipe (UFS), Universidade Federal Rural de Pernambuco

    (UFRPE), Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Universidade Federal

    de Viosa (UFV), Universidade Federal de So Carlos (UFSCar) e Universidade Federal

    do Paran (UFPr) (Matsuoka et al., 1999). Estas universidades assumiram os trabalhos

    daquele rgo, instituindo a Rede Interuniversitria para Desenvolvimento do Setor

    Sucroenergtico RIDESA. Em 2004, a Universidade Federal de Gois (UFG) foi

  • 18

    agregada Rede. Em 2008, as Universidades Federais de Mato Grosso (UFMT) e Piau

    (UFPI) tambm foram includas (Barbosa & Silveira, 2011).

    Outro programa de melhoramento que tem tido significativa contribuio ao

    setor o do Instituto Agronmico de Campinas (IAC). Este programa tem a finalidade de

    estabelecer pesquisa e desenvolvimento agrcola, passada por crises e reformas e mantida

    at hoje com objetivo de gerar inovaes significativas para a rea agrcola, desde o

    melhoramento gentico, sistema de produo, colheita, transporte, rea industrial e

    comercializao (Figueiredo, 2008). O programa de melhoramento gentico do IAC o

    mais antigo em atividade no Brasil.

    Tambm em So Paulo, a Cooperativa dos Usineiros do Oeste do Estado de

    So Paulo (Copereste) criou, em 1953, no municpio de Dumont, regio de Ribeiro Preto,

    uma estao experimental importante quela regio do Estado. Em 1968, a Cooperativa

    Central dos Produtores de Acar e lcool do Estado de So Paulo (Copersucar) deu incio

    a outro importante programa de melhoramento gentico, incorporando a Copereste e sua

    estao experimental. Esse programa foi substitudo pelo Centro de Tecnologia Canavieira

    (CTC), cujas pesquisas esto nas mesmas instalaes que eram ocupadas pela Copersucar.

    Atualmente existem no Brasil quatro programas de melhoramento que possuem

    variedades comerciais lanadas aos produtores, o programa da Ridesa, do CTC, do IAC e

    da Monsanto. Graas ao alto potencial produtivo desses programas, o grande nmero de

    variedades de cana-de-acar permite a disponibilidade de materiais adaptados s

    condies especficas de solo, clima, poca de colheita e manejo agronmico (Landell &

    Bressiani, 2008).

    2.2.2 Melhoramento convencional da cana-de-acar

    O sucesso de um programa de melhoramento gentico est condicionado

    utilizao e ao manejo corretos dos recursos genticos ao longo dos ciclos seletivos

    (Resende, 2002). Segundo Landell et al. (2005), o progresso gentico eficaz decorre da

    habilidade do melhorista em conduzir eficientemente todas as etapas desse longo processo,

    desde o planejamento da hibridao at os ensaios de competio em diferentes locais e

    pocas de colheita, passando por etapas de seleo em que o componente ttico bastante

    exercitado.

  • 19

    O planejamento dos cruzamentos realizado adotando-se como critrios

    principais: grau de endogamia entre genitores, teor de acar, produtividade agrcola,

    resistncia s principais doenas (carvo, mosaico, ferrugem, amarelinho e escaldadura),

    capacidade de brotao em soqueira e hbito ereto de crescimento da touceira nos

    genitores (Landell et al., 2005).

    O tamanho efetivo populacional , tambm, um parmetro muito importante a

    ser considerado nos programas de melhoramento gentico. Porm, o que se observa um

    elevado estreitamento gentico em busca de gentipos cada vez mais produtivos,

    proveniente de pequeno tamanho efetivo populacional e, consequentemente, da

    variabilidade gentica disponvel para ciclos posteriores de melhoramento. importante

    salientar que quanto maior a variabilidade gentica, maior a possibilidade de ganho de

    seleo para o carter desejado.

    2.2.2.1 Hibridao e produo de seedlings

    Os cruzamentos em cana-de-acar so realizados a partir do planejamento

    prvio estabelecido por meio de mtodos especficos. Os melhoristas buscam materiais

    elite com ampla variabilidade gentica para gerao de populaes segregantes. Porm,

    esses materiais devem ser escolhidos com cautela, de modo a no ocorrer cruzamento entre

    indivduos aparentados, a fim de evitar os efeitos da endogamia, visto que a cana-de-acar

    uma espcie algama.

    Atravs da seleo de parentais, buscam-se prognies mais resistentes a pragas

    e doenas, e adaptadas ao ambiente local, gerando ganhos de produtividade. Isso pode ser

    obtido, convencionalmente, pelos seguintes tipos de hibridao:

    a) Cruzamentos bi-parentais: cruzamento simples que so utilizados apenas dois

    genitores conhecidos;

    b) Policruzamentos: cruzamento no qual intercruzado um grupo de genitores

    selecionados. Este tipo de cruzamento impede a identificao da fonte de plen,

    sendo conhecido apenas o genitor feminino, de onde sero coletadas as panculas

    fecundadas.

