ATIVIDADE BIOLGICA DOS LEOS ESSENCIAIS DE GENGIBRE, AAFRO E LOURO SOBRE O FUNGO Aspergillus carbonarius ROBERTA PEREIRA SOARES 2009 ROBERTA PEREIRA SOARES ATIVIDADE BIOLGICA DOS LEOS ESSENCIAIS DE GENGIBRE, AAFRO E LOURO SOBRE O FUNGO Aspergillus carbonarius DissertaoapresentadaUniversidadeFederalde Lavras,comopartedasexignciasdoProgramade Ps-Graduao Strictu Sensu em Agroqumica, para obteno do ttulo de Mestre. Orientadora: Prof Dr Maria das Graas Cardoso LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL 2009 Ficha Catalogrfica Preparada pela Diviso de Processos Tcnicos da Biblioteca Central da UFLA Soares, Roberta Pereira. Atividade biolgica dos leos essenciais de gengibre, aafro e louro sobre o fungo Aspergillus carbonarius / Roberta Pereira Soares. Lavras : UFLA, 2009. 65 p. : il. Dissertao (Mestrado) Universidade Federal de Lavras, 2009. Orientador: Maria das Graas Cardoso.Bibliografia. 1. leos essenciais. 2. Plantas condimentares. 3. Fungos. 4. Aspergillus carbonarius. I. Universidade Federal de Lavras. II. Ttulo. CDD 661.806 589.23 ROBERTA PEREIRA SOARES ATIVIDADE BIOLGICA DOS LEOS ESSENCIAIS DE GENGIBRE, AAFRO E LOURO SOBRE O FUNGO Aspergillus carbonarius DissertaoapresentadaUniversidadeFederalde Lavras,comopartedasexignciasdoProgramade Ps-Graduao Strictu Sensu em Agroqumica, para obteno do ttulo de Mestre. APROVADA em 04 de maro de 2009 Prof. Dr. Angelita Duarte Corra UFLA Prof. Dr. Celeste Maria Patto de AbreuUFLA Prof . Dr. Maria das Graas Cardoso UFLA(Orientadora) LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL A Deus, ao meu pai William Soares de Lima, E minha me, Ndia Maria Pereira Soares, presenas mais importantes em minhavida e exemplos de tudo que mais amo. OFEREO Aomeugrandeeverdadeiroamor, Eduardo,quenuncadeixoudemeapoiar nashorasdifceis,sempremefazendo enxergaroladobomdascoisas.minha irm,Fernanda,quemesmodelonge, sempremeajudouemtudoquepreciseie sminhasqueridasvNrciaetiaIvana, que esto sempre presentes no meu longo e eterno caminhar. DEDICO AGRADECIMENTOS UniversidadeFederaldeLavras(UFLA)eaoProgramadePs-Graduao em Agroqumica, pela oportunidade de realizao do curso. AoDepartamentodeAgroqumica,pelaoportunidadederealizaodo curso e a todos os professores, pelo conhecimento adquirido. minha orientadora, pelo apoio e aprendizado durante o curso. Aomeuco-orientador,professorLuisRobertoBatista,pelapacinciae por ter aberto as portas de seu laboratrio para a concretizao das pesquisas. Aosmembrosdabancaexaminadora:Profa.Dra.MariadasGraas Cardoso,Profa.DraAngelitaDuarteCorra,Prof.Dr.LusRobertoBatistae Profa. Dra. Celeste Maria Patto de Abreu. sprofessorasAngelitaeCeleste,pelaconfianadepositadanomeu potencial,antesedurantemeumestrado,pelaajuda,apoio,epeloespritode companheirismoe,principalmente,pelaatenodedicada,quandonecessria, nesta etapa da minha formao. AtodososprofessoresdaUFLA,pelosconhecimentosadquiridos durante o curso. Aos colegas de Laboratrio e amigos do Departamento de Qumica, pelo companheirismo e auxlio nas atividades de pesquisa. funcionria tcnico-administrativa: Miriam, pelo auxlio e amizade. Aomeunamorado,Eduardo,peloamoreapoioincondicionalnos momentosmaisdifceis,eatodasuafamlia,especialmente,Veronique, Monique e Leonardo. minha me, pelo apoio, carinho e solidariedade durante a minha vida. Ao meu pai, pela sinceridade e pela sabedoria em toda palavra dita. Aos meus avs, pelo exemplo de vida, amor, apoio e presena. SUMRIO Pgina LISTA DE SIGLAS...............................................................................................i LISTA DE FIGURAS...........................................................................................ii LISTA DE TABELAS ........................................................................................iv RESUMO.............................................................................................................. v ABSTRACT ........................................................................................................vi 1 INTRODUO................................................................................................. 1 2 REFERENCIAL TERICO.............................................................................. 3 2.1 Metablitos secundrios de plantas ...........................................................3 2.2 leos essenciais ......................................................................................4 2.3 Biossntese e composio qumica dos leos essenciais..............................7 2.4 Atividade antifngica de alguns leos essenciais......................................12 2.5 Plantas medicinais, aromticas e condimentares.......................................15 2.5.1 Curcuma longa (aafro).....................................................................16 2.5.1.1 Utilizao medicinal e condimentar...................................................17 2.5.2 Gengibre ............................................................................................18 2.5.2.1 Utilizao medicinal e condimentar...................................................19 2.5.3 Laurus nobilis (louro) .........................................................................20 2.5.3.1 Utilizao medicinal e condimentar...................................................21 2.6 Gnero Aspergillus e produo de micotoxinas........................................22 2.6.1 Aspergillus carbonarius ......................................................................23 2.6.2 Ocratoxina A (OTA) ...........................................................................24 3 MATERIAL E MTODOS............................................................................. 26 3.1 Obteno do material vegetal .................................................................26 3.2 Extrao dos leos essenciais .................................................................26 3.3 Perfis cromatogrficos dos leos essenciais.............................................26 3.4 Atividade antifngica dos leos essenciais ..............................................28 3.4.1 Microorganismos................................................................................28 3.4.2 Teste biolgico...................................................................................28 4 RESULTADOS E DISCUSSES................................................................... 30 4.1 Perfis cromatogrficos dos leos essenciais. ............................................30 4.1.1 Aafro..............................................................................................30 4.1.2 Louro.................................................................................................32 4.1.3 Gengibre ............................................................................................35 4.2 Atividade antifngica dos leos essenciais sobre Aspergillus carbonarius. 38 5 CONCLUSES............................................................................................... 48 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................... 49 ANEXOS............................................................................................................ 59 iLISTA DE SIGLAS PAL fenilalanina- amino- liase HMGCOA3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA IPP isopentil-pirofosfato DMAPPdimetil-alil-pirofosfato DXPS1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato iiLISTA DE FIGURAS Pgina FIGURA 1Principaisrotasdebiossntesedemetablitos secundrios......................................................................... 4 FIGURA 2Estrutura qumica do fenilpropanide................................7 FIGURA 3Biossntese de fenilpropanides.........................................7 FIGURA 4Estruturaqumicadaunidadeisoprnica(2-metil-1,3-butanodieno)....................................................................... 8 FIGURA 5Biossntese dos monoterpenos e sesquiterpenos.................9 FIGURA 6Condensaodeunidadesdeisoprenonaformaode terpenides........................................................................... 10 FIGURA 7BiossntesedeterpenospelaviaDXPS(1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato).............................................................. 11 FIGURA 8(A) Aspectos gerais da raiz de aafro, (B) Parte area do aafro................................................................................ 17 FIGURA 9(A)Aspectogeralderaizdegengibre(B)Parteareade gengibre.............................................................................. 19 FIGURA 10(A)Aspectosgeraisdasfolhasefloresdolouro,(B) Planta de louro.................................................................... 