“do leishflow ao leishplex: inovaÇÕes … · ao dr. diogo garcia valadares e ao dr. rodrigo...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

ESCOLA DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

“DO LEISHFLOW AO LEISHPLEX: INOVAÇÕES

TECNOLÓGICAS DA SOROLOGIA POR CITOMETRIA DE

FLUXO APLICADA AO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE

VISCERAL CANINA”

Henrique Gama Ker

Escola de Farmácia

Ouro Preto - 2016

Henrique Gama Ker

“DO LEISHFLOW AO LEISHPLEX: INOVAÇÕES

TECNOLÓGICAS DA SOROLOGIA POR CITOMETRIA DE

FLUXO APLICADA AO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE

VISCERAL CANINA”

Tese apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal de Ouro Preto, como parte

integrante dos requisitos para obtenção do Título

de Doutor em Ciências Farmacêuticas.

Área de concentração: Fármacos, Medicamentos

e Vacinas.

Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis

Co-orientadora: Dra. Andréa Teixeira de Carvalho

Escola de Farmácia

Ouro Preto – 2016

Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis, Laboratório de Imunopatologia,

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB), Universidade Federal de

Ouro Preto, MG.

Co-orientadora: Dra. Andréa Teixeira de Carvalho, Grupo Integrado de

Pesquisas em Biomarcadores, Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ,

MG.

Colaboradores:

Dr. Olindo Assis Martins Filho (CPqRR/FIOCRUZ/MG)

Dra. Patrícia Sampaio Tavares Veras (CPqGM/FIOCRUZ/BA)

Dra. Hélida Monteiro de Andrade (UFMG/MG)

Dr. Diogo Garcia Valadares (UFOP/MG)

Dr. Evandro Marques de Menezes Machado (UFOP/MG)

Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares (UFOP/MG)

Dr. Wendel Coura Vital (UFOP/MG)

Instituições Parcerias:

Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ/MG

Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/FIOCRUZ/BA

Universidade Federal de Minas Gerais

Universidade Federal de Ouro Preto

Suporte Financeiro:

FAPEMIG - EDITAL 14/2013 - PROGRAMA DE PESQUISA PARA O SUS -

PPSUS (CDS - APQ-03505-13)

FAPEMIG - EDITAL 70/2013 - PROGRAMA INVENTIVA (CBB - INV-00037-14)

CAPES: Bolsa de doutorado

Ao meu pais João e Maria José,

Pelos ensinamentos,

E apoio aos meus sonhos.

Ao meus afilhados João Pedro e Francisco,

Pela sincera ternura,

E alegria do nosso laço.

Aos meus irmãos Pedro e Mariana

Pelo companheirismo,

E perene amizade.

À memória das minhas avós Lourdes e Irene,

Pelas queridas lembranças,

E eterno carinho.

Ao meu avô Carlito,

Pela simplicidade,

E contagiante alegria de viver.

À Hélia,

Pelo amor,

E adorável companhia.

“É chato chegar

A um objetivo num instante”

Raul Seixas

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus por colocar em meu caminho pessoas que me

acompanharam nesta jornada e por conceder-me sabedoria para enfrentar esta longa

jornada durante estes quatro anos.

A Escola de Farmácia e à Universidade Federal de Ouro Preto por fazer parte da minha

formação pessoal e por proporcionar minha formação profissional e científica.

Ao Dr. Alexandre Barbosa Reis, meu orientador, e grande amigo, pela confiança, pelo

incentivo, pelas críticas, e pelos ensinamentos que concederam-me a oportunidade de

vislumbrar novos horizontes no âmbito científico e acadêmico.

À Dra. Andréa Teixeira de Carvalho, minha co-orientadora, pela convivência sempre

distinta, de marcante sensibilidade, aliada a um enorme conhecimento. Seus

ensinamentos iluminaram-me o raciocínio e certamente tem grande importância nesta

conquista.

À Dra. Cláudia Martins Carneiro, pela amizade, pela confiança, e pelo amparo nas horas

em que mais precisei, e pelo grande exemplo de pessoa.

Ao Dr. Wendel Coura Vital, grande parceiro que representa um verdadeiro exemplo

profissional. Obrigado pela importante contribuição dada ao longo da minha formação.

Ao Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti e a Dra. Denise da Silveira Lemos Giunchetti, pela

fundamental contribuição nos meus primeiros passos durante o mestrado.

A Dra. Patrícia Sampaio Tavares Veras e Dra. Hélida Monteiro de Andrade e toda a

equipe a quem sempre nos atendeu com solicitude e boa vontade para o fornecimento

dos recombinantes.

Ao Dr. Evandro Marques de Menezes Machado pelos conselhos.

Ao Dr. Diogo Garcia Valadares e ao Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares pela

efetiva participação no desenvolvimento deste trabalho.

Aos Professores André Vasconcelos, Wagner Miranda, Francisco Careta e Taís Bastos,

pela acolhida durante minha estadia no Departamento de Farmácia e Nutrição da

Universidade Federal do Espírito Santo.

Aos meus pais João Carlos e Maria José pela dedicação, amor e compreensão durante

todos esses anos.

Aos meus irmãos Pedro e Mariana, e à Cristina, pela duradoura amizade e

companheirismo. Sempre contarei com vocês!

À Hélia pelo amor, amizade, incentivo e companheirismo. Você é a essência da minha

vida!

Aos meus sobrinhos e afilhados João Pedro e Francisco pela alegria da nossa amizade.

Aos meus avós Carlito e Lourdes, e João e Irene, pelos valores familiares.

Aos amigos do Laboratório de Imunopatologia e Laboratório de Pesquisas Clínicas, pela

convivência harmoniosa e pelos valores de união.

Aos amigos que carrego da cidade de Viçosa-MG, Thiago Andrade, Rafael Santana,

André Féres, Leonardo Comastri e Alexandre Dantas, pelas saudosas lembranças da

minha infância e adolescência. Um dos sacrifícios desta conquista foi viver distante de

vocês.

Aos amigos que carrego da cidade de Ouro Preto-MG, Galeno Cortes, Sheler Martins,

Rodrigo Dian, Kelvinson Viana, Alexandre Rotondo, Ricardo Junqueira e Bernardo

Machado pela verdadeira amizade. A convivência com cada um de vocês ficou marcada.

Aos amigos que carrego da cidade de Manhumirim-MG, Emerson Portugal, João Paulo

Portugal, Orbino Werner, Raphael Gerardi e Gelsomiro Basílio, pelos momentos em que

pude estar da alegre companhia de vocês.

Aos amigos, Antônio Calais e Raphael Bolzan, que me acolheram durante uma curta,

mas importante passagem pela cidade de Alegre-ES.

A todos meus familiares, colegas e amigos, que, mesmo em pensamentos, um sorriso,

ou uma palavra de incentivo, me apoiaram nessa longa jornada.

i

Resumo

Os ensaios sorológicos para Leishmania são determinantes para indicar a eutanásia de

cães como medida de controle da Leishmaniose Visceral no Brasil. No presente estudo,

buscou-se avaliar o desempenho das metodologias sorológicas que atualmente são – e

os que já foram – adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil (DPP, ELISA e RIFI),

assim como o da sorologia por Citometria de Fluxo (CF), no diagnóstico da

Leishmaniose Visceral Canina (LVC). Os ensaios foram conduzidos em uma ampla

variedade de amostras de soro, que incluiu cães naturalmente infectados por

Leishmania infantum portadores de diferentes formas clínicas, cães infectados com

outras protozooses caninas (L. braziliensis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia canis e

Babesia canis) e cães vacinados contra LVC (Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap). Em

relação aos testes oficiais, o principal achado se deu pela elevada especificidade do

DPP (99,4%) em relação à ELISA (89,9%) e RIFI (75,2%). Quanto ao teste LeishFlow,

destacou-se a sensibilidade de 95,0% tanto nos cães assintomáticos, quanto nos

oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade do LeishFlow em amostras de soro

de cães infectados por L. braziliensis foi de 80,0%, 55,6% nas amostras de T. cruzi,

93,3% em E. canis, e 100,0% em B. canis. Nos cães vacinados pela Leishmune®, Leish-

Tec® e LBSap observou-se 100,0% de especificidade. A sequência do trabalho buscou

o desenvolvimento de uma inovação metodológica na sorologia por CF por meio do

acoplamento de antígenos recombinantes à microesferas de poliestireno. Os antígenos

multiepitopo PQ20 e C1, e os recombinantes rLci1A e rLci2B foram acoplados a

diferentes microesferas, formando os sistemas antigênicos microesfera–proteína C6–

PQ20, E7–C1, A4–rLci1A, e E4–rLci2B. Constatou-se que os sistemas A4−rLci1A e

E4−rLci2B foram os únicos que se mostraram adequadamente funcionais para a

pesquisa de anticorpos caninos IgG. O ensaio sorológico pelo sistema A4−rLci1A

apresentou sensibilidade de 85,0% nos cães assintomáticos, e 95,0% nos

oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade deste sistema nos cães infectados

por L. braziliensis foi de 100,0%, enquanto que nas infecções por E. canis e B. canis,

esse valor foi de 30,0% e 20,0% respectivamente. Nos cães vacinados por Leishmune®

e Leish-Tec® a especificidade foi de 70,0%, e por LBSap de 80,0%. O sistema

antigênico E4−rLci2B, por sua vez, apresentou sensibilidade de 85,0% nos animais

assintomáticos, e de 100,0% nos oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade

deste sistema em relação as infecções por L. braziliensis e E. canis foi de 80,0%, e de

60,0% quanto a infecção por B. canis. A especificidade relacionada à vacinação por

Leishmune® e pela Leish-Tec® foi de 90,0%, e na LBSap foi de 50,0%. A combinação

dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B para o ensaio sorológico único, LeishPlex,

apresentou sensibilidade de 85,0% nos cães assintomáticos, e 100,0% nos grupos

oligossintomático e sintomático. A especificidade em cães infectados por L. braziliensis

foi de 100,0%, enquanto que em E. canis foi de 70,0%, e em B. canis foi 60,0%. Nos

cães vacinados pela Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap observou-se 100,0% de

especificidade. Portanto, a inovação LeishPlex resultou em uma elevação da precisão

geral de acertos. O conjunto de dados evidenciados no presente trabalho fortalecem a

sorologia por CF como uma importante abordagem para o diagnóstico sorológico da

LVC.

Palavras chave: Leishmania infantum; Leishmaniose Visceral Canina; Diagnóstico;

Sorologia; Citometria de Fluxo.

ii

Abstract

Serologic tests for Leishmania are key to determine the euthanasia of infected dogs as

a control measure of Visceral Leishmaniasis in Brazil. In the present study, we sought to

evaluate the performance of serologic methods that are currently – and those that have

already been – adopted by the Ministry of Health of Brazil (DPP, ELISA and IFAT), as

well as the serology by Flow Cytometry (FC), in the diagnosis of Canine Visceral

Leishmaniasis (CVL). The tests were conducted in a wide variety of serum samples, that

included dogs naturally infected with Leishmania infantum with different clinical forms,

dogs infected with other canine protozoosis (L. braziliensis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia

canis and Babesia canis), and vaccinated against CVL (Leishmune®, Leish-Tec® and

LBSap). Regarding the official tests, the main finding was associated to the high

specificity of the DPP (99.4%) in relation to ELISA (89.9%) and IFAT (75.2%). For the

LeishFlow test, it was worth noting a sensitivity of 95.0% in all asymptomatic,

oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity of LeishFlow in serum samples

of dogs infected with L. braziliensis was 80.0%, 55.6% in T. cruzi, 93.3% in E. canis, and

100.0% in B. canis. In the dogs vaccinated with Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap,

100.0% of specificity was observed. The next step of the work sought the development

of an innovative approach in FC serology by coupling recombinant antigens to

polystyrene beads. The multiepitope antigens PQ20 e C1, and the recombinants rLci1A

e rLci2B were coupled to different beads generating the antigenic systems C6–PQ20,

E7–C1, A4–rLci1A and E4–rLci2B. It was observed that the systems A4–rLci1A and E4–

rLci2B were the only ones that were properly functional to the research of IgG canine

antibodies. The serological assay by the system A4–rLci1A presented sensitivity of

85,0% in the asymptomatic dogs, and 95,0% in the oligosymptomatic and symptomatic

ones. The specificity of this system in dogs infected by L. braziliensis was 100,0%,

whereas in E. canis and B. canis infections this value was 30,0% and 20,0% respectively.

In dogs vaccinated with Leishmune® and Leish-Tec® the specificity was 70,0%, e with

LBSap it was 80,0%. The antigenic system E4–rLci2B, in turn, showed sensitivity of

85,0% in asymptomatic animals, and of 100,0% in oligosymptomatic and symptomatic

dogs. The specificity of this system concerning infections by L. braziliensis and E. canis

was 80,0%, and 60,0% concerning the infection by B. canis. The specificity regarding

the vaccination with Leishmune® and Leish-Tec® was 90,0%, and with LBSap it was

50,0%. The combination of the systems A4−rLci1A and E4−rLci2B for a single

serological assay, LeishPlex, presented sensitivity of 85,0% in asymptomatic animals,

and of 100,0% in oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity in dogs

infected by L. braziliensis was 100,0%, while in E. canis it was 70,0%, and 60,0%

concerning the infection by B. canis. In the dogs vaccinated with Leishmune®, Leish-

Tec® and LBSap, 100.0% of specificity was observed. Thus, the innovative LeishPlex

yielded increased accuracy. The data set evidenced by the present work strengthened

the FC serology as an important approach for CVL serological diagnosis.

Key words: Leishmania infantum; Canine Visceral Leishmaniasis; Diagnosis;

Serological Test; Flow Cytometry.

iii

Sumário

Resumo................................................................................................................i

Abstract.............................................................................................................iii

Índice de figuras ............................................................................................... v

Índice de tabelas ............................................................................................ vii

Lista de abreviaturas e siglas ...................................................................... viii

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1

2. REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 5

2.1. Aspectos clínicos-laboratoriais e considerações sobre o diagnóstico da LVC ..... 5

2.2. Abordagem histórica das técnicas sorológicas clássicas empregadas no

diagnóstico da LVC ................................................................................................................ 9

2.3. Aprimoramento dos testes sorológicos usualmente empregados no diagnóstico

da LVC ................................................................................................................................... 10

2.4. A necessidade de elevada acurácia para o diagnóstico sorológico da LVC ...... 13

2.5. Atuais perspectivas biotecnológicas na construção de metodologias sorológicas

para o diagnóstico da LVC .................................................................................................. 14

3. JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 17

4. HIPÓTESE ................................................................................................... 18

5. OBJETIVOS ................................................................................................. 18

5.1. Objetivo Geral .............................................................................................................. 18

5.2. Objetivos específicos ................................................................................................... 18

6. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 19

6.1. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: avaliação das metodologias

adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil .................................................................. 19

6.2. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o teste por citometria de fluxo

LeishFlow .............................................................................................................................. 19

6.3. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o desenvolvimento de uma nova

metodologia diagnóstica por citometria de fluxo e a geração de uma plataforma

diagnóstica – LeishPlex....................................................................................................... 19

6.3.1. Animais experimentais.............................................................................................. 20

6.3.2. A tecnologia Cytometric Bead Array (CBA) .......................................................... 22

6.3.3. Padronização do acoplamento de proteínas às microesferas funcionais CBA

................................................................................................................................................ 23

6.3.4. O acoplamento de proteínas recombinantes com potencial para diagnóstico

da LVC e o desenvolvimento de uma nova metodologia diagnóstica por citometria de

fluxo ........................................................................................................................................ 26

6.3.5. Análise dos dados obtidos no citômetro de fluxo ................................................. 28

iv

6.3.6. Análise dos resultados ............................................................................................. 31

6.3.6.1. Análises aplicadas à seleção das condições ideais para reação sorológica 31

6.3.6.2. Análises aplicadas à determinação do ponto de corte .................................... 31

6.3.6.3. Análises aplicadas à avaliação de desempenho diagnóstico ......................... 32

6.4. Comparação entre os testes sorológicos ................................................................. 34

7. RESULTADOS ............................................................................................. 35

7.1. Avaliação das metodologias adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil no

diagnóstico da LVC .............................................................................................................. 35

7.2. Avaliação do teste por citometria de fluxo LeishFlow no diagnóstico da LVC ... 35

7.3. Desenvolvimento e avaliação de um novo teste multiplex por citometria de fluxo

utilizando sistemas microesfera−proteína no diagnóstico da LVC e construção do

LeishPlex ............................................................................................................................... 35

7.3.1. Os sistemas microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20 ..................................... 35

7.3.2. Os sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B ............................................. 37

7.3.3. A construção do novo teste por citometria de fluxo LeishPlex pela combinação

dos sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B ...................................................... 45

7.4. Avaliação comparativa entre os testes sorológicos LeishPlex, LeishFlow, DPP,

ELISA e RIFI ......................................................................................................................... 52

8. DISCUSSÃO ................................................................................................ 53

9. CONCLUSÕES ............................................................................................ 66

10. PERSPECTIVAS ........................................................................................ 67

11. ANEXOS .................................................................................................... 68

12. APÊNDICES .............................................................................................. 72

13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 108

v

Índice de figuras

Figura 1: Panorama dos grupos de soros empregados neste estudo..........................21

Figura 2: Painel das microesferas que compõem o kit BD™ CBA Flex Set................22

Figura 3: Etapas para acoplamento de proteínas a microesferas funcionais do kit BD™

CBA Flex Set..................................................................................................................23

Figura 4: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da

confirmação do acoplamento de soroalbumina bovina em microesferas C7 do kit BD™

CBA Flex Set.................................................................................................................26


confirmação do acoplamento da proteína recombinante C1 à microesfera E7 do kit BD™

CBA Flex Set..................................................................................................................29


confirmação do acoplamento da proteína recombinante PQ20 à microesfera C6 do kit

BD™ CBA Flex Set.......................................................................................................29


confirmação do acoplamento da proteína recombinante rLci1A à microesfera A4 do kit

BD™ CBA Flex Set.......................................................................................................30


confirmação do acoplamento da proteína recombinante rLci1A à microesfera A4 do kit

BD™ CBA Flex Set.......................................................................................................30

Figura 9: Fluxograma do processo da avaliação dos sistemas microesfera−proteína

para aplicação no diagnóstico da LVC. ........................................................................31

Figura 10: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino realizado com o sistema

microesfera−proteína E7−C1........................................................................................36


microesfera−proteína C6−PQ20....................................................................................36


microesfera−proteína A4−rLci1A...................................................................................38


microesfera−proteína microesfera−proteína E4−rLci2B................................................38

Figura 14: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema

A4−rLci1A......................................................................................................................39

Figura 15: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema

A4−rLci1A......................................................................................................................40

Figura 16: Avaliação de desempenho do sistema A4-Lci1A no diagnóstico da

LVC................................................................................................................................41

vi

Figura 17: Avaliação de desempenho do sistema E4-rLci2B no diagnóstico da

LVC................................................................................................................................42

Figura 18: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença...............44

Figura 19: Representação esquemática da sequência da análise dos dados o teste

LeishPlex empregando a matriz antigênica composta pelos sistemas microesfera-

proteína A4−rLci1A e E4−rLci2B...................................................................................47

Figura 20: Obtenção do ponto de corte empregando o teste LeishPlex......................48

Figura 21: Avaliação do desempenho do teste LeishPlex em ensaio sorológico por

citometria de fluxo no diagnóstico da LVC....................................................................49

Figura 22: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença utilizando o

teste LeishPlex..............................................................................................................51

Figura 23: Protótipo do teste sorológico LeishFlow......................................................58

vii

Índice de tabelas

Tabela 1: Relação das microesferas e respectivo antígeno usado na construção dos

sistemas antigênicos microesfera−proteína deste estudo............................................27

Tabela 2: Categorias de resultados do teste diagnóstico em uma população que inclui

cães não infectados e cães infectados com L. infantum...............................................33

Tabela 3: Desempenho dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B no

diagnóstico da LVC.......................................................................................................43

Tabela 4: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise dos sistemas

antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B em diferentes cenários de

prevalência....................................................................................................................43

Tabela 5: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós-teste dos sistemas

antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B. ............................................................................45

Tabela 6: Desempenho dos teste LeishPlex no diagnóstico da LVC...........................50

Tabela 7: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise do teste por

citometria de Fluxo LeishPlex em diferentes cenários artificiais de

prevalência....................................................................................................................50

Tabela 8: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós teste.......................51

Tabela 9: Avaliação da concordância entre as metodologias sorológicas. .................52

viii

Lista de abreviaturas e siglas

ALT - Alaninaminotransferase

AST- Aspartatoaminotransferase

AUC - Area under a curve

BSA - Bovine Serum Albumin

CA - Cães assintomáticos

CBA - Cytometric bead array

CF - Citometria de Fluxo

CCA - Centro de Ciência Animal

CCZ-BH - Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte

CNI - Controle não infectado

CO - Cães oligossintomáticos

CRC - Controle de reatividade cruzada

CS - Cães sintomáticos

DFIP - Departamento de Fiscalização de Insumos Pecuários

DNA - Deoxyribonucleic acid

DPP - Dual Path Platform

DTT - Ditioteitrol

ELISA - Enzime Lynked Immunosorbent Assay

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz

FITC - Isotiocianato de fluoresceína

FL1 - Fluorescência 1



ix

FSC - Foward Scatter

Ig - Imunoglobulina

IgA - Imunoglobulina da classe A

IgE - Imunoglobulina da classe E

IgG - Imunoglobulina da classe G

IgG1 - Imunoglobulina de subclasse G1

IgG2 - Imunoglobulina de subclasse G2

INF - Cães infectados por L. infantum

IFAT - Indirect Fluorescent Antibody Test

INPI - Instituto Nacional De Propriedade Industrial

hsp - Heat shock protein

kDNA - DNA de cinetoplasto

L - Litro

LV - Leishmaniose Visceral

LVC - Leishmaniose Visceral Canina

LPC - Laboratório de Pesquisas Clínicas

LIMP - Laboratório de Imunopatologia

MAPA - Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

mL - Mililitros

µL- Microlitros

mg - Miligramas

MS - Ministério da Saúde

MWCO - Molecular Weight Cut-Off

NEM - N-Ethylmaleimide

NITE - Núcleo de Inovação Tecnológica e Empreendedorismo

x

NNN - Meio de cultura Novy-MacNeal-Nicolle

NUPEB - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas

PBS - Phosphate Buffer Salin

PCLV - Programa de Controle da Leishmaniose Visceral

PCR - Polimerase Chain Reaction

pH - Potencial hidrogeniônico

PPF - Percentual de Partículas Fluorescentes

qPCR - Real Time Polimerase Chain Reaction

RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta

RNA - Ribonucleic Acid

ROC - Receiver Operation Characteristc

rpm - Rotação por minuto

RV - Razão de verossimilhança

SDA - Secretaria de Desenvolvimento Agrário

SSC - Side Scatter

Sulfo-SMCC - Sulfosuccinimidil 4-N-maleimidometil ciclohexano 1-carboxilato

UFOP - Universidade Federal de Ouro Preto

UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais

VPN - Valor preditivo negativo

VPP - Valor preditivo positivo

KER, H.G. INTRODUÇÃO

1

1. INTRODUÇÃO

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada com um importante

impacto para a saúde pública mundial, apresentando cerca de 200.000−400.000 novos

casos por ano (Alvar et al., 2012). A infecção é causada por protozoários parasitos do

gênero Leishmania e é transmitida pela picada da fêmea de flebotomíneos Lutzomyia

spp no Novo Mundo e Phlebotumus spp no Velho Mundo. A LV tem dois principais tipos

de ciclos de transmissão: a antroponótico e a zoonótico. Em relação a primeira, os seres

humanos são os únicos ou principais reservatórios do parasito, e ocorre principalmente

no subcontinente indiano e na África Oriental. A transmissão zoonótica é tipicamente

observada nos países do Mediterrâneo e nas Américas, mas também pode ser

encontrada na Ásia Central, e alguns países do Oriente Médio.

Embora a LV de transmissão antroponótica corresponde a aproximadamente

80.0−90.0% dos casos em todo o mundo, a LV de transmissão zoonótica tem chamado

a atenção de órgãos oficiais de saúde pública e da comunidade científica, dada a

crescente expansão da doença em regiões urbanas de países da América do Sul (OMS,

2010). Nesta região, a doença é causada pelo protozoário Leishmania infantum,

transmitida por flebotomíneos da espécies do gênero Lutzomyia spp (Quinnell et al.,

2009). No Brasil, há uma série de evidências experimentais e epidemiológicas que

suportam os cães como os principais hospedeiros reservatórios de L. infantum em áreas

urbanas.

Partindo do princípio de que os cães infectados desempenham um papel

essencial na transmissão para os seres humanos em um ambiente urbano no Brasil,

uma estratégia de controle eficaz deve ser capaz de diminuir a incidência de infecção

na população canina. Neste contexto, os argumentos relacionados à ação de controle

composta pela eutanásia de cães infectados mostram-se controversos no Brasil.