    Para o xito nos cruzamentos, so necessrias condies climticas favorveis

    ao florescimento e viabilidade dos gros de plen. No Brasil, a hibridao feita em

    regies litorneas do Nordeste, onde o fotoperodo e temperatura so adequados para tal

  • 20

    atividade. Muitos programas de melhoramento de cana-de-acar no mundo utilizam-se de

    Casa de Fotoperodo, ou seja, aplicam condies artificiais para induzir o florescimento

    da cana (Landell et al., 2005).

    Obtidas as sementes, estas so submetidas a condies adequadas para

    germinao. Aps a germinao e crescimento parcial, os seedlings so individualizados

    para o enraizamento total, mantendo, durante este tempo, podas frequentes para evitar o

    estiolamento, at serem levadas para ensaios em campo.

    2.2.2.2 Seleo, obteno e avaliao de clones

    A primeira fase de seleo em prognies de melhoramento de cana-de-acar

    denominada T1. O transplantio pode ser feito agrupado ou individual. A cana-planta

    normalmente cortada, sem seleo, um ano aps o transplantio, e a seleo feita em

    soca aos doze meses de idade. Opta-se pela seleo da soca porque, segundo Matsuoka et

    al. (1999), em cana-planta no se permite avaliao segura da capacidade de brotao,

    aspecto crucial em climas subtropicais e temperados, com frio e seca.

    Na seleo de T1 em geral avaliado, alm da brotao da soca, apenas o vigor

    da planta, pois o elevado nmero de plantas, na casa de 1,5 milhes, inviabiliza outros

    tipos de avaliao. A seleo nesta etapa inicial a que apresenta a menor eficincia,

    quando comparada as demais.

    A prxima fase denominada T2. Nesta fase, feita a avaliao tanto em cana-

    planta quanto em cana-soca. So feitas as seguintes avaliaes: teor de slidos solveis,

    teor de sacarose, altura da planta, dimetro do colmo, nmero de colmos, peso mdio de

    colmos, produo estimada de colmos, tonelada de colmos por hectare, tonelada de slidos

    solveis por hectare, teores de fibra.

    Na terceira fase, denominada T3, o nmero de gentipos sob avaliao menor

    e permite que sejam realizados experimentos em mais de um local. Assim busca-se

    minimizar o efeito do ambiente na seleo. So feitas as mesmas avaliaes descritas em

    T2.

    Por fim, a ltima etapa consiste na fase experimental (FE). Nesta etapa o

    nmero de gentipos diminui de modo a possibilitar, ao longo das fases de seleo,

    aumento nos locais de avaliao, no nmero de repeties por experimento e no tamanho

    das parcelas. Assim, possvel obter elevada preciso experimental.

  • 21

    Os experimentos so conduzidos por vrios ciclos, colhendo-se, pelo menos,

    trs safras, e procedendo-se as avaliaes em trs pocas diferentes de corte com objetivo

    de prever qual a poca adequada para o cultivo da nova variedade. Alm das avaliaes

    descritas anteriormente, feita a curva de maturao separadamente para cada nova

    variedade possvel.

    As etapas de seleo dos diversos programas de melhoramentos de cana-de-

    acar diferem de uma instituio para outra. Na Figura 2 apresentado o cronograma das

    fases de seleo no programa de melhoramento de cana-de-acar da Ridesa.

    Figura 2. Etapas de seleo no programa de melhoramento gentico da cana-de-acar conduzido pela

    Ridesa (Rede Interuniversitria para o Desenvolvimento do Setor Sucroenergtico).

    2.2.2.3 Liberao de cultivares

    Aps doze a quinze anos de pesquisas e avaliaes, os melhores gentipos so

    selecionados e, ento, liberados para comercializao como nova variedade. Logo, o tempo

    gasto e, consequentemente os custos, para o desenvolvimento de uma nova variedade de

    cana-de-acar so elevados.

    Assim, as ferramentas moleculares constituem-se em tcnicas valiosas para

    esses programas de melhoramento, principalmente por oferecerem a possibilidade de

    reduzir o tempo e os custos gastos na obteno de novas variedades com caractersticas

    agronmicas desejveis. Segundo Heerdt (2008), o sequenciamento do genoma da cana-de-

    acar tem facilitado e acelerado a identificao de genes responsveis por caracteres

  • 22

    desejveis, possibilitando a manipulao subsequente de genes de interesse atravs de

    tcnicas de gentica molecular. Com as tecnologias de nova gerao de sequenciamento,

    espera-se melhorar os estudos sobre a estrutura deste genoma, a genmica comparativa e a

    identificao de marcadores associados a caractersticas agronmicas de interesse.