21 FIGURA 11Estrutura qumica da Ocratoxina A.....................................25 FIGURA 12Estruturasqumicasdo(A)p-cimeno,(B)ar-turmeronae (C) -turmerona.................................................................. 32 FIGURA 13Estruturasqumicasdo(A)1,8-cineol,(B)-felandreno-8-ol, (C) sabineno, (D) -tujeno,(E) -pineno................. 35 FIGURA 14EstruturasQumicasdo(A)geranial,(B)nerol,(C) sabineno e (D) -zingibereno.............................................. 38 FIGURA 15CrescimentomicelialdoAspergilluscarbonariusno iiiltimodiadoexperimentofrenteadiferentes concentraes de Tween 80%............................................. 39 FIGURA 16CrescimentomicelialdoAspergilluscarbonariusno ltimodiadoexperimentofrenteaoleoessencialde louro.................................................................................... 40 FIGURA 17CrescimentomicelialdoAspergilluscarbonariusno ltimodiadoexperimentofrenteaoleoessencialde gengibre............................................................................... 42 FIGURA 18CrescimentomicelialdoAspergilluscarbonariusno ltimodiadoexperimentofrenteaoleoessencialde aafro................................................................................ 45 ivLISTA DE TABELAS Pgina TABELA 1Constituintesqumicosdoleoessencialdeaafro identificados por CG/EM-ndice de Kovats....................... 31 TABELA 2Constituintesqumicosdoleoessencialdelouro identificados por CG/EM- ndice de Kovats...................... 34 TABELA 3Constituintesqumicosdoleoessencialdeaafro identificados por CG/EM- ndice de Kovats...................... 36 TABELA 4Valores mdios do dimetro do crescimento micelial de A. carbonarius em funo da concentrao do leo essencial de tween 80%...................................................................... 38 TABELA 5Valores mdios do dimetro do crescimento micelial de A. carbonarius em funo da concentrao do leo essencial de louro................................................................................. 39 TABELA 6Valores mdios do dimetro do crescimento micelial de A. carbonarius em funo da concentrao do leo essencial de gengibre........................................................................... 42 TABELA 7Valores mdios do dimetro do crescimento micelial de A. carbonarius em funo da concentrao do leo essencial de aafro............................................................................. 45 vRESUMO SOARES,RobertaPereira.Atividadebiolgicadosleosessenciaisde gengibre, aafro e louro sobre o fungo Aspergillus carbonarius. 2009. 65 p. Dissertao(MestradoemAgroquimica)UniversidadeFederaldeLavras, Lavras, MG. A atividade microbiana a principal causa de deteriorizao de muitos alimentos e frequentemente a responsvel pela diminuio de sua qualidade e segurana.Nosltimosanos,ocorreuointeressenousodeprodutosnaturais que substituam aditivos qumicos, pois esses apresentam elevada toxicidade ao consumidor.Oscondimentospossuemcomprovadaatividadeantimicrobiana podendo ser utilizados como conservantes em alimentos. Objetivou-se com este estudoavaliaraconstituioqumicaeaatividadeantifngicadosleos essenciaisdeCurcumalonga(aafro)Laurusnobilis(louro)eZingiber oficinalles(gengibre),utilizandoomtodobioanaltico,paraobservaodo crescimentoe/ouinibiomicelialdasculturasfngicas,pormeiode comparaocomocontroleabsoluto(semleo)econtrolerelativo(tween 80%). Para a identificao e quantificao dos constituintes qumicos dos leos, utilizou-seumcromatgrafogasosoacopladoaumespectrmetrodemassae umcromatogrficogasosocomdetectorporionizaodechamas(DIC), respectivamente.Osconstituintesencontradosemmaioresquantidadesnos leosessenciaisdeaafro,louroegengibreforam:ar-turmerona,1,8-cineole geranial, respectivamente. Nos resultados dos testes in vitro, os leos essenciais deaafroegengibrepromoveramefeitoinibitriosobreofungoA. carbonarius;porm,oleodegengibreapresentouinibiototalnas concentraesapartirde500LmL-1. Joleoessencialdelourono apresentou atividade antifngica em nenhuma das concentraes testadas contra omesmofungo.Aconcentraomnimainibitriaparaosleosessenciaisde gengibreeaafrofoide250e500LmL-1,respectivamente.Foipossvel verificarqueosleosessenciaisdegengibreeaafroapresentaramefeito inibitriosobreomicro-organismoestudado.Dessamaneira,podemser utilizados como uma alternativa no controle de microorganismos em alimentos. Comit Orientador: Prof. Dr Maria das Graas Cardoso UFLA (Orientadora) e Prof. Dr. Lus Roberto Batista - UFLA (Co- orientador). viABSTRACT SOARES,RobertaPereira.EssencialoilsofZingiberofficinalis,Curcuma longaandLaurusnobilischemicalcaracterizationandbiologicalactivity againstAspergilluscarbonarius.2009.65p.Dissertation(Masterin Agrochemistry) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. Antimicrobialactivityisthemaincauseoffooddegradationand, frequently,is responsable for its reduction in quality and safety. In recent years, therehasbeenagrowinginterestingintheuseofnaturalproductsthatcan substitutechemicaladditives,becausesuchadditivescanrepresenthighttoxic risk to consumers. Condiments have a proven antimicrobial activity and can be usedtoconservefood.Theobjectofthisstudywastoevaluatethechemical makeupandtheantifungicalactivityoftheessencialoilsofCurcumalonga, LaurusnobilisandZingiberoficinallis,utilizingthebioanalyticmethod,to observethegrowthand/ormicelialinhibitionoffungalcultures,bymeansof comparationbetweentheabsolutecontrol(withoutoil)andrelativecontrol (tween80%).Fortheidentificationandquantificationofthechemical compositionoftheoils,agaschromatographaddedtoamass spectrophotometerandagaschromatographwithaflameionizationdetector (FID) were used, respectively. The compounds found in higher quantities in the essencialoilsofCurcumalonga,LaurusnobilisandZingiberoficinalliswere: ar-turmerone,1,8-cineolandgeranial,respectively.Theinvitrotestresultsfor CurcumalongaandZingiberoficinallesessencialoilspromotedaninibitory effectagainstA.carbonarius,however,Zingiberoficinallesessencialoils showed total inibition atconcetrations higher than 500 L mL-1. The essencial oilofLaurusnobilisdidnotshowantifugalactivityagainstthesamefungiat anyofthetestedconcetrations.Theminimumconcentrationsforinhibitory activity for Zingiber oficinalles and Curcuma longa essencial oils were 250 and 500LmL-1,respectively.Itwaspossibletoverifythattheessencialoilsof ZingiberoficinallesandCurcumalongashowedinhibitoryactivityagainstthe testedmicroorganisms.Beingsuch,theycanbeusedasanalternativeforthe control of food microorganisms.

GuidanceCommittee:Prof.DrMariadasGraasCardosoUFLA(Advisor)and Prof. Dr. Lus Roberto Batista - UFLA (Co-advisor). 11 INTRODUO Nanaturezahumnmeroexpressivodesubstnciasorgnicas,sendo osorganismosdoReinoVegetalumdosprincipaiscontribuintes.Ofascinante potencial de fornecimento de novas substncias deve-se incrvel capacidade de essesorganismosbiossintetizaremosmaisvariadostiposdeestruturas moleculares.Adiversidadeeacomplexidadedasmolculasalgorealmente fantsticoe,portanto,seriaumdesperdcionosebeneficiardaenorme capacidade de sntese das plantas. Aatividadeantimicrobianadesubstnciasnaturais,especialmentede leosessenciais,temsidoreconhecidaempiricamenteporsculos,mas recentementevemsendoestudadaevalorizadacientificamente.Atualmente,o usodeplantascomofontedemedicamentosmaisevidenteempasesem desenvolvimentonasia,AmricaLatinaefrica;porm,vriosgruposde pesquisadoresestoestudandoessaatividadeportodoomundo,orientados pelos conhecimentos populares. Osleosessenciaissocompostosvolteisextradosdosvegetaispor diferentestcnicas,sendoimportantesnocontroledeinmerosfungos filamentosos,levedurasebactrias.Ousoprticodessasatividadestemsido sugeridoemhumanoseanimais,bemcomonaindstriafarmacuticaede alimentos.Algunscompostospresentesnestesltimos,apresentamgrande eficcianocontroledemicro-organismoseestosendoextradoseelucidados portcnicasfitoqumicas,afimde,posteriormente,seremaproveitadosnas indstrias alimentcias e cosmticas como conservantes naturais. Autilizaodosleosessenciaisnasindstriasalimentciascrescea cadaano,comoobjetivodediminuirosdanoscausadosporaditivosqumicos utilizados na conservao dos alimentos, que podem possuir elevada toxicidade 2parahomenseanimais.Estudosdaspropriedadesantifngicasdosleos essenciais de grande parte das espcies condimentares so pouco explorados. As espciesLaurusnobilis,CurcumalongaeZingiberofficinales,conhecidas popularmentecomolouro,aafroegengibre,respectivamente,soutilizadas paratemperaralimentos.Essasespciessofamosasporseuusopopularno tratamentodedoenascausadaspormicro-organismos,porm,sorarosos estudostcnico-cientficosnosquaisseabordamsuasatividadesbiolgicas