Enquanto algumas pesquisas questionam a eficácia desta medida (Dietze et al., 1997;

Costa et al., 2011; Werneck et al., 2014), outros estudos, por sua vez, admitem que esta

estratégia pode produzir resultados positivos (Ashford et al., 1998; Palatnik-de-Sousa et

al., 2001; Nunes et al., 2010). Diante desta divergência, uma certeza comum ressalta

que um dos principais fatores que contribuiu e vem contribuindo para a expansão da LV

nos centros urbanos é a limitação do Programa de Controle da Leishmaniose Visceral

(PCLV) em controlar a Leishmaniose Visceral Canina (LVC).

Dentre os principais determinantes que limitam a eficácia da estratégia de

controle em cães destacam-se: (i) a reposição imediata de cães pela população

(Andrade et al. 2007; Nunes et al., 2008); (ii) a descontinuidade das intervenções

(Malaquias et al., 2007; Barata et al., 2013); (iii) os problemas na logística de eliminação


2

do reservatório doméstico relacionado a demora no diagnóstico e eutanásia dos animais

infectados (Braga et al. 1998; Courtenay et al. 2002); (iv) baixa acurácia dos métodos

de diagnósticos adotados (Courtenay et al. 2002; Palatnik-de-Sousa et al., 2004;

Romero et al., 2010).

Em face destas evidências e em especial a primeira questão sobre a reposição

imediata de cães pela população, tem sido sugerido a implementação de medidas de

apoio ao PCLV. Neste sentido, a implantação de programas de educação voltado a

conscientização da comunidade sobre as práticas de prevenção da LV e posse

responsável do cão tem se mostrado como uma promissora iniciativa (Esch et al., 2012).

Outra medida de apoio ao PCLV trata-se de manejo sanitário dos ambientes domiciliares

e seus entornos (quintais, galinheiros, canis) dentre outros que contribuem para o

aumento de flebotomíneos e consequentemente manutenção do ciclo de transmissão

(MS 2006).

O problema da segunda questão, que trata da descontinuidade das ações

epidemiológicas de controle e vigilância da população canina, é um fato constato em

diversos centros urbanos do Brasil atualmente. Como exemplo, a cidade de Governador

Valadares localizada na região do Vale do Rio Doce, Minas Gerais, teve os primeiros

casos de LV registrados na década de 60 (Coelho & Falcão, 1966). A partir de então,

por meio de um intenso trabalho sobre o controle e a profilaxia da LV na região do Vale

do Rio Doce realizado pelo Professor Wilson Mayrink do Departamento de Parasitologia

do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais

(ICB/UFMG), e o epidemiologista da Superintendência de Campanhas de Saúde

Pública (SUCAM) Paulo Araújo Magalhães, a doença foi considerada “controlada” nesta

região. Já em meados dos anos 90 todo o serviço foi interrompido e vigilância

epidemiológica não foi realizada regularmente desde então, resultando em ausência de

notificações de casos de LV até 2007, quando se mostrou a retomada dos casos de

LVC no município (Malaquias et al., 2007). Em seguida, os casos de LV começaram a

ser novamente registrados no município revelando um foco re-emergente de intensa

transmissão (Barata et al., 2013).

A respeito da terceira questão, sobre a logística do PCLV, era relatado uma

demora de 80 a 180 dias entre a coleta da amostra biológica, sua análise e a eutanásia

dos animais infectados no controle da LVC (Vieira & Coelho, 1998; Moreira et al., 2004).

Assim, a recente implementação do teste imunocromatográfico rápido DPP em

substituição à RIFI sinaliza para uma maior agilidade entre a identificação e eliminação

do reservatório doméstico. Desta forma, a partir do ano de 2012, o protocolo de

eutanásia do cão infectado passou a ser realizado pelo rastreamento com o DPP e

confirmação com o ELISA. Todavia, para proporcionar uma logística ainda melhor, foi


3

sugerido que o ELISA seja usado para rastreamento e o DPP para confirmação em

munícipios com elevada demanda de exames (Coura-Vital et al., 2014). Entretanto, em

áreas de baixa demanda de exames, o DPP certamente pode melhor contribuir como

um teste de triagem uma vez que pode ser aplicado a campo (Schubach et al., 2014).

Apesar das conquistas alcançadas, uma unanimidade entre as principais

considerações sobre as limitações do PCLV tratam da quarta e última questão, que se

relaciona com a necessidade de uma elevação na acurácia dos testes de diagnóstico

sorológico para a melhoria das ações voltadas ao controle e vigilância da LVC

(Courtenay et al. 2002; Palatnik-de-Sousa et al., 2004; Romero et al., 2010; Ribeiro et

al., 2013; Otranto & Dantas-Torres, 2013). Dentro deste contexto, o presente trabalho

buscou tanto avaliar os métodos oficialmente recomendados pelo Ministério da Saúde

(DPP, ELISA e RIFI), quanto desenvolver novas tecnologias aplicadas ao diagnóstico

sorológico da LVC.

Sobre a avaliação dos métodos oficialmente recomendados pelo Ministério da

Saúde (DPP, ELISA e RIFI), os resultados desta avaliação compõe o primeiro trabalho

apresentado nesta tese, designado: “The specificity of canine visceral leishmaniasis

diagnosis in Brazil: a report of laboratory investigation about the cross-reactivity to other

canine infections and seroconversion by vaccination”, recentemente submetido à

Revista de Saúde Pública.

O desenvolvimento e avaliação de novas ferramentas para o diagnóstico

sorológico da LVC se baseou em tecnologias por citometria de fluxo e compreendem

dois trabalhos.

Os resultados do desenvolvimento de um teste sorológico por citometria de fluxo

de primeira geração, nomeado LeishFlow, foram patenteados no Instituto Nacional de

Propriedade Intelectual (BR 10 2012 0047420) sob título “Protótipo de um kit de

diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral canina, empregando formas

promastigotas fixadas pela técnica de citometria de fluxo” e foram publicados no ano de

2013 no periódico Diagnostic Microbiology and Infectious Disease intitulado “Effect

of the preservative and temperature conditions on the stability of Leishmania infantum

promastigotes antigens applied in a flow cytometry diagnostic method for canine visceral

leishmaniasis”. A avaliação do desempenho do teste LeishFlow, por sua vez, está

retratada no trabalho “Evaluation of a Prototype Flow Cytometry Test for Serodiagnosis

of Canine Visceral Leishmaniasis” publicado no ano de 2013 no periódico Clinical and

Vaccine Immunology.

Além dos resultados alcançados pelo teste LeishFlow, o presente trabalho

buscou uma nova inovação metodológica para o diagnóstico da LVC para constituir uma

segunda geração de testes sorológicos da LVC por citometria de fluxo. Sob um novo


4

conceito biotecnológico, a tecnologia multiplex empregando microesferas funcionais

fluorescentes de poliestireno permite a construção de testes sorológicos por citometria

de fluxo configuráveis que podem determinar uma elevação no desempenho diagnóstico

dos ensaios. Esta nova plataforma é designada pelo nome de LeishPlex e os resultados

obtidos compõem um pedido de patente de invenção depositado pelo Núcleo de

Inovação Tecnológica e Empreendedorismo (NITE) da UFOP junto ao INPI (BR 10 2017

006706 8) sob o título “Teste sorológico multiplex por citometria de fluxo”.

KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA

5

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Aspectos clínicos-laboratoriais e considerações sobre o diagnóstico

da LVC

A LVC é um modelo de uma disfunção imunológica específica resultante do

parasitismo do sistema mononuclear fagocitário pela Leishmania infantum, produzindo

um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas.

Entre os principais sinais clínicos comumente observados destaca-se a presença

de alterações dermatológicas (opacificação e queda dos pelos, úlceras de pele, e

dermatites localizadas ou generalizadas), onicogrifose, perda de peso,

hepatoesplenomegalia, ceratoconjutivite, ceratite com opacificação da córnea, e paresia

dos membros posteriores (Ferrer, 1999; Reis et al., 2006a; Reis et al., 2006b; Solano-

Gallego et al., 2011). Com base nesta extensa apresentação sintomatológica, vale aqui

referendar o clássico estudo de Mancianti et al. (1988), que determinou três formas

clínicas básicas em: assintomáticos com ausência de sinais clínicos sugestivos de

infecção por L. infantum, oligossintomáticos com até três sinais clínicos, e sintomáticos

com vários sinais clínicos patognomônicos da doença.

No entanto, o diagnóstico clínico da LVC é difícil de ser determinado, e alguns

importantes fatores podem contribuir com esta constatação. Em áreas endêmicas, uma

considerável proporção dos cães pode ter contato com o parasito e não desenvolver

sinais clínicos da doença, permanecendo inaparente por longos períodos (Dantas-

Torres, 2007). Além disso, há grande porcentagem de cães assintomáticos ou

oligossintomáticos existentes em áreas endêmicas (Solano-Gallego et al., 2001; Otranto

et al., 2009; Paradies et al., 2010). Adicionalmente, outros cães podem apresentar sinais

clínicos comuns a outras patologias caninas como, por exemplo, a erliquiose e

babesiose (Dantas-Torres et al., 2008), ou ainda, podem estar relacionados à

desnutrição dos animais em regiões com baixo desenvolvimento socioeconômico (MS,

2006). Isto é, em áreas endêmicas, um cão que esteja infectado pode não apresentar

sinais clínicos categóricos da LVC, ou mesmo quando os apresentar, pode não ser

específico à infecção por L. infantum.

Diante da dificuldade de um diagnóstico clínico conciso, alguns autores

aconselham que determinados exames laboratoriais sejam adotados para auxiliar na

identificação clínica de cães infectados por L. infantum (Solano-Gallego et al., 2009;

Dantas-Torres et al., 2013). Quanto aos parâmetros bioquímicos, é comumente

observado alterações nas proteínas plasmáticas geralmente observadas em cães


6

oligossintomáticos e sintomáticos, dentre as quais se destacam o aumento sérico das

enzimas hepáticas [Alaninaminotransferase (ALT) e Aspartatoaminotransferase (AST)],

elevação da uréia e creatinina, diminuição de albumina sérica e da razão

albumina/globulina (Reis et al., 2006b; Giunchetti et al., 2008; Freitas et al., 2012). Por

sua vez, as avaliações dos parâmetros hematológicos revelem que animais das

variadas formas clínicas podem apresentar quadros de anemia e leucopenia, sendo

estes mais acentuados em cães sintomáticos. Os quadros de anemia correspondem a

um aspecto normocítico/normocrômico apresentando eritrócitos, hemoglobina e

hematócrito diminuídos (Nicolato et al., 2013). A leucopenia é determinada por

monocitopenia, eosinopenia e linfopenia e pode estar relacionada com possíveis

disfunções na medula óssea ocasionadas pelo intenso parasitismo neste tecido (Reis et

al., 2006b; Trópia de Abreu et al., 2011).

Todavia, vale salientar que apesar dos exames laboratoriais dos perfis

bioquímico e hematológico serem instrumentos prognósticos para a compreensão do

estado clínico de um cão infectado por L. infantum, estes não são propriamente

empregados como ferramentas de diagnóstico da LVC. Para a finalidade de diagnóstico,

a LVC carece de metodologias particulares para a confirmação dos casos.

Os métodos parasitológicos buscam conferir diretamente a presença do parasito

em material biológico obtido por punções ou biopsias de diferentes tecidos,

principalmente do fígado, baço, linfonodos, medula óssea ou pele (Sundar & Rai, 2002;

Maia & Campino, 2008). A partir da coleta do tecido, diferentes abordagens podem ser

utilizadas. Pode ser empregada a coloração dos esfregaços de tecidos em lâmina com

corantes de rotina tais como Giemsa, Wright e Panótico, ou pela cultura in vitro de

fragmentos dos tecidos ou aspirados em meios de crescimento (MS, 2006). No entanto,

essas abordagens não são normalmente empregadas na rotina, uma vez que o tempo

consumido para a confirmação do resultado é demorado, além de serem bastante

invasivos (Gontijo & Melo, 2004; Maia & Campino, 2008; Faria & Andrade, 2012). Em

comparação com outras metodologias de diagnóstico, a sensibilidade dos testes

parasitológicos é a que pode sofrer maiores variações tomando em consideração o grau

de parasitismo tecidual e tipo de tecido avaliado (Moreira et al., 2007). Assim, visto a

necessidade de se avaliar um grande número de animais em curto espaço de tempo,

os métodos parasitológicos são impraticáveis para aplicação em programas de saúde

pública.

O diagnóstico molecular é outro tipo de método parasitológico e é baseado na

detecção de sequências de DNA específicas do parasito, sendo a Reação em Cadeia

da Polimerase (PCR) a PCR em tempo real (qPCR) as principais técnicas utilizadas

(Gomes et al., 2008; Maia et al., 2009). No diagnóstico da LVC, essa vertente molecular


7

é fundamentada na amplificação de distintos oligonucleotídeos que formam uma

sequência conhecida do parasito. Várias sequências do genoma de Leishmania já foram

descritas como alvos de amplificação e incluem os genes para o RNA ribossomal, β-

tubulina, locus gp63, locus hsp70, cisteino-proteinases, e minicírculos do DNA de

cinetoplasto (kDNA) (Singh 2006b, Reithinger & Dujardin 2007).

Estes testes podem ser realizados em diferentes amostras biológicas, mas é

sabido que a sensibilidade da PCR pode variar de acordo com a amostra utilizada na

reação, (Reale et a., 1999; Lachaud et al., 2002; Strauss-Ayali et al., 2004; Baneth &

Aroch, 2008). Entretanto, em amostras de coleta menos invasiva, tais como aspirados

de medula, aspirados de linfonodos, biópsias de pele, sangue, urina, e swab com

amostras de mucosa canina (oral, nasal ou conjuntiva) apresentam sensibilidade inferior

àquela obtida com outros tecidos tais como fígado e baço (Solano-Gallego et al., 2007;

Leite et al., 2010; Lombardo et al., 2012; de Almeida Ferreira et al., 2012; Reis et al.,

2013).

Para superar estes problemas, uma variação da PCR que vem ganhando

destaque nos últimos anos trata-se do método de PCR em tempo real (qPCR), que como

principal vantagem sobre a PCR convencional, permite a quantificação de um número

mínimo de parasitos por reação que corresponde a poucos fentogramas de DNA

(Quaresma et al., 2009). O uso da qPCR no diagnóstico da LVC tem proporcionado um

ganho substancial de desempenho empregando amostras biológicas menos invasivas

(Manna et al., 2008; Paiva-Cavalcanti et al., 2009; Reis et al., 2013). Além disso, vale

aqui mencionar que um novo protocolo de qPCR por uma abordagem denominada High

Resolution Melting (HRM) foi recentemente proposto para o diagnóstico diferencial de

espécies de Leishmania (Zampieri et al., 2016), o que poderia auxiliar numa melhor

certificação dos perfis epidemiológicos da LVC futuramente.

Esta crescente busca por novos métodos moleculares para o diagnóstico da LVC

é amparada por importantes trabalhos que recomendam a incorporação de testes

moleculares para a confirmação da infecção por L. infantum (Baneth et al., 2008;

Solano-Gallego et a., 2011). Este fato se motiva na constatação de que no início da

infecção, a aplicação do diagnóstico molecular mostra-se mais sensível do que a

sorologia (Quinnell et al., 2001). De fato, diferentes estudos mostram que uma

considerável proporção de cães em áreas endêmicas pode apresentar diagnóstico

molecular positivo e sorologia negativa (Martin-Sanchez et al., 2001; Solano-Gallego et

al., 2001; Lachaud et a., 2002). De fato, em um estudo epidemiológico realizado em uma

área endêmica de Belo Horizonte, Coura-Vital et al. (2011a) relatou prevalência de cerca

de 22% relacionado ao diagnóstico molecular, enquanto que a sorologia alcançou

valores em torno de 8%.


8

Diante deste cenário, uma nova categoria clínica caracterizada por apresentar

PCR+/Sorologia‒ foi descrita por Coura-Vital et al. (2011b) e denominada assintomático

I (um) para distinguir dos cães assintomáticos clássicos (CA-II) cães soropositvos e

PCR+ anteriormente descritos por Mancianti et al. (1988) e revisados por Reis et al.

(2006). Entretanto, a PCR (ou alguma de suas variações) ainda não foi admitida como

uma técnica empregada no diagnóstico da LVC no âmbito de programas de controle,

uma vez que um dos questionamentos que emergem é o que fazer com estes cães

assintomáticos I.

Neste contexto, a detecção de anticorpos pelos métodos sorológicos torna-se

bastante relevante, e uma série de fatores destaca a sorologia como importante

ferramenta para o emprego em larga escala nas campanhas de controle.

Os ensaios sorológicos constituíram uma ferramenta essencial para a ampliação

do conhecimento sobre a resposta imune humoral em cães naturalmente ou

experimentalmente infectados por L. infantum (Abranches et al., 1991; Martinez-Moreno

et al., 1993; Genaro, 1993; Pinelli et al., 1994; Deplazes et al., 1995). Ao revisar diversos

trabalhos realizados pelo nosso grupo de pesquisa, torna-se possível inferir que a

resposta imune humoral dos cães naturalmente infectados e portadores das formas

clínicas (assintomática, oligossintomática, ou sintomática), mostram as seguintes

evidências: há aumento dos níveis de IgG total de acordo com a evolução clínica da

LVC; cães assintomáticos e oligossintomáticos apresentam aumentados níveis de IgG1;

a presença de IgG total, IgG2, IgA e IgE é mais evidente em cães sintomáticos (Reis et

al., 2006a; Reis et al., 2006b. Andrade et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Teixeira Neto

et al. 2010; Coura-Vital et al., 2011b). Adicionalmente, é importante relatar que a maior

concentração de anticorpos IgG anti-Leishmania também se correlaciona com a maior

capacidade do cão de independentemente da forma clínica transmitir o parasito ao vetor

Lutzomyia longipalpis (Costa-Val et al., 2007; Michalsky et al., 2007; Laurenti et al.,

2013).

Assim, a intensa atividade policlonal de células B com consequente elevação na

produção de imunoglobulinas é um ponto fundamental na evolução da história natural

da infecção por L. infantum, torna-se preponderante a escolha de metodologias

sorológicas como ferramenta essencial para o controle da LVC em campanhas de

saúde. Somando a esse fato, vale salientar que a coleta da amostra de sangue

necessária à realização destes testes é na maioria das vezes menos invasiva, e o

processamento do sangue por centrifugação é um procedimento muito mais simples do

que o cultivo em meios de cultura ou extração do material genético para a obtenção do

resultado.


9

2.2. Abordagem histórica das técnicas sorológicas clássicas empregadas

no diagnóstico da LVC

A reação de fixação do complemento (RFC) foi bastante realizada no

Brasil nas décadas de 1950 e 1960 (Nussenzweig et al., 1957; Pellegrino & Brener,

1958; Cunha et al., 1963;). Durante a década de 80 a RFC foi amplamente difundida

em institutos de pesquisas do exército dos Estados Unidos, sendo aplicada para a

detecção de anticorpos em cães experimentalmente infectados com L. donovani

(Flemmings et al., 1984), mas foi na LV que a RFC fora amplamente empregada para

fins diagnósticos (Hockmeyer et al., 1984; Smith et al., 1984; Pappas et al., 1985).

Atualmente a RFC encontra-se em desuso no mundo por ser uma técnica complexa e

trabalhosa, necessitando de um dispendioso tratamento prévio para a inativação do

complemento procedente da amostra de soro.

Dentre os métodos imunológicos mais utilizados atualmente, destaca-se a RIFI,

empregada a partir da década de 1960 (Duxbury & Sadun, 1964). Este teste, que utiliza

como antígeno o parasito íntegro, é amplamente utilizado em estudos epidemiológicos

(Alvar et al., 2004). Entretanto, trata-se de um teste sorológico dispendioso, que carece

um alto nível de habilidade técnica para execução do protocolo, e experiência para a

leitura correta da amostra (Gontijo & Melo, 2004). Apesar de a RIFI ter sido

recentemente entrado em desuso nas campanhas de controle do Brasil, alguns

pesquisadores ainda discutem seu uso (Ribeiro et al., 2013). Esse grupo de

pesquisadores se reuniu em um encontro chamado de Brasileish, e sugeriram que cães

soropositivos pela RIFI em ensaio sob diluição de 1:40 deveriam ser considerados

apenas suspeitos, e somente com diluições superiores a 1:160 evidenciaria um

resultado positivo. Apesar desta sugestão já ser habitualmente empregada no

continente europeu (Otranto et al., 2009; Solano-Gallego et al. 2011), a aplicabilidade

desta medida tornaria a operacionalidade da RIFI ainda mais complexa em um cenário

de uso em larga escala, sendo, portanto, mais adequadamente contextualizada

unicamente ao contexto de clínico-veterinário.

Os testes sorológicos de aglutinação Direct Agglutination Test (DAT) e Fast

Agglutination Screening Test (FAST), embora não tenham uso tão comum no

diagnóstico da LVC Brasil, são usualmente empregados para este fim em diferentes

regiões do velho mundo (Harith et al., 1989; Cardoso et al., 2004; Mohebali et al., 2004;

Schallig et al., 2004; Babakhan et al., 2009; Sousa et al., 2011). O fato do número

reduzido de estudos sobre estes testes no Brasil pode estar relacionado a algumas as

limitações sobre a praticidade operacional que remetem à necessidade de etapas

prévias para a inativação do sistema do complemento, que ocorre através da anulação

da atividade aglutinante dos pentâmeros de IgM para tornar o teste mais sensível às


10

aglutinações estabelecidas pela classe IgG. Enquanto que em alguns protocolos

sorológicos do DAT requerem incubação prévia das amostras com β-mercaptoetanol

(um composto altamente tóxico) (Ferreira et al., 2007), a sorologia pelo FAST

geralmente utiliza do aquecimento prévio (56°C) das amostras em banho-maria

(Cardoso et al., 2004; Schallig et al., 2002).

Vale aqui salientar que tanto os testes de RFC, RIFI, DAT e FAST são testes

qualitativos, ou semi-quantitativos, quando é realizada uma diluição seriada da amostra

observando-se a máxima diluição onde ocorre reação positiva.

Assim, pode-se afirmar que o teste de ELISA representou um importante avanço

tecnológico para o diagnóstico na LV e LVC, pois o seu resultado final é obtido por uma

reação enzimática colorimétrica expressa em densidade óptica, o que torna a leitura da

amostra mais objetiva e quantitativa (Voller et al., 1976). Além disso, seu protocolo pode

ser facilmente adaptado para a utilização de diferentes antígenos, e permite a avaliação

de um grande número de amostras em um curto espaço de tempo. No contexto do

diagnóstico da LV, o teste de ELISA foi pioneiramente descrito por Hommel et al. (1978),

e na LVC por Mansueto et al. (1982).

Algumas poucas adaptações nos testes de ELISA seguiram durante a década

de 80 (Badaró et al., 1986), e uma franca expansão na década de 90 foi observada.

Durante este período, estes testes começaram ser largamente empregados em estudos

sorodiagnósticos e epidemiológicos da LVC em todo o Brasil (Evans et al., 1990; Ashford

et al., 1993; Paranhos-Silva et al., 1996; Dietze et al., 1997). Estes trabalhos certamente

ajudaram a credenciar o teste de ELISA para o emprego como teste de rastreamento

de cães soropositivos de 2006 a 2011 (MS, 2006). Atualmente, o teste de ELISA é

empregado como teste sorológico confirmatório nas campanhas de vigilância da LVC

no Brasil (MS, 2011), e mostra-se como um teste confiável em laboratório de diferentes

níveis de complexidade da rede pública de saúde brasileira (de Arruda et al., 2013).

Por fim, mediante o amplo histórico de aplicação das metodologias clássicas

usualmente empregadas para a detecção de anticorpos na LVC, reforça-se a

importância dos testes sorológicos como ferramenta indispensável para o diagnóstico

de uma doença de grande importância para a medicina veterinária e para a saúde

pública. Isso certamente releva a necessidade de contínuos investimentos para a

melhoria destes testes.

2.3. Aprimoramento dos testes sorológicos usualmente empregados no

diagnóstico da LVC

Nos últimos anos, muito se tem feito em prol de alcançar melhor desempenho

de ensaios sorológicos na LVC.


11

A iniciar com o teste sorológico de aglutinação Direct Agglutination Test (DAT),

a melhoria deste ensaio tem sido atribuída a adaptações na preparação dos

componentes antigênicos do teste (Mohebali et al., 2015). O novo método para a

produção do antígeno para o DAT mostra a mesma sensibilidade, especificidade e

durabilidade em comparação com o método de DAT convencional, mas tem as

vantagens adicionais de redução de custos na produção de antígeno, a normalização

de alguns materiais específicos, mas principalmente se beneficia da e redução do tempo

de preparação do antígeno de 3 dias para apenas 5 horas. O aprimoramento do método

Fast Agglutination Screening Test (FAST) não foi tão contundente quanto a ponto de

mudar o panorama de produção do mesmo, mas alguns protocolos distintos podem ser

observados (Schallig et al., 2002; Babakhan et al., 2009).