    2.2.3 Seleo assistida por marcadores moleculares

    O desenvolvimento de marcadores moleculares para aplicaes no

    melhoramento de plantas foi popularizado no incio dos anos 1980, quando os marcadores

    isoenzimticos foram usados para acelerar a introgresso de caractersticas monognicas de

    germoplasma extico em um cultivar (Xu & Crouch, 2008). Os marcadores moleculares

    vieram como ferramenta para auxiliar os melhoristas na seleo de gentipos superiores,

    tornando o processo de seleo mais rpido, podendo, de forma mais eficaz, identificar,

    quantificar e caracterizar a variao gentica dentro de uma populao segregante.

    Com o desenvolvimento dos marcadores moleculares e o avano em tcnicas

    de biologia molecular, criou-se a expectativa de que as informaes genotpicas dos

    marcadores moleculares, uma vez correlacionadas com caractersticas fenotpicas de

    interesse, pudessem ser amplamente utilizadas na obteno e seleo de indivduos com

    maior valor gentico. Esta tcnica ficou conhecida como seleo assistida por marcadores

    moleculares (MAS - Marker Assisted Selection).

    A seleo baseada em MAS apresenta as seguintes caractersticas: (i) requer o

    estabelecimento de associaes marcadores-QTLs, via anlise de ligao, para cada famlia

    em avaliao; (ii) para ser til, precisa explicar grande parte da variao gentica de uma

    caracter quantitativo, que seja governado por muitos locos de pequenos efeito; e (iii) s

    apresenta superioridade considervel em relao seleo baseada em dados fenotpicos,

    quando o tamanho da famlia avaliada e genotipada muito grande. E, em funo desses

    aspectos, a implementao da MAS tem sido limitada e os ganhos em eficincia muito

    reduzidos (Resende et al., 2008). Em razo disso, o uso desta estratgia tem se justificado,

    principalmente, em retrocruzamentos, visando a obteno de maior eficincia na

    transferncia de fatores genticos, e em seleo recorrente, para melhoramento de

    populaes envolvendo cruzamento de indivduos com combinao allica favorvel.

  • 23

    2.2.4 Seleo genmica ampla

    O grande atrativo da gentica molecular, em benefcio do melhoramento

    gentico aplicado, a utilizao direta das informaes de DNA na seleo, de forma a

    permitir alta eficincia seletiva, grande rapidez na obteno de ganhos genticos com a

    seleo e baixo custo, em comparao tradicional seleo baseada em dados fenotpicos

    (Resende et al., 2008). Baseado nestas premissas, Meuwissen et al. (2001) propuseram um

    novo mtodo de seleo como forma de predizer o fentipo futuro de uma populao,

    baseado em informaes de marcadores moleculares. Este mtodo envolve a utilizao de

    mtodos estatsticos de estimao/predio dos valores genotpicos (Resende, 2007;

    Resende et al., 2008), baseado na genotipagem em larga escala utilizando marcadores

    moleculares, sendo denominada seleo genmica ampla (GWS Genome Wide

    Selection).

    Essa tcnica permite a seleo precoce de indivduos, gerando rapidez ao

    processo e aumentando a sua eficincia, objetivando maximizar a acurcia e,

    consequentemente, o ganho de seleo. De acordo com Resende et al. (2008), a tcnica

    pode ser aplicada em todas as famlias sob avaliao nos programas de melhoramento de

    espcies algamas; apresenta alta acurcia para seleo baseada exclusivamente em

    marcadores; e no exige prvio conhecimento das posies dos QTL, caracterstica

    necessria ao seu uso em seleo assistida por marcadores (MAS).

    A GWS consiste na predio simultnea dos efeitos genticos de grande

    nmero de marcadores de DNA dispersos em todo o genoma do organismo. Essa predio

    realizada de forma a capturar os pequenos e grandes efeitos de todos os locos e explicar

    grande parte da variao gentica do carter quantitativo (Fristsche Neto, 2011).

    Atravs de dados fenotpicos da populao de estimao, equaes de predio

    de valores genticos genmicos so obtidas para cada carter de interesse. Nessa

    populao so descobertos, via marcadores, os marcadores que explicam os locos que

    controlam os caracteres, bem como so estimados os seus efeitos (Resende et al., 2010).

    De posse do modelo obtido na populao de estimao, uma populao de validao

    utilizada para avaliar suas acurcias. Com base nestas acurcias, os modelos so ento

    escolhidos e incorporados seleo nos programas de melhoramento, sendo usados na

    predio dos valores genotpicos dos indivduos candidatos seleo (Figura 3).

  • 24

    Figura 3. Esquema de aplicao da seleo genmica ampla em um programa de melhoramento gentico

    (Resende Jnior, 2010).

    A obteno de valores genmicos pode ser efetuada com uso de estimadores de

    quadrados mnimos (LS), por preditores BLUP/GWS (Best Linear Unbiased Prediction),

    utilizando uma abordagem Bayesiana BayesA e BayesB (Meuwinsen et al., 2001;

    Bernardo & Yu, 2007; Lorenzana & Bernardo, 2009), ou por aprendizado de mquina

    (Long et al., 2007). Essas abordagens diferem na suposio sobre o modelo gentico

    associado ao carter quantitativo (Resende et al., 2008).