frente a fungos patognicos de alimentos. Assim, neste trabalho objetivou-se verificar o efeito inibitrio dos leos essenciaisdegengibre,aafroelourosobreocrescimentomicelialdofungo Aspergillus carbonarius e analisar a composio qumica desses leos. 32 REFERENCIAL TERICO 2.1 Metablitos secundrios de plantas Ao longo do processo evolutivo, as plantas desenvolverammecanismos dedefesaparasuasobrevivnciae,entreasformasdeproteoadquiridas, foramdesenvolvidasrotasbiossintticas,atualmenteconhecidascomo metabolismosecundrio,paraproduodesubstnciasnocivasetxicasaos inmeros parasitas e predadores (Salisbury & Ross, 1992).Emboraosvegetaiscontenhammilharesdeconstituintesqumicos,as propriedadesteraputicasestoespecialmenterelacionadascomoschamados metablitos secundrios. Esses so compostos evolutivamente selecionados para conferirvantagensadaptativassplantas.Essassubstnciasparticipam diretamentedasinteraesbioqumicasdeconvivnciaecomunicaoentreas plantaseosvriosorganismosvivosnosistemaambiental(Salisbury&Ross, 1992). Noincio,chegou-seaacreditarqueessescompostosoriundosderotas alternativaseramapenassimplesresduosdometabolismo.Entretanto,sabe-se atualmentequeasprincipaisfunesdosprodutosdometabolismosecundrio so:atuarcomoagentesdedefesaparacombatedeorganismospatognicos, insetosfitfagoseherbvorospredadores,eatuarcomoagentesdecompetio paramodificaodocomportamentogerminativoedocrescimentodeespcies vegetaisestranhas.Acapacidadeestimulatriadetaiscompostostambm destacada,jquepodemservircomoatraentesdeanimaispolinizadorese dispersoresdesementes,promovendo,assim,aperpetuaodeumadada espcie.Alcalides,terpenos,esterides,flavonides,cumarinas,xantonas, lignanas,fenilpropanides,acetofenonas,cromanos,quinonas,derivadosdo cidobenzicoedaacetofenonasoclassesrepresentativasdemetablitos 4secundriosdeplantas(Simesetal.,2004).NaFigura1verificam-seas principais rotas do metabolismo secundrio. FIGURA 1- Principais rotas de biossntese de metablitos secundrios. Fonte: Simeset al. (2004). 2.2 leos essenciais AInternationalOrganizationStandardization,ISO(1997)citadapor Simes&Spitzer(2004)definecomoleosvolteis,osprodutosobtidosde matrias-primas vegetais por meio da destilao por arraste de vapor, bem como expressodospericarposdefrutosctricos.Somisturascomplexasde substnciasvolteis,lipoflicas,geralmenteodorferaselquidas.Apresentam saborgeralmenteacreepicante,coloraesligeiramenteamareladasou 5incolores, so instveis na presena de luz, calor e umidade (Simes & Spitzer, 2004). Amaioria dos leos volteispossui elevado ndice derefrao de luz e so opticamente ativos, sendo essas propriedades utilizadas na sua identificao enocontroledequalidade.Seusconstituintesvariamdesdehidrocarbonetos terpnicos, lcoois simples e terpnicos, aldedos, cetonas, fenis, steres, teres, xidos, perxidos, furanos, cidos orgnicos, lactonas, cumarinas, at compostos sulfurados.Namistura,essescompostosapresentam-seemdiferentes concentraes, e, normalmente, um deles o composto majoritrio; outros esto em menores teores e alguns em baixssimas quantidades (Hauck, 2008). Deacordocomantigohierglifoegpcioemanuscritoschineses,os leosessenciaisforamutilizadosmilharesdeanosatrsnacuradedoenase conservaodecadveresemcerimniasreligiosas.Noinciodosculo,por faltadeestudosquecomprovassemsuaimportncia,elesforamconsiderados pelacomunidadecientficacomoprodutosdodesperdciofisiolgicoe desintoxicaodasplantas,mas,posteriormente,emrazodesuavolatilidade, funes fisiolgicas foram atribudas aos leos, como inibio da germinao de plantas;proteocontrapredadores,atraodepolinizadores,proteocontra perda de gua e aumento da temperatura, entre outras (Craveiro et al., 1981).Osleosessenciaistiveramascensonasrecentesdcadas,coma popularizaodaaromaterapia,prticautilizadanamedicinaalternativa,cujos adeptos acreditam na efetividade dos leos essenciais na cura de enfermidades e, atualmente so utilizados diretamente na manufatura de perfumes, cosmticos e comoflavorizantesdealimentosebebidas.SomuitoutilizadosnaUnio Europia,emalimentos(comoflavorizantes),emperfumes(fragrncias)e formulaesfarmacuticas.Suaspropriedadesantibacterianaseseus componentessoexploradosemdiversosprodutoscomoaferidoresdentaisdo canal da raiz e anti-spticos (Oosterhaven et al., 1995). 6Asmetodologiasempregadasparaaextraodeleosvolteis dependem da localizao do leo na planta, bem como da qualidade do leo que sedesejaobter.Entreessascita-seaenfloraro(enfleurage),utilizadaparaa obteno de leo de ptalas de flores, que contm baixo teor de leo e alto valor comercial(Oliveira&Jose,2007).Almdesses,destaca-seaextraocom solventesorgnicos,porm,nessatcnica,outrosconstituinteslipoflicosso extrados pelos solventes apolares, sendo o leo obtido de baixo valor comercial. O tipo de extrator utilizado o Soxhlet. A prensagem ou expresso outra tcnica empregada para a extrao de leos volteis de pericarpos de frutos ctricos no qual jatos de gua exercem uma ao abrasiva no pericarpo, rompendo as clulas secretoras, sendo o leo obtido apscentrifugao.Essatcnicapossuiproblemasrelacionadosextraode cumarinas,juntamentecomoleo,poisessassubstnciassofototxicas, impedindo que o leo extradoseja aproveitado naindstria cosmtica(Simes & Spitzer, 2004). IndustrialmenteaextraocomCO2 supercrticoummtodomuito eficientedeextraodeleosessenciais,devidoqualidadedoleoobtido, livredesolvente;porm,essemtodoapresentaumcustoelevado(Carrilhoet al., 2001; Maul et al., 1996). Astcnicasdeextraodeleosvolteisporarrasteavapore hidrodestilaopossuemoprincipiodearrastaroleovoltilatravsdevapor. No arraste a vapor, o material vegetal no fica em contato com a gua, no estado lquido,egeralmente,utilizadoemescalaindustrial.Nahidrodestilao,o materialvegetalficaemcontatocomagua,noestadolquido,eosleos volteis,porpossuremtensodevapormaiselevadaqueadagua,so arrastados. Essa tcnica a mais empregada em escala laboratorial, utilizando-se o aparelho do tipo Clevenger (Kelen & Tepe, 2008). 72.3 Biossntese e composio qumica dos leos essenciais Amaioriadosleosessenciaispossuiemsuacomposioos fenilpropanidese/outerpenides.Osfenilpropanidessocaracterizadospor apresentaremumanelbenznicocomumacadeialateraldetrscarbonos (Figura2)derivadosdocidochiqumico,formadordasunidadesbsicasdos cidos cinmico e p-cumrico (Figura 3) (Simes et al., 2004). FIGURA 2 Estrutura qumica do fenilpropanide. Fonte: Simes et al. (2004). cido chiqumicoX= H: fenilalanina X = OH: tirosina PAL= fenilalanina-amino-liase X = H: cido cinmico X = OH: p-cumrico FIGURA 3 Biossntese de fenilpropanides. 8Os terpenides fazem parte da composio de uma grande variedade de substncias vegetais, sendo esse termo empregado para substnciascuja origem biossintticaderivadeunidadesdeisopreno(2-metil-1,3-butanodieno)(Figura 4) que, por sua vez, originam-se do cido mevalnico (Simes et al., 2004). A via mevalonato inclui a condensao de duas unidades de acetoacetil-CoA,gerando,posteriormente,3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA(HMG-CoA), apssofrerhidrlise.Aenzima3-hidroxi-3-metilglutaril-CoAredutase(HMG-CoA-redutase)reduzesseprodutoacidomevalnico,queconvertidoa isopentil pirofosfato (IPP) ou isoprenoativoeseuismeroativodimetilalil-pirofosfato(DMAPP).Esses condensam-se,gerandootrans-geranil-pirofosfato,oqualdarorigemaos monoterpenos e sesquiterpenos (Figura 5) (Santos, 2004). FIGURA 4 Estrutura qumica da unidade isoprnica (2-metil-1,3-butanodieno). 9 HMGCOA= 3-hidroxi-3-metil-glutaril CoA IPP= isopentil-pirofosfato DMAPP= dimetil-alil-pirofosfato MevalonatoIPPDMAPP geranilpirofosfato FIGURA 5 Biossntese dos monoterpenos e sesquiterpenos. Fonte: Simes et al. (2004). Oscompostosterpnicosencontradoscommaiorfrequnciasoos monoterpenos (90% dos leos volteis), seguidos dos sesquiterpenos (Figura 6), sendoosditerpenosencontradosapenasemleosessenciaisextradoscom solventes orgnicos (Simes & Spitzer, 2004). 