O que foi avaliado no contexto da RIFI, e que é relevante tratar aqui, inclui o

desempenho do teste empregando diferentes preparações antigênicas, homólogas (L.

infantum) ou heterólogas (L. major-like). O estudo de Silva et al. (2012), mostrou que o

uso de antígenos homólogos foi responsável por uma melhoria na especificidade da

RIFI. Além disso, outro ponto que merece ser ressaltado no sentido de aprimoramento

deste teste sorológico trata-se da detecção de anticorpos por meio do uso de amostras

de soro canino ou eluato de sangue colhido em papel filtro. Figueiredo et al. (2010)

sugeriu que as amostras de sangue recolhidas em papel filtro apresentam pior

desempenho e não devem ser utilizadas em levantamentos epidemiológicos.

Por outro lado, em relação a metodologia de ELISA, o aprimoramento dos testes

ocorreu de forma aguda nos últimos 20 anos. Em um primeiro momento o

aperfeiçoamento dos testes se deu a partir do melhor domínio das ferramentas de

biologia molecular, e diversos estudos se ocuparam em buscar novos candidatos

antigênicos através da produção de proteínas recombinantes. Um exemplo clássico foi

o K39, uma proteína imunodominante específica do complexo L. donovani e que contém

epítopos repetitivos (Badaró et al. 1993). Esta proteína demonstrou bons resultados

quando pelo teste de ELISA, mostrando simplicidade e rapidez para o diagnóstico de

cães em grande escala (Scalone et al. 2002). Além disso, a combinação de diferentes

subunidades de antígenos recombinantes como rK9, rK26 e rK39 também foi utilizada

com o ensaio de ELISA, e esse procedimento aumentou a sensibilidade deste teste

sorológico (Rosati et al. 2003).

Em um segundo momento, após a era pós-genômica, duas estratégias foram

determinantes para os avanços na evolução dos ensaios sorológicos. Tanto por uma,

quanto pela outra, destaca-se a participação do vasto conhecimento produzido no Brasil

e, desta forma, o presente trabalho se aterá a apresentar os avanços obtidos neste país.


12

Uma das estratégias trata-se das abordagens imunoproteômicas, que

constituem uma série de técnicas que se voltam para a separação, identificação e

quantificação de proteínas, permitindo a realização de estudos com as mais diversas

aplicações na área biológica, incluindo o aprimoramento de testes diagnósticos para a

LVC. Neste contexto, um grande número de proteínas que apresentam considerável

potencial de reconhecimento de anticorpos foi mostrado por alguns pesquisadores

brasileiros (Ferraz-Coelho et al., 2009; Coelho et al., 2012 Braga et al. 2014).

De forma mais recente, com o domínio das ferramentas de bioinformática, uma

potente estratégia para a descrição e obtenção de novos antígenos, marcou um novo

salto tecnológico para o aprimoramento dos ensaios sorológicos. A predição de epítopos

imunorreativos com células B pela bioinformática foi capaz de gerar um grande volume

de novos candidatos antigênicos para o diagnóstico sorológico da LVC. Os antígenos

obtidos por aplicação da bioinformática pode fornecer diferentes proteínas

recombinantes (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012; Martins et al., 2013; Souza et

al., 2013; Menezes-Souza et al., 2015), peptídeos sintéticos (Costa et al., 2011; Faria et

al., 2011; Chavez-Fumagalli et al., 2013; Costa et al., 2013; Toledo-Machado et al.,

2015), ou mesmo por proteínas multiepítopos (Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015).

Mediante a todo este repertório, destaca-se alguns importantes antígenos que

ganharam espaço na literatura. Dois destes antígenos são as proteínas recombinantes

rLci1A e rLci2B, que apresentam homologia com duas importantes proteínas do

complexo L. donovani aplicadas no diagnóstico da LVC. A proteína rLci1A tem

homologia com a proteína de choque térmico Heat shock protein 70 (HSP70), enquanto

que a rLci2B tem homologia a proteína do citoesqueleto da classe das cinesinas Kinesin

39 (K39). Estes dois antígenos mostraram excelente acurácia no diagnóstico sorológico

da LVC (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012; Fraga et al., 2014). Outras duas

proteínas recombinantes em evidência na literatura foram originadas por genes

sintéticos elaborados através da combinação das sequências de codificação de

peptídeos com potencial antigênico (Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015). A proteína

PQ20 abordada em Faria et al., 2015, utilizou-se de 20 sequências codificadoras de

epítopos de células B e T estudas previamente em Costa et al. (2011). A proteína

quimérica C1 tratada em Fonseca et al., (2014), é uma proteína com função

desconhecida que gerou diversos peptídeos reportados no trabalho de Faria et al.,

(2011). Estas proteínas evidenciaram uma conveniência relacionada à sensibilidade de

detecção dos animais assintomáticos na LVC.

Finalmente, sobre o aprimoramento dos teste rápidos de diagnóstico sorológico

na LVC, observa-se que estes testes variam essencialmente nas características dos

suportes imunocromatográficos no qual a proteína recombinante K39 é fixada. A fixação


13

do antígeno em uma faixa de nitrocelulose é comum ao Teste Rápido Anticorpo

Leishmania donovani − TRALd (Badaró et al., 1996), e ao Kalazar DetectTM (Lemos et

al., 2008; Lima et al., 2010; Zanette et al., 2014). A associação de outros antígenos ao

K39, tais como o K9 e/ou K26 é também verificada por outras condições de suporte

imunocromatográfico, como no teste proposto por da Costa et al. (2003), bem como no

mais novo teste, o DPP – Dual Path Plataform (Grimaldi et al., 2012). Apesar das

distintas vias para se realizar um teste sorológico imunocromatográfico rápido para LVC,

um consenso geral indica que o desempenho na acurácia diagnóstica destes testes é

útil para confirmação da infecção em casos clínicos suspeitos, mas a sensibilidade para

a detecção de cães assintomáticos ainda é muito baixa para estudos epidemiológicos

em grande escala (Quinnell et al., 2013).

Mediante o exposto, apesar do aperfeiçoamento dos testes sorológicos alcançados

com uma variedade de antígenos estudados, bem como das variações técnicas, a

busca por melhorias no diagnóstico sorológico da LVC ainda carece de maiores

progressos para configurar testes com maior acurácia.

2.4. A necessidade de elevada acurácia para o diagnóstico sorológico da

LVC

O termo acurácia refere-se à quantidade de resultados corretos de um teste em

comparação aos resultados do padrão de referência (Bossuyt et a., 2003). A acurácia

do diagnóstico pode ser expressa em uma série de parâmetros, incluindo a sensibilidade

e especificidade, valores preditivos positivos e negativos, razões de verossimilhança e

as áreas sob as curvas Receiver Operating Characteristc (Griner et al., 1982).

Entretanto, é importante salientar que as medidas de precisão do teste pode variar entre

diferentes estudos. A variabilidade pode se originar por diferenças entre os grupos de

indivíduos usadas no estudo, diferenças de fatores ambientais, diferenças na

prevalência da doença, assim como e diferenças nos protocolos de ensaio ou em

critérios de positividade do teste (Irwig et al., 2002).

A acurácia dos estudos diagnósticos da LVC apesar de revelarem uma

determinada e esperada variabilidade entre os métodos de diagnóstico sorológicos,

chama a atenção a notória influência de algumas limitações comuns. Essas limitações

podem ser usualmente observadas em métodos convencionalmente adotadas pelo

mundo, assim como nos métodos sorológicos oficialmente recomendadas pelo

Ministério da Saúde (MS) do Brasil.

A principal deficiência na acurácia diagnóstica da LVC trata da baixa

sensibilidade de detecção de casos assintomáticos da doença, e é observada tanto nos


14

testes rápidos que empregam antígenos recombinantes tais como o DPP (Lemos et al.,

2008; Grimaldi et al., 2012; Schubach et al., 2014), assim como nos testes

convencionais de ELISA e RIFI, que empregam antígenos totais de Leishmania sp

(Mettler et al., 2005; Lira et al., 2006; Porrozzi et al., 2007; Ferreira et al., 2007). Além

desta comum constatação, os testes de ELISA e RIFI mostram baixa especificidade

relacionada à reatividade cruzada com anticorpos originários de outras infecções

caninas, tais como por Babesia canis e Ehrlichia canis, bem como por outras

tripanossomíases, como na infecção por Leishmania braziliensis, Trypanossoma cruzi,

e T. caninum (Lira et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Alves et al., 2012; Laurenti et al.,

2014). Adicionalmente, a possibilidade de soroconversão após a vacinação contra LVC

mostra-se como uma preocupante questão que pode interferir na acurácia dos testes de

diagnóstico sorológico (Romero et al., 2010). No Brasil já são documentadas evidências

de falhas de alguns testes mediante a imunização canina pela vacina Leishmune®

(Marcondes et al., 2013; Ribeiro et al., 2015).

Sendo assim, ainda há um extenso caminho a ser seguido no sentido de

desenvolver um teste diagnóstico que forneça melhor acurácia, e esta necessidade tem

sido cada vez mais discutida e invocada pela comunidade científica (Dantas-Torres et

al., 2012; Ribeiro et al., 2013).

2.5. Atuais perspectivas biotecnológicas na construção de metodologias

sorológicas para o diagnóstico da LVC

Diante da clara necessidade de alcançar elevada acurácia, diversas

metodologias sorológicas vem sendo propostas nos últimos anos e a construção de

testes imunocromatográficos rápidos tem sido bastante explorada.

Recentemente, foi descrito por um grupo de pesquisadores brasileiros, um

ensaio denominado Multi-antigen Print Immunoassay (MAPIA) que constitui uma

plataforma de teste sorológico rápido capaz de detectar simultaneamente a resposta da

amostra de soro a 12 antígenos que revestem uma única tira de nitrocelulose (Oliveira

et al., 2015). No entanto, apesar da combinação de vários antígenos a sensibilidade não

ultrapassou 81.0%. Além disso, a leitura de um teste rápido com múltiplos antígenos em

uma única fita de nitrocelulose pode apresentar viés de interpretação do resultado, uma

vez que a intensidade de coloração das áreas reativas varia de forma considerável entre

os distintos antígenos. Isto torna a leitura de um certo modo subjetiva, visto a dificuldade

na determinação de um padrão de positividade único.

Utilizando os antígenos recombinantes rLci1A e rLci2B para construção de um

teste rápido pela tecnologia Dual Path Plattform (DPP), a mesma empregada pela

Biomanguinhos com a proteína recombinantes K28, observou-se que embora a


15

associação destes dois recombinantes forneça uma melhora no desempenho

diagnóstico em relação à avaliação individual de cada antígeno, a sensibilidade deste

teste ainda mostrou-se menor do que à do DPP (K28) oficialmente adotado no Brasil.

De forma semelhante ao encontrado pelo MAPIA, que também utiliza os recombinantes

rLci1A e rLci2B em sua composição, o DPP (rLci1A/rLci2B) mostrou sensibilidade de

83.0%. A especificidade, tanto do MAPIA, quanto do DPP (rLci1A/rLci2B), revelaram

elevados valores (Fraga et al., 2014; Oliveira et al., 2015).

Em paralelo ao desenvolvimento de testes rápidos com fundamentos já bem

definidos como o caso da fixação de antígenos à fita de nitrocelulose e a Dual Path

Plattform, o surgimento de novos conceitos de plataformas diagnósticas é crescente, e

a construção de Biosensores pela técnica de Ressonância de Plasmóns de Superfície

(SPR) vem ganhando destaque, inclusive no âmbito do diagnóstico da LVC (Souto et

al., 2013; Souto et al., 2015). Estes testes permitem uma análise sorológica sem a

necessidade de marcadores químicos e/ou biológicos, com capacidade de detectar

analitos em níveis nanomolares, aumentando a sensibilidade (Souto et al., 2013; Souto

et al., 2015) o que poderia aumentar a capacidade de detecção de cães assintomáticos.

Entretanto, maiores estudos ainda são necessários para a determinação da acurácia

diagnóstica obtida por testes sorológicos com os Biosensores SPR.

Outra vertente que ganhando destaque ultimamente, trata-se da sorologia por

citometria de fluxo (CF) para o diagnóstico de doenças infecto-parasitárias. Essa

abordargem se deu por iniciativa pioneira do Dr. Olindo Assis Martins-Filho do Centro

de Pesquisas René Rachou, pesquisador associado ao nosso grupo de pesquisa

(Martins-Filho et al., 1995). Por esta estratégia, novas perspectivas foram abertas no

sentido do estabelecimento de técnicas diagnósticas de alta eficiência.

Esta linha de pesquisa liderada por Martins-Filho na FIOCRUZ e pelo Dr. Reis

na UFOP já perdura por mais de uma década e estabeleceu inovações metodológicas

aplicadas ao diagnóstico e monitoração de doenças infecto-parasitárias de interesse na

saúde pública, incluindo a doença de Chagas (Vitelli-Avelar et al., 2002; Vitelli-Avelar et

al., 2007; Matos et al., 2011), a Leishmaniose Tegumentar Americana Humana (Rocha

et al., 2002; Rocha et al., 2006; Pereira et al., 2012), a Leishmaniose Visceral Humana

(Lemos et al., 2007; Pissinate et al., 2008), e a Leishmaniose Visceral Canina (Carvalho-

Neta et al., 2006; Andrade et al., 2007; Andrade et al., 2009; Ker et al., 2013a; Ker et al.,

2013b; Sousa et al., 2013).

No tocante ao diagnóstico da LVC, a sorologia por citometria de fluxo tem

mostrado grande potencial, e gerou um diagnóstico preciso em todas as formas clínicas

da LVC, incluindo os casos assintomáticos, e, além disso, apresentou ausência de

resultados falso-positivos em cães vacinados e mínima reatividade cruzada contra


16

outros patógenos caninos (Andrade et al., 2009; Ker et al., 2013b). Esses resultados

foram alcançados utilizando de uma preparação antigênica composta por promastigotas

de L. infantum. Recentemente, a sorologia por CF vem ampliando seu portfólio de

ensaios através do uso de microesferas de níquel revestidas com antígenos

recombinantes de Leishmania (Sousa et al., 2013).

Embora importantes avanços tecnológicos tenham ocorrido, ainda não existe um

método absolutamente preciso para o diagnóstico da LVC. Atualmente, permanece o

desafio para obtenção de um método satisfatoriamente sensível e específico. Neste

cenário o presente trabalho buscou melhorar os aspectos biotecnológicos da sorologia

por citometria de fluxo, seja a que emprega promastigotas fixadas gerando um teste que

denominamos de LeishFlow, ou pelo emprego de microesferas de poliestireno

acopladas com antígenos recombinantes, gerando o LeishPlex.

A crescente contribuição alavancada pela sorologia por citometria de fluxo

permitiu não somente oferecer novas perspectivas para o diagnóstico da LVC, mas se

propôs a avançar no desenvolvimento de protótipos de kit de diagnóstico para serem

testados em estudos multicêntricos em nível de saúde pública, ou seja, em larga escala.

Todos os avanços biotecnológicos que o presente estudo trouxe a luz vieram a contribuir

definitivamente para um importante ponto que se assemelha ao que ocorreu com a

ELISA na década de 80 e 90 – A democratização da sorologia por citometria de fluxo no

Brasil e no Mundo.

KER, H.G. JUSTIFICATIVA

17

3. JUSTIFICATIVA

A leishmaniose visceral canina é endêmica em muitas regiões do mundo e no

Brasil. Nessas áreas, a elevada taxa de infecção em cães está associada com o maior

risco de doença humana. Até o momento não existe alternativas terapêuticas capazes

de conduzir a cura parasitológica em cães infectados e consequentemente reverter seu

papel de reservatório no ciclo de transmissão. Apesar da existência de alternativas

imunoprofiláticas comerciais anti-LVC, a vacinação de cães ainda não é recomendada

pelo Ministério da Saúde.

A necessidade da eliminação dos cães infectados, dada a sua relevância como

reservatório doméstico da doença humana, traz um grande impacto social. Assim, o

diagnóstico seguro tem fundamental importância na dinâmica de controle da doença em

áreas endêmicas. As falhas recorrentes pelo uso dos métodos sorológicos oficialmente

adotados podem levar a eutanásia de cães não acometidos pela LVC, comprometendo

a eficácia das ações de vigilância, gerando uma menor adesão da população ao

programa de controle proposto pelo Ministério da Saúde.

Além disso, a necessidade de ações de controle voltadas aos animais

sorologicamente positivos são relevantes dado pela clássica correlação entre a

severidade da infecção com a presença de anticorpos IgG e presença de sinais clínicos,

e somando-se a isto, mais dois importantes fatores: o fato de que a maior concentração

de anticorpos IgG anti-Leishmania estar correlacionada com uma elevada capacidade

do cão transmitir o parasito ao vetor Lutzomyia longipalpis; e a constatação de que os

animais assintomáticos com baixos títulos de anticorpos IgG anti-Leishmania também

são efetivos na transmissão do parasito ao vetor.

Neste contexto, torna-se urgente a pesquisa e disponibilização de novas

ferramentas aplicadas ao diagnóstico da doença com elevada capacidade de identificar

os animais infectados e discriminar cães sadios, animais vacinados ou, até mesmo,

portadores de outras infecções caninas, evitando assim falso-positivos por reações

cruzadas. Para isso, fundamentalmente, um teste diagnóstico deve apresentar elevada

acurácia.

O uso da citometria de fluxo é uma tendência mundial no desenvolvimento de

abordagens diagnósticas de alto desempenho, e pode contribuir com a melhoria da

confiabilidade e eficácia do diagnóstico da LVC. Portanto, encontra-se neste trabalho

um conjunto de inovações na busca de desenvolvimento biotecnológico de testes

sorológicos empregando a por citometria de fluxo. Tais testes poderão trazer um

impacto positivo sobre as ações voltadas ao controle da leishmaniose visceral.

KER, H.G. HIPÓTESE E OBJETIVOS

18

4. HIPÓTESE

A tecnologia multiplex empregando microesferas funcionais fluorescentes de

poliestireno permite a construção de um teste sorológico por citometria de fluxo que

proporciona elevado desempenho no diagnóstico sorológico da LVC.

.

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo Geral

Estabelecer inovações biotecnológicas que proporcionem o desenvolvimento de um

teste multiplex por citometria de fluxo de elevada acurácia no diagnóstico sorológico da

LVC.

5.2. Objetivos específicos

I. Avaliar o desempenho das metodologias que já foram e as que atualmente são

oficialmente adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil (RIFI, ELISA e DPP)

no diagnóstico sorológico da LVC;

II. Avaliar o desempenho do teste por citometria de fluxo LeishFlow no diagnóstico

sorológico da LVC;

III. Padronizar os procedimentos metodológicos para o acoplamento de proteínas

em microesferas funcionais para uso em ensaio citofluorimétrico;

IV. Padronizar os procedimentos metodológicos para pesquisa sorológica de

anticorpos caninos IgG utilizando sistemas antigênicos microesfera−proteína no

diagnóstico sorológico da LVC;

V. Avaliar o desempenho individual e combinado dos sistemas antigênicos

microesfera-proteína no diagnóstico sorológico da LVC;

VI. Comparar o desempenho das distintas metodologias deste trabalho no

diagnóstico sorológico da LVC.

KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS

19

6. MATERIAL E MÉTODOS

6.1. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: avaliação das

metodologias adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil

Empregando os testes recomendados pelo Ministério da Saúde foram realizados

ensaios sorológicos de forma a avaliar a especificidade dos testes Dual Path Platform

(DPP-LVC®), ELISA (EIE-LVC®), e RIFI (IFI-LVC®) produzidos pelo Instituto de

Tecnologia em Imunobiológicos de Bio-Manguinhos da Fundação Oswaldo Cruz

(FIOCRUZ). Estes experimentos seguiram as orientações listadas na bula dos kits.

Maiores detalhes sobre o material e os métodos utilizados neste estudo estão

apresentados no Apêndice A sob a forma de Artigo Original submetido à Revista de

Saúde Pública (online) da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo.

6.2. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o teste por citometria

de fluxo LeishFlow

O teste diagnóstico desenvolvido neste estudo e denominado LeishFlow basea-

se em uma reação sorológica entre os anticorpos caninos IgG anti-Leishmania a uma

matriz antigênica composta por antígenos totais de promastigotas de L. infantum

estabilizadas em conservante formaldeído 0.5%. Todo o processo que caracteriza este

teste teve pedido de patente depositado junto ao Instituto Nacional de Propriedade

Intelectual (INPI) sob o título “ Protótipo de um kit de diagnóstico da leishmaniose

visceral canina, empregando formas promastigotas fixadas pela técnica de citometria de

fluxo” como indicado no Apêndice B. O detalhamento dos materiais e dos métodos

referentes à padronização e adequação da reação sorológica com o teste LeishFlow

está apresentado no Apêndice C sob forma de artigo científico, publicado no formato

de artigo original na revista Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (Ker et al.,

2013a). Os dados relacionados à avaliação de desempenho diagnóstico do LeishFlow

estão apresentados no Apêndice D sob forma de artigo científico, publicado no formato

de artigo original na revista Clinical and Vaccine Immunology (Ker et al., 2013b).

6.3. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o desenvolvimento de

uma nova metodologia diagnóstica por citometria de fluxo e a geração de

uma plataforma diagnóstica – LeishPlex

As informações sobre o processo descrito a seguir tiveram pedido de patente de

invenção depositado junto ao INPI sob o título “Teste sorológico multiplex por citometria

de fluxo” como indicado no Apêndice E.


20

6.3.1. Animais experimentais

Para os ensaios sorológicos distintos empregados neste trabalho, foram

utilizados amostras biológicas de soros de cães (Canis familiaris), com idade variável e

sexos diferentes. Este material foi dividido em dois subconjuntos como ilustrado na

Figura 2. O subconjunto de amostras de soros caninos não infectados (NI) é formado

por três grupos: pelo grupo de cães não infectados (CNI); pelo grupo de cães do controle

de reação cruzada (CRC); e pelo grupo de cães do controle vacinado com diferentes

imunoprofiláticos anti-LVC (VAC). O subconjunto de amostras de soros caninos

infectados (INF) é formado por cães naturalmente infectados por L. infantum que foram

subdivididos em três grupos clínicos: cães assintomáticos (CA), cães oligossintomáticos

(CO) cães sintomáticos (CS). A seguir todos os grupos serão descritos detalhadamente.

Subconjunto de soros de cães não infectados (NI)

O grupo controle não infectado [CNI (n =30)], correspondem a cães nascidos,

criados, e mantidos no canil do Centro de Ciência Animal (CCA) da UFOP. Além de

Ouro Preto ser considerada área indene para LV este canil possuí uma barreira

composta de uma fina tela de aço inoxidável que impede a entrada de qualquer inseto.

Desta forma, estes cães comprovadamente apresentavam resultados negativos em

exames sorológicos (in house ELISA) e em testes moleculares por PCR realizados em

amostras de medula óssea. Além de negativos em testes sorológicos e moleculares, os

cães do grupo CNI também são negativos em exames parasitológicos realizados em

aspirado de medula óssea corado pelo Giemsa.

O grupo controle de reatividade cruzada [CRC (n=30)] foi composto por amostras

de soro gentilmente cedidas por diferentes laboratórios de pesquisa, e foi constituído de

cães naturalmente infectados com Leishmania braziliensis (n=10), Erlichia canis (n=10)

e Babesia canis (n=10). Essas amostras foram caracterizadas por apresentar resultados

positivos em exames sorológicos e PCR para a respectiva infecção, assim como por

resultados negativos em exames específicos para detecção de infecção por L. infantum

(in house ELISA e PCR).

O grupo controle vacinado (VAC) foi constituído de soro de animais nascidos,

criados, e mantidos no CCA da UFOP, e que foram submetidos a diferentes protocolos

de vacinação contra LVC utilizando as vacinas Leish-Tec® (n=10), Leishmune® (n=10) e

LBSap (n=10). Antes da vacinação, todos os animais apresentavam resultados

negativos por exame sorológico (in house ELISA), e por exame molecular (PCR de

medula óssea). As amostras de soro empregadas neste estudo foram coletadas 100

dias após o protocolo completo de vacinação. Para as vacinas Leish-Tec® e

Leishmune®, a imunização seguiu as normatizações descritas na bula dos respectivos


21

fabricantes, exceto para LBSap, cujo protocolo de imunização foi descrito por Roatt et

al. (2012).

Subconjunto de soros de cães infectados (INF)

Compõem este subconjunto, soros de 60 cães provenientes da área endêmica

de Belo Horizonte recolhidos pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ-BH) durante

campanhas de vigilância e controle do município no ano de 2010. Estes animais são

caracterizados por apresentarem exames sorológicos positivos para LVC [sorologia em

papel filtro − ELISA (EIE-LVC®) e RIFI (IFI-LVC®) − realizado no CCZ-BH], bem como

positivos por exames moleculares (qPCR − realizado no LIMP/UFOP) em pelo menos

um tecido (pele, baço, fígado, medula óssea e linfonodo poplíteo) utilizando

oligonucleotídeos específicos para L. infantum. Além disso, seguindo com a

classificação clínica proposta por Mancianti et al. (1988) e revista por Reis et al. (2006),

os cães foram subdivididos em grupos de cães assintomáticos [CA (n =20)],

caracterizados pela ausência de sinais clínicos; cães oligossintomáticos (CO (n =20)],

caracterizados por apresentarem de 1 a 3 sinais clínicos da doença; e cães sintomáticos

[CS (n =20)], caracterizados por apresentarem mais de 3 sinais clínicos da LVC. Cabe

aqui mencionar que foram realizados exames parasitológicos nestes cães (esfregaços

de tecidos corados pelo Giemsa e/ou isolamento em cultura com meio LIT), dos quais

foram observados 35 animais positivos, em pelo menos 1 dos testes parasitológicos

realizados. Os 60 animais do subconjunto INF foram estudados em trabalhos prévios do

LIMP da UFOP com aprovação no Comitê de Ética da UFOP (Parecer 2007/83 - Anexo

A), bem como pelo Comitê de Ética da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (Parecer

001/2008 - Anexo B).