    A abordagem da predio de valor genmico proposta por Meuwissen et al.

    (2001) considera a predio dos efeitos BLUP pela soluo das equaes de modelos

    mistos de Henderson (Resende, 2007; Resende et al., 2008). Nesse contexto, podem ser

    considerados, por exemplo, todos os marcadores SNPs identificados, para posterior

    predio do valor genotpico dos indivduos avaliados, conforme prescrevem Meuwissem

    et al. (2001), Bernardo & Yu (2007) e Lorenzana & Bernardo (2009).

    Outra alternativa a utilizao da metodologia conhecida como Regresso

    Aleatria (Random Regression) do tipo BLUP (RR-BLUP), aplicada Seleo Genmica

    Ampla (RR-BLUP/GWS), sendo esta um tipo especial da regresso de cumeeira (Ridge

    Regression) (Resende et al., 2010). O procedimento RR-BLUP/GWS visa identificar os

    marcadores com maiores efeitos, objetivando processar anlises com subgrupos menores

    de marcadores e determinar quantos e quais marcadores maximizam a acurcia seletiva.

  • 3 MATERIAIS E MTODOS

    3.1 MATERIAL VEGETAL E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

    Para a conduo do experimento foram utilizados clones desenvolvidos no

    Programa de Melhoramento Gentico de Cana-de-Acar da Universidade Federal de

    Gois (PMGCA-UFG), provenientes de cruzamentos realizados na Estao de

    Cruzamentos de Serra do Ouro, em Murici-AL.

    Foi utilizada uma populao constituda por 91 gentipos, oriunda da

    autofecundao de um gentipo-elite da Ridesa RB97327 e outra, constituda por 81

    gentipos, proveniente do cruzamento entre RB97327 e a variedade comercial RB72454.

    Os gentipos foram plantados em novembro de 2010, no campo experimental da Usina

    Centrolcool, localizada no municpio de Inhumas-GO (1620'50"S, 4929'2"W),

    vinculada ao PMGCA-UFG.

    O experimento apresentou rea total de 978,75 m2 e o delineamento utilizado

    foi o de blocos aumentados (Federer, 1956). O experimento foi constitudo por nove linhas

    de 67,5 m cada, tendo sido cada uma destas subdividida em 15 blocos. Cada bloco foi

    constitudo por oito parcelas (touceiras), das quais duas eram testemunhas comuns a todos

    os blocos. As variedades comerciais utilizadas como testemunhas foram a RB99395 e

    RB98710. O espaamento de cada parcela, bem como o utilizado entre as plantas na linha

    foi de 0,5m, apresentando, portanto, cada bloco, 4,5 m de comprimento.

    O experimento foi conduzido utilizando-se os tratos culturais tradicionalmente

    recomendados para a cultura da cana-de-acar.

    3.2 AVALIAO FENOTPICA

    Em julho de 2012, os colmos de todos os gentipos foram identificados,

    coletados, amarrados em feixes e transportados para a Escola de Agronomia da

    Universidade Federal de Gois, onde foi realizada a avaliao fenotpica dos seguintes

  • 26

    caracteres: peso total da parcela em kg (PESO), nmero de colmos por parcela (NCOLM),

    dimetro mdio do colmo em mm (DIAM), comprimento do colmo em m (COMP),

    nmero de entrens (NENT) e brix em Brix (BRIX) (Figura 4). Com exceo dos dois

    primeiros caracteres, os demais foram avaliados tomando-se seis colmos ao acaso em cada

    touceira.

    Figura 4. Avaliao fenotpica das caractersicas (A) PESO, (B) NCOLM, (C) DIAM, (D) COMP, (E)

    NENT e (F) BRIX.

    Para a obteno do peso total da parcela, os colmos cortados foram amarrados

    em feixes e pesados em balana digital. NCOL foi obtido pela contagem direta do nmero

    de colmos presentes em cada feixe; DIAM foi obtido por paqumetro, tendo sido a medio

    realizada no centro do entren localizado na poro mediana do colmo; COMP foi obtido

    com trena, considerando-se a medida da base do colmo at o ltimo entren; e NENT pela

    contagem direta do nmero de entrens existentes desde a base do colmo at altura da

    emisso das ltimas folhas. Para a avaliao do teor de slidos solveis totais presentes nos

    colmos (BRIX), estes foram cortados em sua poro mediana, no centro de um entren, e

    esmagados para obteno de uma amostra de suco. A leitura do valor referente ao brix,

  • 27

    diretamente relacionada quantidade de sacarose nos colmos, foi realizada em

    refratmetro analgico porttil.

    3.3 AVALIAO GENOTPICA

    3.3.1 Extrao de DNA

    O DNA genmico foi isolado, utilizando o protocolo descrito por Aljanabi et

    al. (1999), com adaptaes para microtubos de 1,5mL. No total realizou-se a extrao de

    DNA de 179 plntulas mais os genitores envolvidos no estudo. A quantificao do DNA

    extrado foi realizada atravs do espectrofotmetro Qubit (Invitrogen).