10 FIGURA 6. Condensao de unidades de isopreno na formao de terpenides. Osmonoterpenosfazempartedaclassemaissimplesdosterpenides, sendoconstitudospor10tomosdecarbono,ouseja,duasunidadesde isopreno.Socomponentesdamaioriadosleosessenciais.Omaiorinteresse nessescompostososeuusocomoperfumeseflavorizantesemalimentos, apesar de eles apresentarem efeitos inseticida e farmacolgico (Dey & Harbone, 1997).Osexemplosmaiscomuns,encontradosnosleosvolteisso:linalol, geraniol,tujona,cnfora,limonenoeoutros.Jentreossesquiterpenosmais comuns,encontram-seofarnesol,nerolidol,bisabolenoeoutros(Simesetal., 2004). Ossesquiterpenossobastanteencontradosemplantas,fungosealgas. Maisde100sesquiterpenossoconhecidoseidentificados.Suasestruturas compreendem15tomosdecarbono,queserelacionamcomoconstituinte fundamental do qual podem se considerarderivados do trans-cis-farnesol ou do trans-trans-farnesol(Costa,1994).Amaioriadossesquiterpenosapresenta propriedades biolgicas, como inseticida e antibitica (Dey & Harbone, 1997). Outrarotaparaabiossntesedeterpenosa1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato(DXPS)(Figura7).Poressavia,opiruvatoeogliceraldedo-3-fosfato 11formam o 1-deoxi-D-xilose-5-fosfato (DXPS) que, posteriormente, d origem ao 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato(MEP).Emseguida,soformados,por sucessivasreaes,oisopentenil-difosfato(IPP)eodimetilalil-pirofosfato (DMAPP), dando origem aos terpenos (Deschamps, 2005 citado por Guimares, 2007). Via DXPS 1-Deoxi-D-xilulose-5-fosfato 2-C-metil-D-eritritol-4fosfato 4-(citidina-5-difosfo)-2-C-metil-D-eritritol 2-C-metil-D-eritritol-2,4-ciclodifosfa 2-fosfo-4-(citidina-5-di-fosfo)-2-C-metil-D-eritritol IPPDMAP Terpenos FIGURA7BiossntesedeterpenospelaviaDXPS(1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato).Fonte: Simes et al. (2004). 122.4 Atividade antifngica de alguns leos essenciais Osleosessenciaissomisturascomplexasdevriassubstncias.A atividade antifngica desses leos pode estar relacionada com a presena de uma substnciaouumconjuntodelas.DeacordocomPateletal.,(2005),a composioqumicabemcomoosgruposfuncionaisdosleostmumpapel importante na atividade antimicrobiana e essa atividade pode ser potencializada. De acordo com Sacchetti et al. (2005), a ao desses leos em micro-organismos pode estar ligada a diferenas na composio qumica de cada um. Craveiro&Machado(1986)jhaviamdescritoqueosmonoterpenose sesquiterpenossoresponsveispordiversasatividadesbiolgicascomo,por exemplo,anestsica,antibitica,anti-helmntica,anti-inflamatria,sedativa, espasmoltica,entreoutras.Omecanismodeaodosterpenosem microrganismosaindanofoielucidado,masespecula-sequesuaaopossa estarassociadaaumrompimentodamembranaatravsdeligaescomos compostos lipoflicos (Cowan, 1999).Sacchettietal.(2005)descreveramquelevedurasefungosso marcadamenteinibidosporleosricosemfenis,aldedoselcoois.Em pesquisadesenvolvidaporChatterjeeetal.(2005),demonstrou-sequeosleos podemregularosefeitoscelulareseaproduodeaflotoxinasproduzidaspor fungos. SegundoCitetal.(2003),osleosessenciaisencontramsuamaior aplicaobiolgicacomoagentesantimicrobianos,sendoessacapacidade associadaaumaextensodoprpriopapelqueelesexercemnasplantas, defendendo-as de bactrias e fungos fitopatognicos. Montes-Belmont & Carvajal (1998), investigando o efeito de seteleos essenciaisdeplantascontraA.flavus,afirmaramqueosleosessenciaisde canela(Cinnamomumzeylanicum),hortel(Menthapiperita),manjerico (Ocimum basilicum), tomilho (Thymus vulgaris), organo (Origanum vulgare) e 13cravo (Syzygium aromaticum) causaram total inibio do desenvolvimento desse fungo em sementes de milho. Salgadoetal.(2003),testandoosleosessenciaisdetrsespciesde eucalipto(E.urophylla,E.camaldulenseseE.citriodora),observaram considervel efeito inibitrio do leo essencial da espcie E. urophylla sobre os fungos F. oxysporum, B. sorokiniana e Bipolaris sorokinian. Para estas espcies, apresenadasubstnciaqumicaglobulolpresentenoleoessencialfoia responsvel pela atividade biolgica apresentada. Souzaetal.(2004),pesquisandoosleosessenciaisdoscondimentos alho(AlliumsativumL.),canela(CinnamomumburnannilMeissn),cravo-da-ndia(CaryophillusaromaticusL.)etomilho(ThymusvulgarisL.),extrados pela tcnica de arraste a vapor e testados nas concentraes de 500; 1.000; 1.500 e 2.000 mg mL-1, exceto o cravo, que foi testado nas concentraes e 200; 400; 600e800mgmL-1sobreosfungosRhizopussp.;Penicilliumspp.;Eurotium repens e Aspergillus niger, isolados de pes envelhecidos, mostraram que esses leosapresentaramatividadebiolgica.Observaramqueoleoessencialda canelainibiucompletamenteodesenvolvimentodosfungostestados.Osleos de tomilho e alho tiveram o mesmo efeito nas concentraes mais altas e o leo de cravo inibiu o desenvolvimento dos fungos Aspergillus niger, Rhizopus sp. e Eurotiumrepens,comaconcentraode600mgmL-1,edofungoPenicillium spp., com a de 800 mg mL-1. Segundo Viegas et al. (2005), os leos essenciais da casca de canela e os de bulbilhos de alho apresentaram atividade promissora contra A.flavus isolados apartirdoamendoim.Apesquisafoirealizadautilizando-se37isolados diferentes, durante 12 meses e o efeito antifngico desses leos essenciais variou para cadaisoladotestado. Oleo essencialde alho promoveu halosde inibio que variaram entre 7,0 e 15,0 mm. Porm, para 34% dos isolados testados, esses halosforammaioresdoque12,0mm,valorconsideradoanteriormentepor 14Gunatilaka et al. (1994) como ideal para testes in vitro.Para o leo de casca de canela, observou-se maior dimetro do halo de inibio para T2, isolado do solo, que para o T24, isolado de semente. Pereiraetal.(2006)avaliaramosefeitosinibitrios,invitro,dosleos essenciais dos condimentos, alecrim (Rosmarinus officinalis L.), cebola (Allium cepaL.),manjerico(OcimumbasilicumL.),menta(MenthapiperitaL.)e organo(OriganumvulgareL.)sobreodesenvolvimentodefungos.Osleos foram testados nas concentraes de 500; 1.000; 1.500 e 2.000 mg mL-1. Como culturaspadres,foramutilizadososfungosFusariumsp.;Aspergillus ochraceus.;Aspergillusflavus e Aspergillus niger. O leoessencial do organo inibiu o desenvolvimento dos fungos testados em todas as concentraes, exceto ofungoA.niger,queteveoseudesenvolvimentomicelialinibidoapartirda concentraode1.000mgmL-1.Osleosdealecrim,menta,cebolae manjerico tiveram um efeito pronunciado a partir da concentrao de 1.500 mg mL-1. Opotencialfungitxicodosleosessenciaisdasplantascondimentares RosmarinusofficinalisL.(alecrim),OriganumvulgareL.(organo),Thymus vulgaris L. (tomilho), Lippia graveolens HBK (lipia), Zingiber officinale Roscoe (gengibre),OcimumbasilicumL.(manjerico),SalviaofficinalisL.(slvia)e CinnamomumzeylanicumBreyn(canela)foramavaliadossobreisoladosde Candida spp. O leo essencial de organo apresentou CMI (crescimento mnimo inibitrio)eCMF(crescimentomnimofungicida)entre200gmL-1e800g mL-1; o leo de lipia entre 400 g mL-1 e 1.600 g mL-1; o de tomilho entre 800 g mL-1 e 1600 g.mL-1; o de canela entre 800 g mL-1 e 1600 g mL-1; o leo degengibreentre1.600gmL-1e3.200gmL-1.Josleosessenciaisde manjerico,slviaealecrimevidenciaramCMImaiorque3.200gmL-1 (Pozzatti et al., 2006). 15Mishra&Dubey(1994)constataramaatividadefungitxicadoleo essencial de capim-limo a 1.500 ppm em meio BDA sobre fungos dos gneros Penicillium, Alternaria, Fusarium e Botrytis.Mishraetal.(1995)verificaramqueFusariumoxysporumapresentou inibiodeseucrescimentomicelialquandosubmetidoaoleoessencialde rizomas da planta jatamansi (Nardostachys jatamansi) na concentrao de 1.000 ppm em meio Czapek-dox gar.Silva&Bastos(2007)avaliaramaatividadefungitxicadoleo essencial em diferentes concentraes extrado de 10 espcies de Piper coletadas naregioAmaznica,sobreocrescimentomicelialeagerminaode CrinipellisperniciosaesobreocrescimentomicelialdePhytophthora palmivoraePhytophthoracapsici.Osleosmaisefetivosqueinibiramem 100%ocrescimentodostrsfungosforamosdeP.callosum,P.marginatum var.anisatumeP.enckea,nasconcentraesde0,75LmL-1 e1LmL-1. Quanto germinao de basidisporos de C. perniciosa, o leo de P. dilatatum foiomaiseficientea0,4LmL-1,seguidopelosleosdeP.callosumeP. marginatum var. anisatum a 0,5 L mL-1. 2.5 Plantas medicinais, aromticas e condimentares Desdeascivilizaesmaisantigas,asplantasmedicinais,aromticase condimentaresjeramutilizadascomoobjetivodecurar,aromatizarecomo propsitodeconservarcadveresemcerimniasreligiosasnaformade blsamoseresinas.Ambaspossuemsimultaneamenteprincpiosativoscapazes decurarenfermidadesou,emdoseselevadas,provocarintoxicaesfatais, possuemaromae/ouperfumecapazesdesensibilizaroolfatodemodo agradvel,capacidadepararealarosabordosalimentosepropriedades conservantes (Upnmoor, 2003). 16Condimentoseespeciariassoprodutosaromticosdeorigemvegetal utilizadosprincipalmenteparaconferirsaboraosalimentos.Almdessa utilidade,possuemtambmpropriedadesantimicrobianas,antioxidantese medicinais.Cercade70tiposdiferentesdecondimentossoencontradosno mercadoesoamplamenteutilizadosparamelhorarosabordealimentose bebidas, sendo os leos essenciais de cravo, canela e cssia empregados desde as civilizaes mais antigas para essa finalidade (Shelef, 1983). 