A Figura 1 apresenta o esquematicamente o panorama dos grupos de soros

empregados no estudo da nova metodologia diagnóstica por citometria de fluxo.

Figura 1: Panorama dos grupos de soros empregados neste estudo.

Soroteca para o estudo

LeishPlex

n = 150

Controle não

infectado (CNI)

n = 30

Controle de reação

cruzada (CRC)

n = 30

Cntrole vacinado

(VAC)

n = 30

Subconjunto de cães

não infectados n = 90

Leishmune®

n =10

Leish-Tec®

n = 10

LBSap

n =10

L. braziliensis

n =10

E. canis

n =10

B. canis

n =10

Subconjunto de cães

infectados

n = 60

Assintomáticos

(CA)

n = 20

Oligossintomáticos

(CO)

n = 20

Sintomáticos

(CS)

n = 20


22

6.3.2. A tecnologia Cytometric Bead Array (CBA)

O sistema BD™ CBA Flex Set (BDTM Biosciences, San Diego, California, EUA)

fornece um menu aberto e configurável de reagentes projetados para criação de ensaios

multiplex. Cada microesfera possui intensidade de fluorescência única, determinado por

um nível discreto de marcação fluorescente, de modo que pode ser distinguida pela sua

intensidade de fluorescência medida no canal de fluorescência FL3 ou FL4 do citômetro

de fluxo (Figura 2). Microesferas com intensidade de fluorescência diferentes podem ser

combinadas para criar um ensaio sorológico do tipo multiplex.

Figura 2: Painel dos tipos distintos de microesferas que compõem o kit BD™ CBA Flex Set. As

letras (A−E) e números (1−6) são empregados para diferenciar as microesferas quanto às suas

características de fluorescência medidas no canal de fluorescência 3 - FL3 (fluorescência

vermelha) x fluorescência 4 - FL4 (fluorescência violeta).

O acoplamento de proteínas às microesferas funcionais do CBA ocorre a partir

de uma ligação covalente estável entre os grupamentos amina das proteínas e os

grupamentos sulfidrila das microesferas. O protocolo de acoplamento baseou-se nas

informações técnicas presentes no Techniques for Immune Function Analysis (Becton

& Dickinson, Application Handbook, Second Edition), com algumas modificações feitas

para este estudo. De forma geral, o mecanismo de acoplamento de proteínas às

microesferas funcionais CBA pode ser dividido nas 3 etapas ilustradas na Figura 3, e

compreende: (i) o preparo da microesfera; (ii) o preparo da proteína; (iii) a conjugação

da microesfera à proteína. A primeira etapa é caracterizada pelo preparo da microesfera

com o reagente Ditioteitrol (DTT), responsável pela redução do grupo dissulfeto

presente na superfície das microesferas e formação de um grupo sulfidrila. A segunda

etapa da reação, que compreende o preparo da proteína, é caracterizada pela reação

da amina primária presente na porção terminal da proteína com uma hidroxisuccinamida

da molécula de Sulfosuccinimidil 4-N-maleimidometil ciclohexano 1-carboxilato (Sulfo-

SMCC) formando um grupo maleimida, que caracteriza-se por ser altamente reativo com

A

B

C

D

E

1 2 3 4 5 6

105

104

103

102

105104103102

FL4

FL3


23

grupos sulfidrilas. A terceira e última etapa deste mecanismo trata da formação da

ligação sulfidrila-maleimida que é estabilizada na presença de N-Ethylmaleimida (NEM),

formando ligações tio-éster estáveis.

Figura 3: Etapas para acoplamento de proteínas a microesferas funcionais do kit BD™ CBA Flex

Set. O DTT reduz o grupo dissulfeto formando grupos sulfidrilas, que são reativos com o grupo

maleimida inserido na porção aminoterminal da proteína por meio de uma reação química com

Sulfo-SMCC. A ligação sulfidrila-maleimida é estabilizada por tratamento com o NEM.

6.3.3. Padronização do acoplamento de proteínas às microesferas

funcionais CBA

Como parte importante que compôs o desenvolvimento metodológico, o plano

inicial de trabalho contou com a elaboração de um protocolo de acoplamento que

utilizou-se de um suporte proteico genérico, neste caso, a soro albumina bovina (bovine

seroalbumin - BSA). Esta estratégia visou o acerto da padronização do acoplamento de

proteínas a microesferas CBA em menor custo e principalmente sem consumir estoque

de antígeno recombinante, bem como dos soros caninos. Para iniciar os experimentos

de padronização da tecnologia, foi escolhido a microesfera C7 do kit BD™ CBA Flex

Set.

O preparo das microesferas C7 iniciou-se com uma sonicação em banho

ultrassônico (Branson 1510 DTH Ultrasonic Cleaner - Brason Sonic Power Co., EUA)

por 1 minuto em uma frequência de 40 Hertz. As microesferas foram homogeneizadas

em vórtex por 1 minuto e 30 segundos, e 75µL das microesferas C7 foram transferidas

para um microtubo de 1,5mL. Em seguida, adicionou-se 1,9µL de DTT 1M. A reação

para formação do grupo sulfidrila na superfície das microesferas ocorreu em um agitador

orbital por 1 hora a temperatura ambiente. Ao final desta etapa, realizou-se 3 lavagens

com 1mL de tampão de acoplamento coupling buffer (BDTM Biosciences, San Diego,

California, EUA) por centrifugação a 900 x g por 3 minutos. Ao fim da lavagem, o

sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e a suspensão de microesferas foi suspensa

Etapa 3: Conjugação microesfera-proteína.

Etapa 1: Preparo da microesfera CBA.

DTT

S-S SH

Etapa 2: Preparo da proteína.

Proteína

NH2

Sulfo-SMCCProteína N

H

SProteína

NH


24

em 50µL do coupling buffer. As microesferas tratadas na primeira etapa foram

armazenadas em geladeira até o momento do uso.

A segunda etapa referente ao preparo da proteína utilizou uma solução estoque

de BSA preparada na concentração de 1mg/mL. Para o desenvolvimento da reação,

empregou-se 90µL da solução estoque de BSA (1mg/mL) e 2µL da solução de Sulfo-

SMCC (2mg/mL) em incubação sob agitação orbital por 1 hora a temperatura ambiente

e ao abrigo da luz.

Após a conclusão deste processo, para a ligação da proteína à microesfera, o

conteúdo do tubo contendo as microesferas tratadas com DTT foi adicionado ao BSA

tratado com Sulfo-SMCC, rapidamente homogeneizado em vórtex, e incubado em

agitador orbital por 1 hora a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Ao fim do

processo, adicionou-se 2µL de NEM (2mg/ml) e a suspensão obtida foi novamente

incubada em agitador orbital por mais 15 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo

da luz. O material foi lavado 3 vezes com 700µL de storage buffer (BDTM Biosciences,

San Diego, California, EUA) por centrifugação a 1000 x g por 3 minutos. Após as

lavagens, aspirou-se o sobrenadante cuidadosamente e o pellet de microesferas foi

suspendido em 500µL de storage buffer (BDTM Biosciences, San Diego, California,

EUA). As microesferas permaneceram por um período mínimo de 18 horas a 4°C para

estabilização da ligação. Após este procedimento, com base nas informações do

fabricante, a concentração final de microesferas é de aproximadamente 3.0 x 106

partículas/mL.

A confirmação da estratégia de acoplamento foi realizada por uma reação

imunológica, através de incubação com diferentes concentrações de um anticorpo

monoclonal anti-BSA (Monoclonal Mouse Anti-Bovine Serum Albumin [Sigma-Aldrich,

Saint Louis, Missouri, EUA]) seguido de posterior incubação com um anti-IgG de

camundongo conjugado com isotiocianato de fluoroceína (FITC) (Goat Anti-mouse IgG

[whole molecule]−FITC [Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA]).

O protocolo de reação imunológica empregado para a confirmação iniciou-se

com a rápida homogeneização da microesfera C7 conjugada à BSA no vórtex e, em

seguida, no banho ultrassônico por 2 minutos (40 Hertz). As microesferas foram diluídas

na proporção de 1:50 v/v em wash buffer (BDTM Biosciences, San Diego, California,

EUA) e 50 µL foram adicionadas em microtubo de 0,5mL, correspondendo a

aproximadamente 4.500 microesferas por microtubo. Em seguida, adicionou-se 50 µL

do anticorpo anti-BSA (diluído em PBS 2% caseína 2% lecitina em títulos de 1:50; 1:100;

1:500; 1:1000) e uma incubação de 90 minutos foi realizada a temperatura ambiente e

ao abrigo da luz. Após este tempo, o conteúdo destes tubos foi transferido para

microtubos de 1,5mL, e então adicionou-se 700 µL do wash buffer (BDTM Biosciences,


25

San Diego, California, EUA) para lavagem do material, que ocorreu em centrifugação a

2000 rpm por 7 minutos. O sobrenadante foi aspirado, e outras duas lavagens foram

realizadas seguindo este mesmo processo. Ao fim da lavagem, adicionou-se 50 µL do

anticorpo secundário anti-mouse IgG FITC (diluído em títulos de 1:50, 1:100, 1:500 e

1:1000) e uma nova incubação de 90 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da

luz foi realizada. O procedimento de lavagem foi novamente realizado por 3 vezes. Após

a última lavagem, o sobrenadante foi aspirado deixando um volume aproximado de

200µL para leitura no citômetro de fluxo. A aquisição dos dados foi realizada no

citômetro de fluxo FACScalibur® (Becton Dickinson) empregando o software Cell Quest.

A análise dos dados foi feita através do software FlowJo® (FlowJo, Ashland, Oregon,

EUA).

Para análise dos dados foram adquiridas informações relativas ao tamanho

(Forward Scatter [FSC] – dispersão frontal), granulosidade (Side Scatter [SSC] –

dispersão lateral), e intensidade relativa de fluorescência do tipo 1 (FL1 - fluorescência

verde) de 2000 microesferas por amostra. A análise da reatividade de anticorpos foi feita

inicialmente pela seleção da população da respectiva microesfera em gráfico

bidimensional de densidade de FSC versus SSC (Figura 4A). Para avaliar a intensidade

média de fluorescência (FL1) da população selecionada, histogramas foram construídos

em função do número de microesferas. A verificação de acerto do acoplamento do BSA

às microesferas C7 se deu pela análise dos histogramas (Figura 4B, 4C e 4D), através

do estabelecimento de um marcador (M1) de reatividade no controle da reação. A

determinação de M1, evidencia o percentual de partículas positivas (PPF) obtidas

quando as microesferas C7 não foram incubadas com anticorpo anti-BSA, assim como

com o anti-mouse IgG-FITC (Figura 4B). A Figura 4C representa a frequência da

intensidade de fluorescência na ausência de incubação com o anticorpo monoclonal

anti-BSA, porém com a incubação com o conjugado anti-mouse IgG-FITC. Na presença

de incubação com o anticorpo monoclonal anti-BSA, seguido da marcação fluorescente

com anti-mouse IgG-FITC (Figura 4D). Esta sequência de gráficos confirmou, através

da interpretação dos valores medidos em PPF, que a estratégia de acoplamento

proposto no kit BD™ CBA Flex Set funcionou apropriadamente em nossas condições

laboratoriais, favorecendo a continuidade do desenvolvimento deste trabalho.


26

Figura 4: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da confirmação do

acoplamento de soroalbumina bovina (BSA) em microesferas C7 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)

Seleção da população de microesferas C7 utilizando-se os parâmetros de tamanho (Forward

scatter - FSC) e granulosidade (Side scatter-SSC). (B) Histograma de Fluorescência 1 – FL1

representando o percentual de partículas positivas (PPF) obtidos com o controle do conjugado

da reação; (C) histograma de FL1 na ausência de incubação com o anticorpo monoclonal anti-

BSA, seguido da marcação fluorescente com anti-mouse IgG-FITC; (D) histograma de FL1 na

presença de incubação com o anticorpo monoclonal anti-BSA, seguido da marcação fluorescente

com anti-mouse IgG-FITC. O posicionamento do marcador (M1) segue o critério de se obter no

máximo 1% de PPF para o controle do conjugado da reação, e é mantido para as demais

análises.

6.3.4. O acoplamento de proteínas recombinantes com potencial para

diagnóstico da LVC e o desenvolvimento de uma nova metodologia

diagnóstica por citometria de fluxo

Com o protocolo de acoplamento de uma microesfera a uma proteína

padronizado, a próxima etapa seguiu no sentido de desenvolver uma tecnologia

inovadora para diagnóstico da LVC. Assim, como parte integrante desta nova etapa,

testamos o acoplamento de distintos antígenos recombinantes a diferentes microesferas

funcionais CBA. Assim, a proposta da nova metodologia diagnóstica por citometria de

fluxo baseia-se em uma reação sorológica entre anticorpos caninos IgG anti-Leishmania

a uma matriz antigênica composta por microesferas funcionais acopladas a antígenos

com potencial antigênico para o diagnóstico da LVC

O acoplamento dos recombinantes deste estudo, os multiepítopos C1 e PQ20,

bem como de rLci1A e rLci2B, basearam-se nas mesmas condições de acoplamento

estabelecidas para a conjugação do BSA às microesferas C7. Com uma particularidade,

o processo de acoplamento de antígenos recombinantes às microesferas CBA exigiu

uma única adaptação ao protocolo: Visto que o sistema de produção de todas as

SS

C

FSC

AGate

99,7%

# d

e e

ve

nto

s

Intensidade de fluorescência FL1

B C D

M1 M1 M1

PPF = 0,68% PPF = 5,6% PPF = 90,1%


27

proteínas deste trabalho empregou tampão uréia 8M para solubilização e eluição dos

recombinantes, e observando que a etapa do acoplamento referente ao preparo da

proteína é caracterizada pela reação da amina primária presente na porção terminal da

proteína com uma hidroxisuccinamida da molécula de Sulfo-SMCC, a presença de uréia

torna-se um potente interferente nesta etapa. Assim, as proteínas passaram por um

processo de diálise para remoção da uréia. Alíquotas das proteínas foram dialisadas em

membrana semipermeável Spectra/Por® MWCO 12−14 (Spectrum Laboratories,

Rancho Dominguez, California, EUA) em tampão PBS pH 7.9, durante 24 horas, a 4°C

sob agitação. Após este processo, as proteínas foram recolhidas e dosadas em

Nanodrop e pelo método de Bradford (1976). Alíquotas das proteínas a 1mg/mL foram

preparadas e conservadas em freezer -20°C até o momento do uso para acoplamento

às microesferas CBA.

Após este processamento, cada proteína foi conjugada a um respectivo modelo

de microesfera funcional CBA, formando um sistema antigênico microesfera−proteína

(Tabela 1).

Tabela 1: Relação das microesferas e respectivo antígeno usado na construção dos sistemas

antigênicos microesfera−proteína deste estudo

Microesfera Antígeno recombinante Sistema microesfera−proteína

A4 rLci1A A4−rLci1A

E4 rLci2B E4−rLci2B

E7 C1 E7−C1

C6 PQ20 C6−PQ20

Os ensaios sorológicos empregando cada um dos sistemas foram padronizados

em placa de 96 poços em fundo em “U” e o protocolo experimental foi desenvolvido e

aplicado igualmente para todos os sistemas antigênicos.

Inicialmente, os sistemas antigênicos microesfera-proteína foram rapidamente

homogeneizados em vortex e, em seguida, por 2 minutos no banho ultrassônico. Uma

alíquota de 150μL foi retirada do respectivo sistema antigênico (aproximadamente

450.000 microesferas) e diluída em 5.000μL de PBS suplementado com 0.5% p/v de

BSA. Após breve homogeneização, os sistemas antigênicos foram distribuídos em

alíquotas de 50μL por poço (aproximadamente 4.500 microesferas) da placa de 96

poços com fundo em “U” (CostarTM, Corning® Life Science, New York, EUA). Em seguida

foram adicionados 50μL do soro canino previamente diluído em PBS contendo 2% de

caseína e 2% lecitina (títulos variando entre 1:50 ─ 1:12.800), e, em seguida, a placa foi


28

incubada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por 90 minutos. Após a incubação

com os soros, os sistemas antigênicos foram lavados três vezes com adição de 200μL

de PBS suplementado com 0.5% p/v de BSA, centrifugados a 2.200rpm por 10min a

24°C, seguido do descarte do sobrenadante. Para a etapa de marcação fluorescente,

após a última lavagem, foi adicionado em cada poço da placa uma quantia de 100μL de

anticorpo anti-IgG canino (específico para a porção Fc) marcado com isotiocianato de

fluoresceína-FITC (Bethyl® Laboratories Inc., Montgomery, Texas, EUA), previamente

diluído em PBS contendo 2% de caseína e 2% de lecitina (títulos variando entre 1:100

─ 1:8.000). Uma nova incubação a temperatura ambiente ao abrigo da luz por 90

minutos foi realizada. As microesferas foram novamente lavadas três vezes com 200μL

de PBS suplementado com 0.5% p/v de BSA, centrifugadas (2.200rpm, 10 minutos,

24°C,) e o sobrenadante desprezado. Em seguida, foram adicionados 180μL de PBS

suplementado com 0.5% p/v de BSA e a leitura foi realizada no citômetro de fluxo

modelo FACScalibur® (Becton Dickinson, San Jose, California, EUA). Na aquisição dos

dados foi empregado o software Cell-Quest® (Becton Dickinson, San Jose, California,

EUA) e para cada amostra individual foram adquiridas informações relativas ao

tamanho, granulosidade, e intensidade relativa de fluorescência de 2.000 microesferas

por leitura.

6.3.5. Análise dos dados obtidos no citômetro de fluxo

A análise dos dados contou com a aplicação do software FlowJo® (FlowJo,

Ashland, Oregon, EUA) e o esquema geral da análise dos sistemas

microesfera−proteína E7-C1, C6-PQ20, A4−rLci1A e E4−rLci2B estão representados

nas Figuras 5, 6, 7 e 8 respectivamente. A análise da reatividade de anticorpos foi feita

inicialmente pela seleção da população, da respectiva microesfera, em gráficos de

tamanho versus granulosidade (FSC X SSC), obtidos em função do número de

microesferas (Painel A). Para avaliar a intensidade média de fluorescência (FL1) da

população selecionada, histogramas de FL1 foram construídos em função do número

de microesferas (Painéis B, C e D). Os resultados das análises de fluorescência

apresentados pelas microesferas após incubação com pool de soros controles dos

grupos CNI (n = 3) e INF (n = 3) foram expressos sob a forma de percentual de partículas

fluorescentes (PPF). O PPF para cada amostra de soro foi determinado através do

estabelecimento de um limiar de negatividade (marcador M) em função da fluorescência

obtida para o controle do conjugado da reação (Painel B). É importante salientar que

para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 1% de

PPF em relação a este controle. Desta forma, a partir da determinação do marcador de

reatividade, foram obtidos os valores de PPF para amostras incubadas com pool de soro


29

do grupo CNI (Painel C), e do grupo INF (Painel D), seguida por marcação com anticorpo

anti-IgG canino conjugado ao FITC.


acoplamento da proteína recombinante C1 à microesfera E7 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)

Seleção da população de microesferas C1 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e

granulosidade (SSC); Histogramas de FL1 representando o percentual de partículas positivas

(PPF) obtidos com (B) o controle do conjugado da reação; (C) após a incubação com pool de

soros CNI; (D) após incubação com pool de soros INF.


acoplamento da proteína recombinante PQ20 à microesfera C6 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)

Seleção da população de microesferas C6 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e




SS

C

FSC

A

# d

e e

ven

tos


M - E7−C1

PPF = 0.465%

M - E7−C1

PPF = 34.3%

M - E7−C1

PPF = 93.8%

Gate

99,7%

B C D

SS

C

FSC

AGate

99,5%

# d

e e

ven

tos


B C

M - C6−PQ20

PPF = 41.9

M - C6−PQ20

PPF = 0.603%

D

M - C6−PQ20

PPF = 93.7%


30


acoplamento da proteína recombinante rLci1A à microesfera A4 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)

Seleção da população de microesferas A4 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e





acoplamento da proteína recombinante rLci2B à microesfera E4 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)

Seleção da população de microesferas E4 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e




Gate

99,6%

M - A4−rLci1A

PPF = 0.201%

M - A4−rLci1A

PPF = 1.57%

M - A4−rLci1A

PPF = 98.7%S

SC

FSC

A

# d

e e

ven

tos


B C D

M - E4−rLci2B

PPF = 3.67%

SS

C

FSC

A

# d

e e

ven

tos


B C D

M - E4−rLci2B

PPF = 99.2%M - E4−rLci2B

PPF = 0.286%

Gate

98,9%


31

6.3.6. Análise dos resultados

O estudo dos sistemas antigênicos microesfera−proteína gerou resultados

obtidos em três etapas distintas (Figura 9), cada qual com sua análise particular

descritas na sequência.

Figura 9: Fluxograma do processo da avaliação dos sistemas microesfera−proteína para

aplicação no diagnóstico da LVC.

6.3.6.1. Análises aplicadas à seleção das condições ideais para reação

sorológica

A determinação das condições ideiais para realização de uma reação sorológica

empregando sistemas antigênicos microesfera‒proteínas distintos se deu por uma

análise exploratória dos resultados obtidos em curvas de titulação de pool de soros

caninos do grupo CNI (n = 3) e do subconjunto INF (n = 3) frente a diferentes

concentrações do conjugado (anti-IgG canino marcado com FITC). Os 3 soros

selecionados do subconjunto INF correspondem a 1 soro do grupo CA, 1 soro do grupo

CO e 1 soro do grupo CS.

A seleção das condições ideais seguiram o mesmo critério estabelecido para o

teste por CF LeishFlow (Ker et al., 2013a), em que determina que um ponto ótimo da

curva de titulação deve corresponder a um título de soro que se encontra entre dois

outros títulos que apresentem excelente diferenciação de reatividade entre CNI e INF.

Isto é, esta região da curva de titulação deve apresentar diferenciação da reatividade

sorológica entre os pool de soro CNI e INF com uma amplitude de variação no PPF

superior a 90% (ΔPPF≥90).

6.3.6.2. Análises aplicadas à determinação do ponto de corte

Quando se tem uma variável contínua, resultado da aplicação de um teste

diagnóstico quantitativo, e se pretende transformá-la numa variável dicotômica, do tipo

doente / não doente, temos que utilizar um determinado valor na escala contínua que

discrimine entre essas duas classes. A esse valor determina-se o nome de ponto de

corte, que pode ser definido arbitrariamente pelo pesquisador dentre os valores da

Seleção das condições ideais para reação sorológica:

Titulação do soro e do conjugado

Determinação do ponto de corte:

Construção da receiver operating characteristic curve – curva ROC

Avaliação de desempenho:

Cálculo dos índices de sensibilidade, especificidade, acurácia, valorespreditivos e razões de verossimilhança


32

variável contínua. Neste trabalho, tratou-se do valor do PPF acima do qual o cão é

classificado como positivo (teste positivo, animal com a doença), e abaixo do qual é

classificado como negativo (teste negativo, ausência de doença). Foram avaliados

pontos de corte arbitrários que corresponderam a PPF≥20, PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50,

PPF≥60. A acurácia global em cada uma destas condições foi avaliada pela medida da

área sob a curva [area under curve (AUC)] geradas pela receiver operating characteristic

curve (curva ROC).

A curva ROC consiste na representação gráfica da sensibilidade (verdadeiro-

positivo) no eixo vertical, e o complemento da especificidade (taxa de falso-positivo) no

eixo horizontal. Neste trabalho, a curva ROC foi construída através dos resultados

gerados por um ensaio sorológico em amostras de animais do grupo CNI (n = 30) e do

subconjunto INF (n = 35) que apresentaram, respectivamente, resultados negativos e

positivos em exames parasitológicos (demonstração direta do parasito por microscopia

e/ou isolamento do parasito em cultura). Conforme estabelecido por Swets (1988), este

trabalho classificou cada ponto de corte como: sem valor (AUC=0,5); baixa acurácia

(0,5<AUC<0,7); de moderada acurácia (0,7<AUC<0,9); elevada acurácia (0,9<AUC<1);

ou perfeito (AUC=1). Na construção das curvas foi utilizado a versão 14.12.0. do

programa estatístico MedCalc®.

6.3.6.3. Análises aplicadas à avaliação de desempenho diagnóstico

A terceira etapa, referente a avaliação do desempenho foi determinada pelos

resultados obtidos um ensaio sorológico que utilizou todas as amostras de soro deste

trabalho. As análises foram incialmente realizadas em uma etapa exploratória por meio

da interpretação de gráficos de dispersão em função do PPF. Adicionalmente, cada

sistema microesfera−proteína teve seu desempenho estimado através dos cálculos da

sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia.