    Duas gemas frescas foram coletadas e colocadas em microtubos do tipo

    eppendorf, contendo 300 L de tampo de homogeinizao, em pH 8,0, constitudo por

    Tris-HCl 200mM, EDTA 50 mM, CTAB 2% e 0,06% de Sulfito de Sdio, juntamente com

    trs beads de tungstnio. Isto foi conduzido ao Laboratrio de Gentica e Genmica de

    Plantas, da Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, da Universidade Federal de

    Gois, para continuao da extrao. Posteriormente, em cada microtubo foram

    adicionados 150 L de soluo de PVP (Polivinilpirrolidona) 10%, 150 L de soluo de

    CTAB 20% e 150 L soluo de N-Lauril Sarcosina 5%.

    As amostras foram maceradas durante 3 em equipamento Tissulyser

    (Qiagen), e, posteriormente, colocadas em banho-maria a 65C, por sessenta minutos.

    Aps retirar os microtubos do banho-maria, foi adicionado 750 L de clorofrmio: lcool

    isoamlico (24:1), em cada tubo, os quais foram homogeneizados por 10. Em seguida, as

    amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 e, aproximadamente 400 L do

    sobrenadante foram transferidos para tubos contendo 500 L de isopropanol, acrescido de

    150 L de soluo de NaCl 6M.

    As amostras foram homogeneizadas e submetidas a -20C por 40, para

    promover a precipitao do DNA. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm

    por 10, para ocorrer a formao do pellet. O sobrenadante foi novamente descartado e o

    pellet formado foi lavado duas vezes com 500 L de etanol 70% e colocados para secar

    temperatura ambiente. Aps completamente secos, os pellets foram ressuspendidos em 100

    L de TE (Tris-EDTA).

  • 28

    Aps a extrao, a quantificao de DNA foi realizada utilizando-se

    espectrofotmetro Quibit (Invitrogen).

    3.3.2 Genotipagem

    Na genotipagem foram utilizados 153.831 locos SNPs para BRIX e 153.829

    para os demais caracteres, que foram escolhidos pelo seu contedo informativo, pela

    localizao nos cromossomos e por apresentarem associao com caracteres de interesse

    agronmico.

    Estes dados foram gerados atravs da tecnologia denominada RAPiD-Seq

    (Rapid Genomics, 2014) a qual foi desenvolvida visando alto rendimento, baixo custo e

    uma plataforma flexvel para genotipagem de DNA de qualquer espcie. Para isso, o

    mtodo faz uso de duas sequncias de reaes em cadeia de polimerase (PCR) para gerar

    uma representao reduzida do genoma que pode ser sequenciada em qualquer plataforma

    de sequenciamento de nova gerao (NGS).

    A primeira PCR realizada de forma independente para cada amostra a ser

    genotipada. Os primers utilizados nesta reao contm uma sequncia especfica que

    determina o nmero e a distribuio dos locais de anelamento do genoma. Portanto, o

    nmero de locos que so genotipados pode ser ajustado pela seleo de diferentes primers,

    de acordo com a densidade de cobertura do genoma e a espcie (Figura 5).

    Figura 5. Resumo do primeiro passo da PCR utilizando o mtodo RAPiD-Seq. A reao realizada

    utilizando primers iniciadores que amplificam o loco desejado do genoma. O primer contm a

    sequncia requerida para o sequenciamento, um cdigo que identificar os indivduos que esto

    sendo genotipados, uma sequncia degenerada que d estabilidade ao primer na reao e

    sequncia especfica que confere especificidade da reao.

  • 29

    A segunda PCR realizada com um pool de amostras derivadas da primeira

    PCR, combinando indivduos que sero sequenciados juntos para aumentar o rendimento

    do processo. Aps essa reao, as amostras so lidas em um sequenciador de nova gerao.

    Os dados da sequncia so analisados usando algoritmos customizados e informao

    genotpica obtida (Figura 6).

    Figura 6. Resumo do Segundo passo do mtodo RAPiD-Seq. O produto da primeira PCR para as amostras

    48-96 combinado para uma nica reao de PCR multiplex. Essa PCR curta incorpora nos

    fragmentos a estrutura final para o sequenciamento.

    3.4 SELEO GENMICA AMPLA

    Nesta etapa, foi empregado o mtodo da regresso aleatria para realizao das

    anlises. Este mtodo utiliza preditores do tipo BLUP, mas os efeitos de marcadores no

    so ajustados como variveis classificatrias, mas sim como variveis explicativas ou

    explanatrias. Assim so variveis regressoras e so ajustadas com base nessas

    covariveis. O nome apropriado ao mtodo Regresso Aleatria (Random Regression) do

    tipo BLUP (RR-BLUP) aplicado seleo genmica ampla (RR-BLUP/GWS), sendo esta

    um tipo especial da regresso de cumeeira (Ridge Regression) (Resende et al., 2010). Este

  • 30

    mtodo estima simultaneamente os efeitos de todas as marcas, sendo estas consideradas

    efeitos aleatrios com varincia comum, ou seja, assumem que todos os marcadores

    contribuem igualmente para a variao gentica (ausncia de genes de efeitos maiores).