2.5.1 Curcuma longa (aafro). PertencentefamliaZingiberaceaeapresenta-secomoumaespcie herbceaeperene.Suaorigemosuldandia,sendocultivadanaChina, Kuwait,ndia,Indonsia,SriLanka,Filipinas,Caribe,nortedaAustrliae AmricadoSul.NoBrasil,conhecidacomocurcuma,batatinha-amarela, gengibre-dourado,mangarataia,aafro-da-terraouaafrodandia.Apresenta umcultivofcil,podendosedesenvolveremclimastropicais,emaltitudesque variamdonveldomarat1500metemperaturasnointervalode20a30C, preferencialmentesobsoloargiloso,frtilericoemmatriaorgnica (Scartezzini & Speroni, 2000).A planta apresentacaractersticas bemmarcantes,comofolhas grandes, longamentepecioladas,invaginanteseoblongo-lanceoladas,queexalamum odoragradvelquandocortadas.Possuifloresamareladas,pequenas,dispostas emespigascompridaserizomastuberososdecentroarredondadocomlaterais alongadasdecoloraoalaranjadacrescendoabaixodosoloeque,agrupados, formamumaestruturachamadamo(Figura8).Apropagaodacurcumaem plantioscomerciaisassexuadavegetativa.Oplantiopodeseserrealizado diretamentenosolopormeiodobulbo(rizomasprimrios)oupormeiodos rizomassecundriosconhecidoscomodedosoupies,originadosdos 17primeiros.Apocaidealparaoplantiosoosmesesdeagostoesetembro (Lorenzi & Matos, 2002; Scartezzini & Speroni, 2000). (A)(B) FIGURA 8 (A) Aspectos gerais da raiz de aafro, (B) Parte area do aafro. Fonte: Lorenzi & Matos (2002). 2.5.1.1 Utilizao medicinal e condimentar NoBrasil,oaafropossuigrandeutilidadenaculinriaparatemperar pratos,sendoospigmentoscurcuminidesmuitoutilizadosparao processamento dealimentos. Namedicina popular, soconferidas a essa planta propriedadesanti-hepatxicas,anti-hiperlipidmicaseanti-inflamatrias (Lorenzi&Matos,2002).umestimulantearomticoraramenteutilizadona medicina,excetocomocorante.Seuusoprincipalestnafabricaodepsde caril.Tambmutilizadoparasubstituiramostardanafabricaode condimentos. A tintura de aafro usada como agente corante, porm, seu odor noagradvel.Namedicinapopular,araizdeaafroutilizadacomo antihepatxica,antihiperlipidmicaeanti-inflamatria,notratamentode doenas, como clculo biliar, ictercia e priso de ventre, so utilizadas a tintura 18e o extrato dessa planta, que tambm tem ao anti-PAF (contra o fator alrgico do PAF) e hipoglicemiante (Grieve, 2008). O componente qumico presente em maior teor nessa espcie o amido (25a50%),seguidodeprotena(4a10%),fibrasecinzas(2a7%).Emsua composio qumica, tambm registra-se a presena de 2 a 7% de leo essencial epigmentoscurcuminides.Seuleoessencialricoemsesquiterpenos oxigenadose,entreseuscomponentesfixos,destaca-seacurcumina,uma substncia corante avermelhada.Apresenadosconstituinteslimonenoelinaloltambmfoiverificada no leo essencial de aafro por Zwaving & Bos (1992). OleoessencialdeC.longaencontra-seretidoemvacolos citoplasmticos,quepodemserrompidospordanosmecnicosoufsico-qumicos.Apresentabaixatemperaturadeebulio,fortearoma,coloraoque variadeamarelo-plidoaamarelo-alaranjadoetemodorcaracterstico.Seus principaiscomponentessoturmerona(35%),ar-turmerona(12%),e-zingibereno (25%), 1-8 cineol (1%), sabineno (0,6%) e borneol (0,5%) (Mata et al., 2004). Richard & Loo (1992) e Oguntimein et al. (1990) confirmaram em suas pesquisasapresenadascetonassesquiterpnicastumeronasear-tumeronas,e tambmdosconstituintes-e-zingibereno,1,8-cineol,-felandreno, sabineno,cineoleborneolcomoosprincipaisconstituintesdoleovoltildos rizomas de aafro. 2.5.2 Gengibre originriadasiatropical,possuihbitoherbceo,rizomatosa perene,possuirazesadventciasefolhasdsticas,sendoasbasilaresreduzidas, brcteas florais obovadas, cada uma envolvendo uma s flor e rizomas de sabor picante.Multiplica-seapenasporrizomas,quepossuemaromaesabor 19suavementecanforceo;cultivadanoBrasilcompropsitomedicinale ocasionalmente como ornamental (Figura 9) (Lorenzi & Matos, 2002). (A)(B) FIGURA 9 (A) Aspecto geral de raiz de gengibre (B) Parte area de gengibre. Fonte: Lorenzi & Matos (2002). 2.5.2.1 Utilizao medicinal e condimentar Araizpossuipropriedadescarminativas,digestivas,sudorficas, antigripais e estimulantes. utilizado para tratar dispepsias e clicas intestinais, excelentequandoadicionadoainfusesaquente,muitotilcontragastrites alcolicas;usado,ainda,paradiarriaquandonoexisteinfeco.Och quente de gengibre uma tima opo para combater resfriados, tem o poder de ruborizar (Grieve, 2008). Na sua composio qumica, destacam-se o leo essencial, curcuminas e seusderivados,resina,amido,substnciasterpenidesesaisminerais,almde uma substncia denominada metoxicinamato de etila, com forte poder fungicida (Lorenzi & Matos, 2002). 20SegundoMartinsetal.(2000),oleoessencialdeZ.officinalestem comoconstituintesqumicosogingerol,zingibereno,-bisaboleno,zingerona, -felandreno, citral, canfeno e cineol, entre outros. Oodordogengibredependemuitodoseuleoessencial,tendoum rendimento que pode variar de 1% a 3%. Cerca de 50 componentes presentes no leojforamcaracterizados,sendoamaioriamonoterpenides:-felandreno, (+)-canfeno,cineol,geraniol,curcumeno,citral,terpineol,borneole sesquiterpenides:-zingibereno(30%a70%),-sesquifelandreno(15%a 20%),-bisaboleno(10%a15%),(E-E)--farneseno,ar-curcumenoe zingiberol.Algunsdessescomponentessoconvertidosduranteasecagemem compostos com menos odor (Evans & Saunders, 2002; Langner et al., 1998).Apungnciadogengibrefrescoestintimamenteligadaaosgingeris, quesosrieshomlogasdosfenis.Omaisabundanteo[6]-gingerol,mas pequenasquantidadesdeoutrosgingeriscomdiferentescadeiastambm podemestarpresentes.Apungnciadogengibresecoresultadosshogais, como,porexemplo,[6]-shogaol,quesoformasdesidratadasdosgingeris, formados a partir de um processo trmico (Wohlmuth et al., 2005). 2.5.3 Laurus nobilis (louro) umarvoreouarbustodefolhasperenes,com5 a10mdealtura, podendoatingir20m,possuicopaovada,densaeirregular.Apresentafolhas comcurtopecolo,oblongas,agudaseodorferas,devidoapresenade glndulas aromticas (Figura 10). 21 (A) (B) FIGURA10(A)Aspectosgeraisdasfolhasefloresdolouro,(B)Plantade louro. Fonte: Lorenzi & Matos (2002). caracterstica do clima mediterrneo e existe em toda essa regio, at asiaMenor.Noseadaptaemregiesdeextremofrioenoultrapassaos 800 m de altitude. Vive cerca de 80 a 100 anos. muito apreciada na culinria, cujasfolhassoutilizadascomotempero.Noplantadaemlargaescala, sendo cultivada em pequenos terrenos. 2.5.3.1 Utilizao medicinal e condimentar SegundoMarques(2001),hrelatosdautilizaodasfolhasdeL. nobilisparaotratamentodeafecesgstricasereumticas,almdepossuir atividadeantiespasmdica.empregadotambmcomosudorficoecontra flatulncias, sendo utilizado externamente em feridas e lceras. indicado para o tratamento de nevralgias, gases, bronquite, reumatismos e como digestivo nas formasfarmacuticasdeinfusoedecocodasfolhas.Seusfrutosraramente soutilizadosinternamente,sendocomunsapenasemprticasveterinrias, funcionandocomoestimulantes.Hrelatosdeusonocontroledehisteria, hemorridas, clicas intestinais, e outros. 22Apresentanasuacomposioqumicaumleovoltilverde-amarelado largamenteobtidopeladestilaodasfolhas,quecontmumagrande porcentagem de xidos. Os frutos contm tanto o leo voltil quanto o leo fixo, conhecido como leo-de-louro (Grieve, 2008). Oleoessencialdessaespcieencontra-searmazenadoemclulas secretorasquepodemserencontradasnasfolhas,nascascasenolenhoe apresentaemsuacomposiolaurostearina,geraniol,linalol,cineol,terpineno, eugenolepineno.Almdecidosgraxos,cidosorgnicosetanino(Barroset al., 1997; Marques, 2001). Sangunetal.(2007),empesquisascomosleosessenciaisdefolhase frutosdeLaurusnobilisdediferentesregiesdaTurquia,obtidosporextrao comsolventeseanalisadosporcromatografiagasosaacopladaao espectrofotmetrodemassas(GC/MS),mostraramqueacomposioqumica doleoessencialdeambasaspartesdaplantafoisimilarqualitativamente.Os compostosqumicosencontradosemmaiorconcentraonasfolhasforam1,8-cineol, sabineno e acetato de -terpinil e, em menor concentrao, o -pineno, -felandrenoetrans--osimeno.O1,8-cineol(59,94%)foiocomponente majoritriopresentenoleoessencialdasfolhas,aopassoqueo-pineno,-pineno,felandreno,1,8-cineoletrans--osimenoforamencontradosemmaior concentraonosfrutos,sendootrans--osimenocomponentemajoritrio presente no leo essencial dos frutos (28,35%). 2.6 Gnero Aspergillus e produo de micotoxinas OgneroAspergilluspertenceaogrupodosHyphomycetos,caracterizados pelaformaodeconidiforos,ouseja,hifasespecializadaseprodutorasde condios com formas e arquiteturas variveis (Figueiredo, 2008; Pitt & Hocking, 1997).Elespodempromoverprejuzossignificativosaosalimentos.Quando presentesemsementes,ocasionamperdadopodergerminativo.Noarrozena 23manteigadecacau,afetamaqualidade,causandodescolorao,enocaf produzemaromasdesagradveis. Podem,ainda,alterar as condiesfsicas dos produtos, reduzir o valor nutritivo, alterar o aspecto externo, produzir aflatoxinas e outros metablitos e favorecer a ao de outros agentes de deteriorao, como leveduras, bactrias e insetos (Fonseca, 2008).A contaminao eadeteriorao dosalimentos causadospor esses tiposde fungossomaiscomunsqueasoriginadasporqualqueroutrogrupodemicro-organismos.Acontaminaoimportantenoapenassobopontodevista sensorial,mastambmpeloperigoqueaproduodemicotoxinasrepresenta para o consumidor (Muninbazi & Bullerman, 1996). Asmicotoxicosessoestadospatolgicoscausadosportoxinasfngicas presentes nos alimentos nos quais os agentes se desenvolvem. Existem mltiplas micotoxicoses,sendoasmaisimportantesasprovocadaspelosfungos: Aspergillusflavus,A.parasiticus,Pithomyceschartarum,Fusarium graminarum,Fusariummoniliforme,Fusariumsporotrichioides,Claviceps purpureaeeAcemoniumcoenophialum.Essesfungosprovocamuma intoxicaoquandoocorreaingestodesubstnciaspr-formadas(toxinas) resultantesdeseumetabolismosobrealimentosespecficos.Nosanimais,as micotoxinasprovocammenorprodutividade,maiorincidnciadedoenas devido a imunossupresso, leses de rgos vitais, comofgado, e interferncias com a capacidade reprodutiva (Maciel et al., 2007). 