Os índices de desempenho foram obtidos utilizando-se o programa estatístico STATA

versão 10.0 (StataCorp, 2007).

Para avaliar o desempenho dos testes sorológicos por CF foram utilizados

índices de validade expressos em porcentagem e em chance, calculados a partir da

classificação dos resultados em quatro categorias de acordo com a presença (grupo

reativo) ou ausência da doença (grupo não-reativo). Tais categorias estão expressas na

Tabela 2 e foram definidas da seguinte forma: “verdadeiro-positivo” [VPos (a)] =

presença de infecção e teste positivo; “falso-positivo” [FPos (b)] = ausência de infecção

e teste positivo; “falso-negativo” [FNeg (c)] = presença de infecção e teste negativo e

“verdadeiro-negativo” [VNeg (d)] = ausência de infecção e teste negativo. Com base

nesses fundamentos, tabelas similares foram preenchidas de acordo com o modelo da

Tabela 2 com o número de ocorrências de cada uma das categorias (a, b, c, e d).


33

Tabela 2: Categorias de resultados do teste diagnóstico em uma população que inclui cães não infectados e cães infectados com L. infantum.

A sensibilidade é calculada pela relação a/(a+c) traduzindo, assim, a proporção

de cães portadores de LVC, nos quais o teste foi positivo. Já, a especificidade mostra a

proporção de cães sem infecção cujo teste é negativo sendo, portanto, determinada pela

relação d/(b+d). Cabe aqui ressaltar que estes índices são definidos a partir do eixo

vertical da tabela, que representa o resultado dos testes sorológicos obtidos no CCZ-

BH [ELISA (EIE-LVC®) e RIFI (IFI-LVC®) – sorologia por papel filtro] concomitantemente

com o qual os novos testes por CF em investigação foram comparados. Sendo assim,

em decorrência de serem calculadas a partir do eixo vertical, a sensibilidade e a

especificidade, não são afetadas pela variação da proporção entre cães não infectados

e infectados, ou seja, com a prevalência da doença. Desta forma, são consideradas

propriedades estáveis de um teste diagnóstico.

O valor preditivo de um resultado positivo - VPP e o valor preditivo de um

resultado negativo - VPN denominados de forma simplificada de valores preditivos

positivo e negativo são fornecidos, respectivamente, pelas relações a/(a+b) e d/(c+d)

traduzindo, assim, a proporção de cães com teste positivo que apresentam LVC e a

proporção de cães com teste negativo que não apresentam LVC. Os valores preditivos,

ao contrário da sensibilidade e especificidade, são definidos a partir do eixo horizontal

da tabela, portanto, variam com a proporção entre cães não infectados e infectados, ou

seja, com a prevalência da doença. Assim, são, consideradas propriedades instáveis de

um teste diagnóstico.

Neste contexto, os valores preditivos foram determinados considerando-se a

prevalência da doença neste estudo, isto é, valor dado pela razão a+c / a+b+c+d e que,

neste estudo, correspondeu a 40% (60/150). Adicionalmente, os valores preditivos

foram apurados considerando-se a prevalência da doença em cenários artificiais da

doença, em valores decrescentes determinados a partir da prevalência artificial do

estudo, que correspondem aos valores de 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% e 5%. Para

os cálculos, empregou-se o Teorema de Bayes, que é definido pelas fórmulas abaixo:

VPP =Sensibilidade x Prevalência

(Sensibilidade x Prevalência) + (1 − Especificidade) x (1 − Prevalência)

LVC TOTAL

REATIVO NÃO-REATIVO

TESTE POSITIVO VPos (a) FPos (b) (a+b)

TESTE NEGATIVO FNeg (c) VNeg (d) (c+d)

TOTAL (a+c) (b+d) (a+b+c+d)


34

VPN =Especificidade x (1 – Prevalência)

Espeificidade x (1– Prevalência) + (1 − Sensibilidade) x (Prevalência)

O índice de acurácia, por sua vez, indica a proporção de todos os resultados

corretos de um teste, ou seja, os “verdadeiro-positivos” e os “verdadeiro-negativos”.

Assim, constitui-se em um indicador do valor global do teste.

Outra forma de abordagem do desempenho de testes diagnósticos,

particularmente daqueles cujos resultados são expressos em escala contínua, consiste

na determinação das razões de verossimilhança (RVs) para diferentes resultados. A RV

para um determinado resultado do teste diagnóstico é expressa em chance e é definida

pela razão entre proporção de um referido resultado em cães portadores de LVC em

relação à proporção do mesmo resultado em cães não infectados. A RV negativa é

calculada pela relação (1 – Sensibilidade) / Especificidade e a RV positiva é dada pela

relação Sensibilidade / (1 – Especificidade).

Desta forma, as RVs expressam quantas vezes é mais provável (ou menos

provável) se encontrar um determinado resultado do teste em um cão portador de LVC

em relação a um cão não infectado.

Segundo a literatura, valores de RV negativa abaixo de 0,1 praticamente

confirmam a ausência de doença e valores de RV positiva acima de 10 praticamente

confirmam a presença de doença (Jaeschke et al., 1994b). Cabe ainda ressaltar, que

as proporções empregadas no cálculo das razões de verossimilhança são definidas a

partir do eixo vertical da Tabela 1 ou de tabelas semelhantes, não apresentando, assim,

variações em relação a mudanças na prevalência da doença em questão.

6.4. Comparação entre os testes sorológicos

Para as comparações entre os testes diagnósticos, utilizou-se as proporções de

concordâncias e a estatística Kappa. A interpretação de Kappa foi de acordo com a

seguinte escala: 1.00-0,81 excelente; 0,80-0,61 bom; 0,61-0,40 moderado; 0,40-0,21,

fraco; 0,20-0,0 ausência de concordância (Szklo & Nieto 2000).

KER, H.G. RESULTADOS

35

7. RESULTADOS

7.1. Avaliação das metodologias adotadas pelo Ministério da Saúde do

Brasil no diagnóstico da LVC

Os resultados e discussão dos ensaios sorológicos empregando os testes

oficiais RIFI (IFI-LVC®), ELISA (EIE-LVC®) e Dual Path Platform (DPP-LVC®), estão

apresentados no Apêndice A sob forma de artigo científico submetido à Revista de

Saúde Pública.

7.2. Avaliação do teste por citometria de fluxo LeishFlow no diagnóstico da

LVC

Os resultados seguidos da discussão da metodologia referente ao ensaio

sorológico de avaliação de desempenho diagnóstico pelo teste LeishFlow está

apresentado no Apêndice C sob forma de artigo científico, publicado no formato de

Original Article na revista Clinical and Vaccine Immunology (Ker et al., 2013b).

7.3. Desenvolvimento e avaliação de um novo teste multiplex por citometria

de fluxo utilizando sistemas microesfera−proteína no diagnóstico da LVC

e construção do LeishPlex

De forma a facilitar a interpretação dos resultados, bem como da discussão, os

resultados obtidos empregando os sistemas microesfera−proteína deste trabalho foram

separados em dois agrupamentos de acordo com a natureza dos antígenos. Um

agrupamento é constituído pelos sistemas antigênicos que empregaram as proteínas

multiepítopos recombinantes C1 e PQ20 (Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015). Um

outro agrupamento é composto pelos sistemas que utilizaram as proteínas

recombinantes rLci1A e rLci2B (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012).

7.3.1. Os sistemas microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20

As Figuras 10 e 11, representam o comportamento da reatividade sorológica

para os sistemas microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20 respectivamente.

Considerando os dois sistemas antigênicos, observou-se a ocorrência de diversos

títulos do pool de soros CNI com valores elevados de PPF (PPF˃90) nos títulos do

conjugado de 1:100, 1:500 e 1:1.000. Além disso, no título do conjugado de 1:2.000, é

possível verificar que a reatividade do pool de soros INF está bastante reduzida. Desta

forma, seguindo o protocolo delineado, não foi possível determinar uma faixa adequada

de reatividade diferencial (ΔPPF≥90) para o prosseguimento do trabalho.


36

Diante deste cenário e, buscando acertar na determinação das condições ideais

de reação sorológica, e principalmente diante da evidência dos elevados valores de PPF

relacionados ao grupo CNI, foram reduzidos o tempo das incubações com as amostras

de pool de soros e com conjugado, em 30 minutos (Figura Complementar I − Apêndice

F) e em 60 minutos (Figura Complementar II – Apêndice F).

Figura 10: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste sorológico por citometria

de fluxo realizado com o sistema microesfera-proteína E7−C1: pool de soros CNI ( ) e INF ( )

incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com isotiocianato de fluoresceína

(FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes (PPF).


de fluxo realizado com o sistema microesfera-proteína C6−PQ20: pool de soros CNI ( ) e INF

( ) incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com isotiocianato de

fluoresceína (FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes

(PPF).

Diluição do Soro

PP

F

Titulação 1:100 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:500 do conjugado IgG-FITC

Titulação 1:1.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:2.000 do conjugado IgG-FITC

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Titulação 1:100 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:500 do conjugado IgG-FITC

Diluição do Soro

PP

F


0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100


37

Apesar das tentativas que visaram ajustar na determinação das condições ideais

de reação sorológica (Figuras complementares I e II – Apêndice D), as curvas de

titulação revelaram que os sistemas E7−C1 e C6−PQ20 não foram capazes em

determinar uma faixa de excelente reatividade diferencial (ΔPPF≥90) entre os pool de

soros CNI e INF. Desta forma, como não foi possível estabelecer uma condição

adequada para realização da reação sorológica empregando estes sistemas

antigênicos, as etapas posteriores de determinação do ponto de corte, assim como da

avaliação de desempenho, não se justificaram.

7.3.2. Os sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B

As Figuras 12 e 13 representam o comportamento da reatividade sorológica

empregando os sistemas microesfera−proteína A4−rLci1A e E4−rLci2B

respectivamente. Os títulos do conjugado avaliados nesta etapa do estudo foram de

1:1.000, 1:2.000, 1:4.000 e 1:8.000.

O comportamento da reação sorológica do sistema A4−rLci1A mostrou que nos

títulos do conjugado de 1:1.000, 1:2.000 e 1:4.000, a reatividade sorológica em pool de

soros do grupo INF obteve valores elevados de PPF (correspondentes a PPF˃90), que

se mantiveram estáveis ao longo da curva de titulação. O título de 1:8.000 apresentou

redução decrescente dos valores de PPF, indicando que não representa uma boa

condição. Em relação ao pool de soros do grupo CNI, uma baixa reatividade

(correspondentes a PPF<10) é encontrada a partir do título de 1:800 para todas as

concentrações do conjugado.

A reatividade sorológica referente ao sistema E4−rLci2B, por sua vez, mostrou

elevados valores de PPF em pool de soros do subconjunto INF para todos os títulos do

conjugado (1:1.000, 1:2.000, 1:4.000 e 1:8.000). O pool de soros do grupo CNI, assim

como no sistema A4−rLci1A, apresentou baixa reatividade a partir do título de 1:800 em

todas as concentrações do conjugado.

Neste panorama, e atendendo ao critério descrito por Ker et al., 2013a, a

condição para realização da reação sorológica selecionada correspondeu pela titulação

do conjugado de 1:4.000, e o título do soro 1:1.600.


38


de fluxo com o sistema microesfera−proteína A4-rLci1A: pool de soros CNI ( ) e INF ( )


(FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes (PPF). O

sombreado cinza representa a faixa ideal de reatividade e a linha pontilhada destaca a diluição

do pool de soro selecionada.


de fluxo com o sistema microesfera−proteína E4−rLci2B: pool de soros CNI ( ) e INF ( )


(FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes (PPF). O

sombreado cinza representa a faixa ideal de reatividade e a linha pontilhada destaca a diluição

do pool de soro selecionada.

Baseando-se no mesmo critério descrito por Ker et al., (2013), que determina a

utilização de um título de soro que se encontra em meio a outro dois pontos com

excelente reatividade diferencial (ΔPPF≥90%), é possível eleger mais de uma faixa de

reatividade ideal para a realização de um bom ensaio sorológico. Tanto no sistema


Diluição do Soro

PP

F


0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100


Diluição do Soro

PP

F


0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100


39

microesfera−proteína A4−rLci1A (nos títulos de 1:1.000 e 1:2.000 do conjugado), quanto

no E4−rLci2B (no título de 1:8.000 do conjugado), seria possível selecionar distintas

faixas com excelente reatividade diferencial entre os pool de soros CNI e INF. No

entanto, as condições de 1:4.000 do conjugado e 1:1.600 do soro foram selecionadas

no sentido de propiciar um arranjo comum entre A4−rLci1A e E4−rLci2B que fosse mais

favorável à criação de um ensaio do tipo multiplex posteriormente. Em outras palavras,

optou-se por estudar inicialmente um ponto de excelente reatividade diferencial comum

entre dois sistemas, do que considerar outras opções que abordariam uma validação

individual do respectivo sistema antigênico.

Assim, sob as condições de reação sorológica com aplicação do conjugado no

título de 1:4.000, e dos soros no título de 1:1.600, seguiram-se os ensaios com as

amostras que mostraram exame parasitológico negativo no grupo CNI e positivo dentre

os cães do subconjunto INF para determinação do ponto de corte de acordo com os

valores estabelecidos neste trabalho (PPF≥20, PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50 e PPF≥60).

Respectivamente para os sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B, os resultados do ensaio

sorológico para construção da curva ROC e determinação do ponto de corte ideal

encontram-se representados na Figuras 14 e 15.

Figura 14: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema A4−rLci1A. (A) Reatividade das

amostras dos cães do grupo controle não infectado (CNI = ) e do subconjunto de cães

infectados (INF = ) nas diluições de 1:1.600 do soro e 1:4.000 do anticorpo conjugado com

isotiocianato de fluoresceína (FITC). Os resultados estão expressos como percentual de

partículas fluorescentes (PPF). (B) Curvas ROC construídas a partir da representação gráfica da

sensibilidade (verdadeiro-positivo) no eixo vertical, e o complemento da especificidade (taxa de

falso-positivo) no eixo horizontal. Os resultados estão determinados pela área sob a curva (AUC).

O sombreado cinza representa o ponto de corte selecionado.

PPF ≥ 20 PPF ≥ 30 PPF ≥ 40 PPF ≥ 50 PPF ≥ 60

100 - Especificidade

Se

ns

ibil

ida

de

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,983

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,986

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,943

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,943

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,986

CNI INF CNI INFCNI INF CNI INF CNI INF

0

20

40

60

80

100

PP

F

B

A

96.7%

100.0%

96.7%

97.1%

100.0%

97.1%

100.0%

91.4%

100.0%

91.4%


40

Figura 15: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema E4−rLci2B. (A) Reatividade das

amostras de cães do grupo controle não infectado (CNI = ) e do subconjunto de cães infectados

(INF = ) nas diluições de 1:1.600 do soro e 1:4.000 do anticorpo conjugado com isotiocianato

de fluoresceína (FITC). Os resultados estão expressos como percentual de partículas

fluorescentes (PPF). (B) Curvas ROC construídas a partir da representação gráfica da

sensibilidade (verdadeiro-positivo) no eixo vertical, e o complemento da especificidade (taxa de

falso-positivo) no eixo horizontal. Os resultados estão determinados pela área sob a curva (AUC).

O sombreado cinza representa o ponto de corte selecionado.

Como pode ser observado, tanto os testes conduzidos com o sistema A4−rLci1A

(Figura 14), quanto pelo sistema E4−rLci2B (Figura 15), apresentaram excelente

performance nas condições de ponto de corte avaliadas. Neste estudo, todos os pontos

de corte avaliados apresentaram valores de AUC superiores a 0,943

independentemente do sistema microesfera-proteína empregado, indicando que ambos

podem constituir um teste sorológico de elevada acurácia. Diante deste cenário, visando

a escolha do ponto de corte ideal de um teste diagnóstico para LVC, optou-se pela

utilização da faixa correspondente ao PPF≥40. Esta escolha, esta calcada no fato que

o PPF≥40 representou o primeiro ponto de corte que alcançou valor de especificidade

de 100.0%, e que manteve o valor máximo da sensibilidade (97.1%), para ambos os

sistemas antigênicos.

Sob esta condição de ponto de corte, o panorama geral do desempenho

diagnóstico do teste sorológico por citometria de fluxo utilizando o sistema A4−rLci1A

está apresentado na Figura 16. Este teste foi capaz de inferir 100,0% (30/30) dos cães

CNI como negativos, enquanto que 90,0% (54/60) das amostras do subconjunto INF

foram consideradas positivas (Figura 16A). Ao dividir o grupo de cães INF de acordo

com a classificação clínica (Figura 16B), observou-se que 80,0% (16/20) dos cães

assintomáticos foram positivos no teste, enquanto que 95,0% (19/20) dos cães

oligossintomáticos e sintomáticos foram considerados positivos. Ao analisar o grupo de

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,952

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,986

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,986

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,971

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,986

PPF ≥ 20 PPF ≥ 30 PPF ≥ 40 PPF ≥ 50 PPF ≥ 60


Sen

sib

ilid

ad

eP

PF

B

A

0

20

40

60

80

100

CNI INFCNI INF CNI INF CNI INF CNI INF

90.0%

100.0%

96.7%

97.1%

100.0%

97.1%

100.0%

97.1%

100.0%

94.3%


41

cães infectados com outros patógenos caninos (Figura 16C), todos as amostras de

grupo L. braziliensis apresentaram resultado negativo no teste com sistema A4−rLci1A.

Nas amostras de animais infectados com E. canis observou-se 30.0% (3/10) de

resultados negativos, enquanto que para B. canis correspondeu a apenas 20,0% (2/10).

Em relação aos cães imunizados (Figura 16D), o sistema A4−rLci1A mostrou que 70,0%

(7/10) das amostras de cães vacinados com Leish-Tec® e Leishmune® apresentaram

resultados negativos, e pela vacinação com LBSap observou-se 80,0% (8/10) de

resultados considerados negativos.

Figura 16: Avaliação de desempenho do sistema A4-rLci1A em ensaio sorológico por citometria

de fluxo no diagnóstico da LVC. Através do perfil de dispersão individual de cada amostra, e

considerando o ponto de corte de PPF≥40, os resultados foram obtidos empregando a diluição

padronizadas dos soros de 1:1.600 e do conjugado de 1:4.000. Os resultados estão expressos

como percentual de partículas fluorescentes (PPF). (A) Controle não infectado (CNI = ) e cães

infectados (INF = ) portadores de diferentes formas clínicas; (B) Cães do subconjunto INF

divididos de acordo com a classificação clínica da doença em: cães assintomáticos (CA = ),

cães oligosintomáticos (CO = ) e cães sintomáticos (CS = ); (C) Cães infectados com outros

patógenos caninos: L. braziliensis ( ), Ehrlichia canis ( ) e Babesia canis ( ); (D) Cães

vacinados contra a LVC: Leish-Tec® ( ), Leishmune® ( ) e LBSap ( ).

A Figura 17 ilustra o desempenho diagnóstico do sistema E4-rLci2B no

diagnóstico da LVC. Observou-se que 100,0% (30/30) dos cães CNI foram considerados

negativos, enquanto que nas amostras do subconjunto INF, 95,0% (57/60) mostraram

resultados positivos (Figura 17A). A divisão do subconjunto INF (Figura 17B) de acordo

com a classificação clínica revelou que 85,0% (17/20) das amostras dos cães

assintomáticos, e 100,0% (20/20) das amostras dos cães oligossintomáticos e

sintomáticos, revelaram resultado positivo. Os animais infectados com L. braziliensis

CA CO CS

PP

F

0

20

40

60

80

100

PP

F

CNI INF

0

20

40

60

80

100 A

B C D

L. braziliensis E. canis B. canis Leish-Tec® Leishmune® Lbsap

95.0% 95.0%

100.0% 30.0% 20.0%

100.0%

90.0%

80.0%

70.0% 70.0% 80.0%


42

assim como E. canis mostraram resultados negativos em 80,0% (8/10) das amostras,

enquanto que para B. canis observou-se em 60,0% (6/10) (Figura 17C). Nos animais

vacinados com Leish-Tec® e Leishmune®, a condição de teste com o sistema E4−rLci2B

revelou que 90,0% (9/10) das amostras apresentaram resultado negativo, ao passo que

nos cães vacinados com LBSap, 50,0% (5/10) das amostras foram negativas (Figura

17D).

Figura 17: Avaliação de desempenho do sistema E4-rLci2B em ensaio sorológico por citometria

de fluxo no diagnóstico da LVC. Através do perfil de dispersão individual de cada amostra, e

considerando o ponto de corte de PPF≥40, os resultados foram obtidos empregando a diluições

padronizadas dos soros de 1:1.600 e do conjugado de 1:4.000. Os resultados estão expressos

como percentual de partículas fluorescentes (PPF). (A) Controle não infectado (CNI = ) e cães

infectados (INF = ) portadores de diferentes formas clínicas; (B) Cães do subconjunto INF

subdivididos de acordo com a classificação clínica da doença em: cães assintomáticos (CA =

), cães oligosintomáticos (CO = ) e cães sintomáticos (CS = ); (C) Cães infectados com

outros patógenos caninos: L. braziliensis ( ), Ehrlichia canis ( ) e Babesia canis ( ); (D) Cães

vacinados contra a LVC: Leish-Tec® ( ), Leishmune® ( ) e LBSap ( ).

Visto a importância de se buscar melhor entender o desempenho do teste

LeishPlex, a Tabela 3 sumariza os resultados expressos pelos índices de sensibilidade,

especificidade e acurácia. O sistema A4−rLci1A mostrou sensibilidade de 91,7%,

especificidade de 74,4%, e a acurácia alcançou 80,7%. O sistema E4−rLci2B, por sua

vez, revelou desempenho superior, com sensibilidade de 95,0%, especificidade de

83,3%, e a proporção geral de acertos medidos pela acurácia foi de 88.0%.

Tabela 3: Desempenho dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B no diagnóstico da LVC

CNI INF

PP

F

0

20

40

60

80

100

CA CO CS

0

20

40

60

80

100

Leish-Tec® Leishmune® LBSapL. braziliensis E. canis B. canis

PP

F

A

B C D

85.0% 100.0% 100.0%

80.0% 80.0% 60.0% 90.0% 90.0% 50.0%

100.0%

95.0%


43

Teste Sensibilidade

(IC 95%) Especificidade

(IC 95%) Acurácia (IC 95%)

A4−rLci1A 91,7%

(81,9−96,4%) 74,4 %

(64,5−82,3%) 81,3 %

(74,3−86,8%)

E4−rLci2B 95,0%

(86,3−98,3%) 83,3 %

(74,3−89,6%) 88,0%

(81,8−92,3%)

IC, intervalo de confiança

A Tabela 4 ilustra os resultados dos valores preditivos calculados em diferentes

cenários de prevalência da LVC. Tomando-se em consideração a prevalência da doença

deste estudo (40%), os valores preditivos positivos (VPPs) indicam valores de 70,5% e

79,2% nos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B respectivamente. Ou seja, sob esta

condição, pode-se inferir que 29,5% dos resultados positivos pelo sistema A4−rLci1A

poderiam ocorrer em animais que não têm a doença, e aproximadamente 20,8% pelo

sistema E4−rLci2B. Já os valores preditivos negativos (VPNs) sinalizam que a

probabilidade de um cão com teste negativo realmente não ter a doença é de 93,1% e

96,2% nos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B respectivamente. Isto é, um resultado

negativo vaticina a não ocorrência da LVC com uma probabilidade superior a 90,0%

pelos dois sistemas antigênicos.

Tabela 4: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise dos sistemas

antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B em diferentes cenários de prevalência

Probabilidade Pré-Teste

A4−rLci1A E4−rLci2B

VPP VPN VPP VPN

40%* 70,5% 93,1% 79,1% 96,1%

35% 65,8% 94,3% 75,4% 96,8%

30% 60,5% 95,4% 70,9% 97,5%

25% 54,4% 96,4% 65,5% 98,0%

20% 47,2% 97,3% 58,7% 98,5%

15% 38,7% 98,1% 50,1% 98,9%

10% 28,5% 98,8% 38,7% 99,3%

5% 15,8% 99,4% 23,0% 99,7%

VPP, valor preditivo positivo; VPN, valor preditivo negativo; * Prevalência deste estudo

Adicionalmente, a interpretação dos cálculos dos valores preditivos em

diferentes cenários artificiais de prevalência da LVC é essencial para a compreensão do


44

possível comportamento dos sistemas antigênicos em situações comumente notadas

nas áreas endêmicas. Assim, assumindo quaisquer prevalência entre 5% e 40%, a

probabilidade de um cão com teste positivo apresentar a doença medida pelo VPP,

encontra-se entre 15,8% a 70,5% no sistema A4−rLci1A, e entre 23,0% e 79,1% no

E4−rLci2B. Por outro lado, o valor preditivo negativo (VPN) que indica a probabilidade

de um cão com teste negativo realmente não ter a doença encontra-se entre 93,1% e

99,4% no sistema A4−rLci1A, e entre 96,1% e 99,7% no E4−rLci2B. Diante do exposto,

é verificado que o sistema E4−rLci2B foi superior ao A4−rLci1A em todos os pontos

assumidos entre 5% e 40%, apresentando tanto maior VPP, quanto maior VPN. A figura

18 ajuda a melhor visualizar e interpretar as considerações acima.