    A predio via RR-BLUP/GWS descrita a seguir com base em Resende

    (2007; 2008). O seguinte modelo linear misto geral ajustado para estimar os efeitos dos

    marcadores:

    eZaXby ,

    em que: y o vetor de mdias fenotpicas de cada clone, b o vetor de efeitos fixos de

    blocos, a o vetor dos efeitos aleatrios de marcadores, e e refere-se ao vetor de resduos

    aleatrios. X e Z so as matrizes de incidncia dos efeitos b e a. A matriz de incidncia X

    contm os valores para o nmero de alelos do marcador.

    A estrutura das mdias e das varincias pode ser definida como:

    )G,(N~a 0

    )R,(N~e 0

    Xb)y(E

    R'ZGZV)y(Var

    As equaes de modelo misto genmicas para a predio de m via o mtodo

    RR-BLUP equivalem a:

    y'Z

    y'X

    a

    b

    n/Z'ZX'Z

    Z'XX'X

    A

    e

    2

    2

    em que, 2A se refere varincia gentica aditiva total do carter, 2

    e a varincia residual

    e n o nmeto total de marcadores ponderados.

    O valor gentico genmico global do indivduo j dado por:

    i

    ii aZyVGG

  • 31

    Primeiramente foi realizada a anlise com o modelo cheio (full), ou seja,

    considerando as informaes de todos os indivduos para o clculo dos VGG, e

    posteriormente foram realizadas validaes por dois diferentes mtodos, k-Fold Cross-

    Validation e Leave One Out Cross-Validation (LOO), ambos por jack-knife. O primeiro

    mtodo de validao cruzada consiste em particionar aleatoriamente a populao em k

    subconjuntos. Destes k subconjuntos, um retido para ser utilizado na validao do

    modelo e os k-1 subconjuntos restantes so utilizados para predio. O processo de

    validao cruzada , ento, repetido k vezes, de forma que todos os subgrupos foram

    utilizados para predio e validao. Neste estudo, foi utilizado k igual a 10, sendo

    denominada como Tem Fold Cross-Validation (10-Fold).

    O segundo mtodo possui a mesma definio da tcnica anterior, a diferena

    est no nmero do subconjunto k. O mtodo Leave-One-Out define o nmero de

    subconjunto igual ao nmero de exemplos pertencentes ao conjunto de treinamento.

    Em ambos os procedimentos, em cada subgrupo analisado a GWS foi avaliada

    ao calcular a correlao entre o valor gentico predito por esse mtodo e o valor fenotpico

    observado nos indivduos. Essa correlao conhecida como capacidade preditiva ( ),

    sendo dada teoricamente pela acurcia de seleo ( ) multiplicada pela raiz quadrada da

    herdabilidade individual no sentido restrito ( ) (Resende et al., 2010).

    =

    As anlises foram realizadas empregando o software R verso 3.1.0 (R Core

    Team, 2014), utilizando o pacote rrBLUP (Endelman , 2011).

  • 4 RESULTADOS E DISCUSSO

    4.1 AVALIAO FENOTPICA

    A Tabela 1 apresenta um resumo das estimativas obtidas para os parmetros

    descritivos relativos a cada um os seis caracteres avaliados. Foram estimados os valores

    mnimos (mn.) e mximos (mx.) para cada varivel, os trs quartis (Q.25, Q.50 e Q.75),

    sendo o segundo a prpria mediana, a mdia aritmtica, a varincia, o desvio padro e o

    coeficiente de variao. Atravs destes dados possvel que tenhamos uma viso global da

    variao desses valores.

    Tabela 1. Estatsticas descritivas das variveis analisadas no experimento de avaliao fenotpica

    Varivel mn. Q.25 Q.50 Q.75 mx. mdia 2 CV%

    BRIX 4,00 20,13 21,64 22,83 26,33 21,17 6,58 2,57 12,12

    COMP 0,48 1,37 1,62 1,84 2,84 1,60 0,13 0,37 22,86

    DIAM 9,48 18,95 22,33 25,31 30,39 21,73 19,80 4,45 20,47

    NCOL 1,00 4,00 6,00 8,00 2,001 6,46 12,18 3,49 54,02

    NENT 10,00 23,2 26,75 31,6 45,00 27,05 44,98 6,71 24,80

    PESO 0,10 1,80 3,80 6,80 31,40 4,75 16,80 4,10 86,21

    A partir do coeficiente de variao pode-se avaliar a homogeneidade do

    conjunto de dados e, consequentemente, se a mdia uma boa medida para representar

    estes dados. Um coeficiente de variao superior a 50% sugere alta disperso o que indica

    heterogeneidade dos dados. Quanto maior for este valor, menos representativa ser a

    mdia. Quanto mais prximo de zero, mais homogneo o conjunto de dados e mais

    representativa ser sua mdia. Alm disso, com CV

  • 33

    correlao mdia (0,3 < r < 0,6) e 7 apresentaram correlao fraca (0,0 < r < 0,3) e 2

    apresentaram correlao negativa, indicando associao negativa entre os caracteres.