2.6.1 Aspergillus carbonarius .Aspergillus carbonarius capaz de produzir micotoxinas atravs de seu metabolismo secundrio, sendo a principal a ocratoxina A. Esse fungo encontra-sepresenteemdiversosprodutosvegetais,comocereais,caf,cacau, especiarias, frutos secos, amendoins e uvas, sendo possvel encontr-lo na carne. umaespciedegrandeimportncianocenriocientficodevidosua 24habilidade de produzir ocratoxina, que bem maior do que a dos fungos A. niger e A. ochraceus (Palacios-Cabrer et al., 2005). Magnanietal.(2005)encontrarampelaprimeiravezapresenado fungoA.carbonariusemfrutosdecafcoletadosnarvorepelastcnicasde PCR. Pesquisasquedesenvolvampossveisagentesantifngicoscontraeste fungo so ainda bem escassas, apesar da grande importncia que esse exerce na contaminao de alimentos. 2.6.2 Ocratoxina A (OTA) AocratoxinaA(Figura11)foidescobertanafricaporMerweetal. (1965)citadosporPradoetal.(2000).Descritainicialmentecomometablito secundriodofungoA.ochraceus.Possuiaonefrotxica,teratognica, carcinognica,citotxica,imunotxica,genotxicaeimunossupressora,para animais,epossivelmente,parahumanoseconstitui-secomoumcontaminante dealimentos.(Dirheimer,1996citadosporPradoetal.,2000).AOTAocorre comocontaminantenaturaldocafedauva,podendoserproduzidapelos fungos Aspergillus carbonarius e A. ochraceus.Aocratoxina(OTA)amicotoxinademaiorsignificnciaencontrada nosgrosdecafecevada.Apresenadessatoxinanocaffoiprimeiramente relatadaem1974,sendorelatadanovamenteemoutrosestudos.Suapresena emalimentostem sido encaradacomo problemamundial nasadepblica.Em pasesdeclimatropical,espciesdeAspergillustmsidoumadasmaiores responsveis pela produo de OTA no caf (Taniwaki et al., 2003). 25 FIGURA 11 Estrutura qumica da Ocratoxina A. 263 MATERIAL E MTODOS 3.1 Obteno do material vegetal Osrizomasdeaafro(Curcumalonga),asfolhasdelouro(Laurus nobilis)naformasecaforamadquiridosnoMercadoMunicipaldeBelo Horizonte-MGeosrizomasdeZingiberofficinalesforamadquiridosinnatura em hortifrutigranjeiros da cidade de Lavras-MG. 3.2 Extrao dos leos Essenciais Osleosessenciaisdegengibre,aafroelouroforamextradosno LaboratriodeQumicaOrgnicadaUniversidadeFederaldeLavras,pelo mtododeextraoporhidrodestilao,utilizando-seoaparelhodeClevenger modificado,acopladoaumbalodefundoredondocomcapacidadepara6L (Castro et al., 2006). As razes de aafro e gengibre e as folhas de louro foram utilizadas da mesma forma que adquiridas. A extrao foi realizada em triplicata porumperodode2horas.Decorridoessetempo,ohidrolatofoicoletadoea separao do leo foi realizada pelo processo de centrifugao em centrfuga de cruzetahorizontala965,36xGpor5minutos.Apsaseparaodasfases,o leofoiretiradocomauxliodeumapipetadePasteur.Osleosessenciais obtidosforamcolocadosemvidrospreviamentesecos,pesadosedeixadosem capelaprotegidosdaluzatpesoconstanteparacompletaevaporaodo solvente remanescente. 3.3 Perfis cromatogrficos dos leos essenciais A anlise qualitativa do leo essencial foi realizada no Departamento de QumicadaUniversidadeFederaldeSergipe(UFS)AracajuSE,por cromatografiaemfasegasosaacopladaespectrometriademassaCG/(EM).O 27cromatgrafoutilizadofoiomodeloShimadzuG-17Aequipadocomdetector seletivodemassamodeloQP5050A.Oequipamentofoioperadonasseguintes condies:colunacapilardeslicafundida(3,0mX0,25mm)comfaseligada DB-5MS(Folsom,CA,USA);temperaturadafontedeonsde280C; programaodacolunacomtemperaturainicialde50Cpor2min,comum aumentode4C/min.,at200C,depois10C/minat300C,finalizando com uma temperatura de300 C por 10 min; gs carreador hlio (1 mL min-1); pressoinicial na coluna de 100,2 KPa; taxa de split 1:83 e volumeinjetado de 0,5L(1%desoluoemdiclorometano).Paraoespectrmetrodemassas (EM),foramutilizadasasseguintescondies:energiadeimpactode70eV; velocidadededecomposio1.000;intervalodedecomposiode0,50;e fragmentosde40Dae550Dadecompostos.Foiinjetada,nasmesmas condiesdaamostra,umasriedepadresdehidrocarbonetos(C9H20....... C26H54).Osespectrosobtidosforamcomparadoscomobancodedadosda bibliotecaWiley229eondiceKovats,calculadoparacadaconstituinte,foi comparado com o tabelado, de acordo com Adams (1995).Aavaliaodosteoresdosconstituintesdoleoessencialfoifeitano Laboratrio de Qumica Orgnica do Departamento de Qumica da Universidade Federal de Lavras (UFLA) Lavras MG, utilizando um Cromatgrafo gasoso Shimadzu GC 17 A, equipado com detector por ionizao de chamas (FID), nas condiesoperacionais:colunacapilarDB5;aprogramaodacolunacom temperatura inicial de 50 C por 2 min, com um aumento de 4 C/min., at 200 C , depois 10 C/min at 300 C , finalizando com uma temperatura de300C por 10 min; temperatura do injetor de 220 C; temperatura de detector de 240 C; gs carreador nitrognio (2,2 mL min-1); taxa de split 1:10 e volume injetado de 1 L (1% de soluo em diclorometano) e presso na coluna de 115 KPa, sendo aquantificaodecadaconstituinteobtidapormeiodenormalizaodereas (%).283.4 Atividade antifngica dos leos essenciais 3.4.1 Microorganismos Foram utilizadas cepas de Aspergillus carbonarius pertencente cultura demicro-organismosdoLaboratriodeMicrobiologiadeAlimentosdo Departamento de Cincias dos Alimentos da UFLA. 3.4.2 Teste biolgico AscepasdosfungosAspergilluscarbonariusforammantidasemmeio inclinado CZAPEK-DOS (CYA), acrescentado de extrato de levedura emBOD a25C.Comoauxliodeumaala,essasforamrepicadasemplacasdePetri, contendo 20 mL do mesmo meio de cultura para a sua ativao e verificao de contaminao. Incubaram-se as placas a 25 C por 7 dias. Asanlisesmicrobiolgicasdosleosessenciaisforamrealizadasno LaboratriodeMicrobiologiadeAlimentosdeDepartamentodeCinciados Alimentos da Universidade Federal de Lavras (UFLA). O mtodo utilizado foi o bioanalticoinvitro,noqualforamavaliadososefeitosinibitriosde diferentes concentraes dos leos (2.000, 1.000, 500, 250 e 100 L L-1) sobre o crescimentomicelialdofungoA.carbonariusemcomparaocomuma testemunhaabsoluta(placacomCZAPEK-DOX(CYA))eumatestemunha relativa (placa com Tween 80% nas concentraes 2.000, 1.000, 500, 250 e 100 LL-1),comafinalidadedeverificaroefeitodoemulsificantesobreo crescimentomicelial.AsplacasforamincubadasemBODtemperaturade25 C,temperaturatimadecrescimentoeproduo demicotoxina.Asavaliaes foramrealizadasapssetediasdamontagemdoexperimento,pormedies diametralmenteopostasdocrescimentomiceliale,decadaduasmedidas opostas, foram calculadas as mdias (Freire, 2008). A porcentagem de inibio do crescimento micelial foi calculada usando a seguinte frmula (Lindsey & Standen, 2004): 29% inibio = 100 (E/C X 100). Em que:E = mdia do crescimento micelial de cada tratamento.C = mdia do crescimento micelial da testemunha absoluta (controle).Osexperimentosforamrealizadospordelineamentointeiramente casualizado,emesquemafatorial(4x6)x4,sendo3leosessenciais(gengibre, aafroelouro)e6concentraes(0,100,250,500,1.000,2.000)comquatro repetiesparacadatratamento.Asvariveisrelativasformaodohalode crescimento foram submetidas anlise de varincia e as comparaes mltiplas demdiaspelotestedeScott-Knott(5%),utilizandooprogramaSISVAR (Ferreira, 2000). 304 RESULTADOS E DISCUSSES 4.1 Perfis cromatogrficos dos leos essenciais4.1.1 Aafro O leo essencial da raiz seca de aafro (Curcuma longa), analisado por cromatografia gasosa acoplada ao espectrmetro de massas (CGMS), apresentou 4 compostos principais. Esses foram identificados por meio da comparao entre osndicesdeKovats(IK),calculadosdeacordocomAdams(1995).Os espectros de massa obtidos foram comparados com os resultados dos bancos de dadosdabibliotecaWiley229.OsteoreseseusndicesdeKovatscalculados esto apresentados na Tabela 1. Ocromatogramadoleoessencialdeaafroapresentou16picos identificados(Anexo1A).Entreoscompostosidentificados,estoaar-turmeronacomocompostomajoritrio,com31,38%seguidadep-cimeno,-turmerona e 5 dimetil-4 hexenil 3-metil, nas concentraes de 16,60%, 15,71% e 14,01%,respectivamente.NaFigura12apresentam-seasestruturasqumicas dos compostos majoritrios encontrados nesse leo essencial. 