Figura 18: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença. (A) Sistema

microesfera−proteína A4−rLci1A: Valores Preditivos Positivos ( ) e Valores Preditivos

Negativos ( ) ; (B) Sistema microesfera−proteína E4−rLci2B: Valores Preditivos Positivos ( )

e Valores Preditivos Negativos ( ). Os retângulos cinzas consideram os intervalos de

probabilidade pré-teste (prevalência) entre 5% e 40%.

Além das análises de desempenho expressas em porcentagem descritas, foi

também realizado uma análise de indicadores expressos em chance, as razões de

verossimilhança (Tabela 5). As razões de verossimilhança expressam quantas vezes

mais provável (ou menos) se encontra um resultado de um teste diagnóstico. As razões

de verossimilhança positivas dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B foram,

de 3,59 e 5,70 respectivamente. A razão de verossimilhança negativa dos sistemas

antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B revelaram valores de 0,112 e 0,060

respectivamente.

Prevalência

Va

lore

s p

red

itiv

os

1001 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100

A

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0

20

40

60

80

100

B


45

Tabela 5: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós-teste dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B

Teste RV+ (IC 95%) RV− (IC 95%)

A4−rLci1A 3,59 (3,28 – 3,92) 0.112 (0,075 – 0,167)

E4−rLci2B 5,70 (4,99 – 6,51) 0.06 (0,032 – 0,127)

IC, intervalo de confiança; RV+, Razão de Verossimilhança Positiva; RV−, Razão de

Verossimilhança Negativa

7.3.3. A construção do novo teste por citometria de fluxo LeishPlex pela

combinação dos sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B

O ensaio LeishPlex é caracterizado por combinar igual proporção dos sistemas

A4−rLci1A e E4−rLci2B, formando a matriz antigênica de um ensaio sorológico único.

Os experimentos foram realizados de acordo com as mesmas condições determinadas

para os ensaios que empregaram os sistemas antigênicos de forma individual, todavia,

torna-se interessante ressalvar os seguintes aspectos:

O protocolo experimental de reação sorológica: soro (1:1.600), conjugado FITC

(1:4.000), tempo das incubações (90 minutos, à temperatura ambiente),

centrifugações (10 minutos, à 2.200rpm).

A quantidade total de microesferas utilizadas por poço da placa:

aproximadamente 4.500 microesferas, sendo metade referente ao sistema

A4−rLci1A e a outra metade a E4−rLci2B.

A leitura de 2.000 eventos por amostra avaliada.

A análise dos dados do LeishPlex, que ocorreu de forma similar ao que foi

descrito para os sistemas antigênicos isolados (Figuras 7 e 8), está aqui representada

na Figura 19. Inicialmente, selecionou-se a população da matriz antigênica composta

pelos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B em gráfico de densidade bidimensional de SSC

versus FSC (Figura 19A). Visto que cada sistema utiliza-se de um modelo de

microesfera funcional distinto, empregando intensidade de fluorescência vermelha

única, torna-se possível diferenciar cada sistema antigênico, através do canal de

fluorescência FL3 do citômetro de fluxo. Os gráficos da intensidade média de

fluorescência FL3, em função da granulosidade (SSC) evidenciam a diferenciação das

populações de microesferas distintas que compõem os sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B

(Figura 19B). Diante desta diferenciação, torna-se possível determinar a intensidade de

fluorescência FL1 para cada sistema antigênico da matriz. Os histogramas da

intensidade de fluorescência FL1 dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B foram então


46

obtidos com o controle do conjugado da reação (Figura 19C), após a incubação com

pool de soro de cão CNI (Figura 19D) e após incubação com pool de soro de cão INF

(Figura 19E).

A partir de então, a análise de intensidade de fluorescência FL1 foi obtida de

forma independente entre os dois sistemas da matriz antigênica. As figuras referentes

ao controle do conjugado da reação, após a incubação com pool de soro de cão CNI, e,

após a incubação com pool de soro de cão INF estão representadas nas Figuras 19F,

19G e 19H para A4−rLci1A, e nas Figuras 19I, 19J e 19L para E4−rLci2B

respectivamente. Tanto para um sistema, quanto o outro, em primeiro lugar foi

determinado um limiar de negatividade (marcador M) no controle do conjugado da

reação, que seguiu o critério de limiar de reatividade de no máximo 1% de PPF (Figura

19F [A4−rLci1A]; e 19I [E4−rLci2B]). A partir da determinação do marcador de

reatividade, e com a manutenção do mesmo, foram obtidos os valores de PPF para a

matriz antigênica incubada com o pool de soro CNI [Figura 19G (A4−rLci1A); e 19J

(E4−rLci2B)] e com o pool de soro INF [Figura 19H (A4−rLci1A); e 19L (E4−rLci2B)].


47

Figura 19: Representação esquemática da sequência da análise dos dados o teste LeishPlex

empregando a matriz antigênica composta pelos sistemas microesfera-proteína A4−rLci1A e

E4−rLci2B. (A) Seleção da população de microesferas utilizando-se os parâmetros de tamanho

(FSC) e granulosidade (SSC). Diferenciação das populações de microesferas em gráficos da

intensidade de fluorescência FL3 versus SSC. A intensidade de fluorescência FL1 do conjunto

A4−rLci1A e E4−rLci2B obtidas para o controle do conjugado da reação (C), após a incubação

com pool de soro CNI (D) e após incubação com pool de soro INF (E). Respectivamente aos

sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B, os histogramas individuais para a determinação do limiar de

negatividade e o percentual de partículas positivas (PPF) foram obtidos com o controle do

conjugado da reação (F e I); após a incubação com pool soro CNI (G e J) e após incubação com

pool de soro INF (H e L).


SS

C

FSC

Gate

99,6%

A

SS

C


E4−rLci2B

51,5%

A4−rLci1A

47,8%

B

C D E

# d

e e

ven

tos

M – A4–rLci1APPF = 0.140%



F G H

M – E4–rLci2BPPF = 0.648%



I J L


48

De forma a conferir o melhor ponto de corte do teste LeishPlex, foi realizado o

ensaio sorológico com as amostras com exames parasitológicos negativos e positivos

do grupo CNI e subconjunto INF respectivamente, tomando-se em consideração os

pontos de corte arbitrários de PPF≥20, PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50 e PPF≥60 (Figura

20A). Visto que o LeishPlex trata-se de um teste que usa de dois sistemas antigênicos

para o diagnóstico de uma única doença, o cálculo do ponto de corte foi determinado

em função da média (Ȳ) dos valores de PPF obtida para cada amostra nos sistemas

A4−rLci1A e E4−rLci1A. A curva ROC para o teste LeishPlex (Figuras 20B), revelou

acurácia de 98,6% (AUC = 0,986) para todas condições de ponto de corte, o que

correspondeu a especificidade de 100,0% e a sensibilidade de 97.1%.

Figura 20: Obtenção do ponto de corte empregando o teste LeishPlex. (A) Reatividade das

amostras de cães do grupo controle não infectado (CNI = ) e do subconjunto de cães infectados

(INF = ) nas diluições de 1:1.600 do soro e 1:4.000 do anticorpo conjugado com isotiocianato

de fluoresceína (FITC). Os resultados estão expressos como média (Ȳ) do percentual de

partículas fluorescentes (PPF) dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B. (B) Curvas ROC

construídas a partir da representação gráfica da sensibilidade (verdadeiro-positivo) no eixo

vertical, e o complemento da especificidade (taxa de falso-positivo) no eixo horizontal. Os

resultados estão determinados pela área sob a curva (AUC).

Os resultados evidenciam que todos os pontos de corte traçados (PPF≥20,

PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50 e PPF≥60) podem conferir uma elevada acurácia diagnóstica

ao novo teste por citometria de fluxo. Visto que os ensaios do teste LeishPlex foram

realizados nas mesmas condições experimentais verificadas nos sistemas antigênicos

A4−rLci1A e E4−rLci2B testados individualmente, e considerando que o ponto de corte

de PPF≥40 também apresentou-se como um ótimo ponto discriminatório (AUC=0.986),

optou-se por sustentar o ponto de corte de PPF≥40 para a classificação dos resultados.

Todavia, vale aqui salientar, que por tratar-se de um teste que usa de dois sistemas

antigênicos para o diagnóstico de uma única doença, o resultado final foi tratado sob o

seguinte critério:

0 20 40 60 80 100

AUC = 0,986

0

20

40

60

80

100


Se

ns

ibil

ida

de

BA

(Ȳ)

PP

F

0

20

40

60

80

100

CNI INF

100.0%

97.1%

PPF ≥ 20

PPF ≥ 30

PPF ≥ 40

PPF ≥ 50

PPF ≥ 60


49

─ O resultado do teste LeishPlex foi considerado positivo quando pelo menos

um dos sistemas antigênicos exibiu PPF≥40, e somando-se a isso, se o resultado da

média do PPF dos dois sistemas antigênicos foi maior do que 40.

A Figura 21 ilustra o desempenho diagnóstico teste LeishPlex, e os resultados

foram apresentados em função da média (Ȳ) dos valores de PPF. O novo teste foi capaz

de discriminar 100,0% (30/30) dos cães CNI como negativos, enquanto que nas

amostras do subconjunto INF, 95.0% (57/60) foram consideradas positivas (Figura 21A).

A divisão do subconjunto INF de acordo com a forma clínica do animal revelou que e

85,0% (17/20) do grupo de cães assintomáticos, e 100,0% (20/20) dos cães

oligossintomático e sintomáticos obtiveram resultados positivos (Figura 21B). No grupo

de cães infectados com outros patógenos caninos, observam-se resultados negativos

em 100,0% (10/10) das amostras de L. braziliensis, 70,0% (7/10) nas de E. canis, e

60,0% (6/10) em B. canis (Figura 21C). O grupo de cães vacinados mostrou resultados

negativos em 100,0% (10/10) das amostras de cães imunizados com Leish-Tec®,

Leishmune® e LBSap (Figura 21D).

Figura 21: Avaliação do desempenho do teste LeishPlex em ensaio sorológico por citometria de

fluxo no diagnóstico da LVC. Através do perfil de dispersão individual de cada amostra, e

considerando o ponto de corte de PPF≥40, os resultados foram obtidos empregando a diluição

padronizadas dos soros de 1:1.600 e do conjugado de 1:4.000. (A) Controle não infectado

(CNI = ) e cães infectados (INF = ) portadores de diferentes formas clínicas; (B) Cães do grupo

INF divididos de acordo com a classificação clínica da doença em: cães assintomáticos (CA = ),

cães oligosintomáticos (CO = ) e cães sintomáticos (CS = ); (C) Cães infectados com outros

patógenos caninos: L. braziliensis ( ), Ehrlichia canis ( ) e Babesia canis ( ); (D) Cães vacinados

contra a LVC: Leish-Tec® ( ), Leishmune® ( ) e LBSap ( ).

CA CO CS

0

20

40

60

80

100

ῩP

PF

B C D

L. braziliensis E. canis B. canis Leish-Tec® Leishmune® LBSap

ῩP

PF

0

20

40

60

80

100

100.0%

95.0%

100.0% 70.0% 60.0% 100.0% 100.0% 100.0%

100.0% 100.0%85.0%


50

No que diz respeito aos resultados da avaliação exploratória do teste LeishPlex,

vale destacar o ganho substancial de especificidade, evidenciando uma menor

proporção (nos grupos do controle de reação cruzada), ou mesmo eliminação de

resultados errôneos (nos grupos do controle vacinado). Na Tabela 6 estão

representados os resultados dos índices de desempenho expressos em porcentagem.

Foram observados valores de sensibilidade de 95.0%, especificidade de 92.2%, e a

proporção geral de acertos medidos pela acurácia alcançou 93.3%, remetendo a um

desempenho superior àquele anteriormente mostrado pela avaliação individual dos

sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B.

Tabela 6: Desempenho do teste LeishPlex no diagnóstico da LVC

Teste Sensibilidade

(IC 95%) Especificidade

(IC 95%) Acurácia (IC 95%)

LeishPlex 95,0%

(86,3−98,3) 92,2%

(84,9−96,2) 93,3%

(88,2−96,3)

IC, intervalo de confiança

A Tabela 7 ilustra os resultados dos valores preditivos calculados em diferentes

cenários de prevalência da LVC. Levando em consideração a prevalência da doença

obtida na soroteca deste estudo (40%), os VPPs indicam que a probabilidade de um cão

com teste positivo realmente apresente a doença é de 89.0%. Já os VPNs sinalizam

que a probabilidade de um cão com teste negativo não ter a doença é de 96.5%.

Tabela 7: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise do teste por citometria

de fluxo LeishPlex em diferentes cenários artificiais de prevalência

Probabilidade Pré-Teste

LeishPlex

VPP VPN

40%* 89,0% 96,5%

35% 86,8% 97,1%

30% 83,9% 97,7%

25% 80,2% 98,2%

20% 75,3% 98,6%

15% 68,2% 99,0%

10% 57,5% 99,4%

5% 39,0% 99,7%

VPP, valor preditivo positivo; VPN, valor preditivo negativo; * Prevalência deste estudo.

Juntamente com a Tabela 7, a figura 22 ajuda a melhor visualizar e interpretar

as considerações sobre os valores preditivos em diferentes cenários de prevalência da


51

LVC. Assim, assumindo quaisquer prevalência entre 5% e 40%, a probabilidade de um

cão com teste positivo pelo LeishPlex apresentar a doença encontra-se entre 39,0% a

89,0%. Por outro lado, o valor preditivo negativo (VPN) que indica a probabilidade de

um cão com teste negativo realmente não ter a doença encontra-se entre

aproximadamente 96,5% e 99,7%.

Figura 22: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença utilizando o teste

LeishPlex: Valores Preditivos Positivos ( ) e Valores Preditivos Negativos ( ). O retângulo

cinza considera o intervalo de probabilidade pré-teste (prevalência) entre 5% e 40%.

Após as análises de desempenho expressas em porcentagem, foi também

analisado os indicadores expressos em chance, as razões de verossimilhança (RVs)

(Tabela 8). O uso do LeishPlex proporciona um diagnóstico seguro, visto que a elevada

RV Positiva (12.2) indica que um resultado positivo é mais provável de ser verdadeiro

positivo do que falso-positivo. Além disso e RV Negativa bem próxima do valor 0 (0.054)

sugere que um resultado negativo é mais provável de ser um verdadeiro negativo do

que um falso-negativo.

Tabela 8: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós teste.

Teste RV+ (IC 95%) RV− (IC 95%)

LeishPlex 12,2 (9,21 – 16,2) 0,054 (0,028 – 0,104)

IC, intervalo de confiança; RV+, Razão de Verossimilhança Positiva; RV−, Razão de

Verossimilhança Negativa

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0

20

40

60

80

100

Prevalência

Va

lore

s p

red

itiv

os


52

7.4. Avaliação comparativa entre os testes sorológicos LeishPlex,

LeishFlow, DPP, ELISA e RIFI

O índice Kappa mostrou concordância classificada como “excelente” entre o

LeishPlex e LeishFlow, assim como entre o LeishPlex e o DPP. Uma concordância

classificada como “boa” foi observada entre os pares LeishPlex e ELISA e LeishPlex e

RIFI (Tabela 9).

Tabela 9: Avaliação da concordância entre as metodologias sorológicas.

Teste LeishPlex

Kappa (IC 95%) Concordância Positivo Negativo Total

LeishFlow

Positivo 56 03 59

0,86 (0,78−0,94) 93,3% Negativo 08 83 91

Total 64 86 150

DPP

Positivo 57 17 74

0,89 (0,82−0,96) 94,7% Negativo 07 69 76

Total 64 86 150

ELISA

Positivo 59 20 79

0,68 (0,56−0,80) 84,0% Negativo 05 66 71

Total 64 86 150

RIFI

Positivo 57 01 58

0,67 (0,55−0,79) 83,3% Negativo 07 85 92

Total 64 86 150

KER, H.G. DISCUSSÃO

53

8. DISCUSSÃO

A LV tem se espalhado para muitos centros urbanos do Brasil, assim como é

atualmente observado em diversas partes do mundo. Especialmente em nosso país, os

cães são considerados o principal reservatório da LV e a detecção e eutanásia de cães

sorologicamente positivos é uma das medidas de controle da LV. Visto a crescente

discussão no que diz respeito a eutanásia de animais de companhia, torna-se cada vez

mais complexo a sustentação desta medida em campanhas de controle. Neste contexto

é fundamental prezar pela elevada especificidade diagnóstica visando evitar a remoção

errônea de cães não infectados. Por outro lado, dada a importância em se reduzir o

número de cães infectados expostos como reservatórios nas áreas endêmicas, torna-

se oportuno privilegiar elevada sensibilidade do teste diagnóstico, de forma a restringir

a expansão do ciclo de transmissão. Diante deste cenário, o atual panorama para o

controle seguro e eficaz da LVC demanda a disponibilização de testes de diagnóstico

que apresentem uma elevada acurácia.

Neste sentido, este trabalho buscou atender às atuais necessidades do sistema

de diagnóstico e controle da LVC no Brasil. Amparando-se em um amplo espectro de

soros caninos, inicialmente se buscou apurar os acertos e esclarecer os possíveis

desacertos referentes à especificidade dos testes recomendados pelo Ministério da

Saúde (DPP, ELISA e RIFI). Posteriormente, os esforços foram concentrados no

desenvolvimento e avaliação de testes sorológicos por citometria de fluxo,

nomeadamente LeishFlow e LeishPlex.

Em relação à primeira parte deste estudo, compreendida pela avaliação da

especificidade dos testes recomendados pelo Ministério da Saúde, os dados revelaram

especificidade de 99,4%, 89,9% e 72,5% respectivamente ao DPP, ELISA e RIFI. Assim,

a implementação do DPP de fato apresenta-se como um impacto positivo sobre a

acurácia diagnóstica, contribuindo com elevada especificidade. Cabe aqui ressaltar, que

o teste rápido DPP foi capaz de evitar potenciais resultados falso-positivos tanto nas

amostras de animais infectados com outros patógenos caninos, assim como em cães

vacinados com os imunoprofiláticos Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap.

Em relação às reações cruzadas com anticorpos decorrentes de outras

infecções caninas, poucos estudos empregando o DPP foram realizados com este foco

(Laurenti et al., 2014). No presente trabalho, apenas uma amostra de E. canis

apresentou um potencial resultado falso-positivo e, mesmo assim, esta amostra também

foi positivo em RIFI, sugerindo tratar-se de um caso falso-negativo. Vale destacar que o

DPP não apresentou resultados falsos-positivos potenciais em soros de L. braziliensis,

T. cruzi, e B. canis. No entanto, em estudos anteriores, um pequeno número de reações


54

cruzadas foi encontrado em amostras de cães infectados por L. braziliensis e B. canis

(Grimaldi et al., 2012; Laurenti et al., 2014). Diante desses fatos, podemos verificar que

DPP vem contribuindo no sentido de evitar a eutanásia equivocada em áreas onde L.

infantum pode ser co-endêmica a outras infecções caninas.

Por outro lado, os testes de ELISA e RIFI mostraram um elevado número de

reações cruzadas T. cruzi e L. braziliensis. Resultados semelhantes obtidos pelos testes

sorológicos oficiais ELISA e RIFI já foram demonstrados em estudos anteriores (Ferreira

et al., 2007; Laurenti et al., 2014). Inclusive, o estudo de Ferreira et al. (2007) também

demonstra a ocorrência de 100,0% de reatividade cruzada obtida pela RIFI em amostras

de cães infectados pelo T. cruzi. Além disso, os testes de ELISA e RIFI também

apresentaram potenciais resultados falso-positivos considerando infecções por E. canis

e B. canis em outros estudos (Lira et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Laurenti et al., 2014).

Assim, de acordo com as pesquisas anteriores, e de acordo com os dados obtidos neste

trabalho, reitera-se a necessidade de atenção quanto à baixa especificidade destes

testes em animais infectados com outros patógenos caninos, mas o destaque especial,

neste caso, deve-se à sorologia por ELISA, que ainda é um ensaio empregado nas

campanhas de controle do Brasil.

Como uma parte importante deste estudo dos métodos sorológicos oficialmente

empregados em campanhas de controle no Brasil, foi também investigado a

possibilidade de soroconversão desencadeada pela imunização profilática utilizando

três diferentes vacinas contra a LVC. Em resumo, o DPP foi o único que não apresentou

potenciais resultados falso-positivos nas três vacinas, ao passo que, os testes por ELISA

e RIFI, demonstraram potenciais resultados falso-positivos em ambos testes nas

diferentes amostras de soros de cães imunizados com Leishmune®, Leish-Tec® e

LBSap.

De fato, a possibilidade do DPP apresentar resultados potencialmente falso-

positivos em amostras de soro de cães vacinados é mínima, e foi comprovada por outros

estudos recentes (Marcondes et al., 2013; Testasicca et al., 2014; Ribeiro et al., 2015).

No entanto, para melhor entender os resultados falso-positivos potenciais determinados

pelos testes ELISA e RIFI, algumas considerações importantes devem ser feitas. Em

primeiro lugar, deve-se recordar sobre a natureza dos antígenos vacinais. Assim,

observa-se que a Leishmune® é composta por uma proteína purificada (Ligante de

Fucose e Manose – FML) da superfície de L. donovani, a Leish-Tec® é composta por

uma proteína recombinante (A2) específica às formas amastigotas de L. donovani, e a

LBSap por uma preparação de antígeno (heterólogo) solúvel de L. braziliensis.

Adicionalmente, a composição antigênica dos testes sorológicos ELISA e RIFI também

é importante nesta interpretação. Estes testes usam de antígenos brutos de


55

promastigotas de L. major em suas composições, buscando assim anticorpos IgG

gênero-específico o que certamente aumenta a sensibilidade podendo então levar a

resultados falso-positivos.

Diante deste panorama, torna-se razoável especular que resultados

potencialmente falso-positivos seriam mais cabíveis pela vacinação com Leishmune® e

principalmente pela LBSap. No primeiro caso, apesar do antígeno vacinal ser derivado

de L. donovani e antígeno dos testes diagnósticos provenientes de L. major, devido a

similaridade genética entre estes parasitos, não poderia ser descartado que alguma

porção dos anticorpos anti-FML sejam capazes de reconhecer determinados epítopos

na superfície dos antígenos de L. major-like (suporte antigênico empregado nas técnicas

de ELISA e IFAT) pela Biomanguinhos (FIOCRUZ, RJ). No caso da LBSap, o

reconhecimento de anticorpos produzidos após a vacinação pelos antígenos de L. major

dos testes sorológicos seria ainda mais esperado, visto que tratam-se de parasitos do

mesmo gênero cuja complexidade genômica e proteômica parecem ser muito

semelhantes.

Neste contexto, diante da análise dos trabalhos que buscaram verificar a

possibilidade de soroconversão pela vacinação anti-LVC através dos testes sorológicos

oficiais ELISA e RIFI, é notório que a vacinação por Leishmune® gerou um considerável

número de resultados potencialmente falso-positivos (Marcondes et al., 2013; Ribeiro et

al., 2015). Apesar de uma fonte escassa de investigações sobre a soroconversão por

Leish-Tec® verificada pela sorologia oficial, o estudo de Coelho et al. (2009) mostrou

ausência de resultados potencialmente falso-positivos por meio de um ensaio de ELISA

empregando antígeno bruto de L. infantum. Por outro lado, no presente trabalho, o cão

reativo pelo teste oficial de ELISA (EIE-LVC®) também foi reativo pela RIFI (IFI-LVC®),

fortalecendo a conjectura de que o antígeno de L. major-like empregado nos testes

oficiais podem eventualmente inferir um resultado falso-positivo em cães vacinados com

Leish-Tec®.

Até o presente momento, a especificidade dos testes serológicos oficiais

brasileiros era abordada em um número restrito de amostras de cães com outras

infecções caninas e, somando-se a isso, a questão da vacinação/soroconversão não

havia sido amplamente abordada e compreendida frente diferentes imunoprofiláticos.

Desta forma, características importantes deste estudo com os testes sorológicos oficiais

podem ser destacadas.

Apesar da RIFI ter sido removido das campanhas de controle e vigilância na

população canina, este estudo contribuiu para clarificar a importância da sua

substituição. Além disso, vale mencionar que apesar da produção e comercialização

Leishmune® estar temporariamente suspensa no Brasil (Nota Técnica


56

038/2014/DFIP/DAS/MAPA), acreditamos que as considerações tratadas no presente

estudo podem ser úteis aos profissionais que trabalham junto ao controle e vigilância da

LVC em áreas endêmicas no Brasil. Por fim, considerando que o DPP é atualmente

aplicado para o rastreamento de cães infectados e o ELISA para a confirmação dos

casos, a possibilidade de ocorrência da eutanásia de cães de forma indevida tornou-se

minimizada frente a estratégia anterior que empregava ELISA e RIFI. Ou seja, apesar

da sorologia por ELISA proporcionar um número considerável de resultados falso-

positivos em cães infectados com outros patógenos, ou vacinados contra LVC, estas

amostras seriam em sua maioria evitadas após o rastreamento com o DPP.