    Figura 7. Grficos de disperso (triangular inferior), histogramas (diagonal) e estimativas do coeficiente de

    correlao (triangular superior) entre as diversas variveis avaliadas no presente estudo.

    Na Tabela 2 esto apresentados os parmetros genticos dos diversos

    caracteres avaliados estimados via REML. As varincias genotpicas foram maiores que as

    varincias ambientais para os caracteres BRIX, DIAM, NCOL e PESO. Os coeficientes de

    variao gentica (CVg) e coeficientes de variao ambiental (CVe) tambm foram estimados.

    O CVg fornece informaes respeito da magnitude relativa da variabilidade gentica presente

    na populao para uma dada varivel de interesse. Valores elevados (superiores a 20%) foram

    observados para os caracteres relacionados diretamente com a produtividade de cana na

  • 34

    populao deste trabalho. Este resultado evidencia a existncia de variabilidade gentica

    suficiente para conduo do trabalho de melhoramento.

    Tabela 2. Estimativas obtidas para os parmetros genticos das variveis quantitativas avaliadas

    Varivel s2g s2

    e CVg (%) CVe (%) CVg/CVe 2CVg (%)

    BRIX 6,73 2,25 12,26 7,09 1,73 24,51

    COMP 0,12 0,06 21,38 15,81 1,35 42,76

    DIAM 14,51 10,14 17,53 14,65 1,20 35,06

    NCOL 14,06 5,15 58,04 35,13 1,65 116,08

    NENT 7,01 24,90 9,79 18,45 0,53 19,58

    PESO 19,06 8,82 91,92 62,52 1,47 183,84

    Conforme salientam Vencovsky & Barriga (1992), a razo CVg/CVe

    representa uma relao importante por sugerir se o ambiente foi favorvel ou desfavorvel

    para realizao de seleo para os caracteres avaliados. Segundo estes autores quando a

    razo CVg/CVe maior do que 1,0, as condies podem ser consideradas favorveis para

    se fazer seleo para a determinada caracterstica. Com base neste critrio, as condies

    ambientais em que o experimento foi conduzido foram favorveis para prtica da seleo

    sobre os seguintes todos os caracteres, exceto NENT. Esta varivel, devido

    preponderncia dos efeitos residuais ambientais sobre os genticos, no esto em

    condies favorveis para se fazer a seleo de gentipos superiores.

    Na Tabela 2 so tambm apresentados os valores correspondentes ao dobro do

    CVg (2CVg). Este parmetro permite a avaliao da magnitude dos limites tericos

    alcanveis sob seleo na populao. Para a varivel PESO, por exemplo, com mdia

    igual a 4,75 kg/parcela, a prtica da seleo pode acarretar um aumento aproximado de at

    183,84%, ou seja, explorando a variabilidade existente na populao a mdia deste carter

    poderia chegar at o limite de 13,48 kg/parcela. Observaes anlogas podem ser feitas

    para as demais variveis.

    4.2 SELEO GENMICA AMPLA

    Foi obtido um modelo de GWS, via RR-BLUP, para 179 indivduos com uso

    de informao de 153.831 locos SNPs para BRIX e 153.829 para os demais caracteres.

    Com base nos modelos obtivemos os valores genticos genmicos (VGG) de cada

    indivduo, para todos os caracteres avaliados. Alm disso, foram calculados valores de

  • 35

    acurcia para cada um dos caracteres e construdos grficos de disperso evidenciando a

    relao entre os VGG preditos para os indivduos e os valores por eles apresentados

    durante a fenotipagem (eBLUPs).

    Durante as anlises, foi realizada uma comparao entre a acurcia obtida entre

    a avaliao do modelo cheio e os dois mtodos de validao cruzada utilizados para definir

    qual melhor mtodo (Figura 8). Os dois mtodos de validao tiveram grande diferena

    apenas para as caractersticas BRIX e NENT, para as demais no houve diferena

    significativa. Para BRIX, o mtodo LOO apresentou maior acurcia, ao contrrio de

    NENT. Sendo assim, para inferncia sobre os valores obtidos foram considerados os

    valores obtidos pela validao LOO, visto que esta gera valores mais consistentes.

    Figura 8. Comparao da acurcia seletiva entre o modelo cheio e os dois mtodos de validao cruzada,

    Tem-fold e LOO, para as seis caractersticas estudadas.