31TABELA1Constituintesqumicosdoleoessencialdeaafroidentificados por CG/EM-ndice de Kovats. Pico aTR bIKcalConcentrao mdia (%)Composto 16,8479230,72-tujeno 28,1169670,51Sabineno 38,2119720,57-pineno 49,1529862,52Mirceno 59,84710053,43-felandreno 610,099102316,60p-cimeno 715,47810310,781,8-cineol 815,973 bNI0,51 cNI 921,68012891,08Timol 1024,11914180,67(E)-cariofileno 1126,15314802,47Ar-curcumeno 1226,57614940,88-zingibereno 1327,48615231,86Sesquifelandreno 1429,18915761,31Ar-turmerol 1529,957-0,94 cNI 1630,594-0,73 cNI 1730,767-0,48 cNI 1830,888-0,97 cNI 1931,79031,38Ar-turmerona 2031,91015,71-turmerona 2132,85114,015-dimetil-4hexenil3-metil 2234,908-1,37 cNI 2335,555-0,45 cNI a tempo de reteno,b ndice Kovats calculado, c no identificado . 32Richard&Loo(1992)eMata(1999)identificaramcomocomponentes principais, no leo essencial de aafro obtido pelo mtodo de hidrodestilao, a ar-turmerona,encontradatambmcomoumdoscomponentesmajoritriosdo leo essencial em estudo, e o -zingibereno, ar-curcumeno e -sesquifelandreno. Os resultados tambm esto de acordo com Oguntimein et al. (1990), os quaisrelataramqueosprincipaisconstituintesdosleosessenciaisdorizoma so os sesquiterpnicos cetnicos turmerona e -turmerona. Naghetini (2006) relatou em sua pesquisa a presena de ar-turmerona, -turmerona e 5 dimetil-4 hexenil 3-metil, exceto do p-cimeno nos leos essenciais extradosdaraizdeaafro,tantocomsolventehexano,quantopor hidrodestilao, confirmando mais uma vez o que foi encontrado neste trabalho.

(A)(B) (C) FIGURA12Estruturasqumicasdo(A)p-cimeno,(B)ar-turmeronae(C)-turmerona. 4.1.2 Louro Oleoessencialdelouroapresentou5substnciasprincipais identificadasporCG-EM.Essescompostosforamidentificadospormeioda comparaoentreosndicesdeKovats(IK),calculadosetabeladosdeacordo comAdams(1995).Osespectrosdemassaobtidosforamcomparadoscomos 33resultados dos bancos de dados da biblioteca Wiley 229. Os teores e seus ndices de Kovats calculados esto apresentados na Tabela 2. Analisando o cromatograma, foram identificados, 11 picos (Anexo 2 A). Entreoscompostosidentificados,foramconsideradoscomocompostos majoritrios:o1,8-cineol,-felandreno-8-ol,sabineno,-tujeno,-pineno,que apresentaramconcentraesde69,32%,3,93%,3,61%,3,22%,3,20%, respectivamente.NaFigura13estorepresentadasasestruturasqumicasdos compostos majoritrios encontrados no leo essencial de louro. Confirmando os resultados encontrados neste trabalho, Riaz et al. (1989) encontraram,entreosprincipaiscomponentesdoleoessencialdelouro,o cineol,sabineno,-pineno;noentantooscompostoseugenol,pineno, metileugenol,-terpineole4-terpineol,citadospelosautores,noforam encontrados neste estudo.Verdian-Rizi(2008)identificaram49componentesrelacionados variaoqumicadosleosessenciaisdaspartesareasdelouro.Osprincipais foram1,8-cineol,trans-sabinenohidratado,acetatode-terpinil,metileugenol, sabineno,eugenole-pineno,sendo1,8-cineolesabineno,tambm identificados neste estudo como componentes majoritrios. 34TABELA 2 Constituintes qumicos do leo essencial delouro identificados por CG/EM-Indice de Kovats. Pico aTR bIKcalConcentrao mdia (%)Composto 16,643-0,26 cNI 26,8499223,22-tujeno 372990,29NI 48,1199673,61Sabineno 58,2139723,20-pineno 68,7000,43NI 79,58510160,31-terpineno 89,85310251,46p-cimeno 910,137103569,321,8-cineol 1011,10610570,56-terpineno 1112,619-0,75 cNI 1213,389-0,29 cNI 1314,032-0,63 cNI 1414,897-0,33 cNI 1515,082-0,73 cNI 1615,47811703,93-Felandreno-8-ol 1715,97111811,894-terpineol 1816,14111950,69-Terpineol 1919,45312850,28Acetato de isobornil 2020,552-0,49 cNI 2121,686-6,72 cNI 2223,539-0,59 cNI a tempo de reteno,b ndice Kovats calculado, c no identificado . 35 (A)(B)(C) (D) (E) FIGURA13Estruturasqumicasdo(A)1,8-cineol,(B)-felandreno-8-ol,(C) sabineno, (D) -tujeno,(E) -pineno. 4.1.3 Gengibre OleoessencialdaraizdegengibrefoicaracterizadoporCG-EM, apresentando24picosemseucromatograma.Essescompostosforam identificados por meio da comparao do ndice de Kovats (IK), calculado com o tabelado de acordo com Adams (1995), e do espectro de massa obtido com os bancos de dados da biblioteca Wiley 229. Suas concentraese seus ndices de Kovats calculados esto apresentados na Tabela 3. 36TABELA3Constituintesqumicosdoleoessencialdegengibreidentificados pelo CG/EM-ndice de Kovats. Pico aTR bIKcalConcentrao mdia (%)Composto 15,8350,77 cNI 26,8469242,63 -tujeno 37,3009679,08Sabineno 48,2109730,38-pineno 58,5599810,396-metil5hepten-2-ona 68,7219871,76Mirceno 79,14810030,38m-octanal 810,02310306,73-felandreno 910,09910327,561,8-cineol 1010,5430,30 cNI 1112,6241,61 cNI 1215,0481,88 cNI 1315,9771,24 cNI 1417,39212281,73Citronelol 1517,833123814,34Nerol 1618,34212545,17Geraniol 1718,,919127120,92Geranial 1819,73512920,462-undecanona 1921,81613490,36Acetato de citronelil 2022,8533,88 cNI 2126,16114802,28Ar-curcumeno 2226,59014958,04-zingibereno 2326,98715074,36-bisaboleno a tempo de reteno,b ndice Kovats calculado, c no identificado . 37Dototalde24picos,17foramidentificados(Anexo3A).Os componentesmajoritriosforamogeranial(20,92%),nerol(14,34%),osabineno (9,08 %) e o -zingibereno (8,04 %). Na Figura 14, esto apresentas as estruturas qumicas dos compostos majoritrios encontrados no leo essencial da raiz de gengibre. Esses resultados so confirmados por aqueles de Norajit et al. (2007), os quaisencontraramozingiberenocomoumdoscomponentesmajoritriosdo leo essencial do gengibre. Dabagueetal.(2007)realizaramestudossobreascaractersticas qumicasdosleosessenciaisdedoisgentiposdiferentesdegengibre:o gentipo Paulista e o gentipo Japons. A anlise cromatogrfica foi similar qualitativamente para os dois gentipos, variando apenas quantitativamente. No primeiro,identificaramoacetatodegeranila(13,99%),geranial(13,87%), zingibereno(10,67%)e-bisaboleno(7,61%),eparaogentipoJapons, foramcaracterizadosoacetatodegeranila(15,95%),geranial(15,66%), zingibereno (10,98%) e -bisaboleno (8,46%). Em trabalhos de Malek et al. (2005), nos quais se avaliou a composio qumica de diferentes variedades de gengibre encontradas na Malsia, observou-se que o Zingiber officinales Rosc. var. officinales (gengibre comum) apresentou emseuleoessencialapresenadezingibereno(16,70%),(E,E)--farneseno (13,10%), geranial (7,60%). OsautoresMaleketal.(2005)eDabagueetal.(2007)encontrarama presenadeconstituintessemelhantesediferentesaosidentificadosnoleo essencial de gengibre deste estudo, provando a coerncia nas anlises qumicas, sendomuitocomumdiferenasnanaturezaenaconcentraodesses constituintesdentrodeumamesmaespcie.Issoocorredevidoadiferenasno tipodesolo,temperatura,partedaplantautilizada,horriosdecoleta,entre outros fatores. 38 (A)(B)(C) (D) FIGURA 14 Estruturas Qumicas do (A) geranial, (B) nerol, (C ) sabineno e (D) -zingibereno. 4.2 Atividade antifngica dos leos essenciais sobre Aspergillus carbonarius. Atestemunharelativa(Tween80%),utilizadacomoagente emulsionanteeestabilizante,nasconcentraestestadasnoinibiu significativamenteocrescimentodofungo,quandocomparadacoma testemunhaabsoluta,comprovandoahiptesedequeosolventeTweenno influencia na inibio do crescimento micelial deles (Tabela 4) (Figura 15). TABELA4ValoresmdiosdodimetrodecrescimentomicelialdeA. carbonarius em funo da concentrao de tween 80%. Concentrao L L-1 (Tween 80%)Dimetro mdio (cm) 08.56 a1 1009.15 a1 2508.54 a1 5008.96 a1 10008.11 a1 20008.27 a1 Mdiasseguidascomamesmaletraminsculano diferemsignificativamente entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Scoot & Knott (1974). 39 FIGURA 15 Crescimento micelial do Aspergillus carbonarius no ltimo dia do experimento frente a diferentes concentraes de Tween 80%. Pelos resultados, verificou-se que o leo essencial de louro tambm no apresentouatividadeemnenhumadasconcentraestestadas,sobreo crescimento micelial do fungo A. carbonarius (Tabela 5) (Figura 16). TABELA5ValoresmdiosdodimetrodecrescimentomicelialdeA. carbonariusemfunodaconcentraodoleoessencialde louro. Concentrao L. L-1 (leo essencial de louro) Dimetro mdio (cm) 08.56 a1 1009.22 a1 2507.32 a1 5009.20 a1 10008.51 a1 20008.72 a1 Mdiasseguidascomamesmaletraminsculano diferemsignificativamente entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Scoot & Knott (1974). 100 L L-1 1000 L.L-1 250 L L-1500 L L-1 2000 L.L-1Controle 40 FIGURA 16 Crescimento micelial do Aspergillus carbonarius no ltimo dia do experimento frente ao leo essencial de louro. Asatividadesfungistticaefungicidaforamobservadasemleos volteisdeCinnamomumzeylanicum,espciedafamlialaurceafrentea Aspergillusflavus,A.parasiticus,A.ochraceuseFusariummoniliforme (Soliman&Badeaa,2002).Simieetal.