Apesar do ganho alcançado pela implementação do DPP, vale ressaltar que

ainda há muito a ser melhorado, visto que estudos recentes mostram que o teste rápido

apresenta baixa sensibilidade na detecção de casos assintomáticos da LVC (Grimaldi

et al., 2012; Schubach et al., 2014). Diante deste fato, em primeira mão, poderia ser

oportuno a alteração do DPP como teste de confirmação, enquanto que a ELISA

passaria a ser novamente utilizada no rastreamento. Entretanto, já é sabido que a

alternação dos testes de rastreamento/confirmação (DPP/ELISA ─ ELISA/DPP) não

afeta a taxa de prevalência da doença e, portanto, o número de animais a ser eliminado

pelo Programa de Controle seria o mesmo independente da sequência dos testes

(Coura-Vital et al.,2014). Além disso, o remanejo do teste de ELISA para o rastreio de

amostras poderia perpetuar a carência relacionada à detecção dos animais

assintomáticos, visto que são comuns os relatos de deficiência desta metodologia na

detecção desses casos (Lira et al., 2006; Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015).

Assim sendo, a procura por novas metodologias que atendam à evidente

necessidade de um acréscimo em sensibilidade, principalmente relativos aos casos

assintomáticos, é ainda crucial para o Programa de Controle. É importante ressaltar que

apesar da necessidade de um teste com superior sensibilidade, este não pode ocorrer

em detrimento da especificidade, uma vez que o DPP não ausenta por completo a

possibilidade de resultados falso-positivos.

A proposição de inovações metodológicas empregando citometria de fluxo (CF)

constituem uma tendência mundial para o desenvolvimento de novas abordagens

diagnósticas de elevado desempenho. Tal tecnologia utiliza um sistema de leitura a

laser, que viabiliza um aumento substancial na capacidade de detecção de

biomoléculas, conferindo uma sensibilidade superior aos ensaios. Adicionalmente, o

sistema de leitura a laser permite o uso de microdiluições da amostra, favorecendo um

ganho em especificidade. As tecnologias por CF foram recentemente apontadas como

uma conquista no âmbito do diagnóstico sorológico de infecções por L. infantum (Paiva-

Cavalcanti et al., 2015).


57

Tanto na Europa quanto no Brasil, no caso da sorologia por CF para LVC,

podemos tratar sobre o desenvolvimento dos novos testes por CF sob duas categorias.

Uma primeira geração de testes que se baseia no emprego de formas íntegras do

parasito L. infantum como matriz antigênica, e uma segunda geração que se caracteriza

pelo emprego de microesferas acopladas a antígenos recombinantes.

O teste sorológico por CF para diagnóstico da LVC de primeira geração na

Europa foi desenvolvido por um grupo de pesquisadores de Portugal e Espanha, e se

baseia no uso de formas amastigotas de L. infantum como matriz antigênica (Silvestre

et al., 2008). Esta técnica mostrou sensibilidade de 96.0% e especificidade de 93.2%

em um ensaio que avaliou tanto cães sintomáticos quanto os assintomáticos.

Por sua vez, foi no Brasil e por nosso grupo de pesquisa que os testes por CF

de primeira geração foram desenvolvidos e propostos. Estes ensaios de sorologia por

citometria de fluxo se caracterizam pelo uso de promastigotas fixadas de L. infantum

como matriz antigênica do teste (Carvalho-Neta et al., 2006; Andrade et al., 2007;

Andrade et al., 2009; Ker et al., 2013a; Ker et al., 2013b). Em relação à tecnologia

Europeia, o uso de formas promastigotas íntegras e fixadas é vantajoso devido a maior

facilidade de obtenção dos antígenos para execução do teste. Além disso, sobre o

desempenho diagnóstico, o uso de promastigotas como matriz antigênica do teste

favorece sensibilidade e especificidade iguais ou superiores a 95.0% (Carvalho-Neta et

al., 2006; Andrade et al., 2007; Ker et al., 2013b). No entanto, um capítulo à parte que

representa um considerável ganho biotecnológico dos testes por CF que empregam

promastigotas de L. infatum diz respeito à padronização da preparação da matriz

antigênica descrita em Ker et al. (2013a). Com os resultados obtidos nesse trabalho

através da investigação dos aspectos morfológicos, microbiológicos e de reatividade

sorológica da preparação antigênica, assegurou-se a estabilidade dos antígenos por 12

meses, viabilizando o emprego em larga escala do teste que hoje denomina-se

LeishFlow.

O teste LeishFlow despontou-se como uma promissora metodologia diagnóstica

que, mesmo utilizando uma matriz antigênica composta por antígenos totais

(promastigotas integras) de L. infantum, proporcionou uma reatividade cruzada mínima

com amostras de cães infectados por outros patógenos caninos, e confirmou uma

habilidade anteriormente destacada por Andrade et al. (2009), e certificada por Ker et

al. (2013b), que trata da discriminação da soroconversão vacinal. O teste LeishFlow

mostrou completa ausência de resultados falso-positivos em cães vacinados com

Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap. Estas verificações permitiram a consolidação do

protótipo de kit de diagnóstico (Figura 23).


58

Figura 23: Protótipo do teste sorológico LeishFlow desenvolvido e exibido no encontro Grand

Challenges in Global Health 2013 organizado pela Bill & Melinda Gates Foundation em parceria

com o Ministério da Saúde do Brasil.

Diante dos resultados conferidos pela sorologia por CF na Europa (Silvestre et

al,, 2008), e pelos avanços alcançados com a proposta do LeishFlow no Brasil (Ker et

al., 2013a), tornou-se um estímulo ainda maior seguir na busca pelo aprimoramento

biotecnológico da sorologia por CF aplicada ao diagnóstico da LVC.

O início da segunda geração de testes se deu em um trabalho pioneiro realizado

por um grupo de pesquisadores de Portugal em associação com pesquisadores do

nosso grupo de pesquisa. O trabalho de Sousa et al. (2013), pela primeira vez mostrou

a construção de um teste sorológico do tipo multiplex por CF. Foram empregadas

microesferas poliméricas magnéticas revestidas com o antígeno clássico rK39 e com

uma proteína recombinante de L. infantum, a enzima citosólica triparedoxina peroxidase

(LicTXNPx) descrita por Cordeiro-da-Silva et al. (2003), e avaliada no contexto de

diagnóstico da LVC por Santarém et al. (2010) que empregaram a técnica de ELISA. A

combinação dos antígenos rK39 e LicTXNPx em um estudo clínico por CF demonstrou

uma sensibilidade de 98.8% com uma especificidade de 94.4% (Sousa et al., 2013).

Apesar do notável desempenho diagnóstico obtido, o uso de microesferas magnéticas

requer placas de ensaio sorológicas específicas, que aumentam consideravelmente o

custo, e podem inviabilizar a aplicação deste teste em larga.

Não obstante a este obstáculo, para aprofundar as investigações sorológicas

multiplex, é importante observar que o mercado de insumos biotecnológicos oferece

uma ampla variedade de modelos de microesferas e inclui diversas empresas que

disponibilizam microesferas poliméricas que se distinguem por meio de características

físico-químicas, tais como, a propriedade do polímero, o tamanho da microesfera, a

fluorescência, bem como pelo revestimento da superfície por variados grupos químicos

que permitem a ligação específica de certos analitos.

Há aproximadamente uma década os ensaios multiplex por CF através da

tecnologia CBA constituem uma realidade seja na pesquisa científica, seja como na

prática da rotina clínica de diversas doenças. Segundo Morgan et al. (2004), esta nova


59

tecnologia possui como principais vantagens: (I) a avaliação de vários analitos numa

única amostra; (II) a requisição de pequeno volume da amostra para a realização dos

ensaios; (III) a reprodutibilidade dos ensaios; (IV) a comparabilidade com ensaios

existentes; (V) e a rápida avaliação de uma amostra por múltiplos componentes

analíticos em uma plataforma de ensaio único.

Inicialmente estudou-se o perfil individual de cada sistema antigênico

microesfera−proteína para, a partir de então, definir os possíveis candidatos à

combinação e consequente constituição do ensaio multiplex, batizado por nós de

LeishPlex. Os sistemas antigênicos montados foram compostos por antígenos

recombinantes já bem caracterizados previamente e que, por características

intrínsecas, apresentaram alguma propriedade ressaltante aplicada a construção de

novas plataformas de testes para o diagnóstico sorológico da LVC.

As proteínas multiepítopos C1 e PQ20 foram selecionadas sob a ótica de que

poderiam representar um antígeno potente para a detecção de casos assintomáticos da

LVC como demonstradas anteriormente ao serem empregados em ELISA (Fonseca et

al., 2014; Faria et al., 2015). Ainda não se sabe ao certo o que pode ter levado à não

funcionalidade dos sistemas antigênicos com estas proteínas, mas é possível ponderar

sobre duas pressuposições.

Uma delas cai sobre uma possível incompatibilidade no arranjo espacial das

proteínas C1 e PQ20. Após a ligação às microesferas, poderia ser inviabilizado a

exposição de alguns epítopos fundamentais no reconhecimento de anticorpos e assim

comprometer a adequada diferenciação entre o pool de soros CNI e INF.

Outro pressuposto, e provavelmente o mais provável, remete a questões

bioquímicas. Visto que a carga elétrica de uma proteína pode variar em função do pH o

qual se encontra solubilizada, e que o grupo sulfidrila encontrado na superfície das

microesferas tem caráter ácido (carga elétrica positiva), torna-se racional efetuar a

solubilização da proteína de tal maneira que proporcione uma carga líquida negativa na

molécula. Ou seja, para atingir esta condição eletronegativa, as proteínas devem ser

solubilizadas em pH acima do seu ponto isoelétrico (PI).

Diante disso, levando-se em consideração que as proteínas C1 e PQ20

apresentam PI entre 9,0 e 9,5, a solubilização destas proteínas deveriam ocorrer em pH

acima de 9,5 para a constituição de uma carga líquida negativa favorável à ligação das

proteínas ao grupo sulfidrila da microesfera. Neste sentido, o pH empregado na

solubilização de todas as proteínas avaliadas neste estudo (pH = 7.9) pode ter sido um

importante motivo para não funcionalidade dos sistemas antigênicos E7−C1 e

C6−PQ20, o que nos permite hipotetizar que uma adequação sutil no protocolo de

acoplamento poderia assegurar o funcionamento destes dois sistemas. Por fim, vale


60

aqui salientar que o fortalecimento do presente trabalho passa pelo desenvolvimento de

uma proposta emoldurada às atuais necessidades do diagnóstico sorológico, da qual a

identificação dos cães assintomáticos é fundamental. Assim, a continuidade dos

estudos com os antígenos C1 e PQ20 ainda permanece como pretensão deste trabalho.

Portanto, o seguimento das investigações para construção de sistemas

antigênicos microesfera−proteína funcionais focalizou as proteínas recombinantes

rLci1A e rLci2B. Estes antígenos foram qualificados para o presente trabalho diante dos

resultados promissores evidenciados em testes por ELISA (Oliveira et al., 2011; Souza

et al., 2012), bem como por um teste rápido baseado na mesma tecnologia do DPP

(Fraga et al., 2014).

Tanto rLci1A quanto rLci2B, conferiram sistemas antigênicos

microesfera−proteína funcionais. Vale aqui observar que o PI das duas proteínas são

próximos do valor 6.0 e, portanto, a solubilização em pH de 7,9 mostrou-se apropriada

para o estabelecimento de uma carga elétrica líquida negativa favorável ao acoplamento

e consequentemente a funcionalidade dos sistemas.

Quanto a etapa inicial de determinação das condições ideais para reação

sorológica, o critério utilizado para tal decisão seguiu os mesmos preceitos

estabelecidos por Ker et al. (2013a). Diante desse critério, a titulação do soro de 1:1.600

e do conjugado de 1:4.000 mostraram-se adequadas para a sorologia empregando o

sistemas A4−rLci1A assim como o E4−rLci2B. Este fato se mostrou bastante

interessante para constituição de uma tecnologia multiplex, visto que, neste caso, os

dois sistemas poderiam ser combinados em um ensaio único.

No entanto, se fossem considerados cada sistema antigênico individualmente, e

mantendo-se a mesma diluição do soro em 1:1.600, o sistema A4−rLci1A poderia ser

também testado na diluição do conjugado em 1:2.000, enquanto que o E4−rLci2B

poderia ser testado na diluição de 1:8.000 do mesmo. Estas observações poderiam

possivelmente determinar alguma diferença no desempenho diagnóstico individual dos

sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B. Apesar disso, visto que a hipótese deste trabalho se

pauta na combinação de antígenos recombinantes em um ensaio multiplex por CF, a

verificação destas alternativas para a reação sorológica a princípio não foi investigada

no presente trabalho. Contudo, é de extrema importância reforçar que os resultados

obtidos pelas curvas de titulação evidenciam uma vantajosa flexibilidade dos sistemas

A4−rLci1A e E4−rLci2B para a combinação com outros sistemas antigênicos que por

ventura possam ser incorporados em testes multiplex futuros.

A fase seguinte do desenvolvimento tratou da determinação do ponto de corte

dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B. É interessante aqui destacar que

quando se deseja realizar um diagnóstico qualquer, e o resultado deve ser apresentado


61

por sentenças dicotômicas do tipo "positivo-negativo", há de se ter a consciência de que

existirão variadas formas de sentenciar sobre isto. O presente trabalho delineou a sua

sentença em um ponto discriminatório dentro de uma variável contínua, o PPF. A

determinação deste ponto discriminatório, ou ponto de corte, seguiu o preceito de

proporcionar uma máxima precisão dessas sentenças.

Dada esta condição, a certificação do melhor ponto de corte foi realizada em um

ensaio sorológico com amostras comprovadamente positivas ou negativas por exames

parasitológicos. Assim, o ponto de corte de PPF≥40 foi o primeiro ponto a atingir

especificidade de 100,0% mantendo-se o valor máximo da sensibilidade (97,0%), o que

promoveu um elevado valor de acurácia (AUC = 0,986) em ambos os sistemas

antigênicos. Entretanto, apesar deste resultado claramente indicar que os sistemas

A4−rLci1A e E4−rLci2B podem constituir um teste de diagnóstico de elevada acurácia,

a avaliação individual dos sistemas antigênicos em uma ampla variedade de amostras

de soros torna-se fundamental para o entendimento do valor diagnóstico de um teste.

A avaliação do sistema antigênico A4−rLci1A revelou uma sensibilidade de

91,7%, especificidade de 74,4% e acurácia de 81,3%. Esses resultados são bem

semelhantes aos obtidos em um ensaio por ELISA com este mesmo antígeno, que

mostrou sensibilidade de 93,0%, especificidade de 76,1% e acurácia de 84,3% (Oliveira

et al., 2011). Em relação a outros estudos que também avaliaram o antígeno rLci1A, os

resultados encontrados no presente estudo mostraram-se semelhantes ao que foi obtido

por ELISA – que alcançou 96,0% (Souza et al., 2012), e superior ao relatado em ensaio

DPP – que atingiu os 75,3% (Fraga et al., 2014). Adicionalmente, a especificidade do

sistema A4−rLci1A foi inferior à alcançada por ensaio do tipo ELISA – de 92,0% (Souza

et al., 2012), e também em ensaio DPP – que atingiu os 100,0% (Fraga et al., 2014).

Diante dos valores de sensibilidade relacionados ao antígeno rLci1A obtidos por

diferentes metodologias sorológicas, pode-se inferir que o ensaio por CF utilizando o

sistema A4−rLci1A mostrou um desempenho satisfatório. Por sua vez, o valor reduzido

da especificidade obtida no presente trabalho, pode ser atribuído essencialmente à

reatividade cruzada com amostras de E. canis e B. canis. Vale lembrar que apesar do

sistema antigênico A4−rLci1A mostrar alguns resultados falso-positivos em amostras de

cães vacinados, a reatividade dessas respectivas amostras mostraram-se mais

próximas ao ponto de corte estabelecido. Além disso, é possível verificar que a

reatividade média do grupo vacinado encontrou-se abaixo do ponto de corte PPF≥40.

Do outro lado, nos grupos E. canis e B. canis, verificou-se maior reatividade das

amostras potencialmente falso-positivas e, assim, a média de reatividade dos

respectivos grupos ficou um pouco acima do ponto de corte.


62

A variação da especificidade do antígeno rLci1A pode ser explicada com base

na organização genética do locus da proteína hsp70, que é uma região bem conservada

entre as espécies de Leishmania (com exceção de L. braziliensis), mas que também

evidencia algum grau de conservação de sequências com a proteína homóloga de

outros protozoários, dentre eles, parasitos do gênero Trypanossoma e Babesia (Quijada

et al., 1996a; Quijada et al., 1996b; Folgueira et al., 2007). Não há estudos na literatura

que comprovam algum grau de similaridade genética entre L. infantum e parasitos do

gênero Ehrlichia. Diante deste panorama, a especificidade do sistema A4−rLci1A

mostrou-se coerente frente as possíveis relações de similaridade genética. Por esta

razão, acredita-se que o resultado observado no presente estudo, assim como notado

em Oliveira et al., (2011), pode ter sido inferior ao constatado por outros trabalhos,

provavelmente devido à pureza do antígeno empregado nos ensaios. Além disso, vale

aqui ressaltar, que nossos resultados confirmam a especificidade do antígeno frente à

infecção por L. braziliensis.

Em relação ao sistema antigênico E4−rLci2B, foi constatado uma sensibilidade

de 95,0%, especificidade de 83,3% gerando uma proporção geral de acertos medida

pela acurácia de 88,0%. Por um breve comparativo sobre a sensibilidade e

especificidade do antígeno rLci2B, observa-se uma certa variação dentre os estudos

que aplicaram este antígeno em ensaios sorológicos distintos. Enquanto que em Oliveira

et al. (2011) e Fraga et al. (2014), os valores observados foram respectivamente de

83,7% e 82,5%, a sensibilidade alcançada no presente estudo esteve mais próxima dos

achados de Souza et al. (2012), que mostrou um valor de 100.0%. Por outro lado, a

especificidade do sistema E4−rLci2B mostrou-se semelhante à observada por Oliveira

et al. (2011) que correspondeu a 84,8%, e inferior ao encontrado nos demais estudos

de Souza et al. (2012) e Fraga et al. (2014), que atingiram 93,0% e 100,0%

respectivamente.

É sabido que os ensaios sorológicos que utilizam o antígeno K39, do qual o

rLci2B é homólogo, proporcionam elevados valores de sensibilidade quando o cão

apresenta sinais clínicos da LVC, mas que pode às vezes ser falho nos casos de cães

assintomáticos (Quinnell et al., 2013). Portanto as variações da sensibilidade

observadas nos diferentes estudos sobre rLci2B pode ser atribuída à proporção de

animais assintomáticos empregadas nos ensaios. Independente disso, o ensaio

sorológico por CF utilizando o sistema antigênico E4−rLci2B mostrou poucas falhas de

detecção, e estas ocorreram essencialmente em poucas amostras de animais

assintomáticos. Por fim, vale aqui destacar que o uso da CF proporcionou maior

sensibilidade do que outras metodologias que utilizaram o K39 (Mettler et al., 2005;

Porrozzi et al., 2007; Lemos et al., 2008).


63

O antígeno K39 é caracterizado por apresentar elevada especificidade (Mettler

et al., 2005; Porrozzi et al., 2007; Lemos et al., 2008) o que também foi verificado em

estudos prévios com o homólogo rLci2B (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012; Fraga

et al., 2014; Oliveira et al., 2015). Neste estudo, apesar desta premissa, o sistema

antigênico E4−rLci2B evidenciou alguns resultados falso-positivos seja em animais do

grupo CRC (L. brazilensis, B. canis e E. canis) ou do grupo VAC (Leish-Tec®,

Leishmune® e LBSap). Embora isto tenha sido observado, a grande maioria dos falso-

positivos apresentam-se de uma certa forma próximos ao ponto de corte. Assim,

ressalva-se que outros estudos seriam necessários para a confirmação destas

observações.

Os valores preditivos são indicadores utilizados para complementar a

interpretação do resultado de um teste diagnóstico. Constituem variáveis dependentes

da sensibilidade e especificidade da técnica e também da prevalência da doença ou

infecção numa determinada região. A prevalência atual da LVC no Brasil oscila, em

diferentes regiões endêmicas, basicamente entre 5 e 40% (Barata et al., 2013; Coura-

Vital et al., 2014; Lopes et al., 2014; Barbosa et al., 2015; Pimentel et al., 2015). Nessa

faixa de prevalência foi possível observar que tanto o sistema antigênico A4−rLci1A,

quanto o E4−rLci2B, apresentaram excelentes valores preditivos negativos, gerando

assim, minimização de resultados falso-negativos. Quanto aos valores preditivos

positivos, observa-se que os resultados relativos aos sistemas antigênicos A4−rLci1A e

E4−rLci2B apresentaram valores superiores ao ensaio sorológico com DPP (Schubach

et al., 2014). Entretanto, cabe aqui observar, que o presente trabalho se trata de um

estudo clínico laboratorial com amostras estudadas em diferentes trabalhos. Portanto,

para sabermos a real dimensão dos valores preditivos, são necessários a avaliação

desses sistemas antigênicos em estudos clínico epidemiológicos bem definidos,

preferencialmente multicêntricos.

Adicionalmente, a análise da razão de verossimilhança (RV) permitiu a

interpretação dos dados como uma medida de chance da presença da doença depois

de um resultado de teste diagnóstico. Visto que quanto maior a RV positiva (mais

distante de 1), e quanto menor a RV negativa (mais próximo de 0), melhor é o teste, os

resultados obtidos no presente estudo constataram que o sistema E4−rLci2B mostrou-

se superior ao A4−rLci1A. Em outras palavras, sob o uso de E4−rLci2B é mais provável

de se obter um resultado verdadeiro positivo (maior RV positiva), bem como da obtenção

de um resultado verdadeiro negativo (menor RV negativa).

Em resumo, dentre todos sistemas microesfera−proteína empregados neste

trabalho, os sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B foram aqueles que

inicialmente mostraram-se apropriados para o desenvolvimento biotencológico de uma


64

nova plataforma de diagnóstico sorológico por CF. Nestes dois sistemas as condições

padronizadas de 1:4.000 do conjugado e 1:1.600 do soro canino se mostraram

favoravelmente aplicáveis para a realização dos ensaios sorológicos, resultando em

testes com um considerável desempenho diagnóstico. Desta forma, e sob estas

condições, a combinação dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B configurou a inovação

denominada LeishPlex.

A combinação dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B determinou um elevado

desempenho no diagnóstico sorológico da LVC, com uma sensibilidade de 95,0%,

especificidade de 92,2% gerando uma proporção geral de acertos medida pela acurácia

de 93,3%. Somando-se a esses achados, verificou-se o maior valor preditivo positivo e

valor preditivo negativo considerando todo intervalo de probabilidade pré-teste de 5 a

40%. Além disso, a maior razão de verossimilhança positiva e a menor razão de

verossimilhança negativa ratificam o superior desempenho.

A relação de concordância entre todas as metodologias de diagnóstico

sorológico do presente estudo apontam que o teste LeishPlex apresentou “excelente”

concordância com os testes DPP e LeishFlow, enquanto que a concordância entre o

LeishPlex com as tradicionais ELISA e RIFI foram classificadas como “boa”.

Estes achados sugerem três pontos capitais que possivelmente se relacionam

com os valores de especificidade obtidos pelos testes sorológicos deste estudo.

Primeiramente, pode-se inferir a “excelente” concordância do LeishPlex com o DPP

devido ao uso de antígenos recombinantes como fonte antigênica do teste sorológico.

Em segundo lugar, a “excelente” concordância entre o LeishPlex e o LeishFlow pode

ser atribuída ao sistema de leitura do citômetro de fluxo, que permite o uso de uma micro

titulação dos reagentes. E por fim, concordância “boa” entre o LeishPlex e as sorologias

ELISA e RIFI deve-se à soma do uso de antígenos brutos Leishmania com o sistema de

leitura destes testes. No entanto, é importante ressalvar que o valor de Kappa depende

da prevalência da doença, e, sob esta óptica, se faz necessário a realização de um

estudo clínico epidemiológico idealmente projetado para certificar estas observações.

Baseando-se nas informações geradas no presente estudo, podemos inferir que

o teste LeishPlex formado pela combinação dos dois sistemas antigênicos permitiu a

avaliação de uma amostra por múltiplos componentes analíticos em uma plataforma de

ensaio sorológico único. Este fato conferiu um ganho de desempenho em relação ao

verificado pela avaliação individual dos sistemas, e ainda certificou a tecnologia CBA

multiplex como potente ferramenta biotecnológica para construção de novas

plataformas de diagnóstico sorológico.