    A herdabilidade de cada carter, no sentido restrito, foi estimada atravs da

    varincia dos caracteres. Esse valor variou de 0,22 a 0,80 entre os diferentes caracteres e

    foi observados o maior valor de herdabilidade para brix (Tabela 3). Com exceo do

    nmero de entrens, no geral, observou-se valores relativamente altos de herdabilidade

    indicando a existncia de efeitos aditivos na expresso gentica desses caracteres.

    Verifica-se tambm que a herdabilidade relacionada ao caractere brix

    maximiza a capacidade preditiva na validao cruzada (Tabela 3). O ponto de mximo da

    capacidade preditiva reflete a coerncia interna e intrnseca dos dados em informar sobre o

    fentipo. As maiores capacidades preditivas foram obtidos para brix seguido por dimetro

    e comprimento do colmo. Atravs do estudo da preciso genmica em cana de acar,

    Gouy et al. (2013), obtiveram capacidade preditiva de 0,13 para resistncia ferrugem e

  • 36

    0,55 para brix; e afirmam que este nvel de correlao promissor para futuras

    implementaes do mtodo para cana de acar.

    Tabela 3. Herdabilidade, capacidade preditiva e acurcias da seleo genmica ampla via RR-BLUP para

    graus Brix, comprimento e dimetro do colmo, nmero de colmos por parcela, nmero de entrens

    e peso da parcela

    Trait Tamanho da

    populao Herdabilidade (h2)

    Capacidade

    preditiva Acurcia

    BRIX 176 0,80 0,77 0,86

    COMP 179 0,67 0,70 0,86

    DIAM 179 0,59 0,73 0,96

    NCOL 179 0,73 0,65 0,76

    NENT 179 0,22 0,03 0,06

    PESO 179 0,68 0,66 0,80

    A acurcia da GWS, em geral, segui a tendncia observada para capacidade

    preditiva; os valores mximos obtidos foram de 0,96 para dimetro de colmo e 0,86 para

    graus Brix e comprimento de colmo, respectivamente (Tabela 3). Em simulaes feitas

    por Meuwissen et al. (2001) o RR-BLUP apresentou uma acurcia de 0,732. Muir (2007)

    simulou 512 gentipos para um carter com uma baixa herdabilidade (h2 = 0,1) que

    resultou numa acurcia ainda maior, de 0,83; Cavalcanti et al. (2012), em estudo de 74

    indivduos de uma famlia de irmos completos de caju, obteve acurcia de 86% para peso

    de amndoas, na anlise com 70 marcadores de maiores efeitos. No melhoramento animal,

    VanRaden et al. (2009) avaliando uma populao de 3500 touros, genotipados com 38416

    SNPs atravs de dois mtodos diferentes, RR-BLUP e Bayes B, obtiveram acurcias de

    0,44 a 0,79 para caractersticas com herdabilidades entre 0,04 e 0,50.

    Alm disso, Fritsche Neto (2011), estimando dois componentes da eficincia

    no uso de nitrognio e de fsforo (eficincia de absoro e de utilizao) em 41

    combinaes hbridas, em dois experimentos, sob baixa e alta disponibilidades de N e P,

    atravs do mesmo mtodo utilizado neste estudo, RR-BLUP, obtiveram altos valores de

    acurcia e concluram que, com o uso da GWS, houve aumento significativo na acurcia

    seletiva e nos ganhos genticos por unidade de tempo.

    Grficos de disperso entre os valores genticos preditos via RR-BLUP e os

    valores de eBLUPs observados para os seis caracteres avaliados podem ser observados na

    Figura 9. Eles ilustram, visualmente, a capacidade de predio genmica obtida para as

    diferentes caractersticas.

  • 37

    Nestes grficos, para os caracteres COMP, DIAM, NCOL e PESO, observa-se

    a formao de dois diferentes aglomerados de pontos. Verificou-se que quanto maior a

    acurcia mais concisos e determinados estes grupos se encontravam. Os demais caracteres

    apresentaram este efeito to menos evidenciado quanto menor a acurcia do modelo.

    Figura 9. Grficos de disperso dos valores genticos preditos via RR-BLUP e os valores de eBLUPs

    observados para os seis caracteres avaliados.

  • 5 CONCLUSES

    Com base nos resultados obtidos, constataram-se, com uso da GWS, altos

    valores de acurcia seletiva para todos os caracteres estudados, exceto para NENT. Alm

    disso, no geral, os valores genticos genmicos preditos na populao de validao cruzada

    apresentam alta correlao com os valores fenotpicos observados e, portanto, a seleo

    genmica ampla pode ser usada com eficincia no melhoramento de cana de acar.

    Dessa forma, os resultados obtidos neste estudo apontam grande potencial

    deste mtodo como forma de acelerar a seleo para caractersticas complexas em cana de

    acar, podendo reduzir significativamente a durao dos ciclos de seleo e,

    consequentemente, otimizando a alocao de recursos e a sustentabilidade do

    melhoramento.

  • 6 REFERNCIAS

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