(2004),tambmtestandoaatividade antifngica dos leos volteis de espcies da famlia laurcea, incluindo Laurus nobilis (louro), observaram que o leo de Cinnamomun zeylanicum foi bastante ativofrenteaos17fungostestadosequeoleodelouronoapresentou nenhuma atividade. Atandaetal.(2005),estudandoosleosessenciaisdecssia (Cinnamomumcssia)elouro(Laurusnobilis),naconcentraode5%, observaramqueessesreduziramaconcentraodasaflatoxinas(B1+G1) presentesnomilhoeproduzidaspelofungoA.flavuspara0,002gmL-1(97, 92%)e0,043g.mL-1(55,21%),respectivamente.Entretanto,observaramque os leos de cssia e louro estimularam o crescimento micelial. 100 L L-1 1000 L L-1 250 L L-1 500 L L-1 2000 L L-1Controle 41Pirajano et al. (2004) investigaram o efeito dos leos essenciais de louro, hortelegraviolacontraodesenvolvimentoinvitrodosfungosRhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum, usando trs diferentes concentraes. Os leos essenciais de hortel e graviola foram os mais eficazes na inibio contra os dois fungos. O leo essencial de louro mostrou a menor atividade antifngica.No entanto, em pesquisas anteriores de Baratta et al. (1998), verificou-se queoleoessencialdefolhasdelouroapresentouatividadefrentesbactrias Acinetobacter calcoaceticus, Beneckea natriegens, Citrobacter freundii, Erwinia carotovora, Lactobacillus plantarum, Micrococcus luteus, Salmonella pullorum, Serratia marcescens e Staphylococcus aureus. SegundoCraveiroetal.(1981),-terpineol,timol,carvacroleo1,8-cineol,constituintemajoritriodoleoessencialdelouroutilizadonoestudo,apresentam atividade antissptica e antifngica. Oleoessencialdegengibreapresentouefeitoinibitriosobreo crescimentomicelialdofungo,quandocomparadotestemunhaabsoluta, (Tabela 6) (Figura 17). 42TABELA6ValoresmdiosdodimetrodecrescimentomicelialdeA. carbonariusemfunodaconcentraodoleoessencialde gengibre. ConcentraoLL-1(leoessencial de gengibre) Dimetro mdio (cm) 08.56 a3 1008,68 a3 2504,26a2 5000,00 a1 10000,00 a1 20000,00 a1 Mdiasseguidascomamesmaletraminsculano diferemsignificativamente entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Scoot & Knott (1974). FIGURA 17 Crescimento micelial do Aspergillus carbonarius no ltimo dia do experimento frente ao leo essencial de gengibre. 100 L L-1 1000 L L-1 250 L L-1500 L L-1 2000 L L-1Controle 43Verificou-se, pelos valores da Tabela 7, que a partir da concentrao de 250LL-1,todosostratamentoscomoleoessencialdegengibrediferiram significativamenteemrelaotestemunhaabsoluta(0LL-1);apartirda concentrao de 500 L L -1, a inibio do fungo foi total.OleoessencialdenoveespciesdeZingiberceastiveramsuas atividades antifngicas testadas contra cinco fungos dermatfitos (Trichophyton mentagrophytes,T.rubrum,Microsporumcanis,M.nanumeEpidermophyton floccosum), trs fungos filamentosos (Aspergillus niger, A. fumigatus and Mucor sp.)ecincotiposdeleveduras(Saccharomycescerevisiae,Cryptococcus neoformans,Candidaalbicans,C.tropicaliseTorulopsisglabrata).Apenaso leoessencialdeBoesenbergiapanduratafoicapazdeinibirocrescimentode todososfungos.OleoessencialdeKaempferiagalangamostroualta toxicidade contra A. fumigatus, ao passo que os leos essenciais de Z. officinales (gengibre) e Z. cassumunar exibiram alta atividade contra as leveduras (Jantan et al., 2003). Usandobioensaiosdirigidosparaoisolamentoeidentificaode compostosantifngicosdogengibre,Fickeretal.(2003)relataramqueos[6], [8],e[10]-gingerise[6]-gingerdiolsoosprincipaiscompostosantifngicos encontrados.Essescompostosforamativoscontra13patgenoshumanosem concentraesmenoresque1,00 mgml-1.Ocomponetegingerolpresentena cultivarafricanatestadafoipelomenostrsvezesmaiordoqueostpicos cultivarescomunsdegengibre.Dessaforma,essesautoressugeremqueos extratos de gengibre poderiam ser considerados como agentes antifngicos pelo uso prtico.Norajitetal.(2007)tambmrelataramaatividadeantimicrobianados leosessenciaisdecincoespciesdafamliaZingiberceaobtidospor hidrodestilao e extrao com dois tipos de solventes (ter de petrleo e etanol) contrabactriaspatognicas:Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillus 44cereus e Listeria monocytogenes. Os leos essenciais de cardamomo (Amomum xanthioidesWall.)ekaempferia(BoesenbergiapandurataHoltt.)inibiramo crescimento de todas as bactrias testadas. O leo essencial de gengibre extrado porhidrodestilaoteveamaioreficinciacontraasbactriasS.aureus,B. cereus e L. monocytogenes, com concentrao mnima inibitriapara B. cereus eL.monocytogenesde6,25mgmL-1.Noentanto,utilizando-sedoextratoda raizdegengibre,Yin&Cheng(1998)mostraramqueesseextratonopossua ao in vitro significante contra os fungos Aspergillus niger e A.flavus. Basilico&Basilico(1999),testandooleoessencialdeoutraplanta condimentar,omanjerico(Ocimumbasilicum),observaramumacompleta inibio no crescimento micelial de A. ochraceus aps um perodo de sete dias e diminuiodaproduodeocratoxinapara0,075%.Testesrealizados posteriormenteporAtandaetal.(2005)mostraramqueaproduode aflatoxinas pode ser completamente inibida no meio de cultura com a utilizao doleoessencialdasfolhasdemanjericoequehpossibilidadedeeleser utilizado para proteger o milho contra contaminaes por Aspergillus. Oleoessencialdeaafroapresentouefeitoinibitriosobreo crescimento micelial do fungo Aspergillus carbonarius, porm, em nenhuma das concentraes testadas, a inibio foi total (Tabela 7) (Figura 18). 45TABELA7ValoresmdiosdodimetrodecrescimentomicelialdeA. carbonariusemfunodaconcentraodoleoessencialde aafro. ConcentraoLL-1(leoessencial de aafro) Dimetro mdio (cm) 08.56 a3 a4 1009.08 a4 2506.54 a2 a3 5005.25 a1 a2 10005.40 a1 a2 20004.06 a1 Mdiasseguidascomamesmaletraminsculano diferemsignificativamente entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scoot & Knott (1974). FIGURA 18 Crescimento micelial do Aspergillus carbonarius no ltimo dia do experimento frente ao leo essencial de aafro. 100 L L-1 1000 L L-1 250 L L-1500 L L-1 2000 L L-1Controle 46Verificou-se,pelosdadosdaTabela8,queapartirdaconcentraode 500LL-1,todosostratamentoscomoleoessencialdeaafrodiferiram significativamente em relao testemunha absoluta (0 L L-1). A atividade antimicrobiana do aafro foi relatada por inmeros autores. Oextratoalcolicodacurcumina,pigmentopresenteemgrandeconcentrao, foitestadopelaprimeiravezporLutomskietal.(1974)eapresentouatividade antimicrobianafrentea Staphylococcusaureusnaconcentraode2,5a50mg 100mL-1.EmtestescomoAspergillusparasisticus,oextratoalcolicodo aafrotambmpromoveuainibiodocrescimento,atuandocomo fungisttico. Umasuspensopreparadacomgua,Tween80%ecurcuminaisolada naconcentraode250mgL.-1foipulverizadasobreplantasinfestadaspor fungosPhytophthorainfestans,PucchiniareconditaeRhizoctoniasolani apresentandoatividadeantifngicanasproporesde85,76e45%, respectivamente (Kim et al., 2001). O leo essencial obtido por hidrodestilao do aafro foi avaliado sem diluionainibio de bactrias. Os resultados obtidos, quando comparadosao antibiticogentamicina(30g),foram:Staphylococcusaureus36%, Staphylococcus epermidis 90%, Escherichia coli 18%, Pseudomona aeruginosa 22%, e Salmonella typhymurium 31% (Singh et al., 2002). Naghetini (2006), testando o leo essencial de aafro (Curcuma longa) extradopelomtododehidrodestilaoepelosolventehexano,observou atividadeantifngicainvitrocontraAlternariabrassicicolaeAspergillus flavipes.A atividade antifngica observada no leo essencial de aafro pode ser devidaasubstnciascetnicaspresentes,como,porexemplo,aar-turmerona, presenteempercentuaissignificativosnoleoessencial.Defato,Leeetal. (2003)observaramatividadeantifngicadaar-turmeronaisoladadafrao 47hexnica,quandotestadanaconcentraode500g/mLcontraosfungos Erysiphe graminis e Phytophthora infestan.Pret-Almeida et al. (2003) verificaram atividade antifngica in vitro de leosessenciaisobtidosporhidrodestilaoparaA.nigereSaccharomyces cerevisiae,emcomparaocomoantibiticoanfotericinaBeperceberamque, nas concentraes de 5 e 10 g, os halos de inibio foram maiores para o leo essencial, quando comparado ao antibitico testado. 485 CONCLUSES Osconstituintesmajoritriosidentificadosnosleosessenciaisde aafro,louroegengibreforam:ar-turmerona,1,8-cineolegeranial, respectivamente. O leo essencial de louro no apresentou nenhum efeito inibitrio sobre A. carbonarius, na concentrao de at 2.000 L L-1. Os leos essenciais de gengibre e aafro apresentaram efeitoinibitrio sobreA.carbonarius,commnimasconcentraesinibitriasde250e500L L-1, respectivamente. Oleoessencialdegengibrefoioqueapresentoumelhoratividade antifngica, inibindo completamente o crescimento micelial do fungo a partir da concentrao de 500 L L-1. 49REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ADAMS, R. P. 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