No Brasil, o Plano Institucional de Indução à Ciência, Tecnologia e Inovação em

Saúde (PCTIS) da FIOCRUZ, Ministério da Saúde, foi planejado e está estruturado para


65

contribuir com o desenvolvimento de diversos insumos para saúde, dentre eles, novas

ferramentas de diagnóstico. Com a promoção crescente da citometria de fluxo como

uma alternativa para o estabelecimento de testes sorológicos não convencionais

ultrassensíveis e com desempenho diagnóstico robusto, anseia-se que os testes

LeishFlow e LeishPlex possam integrar um novo protocolo de diagnóstico da LVC em

um futuro não muito distante.

KER, H.G. CONCLUSÕES

66

9. CONCLUSÕES

Considerando o conjunto de resultados obtidos, conclui-se que os testes

sorológicos por citometria de fluxo apresentam elevado desempenho no diagnóstico

sorológico da LVC.

No presente trabalho, empregou-se um conjunto de quatro potenciais proteínas

recombinantes, das quais duas, a princípio, se mostraram funcionais e eficazes na

criação de um teste sorológico por citometria de fluxo. Em suma, o sistema antigênico

A4−rLci1A apresentou considerável sensibilidade no diagnóstico da LVC em cães de

diferentes formas clínicas, além de especificidade marcada pela ausência de resultados

falso-positivos em cães infectados por L. braziliensis, assim como por uma moderada

proporção de resultados falso-positivos em cães vacinados. Por sua vez, o sistema

antigênico E4−rLci2B apresentou acentuada sensibilidade no diagnóstico da LVC em

cães de diferentes formas clínicas, além de especificidade marcada por uma moderada

proporção de resultados falso-positivos em cães infectados com outros patógenos

caninos, assim como em cães vacinados com imunoprofiláticos estudados no Brasil.

A combinação dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B que originou o

teste denominado LeishPlex resultou em um ganho no desempenho diagnóstico da

sorologia por citometria de fluxo. Foi constatado uma elevada sensibilidade no

diagnóstico da LVC em cães de diferentes formas clínicas, além de especificidade

caracterizada pela ausência de resultados falso-positivos em cães infectados por L.

braziliensis, assim como em cães vacinados. Mediante estes aspectos, o LeishPlex

determinou sensibilidade de 95,0%, especificidade de 92,2% e acurácia de 93,3% em

um ensaio sorológico com uma ampla variedade de amostras.

Cabe ainda ressaltar que a inovação LeishPlex apresentou excelente

concordância com o teste por citometria de fluxo LeishFlow e com o teste convencional

DPP, e boa concordância com os tradicionais ELISA e RIFI. Desta forma, assegurou-se

que a nova metodologia apresenta potencial diagnóstico compatível com outras técnicas

já bem documentadas.

Por fim, e mediante o conjunto de dados exibidos neste trabalho, destaca-se que

a sorologia por citometria de fluxo representa um novo conceito de diagnóstico

sorológico da LVC, marcado pela promoção de elevada acurácia diagnóstica.

KER, H.G. PERPECTIVAS

67

10. PERSPECTIVAS

O conjunto de resultados alcançados prontamente abrem precedentes para novos

estudos. Dentre os possíveis desdobramentos deste trabalho, destacam-se:

Aperfeiçoar o teste LeishPlex através da funcionalização dos sistemas

microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20;

Expandir os estudos para aplicação da sorologia por citometria de fluxo

LeishPlex na LV humana;

Pesquisar novos sistemas antigênicos pelo emprego de peptídeos construídos

por bioinformática a partir do genoma de L. braziliensis e L. infantum em uma

plataforma multiplex por citometria de fluxo;

Pesquisar novos sistemas antigênicos pelo emprego de proteínas

recombinantes da saliva de Lutzomyia longipalpis para avaliar a exposição ao

vetor em populações caninas e humanas;

Pesquisar novos sistemas antigênicos microesfera−proteína pelo emprego de

proteínas recombinantes de outros agentes patogênicos caninos para avaliar

coinfecções (babesiose, erlichiose, leishmanioes, toxoplasmose, e doença de

chagas canina) em áreas endêmicas da LVC;

Pesquisar novas abordagens de marcação pelo emprego de conjugados mais

sensíveis para avaliar a possibilidade de detecção de cães assintomáticos I

(PCR+/Sorologia−);

Pesquisar novas abordagens de diagnóstico por citometria de fluxo pela

construção de sistemas antigênicos de captura direta de antígenos de L.

infantum em distintas amostras biológicas;

KER, H.G. ANEXO A

68

11. ANEXOS

KER, H.G. ANEXO B

69

KER, H.G. ANEXO B

70

KER, H.G. ANEXO B

71

KER, H.G. APÊNDICE A

72

12. APÊNDICES

Title: The specificity of canine visceral leishmaniasis diagnosis in Brazil: a report of

laboratory investigation about the cross-reactivity to other canine infections and

seroconversion by vaccination

Henrique Gama Ker1,2, Wendel Coura-Vital1,2, Bruno Mendes Roatt1,2, Nádia das Dores

Moreira1,2, Rodrigo Dian Oliveira Aguiar-Soares1,2, Evandro Marques de Menezes

Machado2, Rodolfo Cordeiro Giunchetti3, Rodrigo Corrêa-Oliveira1,4, Mariângela

Carneiro5, and Alexandre Barbosa Reis1,2,+

1Laboratório de Pesquisas Clínicas, Programa de Pós Graduação em Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Ouro Preto, Morro do Cruzeiro, Ouro Preto,

Minas Gerais, CEP 35400-000, Brazil

2Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Ouro Preto, Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, Minas Gerais, CEP

35400-000, Brazil

3Laboratório de Biologia das Interações Celulares, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, Pampulha, Belo

Horizonte, Minas Gerais, CEP 31270-901, Brazil

4Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou,

Fundação Oswaldo Cruz, Av. Augusto de Lima, 1715, Belo Horizonte, Minas Gerais

CEP: 30.190-002, Brazil

5Laboratório de Epidemiologia de Doenças Infecciosas e Parasitárias, Instituto de

Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627,

Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais, CEP 31270-901, Brazil


73

+Corresponding author: Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de

Ouro Preto, Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, Minas Gerais, CEP 35400-000, Brazil.

Tel.: +55-21-31-3559-1036. e-mail address: [email protected] (A.B. Reis)

RESUMO

Os cães vem sendo considerado o principal reservatório do agente causador da

leishmaniose visceral (LV) e, especialmente, no Brasil, o diagnóstico dos animais

soropositivos é parte do Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral e

(PVCLV). Durante anos, este programa determinou a triagem sorológica por ELISA, e

confirmação por RIFI. Recentemente, uma alteração no diagnóstico foi instituído e RIFI

foi substituído pelo teste rápido da plataforma Dual-Path (DPP). Além dessa substituição,

por sua vez, a sorologia por ELISA foi transferida para a confirmação dos resultados

triados pelo DPP. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi verificar quão

vantajosa foi esta mudança em relação à especificidade do diagnóstico. Um conjunto de

198 amostras de soro foram avaliadas com estes três testes oficiais brasileiros: DPP (DPP-

LVC®), ELISA (EIE-LVC®) e RIFI (IFI-LVC®). As amostras de soros compreende

controles não endêmicas (n = 30); controles de área endêmica (n = 40); cães com outras

doenças caninas (n = 88), incluindo Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Babesia

canis e Ehrlichia canis; e cães vacinados (n = 40) usando Leishmune®, Leish-Tec® ou

LBSap. Em relação a este painel de amostras, a especificidade global foi de 99,4%, 89,9%

e 75,2% em relação ao DPP, ELISA e RIFI respectivamente. Assim, a implementação do

DPP mostrou um impacto positivo na especificidade do diagnóstico e contribui

diretamente para a melhoria da PVCLV no Brasil.

Palavras Chave: Leishmania infantum; Leishmaniose Visceral; Leishmaniose Visceral

Canina; Sorodiagnóstico.


74

ABSTRACT

Dogs are the main reservoir of the causative agent of Visceral Leishmaniasis (VL) and

especially in Brazil, the diagnosis of seropositive animals is part of the Visceral

Leishmaniasis Control and Surveillance Program (VLCSP). For years, this program

determined the serological screening by ELISA and confirmation by IFAT. Recently, an

alteration in dog’s diagnosis was instituted and IFAT was replaced by the rapid test Dual-

Path Platform (DPP). Besides this substitution, in turn, the serology by ELISA was

relocated for confirmative test and DPP for screening. In this context, the aim of the

present study was verify if this change was advantageous regarding the diagnosis

specificity. A set of 198 sera samples were assessed with these three Brazilian official

tests: DPP (DPP-LVC®), ELISA (EIE-LVC®), and IFAT (IFI-LVC®). The sera samples

comprises nonendemic controls (n=30); endemic controls (n=40); dogs with other

diseases (n=88) including Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis,

and Ehrlichia canis; and vaccinated dogs (n=40) using Leishmune®, Leish-Tec® or

LBSap. Concerning this panel of samples, the overall specificity were 99.4%, 89.9% and

75.2% regarding DPP, ELISA and IFAT respectively. The implementation of DPP

showed a positive impact in the diagnostic specificity and directly contributes to the

improvement of Brazilian VLCSP.

Keywords: Leishmania infantum; Visceral Leishmaniasis; Canine visceral leishmaniasis;

Serodiagnosis.


75

INTRODUCTION

Visceral leishmaniasis is a worldwide public health problem and is currently

highlighted as one of the major neglected diseases. In Brazil, to control the disease, the

Ministry of Health through the Visceral Leishmaniasis Control and Surveillance Program

(VLCSP) follows three central recommendations comprising, the early diagnosis and

prompt treatment of human cases, vector control by insecticide spraying, and the

serological screening and culling of seropositive dogs in endemic areas (Ministério da

Saúde, 2006). However, regarding the last control measure, the stamping-out approach

on companion animals like the domestic dogs brings further complexities particularly

linked to social costs by the misdiagnosis (Costa et al., 2013). In the context, the wide

comprehension about the specificity of the diagnostic tests applied in canine surveys turns

crucial. Despite this issue have greater importance in Brazil where the removal of infected

dogs is undertaken systematically since the 1960s (Romero and Boelaert, 2010), this

strategy is eventually employed in other South American countries (Travi et al., 2014),

turning the issue even more comprehensive.

Thereby, the necessity for specific diagnosis of canine visceral leishmaniasis

(CVL) lead the Brazilian VLCSP to replace the IFAT by an rapid test based on the Dual

Path Platform (DPP) (Ministério da Saúde, 2011). However, the scientific community

strengthen the necessity of complementary studies to comprehend the real value of this

rapid test so that it can be successfully engaged in public health programs (Coura-Vital et

al., 2014; Schuback et al., 2014). One of the fundamental questions that needs to be

answered is the specificity of the rapid test DPP in samples that could potentially cross-

react serologically with CVL. The validation study of the DPP rapid diagnostic tests

employed a limited number of cross-reacting samples (Grimaldi et al., 2012) and few

researches has been done to deepen the investigations of the specificity in CVL official


76

diagnosis tests. Notwithstanding, an additional concern related to the diagnostic

specificity is associated to the possibility of seroconversion triggered by prophylactic

vaccination (Romero and Boelaert, 2010). The correct distinction of seroreactivity

triggered by vaccination from the L. infantum natural infection remains a serious issue

for public health programs such as the Brazilian VLCSP. In the past 12 years, two

vaccines against CVL (Leishmune® and Leish-Tec®) were already licensed for

commercial use in Brazil. Even so, once the searching for new alternatives are growing,

some candidates turn out to be in evidence, such as LBSap vaccine (Giunchetti et al.,

2007; Roatt et al., 2012). In the context, the search and availability of vaccines endorses

the importance to be specific to achieve the correct distinction of an antibody response

produced after vaccination from to that due natural infection.

According to the above-mentioned foundations, it is remarkable that the

serodiagnosis of CVL in Brazil remains challenging because the current diagnostic tests

might lack satisfactory specificity. Based on the results revealed in this study, we hope to

contribute in the discussion related to the CVL control strategy proposed by the Brazilian

VLCSP within the challenging factor of specific diagnosis considering other canine

infections and vaccination against CVL.

MATERIALS AND METHODS

The canine sera used in the present report of laboratory investigation were selected

in archived samples storage at -80°C at the Clinical Research Laboratory of Pharmacy

School from the Federal University of Ouro Preto. The serology assays were performed

under blind codes and according to the manufacturer's package insert.

Animals and groups


77

The set of samples were distributed in four major groups: (i) nonendemic control

(NEC: dogs living in areas with no Leishmania transmission); (ii) endemic controls (EC:

dogs living in endemic areas but with negative diagnostic test result for Leishmania

infection); (iii) cross-reactive control (CRC: dogs with confirmed disease that could

potentially cross-react serologically); (iv) vaccinated control (VAC: dogs vaccinated

against CVL with Brazilian vaccines).

The NEC group (n = 30) is composed by dogs born and kept in an area with no L.

infantum transmission located at the animal facility in the Federal University of Ouro

Preto. The EC group (n = 40) is part from epidemiological research during a cross-

sectional study conducted in an endemic area from the northwest sanitary region of Belo

Horizonte, Minas Gerais, Brazil (Coura-Vital et al., 2011). The absence of IgG against

Leishmania in sera samples from both groups were determined using an ‘‘in-house’’

ELISA performed using soluble Leishmania infantum antigen (MHOM/BR/1070/BH46)

described by Reis et al. (2006). Both groups are PCR-negative for L. infantum.

A large set of samples included in the CRC group (n = 88) was used to investigate

the specificity of the Brazilian official tests. The CRC group can be distributed in four

subsets related to other relevant canine infections such as L. braziliensis (n = 30), T. cruzi

(n = 18), E. canis (n = 30) and B. canis (n = 10). These sera samples were provided by

different laboratories, which characterized through specific serology (ELISA) and PCR-

positive results respectively to each infection, as well PCR-negative for L. infantum.

Furthermore, 40 vaccinated control (VAC) composed by dogs from an area with

no L. infantum transmission, vaccinated with Brazilian vaccines: Leishmune® (n = 12),

Leish-Tec® (n = 16), or LBSap (n = 12). These dogs presented negative serology (in house

ELISA [Reis et al., 2006b]) as well PCR-negative for L. infantum. All of the vaccinated

animals received the complete vaccination protocol established by three doses of


78

respective vaccines with 21 days between each dose. The vaccination was conducted

according to the manufacturer's instructions for the Leishmune® and Leish-Tec® vaccines,

and according Roatt et al., (2012) for the LBSap vaccine. The tested samples were

collected a hundred days after the complete vaccination procedure.

Serological assays

The serological assays were performed according to the manufacturer's package

insert of the official Brazilian serology tests. For the rapid test DPP® (Bio-

Manguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil), after addition of the sera sample and the

application of running buffers, the reading was performed after 15 minutes and the results

were considered positive when two lines were visualized. The ELISA serology was done

using EIE-LVC® kit (Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil) and the optical

densities were determined at 450 nm by using an automatic EL 800G microplate reader.

The cut-off was determined according to the manufacturer’s recommendations and was

obtained using the negative controls supplied in the kit. The IFAT was conducted using

the IFI-LVC® kit (Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil) and the slides

were examined using a fluorescent microscope with 40× objective (Olympus BX40). For

positive samples, parasites antigens displayed an intense bright-green stain at titration of

1:40 or more.

Statistical analysis

The results are presented descriptively by an exploratory analysis of data. The

diagnostic specificity analyses were performed at the 95% confidence interval using Stata

software 11.0 (StataCorp LP, College Station, Texas, USA).

Ethical approval


79

The study was approved by the Ethics Research Committee of the Universidade

Federal de Ouro Preto (protocol number 083/2007).

RESULTS

The general specificity assessed in the 198 samples from NEC, EC, CRC and

VAC together, revealed a pronounced performance of DPP® reaching 99.4% of

specificity. The ELISA serology leads to a specificity of 89.9% while IFAT revealed

greater number of cross-reaction in CRC and VAC and, therefore, showed reduced

specificity of 75.2% (Table I).

In dogs infected with other important canine pathogens (Table II), the DPP®

revealed an outstanding capacity to avoid cross-reactions in L. braziliensis, T. cruzi, E.

canis, and B. canis samples. Only 1.1% (1/88) cross-reaction was observed in CRC,

related to a single sample from E. canis subset. The ELISA serology showed cross-

reactivity in 29.5% (26/88) samples from the CRC set. So, 26.7% (8/30) of L. braziliensis

subset, 22.2% (4/18) regards T. cruzi, and 3.3% (1/30) is E. canis showed false-positive

tests. The ELISA test in B. canis subset shows to be negative. The IFAT showed cross-

reactivity in all subsets from CRC resulting in 40.9% (36/88) of false-positives.

Respectively to L. braziliensis, T. cruzi, E. canis and B. canis, the corresponding

performance was 40.0% (12/30), 100.0% (18/18), 6.6% (2/30) and 40.0% (4/10).

In dogs immunized with Brazilian vaccines (Table III), none [0.0% (0/40)] of

VAC sera samples presented false-positive results in DPP® testing. The ELISA serology

indicated false-positive results in 17.5% (7/40) samples from VAC. It was observed that

8.3% (1/12) of the dogs vaccinated with Leishmune®, 6.3% (1/16) by Leish-Tec®, and

41.6% (5/12) by LBSap, presented false-positive results. Mistaken results were

commonly observed in the IFAT testing, leading to cross-reactions in 32.5% (13/40) from

VAC samples, and respectively to Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap subsets, 16.7%


80

(2/12), 18.7% (3/16) and 66.7% (8/12) of false-positive results were observed.

DISCUSSION

One of the main arguments against the canine intervention of the VLCSP is the

incorrect euthanasia of dogs because erroneous diagnoses (Costa et al., 2013). Our major

result showed that the serology by DPP revealed higher specificity than ELISA and IFAT,

avoiding mistaken diagnosis in dogs with other canine infections and in the vaccinated

ones. It is important to highlight that DPP serology was capable to substantially minimize

the possibility of cross-reactions against antibodies produced by other infectious pictures,

as well provides an absence of false-positive results related to the dogs vaccination

regardless the given vaccine. Regarding these aspects, the substitution of the IFAT

serology by DPP proved to be a correct and prudent change by the Brazilian VLCSP.

Using tests of low specificity may incur in important social costs, putting the

VLCSP strategy for canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis under hazard. The

official ELISA and IFAT tests are based on crude antigens of promastigote forms of L.

major-like and, although its applicability is assumed for a long time, some questionings

about their specificity performance are arising in the last years (Ribeiro et al., 2013;

Peixoto et al., 2015). One of the most relevant disadvantages relates to the occurrence of

false-positive results due to cross-reactions with other members of Trypanosomatidae

family, such as T. cruzi and L. braziliensis, or even in phylogenetically distant organisms

as E. canis and B. canis (Lira et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Laurenti et al., 2014). In

accordance with these studies, and considering the large sampling used in the present

study, we strongly reiterate the urgency to fill this gap of low specificity by ELISA and

IFAT. The DPP, on the other hand, which uses the recombinant antigen K28, minimizes

the number of cross-reactions and could truly lead to diminish euthanasia due false-


81

positive diagnostic in areas where L. infantum can be endemic along with other canine

infections.

Considering the different nature of the antigens used in Leishmune®, Leish-Tec®

and LBSap vaccines, which are respectively composed by a surface L. donovani protein

Fucose and Manose Ligand (FML), a recombinant amastigote-specific protein A2 (rA2),

and soluble antigens from L. braziliensis, it is likely to expect that ELISA and IFAT may

be less efficient to avoid false-positive than DPP. It should not be discarded that some

antibodies produced by vaccination with Leishmune® and LBSap could recognize some

epitopes in the L. major antigens from ELISA and IFAT, leading to false-positive results.

It is important to highlight that the genome and proteome of L. major, L. braziliensis, L.

infantum and L. donovani are highly similar (Peacock et al., 2007; Smith et a., 2007;

Rezende et al., 2012). The amastigote-specific rA2 antigen used in Leish-Tec®, in turn,

generated the highest number of false-positive results by IFAT probably due to the

titration of 1:40 considered as positive test. Some researchers suggest that a dilution of

1:40 should be considered a suspect result, and a titre four times higher (at

dilutions ≥ 1:160) should be indicated as positive IFAT test (Solano-Gallego et al., 2011;

Ribeiro et al., 2013). On the other hand, and finally, the recombinant antigen K28 used in

DPP proves to be efficient to avoid false-positive results triggered by vaccination against

CVL, regardless their antigenic composition.

In summary, the results of this investigation showed that the DPP® presents

outstanding values of specificity. Their implementation contributes to a reliable

diagnostic of CVL evidenced by excellent capacity to avoid false-positive results in dogs

infected with other canine pathogens commonly encountered in Brazil, as well as in dogs

that undergone vaccination. On the other hand, there was a slighty reduction in the

specificity in ELISA, and markedly by IFAT. Therefore, the implementation of the rapid


82

test DPP® in substitution to IFAT proves to be advantageous and contributes to the

strengthening of the Brazilian VLCSP.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais,

Brazil (FAPEMIG grants CBB–APQ-3073-4.01/07, APQ-02473-10, and APQ-01052-

11), Programa de Pesquisa para o SUS (PPSUS/MS/CNPq/FAPEMIG/SES-MG grant

CBB-APQ-00356-10), Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq grants 472554/2007-7 and

473234/2010-6), and Departamento de Ciência e Tecnologia do Ministério da Saúde

(DECIT/MS/CNPq/BR grant 576062/2008-1). A.B.R., M.C., R.C.G., and R.C.O. are

grateful for CNPq fellowships.

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86

TABLE I: Specificity from DPP, ELISA and IFAT

Samples (n) DPP ELISA IFAT

Positive Negative Positive Negative Positive Negative

NEC (30) 0 30 0 30 0 30

EC (40) 0 40 0 40 0 40

CRC (88) 1 87 13 75 36 52

VAC (40) 0 40 7 34 13 27

Total (198) 1 197 20 178 49 149

Specificity 99.4% (97.299.9) 89.9% (84.993.4) 75.2% (68.880.7)

DPP, Dual-Path Platform; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IFAT, immunofluorescence

antibody test

Table II: Performance of DPP, ELISA and IFAT in samples from cross-reactive control (CRC)

Set Subset Number of positive samples/total (%)

DPP ELISA IFAT

CRC

L. braziliensis 0/30 (0.0%) 16/30 (53.3%) 12/30 (40.0%)

T. cruzi 0/18 (0.0%) 4/18 (22.2%) 18/18 (100.0%)

E. canis 1/30 (3.3%) 6/30 (20.0%) 2/30 (6.6%)

B. canis 0/10 (0.0%) 0/10 (0.0%) 4/10 (40.0%)

Total 1/88 (1.1%) 26/88 (29.5%) 36/88 (40.9%)


antibody test

Table III: Performance of DPP, ELISA and IFAT in samples from vaccinated control (VAC)

Set Subset Number of positive samples/total (%)

DPP ELISA IFAT

VAC

Leishmune® 0/12 (0.0%) 1/12 (8.3%) 2/12 (16.6%)

Leish-Tec® 0/16 (0.0%) 1/16 (6.3%) 3/16 (18.7%)

LBSap 0/12 (0.0%) 5/12 (41.6%) 8/12 (66.6%)

Total 0/40 (0.0%) 7/40 (17.5%) 13/40 (32.5%)


antibody test

KER, H.G. APÊNDICE B

87

KER, H.G. APÊNDICE B

88

KER, H.G. APÊNDICE C

89


90


91


92


93


94


95

KER, H.G. APÊNDICE D

96


97


98


99


100


101


102

KER, H.G. APÊNDICE E

103


104


105


106

KER, H.G. APÊNDICE F

107

Figura Complementar I: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste

sorológico por citometria de fluxo realizado com os sistemas microesfera-proteínas E7−C1

[Painel Superior ‒ pool de soros CNI ( ) e INF ( )] e C6−PQ20 [Painel Inferior ‒ pool de

soros CNI ( ) e INF ( )] incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com

isotiocianato de fluoresceína (FITC). Foram reduzidos o tempo das incubações com as amostras

de pool de soros e com conjugado para 30 minutos. Os resultados foram expressos como

percentual de partículas fluorescentes (PPF).

Figura Complementar II: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste

sorológico por citometria de fluxo realizado com os sistemas microesfera-proteínas E7−C1

[Painel Superior ‒ pool de soros CNI ( ) e INF ( )] e C6−PQ20 [Painel Inferior ‒ pool de

soros CNI ( ) e INF ( )] incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com

isotiocianato de fluoresceína (FITC). Foram reduzidos o tempo das incubações com as amostras

de pool de soros e com conjugado para 60 minutos. Os resultados foram expressos como

percentual de partículas fluorescentes (PPF).

Diluição do soro

0

20

40

60

80

100

C6 −

PQ

20

PP

FTitulação 1:100 do

conjugado IgG-FITC

Titulação 1:2.000 do

conjugado IgG-FITC

Titulação 1:500 do

conjugado IgG-FITC


conjugado IgG-FITC

0

20

40

60

80

100

E7−

C1

Diluição do soro

PP

F


conjugado IgG-FITC


conjugado IgG-FITC


conjugado IgG-FITC


conjugado IgG-FITC

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

C6 −

PQ

20

E7−

C1

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